Dissertations / Theses on the topic 'Préparation échantillon'

La bio-analyse correspond à l'identification et la quantification des molécules biologiques ou activement biologiques dans un échantillon. Elle se divise en plusieurs étapes : la collecte de l'échantillon et l'envoi au laboratoire ; la préparation des échantillons qui permet de le rendre compatible à la méthode d'analyse ; l'analyse et enfin la mesure des événements ayant eu lieu pendant l'analyse.Au cours de cette thèse, deux types d'analyse ont été étudiées : la spectrométrie de masse, plus particulièrement le MALDI-TOF, et une PCR isotherme nommée amplification isotherme médiée par les boucles (LAMP).L'objectif principale de la thèse était de rendre compatible ces méthodes d'analyse à une utilisation terrain. Pour cela, le SPID, un dispositif breveté par le CEA, a été adapté à ces deux technologies. Ce dispositif permet la filtration, la concentration, l'extraction d'une suspension bactérienne et la détection par immunochromatographie à flux latéral. Le SPID est un outil qui permet de s'affranchir des étapes de centrifugations ou lavages, méthodes classiquement utilisées pour préparer les échantillons pour le MALDI et la LAMP.Pour extraire les protéines ribosomales, pour une analyse au MALDI-TOF, il a fallu développer un tampon d'extraction compatible avec une telle analyse. En effet, pour faciliter la lyse bactérienne, l'utilisation de détergents est souvent recommandée ; or, les détergents peuvent empêcher l'identification des bactéries en spectrométrie de masse. Les résultats ont été comparés avec un protocole de référence proposé par Bruker. L'utilisation du SPID a permis d'identifier trois espèces bactériennes à une concentration de 107 UFC/mL dans un milieu simple et en urine. Le protocole de référence, quant à lui, a permis ces mêmes identifications à une concentration de 106 UFC/mL.Pour extraire l'ADN des bactéries avec le SPID suivi d'une amplification LAMP, de nombreuses mises au point ont été faites. Après avoir implanté la technique au laboratoire, différentes méthodes d'extraction avec le SPID ont été développées. Celle qui permet d'obtenir les meilleurs résultats est la création d'un tampon d'extraction combiné aux réactifs nécessaires à la LAMP. L'autre méthode étudiée est l'utilisation de billes de silice pour purifier l'ADN avant la réaction d'amplification.Pour rendre le chauffage compatible à une utilisation terrain, une station de chauffage a été conçue au cours de la thèse. Cette station permet de chauffer le réservoir du SPID pendant 40 minutes à 65 °C. Elle pourrait être alimentée par batterie.La détection des produits de l'amplification, appelés amplicons, est faite par immunochromatographie à flux latéral. Les amplicons sont marqués à leurs extrémités grâce à deux amorces. Une des amorces est marquée à la digoxigénine, l'autre à la biotine. L'amplicon est capturé par un anti-anticorps anti-digoxigénine, immobilisé sur une membrane de nitrocellulose, et est révélé à l'aide de la streptavidine couplé à des nanoparticules d'or.Avec les différents éléments développés au cours de cette thèse, le protocole pour réaliser une LAMP sur le terrain dure moins d'une heure : de la préparation des échantillons à la détection
Bioanalysis is the identification and the quantification of biological molecules or active biological agent in a sample. It is divided into several stages: sample collection and sending to the laboratory; sample preparation to make it compatible with the analysis method; analysis and, finally, measurement of the events occurring during the analysis.During this thesis, two analysis were studied: mass spectrometry, more specifically MALDI-TOF and an isothermal PCR called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP).The main aim was to make these methods compatible with field use. To achieve this, the SPID, a device patented by CEA, was adapted to both technologies. This device enables a bacterial suspension to be filtered, concentrated, extracted and detected by lateral flow immunoassay. The SPID is a tool that eliminate the need for centrifugation or washing, methods traditionally used to prepare sample for MALDI and LAMP.To analyze ribosomal proteins by MALDI-TOF, an extraction buffer compatible with this technic had to be developed. Indeed, to facilitate bacterial lysis, the use of detergents is often recommended but detergents can prevent the identification of bacteria by mass spectrometry. The results were compared with a reference protocol proposed by Bruker. Using SPID, three bacterial species were identified at a concentration of 107 CFU/mL in a simple medium and in urine. In contrast, the reference protocol identified the same species at a concentration of 106 CFU/mL.To make heating step compatible with filed use, an autonomous heating station was designed during the thesis. This station heats the SPID tank for 40 minutes at 65°C. It could be battery-powered.The amplification products, called amplicons, are detected by lateral flow immunoassay. Amplicons are end-labeled using two pirmers. One primer is labeled with digoxygenin, the other with biotin. The amplicon is captured by an anti-digoxigenin antibody, immobilized on a nitrocellulose membrane; and revealed using streptavidin coupled to gold nanoparticles.With the optimizations made during the thesis, the complete LAMP field protocol takes less than an hour : from de sample preparation to the detection

