Dissertations / Theses: 'ProteÃna recombinante'

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Oliveira, Raquel Sombra BasÃlio de. "ExpressÃo heterÃloga, caracterizaÃÃo cristalogrÃfica e anÃlise funcional de uma osmotina antifÃngica de Calotropis procera." Universidade Federal do CearÃ, 2014. http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=13438.

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Abstract:

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico
Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna purificada a partir do lÃtex da planta Calotropis procera foi purificada e sua caracterizaÃÃo bioquÃmica revelou ser esta uma proteÃna similar a osmotinas e que a mesma, denominada de CpOsm, exibia forte atividade contra fungos fitopatogÃnicos. Neste trabalho foram investigados sistemas de expressÃo heterÃlogos, procarionte e eucarionte, com o objetivo de estabelecer sistemas de expressÃo que pudessem produzir CpOsm recombinante e avaliar se sua expressÃo produzia a proteÃna ativa, com aÃÃo antifÃngica. A partir do sequenciamento do cDNA da CpOsm e ensaios de cristalizaÃÃo desenvolvidos com a proteÃna purificada do lÃtex foi possÃvel estudar suas caracterÃsticas moleculares. Para a expressÃo em E. coli foi utilizado o vetor pET303CT-His e P. pastoris o vetor pPICZαA. A proteÃna recombinante (rCpOsm) expressa no sistema procarionte nÃo foi secretada para o meio externo, acumulando-se no espaÃo intracelular, formando corpos de inclusÃo, nos quais a proteÃna estava insolÃvel. Embora a insolubilidade represente um passo limitante, este sistema de expressÃo pode ser muito interessante para a produÃÃo quantitativa de rCpOsm para outros fins como produÃÃo de anticorpos ou estudos de folding/refolding proteico, considerado suas caracterÃsticas moleculares peculiares, observadas nos estudos cristalogrÃficos, tais como o conjunto de pontes dissulfeto intracadeia. rCpOsm foi tambÃm expressa em cÃlulas de P. pastoris, entretanto o sistema de expressÃo deverÃ, necessariamente, sofrer melhorias para maximizar o rendimento. rCpOsm de P. pastoris foi inicialmente detectada por sequenciamento de novo por espectrometria de massas a partir da digestÃo trÃptica. A identificaÃÃo de peptÃdeos internos confirmou sua presenÃa no meio extracelular. A limitaÃÃo deu-se pela baixa taxa de expressÃo, o que, por conseguinte, nÃo permitiu uma caracterizaÃÃo mais ampla da rCpOsm deste sistema. rCpOsm expressa em P. postoris estava em sua forma ativa. Em uma anÃlise comparativa, rCpOsm e CpOsm, de modo e intensidade similares, foram capazes de alterar drasticamente a morfologia de esporos de F. solani e reduzir seu volume, comparados a esporos nÃo tratados, revelado atravÃs de microscopia de forÃa atÃmica. CpOsm foi cristalizada pelo mÃtodo de gota pendente e os cristais obtidos difrataram a uma resoluÃÃo de 1,61 Ã com caracterÃsticas morfolÃgicas do espaÃo cristalogrÃfico P6122. Os dados coletados sugerem que a proteÃna mantÃm uma estrutura em monÃmero, correspondendo a sequÃncia de aminoÃcidos do cDNA, com 203 resÃduos. A estrutura pode ser vista como trÃs regiÃes distintas, presentes em outras osmotinas jÃ descritas, formando um domÃnio central onde hÃ um conjunto de folhas beta, sendo este o mais longo, e dois outros menores, formados de estrutura predominantemente desordenadas com pequenos segmentos em alfa-hÃlice (domÃnio II) e longas alÃas (domÃnio III). Oito pontes dissulfeto estabilizam a estrutura e envolvem todos os resÃduos de cisteÃna da estrutura primÃria. NÃo hÃ evidencias cristalogrÃficas para formaÃÃo de oligÃmeros. Este estudo conclui que a expressÃo heterÃloga em sistema eucarionte produz rCpOsm ativa e isto representa uma etapa a mais cumprida para a sua possÃvel expressÃo em plantas com o objetivo de proteÃÃo contra fitopatÃgenos.
In a previous step to this work, a latex protein belonging to Calotropis procera was described. The protein, named CpOsm, exhibited biochemical characteristics closely related to pathogenesis related proteins joined into PR-5 group. The new protein with osmotin characteristics displayed activity against phytopatogenic fungi. Here, attempts to obtain a suitable heterologous system to express functional recombinant CpOsm were performed in Prokaryote and Eukaryote expression systems. Further, cDNA sequencing and crystallographic assays were performed using CpOsm and the molecular and structural properties of the functional protein. The vector pET303CT-His and PICZαA were used to express CpOsm in E. coli and P. pastoris, respectively. The ecombinant protein (rCpOsm) produced in the Prokaryote system was retained into E. oli cells and deposited as inclusion bodies. rCpOsm was insoluble. Although insoluble roteins into inclusion bodies represent an adverse phase for obtaining the active CpOsm, this system of expression can be interesting to other goals as quantitative roduction of rCpOsm for producing antibodies or to study protein folding/refolding, ince CpOsm possesses peculiar structural characteristics such as occurrence of an xtended network or intra chain disulfide bonds stabilizing the overall structure. rCpOsm as also successfully expressed in P. pastoris. However, this protocol must to undergo improvement in order to maximize yield. rCpOsm was initially detected in the P. pastoris expression system by MS/MS de novo sequencing after tryptic digestion. Identification of internal peptides present in the extracellular media confirmed the production and excretion of rCpOsm in P. pastoris cells. The very low yield of recombinant protein avoided enough amount of purified rCpOsm to perform a broad characterization. On a comparative basis, native CpOsm, purified of the latex, and rCpOsm, purified from P. pastoris cultures, at similar mode and intensity were capable of drastically alter the morphological architecture of spores of F.solani and reduced their olume as compared to non-treated spores, as revealed by atomic force microscopy measurements. CpOsm was crystallized by the pendant drop method and the crystals grown diffracted at 1.61 Ã. They fit on the P6122 space. The data collecting, supported by the cDNA deduced amino acid sequence suggested that CpOsm occurs as an monomeric structure composed of a unique chain of 203 amino acid residues and no evidences for quaternary association was seen. The overall structure can separated in three structural domains, which have been reported in other osmotins. The central region preserves the set of beta-sheets and is the largest. The others exhibit short segments on alpha-helix interconnected by randomized sequences (domain II). In domain III predominates randomized sequences and long loops. Eight disulfide bonds stabilize the structure and involve all cysteine residues of the primary sequence. The heterologous expression of CpOsm on Eukaryote system produces rCpOsm active and this support the hypothesis that rCpOsm is a suitable candidate for heterologous expression in plants in order to obtain improved crops against selected phytopatogens.

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Nepomuceno, Denise Rocha. "Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli." reponame:Repositório Institucional da UFC, 2008. http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/10819.

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Abstract:

NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli. 2008. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008.
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The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein.
As lectinas constituem ferramentas biotecnológicas de fundamental importância em estudos histoquímicos e citoquímicos para a detecção de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicações, destacam-se a identificação de receptores de membrana e a detecção de estruturas características de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, já foi utilizada na detecção histoquímica de lesões malignas de mama e tireóide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressão do gene da frutalina em células de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteína através da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estágios de maturação dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqüenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia única, formada pela cadeia beta com 20 resíduos, ligada a um peptídeo de ligação com quatro resíduos, e a cadeia alfa com 133 resíduos. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), após a indução com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios de ligação a carboidratos das moléculas. As mutações nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína.

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Landim, PatrÃcia Gadelha de Castro. "ProduÃÃo em Pichia pastoris de uma quitinase de feijÃo-de-corda com atividade antifÃngica." Universidade Federal do CearÃ, 2011. http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=8584.

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Abstract:

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico
As quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar as ligaÃÃes β-(1,4)-glicosÃdicas presentes em biopolÃmeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarÃdeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterÃlogos e a proteÃna recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relaÃÃo ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinaÃÃo de esporos/conÃdios de fungos filamentosos. A seqÃÃncia de DNA codificando a proteÃna foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressÃo pET32a(+) e pPICZαA, para expressÃo heterÃloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressÃo de rVuChi em cÃlulas de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusÃo. Em seis estirpes de P. pastoris a proteÃna recombinante foi secretada, de forma solÃvel, para o meio de cultura. Na fraÃÃo extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolÃtica, apÃs 72 horas de induÃÃo. A detecÃÃo de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequÃncia N-terminal e a ausÃncia de N-glicosilaÃÃo foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fraÃÃo F0/40 precipitada com sulfato de amÃnio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interaÃÃes hidrofÃbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltraÃÃo em membrana com limite de exclusÃo de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolÃtica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora nÃo tenha apresentado atividade contra substratos sintÃticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusÃo molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis âspotsâ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestÃvel em temperaturas atÃ 50 ÂC e sua atividade enzimÃtica mÃxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presenÃa de Ãons metÃlicos causou uma reduÃÃo de sua atividade enzimÃtica. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimÃtica enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hÃlice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroÃsmo circular. A desnaturaÃÃo de 50% das molÃculas de rVuChi ocorreu a 54,41 ÂC. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna produzida em P. pastoris estava em sua conformaÃÃo totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijÃo-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinaÃÃo de esporos de Penicillium herquei atÃ 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibiÃÃo de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibiÃÃo de 55% na germinaÃÃo dos conÃdios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinaÃÃo dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinaÃÃo de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. AlÃm disso, a proteÃna recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porÃm nÃo apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata Ã uma proteÃna com atividade antifÃngica.
Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50 Â C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41 Â C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity.

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Viana, MartÃnio Ponte. "ToxicoproteÃmica aplicada Ã anÃlise de risco da proteÃna recombinante cry1ac de Bacillus thuringiensis." Universidade Federal do CearÃ, 2014. http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=17262.

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Abstract:

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
Dentre os vÃrios microrganismos entomopatogÃnicos utilizados no controle biolÃgico, o Bacillus thuringiensis (Bt) vem sendo considerado uma das alternativas mais viÃveis, devido Ã presenÃa de proteÃnas inseticidas em seus esporos, como as δ-endotoxinas Cry. As toxinas Cry apresentam atividade contra diferentes ordens de insetos, como Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Hemiptera e Lepidoptera. Tais proteÃnas sÃo altamente especÃficas, ou seja, sÃo inÃcuas para a maioria dos organismos nÃo-alvo, fato que favorece sua utilizaÃÃo na agricultura. Hoje existem mais de 114 milhÃes de hectares de lavouras geneticamente modificadas e 37% expressam traÃos de proteÃnas inseticidas de Bt. Como os organismos geneticamente modificados (OGMs) estÃo se tornando cada vez mais predominantes, vÃrias organizaÃÃes internacionais tÃm dado orientaÃÃes no sentido de investigar a seguranÃa de alimentos provenientes de OGMs. Este trabalho teve como objetivo utilizar uma abordagem toxicoproteÃmica para anÃlise de risco da proteÃna recombinante Cry1Ac de Bt a fim de contribuir para uma maior compreensÃo de seus efeitos em modelo de mamÃferos. O ensaio de toxicidade foi conduzido de acordo com o protocolo 425 da âOrganizaÃÃo para a CooperaÃÃo e Desenvolvimento EconÃmicoâ - OECD e nÃo foram verificadas mortes ou sinais de toxicidade. As anÃlises proteÃmicas baseadas em gel mostraram 4 proteÃnas diferencialmente expressas Serpina α-1, Serpina A3K, CininogÃnio e Complemento C3. Essas proteÃnas tiveram uma reduÃÃo em sua expressÃo no grupo tratado com a toxina Cry1Ac. Na abordagem âgel-freeâ foram identificadas 7 proteÃnas diferencialmente expressas. Dentre elas, fator I, inibidor de tripsina H3, plasminogÃnio, serpina A6, albumina e proteÃna resistente Ã oxidaÃÃo apresentaram uma expressÃo maior em animais tratados com Cry1Ac, enquanto que a protrombina teve sua expressÃo reduzida em animais tratados com a mesma proteÃna. Tais molÃculas sÃo importantes para hemostasia e sistema imune, podendo interferir no processo inflamatÃrio, na ativaÃÃo da via do complemento e da cascata de coagulaÃÃo. No entanto, a abordagem toxicoproteÃmica adotada mostra-se Ãtil para a identificaÃÃo de efeitos adversos, atÃ mesmo de uma jÃ amplamente conhecida por sua baixa toxicidade. Isso encoraja a utilizaÃÃo da referida abordagem para a avaliaÃÃo de risco de proteÃnas recombinantes. Apesar das alteraÃÃes fisiolÃgicas causadas, a proteÃna Cry1Ac ainda Ã considerada segura jÃ que tais alteraÃÃes ocorreram na dose mais alta recomenda pela OECD (2000mg/Kg) e sem causar morte dos animais.
Among the various pathogenic bacteria used in biological control, Bacillus thuringiensis has been considered one of the most viable alternatives, due to the presence of insecticidal proteins in their spores, such as the δ-endotoxin, Cry. The Cry toxins exhibit activity against different insect orders, such as Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Hemiptera and Lepidoptera. Such proteins are highly specific, which means, they are harmless to most organisms. This fact justifies their use in agriculture. Nowadays, there are over 114 million hectares of GM crops and 37% express traits of insecticidal proteins of B. thuringiensis. Since genetically modified organisms (GMOs) are becoming increasingly prevalent, several international organizations have given guidelines to investigate the safety of food derived from GMOs. This work aimed to evaluate the acute toxicity of the entomotoxin Cry1Ac in rats through classical in vivo analyzes associated with proteomic study by two-dimensional electrophoresis and shotgum proteomic technique (gel-free). Toxicity tests were conducted according to the protocol of 425 "Organization of Economic Cooperation and Development" - OECD and no deaths or signs of toxicity were observed. The gel-based proteomic analysis showed four differentially expressed proteins: Serpin α-1, Serpin A3K, Kininogen and Complement C3. These proteins expressions were reduced for the group treated with the Cry1Ac toxin. In gel-free approach, seven differentially expressed proteins were identified. Among them, factor I, H3 trypsin inhibitor, plasminogen, serpin A6, albumin, and protein resistant to oxidation showed a higher expression in animals treated with Cry1Ac, while the prothrombin expression was reduced in animals treated with the same protein. Such molecules are important for hemostasis and immune system, and may interfere with the inflammatory process, activation of the complement pathway and the coagulation cascade. Despite the physiological changes caused by Cry1Ac, this protein is still considered safe since these changes occurred at the highest dose recommended by OECD (2000 mg / kg) and without causing death of the animals.

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Teixeira, CÃcero Silvano. "ExpressÃo de uma quitinase de Chromobacterium Violaceum em Pichia Pastoris: purificaÃÃo e caracterizaÃÃo parcial da proteÃna recombinante." Universidade Federal do CearÃ, 2011. http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=5880.

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Abstract:

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico
A utilizaÃÃo de microrganismos como sistemas heterÃlogos de expressÃo de proteÃnas tem se mostrado uma estratÃgia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificaÃÃo de proteÃnas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolÃticas capazes de degradar quitina, tÃm sido expressas em diferentes sistemas heterÃlogos, incluindo bactÃrias e leveduras. Quitina Ã um polÃmero linear composto de resÃduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaÃa de crustÃceos e membrana peritrÃfica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrÃfica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, alÃm de purificar e caracterizar a proteÃna recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construÃÃo (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nÃvel de expressÃo quando comparada Ã cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de nÃquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluÃda como um Ãnico pico com imidazol 0,04 M. A proteÃna purificada se mostrou homogÃnea quando submetida Ã eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presenÃa de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condiÃÃes, uma Ãnica banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solÃvel utilizando o sistema de expressÃo P. pastoris e, alÃm disso, sua purificaÃÃo foi realizada de forma satisfatÃria. O conteÃdo de estrutura secundÃria foi estimado por espectroscopia de dicroÃsmo circular (CD), com a proteÃna submetida a diferentes temperaturas (10-90 ÂC). Na temperatura de 24 ÂC, o espectro de CD revelou a predominÃncia do conteÃdo de hÃlice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randÃmica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 ÂC, rCHI3316 exibiu um espectro caracterÃstico de folha beta. A partir de 60 ÂC atÃ 90 ÂC, rCHI3316 adquiriu uma conformaÃÃo caracterÃstica de hÃlice alfa. A temperatura mÃdia para essa transiÃÃo conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 ÂC. Experimentos de espectroscopia de fluorescÃncia, com excitaÃÃo a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissÃo com comprimentos de onda mÃximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores sÃo caracterÃsticos de resÃduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolÃtica contra vÃrios substratos e dependÃncia de pH da atividade enzimÃtica da proteÃna pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolÃtica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-Nâ-diacetil-β-D-quitobiosÃdeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-Nâ-Nââ-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimÃtica da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminÃdeo. A enzima exibiu atividade quitinolÃtica Ãtima (100%) em pH 5,0; quando quitina coloidal foi utilizada como substrato. Em adiÃÃo, a atividade antifÃngica contra fungos fitopatogÃnicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Penicillium herquei foi investigada. rCHI3316 nÃo inibiu a germinaÃÃo e o crescimento micelial dos esporos dos fungos testados, na concentraÃÃo de 0,63 mgP.ml-1. Estudos subseqÃentes deverÃo ser realizados na intenÃÃo de descobrir potenciais aplicaÃÃes desta proteÃna como uma ferramenta biolÃgica no controle de outros fungos fitopatogÃnicos bem como insetos considerados pragas.
Microorganisms are a valuable tool for the expression of proteins from a variety of sources, including plants, animals and other microorganisms. Thus, chitinases, a group of glycosil hydrolases capable to hydrolize chitin, have already been expressed and purified from different systems including bacteria and yeast. Chitin, a linear polymer of N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), is an important structural component found in the crustacean shells, in the peritrophic membrane of insect guts as well as in the fungi cell walls. The aim of this work was to express a chitinase (encoded by the ORF CV3316) from Chromobacterium violaceum ATCC 12472, using the methylotrophic yeast Pichia pastoris strains GS115 and KM71H. Furthermore, purification and partial characterization of the recombinant protein were also achieved. The GS115 strain carrying the expression cassette pPICZαA-CV3316 was selected due to its higher expression level as compared to KM71H strain. Immobilized metal ion affinity chromatography was employed to purify the recombinant chitinase which was eluted as a single peak at 0.04 M imidazol. The homogeneity of the purified protein was confirmed as judged by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In these conditions, the recombinant chitinase migrated as a single protein band with an apparent molecular mass of about 87 kDa. Thus, a chitinase from C. violaceum ATCC 12472 was successfully expressed in P. pastoris and the soluble recombinant protein purified. The content of secondary structure was investigated by circular dichroism (CD) spectroscopy. At 24 oC the CD spectrum revealed secondary structure contents of 37% (alpha helix), 26% (beta sheet) and 38% (random coil). The CD spectra obtained in the temperature range 10-50 oC were characteristic of beta sheet. In contrast, the CD spectra generated in the range 60-90 oC were characteristic of alpha helix. The midpoint temperature of this conformational transition was 59.6 1.2 oC as calculated from the CD experimental data. Fluorescence spectroscopy was carried out with excitation at 280 and 290 nm, producing emission spectra in which the wavelengths of maximum emission were 339 and 342 nm, respectively. This behavior is characteristic of tryptophan residues in limited contact with water. Chitinolytic activity against several substrates and the pH dependency of the enzymatic activity of the pure protein were all accessed. The purified enzyme showed hydrolytic activity on the following substrates: colloidal chitin (1,189.4 U.mgP-1), 4-nitrophenyl N-Nâ-diacetyl--D-chitobioside (30,411.0 U.mgP-1) and 4-nitrophenyl β-D-N-Nâ-Nâ-triacetylchitotriose (13,150.0 U.mgP-1); and, respectively. In contrast, no activity was detected using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as substrate. The enzyme presented an optimal chitinolytic activity at pH 5.0 using colloidal chitin as a substrate. Additionally, the antifungal activity against the phytopathogenic fungi, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Penicillium herquei was investigated. The recombinant chitinase did not inhibit the spore germination and the mycelium growth of the tested fungi, at the 0.63 mgP.ml-1 concentration. Further studies should be carried out in order to discover potential applications of this protein as a biotechnological tool in the control of other phytopathogenic fungi as well as economically important pests.

