Academic literature on the topic 'Primary Hyperoxaluria Type I (PHI)'

Primary Hyperoxaluria Type 1 (PH1) is a rare autosomal recessive disorder characterized by the deposition of insoluble calcium oxalate crystals at first in the kidneys and urinary tract and then in the whole body. PH1 is caused by the deficiency of human liver peroxisomal alanine:glyoxylate aminotransferase (AGT). AGT is a pyridoxal 5'-phosphate (PLP)-dependent enzyme, which converts glyoxylate to glycine, thus preventing glyoxylate oxidation to oxalate and calcium oxalate formation. Only two curative therapeutic approaches are currently available for PH1: the administration of pyridoxine (PN), a precursor of PLP, which is only effective in a minority of patients (25- 35%), and liver transplantation, a very invasive procedure. AGT is encoded by the AGXT gene, which is present in humans as two polymorphic forms: the major allele (encoding AGT-Ma) and the minor allele (encoding AGT-Mi). PH1 is a very heterogeneous disease with respect to the clinical manifestations, the response to treatment and the pathogenic mechanisms. In fact, more than 200 pathogenic mutations have been identified so far and the molecular mechanisms by which missense mutations cause AGT deficiency span from functional, to structural and to subcellular localization defects or to a combination of them. Several lines of evidence at both molecular and cellular level, indicate that many disease-causing missense mutations interfere with AGT dimer stability and/or aggregation propensity. However, neither the dimerization nor the aggregation process of AGT have been analyzed in detail. Therefore, we engineered a mutant form of AGT stable in solution in the monomeric form and studied its biochemical properties and dimerization kinetics. We found that monomeric AGT is able to bind PLP and that the coenzyme stabilizes the dimeric structure. Moreover, the identification of key dimerization hot-spots at the monomer-monomer interface allowed us to unravel the mechanisms at the basis of the aberrant mitochondrial mistargeting of two of the most common PH1-causing variants. We also elucidated the molecular and cellular consequences of the pathogenic mutations R36H, G42E, I56N, G63R and G216R, involving residues located at the dimer interface, and tested their in-vitro responsiveness to the treatment with PN. The latter results allowed us to suggest a possible correlation between the structural defect of a variant and its degree of responsiveness to PN. Finally, by combining bioinformatic and biochemical approaches, we analyzed in detail the tendency of AGT to undergo an electrostatically-driven aggregation. We found that the polymorphic changes typical of the minor allele have opposite effect on the aggregation propensity of the protein, and we predicted the possible effect/s of pathogenic mutations of residues located on the AGT surface. Overall, the results obtained allow not only to better understand PH1 pathogenesis, but also to predict the response of the patients to the available therapies as well as to pave the way for the development of new therapeutic strategies.

L’iperossaluria primaria di tipo 1 (PH1) è una malattia autosomica recessiva rara caratterizzata dal deposito di cristalli insolubili di ossalato di calcio prima nei reni e nel tratto urinario ed in seguito, in assenza di un appropriato trattamento, in tutto il resto del corpo. PH1 è causata da un deficit funzionale di alanina:gliossilato aminotransferasi umana (AGT), un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP) dipendente che converte il gliossilato in glicina, prevenendo in tal modo la ossidazione del gliossilato ad ossalato e quindi la formazione di cristalli insolubili di ossalato di calcio. L’AGT normale è codificato dal gene AGXT che esiste nella popolazione umana in 2 varianti polimorfiche: l’allele maggiore (AGT-Ma) e l’allele minore (AGT-Mi), quest’ultimo caratterizzato da due mutazioni puntiformi, che portano alla sostituzione della prolina 11 con una leucina e della isoleucina 340 con una metionina, e da una duplicazione di 74 paia di basi nell’introne 1. Sebbene la presenza dell’allele minore non sia in sè patogenica, questa rende però l’enzima più suscettibile all’effetto di alcune mutazioni che non sarebbero patogeniche se associate all’allele minore. Perciò, c’è un grande interesse nel definire le proprietà dell’AGT-Mi, in quanto punto di partenza per capire