Dans le domaine du diagnostic in vitro, l'étape d'extraction de micro-organismes à partir d'un échantillon complexe est une étape clé pour permettre l'identification du pathogène responsable d'une infection. Pour les septicémies, cette étape d'extraction est généralement précédée d'une étape de culture, ce qui conduit à une obtention des résultats au bout de plusieurs jours. Un résultat plus rapide (typiquement inférieur à 24h) permettrait d'augmenter le taux de survie des patients, et aurait ainsi une forte valeur ajoutée pour le corps médical. Le but de ces travaux est donc de développer une nouvelle méthode d'extraction et de concentration de pathogènes directement à partir d'un échantillon sanguin, sans étape de culture. Une stratégie en deux modules microfluidiques associés en série est proposée : elle repose sur la modification de la conductivité et de l'osmolarité de l'échantillon dans un premier module, puis sur la capture des micro-organismes par diélectrophorèse dans un second module. L'étude du premier module a permis de déterminer l'impact de la conductivité et de l'osmolarité du milieu sur les propriétés diélectriques des cellules. Deux voies ont ainsi été abordées, afin de diriger les cellules du sang et les micro-organismes vers un milieu de conductivité et d'osmolarité contrôlées : la dilution, et l'utilisation de forces acoustiques. L'étude du deuxième module a ensuite permis de démontrer la possibilité de capturer et concentrer des micro-organismes à partir d'un échantillon hypotonique et faiblement conducteur dans un écoulement microfluidique par diélectrophorèse. L'architecture d'un microsystème dédié a été définie grâce à un modèle numérique, puis validé expérimentalement avec des échantillons sanguins et différents micro-organismes (E. coli, S. epidermidis et C. albicans). La capture générique des micro-organismes est démontrée, et un taux de capture de 97% a été obtenu pour la séparation de \EC, avec une vitesse moyenne de l'échantillon dans le microsystème de 100 à 200 µm.s-1. Enfin, des perspectives d'amélioration sont présentées pour permettre d'effectuer cette étape de séparation sur un gros volume d'échantillon (1 à 10mL) en quelques heures, afin de répondre aux exigences imposées par l'urgence des tests de diagnostic des septicémies
Extraction of pathogens from a biological sample is a key step for efficient diagnostic tests of infectious diseases. For bloodstream infections, current diagnostic methods are usually based on bacterial growth and take several days to provide valuable information. An accelerated result would have a high medical value to adjust therapeutic strategies. The aim of this study is to design a new approach for separation and concentration of microorganisms directly from a blood sample, to avoid time-consuming growth stages. We report a method based on two different microsystems connected in series: it combines modification of conductivity and osmolarity of the sample with generic capture of microorganisms by dielectrophoresis. First we explore the impact of conductivity and osmolarity on the dielectric properties of blood cells and microorganisms. Dilution and acoustic forces are both analyzed to transfer blood cells and microorganisms to the optimized buffer. Then we demonstrate the feasibility of achieving the dielectrophoretic separation of microorganisms from blood cells in a low conductivity and low osmolarity medium inside a fluidic device. The structure of the device is optimized with numerical simulations and experiments performed on blood samples and various microorganisms (E. coli, S. epidermidis and C. albicans).The generic capture of microorganisms is validated, and we achieved a separation of 97% efficiency with E. coli, with an optimal inlet velocity around 100-200 µm.s-1. Finally, we propose an improved microsystem to perform the sample preparation step on a larger volume (1-10mL) in a few hours, in order to fit the medical need

Dans le domaine du diagnostic in vitro, l'étape d'extraction de micro-organismes à partir d'un échantillon complexe est une étape clé pour permettre l'identification du pathogène responsable d'une infection. Pour les septicémies, cette étape d'extraction est généralement précédée d'une étape de culture, ce qui conduit à une obtention des résultats au bout de plusieurs jours. Un résultat plus rapide (typiquement inférieur à 24h) permettrait d'augmenter le taux de survie des patients, et aurait ainsi une forte valeur ajoutée pour le corps médical. Le but de ces travaux est donc de développer une nouvelle méthode d'extraction et de concentration de pathogènes directement à partir d'un échantillon sanguin, sans étape de culture. Une stratégie en deux modules microfluidiques associés en série est proposée : elle repose sur la modification de la conductivité et de l'osmolarité de l'échantillon dans un premier module, puis sur la capture des micro-organismes par diélectrophorèse dans un second module. L'étude du premier module a permis de déterminer l'impact de la conductivité et de l'osmolarité du milieu sur les propriétés diélectriques des cellules. Deux voies ont ainsi été abordées, afin de diriger les cellules du sang et les micro-organismes vers un milieu de conductivité et d'osmolarité contrôlées : la dilution, et l'utilisation de forces acoustiques. L'étude du deuxième module a ensuite permis de démontrer la possibilité de capturer et concentrer des micro-organismes à partir d'un échantillon hypotonique et faiblement conducteur dans un écoulement microfluidique par diélectrophorèse. L'architecture d'un microsystème dédié a été définie grâce à un modèle numérique, puis validé expérimentalement avec des échantillons sanguins et différents micro-organismes (E. coli, S. epidermidis et C. albicans). La capture générique des micro-organismes est démontrée, et un taux de capture de 97% a été obtenu pour la séparation de \EC, avec une vitesse moyenne de l'échantillon dans le microsystème de 100 à 200 µm.s-1. Enfin, des perspectives d'amélioration sont présentées pour permettre d'effectuer cette étape de séparation sur un gros volume d'échantillon (1 à 10mL) en quelques heures, afin de répondre aux exigences imposées par l'urgence des tests de diagnostic des septicémies.

Identifier des traces de vie sur la Lune ou sur Mars requiert des forages. Les contraintes très fortes sur les systèmes spatiaux et les environnements à faible gravité nuisent aux performances des foreuses rotatives. Une solution innovante a été identifiée chez un insecte qui creuse dans le bois pour déposer ses œufs. Des tests ont montré la faisabilité d’imiter cet insecte pour creuser sans force ou appui extérieur. Ce doctorat poursuit le développement du concept de forage bio-inspiré surtout pour forer dans le régolithe extra-terrestre. Cette nouvelle technique est nommée « Dual Reciprocating Drilling » (DRD). Tout d’abord, des simulants de régolithe lunaire et martien ont été testés ainsi que leurs méthodes de préparation. DRD a été testé pour la première fois dans du régolithe. L’importance du dérapage (slippage en anglais) a été identifiée. Des mécanismes de pénétration du régolithe par le DRD ont été proposés. Une seconde expérience a permis de raffiner les mécanismes de pénétration du régolithe. L’importance des mouvements latéraux lors du forage a été identifiée. Finalement un code utilisant les éléments discrets a été implémenté sur des GPU (Graphical Processing Units) permettant la première simulation d’interaction tête de forage - régolithe avec plus d’un million de particules. Avant ces travaux, DRD était vu comme capable de développer sa propre force de progression. Dans le régolithe DRD a besoin d’une force externe pour progresser. Cependant DRD permet de réduire cette force (grâce aux mouvements latéraux). Une proposition d’architecture système reflétant cette nouvelle compréhension a été faite.

