Academic literature on the topic 'Pool de nucléotides'

Adenylate cyclase and 5′-nucleotidase activities were localized at the ultrastructural level. Variations of these activities were checked in the transfer cells of the cotyledonary node in the intact or decapitated plant. They were also studied in the shoot apex of both inhibited (G0 state) and released cotyledonary buds, during the transitions G1–S orG2–M. The adenylate cyclase activity is mainly associated with the exterior side of the plasma membrane and it is identical in both specialized and meristematic cells, no matter what the phase of the cell cycle is. Sodium fluoride did not appear as an activator of the plant enzyme adenylate cyclase. The 5′-nuelcotidase activity was predominant on the outside of the plasma membrane and in the plasmodesmata with no variation of intensity in the meristematic cells of the bud in relation to the cell cycle phases. Use of inhibitors of alkaline phosphatase (L-p-bromotetramisole and L-phenylalanine) and 5′-nucleotidase activities (α-β-methylene adenosine 5′-diphosphate) demonstrated the specificity of the reaction along the plasma membrane. The constancy of adenylate cyclase and 5′-nucleotidase activities in both inhibited and released buds suggests that if the optimization of the pool of polynucleotides is a component of the release from inhibition in the cotyledonary bud of pea, it is not due to the variation of activities of enzymes which release adenosine from ATP.

La stabilité du génome est compromise par les déséquilibres du pool de dNTPs qui affectent la vitesse de progression des fourches de réplication. Par exemple, la déficience en cytidine désaminase (CDA) conduit à un excès de dCTP qui induit un ralentissement des fourches de réplication. Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme par lequel un déséquilibre du pool de nucléotides compromet la complétion de la réplication et la ségrégation correcte des chromosomes. En utilisant des techniques de peignage moléculaire, de microscopie électronique et d’imagerie cellulaire permettant de quantifier le niveau basal de PAR, nous avons montré que la réplication incomplète de l’ADN lorsque la CDA est absente est due à l’inhibition partielle de PARP-1, et n’est pas liée au ralentissement de la vitesse de progression des fourches de réplication. En effet, l’accumulation intracellulaire de dCTP inhibe l’activité de PARP-1 ce qui réduit l’activation de Chk1 et l’efficacité des points de contrôle situés en aval, favorisant ainsi l’accumulation de séquences d’ADN non répliquées en mitose. Celles-ci conduisent alors à la formation de ponts anaphasiques ultrafins (UFBs) entre les chromatides sœurs au niveau de sites difficiles à répliquer tels que les centromères et les sites fragiles. Ces résultats ont des implications directes dans le syndrome de Bloom (BS), une maladie génétique rare combinant prédisposition aux cancers et instabilité génétique. Ce syndrome est la conséquence de la mutation du gène BLM, codant pour une hélicase RecQ du même nom. La déficience en BLM conduit à une chute de l’expression de la CDA résultant en une augmentation des UFBs entièrement due à l’inhibition de PARP-1 par la dCTP, indépendamment de BLM. Ces travaux décrivent ainsi une conséquence pathologique encore inconnue du déséquilibre du pool de nucléotides et révèlent un rôle inattendu de PARP-1 dans la surveillance des séquences d’ADN non répliquées prévenant leur accumulation en mitose et les défauts de ségrégation des chromosomes associés
Genome stability is jeopardized by imbalances of the dNTP pool; such imbalances affect the rate of fork progression. For example, cytidine deaminase (CDA) deficiency leads to an excess of dCTP, slowing the replication fork. We describe here a novel mechanism by which pyrimidine pool disequilibrium compromises the completion of replication and chromosome segregation. Using molecular combing, electron microscopy and a sensitive assay involving cell imaging to quantify steady-state PAR levels, we found that in CDA-deficient cells DNA replication was unsuccessful due to the partial inhibition of basal PARP-1 activity, rather than slower fork speed. Indeed, the intracellular accumulation of dCTP inhibits PARP-1 activity compromising the activation of Chk1 and the downstream checkpoints efficiency, allowing the subsequent accumulation of unreplicated DNA in mitosis. This unreplicated DNA leads to the formation of ultrafine anaphase bridges (UFBs) between sister-chromatids at “difficult-to-replicate” sites such as centromeres and fragile sites. These results have direct implications for Bloom syndrome (BS), a rare genetic disease combining susceptibility to cancer and genomic instability. BS results from mutation of the BLM gene, encoding BLM, a RecQ 3’-5’ DNA helicase, a deficiency of which leads to CDA downregulation. BS cells thus have a CDA defect, resulting in a high frequency of UFBs due entirely to dCTP-dependent PARP-1 inhibition and independent of BLM status. Our results describe previously unknown pathological consequences of the distortion of dNTP pools and reveal an unexpected role for PARP-1 in preventing unreplicated DNA accumulation in mitosis and in preventing chromosome segregation defects