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Koscky, Paier Carlos Roberto 1983. "Padronização da expressão heterologa e de modelo de ensaio de atividade para a proteina quinase humana S6K." [s.n.], 2009. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314787.

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Abstract:

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-14T12:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KosckyPaier_CarlosRoberto_M.pdf: 3760581 bytes, checksum: 99331529324819b59a4360d60efd9b9a (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: A quinase de 70 kDa da proteína ribossomal S6, isoforma 1 (S6K1), é uma fosfoproteína implicada na regulação de genes relacionados ao controle da tradução em mamíferos e possui uma forma nuclear (a1) e uma citoplasmática (a2). A fosforilação do seu principal alvo, a proteína RPS6, tem sido comumente associada ao recrutamento seletivo dos 5'-TOP (5' tract of oligopyrimidine) mRNAs pela maquinaria de tradução, embora haja estudos contrariando esta hipótese. Devido às funções de seus demais alvos, S6K1 tem sido implicada na sobrevivência celular e em diversos outros processos, como crescimento, câncer e resistência à insulina. S6K1 é ativada por um mecanismo que envolve fosforilação seqüencial através da ativação das vias mTORC1 (complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos) e PI3K (fosfoinositol-3 quinase). Como uma quinase da família AGC, S6K1 deve ser fosforilada por mTORC1 no resíduo Thr389 do domínio hidrofóbico e, em seguida, por PDPK1 (proteína quinase 1 dependente de fosfoinositol) no resíduo Thr229 da alça T do domínio catalítico. Estes eventos ocorrem somente após a fosforilação em diversos sítios do domínio auto-inibitório carboxiterminal, por mTORC1. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio modelo para análise da função da S6K1 in vitro e utilizá-lo como ferramenta na elucidação do papel de proteínas adaptadoras da via de mTOR em interações com a S6K1. Para isso foi necessário produzir as proteínas recombinantes para ensaios de interação e para realização de um ensaio de atividade para a S6K1. Foram testados vários sistemas de expressão para Escherichia coli para produção das construções GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT (forma a2 de S6K1 com a substituição T389E e o carboxiterminal truncado), GST-PDPK1 e GST-CDPDPK1 (domínio catalítico de PDPK1 fusionado a GST). A expressão das formas truncadas de S6K1 e PDPK1 foi mais eficiente em E. coli. Embora o rendimento tenha ficado muito aquém do esperado, foi suficiente para os ensaios de interação in vitro. Também foi feita a expressão em E. coli da região C-terminal da proteína RPS6, que é o substrato da S6K1, em fusão com a proteína D do fago ?. Posteriormente, foram montados sistemas de expressão das construções His6-S6K1a2T389E?CT e His6-CDPDPK1 em células de inseto, a partir de vetor de baculovírus. Constatou-se que essas construções são expressas na forma de fosfoproteínas em células de inseto. Ensaios de GST pull-down com GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT contra as duas isoformas da subunidade catalítica da PP2AC, His6-PP2ACa(maior) e His6-PP2ACa(menor), revelaram que His6-PP2ACa(maior) não interage com GST-S6K1a2-His6, embora interaja fortemente com GST-S6K1a2T389E?CT. Já a construção His6-PP2ACa(menor) interage fracamente com as construções GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a presença do C-terminal não fosforilado de S6K1a2 impede a interação com PP2ACa(maior). PP2ACa(menor) comporta-se de forma completamente diferente da isoforma maior, pois a interação entre PP2ACa(menor) e S6K1a2 parece ser independente do carboxiterminal da quinase, visto que as quantidades de S6K1a2T389E?CT e de S6K1a2 inteira que interagem com PP2ACa(menor) são semelhantes. Esses resultados necessitam ainda serem confirmados in vivo. Outros experimentos de GST pull-down confirmaram que as construções de S6K1 não interagem com a4, embora interajam com TIPRL1. Se confirmado in vivo, esse resultado compõe um novo quadro na regulação coordenada entre mTOR1 e PP2A, do qual TIPRL1 parece participar. As construções genéticas e os sistemas de expressão gerados neste trabalho possibilitaram a obtenção dos reagentes necessários para analisar o mecanismo de regulação da quinase S6K1, mediado por proteínas regulatórias. Permitem também desenvolver uma série de experimentos, como busca de inibidores específicos para a S6K1, que dependem da reconstituição de ensaios de atividade in vitro com a S6K1 ativada. Contudo, o ensaio de atividade realizado não apresentou resultados satisfatórios e precisa ser desenvolvido.
Abstract: The 70kDa ribosomal S6 protein kinase 1 (S6K1) is a phosphoprotein involved in the regulation of genes related to translational control in mammals. S6K1 shows distinct nuclear (a1) and cytoplasmic (a2) forms. Phosphorylation of the S6K1 best characterized target, the protein of the small ribosomal subunit (RPS6), has been generally associated to the selective recruitment of the 5'-TOP mRNAs (5' tract of oligopyrimidine) by the translational machinery, although there is still some controversy on this issue. Due to the function of its targets, S6K1 has been implicated in several cellular processes including cell growth, cancer and insulin resistance. S6K1 is activated by a mechanism of sequential phosphorylation following activation of the mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) and PI3K (phosphoinositide-3-kinase) pathways. As a kinase of the AGC family, S6K1 activation requires mTORC1 phosphorylation of residue Thr389 of the hydrophobic domain followed by PDPK1 (phosphoinositide dependent protein kinase 1) phosphorylation of residue Thr229 at the T loop of the catalytic domain. These take place only after phosphorylation by mTORC1 of several residues of the autoinhibitory C-terminal domain. The objective of this work was to develop an assay to analyze the function of S6K1 in vitro and use it as a tool in the discovering of the functions of regulators proteins of the mTOR cascade in interactions with S6K1. For these purposes, expression systems were constructed to produce the various recombinant proteins to be used in the interaction and activity assays. Several genetic constructions were tested in Escherichia coli for the production of GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT (a2 form of S6K1 with the T389E substitution and truncated carboxiterminus), GST-PDPK1 and GST-CDPDPK1 (GST fusion protein of the catalytic domain of PDPK1). The truncated forms were expressed more efficiently in E. coli. Although the yield in E. coli was lower than expected, it was sufficient to perform interaction assays. The C-terminal domain of RPS6, a substrate for S6K1, was successfully expressed in E. coli as a fusion protein with the phage ? protein D. Subsequently, expression systems for production of His6-S6K1a2T389E?CT and His6-CDPDPK1 in insect cells were constructed using baculovirus vectors. It was found that these constructs are expressed in the form of phosphoproteins in insect cells. GST pull-down assays using GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT to test interaction with the PP2AC isoforms His6-PP2ACa(major) and His6-PP2ACa(minor) revealed that His6-PP2ACa(major) does not interact with GST-S6K1a2-His6, although it interacts strongly with GST-S6K1a2T389E?CT. On the other hand, His6-PP2ACa(minor) interacts weakly with both GST- S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT. This finding suggests that the unphosphorylated C-terminal of S6K1a2 inhibits interaction with PP2ACa(major). His6-PP2ACa(minor) behaves differently form His6-PP2ACa(major). Its interaction with S6K1a2 seems to be independent of the C-terminal since the amounts of S6K1a2T389E?CT and S6K1a2 that interact with His6-PP2ACa(minor) are similar. Future work in vivo is required to confirm these results. GST pull-down assays confirmed that a4 does not interact with the constructions of S6K1, while TIPRL1 interacts with them. If confirmed in vivo, these results provides a new perspective for the coordinated regulation between mTOR1 and PP2A, which apparently involves also TIPRL1. The genetic constructions and expression systems established in this work allow the production of the reagents required to study the mechanism of S6K1 regulation mediated by adaptor proteins. They will also allow the development of experiments such as screening for specific S6K1 inhibitors, which depend on reconstitution of S6K1 activity assays using activated S6K1. Nevertheless, the activity assay performed did not yield satisfactory outcomes and must be improved.
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Roca, Pinilla Ramon. "Development of a new generation of antimicrobial proteins based on a versatile nanoparticulated format and multidomain structure." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2020. http://hdl.handle.net/10803/670790.

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Abstract:

Durant la major part de la historia humana, els patògens han estat una de les principals causes de morts i malalties. Gràcies al descobriment dels antibiòtics hem aconseguit tractar aquestes malalties amb facilitat, però el seu mal ús ha accelerat l’aparició de resistències als antimicrobians (AMRs). Atès que les AMRs han provocat que la majoria de fàrmacs antimicrobians siguin ineficaços, el desenvolupament de tractaments alternatius és mes necessari que mai. Els pèptids de la defensa del hoste (HDPs) han estat proposats com a models per la generació de nous antimicrobians per lluitar contra les infeccions AMR. Tot i així, la majoria d’HDPs és produeixen mitjançant la síntesi química, un procés que és car, insostenible i difícil d’escalar. Alternativament, la producció recombinant d’HDPs és molt atractiva però complicada, ja que són pèptids altament susceptibles de ser degradats i són tòxics per l’hoste recombinant. Malgrat això, els cossos d’inclusió (IBs), que són agregats de proteïna formats durant els processos de producció recombinant, es poden utilitzar com a format alternatiu al de la proteïna soluble per permetre la producció d’HDPs dins l’hoste sense efectes tòxics. D’altra banda, la construcció de proteïnes quimèriques podria ser una estratègia per expressar pèptids petits amb èxit. En aquest context, aquesta tesi explora diverses estratègies per la producció recombinant d’HDPs. Per una banda, hem explorat l’ús de les cremalleres de leucina com a dominis potencials per fomentar la producció recombinant d’HDPs en la fracció insoluble i per augmentar la qualitat de la proteïna recombinant dels IBs. A més a més, hem desenvolupat diverses proteïnes antimicrobianes multidomini basades en la fusió de diferents pèptids HDP i proteïnes de la immunitat innata. Com que també hem utilitzat cremalleres de leucina en aquests constructes, es poden expressar de manera efectiva – sense toxicitat per la cèl·lula productora. A més, en cas de necessitat, podem recuperar antimicrobians solubles a partir dels IBs gràcies a un protocol de solubilització suau i no desnaturalitzant. En conjunt, hem demostrat que aquests constructes tenen un ampli espectre d’acció antimicrobiana contra bacteris multi resistents (MDR), tant en el format soluble com en el format d´IB. És més, els constructes també són capaços d’estimular l’alliberament de IL-8 dins d’un potencial rang de propietats immunomoduladores. Aquests resultats ens han convidat a utilitzar les nostres proteïnes en la biofuncionalització de monocapes autoacoblants per evitar la formació de biofilms, i hem observat que aquestes proteïnes poden ancorar-se a aquests materials i evitar el creixement de biofilms. En resum, aquests resultats reforcen les proteïnes antimicrobianes multidomini com a potencials alternatives antimicrobianes amb propietat immunomoduladores.
Durante la mayor parte de la historia humana, los patógenos han sido una de las principales causas de muertes y enfermedades. Gracias al descubrimiento de los antibióticos hemos conseguido tratar estas enfermedades con facilidad, pero su mal uso ha acelerado la aparición de resistencias a los antimicrobianos (AMRs). Dado que las AMRs han provocado que la mayoría de fármacos antimicrobianos sean ineficaces, el desarrollo de tratamientos alternativos es más necesario que nunca. Los péptidos de la defensa del huésped (HDPs) han sido propuestos como modelos para la generación de nuevos antimicrobianos para luchar contra las infecciones AMR. Sin embargo, la mayoría de HDPs se producen mediante la síntesis química, un proceso que es caro, insostenible y difícil de escalar. Alternativamente, la producción recombinante de HDPs es muy atractiva pero complicada, ya que son péptidos altamente susceptibles de ser degradados y son tóxicos para el huésped recombinante. Sin embargo, los cuerpos de inclusión (IBs), que son agregados de proteína formados durante los procesos de producción recombinante, se pueden utilizar como formato alternativo al de la proteína soluble para permitir la producción de HDPs dentro del huésped sin efectos tóxicos. Por otra parte, la construcción de proteínas quiméricas podría ser una estrategia para expresar péptidos pequeños con éxito. En este contexto, esta tesis explora diversas estrategias para la producción recombinante de HDPs. Por un lado, hemos explorado el uso de las cremalleras de leucina como dominios potenciales para fomentar la producción recombinante de HDPs en la fracción insoluble y para aumentar la calidad de la proteína recombinante en los IBs. Además, hemos desarrollado varias proteínas antimicrobianas multidominio basadas en la fusión de diferentes péptidos HDP y proteínas de la inmunidad innata. Como también hemos utilizado cremalleras de leucina en estos constructos, se pueden expresar de manera efectiva - sin toxicidad para la célula productora. Además, en caso de necesidad, podemos recuperar antimicrobianos solubles a partir de los IBs gracias a un protocolo de solubilización suave y no desnaturalizando. En conjunto, hemos demostrado que estos constructos tienen un amplio espectro de acción antimicrobiana contra bacterias multi resistentes (MDR), tanto en el formato soluble como en el formato de IBs. Es más, los constructos también son capaces de estimular la liberación de IL-8 dentro de un potencial rango de propiedades inmunomoduladoras. Estos resultados nos han invitado a utilizar nuestras proteínas en la biofuncionalizacón de monocapas autoensamblantes para evitar la formación de biofilms, y hemos observado que estas proteínas pueden anclarse a estos materiales y evitar el crecimiento de biofilms. En resumen, estos resultados refuerzan las proteínas antimicrobianas multidominio como potenciales alternativas antimicrobianas con propiedades inmunomoduladoras.
For most of human history, pathogens have been a leading cause of death and illness. Although we have attained the ability to treat them easily, thanks to the discovery of antibiotics, the widespread overuse and misuse of antimicrobial drugs have accelerated the appearance of antimicrobial resistances (AMRs). Because AMRs have rendered most antimicrobial drugs ineffective, the development of alternative approaches is more necessary than ever before. Host defense peptides (HDPs) have been proposed as blueprints for the generation of new antimicrobials to fight AMR infections. Despite this, most HDPs are produced by chemical synthesis, which is expensive, unsustainable, and difficult to scale-up. Alternatively, their recombinant production is very appealing but still challenging. HDPs are highly susceptible to degradation and are generally toxic to the recombinant host. However, inclusion bodies (IBs), which are protein aggregates that usually happen during recombinant production, can be used to allow HDP formation inside the host without being harmful. Also, the construction of chimeric proteins could be a strategy for successful recombinant expression of small peptides. In this context, this dissertation explores several new strategies for the recombinant production of HDPs. We tried leucine zippers as potential domains to drive the recombinant production of HDPs to the insoluble fraction and improve IBs protein quality. After that, we developed several antimicrobial multidomain proteins based on the fusion of different peptides and proteins from innate immunity. Because we also used leucine zippers with these constructs, they could be produced effectively – without toxicity to the microbial cell factory. Moreover, when needed, we were able to recover soluble antimicrobials from IBs using a mild, non-denaturing protocol. Overall, we demonstrated that these constructs have a broad-spectrum antimicrobial action against multi-drug resistant (MDR) bacteria, in both the soluble and IB format, and that they could trigger the release of IL-8 within a range of potential immunomodulatory properties. These outcomes invited us to use our constructs in the biofunctionalization of self-assembled monolayers to avoid biofilm formation. We observed that the chimeric proteins could be anchored to these materials and avoid biofilm growth. In sum, these results reinforce multidomain antimicrobial proteins as potential antimicrobial alternatives with immunomodulatory properties and open up the possibility for many applications of this new generation of antimicrobial protein nanoparticles as well as their soluble analogs.

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Raposo, Renato Astolfi. "Análise de interações da subunidade catalítica da fosfatase do tipo 1 (PP1c) de Dictyostelium discoideum identificadas através do sistema de duplo-híbrido em leveduras." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14052013-102905/.

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Abstract:

A proteína fosfatase do tipo-1 (PP1) é uma das principais proteínas serina/treonina fosfatases (PSTPs) e desempenha papeis fisiológicos tão diversos quanto importantes, tais como a regulação do metabolismo de carboidratos e do ciclo celular. A holoenzima PP1 é constituída por uma subunidade catalítica conservada (PP1c) que está associada a subunidades não-catalíticas que modulam sua localização subcelular, especificidade de substrato e atividade enzimática. Mais de 100 proteínas que interagem com a PP1c já foram identificadas em distintos organismos eucarióticos. Proteínas que interagem com a PP1c são, portanto, a chave para compreender os diferentes papéis biológicos da PP1. A subunidade catalítica da PP1 da ameba social Dictyostelium discoideum (DdPP1c) é codificada por um gene em cópia única o qual é expresso ao longo de todo o ciclo de vida desse organismo. Algumas proteínas que interagem e possivelmente modulam a atividade da PP1 de D. discoideum já foram identificadas, utilizando-se tanto buscas por similaridades na sequência genômica deste microorganismo como ensaios utilizando o sistema de duplo-híbrido em leveduras, utilizando-se a PP1c como isca. Com esta última abordagem, foram selecionados mais de 25 clones distintos de cDNA que codificam proteínas que potencialmente interagem com a DdPP1c, após varreduras de bibliotecas de cDNA de diferentes estágios de desenvolvimento de D. discoideum. Neste trabalho, nós confirmamos que o produto protéico de 11 destes clones interagem com a isca DdPP1c com base em novos ensaios de duplo-híbrido. Os demais clones codificam proteínas que não interagem com DdPP1c ou promovem auto-ativação do gene repórter. Selecionamos para estudos adicionais um clone do gene DDB_G0269300 cujo produto protéico predito de 423 de aminoácidos não tem função ainda conhecida. A sequência codificadora completa de DDB_G0269300 foi clonada para realização de novos ensaios de duplo-híbrido em leveduras, os quais confirmaram a especificidade de sua interação com DdPP1c. A proteína recombinante rDDB_G0269300 foi obtida com sucesso em bactérias, possibilitando a obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. O anti-soro anti-rDDB_G0269300 é aparentemente específico no reconhecimento da proteína correspondente em extratos celulares de D. discoideum coletados em 12h e 16 da fase de desenvolvimento. Estes resultados coincidem com dados obtidos através de RT-qPCR que mostram aumento nos níveis dos transcritos de DDB_G0269300 entre 8h e 12h da fase de desenvolvimento, o que é indicativo da sua importância desta proteína durante esta fase do ciclo de vida de Dictyostelium como uma potencial parceira molecular da DdPP1c
Protein phosphatase type-1 (PP1) is a major protein serine/threonine phosphatase (PSTP) which plays as diverse as important physiological roles, such as regulation of carbohydrate metabolism and of cell cycle. The PP1 holoenzyme comprises a conserved catalytic subunit (PP1c) associated with non-catalytic subunits that modulate its subcellular localization, substrate specificity and enzymatic activity. More than 100 proteins that interact with PP1c have been identified in different eukaryotic organisms. Therefore proteins that interact with PP1c are key to the understanding of PP1 different biological roles. The catalytic subunit of PP1 the social amoeba Dictyostelium discoideum (DdPP1c) is encoded by a single copy gene which is expressed throughout the life cycle of this organism. Some proteins that interact with and possibly modulate the activity of D. discoideum PP1 have been identified, using both similarity searches in the genome sequence of this microorganism as yeast two-hybrid screenings using PP1c as bait. With the latter approach, we have selected more than 25 distinct cDNA clones encoding proteins that potentially interact with DdPP1c after screening D. discoideum cDNA libraries from different developmental stages. In this study, we confirmed that the protein product from 11 of these clones interact with the bait DdPP1c based on two-hybrid assays. The other clones encode proteins that either does not interact or promote self-activation of the reporter gene. The clone related to DDB_G0269300 gene that encodes a predicted protein of 423 amino acids with unknown function was selected for further studies. DDB_G0269300 full-length coding sequence was cloned and new yeast two-hybrid assays were performed confirming the specificity of the interaction with DdPP1c. The recombinant protein rDDB_G0269300 was successfully obtained in bacteria and further used for polyclonal antibodies production in mice. The antiserum anti-rDDB_G0269300 is apparently specific for recognition of the corresponding protein in D. discoideum cell extracts collected after 12h and 16h of development. These results agree with RT-qPCR data showing that the levels of DDB_G0269300 transcripts are increased between 8 h and 12 h during the development, which is indicative of its importance during this phase in Dictyostelium life cycle as a DdPP1c potential molecular partner.