L'extraction et l'enrichissement de micropolluants organiques, couvrant une large gamme de polarite, sont etudies pour des matrices environnementales. Deux techniques de preparation d'echantillons sont evaluees et optimisees: l'extraction par fluide supercritique (sfe) de matrices solides (sols, sediments, adsorbants) et la preconcentration de polluants aqueux sur une precolonne, remplie d'un adsorbant polymerique (polystyrene-divinylbenzene), couplee en-ligne a la chromatographie en phase liquide (hplc), equipee d'un detecteur uv multi longueur d'ondes. Les fluides supercritiques permettent d'extraire des pesticides organophosphores et le pyrimicarbe de sols et de sediments en moins d'une heure avec des rendements de 80% (ou superieurs). L'ajout de methanol ou d'eau a la matrice permet de rompre les interactions matrice-analyte, qui sont un des principaux facteurs limitant l'efficacite en sfe. L'eau modifie la morphologie d'un sol et ameliore l'extraction des analytes polaires, mais diminue la vitesse d'extraction des composes apolaires. Des extractions a des temperatures elevees ( 100c) augmentent la diffusivite des analytes dans la matrice. Un ajustement de ces parametres est particulierement important si le temps de contact entre les polluants et la matrice est long (plusieurs mois). L'influence relative des divers parametres operatoires (temperature, pression, debit du fluide, methode de dopage, modificateurs, caracteristiques de la matrice etc. . . ) est etudiee. Une purification en-ligne des extraits sur silice ou florisil est evaluee. Des extractions fractionnees par ajustement de la densite du fluide sont realisables pour des polluants aqueux, enrichis sur un adsorbant. L'enrichissement sur l'adsorbant polymerique est etudie pour 42 polluants, en particulier des pesticides, dans les eaux de riviere de la region toulousaine. 34 composes peuvent etre doses a 1. 0 ppb et identifies plus surement grace a l'acquisition de leurs spectres uv. Les composes neutres tres polaires ou ioniques (substances acides) ne sont pas suffisamment retenus par l'adsorbant pour une identification a 1 ppb. La repetabilite des temps de retention et des surfaces chromatographiques est etudiee, ainsi que l'effet d'une filtration et d'une acidification de l'eau. Deux adsorbants, un charbon graphitise et un polymere polyvinylpyrrolidone ne permettent pas d'elargir la gamme de micropolluants analysables a 1 ppb. Les 2 techniques de preparation d'echantillons etudiees diminuent considerablement le temps et la consommation de solvants par rapport aux techniques d'extraction classiques. (soxhlet, extraction liquide-liquide)

Ce travail est un apport nouveau pour la préparation des échantillons biologiques en vue d'étudier la distribution des ions diffusibles par microscopie SIMS (Spectrométrie de Masse d'Ions Secondaires). Nous faisons une analyse comparative de cette technique par rapport aux autres méthodes d'imagerie analytique des distributions des ions inorganiques. La partie principale du travail concerne la mise au point d'un protocole d'observation d'échantillons congelés hydratés en SIMS dynamique sous bombardement d'oxygène neutre. Nous présentons une description du dispositif original permettant la mise en œuvre de tels échantillons avec un analyseur SIMS IMS 4f. Nous faisons une analyse critique de l'émission secondaire de Na, K, Mg et Ca et des ions de la glace dans les échantillons congelés. Nous discutons la mesure des coefficients de sensibilité relatifs par rapport à K après avoir montré que la référence aux ions de la glace était inappropriée pour les deux modes de congélation étudiés (" Plunge Freezing " et " High Pressure Freezing "). Nous présentons des images SIMS des distributions ioniques obtenues avec des échantillons congelés hydratés de lin, de camomille et de lierre. Nous avons mesuré les rapports de concentration des cations inorganiques dans les vacuoles des cellules d'hypocotyles de lin et montré qu'il existait une grande diversité dans les contenus ioniques vacuolaires, même de cellules adjacentes. Ce travail comporte également la mise au point d'un nouveau protocole de préparation des échantillons biologiques végétaux en phase vapeur. Nous décrivons une application de ce nouveau protocole à l'étude du rôle du bore chez les plantes par imagerie SIMS de la distribution des deux isotopes 10B et 11B dans des cellules d'hypocotyle de lin. Nous montrons que la méthode est applicable à la quantification simultanée des isotopes du bore chez les végétaux
This work is a new contribution to the preparation of biological samples to study the distribution of diffusible ions using SIMS microscopy (Secondary Ion Mass Spectrometry). We compare the capabilities of the SIMS technique for imaging the inorganic cations with those of the others analytical imaging techniques. The main part of the work was to develop a new method for the dynamic SIMS analysis of frozen-hydrated samples under Fast Atom Bombardment (neutral oxygen). We describe the new cold stage built especially for our IMS 4F SIMS analyser. We show that referencing to the ice characteristic ions in the measurement of the relative sensitivity factors of Na, K, Mg and Ca cations gave non reliable results whatever the freezing mode (Plunge Freezing or High Pressure Freezing). Sensitivity factors relative to K gave, in contrast, results of reasonable accuracy. We show images of the cations distributions obtained with frozen-hydrated samples of ivy camomile and flax. We measured the inorganic ions ratios in the vacuoles of the cells of flax hypocotyl. These measurements revealed a high diversity in ionic contains of vacuoles even of adjacent cells. We also describe a new sample preparation method of plant samples without contact with a liquid to prevent the loss of diffusible species (“vapour phase method”). We used this method to appraise the SIMS applicability to boron studies in plants. We show that the SIMS technique has the potential for the simultaneous quantitative detection of the 10B and 11B isotopes in plant cells

Ce travail est une approche par imagerie ionique analytique de l'implication des ions inorganiques dans la différenciation des fibres chez le lin. Le modèle expérimental est l'hypocotyle de lin. La cartographie semi-quantitative des ions Na+, Ca2+, K+ et Mg2+ a été réalisée par microscopie ionique analytique (MIA). Cette technique a été combinée aux techniques de microscopie photonique et électronique. Ce travail comporte une mise au point méthodologique de la préparation des échantillons végétaux en vue de l'immobilisation des ions diffusibles. Il est réalisé une approche critique des possibilités et des limites des deux méthodes de préparation que nous avons utilisées: la méthode par précipitation au pyroantimoniate et la méthode par cryosubstitution. Ce travail comporte également une analyse critique des images, par microscopie ionique à balayage, des distributions ioniques dans l'hypocotyle de lin et propose quelques améliorations instrumentales. La mise en évidence d'une augmentation du rapport des concentrations Na/Ca, d'une structuration dans la distribution du sodium au sein de la paroi secondaire des fibres ainsi que les effets marqués sur le développement des fibres, d'une carence en sodium suggèrent que cet ion pourrait être impliqué dans la différenciation des fibres chez le lin. L'étude, par radiographie par capture neutronique, de la microlocalisation du bore dans les différents tissus de l'hypocotyle suggère aussi un rôle possible de cet élément dans la cohésion du tissu fibreux