Le syndrome de Bloom (SB) est une maladie humaine autosomique récessive rare résultant d’une mutation sur les deux copies du gène BLM, qui code pour la protéine BLM, une 3’-5’ ADN hélicase de la sous-famille recQ. Les cellules SB présentent une forte instabilité génétique et les patients atteints du SB sont prédisposés au développement de tous les types de cancers affectant la population générale. La déplétion en BLM conduit à une chute drastique de l’expression de la cytidine désaminase (CDA), une enzyme de la voie de sauvetage des pyrimidines qui catalyse la désamination hydrolytique de la cytidine (C) et de la désoxycytidine (dC) en uridine (U) et désoxyuridine (dU). La déficience en CDA conduit à un excès de dC et de dCTP (désoxycytidine triphosphate) dans les cellules SB, mais également dans les cellules qui expriment BLM, ce qui entraîne une instabilité génétique. Effectivement, ce déséquilibre du pool de pyrimidines conduit à une diminution significative de l’activité basale de la poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1) qui, elle-même, entraîne une réduction de l’activation de Chk1. Ceci affaiblit l‘efficacité des points de contrôle du cycle cellulaire en aval, favorisant l’accumulation en mitose de séquences d’ADN non répliquées qui conduisent à une formation excessive de ponts anaphasiques ultrafins (UFB). Ces séquences concernent essentiellement des régions du génome « difficiles à répliquer », comme les centromères et les sites fragiles. L’objectif de mon projet thèse était de décrypter le mécanisme conduisant à la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons effectué une étude comparative des métabolomes de deux couples de lignées isogéniques exprimant ou non CDA qui a révélé une augmentation du niveau de nicotinamide (NAM), substrat de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT), et une diminution du niveau de nicotinamide mononucléotide (NMN), produit de la NAMPT, dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons confirmé la réduction de l’activité de la NAMPT nucléaire dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons également montré que la déplétion en NAMPT par ARN interférence ou l’inhibition chimique de l’activité de la NAMPT reproduit la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules exprimant CDA, et pas dans les cellules déficientes en CDA. De plus, l’expression exogène de la NAMPT sauvage, mais pas celle de la NAMPT mutée dans son site catalytique, restaure complètement l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA, entraînant de fait une normalisation de la fréquence des UFBs dans ces cellules. Ces résultats indiquent que la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA résulte de la diminution de l’activité de la NAMPT. Nous proposons un modèle dans lequel l’accumulation intracellulaire de dC /dCTP résultant de la déficience en CDA pourrait entraver l’activité de la NAMPT nucléaire, provoquant une accumulation intracellulaire de NAM, un inhibiteur naturel connu de PARP-1, qui par conséquent réduirait l'activité basale de PARP-1. Nos résultats révèlent pour la première fois, un lien entre la déficience en CDA et le métabolisme du nicotinamide, voie métabolique essentielle pour le maintien de l’intégrité de la cellule
Bloom syndrome (BS) is a rare human autosomal recessive disorder resulting from mutations in both copies of the BLM gene, encoding BLM, a 3’-5’ RecQ DNA helicase. BS cells present a strong genetic instability and BS patients are predisposed to a wide range of cancers that commonly affect the general population. BLM depletion leads to the downregulation of cytidine deaminase (CDA), an enzyme of the pyrimidine salvage pathway that catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine (C) and deoxycytidine (dC) to uridine (U) and deoxyuridine (U), respectively. CDA defect leads to an excess of cellular dC and deoxycytidine triphosphate (dCTP) in either BS cells or BLM-expressing cells, that jeopardizes genome stability. Indeed, this nucleotide pool disequilibrium leads to a significant reduction of basal Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) activity. The resulting low levels of PARP-1 activity disturb Chk1 activation and decrease the efficiency of downstream checkpoints, leading to the accumulation, during mitosis, of unreplicated DNA at some “difficult-to-replicate” loci in