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Comenale, Gabriela. "Expressão e purificação da proteína recombinante L2 do Papilomavírus bovino tipo-2 em sistema bacteriano." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-11102013-104819/.

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Abstract:

A papilomatose bovina é uma doença infectocontagiosa de ocorrência mundial, que assola o rebanho brasileiro, sem qualquer atitude efetiva de controle, e que tem como enfermidades associadas a tumores de bexiga hematúria enzoótica e tumores de trato digestório superior caraguatá, responsáveis por sensíveis perdas para a pecuária. Várias tentativas vacinais têm sido empreendidas com finalidades profiláticas ou terapêuticas, porém sem resultados eficazes. Esta situação se deve a aspectos relacionados à estrutura viral que dificultam uma manipulação eficiente para produção de produtos vacinais. Para que tais dados possam ser obtidos, faz-se necessário uma melhor compreensão da ação das proteínas recombinantes. A clonagem em vetores bacterianos para a expressão e purificação dessas proteínas serve a diferentes propósitos. Entre eles, a produção de insumos imunológicos, como testes diagnósticos ou mesmo vacinas. O presente projeto visou à expressão e purificação da proteína de capsídeo recombinante L2 de BPV-2. A proteína foi expressa em bactéria e tentou-se a purificação por coluna de afinidade; entretanto, problemas na purificação não possibilitaram a conclusão deste objetivo. Todas as abordagens e protocolos utilizados nesse trabalho são discutidos para contribuição ao conhecimento do processo.
The bovine papillomatosis is an infectious disease of worldwide occurrence, plaguing the Brazilian herd, without any effective attitude control, and whose illnesses associated with bladder tumors \"enzootic hematuria\" and upper digestive tract tumors \"caraguatá\" sensitive responsible for losses to livestock. Several attempts have been undertaken vaccine with prophylactic or therapeutic purposes, but without effective results. This is due to issues related to viral structure that hinder efficient manipulation for production of vaccine products. In order to obtain such information, it is necessary better understanding of the action of recombinant proteins. The bacterial cloning vectors for the expression and purification of such proteins serve different purposes. Among them, the production of immune inputs, such as diagnostic tests or vaccines. This project aimed the expression and purification of recombinant L2 capsid protein of BPV-2. The protein was expressed in bacteria and purification was carried out by affinity column. However, difficulties in the purification process, impaired the full completion of this objective. All the attempted approaches and protocols were discussed and potential solutions proposed.

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Teixeira, Lais Helena. "Geração e análise da imunogenicidade de proteínas recombinantes baseadas nas diferentes formas do antígeno circumsporozoíta de Plasmodium vivax visando o desenvolvimento de uma vacina universal contra malária." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42133/tde-11072014-110149/.

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Abstract:

O P. vivax é a segunda espécie mais prevalente causadora de malária no mundo. Medidas de controle ineficientes exigem o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção, como vacinas, novas drogas e novos inseticidas. O objetivo geral do trabalho foi gerar uma formulação vacinal universal com proteínas e adenovírus recombinantes capazes de induzir anticorpos contra as diferentes formas alélicas da proteína circumsporozoíta (CSP) do P. vivax. As proteínas foram produzidas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade e troca iônica. A obtenção destas proteínas nos permitiu testar qual seria a melhor formulação vacinal para a indução de anticorpos contra as três formas alélicas da proteína CSP de P. vivax (PvCSP). Anticorpos específicos reconheceram esporozoítas do P. vivax por imunofluorescência. Por fim testamos o uso de dois adenovírus recombinantes, um símio e um humano, deficientes em replicação, expressando as três regiões imunodominantes da proteína PvCSP em fusão. Estes foram capazes de induzir resposta imune específica contra as proteínas PvCSP sendo testados em esquema de prime-boost heterólogo, onde camundongos foram primados com os adenovírus e nas doses-reforço receberam a mistura com as três proteínas recombinantes.
The Plasmodium vivax is the second most prevalent species of malaria in the world. Inefficient measures of control used today demand the development of new strategies for prevention, as vaccines, new drugs and new insecticides. The central objective of this thesis was to generate a universal vaccine formulation with proteins and recombinant adenoviral vectors representing the different allelic forms of the circumsporozoite protein (CSP) of the P. vivax. The recombinant proteins were expressed in E. coli and purified. These proteins allowed us to test which would be the best vaccine formulation for the induction of antibodies against the three allelic forms of CSP. The specific antibodies also recognized P. vivax sporozoites by immunofluorescence. Finally we test the use of two recombinant adenoviral vectors, a simian and a human, both replication deficient, expressing a protein containing the repeat regions of the CSP in fusion. These adenoviral vectors induced specific immune response against CSP and were successfully used in an immunization regimen of heterologous prime and boost where in the first dose the mice received recombinant adenoviral vector and in the subsequent doses, the mixture with three recombinant proteins.

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Garrigós, Martínez Javier. "Multidisciplinary approach for recombinant protein production bioprocess design with classic and novel expression systems in Pichia pastoris." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2021. http://hdl.handle.net/10803/671119.

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Abstract:

La present tesi doctoral es centra en la caracterització de sistemes d’expressió utilitzats per a la producció de proteïnes recombinants (RPP) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. Al llarg de tot aquest treball s’integren els resultats de diferents camps -enginyeria de bioprocessos i regulació génica- per tal d’ampliar la informació sobre els sistemes d’expressió analitzats i, així, reduir la incertesa a l’dissenyar un bioprocés RPP. En el primer capítol de la tesi, s’estudia el sistema clàssic d’expressió basat en el PAOX1. En un primer pas, es van cultivar en quimiòstat dos clons productors de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) amb diferent dosi gènica. D’aquesta manera, es va determinar la interrelació de tres factors importants en els bioprocessos RPP com ara la velocitat específica de creixement (μ), els nivells d’expressió relativa de el gen heteròleg (RTL) i la velocitat específica de generació de producte (qp) . A més, també es va monitoritzar l’expressió d’un factor de transcripció important per a la via d’utilització de metanol (MIT1). Un cop establertes les condicions òptimes d’operació en continu, es van dur a terme cultius en fed-batch per validar i comparar el comportament dels clons productors observat, tant des del punt de vista del seu estat fisiològic com de la cinètica de producció de Crl1 . Els inconvenients de l’ús de el potent sistema d’expressió basat en PAOX1-principalment derivat de l’ús de l’metanol com a font de carboni, font d’electrons i inductor de RPP- han portat a la comunitat de Pichia a investigar i desenvolupar sistemes d’expressió alternatius que no depenguin de l’addició de metanol. A causa d’això, en el segon capítol de la tesi, es van caracteritzar dos nous sistemes d’expressió, basats en el PPDF i PUPP, per determinar si poden competir amb l’àmpliament utilitzat PGAP en la producció de la Lipasa B de Candida antarctica (Calb) . El comportament dels tres sistemes d’expressió es va comparar, en primer lloc, en quimiòstat. Això va permetre obtenir informació sobre la influència de la μ i l’expressió de Calb en la cinètica de producció de la proteïna. A més, els clons productors de la proteïna recombinant sota els nous sistemes d’expressió es van cultivar a fed-batch, en les condicions òptimes observades prèviament, per tal de provar la potencial escalabilitat del bioprocés. En l’últim capítol de la tesi es va optimitzar, utilitzant cèl·lules senceres de P. pastoris (whole cells), la producció del citrocromo P450 2C9 humà (CYP2C9). La coexpressió d’aquest enzim d’interès industrial al costat del domini donador d’electrons (cytochrome P450 reductase, CPR) es va realitzar mitjançant un nou sistema de promotors bidireccionals. Després d’una fase de screening en la qual es van provar fins a 8 promotors per a la producció de CYP2C9 / CPR, es va seleccionar la combinació que va proporcionar la major activitat oxidasa, i es van realitzar una sèrie de cultius per optimitzar el bioprocés. D’aquesta manera, es va determinar la influència de paràmetres importants de l’bioprocés -μ, pH i estratègia d’addició de metanol en la producció de biocatalizador. Finalment, l’eficiència de l’biocatalizador obtingut es va testar en la reacció de hidroxilació de l’ibuprofèn.
La presente tesis doctoral se centra en la caracterización de sistemas de expresión utilizados para la producción de proteínas recombinantes (RPP) en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. A lo largo de todo este trabajo se integran los resultados de diferentes campos —ingeniería de bioprocesos y regulación génica— con el fin de ampliar la información sobre los sistemas de expresión analizados y, así, reducir la incertidumbre al diseñar un bioproceso RPP. En el primer capítulo de la tesis, se estudia el sistema clásico de expresión basado en el PAOX1. En un primer paso, se cultivaron en quimiostato dos clones productores de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) con diferente dosis génica. De esta manera, se determinó la interrelación de tres factores importantes en los bioprocesos de RPP tales como la velocidad específica de crecimiento (µ), los niveles de expresión relativa del gen heterólogo (RTL) y la velocidad específica de generación de producto (qp). Además, también se monitorizó la expresión de un factor de transcripción importante para la vía de utilización del metanol (MIT1). Una vez establecidas las condiciones óptimas de operación en continuo, se llevaron a cabo cultivos en fed-batch para validar y comparar el comportamiento de los clones productores observado, tanto desde el punto de vista de su estado fisiológico como de la cinética de producción de Crl1. Los inconvenientes del uso del potente sistema de expresión basado en PAOX1—principalmente derivado del uso del metanol como fuente de carbono, fuente de electrones e inductor de RPP— han llevado a la comunidad de Pichia a investigar y desarrollar sistemas de expresión alternativos que no dependan de la adición de metanol. Debido a ello, en el segundo capítulo de la tesis, se caracterizaron dos nuevos sistemas de expresión, basados en el PPDF y PUPP, para determinar si pueden competir con el ampliamente utilizado PGAP en la producción de la Lipasa B de Candida antarctica (CalB). El comportamiento de los tres sistemas de expresión se comparó, en primer lugar, en quimiostato. Esto permitió obtener información sobre la influencia de la µ y la expresión de CALB en la cinética de producción de la proteína. Además, los clones productores de la proteína recombinante bajo los nuevos sistemas de expresión se cultivaron en fed-batch, en las condiciones óptimas observadas previamente, con el fin de probar la potencial escalabilidad del bioproceso. En el último capítulo de la tesis se optimizó, utilizando células enteras de P. pastoris (whole cells), la producción del citrocromo P450 2C9 humano (CYP2C9). La coexpresión de esta enzima de interés industrial junto al dominio donador de electrones (cytochrome P450 reductase, CPR) se realizó mediante un novedoso sistema de promotores bidireccionales. Después de una fase de screening en la que se probaron hasta 8 promotores para la producción de CYP2C9/CPR, se seleccionó la combinación que proporcionó la mayor actividad oxidasa, y se realizaron una serie de cultivos para optimizar el bioproceso. De este modo, se determinó la influencia de parámetros importantes del bioproceso —µ, pH y estrategia de adición de metanol— en la producción de biocatalizador. Finalmente, la eficiencia del biocatalizador obtenido se testó en la reacción de hidroxilación del ibuprofeno.
The present thesis is focused on the characterization of alternative expression systems used for recombinant protein production (RPP) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Over this whole work, the integration of results from different fields —bioprocess engineering and gene regulation— is attempted in order to fill the gaps that frequently come up when designing a RPP bioprocess. In the first chapter of the thesis, the classical PAOX1-based expression system is thoroughly studied. Specifically, through a set of chemostat cultivations of two clones expressing the Candida rugosa lipase 1 (Cr1l) with different gene dosage, it was determined the interrelation of three important factors in RPP processes such as specific growth rate (µ), heterologous gene relative transcript levels (RTL) and specific product generation rate (qp). Moreover, the expression of a crucial transcription factor of the methanol utilization pathway (MIT1) was also determined in chemostat cultivations. Once the optimal operation conditions were identified in steady state conditions, fed-batch cultivations were conducted to validate the clones’ behaviour observed previously in terms of both physiological state and Crl1 production kinetics. The inherent drawbacks of using the powerful PAOX1-based expression system —mainly derived from the use of methanol as carbon source, electron source and RPP inducer— has forced the Pichia community to investigate and develop alternative methanol-free expression systems. Due to that, in the second chapter of the thesis, two novel expression systems, based on the PPDF and PUPP, were similarly characterized in order to determine whether they can compete in terms of protein production with the widely used PGAP, usually considered the methanol-free reference, for the production of the Lipase B from Candida antarctica (CalB). All the three expression systems performance was firstly compared in chemostat cultivations, which enabled to shed light on the influence of µ and CALB expression on the CalB production kinetics. Additionally, the clones harboring the novel expression system were cultivated in fed-batch mode at the optimal conditions observed in chemostat in order to test their potential bioprocess scalability. Finally, in the last chapter of the thesis, the production of active whole cell biocatalyst based on the human cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) in P. pastoris was afforded. The coexpression of the protein along with its redox partner (cytochrome P450 reductase, CPR) was achieved by means of a bidirectional promoter system. After a screening phase in which up to 8 promoters were tested for CYP2C9/CPR production, the combination that provided the best balance was selected for subsequent bioprocess optimization experiments. In this way, the influence of important bioprocess parameters — pH, µ and methanol addition— on active CYP2C9/CPR whole cell biocatalyst production was determined. Finally, the efficiency of P. pastoris whole cell biocatalyst based on CYP2C9/CPR was tested in a proof of concept reaction of interest, in which ibuprofen is hydroxylated into its oxidized derivatives.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biotecnologia

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Tomàs, Gamisans Màrius. "Developing strategies for systems metabolic engineering of Pichia pastoris." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2017. http://hdl.handle.net/10803/458538.

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Abstract:

Pichia pastoris s’ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més utilitzades per a la producció de proteïnes recombinants i metabòlits d’alt valor afegit. En els darrers anys s’han aconseguit fites importants en l’anàlisi quantitativa a nivell de sistemes de la seva fisiologia. Aquesta gran quantitat d’informació ha permès desenvolupar models metabòlics a escala genòmica, que permeten el desenvolupament de noves estratègies per l’enginyeria de soques i de bioprocés. Amb anterioritat a aquest estudi s’havien publicat tres models metabòlics a escala genòmica per a P. pastoris. No obstant això, aquests models presentaven algunes inconsistències en algunes vies metabòliques, en la nomenclatura de metabòlits i reaccions, així com les anotacions associades a certes vies. A més, algunes de les rutes metabòliques o característiques específiques de P. pastoris eren representades de forma errònia o incompleta. És per això que en aquest estudi es desenvolupa un model metabòlic a escala genòmica consens, que integra els models anteriors. A més, també es fa una revisió exhaustiva de diverses rutes metabòliques i nombroses vies es corregeixen i actualitzen d’acord amb les publicacions disponibles. Com a resultat, el nou model, iMT1026, pot reproduir amb més precisió els paràmetres de creixement experimentals de cèl·lules creixent en glucosa i diferents nivells de disponibilitat d’oxigen. Amb la voluntat d’expandir les capacitats del model, es generen noves dades fisiològiques fent servir dos dels substrats més importants per aquesta factoria cel·lular. Es realitzen unes series de cultius en continu per a la caracterització del perfil fisiològic de P. pastoris creixent en glicerol i metanol com a fonts úniques de substrat. A més, també es caracteritza la composició macromolecular de la biomassa. Posteriorment, s’incorporen en el model noves equacions de biomassa específiques per a cada font de carboni. Aquestes noves dades experimentals han permès estimar els paràmetres energètics associats a les fonts de carboni i validar el model (iMT1026 v3.0) per aquestes condicions de creixement. Tot i la validació de iMT1026 v3.0 en un rang més ampli de condicions, en aquest treball es prova en dues aplicacions diferents: en l’anàlisi de fluxos metabòlics basat en 13C i com a eina de suport per a la interpretació de resultats en soques amb modificades en el metabolisme redox. Tot i que hi ha un únic estudi on s’analitza la relació entre fluxos metabòlics en cèl·lules creixent en glicerol, no es té constància de cap estudi d’anàlisi de fluxos metabòlics en aquesta font de carboni. Així doncs, es redueix el model metabòlic a escala genòmica a un model del metabolisme central i es fa servir per a l’anàlisi de fluxos metabòlics basats en 13C en cèl·lules creixent amb glicerol a diferents velocitats de creixement. Els resultats obtinguts són molt consistents amb els cultius previs en glicerol. També s’utilitza iMT1026v3.0 com a suport per a la interpretació del perfil fisiològic obtingut en soques amb el metabolisme redox modificat. Una soca que expressa un fragment d’anticòs es modifica genèticament mitjançant l’expressió d’una NADH quinasa, de manera que el balanç de cofactors redox queda pertorbat. Les soques generades mostren una producció de proteïna recombinant més elevada i una alteració en el perfil macroscòpic de creixement. Mitjançant l’anàlisi in silico dels perfils fisiològics resultants, es prediuen possibles canvis metabòlics associats a l’alteració del balanç de cofactors que estan d’acord amb el perfil macroscòpic observat. Així doncs, en línies generals, en aquest treball es desenvolupa una eina precisa per a l’enginyeria de sistemes metabòlics. A més, és validada en condicions vàries i s’utilitza en dues aplicacions diferents que demostren la seva fiabilitat.
Pichia pastoris has become one of the most extensively used platform cell factories for recombinant protein and high-value added metabolite production. In the past recent years, important breakthroughs in the systems-level quantitative analysis of its physiology have been achieved. This wealth of information has allowed the development of genome-scale metabolic models, which make new approaches possible for host cell and bioprocess engineering. Previous to this work, three different genome-scale metabolic models were available for P. pastoris. Nevertheless, these models showed some inconsistencies regarding certain pathways, including the terminology for both metabolites and reactions and annotations. Furthermore, some P. pastoris specific metabolic traits were misrepresented. Therefore, in this study, a consensus genome-scale metabolic model has been developed, thereby integrating the prior models. In addition, a comprehensive revision of metabolic pathways was performed and several pathways were curated and updated according to the currently available literature. As a result, the new model, iMT1026, is able to more accurately reproduce experimental growth parameters using glucose as carbon source and different oxygen availability conditions. In order to expand the capabilities of the consensus model, new physiological datasets of cells growing on two of the most relevant substrates for this cell factory were generated. Specifically, a series of chemostat cultivations were performed to characterise the physiologic profile and macromolecular biomass composition of P. pastoris growing on glycerol and methanol as sole carbon sources. Also, macromolecular biomass composition was analysed, allowing us to incorporate new carbon-source specific stoichiometric biomass equations into the model, as well as to estimate the associated energetic parameters. Overall, a new version of the model (iMT1026 v3.0) was validated for these growing conditions. In addition to the validation of iMT1026 v3.0 for a wider range of carbon sources and growth conditions, we have further tested its performance in two different applications, namely, the generation of reduced metabolic models suitable for 13C-based metabolic flux analysis and, assisting the interpretation of physiological growth parameters of redox-cofactor engineered strains. In particular, the genome-scale metabolic model has been reduced into a core model and used for 13C-based metabolic flux analysis of cells growing on glycerol at different growth rates. To our knowledge, this is the first study ever reported of 13C-MFA using glycerol as sole carbon source. Notably, flux analyses are highly consistent with pioneering 13C-based metabolic profiling studies of P. pastoris growing on glycerol. iMT1026 v3.0 was also employed for assisting the interpretation of the physiological profiles obtained for redox-cofactor engineered strains. A recombinant strain producing an antibody fragment was engineered to overexpress a heterologous NADH kinase, aiming at increased NADPH regeneration rates. Notably, the redox-engineered strains showed an increase in recombinant protein production and altered macroscopic growing profiles. In silico analysis of the impact of NADH kinase overexpression using the iMT1026 model predicted possible metabolic changes associated to the redox cofactor imbalance that were in agreement with the observed physiological phenotypes. Overall, a refined tool for systems metabolic engineering is provided in the present study. Moreover, such tool has been validated for a wide range of environmental conditions and employed in two different applications, confirming its reliability.