Ce mémoire présente une approche par Microscopie Ionique Analytique (MIA) des relations ioniques dans l'activité cambiale et la xylogénèse chez deux modèles expérimentaux : le pin sylvestre (pinus sylvestris L. ) Et le hêtre (fagus sylvatica L. ). Ce travail comporte des mises au point méthodologiques concernant la préparation des échantillons ligneux et les conditions instrumentales de l'analyse en MIA. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de préparation des échantillons végétaux, la fixation - déshydratation en phase vapeur, qui assure une bonne conservation des ultrastructures cellulaires et une bonne rétention des éléments diffusibles, comparativement à la technique de préparation par précipitation au pyroantimoniate. Les conditions de mise en oeuvre de l'analyseur ionique ont été spécifiquement établies sur notre matériel biologique et ont permis d'effectuer des analyses semi-quantitatives des distributions ioniques à l'échelle tissulaire et cellulaire. Les distributions saisonnières de Ca et de Na dans le tissu cambial et les tissus conducteurs voisins ont été étudiées sur des rameaux de hêtre et de pin sylvestre. La valeur du rapport de concentration Ca/Na est fortement corrélée à l'âge des organes caulinaires, un rapport Ca/Na élevé caractérisant les tissus des organes matures à activité cambiale intense, un rapport Ca/Na faible les tissu des organes jeunes à activité cambiale modérée. Nous avons montré qu'une augmentation temporaire du calcium dans le cambium et le liber est impliquée dans les processus conduisant à la reprise de l'activité cambiale chez le hêtre. La distribution de Ca, Na, Mg et K a été explorée lors des processus de maturation pariétale secondaire chez des plantules de hêtre se développant sur des milieux minéraux de composition variés. Lors d'une culture sur un milieu normal, les résultats obtenus par MIA ont montré que les cellules à épaississements pariétaux secondaires présentaient des teneurs en calcium beaucoup plus faibles que celles observées dans les cellules ne présentant que des parois primaires. Par contre, les teneurs en calcium dans les structures pariétales secondaires sont augmentées lorsque l'on fait varier les concentrations en sodium dans le milieu de culture (privation ou apport de Na). Dans le cas d'un apport de NaCl de 20 mM, les dépôts secondaires au niveau des parois des cellules du xylème secondaire et des fibres libériennes, sont absents. De plus, nous avons enregistré des augmentations importantes des teneurs en sodium, mais aussi en potassium, magnésium et calcium dans ces cellules où les dépôts pariétaux secondaires se seraient normalement formés. Bien que l'implication du calcium dans les processus de différenciation pariétale soit déjà connue, cette approche par MIA révèle une étroite interdépendance entre le calcium et les autres cations majeurs (sodium, potassium et magnésium) dans ces processus. L'ensemble de ces ions fait partie d'un système intégré, dans lequel des modifications d'un composant perturbe l'intervention des autres dans les mécanismes physiologiques étudiés.

Les puces microfluidiques sont des éléments clés pour la manipulation et l'analyse de solutions et d'échantillons biologiques. Elles facilitent les études aux échelles microscopiques et sont le fondement du concept de laboratoire sur puce, à la pointe des diagnostics médicaux. L'objectif de ces travaux de thèse a été d'explorer les possibilités fonctionnelles offertes par les architectures microfluidiques 3D, dans le cadre du développement d'outils diagnostiques reposant sur le tri, le marquage et la manipulation de cellules. Ces fonctions ont été validées sur des sous-populations de monocytes, qui sont des marqueurs de maladies inflammatoires. Afin de couvrir une chaîne cohérente d'étapes nécessaires au prétraitement des échantillons biologiques complexes, trois fonctions complémentaires ont été étudiées : le tri par taille par filtration hydrodynamique, le tri immunologique par séparation magnétique et le marquage sur puce par microparticules magnétiques. En vue d'effectuer des réactions de marquage (sondes fluorescentes ou microbilles magnétiques), un micro-mélangeur reposant sur la séparation et recombinaison de flux (transformation du boulanger) a été fabriqué et caractérisé. Des expériences de test des dispositifs pour les mélanges fluorescéine/eau et cellules/microbilles sont proposées, ainsi que les modèles analytiques et numériques associés. De nouvelles approches de tri par taille par filtration hydrodynamique ont été étudiées, en réalisant des structures 3D en "bypass", qui rendent possible une stratégie de mélange adaptée aux cellules et particules. Un modèle analytique des écoulements et de l'efficacité de tri et de mélange est proposé, ainsi qu'une caractérisation des dispositifs. Il a été de plus démontré que cette approche permettait également de réaliser la séparation d'espèces sub-micrométriques comme les microparticules sanguines. Tous les systèmes microfluidiques 3D ont été obtenus par une technique originale d'empilement (laminage) de films secs photosensibles, réduisant nettement le temps de micro-fabrication et compatibles avec les procédés standards. Cette technique de fabrication permet également l'intégration de micro-sources magnétiques dans les laboratoires sur puce par la réalisation de micro-bobines planaires sous des canaux microfluidiques. En couplant les effets des micro-bobines intégrées aux champs générés par des aimants extérieurs, nous apportons la preuve de concept de systèmes pour la séparation, la déviation et le piégeage de microbilles magnétiques. Les modèles (champs et force magnétiques) et la caractérisation des dispositifs seront présentés. Nous aborderons également la réalisation d'instrumentation spécifique (source de courant) pour l'actionnement des bobines, permettant le contrôle (temporel et en intensité) des champs magnétiques appliqués
Microfluidic chips are key elements for solutions and biological samples handling and analysis. They are enablers for micro-scale studies and are the cornerstone of lab on chips, at the cutting edge of medical diagnostics. The aim of this thesis work was to explore functional possibilities offered by 3D microfluidic architectures for the development of diagnostic tools relying on cell sorting, tagging and handling. These functions were investigated on monocytes sub-populations, which are markers for many inflammatory diseases. In order to cover a consistent series of necessary steps for complex biological samples pretreatment, three additional functions were studied: size sorting with hydrodynamic filtration, immuno-isolation by magnetic separation, and on-chip tagging with magnetic microparticles. To perform tagging reactions, a micromixer based on diffusion and flow split and recombination (baker's transform) was fabricated and characterized. Analytical (diffusion) and numerical (diffusion-advection) models are showed, together with test experiments on the devices for mixing reactions of fluorescein/water and cells/microbeads. New approaches of hydrodynamic filtration based size sorting were investigated by devising 3D bypass structures, that allow developing a mixing strategy (tagging reactions) suited to cells and particles. An analytical model for flows and sorting efficiency is introduced and compared to the devices characterization. Furthermore, it was shown that this approach also enables sorting of sub-micron particles (like blood microparticles). All 3D microfluidic systems were obtained thanks to an original dry film photoresist stacking (lamination) technique, dramatically reducing micro-fabrication time, even though compatible with standard process. This fabrication technique also enables magnetic micro-sources integration in lab on chips by realizing planar micro-coils underneath microfluidic channels. By coupling the effects of integrated micro-coils to the fields generated by external magnets, we brought the proof of concept of systems dedicated to trapping, focusing and separating (in flow) magnetic microbeads. Models (magnetic fields and forces) are described along with devices characterization. Conception of specific instrumentation (current source) for micro-coils actuation is also shown, as it allows time and intensity control over applied magnetic fields