il meccanismo molecolare alla base del sinergismo tra l’AGT-Mi e le mutazioni patogeniche che cosegregano con esso. In questo lavoro, tramite un approccio “in vitro” su proteine purificate, sono stati studiati gli effetti delle 2 mutazioni combinate polimorfiche proprie dell’allele minore, sulle caratteristiche biochimiche dell’AGT, così come di 2 mutazioni che provacono PH1 se associate all’allele minore: F152I e G170R. I dati ottenuti hanno evidenziato che: 1) AGT-Mi mostra caratteristiche spettroscopiche, parametri cinetici, e affinità per il PLP simili a quelle di AGT-Ma. Tuttavia, la sua struttura dimerica è caratterizzata da una bassa resistenza allo stress sia chimico che termico. Questi effetti sembrano essere dovuti alla mutazione P11L dal momento che tale variante mostra un profilo di denaturazione comparabile con quello di AGT-Mi; 2) La mutazione patgenica F152I porta ad una diminuzione di ca. 200 volte nell’affinità dell’AGT per la piridossamina 5-fosfato (PMP) e quando associata all’allele minore, anche ad una inattivazione tempo dipendente ed ad una aggregazione a temperatura fisiologica.; 3) La mutazione patogenica G170R non incide né sulle proprietà spettroscopiche né su quelle cinetiche dell’AGT-Mi in condizioni native. D’altro canto, rende la struttura dimerica dell’apoG170R-Mi più sucettibile alla dissociazione rispetto al corrispondente apoAGT-Mi. Riassumendo i dati ottenuti: (i) rivelano le differenze tra AGT-Ma e AGT-Mi; (ii) gettano luce sul difetto molecolare associato alle varianti F152I-Mi e G170R-Mi; (iii) permettono di fare ipotesi sulla risposta alla terapia con piridossina osservata nei pazienti recanti queste 2 mutazioni.<br>Primary hyperoxaluria type 1 (PH1) is a rare autosomal recessive disorder characterized by the deposition of insoluble calcium oxalate crystals at first in the kidneys and urinary tract and then, in the absence of appropriate treatments, in the whole body. PH1 is caused by the deficiency of human liver peroxisomal alanine:glyoxylate aminotransferase (AGT), a pyridoxal 5'-phosphate (PLP)-dependent enzyme that converts glyoxylate to glycine, thus preventing glyoxylate oxidation to oxalate and therefore the formation of calcium oxalate. Normal human AGT is encoded by the AGXT gene that exists in human populations in two polymorphic forms: the major allele (AGT-Ma) and the minor allele (AGT-Mi), which is characterized by two point mutations, leading to the Pro11Leu and Ile340Met substitutions, and a 74 bp-duplication in intron 1. Although the presence of the minor allele polymorphism is not pathogenic “per se”, it makes AGT more susceptible to the effect of some PH1-causing mutation that are expected to be not pathogenic when associated with the major allele. Thus, there is a great interest in defining the properties of AGT-Mi, as the base to unravel the molecular mechanism underlying the synergism between AGT-Mi and the pathogenic mutations that cosegregate with it. In this work, by an “in vitro” approach on purified proteins, we studied the effects on the biochemical features of AGT of the two combined polymorphic mutations typical of the minor allele as well as of two PH1-causing mutations associated with the minor allele, Phe152Ile and Gly170Arg. The data obtained have shown that: 1) AGT-Mi displays spectral features, kinetic parameters, and PLP binding affinity similar to those of AGT-Ma. However, its dimeric structure is characterized by a low resistance to both chemical and thermal stress. This appears to be due to the P11L mutation since the P11L variant exhibits a denaturation pattern comparable to that of AGT-Mi; 2) The PH1-causing F152I mutation leads to a ~200 fold decrease in the affinity of AGT for pyridoxamine 5’-phosphate and, when associated with the minor allele polymorphism, to a time-dependent inactivation and aggregation at physiological temperature; 3) The pathogenic mutation G170R does not affect neither the spectroscopic nor the kinetic properties of AGT-Mi under native conditions. However, it makes the dimeric structure of apoG170R-Mi more susceptible to dissociation than the corresponding apoAGT-Mi. Overall, the obtained data: (i) reveal the biochemical differences between AGT-Ma and AGT-Mi; (ii) allow to shed light on the molecular defect associated with the F152-Mi and the G170R-Mi variants; (iii) permit to speculate on the responsiveness to pyridoxine therapy of the patients bearing these mutations.