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Hashimoto, Vivian Lika. "Clonagem e expressão gênica de antígenos candidatos vacinais contra leptospirose." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-11062012-082558/.

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Abstract:

A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais domésticos, silvestres e o homem, causada por bactérias do gênero Leptospira. No Brasil, a hemorragia pulmonar constitui o principal fator de risco para o óbito com taxas de letalidade para essa forma da doença superior a 50%. Desta maneira, o desenvolvimento de uma vacina preventiva e o melhor entendimento dos mecanismos de lesão envolvidos nos processos de desenvolvimento da leptospirose nos permitirá propor novas terapêuticas a fim de diminuir a alta letalidade associada à doença. Neste trabalho propusemos investigar doze genes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. A identificação de uma metaloprotease abre caminho para a investigação de uma possível protease envolvida nos processos hemorrágicos para essa importante zoonose. Esperamos, com os resultados apresentados neste trabalho, contribuir com a caracterização da biologia e patogenicidade da leptospirose.
Leptospirosis is an infectious disease that affects domestic animals, wildlife and humans, caused by bacteria of the genus Leptospira. In Brazil, pulmonary hemorrhage is the major risk factor to death with mortality rates for this form of the disease over than 50%. Thus, the development of a preventive vaccine and better understanding of injury mechanisms involved in leptospirosis would allow us to propose new therapies to reduce the high mortality associated with the disease. In the present study we proposed to investigate twelve genes of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. The identification of one protease opens the way for the investigation of a possible protease involved in bleeding processes in this important zoonosis. With the results presented here, we expect to contribute to the biology and pathogenicity characterization of leptospirosis.

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Silva, Lucas Pereira e. "Clonagem, expressão e caracterização de prováveis proteínas de membrana indentificadas no genoma de Leptospira interrogans." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24082016-094832/.

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Abstract:

A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro. Dois genes de L. interrogans foram selecionados, clonados, expressos e suas respectivas proteínas caracterizadas. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. A proteína rLIC10821 foi capaz de se ligar a laminina, plasminogênio e fibrinogênio. Ambas as proteínas foram localizadas na membrana externa de acordo com as três metodologias utilizadas: imunofluorescência, proteinase K, leptospira intacta. A proteína rLIC10821 que interagiu com o PLG foi capaz de gerar plasmina. Após a interação da proteína rLIC10821 com o fibrinogênio, foi possível identificar uma diminuição de 60% no coágulo de fibrina.
Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Currently research has focused to identify conserved antigens related to the host-pathogen interaction. Two genes of L. interrogans were selected, cloned, expressed and its proteins characterized. The genes were amplified by PCR and cloned into expression vetor pAE. The recombinant proteins were purified by chromatography of metal affinity. The protein rLIC10821 were able to bind to laminin, plasminogen and fibrinogen. Both proteins were localized in the outer membrane according three methodologies: immunofluorescence, proteinase K, intact leptospira. The protein rLIC10821 interacted with PLG was able to generate plasmin. After the interaction of the protein rLIC10821 with fibrinogen, we could identify a decrease of 60% in the fibrin clot.

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Oliveira, Tatiane Rodrigues de. "Estudo da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes correspondentes a antígenos de estágios assexuados sanguíneos de Plasmodium vivax." Universidade de São Paulo, 2006. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-21082017-110631/.

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Abstract:

No presente estudo, avaliamos a resposta imune naturalmente adquirida ao Plasmodium vivax em indivíduos de áreas endêmicas de malária utilizando proteínas recombinantes baseadas em três antígenos de formas assexuadas sanguíneas do parasita: Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (MSP1 19) e Antígenos Variantes de P. vivax (VIR). Sete proteínas recombinantes correspondentes a quatro subfamílias VIR (A, B, C e E) foram incluídas neste estudo. Inicialmente, as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 200 indivíduos infectados por P. vivax procedentes dos estados do Pará e Rondônia. As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM ou IgG anti-VIR durante a infecção foram de 29,6% e 26,0%, respectivamente. Não observamos predomínio de determinadas subclasses de IgG na resposta imune anti-VIR, com exceção da subfamília C que foi predominantemente reconhecida por anticorpos da subclasse IgG1. Em contraste, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para as proteínas AMA-1 e MSP119 foram significativamente mais altas (57,0% e 90,5%, respectivamente). A resposta imune celular aos antígenos VIR foi avaliada por ensaios de proliferação in vitro com células mononucleares de indivíduos recentemente expostos ao P. vivax. Não observamos respostas proliferativas significativas a estes antígenos quando comparamos o grupo de indivíduos exposto ao P. vivax com o grupo não exposto. Posteriormente, avaliamos o padrão de reatividade cruzada entre anticorpos e células T contra as quatro subfamílias VIR através da imunização experimental de camundongos BALB/c com cada uma das proteínas na presença de adjuvante de Freund. Os títulos de anticorpos IgG dos animais imunizados contra cada proteína recombinante foram detectados por ELISA de inibição. Altos títulos de anticorpos específicos contra as proteínas VIR foram obtidos após a 2ª dose de imunização. Além disso, observamos que o esquema de imunização utilizado, constituído por duas doses seqüenciais de cada uma das proteínas recombinantes VIR, foi capaz de induzir anticorpos de reatividade contra as diferentes subfamílias VIR. Complementamos estes estudos avaliando a resposta proliferativa de células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados e re-estimuladas in vitro com cada uma das proteínas VIR. Os resultados demonstraram que as proteínas VIR contêm epítopos específicos e de reatividade cruzada para células T. Estes dados sugerem fortemente a presença de epítopos comuns entre esses antígenos e mostram que o esquema de imunização utilizado pode servir como base para futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não humanos.
In the present study, we evaluated comparatively the acquired immune response to Plasmodium vivax in individuais from endemic areas of malaria using recombinant proteins based on three antigens from asexual blood stages of the parasite: Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein1 (MSP1 19), and Variant Antigens of P. vivax (VIR). Seven recombinant proteins corresponding to the four VIR subfamilies (A, B, C and E) were included in this study. Initially, the different recombinant proteins were compared by ELISA with regard to the recognition by IgM, IgG, and IgG subclass of antibodies from 200 individuais with patent infection from the States of Pará and Rondônia. The frequencies of individuais that presented IgM ar IgG antibodies anti-VIR during the infection were 29.6% or 26.0%, respectively. We did not observe predominance of any IgG subclass during immune response anti-VIR, except in the case of the C subfamily which was predominantly recognized by IgG1 subclass. In contrast, the frequencies of the individuais that presented IgG antibodies to AMA-1 e MSP119 were significantly higher (57.0% and 90.5%, respectively). The cellular immune response to VIR antigens was evaluated by in vitro proliferative assays in mononuclear cells of the individuais recently exposed to P. vivax. We did not observe significantly proliferative responses to these antigens when we compared malaria exposed and non exposed individuais. Subsequently, we evaluated the pattern of cross recognition between antibodies and T cell against four VIR subfamilies after experimental immunization of BALB/c mice with each one of the proteins emulsified with Complete Freund\'s adjuvant. The IgG antibody titers of the mice immunized against each one of the recombinant proteins were detected by inhibition ELISA. High specific titers against VIR proteins were obtained after the second immunizing dose. Most importantly, we observed that the immunization schedule constituted by two sequential doses of each one of the VIR recombinant proteins were able to induce cross-reactive antibodies against the different VIR subfamilies. These studies were complemented by lymphocyte proliferative response analysis of the immunized mice after an in vitro stimulation with each one of the VIR proteins. Our results demonstrated that the VIR proteins presented specific and cross-reactive epitopes recognized by T cells. These data strongly suggested of the commons epitopes are present and showed that this schedule of immunization may be used as basis for future studies aimed at inducing protective immunity against vivax malaria in non human primates.

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Figueredo, Jupciana Martins. "Avaliação do papel de duas proteínas de Leptospira interrogans na patogênese da leptospirose." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-23032017-151831/.

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Abstract:

Leptospirose é uma zoonose mundial que acomete várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causada por espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Possui um quadro de manifestação clínico muito variado, podendo apresentar desde sintomas comuns a outras doenças como febre, calafrios, cefaleia, dores musculares, enjoo, vômitos, diarreia e uma forma mais severa da infecção denominada síndrome de Weill. Seguindo a estratégia de genômica funcional, foram selecionados genes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 e LIC12287, tendo como critério a predição de localização das proteínas na membrana. Os fragmentos referentes aos genes LIC11122 e LIC12287 foram clonados no vetor pGEM-T Easy e subclonados no vetor de expressão pAE. As proteínas avaliadas interagem com laminina e plasminogênio, de forma dose-dependentes e saturáveis, sugerindo atuam nos processos de patogênese da bactéria. A presença de um fator sigma na superfície celular desempenhando um papel secundário, sugere que a rLIC11122 pode ser uma proteína moonlight.
Leptospirosis is a worldwide zoonosis that affects several species of mammals, including humans, caused by species of pathogenic bacteria of the genus Leptospira. It has a very varied clinical manifestation board and may have symptoms from common tropical diseases such as fever, chills, headache, muscle aches, nausea, vomiting, diarrhea and a severe syndrome of infection known as Weill syndrome. Following the functional genomics strategy, genes were selected from Leptospira interrogans serovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 and LIC12287, with the criterion of the prediction location of proteins in the membrane. The fragments related to genes LIC11122 and LIC12287 were cloned into pGEM-T Easy vector and subcloned into the expression vector pAE. The evaluated proteins interact with laminin and plasminogen, dose-dependent and saturable manner, suggesting participation in bacterial pathogenesis processes. The presence of a sigma factor on the cell surface plays a secondary role, suggests that performs a moonlight rLIC11122 protein.

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Koscky, Paier Carlos Roberto 1983. "Caracterização estrutural do complexo protéico Calsarcina 1 : Calcineurina A." [s.n.], 2014. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314411.

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Abstract:

Orientador: Kleber Gomes Franchini
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-26T03:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KosckyPaier_CarlosRoberto_D.pdf: 7798282 bytes, checksum: 043e551d51c3a8309982d9ff59835b10 (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: A via de sinalização da Calcineurina (Cn), uma fosfatase dependente de cálcio, desempenha papel chave no desenvolvimento, na hipertrofia e no remodelamento patológico do coração. A Calcineurina é negativamente regulada pelas Calsarcinas (CS), uma família de proteínas específicas do músculo estriado, que interagem diretamente com Cn. No entanto, os mecanismos moleculares de inibição de Cn por CS permanecem obscuros. Compreender a estrutura do complexo Cn:CS é fundamental para desvendar esse mecanismo de regulação. Neste trabalho foram combinados ensaios bioquímicos, crosslinking químico acoplado à Espectrometria de Massas (experimentos de MS / MS), análise mutacional e uma estratégia de modelagem computacional para a caracterização estrutural do complexo CnA:CS1 (isto é, constituído pela subunidade A de Cn e a isoforma 1 de CS, ambas murinas). O complexo recombinante foi submetido a crosslinking químico, tripsinizado e analisado por LC-MS/MS. Os dados obtidos foram utilizados em um docking in silico dos modelos de ambos os polipeptídeos, gerando várias poses para o complexo. As poses de menor energia de ligação foram agrupadas de acordo com semelhança estrutural e submetidas à simulação de dinâmica molecular. A superfície de interação identificada em CnA abrangeu as ?-hélices 1, 3 e loops vizinhos, enquanto a superfície correspondente de CS1 compreendeu os loops carboxiterminais das regiões Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 e Thr250-Leu264. Notavelmente, a superfície de interação de CnA situa-se muito próxima à folha-? 14, o principal sítio de ligação do motivo PxIxIT do fator de transcrição NFAT, importante efetor da Calcineurina. Experimentos realizados com vários mutantes de CnA (FLAG- CnA) e CS1 (myc -CS1 ) foram utilizados para validar o modelo estrutural do complexo CnA:CS1. Os resíduos Lys40 (CnA) e Glu254 (CS1) foram identificados como críticos para a estabilidade do complexo. O modelo gerado neste estudo apoia a hipótese de que CS1 interage com um sítio alostérico para inibir a atividade de CnA
Abstract: Signaling by the calcium-dependent phosphatase calcineurin (Cn) plays key roles in regulating cardiac development, hypertrophy, and pathological remodeling. Cn binds to and is negatively regulated by calsarcins (CS), a family of muscle-specific proteins. However, the molecular mechanisms involved in the inhibition of Cn by CS remain unclear. Understanding the architecture and structure of Cn-CS complex is critical to unravel the regulation of Cn by CS. Here we combined biochemical assays, chemical crosslinking coupled to mass spectrometry experiments (MS/MS), mutational analysis and a modeling strategy for structural characterization of CnA-CS1 assembly. The MS/MS data obtained from the cross-linked peptides of both proteins were used to guide an in silico docking of their polypeptide models. The protein complex models with the smallest estimated binding energy were clustered according to structural similarity and submitted to molecular dynamics simulation. The interacting surface of CnA was mapped in a pocket between the 1st and 3rd ?-helixes and surrounding loops, while the corresponding surface of CS1 was mapped to the carboxyterminal loops within the Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 and Thr250-Leu264 regions. Notably, the region of CnA that interacts with CS1 was found to be located in close proximity, but not coincident, to the ?-sheet 14, the main binding site for the PVIVIT sequence of NFAT. Experiments performed with several CnA (FLAG-CnA) and CS1 (myc-CS1) mutants were used to validate the structural model of the CnA-CS1 assembly. The Lys40 (CnA) and Glu254 (CS1) residues were identified as critical for the complex stability. The model that emerges from this study supports the notion that CS1 interacts with an allosteric site to inhibit the activity of CnA
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

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Pereira, Priscila Romero Mazzini. "Caracterização imunogênica e funcional de duas lipoproteínas preditas de Leptospira interrogans expressas em Escherichia coli." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-23052017-141254/.

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Abstract:

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro.
Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

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Corgozinho, Carolina Nunes Costa. "Desenvolvimento de vacina baseada em sistema de liberação sustentada contendo proteína recombinante." Universidade de São Paulo, 2008. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-31072009-083709/.

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Abstract:

No Brasil, e em outros paises de clima tropical, os carrapatos se tornaram um enorme problema economico de^$de que a industria do gado se desenvolveu. O carrapato Boophilus microplus, um dos artropodes mais importantes na veterinaria, causa efeitos direto, como suc,cao de sangue, e indireto, como a transmissao de uma grande variedade de patogenos que normalmente resulta em infec,c~es letais. As vacinas genicas contendo o antigeno Bm86, uma proteina ligada a membrana do intestino do carrapato B. microplus, representam uma alternativa atrativa aos acaricidas para controlar as infesta~oes por carrapatos em contrapartida aos inconvenientes produtos quimicos. Devido sua administra,cao ser feita em 4 doses no primeiro ano, seguida de refor,cos a cada seis meses, estas formula,coes vacinais nao s3c adequadas para paises com cria,cao extensiva de gado, como no Brasil. Visando uma libera~ao sustentada do antigeno Bm86, neste trabalho desenvolveuse uma vacina de dose unica baseada em microesferas polimericas. Para obter o padrao de liberac,ao desejavel, diferentes formula,coes e parametros de processo foram variados, como a composi,cao do polimero, a taxa entre os monomeros ^Uacido latico:acido glicolico\" e o tamanho das microparticulas. As formula,coes foram preparadas pelo metodo de emulsao multipla e evapora,cao do solvente. A formula~ao que melhor se enquadrou nos objetivos da vacina de dose unica foi preparada com PLGA 75:25, solu,cao 3% de PVA como estabilizante, agita,cao de 11000 rpm para forma,cao da emulsao primaria e de 800 rpm para forma,cao da emulsao multipla e evapora,cao do solvente. As particulas assim obtidas apresentaram um tamanho medio de 25 ,um, uma taxa de encapsula,cao maior que 90% e aproximadamente 50% da proteina foi liberada in vitro em 60 dias. Analises por SDS-PAGE e Westem Bloning revelaram que a proteina se manteve integra apos encapsula,cao. Os resultados da avalia,cao da imunogenicidade em bovinos mostraram que a formula,cao baseada em microesferas polimericas biodegradaveis e habil a conseguir, com uma unica dose, uma resposta imune similar aquela conseguida com tres doses das formula,coes convencionais da vacina de Bm86.
In Brazil, and in others tropical countries, the ticks have become a huge economic problem since the industry of livestock has developed. Ticks and tick-borne diseases affect animal and human health and are the cause of significant economic losses. The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important arthropods in veterinary. This tick species causes both direct effects, such as blood sucking, and indirect effects, such as transmission of a wide variety of pathogens, which usually result in lethal infections. The gene vaccines based on Bm86 antigen, a midgut membrane-bound protein of the cattle tick B. microplus, represent a good alternative to control tick infestations, compared to chemicals. However, due to these vaccine formulations need 4 doses over the first year with booster at each 6 months to be effective, they are not suitable for countries with extensive cattle raising, like Brazil. Aiming a sustained release of Bm86 antigen, in this work we developed a single shot vaccine based on Bm86 loaded polymeric microspheres. In order to obtain desired release patterns, different formulations and processing parameters were varied, for example, the composition of the polymer, the monomer ratio lactic acid:glycolic acid and the size of the microparticles. The formulations were prepared by solvent evaporation method based on double emulsion. The formulation that presented better result as single shot vaccine was prepared with PLGA 75:25, solution 3% of PVA as stabilizer, agitation of 11000 rpm to form the primary emulsion and 800 rpm to obtain the double emulsion and solvent evaporation. The particles thus obtained presented an average size of 25 m, encapsulation ratio greater than 90% and approximately 50% of the protein was released in vitro in 60 days. Analysis by SDSPAGE and Western Blot showed that the integrity of the protein remained after encapsulation. The immunogenic studies showed that the formulation based onbiodegradable polymeric microspheres is able to elicit, with a single dose, an immune response and protection similar to that attained with 3 doses of conventional Bm86 vaccine formulations.

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Chaves, Roberta Viana Ara?jo. "Avalia??o de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e express?o de ant?genos de Leishmania chagasi (kmp11 e P36)." Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2009. http://repositorio.ufrn.br:8080/jspui/handle/123456789/15787.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico
Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies
A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo

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Schimpl, Flávia Camila 1987. "Teores de metilxantinas e metabolismo de cafeína em frutos de guaraná (Paullinia cupanavar. sorbilisKunth.)." [s.n.], 2013. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/315466.