Ce travail présente la conception, la fabrication et le test d’une unité de préparation d’échantillons utilisant une approche originale combinant les microfluidiques digitale et continue. L'avantage du préconditionnement ‘numérique’ est d’éviter l’introduction d'un réseau complexe de micro-vannes pour manipuler les échantillons, tandis que le format ‘continu’ en entrée et sortie de l’unité permet de coupler facilement ce dispositif avec des composants microfluidiques situés en amont et en aval. Nous avons travaillé sur deux procédés de fabrication. Le premier comprend un tricouche PSP (Pyrex-Silicium-Pyrex) pour lequel les interfaces liquide-solide sont de nature hydrophobe. Un procédé original de collage thermoplastique a été optimisé qui est suffisamment générique pour être utilisé dans d’autres procédés MEMS. Cependant, les résultats des caractérisations ont montré que bon nombre des échantillons ne pouvaient pas être manipulés. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un procédé bicouche PS (Pyrex-silicium) où les interfaces liquide-solide sont de nature superhydrophobe suite à une nanotexturation du silicium par traitement chimique. Grâce à la faible hystérésis, la résistance de friction et la pollution biologique sont largement réduites ce qui permet la manipulation de liquides complexes. Cette technologie a été employée pour fabriquer une unité microfluidique dédiée à de la préparation d’échantillons issus de bioprocédés à base de levures. Ces échantillons préparés sont ensuite analysés soit par une méthode immuno-enzymatique (ELISA) soit par une analyse par spectrométrie de masse précédée par une étape de séparation par électrophorèse capillaire
This work presents the concept, fabrication technology and characterization of a sample preparation unit using an original approach coupling channel-based continuous and electrowetting-on-dielectric (EWOD)-based digital microfluidics. The major advantage of ‘digital’ is the accurate control of multiple reagents without the need of a complex network of microvalves, while unprocessed and reprocessed ‘continuous’ format is ideal for coupling with upstream and downstream microfluidic devices. We have developed two generations. In our first work, a three layers PSP (Pyrex-Silicon-Pyrex) configuration with hydrophobic liquid-solid interfaces was employed. An original adhesive wafer bonding technique has been optimized that is sufficiently generic to be used in diverse MEMS processes. However, the preliminary characterization results have shown that most real samples used in bioprocessing could not be handled by this first prototype. To address this issue, we have developed a bilayer PS (Pyrex-Silicon) configuration with superhydrophobic liquid-solid interfaces made by chemical nanotexturation of silicon. Thanks to the low contact angle hysteresis of this superhydrophobic surface, the friction resistance and bio-adsorption on the surface were largely reduced allowing transport of real complex liquids. Finally, this prototype has been successfully used for preconditioning samples taken from a yeast bio-reactor and then delivered to analytical modules either an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or a capillary electrophoresis (CE) device coupled with a mass spectrometry (MS)

Depuis plus d’une vingtaine d’années, la problématique des perturbateurs endocriniens (PE) mobilise la communauté scientifique et les pouvoirs publics en raison des effets néfastes, avérés ou suspectés, de ces composés sur la santé de l’Homme. En particulier, la génération de données d’exposition interne (imprégnation) chez certaines sous-populations reconnues ou supposées plus sensibles (femmes enceintes, foetus, nourrissons) est à la fois une priorité et un domaine exigeant associé à une certaine rareté. De par leur diversité au plan structural et en termes de propriétés physico-chimiques, l’analyse simultanée d’un large panel de PE reste de nos jours un véritable challenge analytique. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail consistait à développer une méthode multi-résidus permettant l’isolement et la mesure simultanée de PE à effet estrogénique (13 PE au total). En premier lieu, une méthode de mesure par couplage chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) après dérivation chimique par le chlorure de dansyle a été développée. En second lieu, un support de type polymère à empreinte moléculaire (MIP phénolique) a été mis en oeuvre pour l’extraction simultanée du panel de PE ciblés à partir du milieu aqueux et de matrices biologiques de complexité croissante (urine, sérum, lait maternel). La stratégie développée sur MIP phénolique a été appliquée, après prévalidation, à un ensemble d’échantillons de sérum maternel, sérum du cordon et urine de nouveaux-nés. Enfin, un support de type colonne greffée par du récepteur aux estrogènes α (colonne ERα) a été appliqué pour l’isolement simultané des composés ciblés à partir d’un milieu aqueux
For over twenty years, the issue of endocrine disruptors (EDs) mobilizes the scientific community and public authorities because of the negative effects, actual or suspected, of these compounds on human health. In particular, the generation of internal exposure data (impregnation) in some subpopulations, which are recognized or assumed as being sensitive (pregnant women, fetuses, infants), is both a priority and a demanding field associated with a certain rarity. Considering their structural diversity and with regards to their physicochemical properties, the simultaneous analysis of a large panel of EDs remains a real analytical challenge. In this context, the objective of this work was to develop a multi-residue method for the simultaneous isolation and measurement of estrogenic endocrine disruptors (13 EDs in total). Firstly, an analysis method using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) after chemical derivatisation by dansyl chloride was developed. Secondly, a molecularly imprinted polymer (MIP with phenolic imprint) was implemented for the simultaneous extraction of the targeted EDs from aqueous medium and biological matrices of increasing complexity (urine, serum, breast milk). The strategy developed on MIP was applied, after validation, to a set of samples (maternal serum, cord serum and urine of newborns). Finally, a column support grafted with estrogen receptor α (ERα column) was applied for the simultaneous isolation of the targeted compounds from an aqueous medium