the genome, such as centromeres, fragile sites, leading to excess ultrafine anaphase bridge (UFB) formation. The objective of my PhD project was to decipher the mechanism leading to the reduction of basal PARP-1 activity in the absence of CDA. We performed a metabolomic study that revealed an increase in nicotinamide (NAM) levels, the substrate of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), and a decrease in nicotinamide mononucleotide (NMN) levels, the product of NAMPT. We confirmed the reduction of the nuclear NAMPT activity in CDA-deficient cells. We found that the siRNA-mediated NAMPT knockdown or the chemical NAMPT inhibition reproduce the reduction of basal PARP-1 activity in CDA-proficient cells, but not in CDA-deficient cells. Moreover, expression of exogenous wild type NAMPT, but not of the NAMPT catalytic mutant, fully rescued the reduction of basal PARP1 activity, and the subsequent increase in UFB frequency in CDA-deficient cells. These results indicate that the reduced basal PARP-1 activity in CDA-deficient cells is due to a reduced NAMPT activity. We propose a model in which the intracellular accumulation of dC/dCTP resulting from CDA deficiency might impair the nuclear NAMPT activity, resulting in an intracellular accumulation of NAM, a known natural inhibitor of PARP-1, that consequently reduces PARP-1 activity. Our results highlight for the first time a link between cytidine deaminase deficiency and nicotinamide metabolism, a pathway essential for the maintenance of cell integrity

Dans les trois domaines du vivant, que constituent les bactéries, les eucaryotes et les archées, une molécule a la capacité souveraine de gouverner la vie, la mère à l’origine de tous les mécanismes biologiques, l’ADN. S’il est évident de dire que le maintien de l’intégrité des génomes est essentiel à la vie, il existe deux systèmes qui le permettent, la réplication et la réparation de l’ADN. La fidélité de ces derniers est finement influencée par la disponibilité (ratio et balance) des précurseurs nucléotidiques désoxyribonucléotides (dNTPs) et ribonucléotides (rNTPs) au cours du cycle cellulaire. Même si la concentration intracellulaire en nucléotides est largement documentée chez les eucaryotes et les bactéries, ça n’est malheureusement pas le cas chez les archées. En ce qui concerne l’étude de la maintenance génomique, un groupe d’archées a intéressé les chercheurs de par leurs capacités à survivre dans des milieux dits extrêmes. Pyrococcus abyssi est l’une d’entre elles qui depuis de nombreuses années sert de modèle biologique pour répondre aux questions de la stabilité de l’ADN à haute température. Cette étude est centrée sur cette thématique et particulièrement sur les caractéristiques fonctionnelles des ADN polymérases: PolD, PolB et le complexe p41/p46. Initialement, le contenu en nucléotides a été évalué dans des cellules en phase exponentielle de croissance par la technique de chromatographie couplée à une double détection en spectrométrie de masse (zicHILIC-MS-MS). Les résultats montrent que le contenu en rNTPs est de 20 fois supérieur à celui en dNTPs. Pour cette raison, la discrimination sélective des dNTPs par les ADN polymérases est mise à l’épreuve. Même si, des mécanismes permettent d’exclure les rNMPs durant la synthèse de l’ADN, de récentes études ont montrées que des rNMPs étaient incorporés par des ADN pols. Ainsi, le ratio en nucléotides obtenu a été utilisé pour l’analyse de son effet sur la synthèse d’ADN par les ADN Pols et les extraits cellulaires de P. abyssi. Les résultats démontrent clairement que les rNMPs sont incorporés par l’ADN polymérase PolD. Puis, les conséquences de la présence des rNMPs dans l’ADN sur la réplication ont été étudiées et ont mis en évidence que les extraits cellulaires, tout comme les ADN Pols de P. abyssi étaient capables de « passer » un rNMP présent dans l’ADN. Pour finir, une étude de l’incorporation préférentielle de chaque dNMP et rNMP a été menée démontrant que la complémentarité des bases était respectée même lors de l’incorporation de rNMPs. Enfin, la caractérisation de la petite sous-unité, DP1, de PolD a permis de montrer sa capacité à retirer des rNMPs grâce à son activité de relecture, suggérant un premier rempart à la présence de rNMPs dans l’ADN. Pour conclure, ces résultats montrent que la présence de rNMPs dans l’ADN est un phénomène conservé dans les trois domaines du vivant