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Abstract:

Orientador: Paulo Mazzafera
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-23T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schimpl_FlaviaCamila_M.pdf: 3074978 bytes, checksum: 589ce5b09a9c5f294c4bd4eaaff896b1 (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: Alguns grupos de plantas caracterizam-se por acumularem cafeína. Chá, café e guaraná, que acumulam cafeína, são algumas dessas plantas. As sementes de guaraná possuem o maior teor de cafeína já descrito em plantas, entre 2,5 e 6%. A popularização dos produtos a base de guaraná e a alta demanda por cafeína natural (obtida por descafeinação de plantas) destacam o interesse comercial pela espécie. A biossíntese de cafeína em plantas foi extensivamente estudada em café e chá e ambas espécies têm as mesmas vias chave da biossíntese da cafeína. O terceiro passo da via ocorre na presença de teobromina sintase (TS), enzima com atividade específica na conversão de 7-metilxantina em teobromina, e/ou dependendo da espécie, na presença de cafeína sintase (CS), uma enzima bifuncional que atua nos dois últimos passo da síntese de cafeína, na conversão da 7-metilxantina para teobromina e posteriormente desta para cafeína. O objetivo desta tese foi caracterizar os níveis de metilxantinas, atividade e expressão de CS em frutos de guaraná, sendo que para isto foram realizadas análises bioquímicas e moleculares nos tecidos de cinco cultivares (BRS-Amazonas, BRS-CG372, BRS-CG611, BRS-Maués, BRS-Luzéia). Teobromina acumulou preferencialmente em folhas (estádios jovem, intermediária e madura), caule (porção apical e basal), inflorescência, pericarpo de frutos nos estádio verde, intermediário e maduro. Nas sementes, a cafeína foi o alcaloide que acumulou em maior quantidade e atingiu níveis entre 3,3 e 5,8%. Nos tecidos analisados, seja teobromina ou cafeína, a maior concentração do alcaloide foi em tecidos novos, reduzindo com o desenvolvimento. Enquanto que teofilina foi encontrada em quantidades baixas em todos os materiais. A maior concentração de cafeína em frutos imaturos foi confirmada pela maior atividade de CS e maior expressão de PcCS. A busca do gene da CS de guaraná no banco de sequências EST Realgene gerou uma sequencia de nucleotídeos (PcCS) com 1080 pb, que apresenta semelhança filogenética com proteínas de CS de cacau (BCS1) e chá (TCS1 e TCS2). A produção da proteína recombinante permitiu a caracterização funcional de PcCS como uma CS bifuncional, capaz de catalisar os dois últimos passos de metilação da biossíntese de cafeína. PcCS mostrou afinidade para 7-metilxantina e teobromina (maior afinidade), diferindo das CS descritas para outras espécies acumuladoras de cafeína, que possuem maior afinidade por paraxantina. Provavelmente isto se deve aos resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo da proteína predita, quando comparada com a de café
Abstract: Some plants are characterized by presenting high contents of caffeine. Tea, coffee and guarana, which accumulate the alkaloid caffeine, are some of these plants. Guarana seeds have the highest caffeine content (2.5 and 6%) among plants accumulating methylxanthine alkaloids. The increase in popularity of products made from guarana and the high demand for natural caffeine (obtained by decaffeination plant) justify the commercial interest for this species. The biosynthesis of caffeine in plants has been extensively studied in coffee and tea and both species present high similarity regarding the caffeine biosynthesis pathway. The third step of the pathway occurs in the presence of the enzyme theobromine synthase (TS), which converts 7-methylxanthine to theobromine but depending on the species, this step is also mediated by caffeine synthase (CS), an bifunctional enzyme that in addition to convert 7-methylxanthine to theobromine, also convert the later to caffeine. The aim of this study was to characterize the levels of methylxanthine alkaloids, activity and expression of caffeine synthase in the guarana fruit, and for this biochemical and molecular analyses were carried out in tissues of five cultivars of guarana (BRS-Amazonas, BRS-CG372, CG611-BRS, Maués-BRS, BRS-Luzéia). Theobromine was preferentially accumulated in the leaves (young, intermediate and mature stages), stems (apical and basal sections), inflorescence, and pericarp of fruits (green, intermediate and mature stages). However caffeine accumulated in the seeds as the main alkaloid and reached levels between 3.3 and 5.8%. In all tissues analyzed, whether theobromine or caffeine, the alkaloid concentration was higher in new tissues, reducing with the development/maturation. While theophylline was found in low amounts in all materials. The highest concentration of caffeine in immature fruits was confirmed by the highest activity of CS and highest expression of PcCS. The search for the CS gene of guarana in the EST guarana database Realgene generated a sequence of nucleotides (PcCS) with 1080 bp, which presented phylogenetic similarity with proteins of caffeine synthase from cocoa (BCS1) and tea (TCS1 and TCS2). The production of the PcCS recombinant protein allowed the functional characterization of the enzyme as a bifunctional CS, able to catalyze the two last methylation steps in the biosynthesis of caffeine. PcCS showed affinity for 7-methylxanthine and theobromine (highest), differing from the CS described for other species accumulating caffeine, which have highest affinity paraxanthine. This is probably due to the amino acid residues present in the active site of the predicted protein when compared to coffee
Mestrado
Biologia Vegetal
Mestra em Biologia Vegetal

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Pereira, Cristiane Tambascia. "Estudos funcionais e estruturais para a caracterização da via de captação e assimilação de sulfato em Xanthomonas axonopodis pv. citri." Universidade de São Paulo, 2013. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-05112013-113438/.

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Abstract:

Em Escherichia coli, a assimilação de sulfato e sua redução a sulfeto é mediada por um transportador do tipo ABC codificado pelos genes sbpcysWUA e várias enzimas codificadas por cysNCDGHIJ. Embora a importância deste sistema tenha sido largamente demonstrada em outros organismos, não existem relatos na literatura sobre a via na bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). Neste trabalho, utilizando uma abordagem funcional baseada em análises de bioinformática, proteômica e gene repórter, mostramos que a via de sulfato está presente e ativa em X. citri. Ainda, a partir da expressão e produção em larga escala da proteína ligadora de sulfato Sbp, realizamos ensaios de biofísica que evidenciaram a interação da proteína com sulfato e o aumento da estabilidade térmica e estrutural, obtendo-se cristais. O trabalho apresenta as primeiras evidências da funcionalidade desta via em X. citri durante o crescimento in vitro e infecção in vivo e abre pespectivas de estudos para compreensão do papel deste íon na fisiologia do microrganismo.
In Escherichia coli, the capture and reduction of sulfate to sulfide is mediated by an ABC-type transporter encoded by genes sbpcysWUA and several enzymes encoded by cysNCDGHIJ. Although the importance of this system has been widely demonstrated in other organisms, there are no reports in the literature related to the way that sulfate is assimilated and reduced in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). In this work, using a functional approach based on bioinformatics analysis, proteomics and gene reporter, we show that the way is present and active in X. citri. Indeed, the sulfate binding protein was expressed and produced in large scale for biophysical assays demonstrating the interaction of the protein with sulfate and increased thermal stability and crystals was produced. The study presents the first evidence of the functionality of this pathway in X. citri during growth in vitro and in vivo infection and opens perspectives studies to understand the role of this ion in the physiology of the microorganism.

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Domingos, Renan Francisco. "Caracterização de duas proteínas de Leptospira interrogans na patogênese da leptospirose." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-09122014-122906/.

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Abstract:

O sequenciamento da L. interrogans sorovar Copenhageni e as análises bioinformáticas permitiram a identificação de candidatos vacinais e fatores de virulência. Foram selecionados dois genes, LIC11834 e LIC12253, que foram submetidos a ensaios de presença do DNA genômico e RNA mensageiro em diferentes sorovares de Leptospira. Observamos que o gene LIC12253 foi o mais presente entre os sorovares testados. Os genes foram clonados em vetor de expressão pAE e expressos em E. coli BL21 SI. As proteínas recombinantes foram purificadas e submetidas a ensaio de dicroísmo circular, o qual confirmou que ambas as proteínas estavam estruturadas. Por meio de testes de imunogenicidade em camundongos, ambas as proteínas mostraram-se imunogênicas, apresentando altos títulos de anticorpos, porém não foram capazes de promover resposta imune celular. Em ensaios de localização das proteínas nativas podemos observar a presença destas proteínas na membrana externa de Leptospira. Ensaios de reatividade com soros de pacientes diagnosticados com leptospirose mostraram que há reconhecimento das proteínas por anticorpos presentes nesses soros, sugerindo que as proteínas são expressas durante a infecção. Em ensaios de adesão a componentes de matriz extracelular e componentes do soro e plasma humano, rLIC11834 apresentou ligação à laminina, sendo nomeada de Lsa33, além de ligação ao plasminogênio, ao C4bp e ao fibrinogênio de forma dose-dependente; rLIC12253 apresentou ligação à laminina, sendo chamada de Lsa25, e ao C4bp de forma dose-dependente. Ensaios de desafio demonstraram que as proteínas não apresentam proteção contra infecção letal em hamsters. Assim, acreditamos que estas proteínas multifuncionais possam interagir com proteínas do hospedeiro e ter participação na patogênese da doença.
The genomic sequencing and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of new vaccine candidates and new virulence factors. Therefore, two genes from L. interrogans serovar Copenhageni, LIC11834 and LIC12253 were selected and subjected to assays for the presence of genomic DNA and mRNA in different serovars of Leptospira. These assays found that the gene LIC12253 was the most present among the tested serovars. The genes were then cloned in the expression vector pAE and expressed in E. coli BL21 SI. The recombinant proteins were purified and subjected to circular dichroism, which confirmed that both proteins presented secondary structures. Immunogenicity tests in mice showed that both proteins are immunogenic, with high antibodies titers, but don\'t induce cellular immune response. Localization assays of the native proteins on the leptospiras demonstrated the presence of the proteins on the surface of Leptospira. Reactivity assays with sera of patients diagnosed with leptospirosis showed that the recombinant proteins could be recognized by their antibodies, suggesting that they are expressed during infection. Adhesion assays to the extracellular matrix components, human serum and plasma components, showed that the protein rLIC11834 binds to laminin and was called Lsa33. In addition, Lsa33 interacts to plasminogen, to C4bp and to fibrinogen in a dose-dependent manner. The protein rLIC12253 showed binding to laminina, named Lsa25, and to C4bp in a dose-dependent manner. Challenge assays showed that both recombinant proteins don\'t afford protection against lethal infection in hamsters. Thus, we believe that these multifunctional proteins may interact with host proteins and may play a role in leptospiral pathogenesis.

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Dias, Rodrigo Yukio Shiroma. "Caracterização dos efeitos do Amblyomin-X sobre a angiogênese e a célula endotelial." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9141/tde-06092013-152354/.

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Abstract:

A proteína recombinante inibidora de serinoprotease denominada de Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense, construída e utilizada para identificar um gene que codifica um inibidor de serinoprotease do tipo Kunitz. O Amblyomin-X inibe a formação da massa tumoral in vivo, no entanto o mecanismo envolvido neste efeito não está totalmente esclarecido. Visto que um dos mecanismos anti-carcinogênicos dos inibidores de serinoproteases é a inibição do processo de angiogênese, este trabalho foi delineado para avaliar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial envolvidas neste processo. A angiogênese in vivo foi estudada em modelo de câmara dorsal por microscopia intravital. Quarenta e oito horas após a implantação da câmara dorsal, os animais receberam tratamento tópico de salina ou de Amblyomin-X por 8 dias, com intervalos de 48 horas a cada dose (10, 100 ou 1000ng/mL). Os efeitos foram avaliados em condições basais e na vigência do crescimento tumoral (injeção de 1x105 células B16-F10 de melanoma murino no tecido subcutâneo). Adicionalmente, os efeitos do Amblyomin-X sobre a permeabilidade vascular foram avaliados pela mensuração espectrofotométrica da quantidade de corante extravasado no tecido dos animais após injeção intradérmica do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ou do Amblyomin-X. Uma série de estudos in vitro foram realizados em células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End) para avaliar os efeitos do Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) sobre: 1) a migração destas células, usando modelos bidimensional (2D) de cicatrização in vitro e tridimensional (3D) em câmara de Boyden modificada, na ausência e frente ao fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF; 100 ng/mL); 2) sobre a aderência em Matrigel® e 3) sobre a secreção de prostaglandina E2 (PGE2) e a produção de óxido nítrico (NO) por ensaio imunoenzimático e reação de Griess, respectivamente. Ademais, foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre a viabilidade das células B16-F10 (1x105) por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostram que a aplicação tópica de Amblyomin-X reduziu o número de vasos no tecido subcutâneo dorsal (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1° dia de tratamento). O mesmo efeito foi observado na presença de células B16-F10 (1000ng/mL= 44,3% vs 1° dia de tratamento), além de uma redução no desenvolvimento da massa tumoral (1000ng/mL= 88% vs controle). O tratamento com Amblyomin-X reduziu a migração basal das células t-End no modelo 2D (10ng/mL=16,4%; 1OOng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs controle) e 3D (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inibiu a adesão destas células endoteliais em Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs controle); não alterou produção os mediadores químicos NO e PGE2 pelas células endoteliais; não modificou a permeabilidade vascular e não alterou a viabilidade das células de melanoma murino B16-F10. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos em condições basais e na vigência de crescimento tumoral in vivo que este efeito pode estar relacionado à redução do desenvolvimento tumoral, uma vez que a concentração de Amblyomin-X que inibe a angiogênese não causou citotoxicidade às células tumorais in vitro. Além disso, os mecanismos envolvidos no processo de angiogênese podem ser decorrentes, pelo menos em parte, de prejuízos na migração e adesão das células endoteliais.
The recombinant serine protease inhibitor protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajennense salivary glands constructed and used to identify a gene encoding a kunitz type serine protease inhibitor. Amblyomin-X presents inhibitory effect on tumoral mass formation in vivo. Nevertheless, the mechanisms involved in the effects have not been clarified. Considering that interference on angiogenesis process is one of the mechanisms responsible for the antitumor activity displayed by serine protease inhibitors, this project was undertaken to study the Amblyomin-X actions on this process and on related endothelial cell functions. In vivo angiogenesis was studied using dorsal chamber model associated to intravital microscopy. Forty eight hours after dorsal chamber implantation, the animals were topically treated with saline or Amblyomin-X during 8 days, with intervals at each 48hs (10, 100 ou 1000ng/mL). The effects were evaluated at basal conditions or during tumoral development (1x105 B16-F10 murine melanoma cells injected into subcutaneous tissue). In addition, the effects of Amblyomin-X on vascular permeability were evaluated by measuring the dye leakage into dorsal intradermic tissue after local injection of vascular endothelial growth factor (VEGF) or Amblyomin-X, or both. In vitro assays were also performed using endothelial cells from microcirculation (t-End) and the effects of Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) were studied on: 1) cell migration, using bidimensional (2D) and tridimensional (3D) models in modified Boyden chamber using chemotatic factor (VEGF100 ng/mL); 2) Matrigel® adherence and, 3) prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO) secretion by enzymatic assay and Griess reaction, respectively. In addition, the Amblyomin-X toxicity was evaluated on the B16-F10 cells (1x105), using flow citometry. Results obtained show that topic application of Amblyomin-X reduced the number of vessels in the subcutaneous dorsal tissue (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1st day of treatment). The same effect was observed in the presence of B16-F10 cells (1000ng/mL= 44,3% vs 1st day of treatment), simultanesouly to a significant reduction on tumoral mass development (1000ng/mL= 88% vs control). Amblyomin-X treatment impaired basal migration of tEnd in the 2D (10ng/mL=16,4%; 100ng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs control) and 3D model (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inhibited the adhesion of t-End in Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs control); did not alter the production of chemical mediators (PGE2 and NO); did not modify the vascular permeability and did not affect the B16-F10 cells viability. Taken together, data here obtained show that Amblyomin-X inhibited the new vessels formation under basal conditions, and during tumoral development. The effect could be related to the reduction of tumoral progress also detected in vivo, asthe schedule of treatment employed did not induce cancer cell toxicity. The mechanisms involved in the reduced angiogenesis may be related, at least in part, to the impaired endothelial cell migration and adhesion.

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Rossini, Amanda Diaz. "Caracterização de uma proteína de Leptospira interrogans e avaliação do seu envolvimento na relação patógeno-hospedeiro." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-15062018-101521/.

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Abstract:

As bactérias patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma doença de importância global. As leptospiras patogênicas causam infecção em um amplo espectro de animais e no homem. As leptospiras podem invadir o corpo humano através de abrasões na pele e mucosa. A invasividade bacteriana depende de várias etapas, tais como: aderência, invasão e disseminação através dos tecidos do hospedeiro. Recentemente, nosso grupo identificou proteínas de membrana externa que atuam como adesinas de leptospira e/ou receptores de componentes do plasma hospedeiro, o que poderia contribuir para a patogenicidade bacteriana. Assim, o presente projeto tem como objetivo avaliar as propriedades funcionais do gene LIC10920, identificado na sequência genômica de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, como uma proteína hipotética, predita de membrana externa. A sequência LIC10920 foi amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão pAE. O plasmídeo pAE contendo o inserto foi introduzido em estirpes de E. coli para a expressão da proteína. A proteína recombinante rLIC10920 foi purificada por cromatografia de afinidade a níquel e sua integridade estrutural foi avaliada pela técnica de dicroísmo circular. Camundongos foram imunizados com a LIC10920 para a avaliação da sua imunogenicidade. A presença de IgG humano contra LIC10920, foi avaliada por ELISA, em amostras de soro de pacientes com leptospirose. Assim, como a sua ligação com componentes da matriz extracelular e plasma do hospedeiro. Animais imunizados apresentaram alto título de anticorpos contra LIC10920. Além disso, a proteína foi reconhecida por anticorpos presente em amostras de soro humano infectado. A proteína foi capaz de interagir com plasminogênio e laminina de maneira dose-dependente e saturável. Em ambas as interações, a participação das regiões imunogênicas se mostrou importante. rLIC10920 foi capaz de capturar o plasminogênio direto do soro humano também de maneira dose-dependente. Por fim, foi observado que o plasminogênio ligado a rLIC10920 pode ser convertido em plasmina. A proteína em estudo é expressa durante a infecção e podemos atribuir a função de adesina, com papel na patogênese da bactéria.
Pathogenic bacteria of genus Leptospira are the causative agent of leptospirosis, a disease of global importance. Pathogenic leptospires cause infection in a broad spectrum of animals and humans. Pathogenic leptospires can efficiently invade the human body through skin and mucosa and promptly spread into blood vessels, reaching target organs. Bacterial invasiveness depends on several steps, such as adherence, invasion and throughout host tissues. Recently, our group has identified outer membrane proteins that act as leptospiral adhesins and/or receptors of host plasma components, which could contribute for bacterial pathogenesis. This project aims to evaluate the functional properties of the gene LIC10920, identified in the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, as a predicted outer membrane protein of unknown function. The LIC10920 sequence was amplified by PCR, cloned into the expression vector pAE. Plasmids containing cloned DNA were introduced in E. coli strains for protein expression. The recombinant protein was purified by the metal affinity chromatography and its structural integrity was assessed by circular dichroism spectroscopy. Mice were subcutaneously immunized with LIC10920 for immunogenicity evaluation. The presence of IgG against LIC10920 in confirmed leptospirosis human serum samples was evaluated by ELISA. Binding of protein with extracellular matrix or plasma components was also assessed. Sera from immunized animals show that the rLIC10920 protein is capable to stimulate antibody immune response in mice. In addition, the protein is recognized by antibodies in leptospirosis human serum samples. The recombinant protein was capable of binding plasminogen and laminin. Dose-dependent and saturable binding was observed when increasing concentrations of the rLIC10920 were allowed adhere to a fixed concentration of plasminogen or of laminin, fulfilling the receptor-ligand interactions. In both cases, the participation of the immunogenic regions occurs, but in the case of laminin, the dependence is greater with structured epitopes. It has been shown that plasminogen linked to rLIC10920 can be converted to plasmin in the presence of activator. The recombinant protein was able to capture the plasminogen directly from normal human serum in a dose-dependent manner, suggesting the involvement of native protein in host-pathogen interactions. The protein under study is expressed during the infection and due to its capacity of interaction with host components, we may anticipate its role in leptospiral pathogenesis.

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Goes, Lidiana Cristina de. "Efeito do agente quelante na adsorção e purificação de pro-insulina recombinante em imac." [s.n.], 2009. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/267044.