Les stratégies de protéomique quantitative sans marquage sont très attractives dans le domaine de la recherche de biomarqueurs de pathologies. Cependant, elles requièrent une pleine maîtrise du schéma analytique et de sa répétabilité. Plus particulièrement, la préparation d’échantillons nécessite d’être suffisamment répétable pour ne pas impacter la qualité et la fiabilité des résultats. Les objectifs de cette thèse étaient de développer et d’optimiser des méthodes analytiques pour la protéomique quantitative, en particulier pour l’étape de préparation d’échantillons. Ainsi, un protocole innovant, simple, rapide et permettant l’analyse quantitative sans marquage d’un grand nombre d’échantillons avec une haute répétabilité a été développé et optimisé : le « Tube-Gel ». Par ailleurs, des préparations d’échantillons adaptées à différentes matrices biologiques pour la recherche de biomarqueurs ont été élaborées. Les méthodes mises au point et leur application ont permis de proposer des candidats biomarqueurs pour plusieurs pathologies : le glioblastome, les lymphomes B diffus à grandes cellules, et les complications survenant sur les greffons rénaux
Label-free quantitative proteomics strategies are very attractive for diseases biomarkers researches. These approaches require the full control and the repeatability of the analytical workflow. In particular, the sample preparation has to be repeatable enough to ensure the quality and reliability of the results. Objectives of this work were to optimize and develop analytical methods for quantitative proteomics, with a special focus on the sample preparation step. Thus, an innovative, easy and fast protocol allowing the analysis of high sample numbers with high repeatability was developed and further optimized: the “Tube-Gel” protocol. Besides,sample preparations adapted to a variety of biological matrices were developed for the search of biomarkers. The developed methods and their application allowed the identification of potential biomarkers for a variety of diseases: glioblastoma, diffuse large B-cell lymphomas and renal transplants failures

Les vésicules extracellulaires (EVs) apparaissent depuis une dizaine d'années comme de nouveaux biomarqueurs à fort potentiel pour des applications de biopsie liquide. En effet, les EVs portent la signature de leurs cellules émettrices, par le transport de matériel génétique et protéique cellulaire, qui peut être exploité comme outil de diagnostic précoce. L’une des principales limitations actuelles à l'utilisation clinique des EVs est la difficulté à extraire ces nano-objets à partir de biofluides complexes et à standardiser les protocoles de préparation d'échantillon. En effet, de nouvelles technologies sont requises pour effectuer un isolement efficace, bas coût et rapide de sous-populations d'EVs, sans altérer leur intégrité et à partir de faibles volumes d'échantillon. La technique microfluidique de Déplacement Latéral Déterministe (DLD) apparaît comme une des technologies prometteuses pour atteindre ces performances grâce à une purification passive et sans marquage. Les dispositifs de DLD mettent en oeuvre un réseau de piliers générant un tri en taille des particules, et dont les paramètres géométriques permettent de contrôler précisément le diamètre de séparation. Parmi les nombreuses applications de cette technologie dans le secteur biomédical, aucune ne permet pour le moment de réaliser l'extraction complète d'EVs directement à partir du biofluide d'intérêt, sans étapes de purification intermédiaires par centrifugation par exemple. Dans cette perspective, nos développements technologiques ont pour but d'améliorer la fiablilité, l'efficacité et l'intégration des dispositifs de DLD. A partir d'études numériques et expérimentales, nous proposons ici de nouveaux modèles pour anticiper au mieux le comportement des particules lors de la conception de réseaux de DLD. Par ailleurs, dans une approche orientée système, nous proposons également un packaging fluidique des dispositifs de DLD. Plusieurs étapes de tri étant généralement requises pour la purification d’échantillons biologiques, nos développements portent également sur la façon d’interconnecter ces modules au sein d'une configuration en série. Deux applications biologiques sont adressées et démontrent la versatilité de la technologie de DLD : l'isolement de bactéries E. coli à partir de prélèvements sanguins humains - en vue du diagnostic du sepsis - et l'extraction d'EVs dans des milieux de culture cellulaires - avec en perspective la détection d'EVs spécifiques par biopsie liquide. L'étape de préparation d'échantillon ne peut être dissociée de l'étape de caractérisation. C'est pourquoi, l'isolement des EVs devra dans un second temps être couplé à leur analyse au sein d'un dispositif intégré, portable et autonome, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives vers l'application clinique des recherches actuelles sur les EVs
Over the past decades, Extracellular Vesicles (EVs) have demonstrated strong potential as new biomarkers for liquid biopsy. Indeed, since EVs are fingerprints of parent cells, they can be exploited as early diagnostic tools. However, owing to their small size and high heterogeneity, EVs are challenging to extract from biofluids. In particular, reproducible and standardized protocols are required to perform fast, efficient, and cost-effective preparation of undamaged EV subpopulations from limited sample volumes. Deterministic Lateral Displacement (DLD) appears to be a promising microfluidic technology for this preparation by means of passive and label-free separation. DLD performs size-based separation of particles around a critical diameter that can be fine-tuned according to design parameters in an array of micropillars. Across the numerous biotechnological applications of DLD, none has yet successfully performed the complete extraction of EVs from unprocessed biofluids. This is the underlying motivation of this thesis, which outlines technological enhancements that make DLD separation more predictable, efficient, and easy-to-integrate. Based on both numerical and experimental developments, predictive models are proposed in order to anticipate particle behavior and to help in the design of efficient DLD devices. In addition to the optimization of single DLD devices, this thesis also addresses the issue of system integration. An innovative approach of serial connection between DLD modules is proposed to address the sequential sorting of particles from a complex biofluid and ensure that there is no loss of function of individual DLD devices when operated alone or in series. Two biological applications illustrate the potential of DLD-based sample preparation systems: the isolation of E. coli bacteria from human blood samples for sepsis diagnostics and the extraction of EVs from cell culture media with the perspective of liquid biopsy applications. And as sample preparation cannot be dissociated from detection or characterization, this thesis moreover highlights the potential integration of DLD in an all-in-one microfluidic device for both sample preparation and analysis of extracted EVs. Such a portable and autonomous device could overcome some of the current limitations with regard to the clinical use of EVs