In the three domains of life that include Bacteria, Eukarya and Archaea, one molecule has the sovereign ability to govern life, and not the least one, the mother of all biological mechanisms, DNA. Maintaining the integrity of genomes is obviously essential for life, and faithful DNA replication and repair are the guarantees. The fidelity of these two processes may vary depending on the availability and levels (balance and ratio) of deoxyribonucleotides (dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs) during the cell-cycle. Even if intracellular concentration of nucleotides is largely documented in Eukarya and Bacteria, it remains limited in Archaea. From many years one group of Archaea is of great interest for studying genomic maintenance, because of its ability to survive in extremes environments. Pyrococcus abyssi is one of them that is used as biological model for deciphering the stability of DNA at elevated temperature in LM2E. The present work focuses on genomic integrity and particularly on the functional characterization of the three DNA polymerases: PolD, PolB and the p41/p46 complex. Initially, the nucleotide pool has been evaluated in exponentially growing cells using the highly sensitive method that combined chromatography and mass spectrometry (zicHILIC-MS-MS). The results show that rNTPs content is 20-fold higher than dNTPs. For that reason, fidelities of DNA polymerases are challenged to select the correct dNTP over the most abundant rNTP during DNA synthesis. Despite the fact that some mechanisms allow the exclusion of rNTPs from entry to the Pol active site, recent findings indicate that ribonucleotides are incorporated by different DNA Pols with surprisingly high frequency. In this work, the obtained intracellular balance and ratio of rNTPs and dNTP have been used to analyze their effect on DNA synthesis by P. abyssi DNA Pols and cell-free extracts. Our results clearly demonstrate that rNTP incorporation is detectable with distinct efficiencies among DNA pols. Secondly, the consequences of the presence of rNMPs in a DNA template on DNA polymerisation has been examined and highlights that cell-free extracts are able to bypass a single rNMP as well as replicative DNA polymerases. To strengthen that study, single nucleotide incorporation opposite rNMP or dNMP has been carried out and the results demonstrate that replicative Pyrococcus abyssi DNA Pols can basepair the complementary rNTPs opposite dNMPs, and vice-versa, the complementary dNTPs opposite rNMPs.Furthermore, the preliminary results obtained about the nucleolysis activities of the PolD small subunit, DP1, show that the DNA polymerase D is able to remove rNMPs from a DNA strand, suggesting a first level of protection against ribonucleotide contamination of DNA. Definitely, these data indicate that the presence of transient embedded rNMPs in genomic DNA represents a universally conserved phenomenon across Archaea, Bacteria and Eukarya

Les analogues de nucléosides représentent une famille thérapeutique très largement utilisée en cancérologie dans le traitement des hémopathies malignes et autres cancers. Leur implication sur les variations des pools des nucléotides endogènes a été largement décrite et a constitué le point de départ de ce travail. C’est dans le but d’étudier ces variations que nous avons développé une méthode de dosage sensible et spécifique des ribonucléotides et désoxyribonucléotides physiologiques intracellulaires. Dans la première partie de ce mémoire nous avons réalisé une revue de la bibliographie sur les méthodes de dosage décrites dans la littérature puis nous avons détaillé le métabolisme des nucléotides endogènes et de leurs analogues. Dans la deuxième partie, nous présentons la validation de notre méthode de dosage et l’application à l’étude des variations des pools endogènes de ribonucléotides et désoxyribonucléotides dans différents modèles cellulaires : lignées résistantes versus lignées parentales et lignées traitées versus lignées non traitées. Les résultats obtenus sur les cellules montrent que notre méthode de dosage permet d’étudier l’impact des analogues nucleosidiques sur les pools endogènes de nucléotides mais aussi les dosages des dérivés phosphates de ces nucléosides
Nucleoside analogues constitute family of drugs widely used in cancer therapeutic for the treatment of malignancy hemopathies and several type of cancer. Numerous studies described their action on the variation of endogen nucleotide pools. This constitutes the point of starting of the present work. A sensible and specific assay for the quantification of intracellular ribonucleotides and désoxyribonucleotides was developed. In the first part, a review concerning the analytical methods published is presented. We also focused on the metabolism of endogen nucleotides and their analogues. In the second part, our method for the quantification of endogen nucleotides and désoxynucleotides is presented from different cellular models: resistant cell lines versus wild type lines, treated cells with analogues versus untreated cells. Results obtain from the cells lines studied show that our analytical method allows to study the impact of nucleoside analogues on endogenous nucleotides, but also the quantification of the phosphate derivatives of these analogues