Iperossaluria Primaria tipo I ( PH1 ) è una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata da un elevato livello di ossalato nelle urine , che provoca la formazione di cristalli insolubili di ossalato di calcio dapprima nei reni e delle vie urinarie e , in assenza di un adeguato trattamento , in tutto il corpo . PH1 è causata da un deficit dell'enzima epatico Alanina: Gliossilato aminotransferasi ( AGT ). AGT è un enzima piridossal 5' - fosfato perossisomi ( PLP )-dipendente che converte il gliossilato in glicina, impedendo così l'ossidazione gliossilato di ossalato e la successiva formazione di ossalato di calcio. AGT è codificata dal gene AGXT, che presenta nell'uomo, due forme polimorfe : l'allele maggiore (codifica AGT - Ma) e l'allele minore (codificante AGT - Mi). Finora sono state identificate più di 150 mutazioni associate a PH1. Diversi studi hanno consentito interessanti progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari per cui ciascuna mutazione conduce alla carenza di AGT . Tuttavia, molto spesso i pazienti affetti da PH1 sono eterozigoti composti e il loro fenotipo enzimatico potrebbe dipendere da fenomeni di complementazione interallelic ( IC ). Fino ad ora , la patogenesi di PH1 è stata studiata solo tramite approcci che mimano la situazione cellulare di pazienti omozigoti , mentre il fenotipo clinico relazione genotipo- fenotipo enzimatico di pazienti eterozigoti composti è completamente sconosciuto . Durante il mio dottorato di ricerca , ho condotto studi volti a chiarire il fenotipo enzimatico legata alla mutazione S81L su AGT -Ma , concernente un residuo di interazione con il PLP , sia in omozigosi sia in eterozigosi composta con la mutazione G170R , la variante più comune in AGT – Mi. G170R è nota per determinare il mistargeting mitocondriale di AGT senza alterare le proprietà funzionali dell'enzima stesso. Utilizzando un vettore di espressione eucariotico bicistronico abbiamo dimostrato che ( i) S81L -Ma ha una significativa ocalizzazione perossisomale, e ( ii ) l'interazione dei monomeri S81L e G170R si verifica nella cellula formando un eterodimero G170R-Mi/S81L-Ma, che viene importato in perossisomi e presenta una funzionalità migliorata rispetto agli enzimi parentali . Questi dati , integrati con i risultati della caratterizzazione biochimica dell' eterodimero purificato ottenuti da un vettore di espressione procariotico, sostengono l'ipotesi di un IC positiva tra i monomeri S81L e G170R. Questo studio rappresenta la prima indagine della patogenesi della PH1 in pazienti eterozigoti composti a livello molecolare. PH1 è una malattia molto difficile da curare. Solo due approcci terapeutici sono attualmente a disposizione: la somministrazione di piridossina , un precursore di PLP, che è efficace solo in una minoranza di pazienti, e il trapianto di fegato, una procedura molto invasiva . Ne consegue che lo sviluppo di nuove strategie di trattamento , meno invasive ed efficaci per tutti i pazienti , sarebbe altamente desiderabile. Poiché PH1 è originata dal deficit di un singolo enzima , la possibilità di ripristinare la capacità catalitica degli epatociti somministrando enzima esogeno è una prospettiva intrigante. Uno dei problemi principali per lo sviluppo di una terapia somministrazione enzima è l'ingresso intracellulare della proteina esogena. Durante il mio dottorato di ricerca ho utilizzato un duplice approccio per ottenere una forma AGT in grado di attraversare il plasma membrana: ( i) la costruzione di una proteina di fusione tra AGT e la Tat peptide sfruttando le capacità di attraversamento di membrana del domino Tat , e ( ii ) la coniugazione di AGT con un nanocarrier polimerico in grado di trasportare l'enzima funzionale attraverso la membrana plasmatica. Entrambe le strategiehanno dimostrato di essere efficaci nella trasduzione di AGT in un modello cellulare permettendo di ripristinare la capacità di disintossicazione gliossilato senza alterare significativamente le proprietà strutturali e funzionali di AGT. Questi risultati possono essere considerati un incoraggiante punto di partenza per lo sviluppo di una terapia somministrazione enzima per PH1.