Ce mémoire de thèse décrit des développements de méthodes MALDI-MS pour la caractérisation de polymères synthétiques, ainsi que les études plus fondamentales menées pour rationaliser des résultats inattendus et contribuant à une meilleure compréhension du processus d’ionisation MALDI. Synthétisés par polymérisation radicalaire contrôlée, les polymères étudiés ont des terminaisons fragiles qui ne survivent pas à l’étape d’ionisation. Une approche multidimensionnelle, combinant la spectrométrie de masse (MS et MS/MS haute résolution) et la spectrométrie de mobilité ionique, a permis de caractériser les nouveaux bouts de chaînes générés en source dans le cas du polystyrène. Dans le cas du poly(4-vinylpyridine) (P4VP), un protocole expérimental plus spécifique a dû être développé pour s’affranchir de la propension des unités monomériques à interagir avec la matrice. Ces fortes interactions se manifestent par la détection de complexes P4VP/matrice au sein desquels la nature des liaisons (covalentes vs non covalentes) change en fonction de la pression régnant dans la source MALDI. Dans une source opérant à une pression relativement élevée, ces interactions sont à l’origine de l’incorporation d’une molécule de matrice au bout des chaînes de P4VP. Ce cas de MALDI réactif a été rationalisé par un modèle basé sur un couplage radicalaire. Dans cette source d’ionisation, la forte densité de la plume MALDI serait également à l’origine de la production atypique d’espèces doublement chargées à partir de polymères synthétiques de faible taille (Mn < 5 kDa). Ces résultats suggèrent que la cationisation des polymères synthétiques en MALDI résulte de transferts de charges en phase gazeuse
This thesis manuscript describes methodological developments in MALDI-MS to characterize synthetic polymers, as well as associated fundamental studies carried out to rationalize unexpected results, allowing new insights in the MALDI process. Studied samples were synthesized by controlled radical polymerization and contained fragile end-groups that do not survive the ionization step. A multidimensional approach, combining high resolution mass spectrometry (MS and MS/MS) with ion mobility spectrometry, allowed a full characterization of in-source newly formed terminations in the case of polystyrene. For poly(4-vinylpyridine), a more specific experimental protocol was required to overcome the propensity of monomeric units to interact with matrix molecules. These strong interactions were revealed by P4VP/matrix complexes in which the type of bonds (covalent vs non covalent) changes with the MALDI source pressure. Using a source operated at quite high pressure, a reactive MALDI phenomenon was evidenced to generate a new P4VP species in which one matrix molecule was incorporated in the chain end. A model involving a radical coupling process was proposed to account for the formation of these covalent adducts. The high density of the MALDI plume in such "high pressure" source would also be responsible for the unexpected formation of doubly charged species for small synthetic polymers (Mn < 5 kDa). These results are consistent with charge transfers in the gas phase as the process for cation adduction of synthetic polymers in MALDI

Les recherches sur les nanocristaux semiconducteur (NCs) ont conduit à des résultats scientifiques fascinants, spécialement pour l'application en dispositifs optoelectroniques. Afin de répondre à certaines exigences comme des coûts mineurs, des gains d'efficacité, des composants respectueux de l'environnement, etc., des nouvelles méthodes sont explorées: dans les procédés en solution, dans l'ingénierie de bande et des niveaux d'énergie. En particulier, la méthode de synthèse peut influencer les propriétés optoélectroniques. Par conséquent, une meilleure compréhension des facteurs complexes pendant la synthèse entraînera une amélioration des performances.La microscopie électronique avancée fournit un moyen précis de recueillir des informations sur la morphologie, la structure cristalline et la composition chimique des matériaux avec une résolution spatiale au niveau atomique. La première partie de cette thèse traite de la synthèse et de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique à transmission en haute résolution (HRTEM).La deuxième partie traite du mécanisme de croissance des NCs Cu2ZnSnS4 synthétisés par une méthode colloïdale. La morphologie et la stoechiométrie des intermédiaires de réaction extraits après différents intervalles de temps sont déterminés par HRTEM et analyse dispersive en énergie (EDS).Deux méthodes complémentaires, la diffraction par nanofaisceau d’électrons en précession (NPED) et la microscope électronique en transmission par balayage à haute résolution avec imagerie en champ sombre avec détecteur annulaire à grand angle (HRSTEM-HAADF) permettent une profonde caractérisation de la structure cristalline.En outre, la structure cristalline de NCs CsPbBr3 est résolue avec simulations de STEM-HAADF. Cet approche peut différencier entre structures cristallines cubiques et orthorhombiques, impossible avec techniques de diffraction traditionnelles. Enfin, l'influence des méthodes de synthèse sur la morphologie et sur la structure cristalline de NCs CuFeS2 pour applications dans le domaine de la thermoélectricité est analysée par HRTEM
The investigations of semiconductor nanocrystals (NCs) led to fascinating scientific results in optoelectronic devices. In order to fulfill certain requirements, i.e. cheaper costs, higher efficiencies, environmental friendly components etc., new methods are explored in solution-processing, band gap and energy level engineering. Particularly, the method of synthesis can alter the optoelectronic properties. Therefore, a better understanding of the intricate factors during synthesis will lead to improved performances. Advanced electron microscopy provides a precise way to gather information about morphology, crystal structure and chemical composition of materials with a spatial resolution down to the atomic level. The first part of this thesis deals with the optimization of the synthesis and sample preparation for high resolution transmission electron microscopy (HRTEM).The second part deals with the growth mechanism of Cu2ZnSnS4 NCs synthesized by a colloidal method. The morphology and stoichiometry of the samples extracted after different time intervals are characterized by HRTEM and electron dispersion spectroscopy (EDS). Two complementary methods, Nanobeam Precession Electron Diffraction (NPED) and High Resolution Scanning Transmission Electron Microscopy by High Angle Annular Dark-Field Imaging (HRSTEM-HAADF), provide an in-depth crystal structure characterization.Moreover, the crystal structure of CsPbBr3 NCs is solved by probing STEM-HAADF simulations. This approach is able to differentiate cubic and orthorhombic crystal structures, which is otherwise impossible by diffraction techniques. Finally, the influence of synthesis methods on the morphology and crystal structure of CuFeS2 NCs is investigated by HRTEM for thermoelectric applications