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Abstract:

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-13T12:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goes_LidianaCristinade_M.pdf: 4033239 bytes, checksum: 07d68044592d217e51b3096b35496c87 (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: Este trabalho visou investigar o efeito dos quelatos IDA-Ni(II), CM-Asp-Ni(II), TED-Ni(II) e TREN-Ni(II) na purificação de pró-insulina humana recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de solução clarificada, obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise, proveniente do processo de produção de insulina (BIOMM, MG). Dentre os adsorventes estudados, Sepharose-TREN-Ni (II) apresentou a maior capacidade de adsorção em termos de PIS, cerca de 50% da proteína alimentada. Os demais adsorventes apresentaram a seguinte ordem de capacidade de adsorção IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. Em termos de seletividade, os adsorventes com CM-Asp-Ni (II) e TEDNi (II) imobilizados apresentaram maior seletividade. Os dados de adsorção de PIS no equilíbrio a 25°C foram bem representados pelo modelo de Langmuir-Freundlich., fornecendo valores de capacidade máxima de adsorção entre 43,14 mg e 154,56 mg de PIS/g de adsorvente e valores de constante aparente de dissociação entre 10-5 a 10-7 M. O estudo termodinâmico para adsorção de PIS nos adsorventes estudados na faixa de 4 a 25°C (exceto para TED-Ni(II), faixa de temperatura de 25 a 45°C) mostrou diminuição dos valores de Kd com o aumento da temperatura, fornecendo valores de ?H° positivos para todos os casos, indicando que a adsorção de PIS nos quelatos estudados é um processo endotérmico. Os valores de ?Gº foram negativos para todos os sistemas, indicando que a adsorção é espontânea. Os valores de ?Sº encontrados foram positivos e pouco alterados com o aumento de temperatura em todos os casos, favorecendo a complexação proteína-íon metálico.
Abstract: This work sought to investigate the effect of the chelating groups IDA-Ni(II), CMAsp- Ni(II), TED-Ni(II) and TREN-Ni(II) in the purification of a recombinant human proinsulin poly-histidine tagged (PIS) starting from clarified solution, obtained from the dissolution of inclusion bodies and oxidative sulfitolysis, originating from the process of insulin production (BIOMM, MG). Among of the studied adsorbents, Sepharose-TREN-Ni (II) it presented the largest adsorption capacity in terms of PIS, about 50 % of the fed protein. The other adsorbents presented the following order in adsorption capacity IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. In selectivity terms, the adsorbents with the chelating groups CM-Asp-Ni (II) and TED-Ni (II) immobilized presented a larger selectivity. The data of adsorption of PIS in the equilibrium to 25°C were well represented by the model of Langmuir-Freundlich, supplying values of maximum adsorption capacity between 43, 14 mg and 154, 56 mg of PIS / g adsorbent and values of apparent constant of dissociation among 10-5 to 10-7 M. The thermodynamic study for adsorption of PIS in the adsorbents considering the range from 4 to 25°C (except for TED-Ni (II), temperature range from 25 to 45°C) showed decrease of the values of Kd with the increase of temperature, providing positive values of ?H° for all of the cases, indicating that the adsorption of PIS in the studied chelating groups is a endothermic process. The values of ?Gº were negative for all of the systems, indicating that the adsorption is spontaneous. The values of ?Sº founded were positive and had little alteration due to temperature increase in all of the cases, favoring the formation of complex protein-metallic ion.
Mestrado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Mestre em Engenharia Química

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Souza, Laís Cristina de. "Reconhecimento da ligação dos anticorpos anti-HCV com proteínas recombinantes do vírus da hepatite C por meio do teste ELISA." Universidade Federal de São Carlos, 2016. https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/8396.

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Abstract:

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-01-05T12:06:12Z No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5)
Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T12:39:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5)
Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T12:39:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5)
Made available in DSpace on 2017-01-16T12:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5) Previous issue date: 2016-07-15
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Viral hepatitis is a major public health problem worldwide and in Brazil. They are notifiable diseases and according to estimates, billions of people have had contact with the hepatitis and millions are chronic carriers. Infection with hepatitis C virus (VHC) is a major problem worldwide public health due to the high rate of progression to chronicity, the evolutionary potential for cirrhosis and hepatocellular carcinoma, major complications leading to death. In general it can be said that in the last decade there have been major advances in the diagnosis of hepatitis C. In this period there was progressive improvement in sensitivity and specificity of the tests used to detect antibodies against the VHC virus. However, it is necessary that more accurate tests are developed. Thus, considering that the concern for the detection of hepatitis C increases every day, especially in blood banks; the diagnostic methods of this infection are of great clinical relevance and may be used as markers chronicity and indicative of therapeutic efficacy. Therefore, this work proposed to evaluate the connection and recognition of anti-VHC antibody positive and positive genotyped samples in patients with hepatitis C through the standardization of procedures and solutions used in qualitative ELISA. There was the process of awareness of microplates with recombinant chimeric protein, made the analysis of sensitivity, specificity, reproducibility and validity of the method. We obtained from ELISA assays with standardized recombinant proteins a protocol able to have a good performance of the main components of the reaction, and antigens conjugated with good resolution. This study presented ELISA results valid 95.69%, 100% reproducibility, 94.5% sensitivity and specificity 99.3%, higher than the ELISA performed with multiepitopo protein MEHCV who presented with sensitivity (92.86%) and specificity (82.89%). The standard ELISA can be used as a qualitative serological technique aimed at detection of anti-VHC antibodies, as demonstrated with great reactivity in patients infected with VHC.
As hepatites virais são um grave problema de saúde pública no mundo e no Brasil. São doenças de notificação compulsória e segundo estimativas, bilhões de pessoas já tiveram contato com vírus das hepatites e milhões são portadores crônicos. A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) constitui um grave problema de saúde pública mundial devido à elevada taxa de progressão para cronicidade, ao potencial evolutivo para cirrose e carcinoma hepatocelular, principais complicações conducentes à morte. Em geral, pode-se dizer que na última década houve grandes avanços no diagnóstico da hepatite C. Nesse período houve progressiva melhora na sensibilidade e especificidade dos testes utilizados para detecção de anticorpos contra o vírus HCV. Contudo, é necessário que sejam desenvolvidos testes de maior acurácia. Assim, considerando que a preocupação com a detecção da hepatite C aumenta a cada dia, principalmente em bancos de sangue; os métodos diagnósticos desta infecção são de grande relevância clínica e podem ser utilizados como marcadores de cronicidade e indicativos da eficácia terapêutica. Portanto, esse trabalho propôs avaliar a ligação e reconhecimento dos anticorpos anti-HCV de amostras positivas e positivas genotipadas de pacientes portadores de Hepatite C, através da padronização dos procedimentos e soluções utilizadas no ELISA qualitativo. Realizou-se o processo de sensibilização das microplacas com proteína recombinante quimérica, fez-se a análise da sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e validade do método. Obtivemos a partir dos ensaios de padronização do ELISA com proteínas recombinantes um protocolo capaz de ter um bom rendimento dos principais componentes da reação, antígenos e conjugado, com boa resolução. O presente estudo apresentou-se resultados do ELISA com validade 95,69% , reprodutibilidade 100%, sensibilidade 94,5% e especificidade 99,3%, superior ao ELISA realizado com a proteína multiepitopo MEHCV que apresentaram com sensibilidade (92,86%) e especificidade (82,89%). O ELISA padronizado pode ser utilizado como uma técnica sorológica qualitativa, visando a detecção de anticorpos anti-HCV, pois mostrou-se com ótima reatividade nos soros pacientes infectados com HCV.

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Freitas, Marcela Cristina Corrêa de. "Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-05012016-091813/.

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Abstract:

O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a -carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, -carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressão gênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da -carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 g de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 g de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores
Recombinant factor VII (FVIIr) has been the main therapeutic choice for hemophilic patients who develop inhibitors antibidies to conventional treatments (FVIII and FIX). Currently, the comercial product is produced in murine cells (BHK-21) which gives disadvantages considering the complexity of post-translational modifications of these proteins. The insertion of murine residues can be highly immunogenic in humans. Thus the production of proteins for therapeutic use in human cell lines appears as a promising alternative. In this context, the aim of this study was to clone and express the blood coagulation FVII in 3 human cell lines (HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11) and select the best cell line for production of recombinant protein. The cells were modified with the lentiviral vector p1054-CIGWS containing the FVII gene and GFP gene marker. After cells modification we observed efficiency of transduction, in which 80% of BHK-21-FVIIr cells showed GFP expression, 73% of HepG2-FVIIr cells, 32% of HKB-11-FVIIr cells and 95% SK- Hep-FVIIr. Gene expression analysis by real-time PCR showed that the three modified human cell lines exhibited RNAm expression relative to FVIIr. When cells were treated with 5 ug/mL vitamin K in culture, the gene expression of FVIIr was similar in the three cell lines (HepG2: 164 563 URE, HKB-11: 119122 and SK-Hep URE: 124919 URE). For FVII activation, the main post translational modification is -carboxylation vitamin-K-dependent which envolves three enzymes, -carboxylase, VKORC1 and calumenina (inhibitor) . Gene expression of these enzymes was evaluated before and after treatment with vitamin K. It was observed that there was an increase in mRNA levels in human cells treated with vitamin K, suggesting that the treatment is capable of activating the enzymes of the vitamin K cycle. Cell growth kinetics showed that modified murine cells BHK-21 have a higher specific growth rate, around 25% more than human cells. However the kinetics of production of recombinant cell lines showed that human cells expressing rFVII 3-fold more rFVII than BHK-21 cells. Due the low rFVII production of murine cells, and the extremely slow growth profile of human cell line HepG2, the recombinant cell lines Sk-Hep-1-rFVII and HKB-11-rFVII have been selected for cultivation tests in suspension using microcarriers in spinners flasks. Over 10 days of cultivation the HKB-11 cells showed a cumulative production of rFVII 152 ug, corresponding to 304 IU and SK-Hep-1 cells showed a rFVII production of 202.6 ug, corresponding to 405.2 IU. In summary, our data demonstrate that human cell lines are effective for producing recombinant factor VII. Using our production model, human cells were better than murine cells (BHK-21) used by the industry. Thus, these human cell lines can be used as a new platform for the FVII production, as well as for other recombinant proteins, with less risk of developing inhibitor antibodies

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Sousa, Luciana Pereira de. "Desenvolvimento e análise de anticorpos policlonais anti-ldh de plasmodium vivax para o diagnóstico de malária." Universidade Federal do Amazonas, 2012. http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/2630.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Pereira de Sousa.pdf: 2276123 bytes, checksum: a079176d073fb54e951e38fb4291c529 (MD5) Previous issue date: 2012-11-12
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Malaria is one of the most serious public health problems in the world, accounting for high morbidity and mortality. The diagnosis remains the most widely used microscopy, however this approach requires adequate infrastructure and highly skilled professionals for the exams, making it unfeasible in areas of difficult access. Tests for the rapid and simple diagnosis of malaria are commercially available, but none of national origin, complicating the deployment by the Unified Health System (SUS). Faced with this problem, this study has as main objective the production of Plasmodium vivax Lactate Dehydrogenase (pLDH), aiming at the development of polyclonal antibodies anti-LDH able to detect the native antigen in blood samples from patients infected with the intention of offering future perspectives for the development of a rapid diagnostic test for malaria. For this, pvLDH protein was produced by recombinant DNA technology in host cells chemically competent. Therefore, it was purified to inoculation into rabbits and mice Balb /c. The response of the inoculated animals as well as the performance of polyclonal antibodies anti-LDH in the recognition of native antigen were assessed by ELISA immunoassays and sandwich system, respectively. The animals showed good antibody titers anti-pLDH after the third inoculation of the recombinant protein pLDH, and the rabbit antibody response than the response of mice with absorbance values at dilution 1/100, 2,600 and 2,100, respectively. Polyclonal antibodies anti-pLDH were able to recognize the native protein pLDH 131 samples to 154 samples positive malaria and incapable of recognizing human isoforms of LDH when evaluated against malaria negative samples, since the 23 negative samples evaluated, all also remained negative during the tests. The proposal idealized in this study proved extremely viable and promising. The results of this study meet expectations and provided future prospects as regards the use of recombinant pvLDH for the development of polyclonal and monoclonal antibodies functional in murine model for use in rapid diagnostic test (RDT) for malaria in attempt to offer alternatives to diagnosis in Brazil, or for use in immunoassay targeting the monitoring of the disease course.
A malária é um dos mais sérios problemas de saúde pública do mundo, sendo responsável por elevada morbidade e mortalidade. O diagnóstico mais utilizado continua sendo a microscopia, contudo esta metodologia exige infraestrutura adequada e profissionais altamente qualificados para a realização dos exames, tornando-se inviável em áreas de difícil acesso. Testes para o diagnóstico rápido e simples de malária estão disponíveis no mercado, porém nenhum de origem nacional, dificultando a implantação pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Diante desta problemática, o presente estudo tem como principal objetivo a produção de Lactato Desidrogenase de Plasmodium vivax (pvLDH), visando o desenvolvimento de anticorpo os policlonais anti-LDH capazes de detectar o antígeno nativo em amostras sanguíneas de pacientes infectados com a pretensão de oferecer perspectivas para a elaboração de um teste diagnóstico rápido para a Malária. Para isto, a proteína pvLDH foi produzida pela tecnologia do DNA recombinante em células hospedeiras quimicamente competentes. Logo, a proteína foi purificada para a imunização de coelho e camundongos Balb/c. A resposta dos animais as inoculações assim como o desempenho dos anticorpos policlonais anti-LDH no reconhecimento do antígeno nativo foram avaliados por ensaios imunoenzimáticos ELISA indireto e em sistema sanduíche, respectivamente. Os animais demonstraram boa resposta de anticorpos anti-pvLDH após a terceira imunização de proteína recombinante, sendo a resposta de anticorpos do coelho superior a resposta dos camundongos, com valores de absorbância de até 2.600 e 2.100, respectivamente. Os anticorpos policlonais anti-pvLDH foram capazes de reconhecer a proteína LDH nativa em 131 amostras de 154 amostras positivas para malária e incapazes de reconhecer isoformas de LDH humana quando avaliados em relação a amostras negativas para malária, uma vez que das 24 amostras negativas avaliadas, todas se mantiveram também negativas nos ensaios. A proposta idealizada neste trabalho se mostrou extremamente viável e promissora. Os resultados obtidos neste estudo corresponderam às expectativas e forneceram perspectivas futuras no que diz respeito à utilização da pvLDH recombinante para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais funcionais, em modelo murino, para a utilização em teste diagnóstico rápido (TDR) para a malária, na tentativa de oferecer alternativas ao diagnóstico no Brasil, ou para a utilização em imunoensaio visando o monitoramento do curso da doença.

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GAZZANEO, Luiz Rodrigo Saldanha. "Expressão heteróloga da defensina dehys de euphorbia hyssopifolia 32 em E. coli." Universidade Federal de Pernambuco, 2016. https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/19523.

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Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T14:29:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_Gazzaneo (Biblioteca Central).pdf: 2832068 bytes, checksum: bb29fc38317d9f60a0d6129655b9b7a1 (MD5)
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Defensinas são peptídeos antimicrobianos (AMPs) que apresentam atividade contra diversos microrganismos patogênicos, em especial fungos. Embora não totalmente elucidados, há diversos mecanismos de ação propostos para as defensinas, que incluem permeabilização seletiva ou ruptura da membrana plasmática de microorganismos, ação direta em alvos intracelulares, ativação de cascatas de sinalização e aumento da produção de espécies reativas de oxigênio. Desde a sua descoberta e, tendo em vista sua ampla atividade biológica, o uso de defensinas no melhoramento de plantas cultivadas, bem como na produção de novos medicamentos tem sido proposto. Estudos de atividade biológica e possível aplicação biotecnológica das defensinas demandam uma grande quantidade dessas proteínas. Entretanto, o processo de extração da mesma é laborioso, dispendioso e, de acordo com a população ou disponibilidades da espécie vegetal escolhida, não sustentável ecologicamente. Portanto, a utilização de sistemas heterólogos de expressão é uma importante ferramenta para obtenção de defensinas recombinantes em escala industrial. Nesse estudo, um gene de defensina “DeHys”, isolado da Euphorbia hyssopifolia, foi inserido no plasmídeo pET102/D-TOPO e células da linhagem BL21(DE3) de Escherichia coli foram transformada com essa construção. Foi produzida a defensina recombinante Dehys com tamanho aproximado de 24 kDa. Sua identidade foi confirmada por western blot e pela análise do padrão de digestão com proteases.
Defensins are antimicrobial peptides (AMPs) , which present activity against a variety of pathogenic microorganism, especially funghi. Although not completely elucidated, there are a variety of proposed mechanisms of action for defensins, which includes selective microorganisms plasmatic membrane permeabilization or rupture, straight action agains intracellular targets, activation of signaling cascades and the burst of reactive oxygen species. Since it’s discovery and due to it’s wide biological activities, it’s use in crop enhancing, as well as its use in the development of new drugs have been proposed. Defensin’s biological activity and biotecnological application studies demand a reasonable amount of purified protein. However, the extraction processes is laborious, expensive, time consuming and depending on the population or the chosen plant species supply, not ecologically sustainable. So, the use of heterologous expression sytems is an importante tool to obtain purified proteins in industrial scale. In this study, a defensing gene (Dehys) isolated from Euphorbia hyssopifolia was inserted in a p pET102/D-TOPO vector and trasnformed into BL21(DE3) Escherichia coli strains. A recombinat Dehys defensin of approximately 24 kDa was obtained. It’s identity was double-checked using by Western blot and protease digestion pattern analyses.

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Módolo, Diego Grando 1984. "Proteína L1 de Papilomavírus Bovino (BPV-1) = produção em bactéria e plantas de tabaco = Bovine Papillomavirus L1 protein (BPV-1) : production in bacteria and tobacco plants." [s.n.], 2014. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/317060.

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Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Rodrigo Franco de Carvalho
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-25T18:01:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Modolo_DiegoGrando_D.pdf: 3351414 bytes, checksum: 2f6c8310f0efbb6e6f3d2e48e34de879 (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: O Brasil é conhecido por ter o segundo maior efetivo bovino e por ser o maior exportador de carne bovina no mundo. Dentre os problemas que afetam a pecuária nacional está a papilomatose bovina, uma doença infecto contagiosa causada pelo papilomavírus bovino (BPV). Diversas doenças de alto impacto econômico não só na pecuária nacional mas também mundial estão associadas ao BPV, sendo que ainda não existe uma vacina que possa prevenir o alastramento da doença e nem métodos eficázes de tramento. A proteína L1 do capsideo do BPV tipo 1 é uma forte candidata para ser utilizada na formulação vacinal por ser altamente imunogênica e ter a capacidade de formar, sozinha, partículas "virus-like" (VLPs). Devido a incapacidade de se multiplicar papilomavírus "in vitro", a utilização de sistemas de produção de proteínas recombinantes é a melhor estratégia para produção de proteínas virais em larga escala que possam ser utilizadas em formulações vacinais ou em testes de diagnósticos. Neste trabalho desenvolvemos uma plataforma de produção e purificação da proteína recombinante L1 em bactéria. A proteína L1 recombinante foi purificada por cromatografia de troca iônica e foi possível obter frações em alto nível de pureza. Também produzimos plantas transgênicas visando a produção da proteína L1. A transformação genética de plantas foi confirmada por PCR e RT-PCR, mas devido a inespecificidade dos anticorpos comerciais disponíveis e a uma possível baixa expressão do gene L1 em plantas, não foi possível confirmar a expressão da proteína recombinante. A proteína L1 obtida em bactérias poderá ser analisada como vacina e bem como na obtenção de anticorpos mais específicos e na produção de testes de diagnósticos. O conhecimento obtido neste trabalho poderá ser adaptado no desenvolvimento de outras vacinas de importância socio-econômica.
Abstract: Brazil is known as the largest exporter of beef and for having the second largest cattle herd in the world. Several illness that affect the national cattle industry are associated to the bovine papillomatosis, an infectious disease caused by Bovine Papillomavirus (BPV). Althought the economic impacts of these diseases affect the livestock at a global scale, there is no BPV vaccine or effective treatment methods available yet. The L1 capsid protein of BPV type 1 is a good candidate to be used in a vaccine formulation due its high immunogenicity and the ability to form virus-like particles (VLPs). Due to the inability to multiply papillomavirus in vitro, the use of recombinant protein production systems is the best strategy to produce viral proteins in large scale that can be used in vaccine formulations or for diagnosis testing. In this work, we developed a bacteria expression system to produce the recombinant L1 protein. The recombinant L1 protein was purified by ion exchange chromatography and highly purified fractions of L1 were obtained. We also obtained transgenic plants to produce the L1 protein. The genetic transformation of plants was confirmed by PCR and RT-PCR. Due to lack of specificity of commercial antibodies used in this study and a possible low expression of the L1 gene in plants, it was not possible to confirm the accumulation of the recombinant protein. The protein obtained in bacteria can be evaluated as vaccine as well as in the production of more specific antibodies and diagnosis tests. The knowledge obtained in this work can be adapted in the development of vaccines for other important socio-economic diseases
Doutorado
Genetica Vegetal e Melhoramento
Doutor em Genetica e Biologia Molecular

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Adelantado, Vallvé Núria. "Lipidomics studies of recombinant Pichia pastoris for improved recombinant protein secretion through cell engineering." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2016. http://hdl.handle.net/10803/384229.