Les nucléotides, terme regroupant les nucléosides monophosphate, diphosphate et triphosphate, sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires. Ils représentent les éléments constitutifs des acides nucléiques, fournissent de l'énergie à des réactions métaboliques, jouent le rôle de transporteurs et seconds messagers. L'exploration des pools nucléotidiques apparaît indispensable afin de connaître leur rôle précis dans des situations physiologiques ou pathologiques. Nous avons développé une méthode de dosage des nucléotides endogènes (formes mono-, di- et triphosphate) par extraction en ligne sur colonne WAX couplée à la LC-MS/MS. La séparation analytique est réalisée sur colonne Hypercarb, sans agent de paire d'ions dans la phase mobile. Grâce à l'utilisation d'un triple quadripôle et une ionisation en mode positif, les nucléotides endogènes sont identifiés sans équivoque, y compris ceux possédant la même masse molaire. L'extraction et la séparation des nucléotides sont réalisées en 20 min. L'ensemble de la méthode, en comptant la ré- équilibration des colonnes, dure 37 min. La méthode de dosage a été validée pour les formes mono- et triphosphate et est applicable à des séries d'une vingtaine d'échantillons biologiques. D'autre part, dans une étude pré-analytique basée sur les plans d'expériences, nous avons comparé les conditions de préparation d'échantillons en vue du dosage de nucléotides intracellulaires dans 4 lignées cellulaires : 2 adhérentes (Messa et NCI-H292) et 2 en suspension (RL et L1210). Nous avons montré que les conditions pré-analytiques optimales dépendent de la lignée cellulaire soulignant ainsi l'importance de cette phase dans l'analyse des nucléotides. Enfin, l'expérience et les connaissances acquises lors du développement de la méthode de dosage des nucléotides ainsi que la large palette de molécules analysables avec cette méthode (nucléosides, nucléotides sucrés, autres métabolites), nous ont permis de développer des collaborations dans le domaine de la cancérologie avec différentes équipes de recherche. Par exemple, nous avons étudié l'implication des pools nucléotidiques dans le stress réplicatif induit par le stress oxydant et dans la reprogrammation cellulaire observée dans les cellules cancéreuses. Ainsi, les informations apportées par notre approche analytique, complémentaires des autres approches utilisées, ont montré l'implication des pools nucléotidiques dans la tumorigénèse. En conclusion, ce travail a permis de développer une technique analytique et de mettre en place une méthode de travail pour le dosage des nucléotides endogènes dans différents milieux biologiques
Nucleotides, term including nucleoside mono-, di- and triphosphates, are endogenous compounds playing various roles in biology. They are components of nucleic acids, provide energy to metabolic reactions and act as carriers or second messenger. The study of endogenous nucleotides has become of great interest in physiological and pathological conditions. We developed a method for the quantification of endogenous nucleotides, using an on-line extraction on a WAX column coupled with LC-MS/MS. Analytical separation is performed on a Hypercarb column, without ion pairing agent in the mobile phase. The use of a triple quadrupole mass spectrometer following positive mode ionization allows the unambiguous identification of nucleotides presenting the same mass. Extraction and separation of nucleotides are achieved within 20 min and the method including re-equilibration of the two columns within 37 min. The method was validated for the quantification of nucleoside mono- and triphosphates, and could be applied to series of more than twenty biological samples. Secondly, in a study based on design of experiments, pre-analytical parameters influencing results of intracellular nucleotides were compared in four cell lines. We demonstrated that optimal pre-analytical parameters depend on cell lines. This clearly highlights the importance of pre- analytical conditions for the quantification of intracellular nucleotides to be as representative as possible of the real levels in cells. Then, thanks to experience acquired during the development and the validation of the analytical method, scientific collaborations have been established with several cancer research teams. For example, implication of nucleotide metabolism in replicative stress induced by oxidative stress or in the metabolic reprogramming in cancer cells was studied. Results obtained by our analytical approach were complementary to those obtained by other techniques. To conclude, our work consisted on the study of the entire workflow for the analysis of endogenous nucleotides in various biological samples