Ce travail de thèse s’est focalisé sur le développement des approches génériques de spectrométrie de masse (MS) pour la quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) et de leurs produits dérivés dans des études précliniques. Premièrement, le développement des protocoles de préparation d’échantillons basée sur la digestion directe à partir de sérum ou comportant une étape d’immuno-précipitation spécifique par anticorps a permis la quantification des mAbs couvrant une large gamme d'étalonnage de cinq ordres de grandeur. En outre, l'emploi de peptides provenant de la région constante du mAb a démontré la polyvalence de telles approches génériques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS/MS). Deuxièmement, les instruments de MS à haute résolution (HRMS) ont étés évalués dans le cadre de cette thèse en tant qu'alternative aux spectromètres de masse de type triple quadripôle traditionnellement utilisés pour l’analyse bottom-up quantitative. L’avantage majeur de l’intégration des analyseurs de HRMS a été associé à la possibilité de l’analyse quantitative simultanée des mAbs et leurs produits associés directement au niveau de la protéine fournissant un niveau d'informations bien au-delà de celui obtenu avec des approches bottom-up. Par conséquent, l’apport essential de la HRMS pour les analyses qualitative et quantitative des protéines thérapeutiques de type mAbs et produits associés a été démontré dans cette thèse
This PhD thesis focused on the development of generic mass spectrometry (MS)-based workflows for monoclonal antibody (mAb)-related therapeutic protein quantification in pre-clinical species. First, the development of bottom-up sample preparation protocols either based on direct serum digestion or immuno-capture allowed mAb-related therapeutic protein quantification over five orders of magnitude whereas the employment of peptides from the constant region of the mAb demonstrated the versatility of such generic liquid chromatography tandem MS (LC-MS/MS)-based approaches. Second, high-resolution MS (HRMS) instruments were evaluated as an alternative to triple quadrupole mass analyzers, traditionally utilized for bottom-up mAb quantification by LC-MS/MS. The major benefit of HRMS incorporation into the workflow was associated with the possibility to quantify simultaneously mAb-related therapeutic proteins directly at an intact level, providing an information level far beyond the one obtained with bottom-up LC-MS/MS methodologies. Hence, the pivotal role of HRMS for the qualitative and quantitative analyses of mAb-related therapeutic proteins was further outlined throughout this doctoral work

Ce mémoire de thèse décrit des développements de méthodes MALDI-MS pour la caractérisation de polymères synthétiques, ainsi que les études plus fondamentales menées pour rationaliser des résultats inattendus et contribuant à une meilleure compréhension du processus d’ionisation MALDI. Synthétisés par polymérisation radicalaire contrôlée, les polymères étudiés ont des terminaisons fragiles qui ne survivent pas à l’étape d’ionisation. Une approche multidimensionnelle, combinant la spectrométrie de masse (MS et MS/MS haute résolution) et la spectrométrie de mobilité ionique, a permis de caractériser les nouveaux bouts de chaînes générés en source dans le cas du polystyrène. Dans le cas du poly(4-vinylpyridine) (P4VP), un protocole expérimental plus spécifique a dû être développé pour s’affranchir de la propension des unités monomériques à interagir avec la matrice. Ces fortes interactions se manifestent par la détection de complexes P4VP/matrice au sein desquels la nature des liaisons (covalentes vs non covalentes) change en fonction de la pression régnant dans la source MALDI. Dans une source opérant à une pression relativement élevée, ces interactions sont à l’origine de l’incorporation d’une molécule de matrice au bout des chaînes de P4VP. Ce cas de MALDI réactif a été rationalisé par un modèle basé sur un couplage radicalaire. Dans cette source d’ionisation, la forte densité de la plume MALDI serait également à l’origine de la production atypique d’espèces doublement chargées à partir de polymères synthétiques de faible taille (Mn < 5 kDa). Ces résultats suggèrent que la cationisation des polymères synthétiques en MALDI résulte de transferts de charges en phase gazeuse
This thesis manuscript describes methodological developments in MALDI-MS to characterize synthetic polymers, as well as associated fundamental studies carried out to rationalize unexpected results, allowing new insights in the MALDI process. Studied samples were synthesized by controlled radical polymerization and contained fragile end-groups that do not survive the ionization step. A multidimensional approach, combining high resolution mass spectrometry (MS and MS/MS) with ion mobility spectrometry, allowed a full characterization of in-source newly formed terminations in the case of polystyrene. For poly(4-vinylpyridine), a more specific experimental protocol was required to overcome the propensity of monomeric units to interact with matrix molecules. These strong interactions were revealed by P4VP/matrix complexes in which the type of bonds (covalent vs non covalent) changes with the MALDI source pressure. Using a source operated at quite high pressure, a reactive MALDI phenomenon was evidenced to generate a new P4VP species in which one matrix molecule was incorporated in the chain end. A model involving a radical coupling process was proposed to account for the formation of these covalent adducts. The high density of the MALDI plume in such "high pressure" source would also be responsible for the unexpected formation of doubly charged species for small synthetic polymers (Mn < 5 kDa). These results are consistent with charge transfers in the gas phase as the process for cation adduction of synthetic polymers in MALDI