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Abstract:

L’ús cada cop més extensiu de plataformes “òmiques” per a l’estudi de llevats ha generat grans quantitats d’informació relativa a la fisiologia cel·lular sota diferents condicions de cultiu, la qual pot ser utilitzada per al desenvolupament de noves estratègies d’enginyeria genètica. S’ha observat que els nivells d’expressió d’un fragment d’anticòs humà produït en el llevat metilotròfic Pichia pastoris augmenten significativament quan aquest és cultivat en nivells de baixa disponibilitat d’oxigen. Anàlisis transcriptòmics mostren que hi ha una regulació important dels gens involucrats en el metabolisme de lípids i la resposta al mal plegament de proteïnes (UPR), destacant la l’augment de transcrits provinents de gens involucrats en les rutes de biosíntesi de l’ergosterol i esfingolípids. A més, s’ha observat que la presència en el medi de cultiu de fluconazol, un agent antifúngic que inhibeix específicament l’activitat de la esterol C14α-demetilasa (Erg11p) en la ruta de biosíntesi de l’ergosterol, resulta en una disminució dels nivells d’ergosterol en les membranes cel·lulars, millorant els nivells de proteïna recombinant secretada al medi de cultiu. Finalment, el factor de transcripció Hac1, amb un paper important en la regulació de la UPR, també es troba involucrat en la regulació de la síntesi de lípids. En el present estudi, la soca de referència, P. pastoris que produeix el fragment d’anticòs 2F5 de manera recombinant, s’ha modificat genèticament per tal de canviar la seva composició lipídica. S’ha generat una bateria de soques que presenten alguns gens de la ruta de biosíntesi d’esfingolípids delecionats (DES1, SUR2), o bé sobreexpressats (DES1). Al mateix temps, s’ha alterat la ruta de síntesi de l’ergosterol de la soca de referència mitjançant la sobreexpressió del gen ERG11 o tractant les cèl·lules amb fluconazol. Finalment, també es va sobreexpressar HAC1. Les cèl·lules es van cultivar en cultius en continu sota condicions d’oxigen normals (normoxia), i baixos (hipòxia), i les soques van ser caracteritzades en quant a nivells de Fab produïts, la seva distribució intra/extracel·lular, morfologia a partir d’estudis de microscòpia electrònica (TEM), i el seu contingut lipídic, quantificant els nivells d’àcids grassos, fosfolípids, esterols, lípids neutres i esfingolípids. Amb tota aquesta informació es pretén comprendre com les cèl·lules s’adapten a canvis genètics i ambientals a través de canvis en el seu contingut lipídic. Els resultats obtinguts s’han combinat amb informació transcriptòmica prèviament publicada, demostrant que existeix una important remodelació del metabolisme lipídic quan les cèl·lules es troben en condicions d’hipòxia.
The increasing availability of omics databases provides an important knowledge base for the design of novel yeast engineering strategies, since they offer systems-level information on the physiology of the cells under diverse growth conditions and genetic backgrounds. In a previous study, a beneficial effect of low oxygen availability on the expression of a human Fab fragment in Pichia pastoris has been identified. Transcriptomic analyses pointed out important regulation of the Unfolded Protein Response (UPR) and lipid metabolism, with a significant transcriptional up-regulation of ergosterol and sphingolipid biosynthetic pathways. Furthermore, cells cultured in the presence of fluconazole, an antifungal agent that inhibits sterol C14α-demethylase (Erg11p) activity in the ergosterol biosynthetic pathway, showed a reduced amount of ergosterol in the plasma membrane, resulting in increased protein secretion levels. Moreover, it is known that the transcription factor Hac1, which plays a key role by regulating the UPR, regulates lipid biosynthesis In the present study, a reference strain of P. pastoris secreting the 2F5 Fab antibody fragment as a model recombinant protein was genetically modified in order to change its lipid composition. A set of strains harbouring either deleted (DES1, SUR2) or overexpressed (DES1) genes of the sphingolipid pathway were generated. In addition, a Fab producing strain overexpressing HAC1 or ERG11 were constructed and, as an alternative to the ergosterol pathway knockout, the reference strain was treated with fluconazole. The series of strains were cultivated in chemostat cultures under normoxic and hypoxic conditions. Strains were characterised in terms of Fab- productivity, intra/extracellular product distribution, cell morphology by transmission electron microscopy (TEM) and lipid content in terms of phospholipids, fatty acids, sterols, non-polar lipids and sphingolipids, in order to fully understand how cells adapt to genetic and environmental changes involving lipid changes. The obtained results were combined with previously published transcriptional data, allowing us to demonstrate an important remodelling of the lipid metabolism under limited oxygen availability.

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Pereira, Larissa Miranda. "Clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural da proteína ribossomal L10 humana recombinante." Universidade de São Paulo, 2009. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-22092011-101810/.

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Abstract:

A proteína ribossomal L10 (RP L10) é uma forte candidata a ser incluída na classe de proteínas supressoras de tumor. Também denominada QM, a proteína em questão é conhecida por participar da ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e da tradução de mRNAs. Possui massa molecular entre 24 a 26 kDa e ponto isoelétrico (pI) 10,5. A seqüência da proteína QM é bastante conservada em mamíferos, plantas, invertebrados, insetos e leveduras indicando que esta possui funções críticas na célula. Com função supressora de tumor, a proteína RP L10 foi estudada em linhagens de tumor de Wilm (WT-1) e em células tumorais de estômago, nas quais se observou uma diminuição na quantidade de seu mRNA. Mais recentemente a RP L10 foi encontrada em baixas quantidades nos estágios iniciais de adenoma de próstata e com uma mutação em câncer de ovário, indicando uma participação no desenvolvimento destas doenças. Como proteína, já foi descrito que esta interage com as proteínas c-Jun e c-Yes, inibindo a ação ativadora de fatores de crescimento e divisão celular. Este trabalho tem um papel importante no estabelecimento da expressão desta proteína solúvel, para estudos posteriores que tenham como objetivo avaliar a ação de regiões específicas que atuam na ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e tradução, bem como nas regiões que se ligam a proto-oncogenes. O cDNA para proteína QM foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão periplásmica p3SN8. A proteína QM foi expressa em E.coli BL21 (DE3) no citoplasma e periplasma bacteriano e na melhor condição, a expressão de QM de bactérias transformadas pelo plasmídeo recombinante p1813_QM em 25°C ou 30°C, a proteína foi obtida solúvel e com quantidad es muito pequenas de contaminantes. Os ensaios de estrutura secundária demonstraram que a proteína QM tem predominância de a-hélice, mas quando do seu desenovelmento, essa condição muda e a proteína passa a ter característica de folhas β.
The ribosomal protein L10 (RP L10) is a strong candidate to be included in the class of tumor suppressor proteins. This protein, also denominated as QM, is known to participate in the binding of ribosomal subunits 60S and 40S and the translation of mRNAs. It has a molecular weight that varies between 24 and 26 kDa and an isoelectric point of (pI) 10.5. The sequence of the protein QM is highly conserved in mammals, plants, invertebrates, insects and yeast which indicates its critical functions in a cell. As a tumor suppressor, RP L10 has been studied in strains of Wilm\'s tumor (WT-1) and tumor cells in the stomach, where was observed a decrease in the amount of its mRNA. More recently, the RP L10 was found in low amounts in the early stages of prostate adenoma and showed some mutation in ovarian cancer, what indicates its role as a suppressor protein in the development of these diseases. It has also been described that this protein interacts with c-Jun and c-Yes inhibiting growth factors and consequently, cell division. This work has an important role on the establishment of soluble expression of QM to give base information for further studies on expression that aim to evaluate the specific regions where it acts binding the 60S and 40S ribossomal subunits and translation, as well as its binding to proto-oncogenes. The cDNA for QM protein was amplified by PCR and cloned into periplasmic expression vector p3SN8. The QM protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) in the region of cytoplasm and periplasm, the best condition was obtained from the expression of the recombinant plasmid QM p1813_QM at 25°C or 30°C, the soluble protein was obtained with small amounts of contaminants. The assays of secondary structure showed that the QM protein is predominantly alpha-helix, but when it loses the folding, this condition changes and the protein is replaced by β- sheet feature.

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Oliveira, Rosane de. "Caracterização de lipoproteínas de Leptospira interrogans expressas em Escherichia coli." Universidade de São Paulo, 2013. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-14052014-160155/.

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Abstract:

Leptospirose é uma zoonose altamente disseminada causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Nos centros urbanos, os roedores são os mais importantes reservatórios da doença. Desde que o controle dos roedores e medidas sanitárias não são facilmente implementadas, o desenvolvimento de uma vacina é necessário para o combate da leptospirose. Desta maneira, os genes LIC10258, LIC12880 e LIC12238 foram selecionados por análises de bioinformática e amplificados do DNA genômico de L. interrogans por metodologia de PCR. A avaliação da capacidade de adesão das proteínas recombinantes com componentes da matriz extracelular mostrou que rLIC10258 interage com a laminina e fibronectina plasmática. Todas as proteínas recombinantes foram capazes de ligar ao plasminogênio e gerar plasmina, mostrando atividade proteolítica específica, enquanto que apenas rLIC12238 foi capaz de ligar ao fibrinogênio. Os resultados obtidos sugerem que estas proteínas podem desempenhar algum papel na patogênese da doença.
Leptospirosis is worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochaetes of the genus Leptospira. In the urban settings, rodents are the most important reservoirs. Since the control of the rodents and sanitation measures are not easily implemented, the development of vaccine is necessary to combat the leptospirosis. Thus, the genes sequences of LIC10258, LIC12880 and LIC12238 were selected by bioinformatics analysis and amplified by PCR methodology from genomic DNA of L. interrogans. Evaluation of the adhesion capacity of the recombinant proteins with extracellular matrix components showed that rLIC10258 interacts to laminin and plasma fibronectin. All recombinant proteins were capable to bind plasminogen and to generate plasmin, showing specific proteolytic activity, whereas that only rLIC12238 was capable to bind fibrinogen. The results obtained suggest that these proteins may play a role in leptospiral pathogenesis.

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Bertoncini, Michelle Darrieux Sampaio. "Expressão, purificação e avaliação imunológica de formas truncadas e hibrídos da proteína de superfície de pneumococo A (PspA)." Universidade de São Paulo, 2007. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-18042008-090617/.

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Abstract:

Streptococcus pneumoniae é um importante agente causador de pneumonia, meningite e septicemia. O alto custo e a cobertura limitada da vacina conjugada atual reforçam a necessidade de se desenvolver uma vacina mais abrangente e acessível. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é imunogênica e protetora em modelos animais; porém, devido à sua diversidade - há 6 clados e 3 famílias de PspA - uma vacina baseada em PspA deverá incluir fragmentos das duas famílias prevalentes (1 e 2). Neste estudo, foram produzidos fragmentos contendo a região N-terminal de PspA das famílias 1 e 2, e proteínas híbridas - contendo fusões destes fragmentos. Os anticorpos gerados contra os híbridos reconheceram PspAs nativas das duas famílias, foram capazes de se ligar a bactérias íntegras, e de aumentar a deposição de complemento em sua superfície. Finalmente, a imunização de camundongos com os híbridos foi capaz de proteger contra desafio com pneumococos contendo PspAs diversas, mostrando que estes seriam candidatos promissores na composição de uma vacina anti-pneumocócica.
Streptococcus pneumoniae is an important cause of pneumonia, meningitis and septicaemia. The high cost and limited coverage of the available conjugate vaccine reinforce the need for cost effective strategies, with broader coverage. Pneumococcal Surface Protein A (PspA) is immunogenic and protective in animal models; however, due to its diversity - there are six clades and threee families of PspA - a PspA based vaccine should include fragments of each major family (1 and 2). In the present study, we have produced fragments of the N-terminal region of PspAs families 1 and 2, and hybrid proteins - containing fusions of these fragments. Sera made against the hybrids induced antibodies that recognized PspAs from both families; these sera were also able to bind pneumococcal strains bearing diverse PspAs, and to increase complement deposition on their surface. Finally, immunization of mice with PspA hybrids was protective against challenge with pneumococci bearing diverse PspAs, showing that these hybrids should constitute promising candidates in an anti-pneumococcal vaccine.

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Santos, Milene Cristina Menezes dos. "Estudo sobre a função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase do veneno da serpente Bothrops jararaca, na sua interação com alvos celulares e plasmáticos." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-23082010-144336/.

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Abstract:

O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária.
This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.

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Teixeira, Aline Rodrigues Florencio. "Avaliação e caracterização de candidatos vacinais voltados para o controle da leptospirose." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-25082016-100745/.

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Abstract:

A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. Vacinas surgem como fortes candidatas para contornar o problema. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro.O presente projeto selecionou três proteínas hipotéticas de L. interrogans para serem caracterizadas quanto ao seu papel na patogênese e avaliadas quanto ao seu potencial protetor. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas LIC13479 e LIC10050 foram capazes de se ligar a laminina, plasminogênio e fibronectina plasmática. Em relação à LIC10537, dois fragmentos recombinantes foram gerados. Apenas o fragmento 2 foi capaz de interagir com PLG. As proteínas que interagiram com o PLG foram capazes de gerar plasmina As proteínas foram capazes de estimular uma resposta imune e LIC13479 e LIC10050 exerceram proteção parcial no modelo de leptospirose em hamsters.
Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Vaccines emerge as strong candidates to fight the problem.Currently research has focused to identify conserved antigens This project selected three hypothetical proteins of L. interrogans. Thesecoding sequences were characterized for their possible role in pathogenesis and their potential to protect animals against challenge with virulent leptospires. Genes were amplified by PCR and cloned into the expression vector pAE. The recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography and were recognized by confirmed human leptospirosis serum samples.LIC13479 and LIC10050 proteins were able to bind with laminin, plasminogen and plasma fibronectin. The coding sequence LIC10537 was cloned in two fragments. Fragment 2was able to interact with plasminogen. All proteins were able to generate active plasmin. The recombinant proteins were able of inducing an immune response. Evaluation of immunoprotection in leptospirosis hamster model followed by challenge with virulent bacteria showed that the recombinant proteins conferred partial protection.

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Pinto, Emerith Mayra Hungria. "Reatividade sorológica a proteínas recombinantes do Mycobacterium leprae em diferentes grupos populacionais de distintas regiões endêmicas do Brasil." Universidade Federal de Goiás, 2013. http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/3705.

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Abstract:

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-28T12:32:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
The development of laboratory tests applicable for the diagnosis/classification of the different clinical forms of leprosy is considered a research priority. The completion of Mycobacterium leprae genome together with new gene cloning/expression techniques and new bioinformatic tools have promoted the production and availability of new M. leprae recombinant proteins for immunologic assessment. Goal: This study assessed the serologic reactivity to M. leprae recombinant proteins among leprosy patients and controls from two hiperendemic regions in Brazil: “Rondonópolis/MT” and “Vila do Prata/Igarapé-Açú/PA” (former leprosy colony). Material and Methods: IgG antibodies to M. leprae recombinant proteins (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) and IgM antibodies for the PGL-I synthetic trissacaride (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) were detected by ELISA. The following study groups were included (n=847): newly diagnosed untreated leprosy patients (paucibacillary- PB and multibacillary- MB), household contacts of MB patients (HHC), healthy endemic controls (EC) and former MB that concluded leprosy multidrug therapy (MDT) (post MDT). Results: Among participants from Rondonópolis/MT (n=764), the seropositivity of MB patients (n=58) was 59% for 92f, 81% for 46f, 89% for LID-1, 84% for ML0405; 83% were anti-PGL-I positives. Among 10 anti PGL-I negative MB patients, 5 recognized LID-1 e 4 had IgG antibodies to 92f, 46f and ML0405. Among PB leprosy patients (n=93) seropositivity rates to M. leprae recombinant proteins ranged from 5-16%; 8% were anti PGL-I positives. In the HHC (n=192) and in the EC groups (n=282) low reactivity rates were detected ranging from 3-7%. For the post MDT group, positivity rates ranged from 17-45%. Among participants from “Vila do Prata” 3-8% of HHC were seropositives for recombinant proteins; 11% were anti- PGL-I positives. In the post MDT group from “Vila do Prata” (n=47) 33-50% were seropositives for recombinant proteins. Conclusion: High positivity rates to M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 were detected among MB leprosy patients with different genetic/ethnic profiles from distinct geographical regions. These results indicate that the development of a serologic test for leprosy employing both M. leprae recombinant proteins and PGL-I can potentially detect the majority of MB patients from different hiperendemic regions. The use of this diagnostic tool by the public health system can contribute for the early diagnosis and treatment of MB disease which are crucial for the control/elimination of leprosy in Brazil.
O desenvolvimento de testes laboratoriais para o diagnóstico/classificação das diferentes formas clínicas da hanseníase é tema prioritário em pesquisa. O sequenciamento completo do genoma do Mycobacterium leprae, avanços em técnicas de clonagem e expressão gênica e novas ferramentas de bioinformática promoveram a produção e a disponibilidade de novas proteínas recombinantes para avaliação imunológica. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar reatividade sorológica a proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase e controles de duas áreas hiperendêmicas para hanseníase do Brasil: Rondonópolis/MT e Vila do Prata/Igarapé-Açú/PA. Materiais e Métodos: A presença de anticorpos IgG para as proteínas recombinantes do M. leprae (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) e IgM para o trissacarídeo sintético do PGL-I (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) foi avaliada por ELISA. Os grupos de estudo incluíram (n=847): pacientes recém diagnosticados com hanseníase (paucibacilar- PB e multibacilar- MB) virgens de tratamento, contatos domiciliares de MB (CD), controles saudáveis de área endêmica (CS) e casos antigos de hanseníase MB que concluíram a multidrogaterapia (MDT) (pós MDT). Resultados: Entre os participantes de Rondonópolis/MT (n=764), a soropositividade de pacientes MB (n=58) foi de 59% para 92f, 81% para 46f, 89% para LID-1, 84% para ML0405; 83% apresentaram IgM para PGL-I. Dentre 10 pacientes MB soronegativos para PGL-I, 5 reagiram com LID-1 e 4 reconheceram 92f, 46f e ML0405. Entre os pacientes PB (n=93) as taxas de sororeatividade para as proteínas recombinantes variaram de 5-16% e 8% apresentaram sorologia anti- PGL-I positiva. Nos CD (n=192) e CS (n=282) as taxas de reatividade variaram de 3-7%. No grupo pós MDT as taxas de positividade variaram de 17-45%. Na Vila do Prata a taxa de positividade para as proteínas recombinantes nos CD (n=36) variou de 3-8% e 11% dos CD apresentaram anticorpos anti-PGL-I. Entre os indivíduos pós MDT (n=47) as taxas de reatividades variaram de 33-50%. Conclusões: Taxas de positividade acima de 80% foram detectadas para proteínas recombinantes do M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 em pacientes com hanseníase MB com diferentes características genéticas/ étnicas de distintas regiões geográficas. Estes resultados indicam que o desenvolvimento de um teste sorológico para hanseníase que associe proteínas recombinantes e PGL-I tem o potencial de detectar a grande maioria dos pacientes MB provenientes de diferentes regiões hiperendêmicas. O uso deste teste pelo sistema de saúde pública poderá contribuir para o diagnóstico e tratamento precoces da hanseníase MB que são cruciais para o controle/eliminação da doença no Brasil.

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Mendes, Jéssica Mariane Ferreira. "Produção e Avaliação de antígenos recombinantes candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina." reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, 2016. https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14161.