<br>Primary Hyperoxaluria Type I (PH1) is a rare autosomal recessive disorder characterized by a high level of oxalate in the urine, which in turn results in the formation of insoluble calcium oxalate crystals at first in the kidneys and urinary tract and then, in absence of an appropriate treatment, in the whole body. PH1 is caused by the deficiency of human liver alanine:glyoxylate aminotransferase (AGT), a peroxisomal pyridoxal 5'-phosphate (PLP)-dependent enzyme. AGT detoxifies glyoxylate to glycine, thus preventing glyoxylate oxidation to oxalate and the subsequent calcium oxalate formation. AGT is encoded by the AGXT gene, which presents, in humans, two polymorphic forms: the major allele (encoding AGT-Ma) and the minor allele (encoding AGT-Mi). At the time of writing, more than 150 mutations associated with PH1 have been reported and several studies allowed for interesting progresses in the understanding of the molecular mechanisms by which each mutation leads to AGT deficiency. However, quite often patients affected by PH1 are compound heterozygous and their enzymatic phenotype could depend on interallelic complementation (IC) effects. Until now, the pathogenesis of PH1 has been only studied by approaches mimicking homozygous patients, while the genotype-enzymatic phenotype-clinical phenotype relationship of compound heterozygous patients is completely unknown. During my PhD, we elucidated the enzymatic phenotype linked to the S81L mutation on AGT-Ma, concerning a PLP binding residue, and how it changes when the most common mutation G170R on AGT-Mi, known to cause AGT mistargeting without affecting the enzyme functional properties, is present in the second allele. By using a bicistronic eukaryotic expression vector we demonstrated that (i) S81L-Ma has a significant peroxisomal localization, and (ii) the interaction of the S81L and G170R monomers occurs in the cell yielding the G170R-Mi/S81L-Ma heterodimer, which is imported into peroxisomes and exhibits an enhanced functionality with respect to the parental enzymes. These data, integrated with the biochemical features of the recombinant purified heterodimer compared with those of the homodimeric counterparts obtained by a dual vector prokaryotic expression strategy, provided evidence for a positive IC between the S81L and G170R monomers. This study represents the first investigation of the pathogenesis of PH1 in compound heterozygous patients at molecular level. PH1 is a very difficult-to-treat disease. Only two curative therapeutic approaches are currently available: the administration of pyridoxine, a precursor of PLP that is only effective in a minority of patients, and liver transplantation, a very invasive procedure. It follows that the development of new treatment strategies, less invasive and effective for all the patients, would be highly desirable. In this regard, since PH1 originates from the deficit of a single enzyme, the opportunity to restore the catalytic pool of the hepatocytes by administering exogenous enzyme is an intriguing perspective. One of the major issues for the development of an enzyme administration therapy is the intracellular delivery of the exogenous protein. During my PhD, to obtain an AGT form able to cross the plasma membrane, a dual approach was used: (i) the construction of a fusion protein between AGT and the Tat peptide exploiting the membrane crossing capabilities of the Tat moiety, and (ii) the conjugation of AGT with a polymeric nanocarrier able to deliver the functional enzyme across the plasma membrane. Both strategies did not significantly alter the structural and functional properties of AGT and proved to be effective in transducing active AGT into a cellular disease model and in restoring their glyoxylate detoxification ability. These results can be considered an encouraging starting point for the development of an enzyme administration therapy for PH1.