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Abstract:

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-10T16:21:40Z No. of bitstreams: 1 Jessica Mariane Ferreira Mendes Produção... 2016.pdf: 1965926 bytes, checksum: ac5119592b97390470f4914f6fcbddf0 (MD5)
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Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral (LV) canina pode contribuir para o controle da doença no homem. Visando o desenvolvimento de uma vacina contra LV canina, antígenos recombinantes de L. infantum foram selecionados em nosso laboratório pelo uso de uma mistura de soros de seres humanos ou cães naturalmente infectados pela L. infantum. Alguns destes antígenos foram testados em diversos protocolos de imunização, incluindo uso de diferentes adjuvantes, em camundongos ou cães. A imunização de camundongos ou cães com um dos antígenos recombinantes (rLci2B) usado isoladamente ou em associação com saponina induziu resposta imune Th2 ou Th1/Th2, respectivamente, não protetoras contra a infecção experimental. Com a determinação da sequência deduzida de aminoácidos notou-se que a maioria dos antígenos selecionados apresenta um segmento com sequência de aminoácidos única (domínio não repetitivo) e segmentos com sequência de aminoácidos com motivos repetitivos (domínios repetitivos). Possivelmente a incapacidade dos antígenos recombinantes de induzir uma resposta imune predominantemente Th1, protetora contra a LV, seria por conta da presença de domínios repetitivos, que favorecem a apresentação antigênica por linfócitos B e, consequentemente, estimulam uma resposta imune Th2. Para avaliar o direcionamento da resposta imune pelos dois tipos de domínio, novas construções de DNA foram concebidas de modo a codificar apenas domínio(s) não repetitivo(s) ou domínio(s) não repetitivo(s) e domínios repetitivos. OBJETIVOS: Produzir quatro proteínas recombinantes com domínios não repetitivos (rLci2-NT-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT e rLci12-NT-CT) e avaliar a capacidade desses polipeptídios de induzir resposta imune celular in vitro em cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram realizadas: a) a subclonagem de construções de DNA (Lci3-NT-CT, Lci10-NT e Lci12- NT-CT) em um plasmídeo apropriado para expressão em Escherichia coli, b) a determinação de condições apropriadas para produção das proteínas recombinantes (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT-2R e rLci10- NT) c) a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade e d) avaliação da capacidade dos polipeptídios de induzir estimulação de células mononucleares sangue periférico (PBMC) de cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum. RESULTADOS: Três (rLci2-NT-CT, rLci2-NT-5R-CT, rLci3- NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci10-NT e rLci10-NT-2R) dos quatro pares de polipeptídios recombinantes foram expressos, produzidos e purificados. Três antígenos recombinantes (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT e rLci3-NT-2R-CT) promoveram a linfoproliferação in vitro utilizando PBMC de cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum CONCLUSÕES: Três das seis proteínas produzidas induziram a linfoproliferação, sendo a maior linfoproliferação encontrada para PBMC estimulado com a proteína sem domínios repetitivos (rLci2-NT-CT). Avaliações adicionais são necessárias para comprovar a utilidade destas moléculas em formulação de vacina contra leishmaniose visceral canina.
An effective vaccine against visceral leishmaniasis (VL) dog can help to control the disease in man. Aiming at development of a vaccine against canine VL, recombinant antigens of L. infantum were selected in our laboratory by using a mixture of sera from humans or dogs naturally infected with L. infantum. Some of these antigens were tested in different immunization protocols, including use of different adjuvants in mice or dogs. The immunization of mice or dogs with a recombinant antigens (rLci2B) used alone or in combination with saponin induced Th2 response or Th1 / Th2, respectively, did not protective against experimental infection. With the determination of the deduced amino acid sequence it was noted that most of the antigens selected segment has a unique amino acid sequence (non-repetitive domain) and segments of amino acid sequence with repetitive motifs (repetitive domains). Possibly the inability of recombinant antigens to induce an immune response predominantly Th1 protective against LV would be due to the presence of repetitive domains that promote antigen presentation by B cells and thus stimulate an immune response Th2. To assess the direction of the immune response by two types of domain, new DNA constructs were designed to encode only the domain (s) not repetitive (s) or domain (s) not repetitive (s) and repetitive fields. MATERIALS AND METHODS: Were performed: a) subcloning DNA constructs (rLci3-NT-CT, rLci10-NT and rLci12-NT-CT) into a suitable plasmid for expression in Escherichia coli, b) determining the appropriate conditions for the production of proteins recombinant (rLci2- NT-5R-CT, rLci2-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT-2R and rLci10-NT) c) purification of recombinant proteins by chromatography affinity d) evaluating the ability of polypeptides rLci2-NT-CT, rLci3-NT-CT and rLci10-NT to induce stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy dogs inoculated dermal with L. infantum. RESULTS: Three (rLci2-NT-CT, rLci2-NT-5R-CT, rLci3-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci10- NT and rLci10-NT-2R) of the four pairs of recombinant polypeptides are expressed, produced and purified. Three recombinant antigens (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT and rLci3-NT-2R-CT) promoted lymphocyte proliferation in vitro using asymptomatic dogs PBMC inoculated dermal L. infantum CONCLUSIONS: Three of the six proteins produced induced lymphoproliferation, most lymphoproliferation was found to PBMC stimulated with the protein without repetitive domains (rLci2-NT-CT). Additional evaluations are necessary to confirm the utility of these molecules against canine visceral leishmaniasis vaccine formulation

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Souza, Ana Paula Almeida de. "Validação de proteínas recombinantes da Leishmania infantum e da saliva do Lutzomyia longipalpis como biomarcadores para o sorodiaginóstico e avaliação da exposição às leishmanioses." Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, 2013. https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/6462.

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Abstract:

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-18T18:08:55Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5)
Made available in DSpace on 2013-04-18T18:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) Previous issue date: 2013
Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses.
The population control of sand flies, containment of epidemics in the early stages and facilitating early diagnosis of infected individuals are strategies outlined by WHO for surveillance and control of Leishmaniasis. In this context, serologic tests using both the salivary gland sonicate (SGS) of sandflies as soluble Leishmania antigen (SLA) are important tools for the control / diagnosis of Leishmaniasis. However, tests based on the use of antigens derived from crude fractions, despite showing high sensitivity, some of these antigens cross-react with epitopes shared by other pathogens / vectors. Moreover, the preparation of antigens has adequate reproducibility due to difficulty in obtaining and / or standardization of these. In this study, we aimed to identify biomarkers for the surveillance and control of Leishmaniasis, through use of recombinant proteins from the saliva of sandflies as biomarkers of exposure to vector and through the use of recombinant proteins of Leishmania to get a more accurate serodiagnosis for human leishmaniasis. On the first step, ELISAs were performed against the recombinant protein from the saliva of the vector L. longipalpis (rLJM11 and rLJM17) to estimate the positive anti-saliva on a small number of sera from children from an endemic area for VL. It was observed that the sera that recognize the SGS of L. longipalpis also recognize in different proportions of rLJM17 and rLJM11 proteins. Further, each recombinant protein was able to detect anti-saliva seroconversion in sera from a second endemic area for VL, with increase in recognizing when the two recombinant proteins were used in combination. Furthermore, the ROC analysis showed the superior performance of the combination of rLJM17 + rLJM11, these data confirmed using a large panel of 1077 serum samples from individuals from another endemic area for LV. At this stage, our results indicate that proteins rLJM11 + rLJM17 represent a promising epidemiological tool that can assist in the implementation of control measures against Visceral Leishmaniasis. In a second step, ELISAs were performed against a series of recombinant proteins of Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, and H4 KMP11) so antigenic proteins were selected against serum from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL) and that presented high specificity when tested against sera from patients with other diseases (Chagas disease, Systemic Lupus Erythematosus, Leprosy and Tuberculosis). To identify the effectiveness of recombinant proteins, ROC curves were used to select antigens possibly more efficient than SLA. Recombinant proteins HSP70 and H2A were selected for having high sensitivity in recognizing sera from patients with LM and LC respectively. In the last experimental stage using sera from individuals with other pathologies, it was observed that the reduced cross-reactivity against the recombinant antigen, especially for rHSP70 when compared to that observed for the SLA. Our results show the high antigenicity of rHSP70, suggesting the possibility of using this recombinant protein for serodiagnosis of Leishmaniasis. In this work, it was possible to identify and validate the use of recombinant proteins of the parasite and of the saliva of sandflies as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to Leishmaniasis.

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Barbosa, Maysa Santos. "Clonagem, purificação e caracterização de proteínas antigênicas recombinantes obtidas de Mycoplasma agalactiae." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-20022017-144035/.

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Abstract:

A agalaxia contagiosa é uma doença de notificação obrigatória que causa severas perdas econômicas para produção de ovinos e caprinos mundialmente. Apesar de seu impacto na produção animal, pouco se sabe sobre os fatores de virulência e patogenicidade do M. agalactiae (principal agente etiológico). Desta maneira, o presente estudo possuiu como objetivo a identificação, purificação e caracterização de proteínas antigênicas de M. agalactiae. Para tanto, quatro proteínas de superfície com potencial antigênico (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) foram selecionadas. Essas proteínas foram expressas em Escherichia coli e purificadas em coluna de níquel. As proteínas purificadas foram avaliadas quanto a antigenicidade em Western blotting utilizando soros de caprinos naturalmente infectados com M. agalactiae. Todas as proteínas expressas foram imunorreativas aos soros de caprinos naturalmente infectados, demonstrando que as proteínas utilizadas nesse estudo são possivelmente antigênicas e possuem epítopos acessíveis.
The Contagious agalactia is a notifiable disease that causes severe economic losses to sheep and goats worldwide. Despite its impact on animal production, little is known about the virulence factors and pathogenicity of M. agalactiae (main etiological agent). Thus, the present study identified, purified and characterized antigenic proteins of M. agalactiae. Therefore, four surface proteins with antigenic potential (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) were selected. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified on nickel column. The purified proteins were assayed for antigenicity by Western blotting using goat sera naturally infected with M. agalactiae. All expressed proteins were immunoreactive with sera from naturally infected goats, demonstrating that the proteins used in this study are possibly antigenics and it have acessible epitopes.

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Silva, João Renato Souza Negrão e. "Construção de vetores para superexpressão da proteína L1 do HPV16 em Pichia pastoris." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112010-104443/.

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Abstract:

O papilomavirus humano (HPV) é o agente etiológico da infecção sexualmente transmissível mais comum na população mundial. A prevalência da infecção por HPV é estimada em 660 milhões de pessoas e mais de 50% das mulheres serão acometidas pela infecção ao menos uma vez na vida. O HPV é responsável por virtualmente todos os casos de câncer de colo de útero (99%), além de causar muitos outros tipos de câncer de mucosa. O câncer cervical afeta aproximadamente 1.4 milhões de mulheres e 500 mil novos casos surgem anualmente, resultando em 250 mil mortes por ano. Os maiores índices de incidência são observados na América Latina e na África. Duas vacinas contra o HPV são comercializadas desde 2006 por empresas estrangeiras. Entretanto, o custo mínimo da vacinação é superior a 600 reais. Este preço torna sua incorporação pelo sistema de saúde um processo economicamente inviável. Dessa forma, devem ser buscadas alternativas para a produção de uma vacina eficaz, de qualidade e de baixo custo no Brasil. A proteína L1, principal proteína do capsídeo do HPV, tem a propriedade de se auto agregar em partículas semelhantes às virais (VLPs), que são o principal componente das vacinas atuais e possuem muita semelhança com os vírions nativos, introduzindo inclusive, uma imunização predominantemente tipo-específica. Este projeto se propôs a construir e avaliar vetores de expressão visando à produção em larga escala da proteína L1 do HPV 16, o tipo de HPV de maior risco e incidência na população mundial. Foram construídos cinco plasmídeos para Pichia pastoris, uma das principais plataformas industriais de expressão. Eles se diferenciam pelos marcadores de seleção e pelas sequências de manutenção do vetor, mas têm exatamente o mesmo objetivo: gerar sistemas que possuam múltiplas cópias do gene da L1 e que não necessitem da utilização de antibióticos. Essa estratégia foi escolhida porque a produtividade de muitas das proteínas heterólogas tem grande dependência da dosagem gênica e porque o uso de antibióticos encarece muito o custo da produção. Na primeira etapa do projeto foi avaliado um sistema de expressão epissomal auxotrófico, mas ele não se manteve estável ao longo de 60 gerações. Na segunda parte, dois vetores de integração ao sítio do DNA ribossomal foram testados. O sistema mais estável e produtivo foi caracterizado quanto ao número de cópias integradas ao genoma da P. pastoris e ao nível de expressão. O sistema é capaz de produzir clones com mais de 30 cópias do gene da L1 e dois clones expressaram cerca de 20 a 30 miligramas/litro de L1. Adicionalmente outros dois vetores integrativos que utilizam sequências teloméricas para integração foram construídos. Ainda são necessários estudos conjuntos de fermentação em larga escala e purificação da proteína para verificar a viabilidade do sistema
The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of the sexually transmitted infection most common worldwide. The prevalence of HPV infection is estimated at 660 million people and over 50% of women will be affected by the infection at least once in their lifetime. HPV is responsible for virtually all cervical cancers cases (99%), and causes many other types of mucosal cancer. Cervical cancer affects approximately 1.4 million women, and 500.000 new cases occur annually, resulting in 250.000 deaths per year. The highest incidence rates are seen in Latin America and Africa. Two HPV vaccines are marketed since 2006 by foreign companies. However, the minimum cost of vaccination is higher than 360 dollar. This price makes its incorporation by the Brazilian Health System economically unfeasible. Thus, alternatives must be found to produce an effective vaccine, with low cost and high-quality in Brazil. The L1 protein, the major capsid protein of HPV, has the ability to self aggregate into virus-like particles (VLPs) which are the main component of current vaccines. The VLPs are very similar to the native virions and can introduce an immunization predominantly type-specific. This project aimed to construct and evaluate expression vectors to produce, at large scale, the L1 protein of HPV 16, which is the HPV type at greater risk and incidence in the world. Five plasmids were constructed for Pichia pastoris, one of the major industrial expression platforms. They differ in the selection markers and the vector maintenance sequences, but they have exactly the same goal: to create systems with multiple copies of the L1 gene and that don\'t require the use of antibiotics. This strategy was chosen because the productivity of many heterologous proteins have heavy dependence on gene dosage and because the use of antibiotics is extremely expensive for its production. In the first stage of the project, it was rated an episomal auxotrophic expression system, but it was unstable after a period of 60 generations. In the second part, two vectors for integration in the ribosomal DNA locus were tested. The most stable and productive system was featured on the number of copies integrated into the P. pastoris genome and on the expression level. It was proved that the system is able to produce clones with more than 30 copies of the L1 gene and two clones expressed approximately 20-30 milligrams/liter of L1. Additionally, two other integrative vectors for integration in telomeric sequences were constructed for future testing. More studies on large-scale fermentation and protein purification will be necessary to determine the feasibility of the system.

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Lima, Luciana Chagas de. "Avaliação da imunogenicidade de proteínas recombinantes baseadas em antígenos de diferentes estágios do Plasmodium vivax expressos em Pichia pastoris." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-29092014-150152/.

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Abstract:

O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos.
Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-γ, IL-2, TNF-α and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

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Robic, Goran. "Soja como biorreator : estudo de extração e purificação de proteina recombinante utilizando 'beta'-glucuronidase." [s.n.], 2005. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/267421.

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Abstract:

Orientador: Everson Alves Miranda
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo
Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein
Mestrado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Mestre em Engenharia Química

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Zamboni, Bruna Maria. "Estudos estruturais com miotoxinas fosfolipase a2-like isoladas e recombinante da peçonha de bothrops pauloensis." Botucatu, 2020. http://hdl.handle.net/11449/192853.

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Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes
Resumo: A toxicidade do veneno das serpentes do gênero Bothrops é resultante da ação integrada de várias toxinas, entre elas as fosfolipases A2 (PLA2s). Entre o grupo das PLA2s, há as PLA2s ativas enzimaticamente e as PLA2s desprovidas de atividade enzimática, denominadas proteínas PLA2-like. Apesar de sua inatividade enzimática, as proteínas PLA2-like desses venenos possuem potente ação miotóxica local; efeito o qual o soro antiofídico não é capaz de neutralizar efetivamente. Tendo em vista as limitações da soroterapia, é necessário compreender como essas miotoxinas agem localmente. Uma abordagem eficaz é o estudo estrutural-funcional destas toxinas com potenciais inibidores ou ativadores. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo estudar a relação estrutura-função da BnSP-7 e sua isoforma BnSP-6, duas miotoxinas PLA2-like do veneno de Bothrops pauloensis, através de sua interação com ácidos graxos. Deste modo, essas proteínas foram obtidas a partir do veneno bruto de B. pauloensis por cromatografia líquida de troca iônica seguida por cromatografia em fase reversa. As frações obtidas foram analisadas por espectrometria de massa para a confirmação de ambas as identidades, no entando não foi possível identifica-las. Foi observado por técnica de espectroscopia de dicroísmo circular a preservação das estruturas secundárias dessas toxinas (enovelamento referente à PLA2). Foram obtidos cristais da amostra purificada após 21 dias de incubação a 283 K e por esses dados cristalográfico... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The toxicity of Bothrops venom is the result of the integrated action of several toxins, including phospholipases A2 (PLA2s). Among the group of PLA2s, there are the enzymatically active PLA2s and the PLA2s devoid of enzymatic activity, called PLA2-like proteins. Despite their enzymatic inactivity, the PLA2-like proteins of these poisons have a potent local myotoxic action; an effect that the anti-oxyde serum is not able to neutralize effectively. Given the limitations of serotherapy, it is necessary to understand how these myotoxins act locally. An effective approach is the structural-functional study of these toxins with potential inhibitors or activators. Therefore, the present study aims to study the structure-function relationship of BnSP-7 and its BnSP-6 isoform, two PLA2-like myotoxins from Bothrops pauloensis venom, through their interaction with fatty acids. Thus, these proteins were obtained from the raw venom of B. pauloensis by ion exchange liquid chromatography followed by reverse phase chromatography. The fractions obtained were analyzed by mass spectrometry to confirm both identities, but it was not possible to identify them. The preservation of secondary structures of these toxins (entanglement related to PLA2) was observed by circular dichroism spectroscopy technique. Crystals were obtained from the purified sample after 21 days of incubation at 283 K and by these crystallographic data it was found that the sample had the BnSP-7 protein sequence. In addition,... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

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Barrero, Peña Juan José. "Overcoming the secretory limitations in Pichia pastoris for recombinant protein production." Doctoral thesis, TDX (Tesis Doctorals en Xarxa), 2020. http://hdl.handle.net/10803/670387.

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Abstract:

El llevat metilotròfic Pichia pastoris (genere Komagataella) s’ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més populars per produir proteïnes d’interès industrial, la majoria de les quals es secreten extracel·lularment per facilitar el posterior procés de purificació. La secreció de proteïnes heteròlogues fora de la cèl·lula està mediada per la via secretora, una ruta que engloba diversos passos i té diferents orgànuls interconnectats per aconseguir una secreció eficient. Tanmateix, quan P. pastoris es veu obligat a produir proteïnes heteròlogues, el correcte funcionament de la via de secreció podria veure’s compromesa. En aquest context, s’han realitzat diferents estudis per identificar colls d’ampolla específics i maximitzar la producció de proteïnes. Es va identificar la translocació de proteïnes del citoplasma al reticle endoplasmàtic (ER) com un coll d’ampolla precoç important que es troba a la via secretora. El pas de translocació sol estar mediat per un pèptid senyal que es troba al N-terminal de la proteïna a traduir. Depenent de la seqüència senyal, aquest pas es pot realitzar mentre la proteïna es tradueix (translocació co-traduccional) o després de la traducció (post-traducció). A més, la senyal de secreció ha de contenir l’anomenada regió ‘pro’ per mediar una ràpida exportació de la proteïna recombinant des del ER al Golgi per tal que s’acabi secretant. A la primera part d’aquest estudi, ens vam centrar en l’enginyeria i la caracterització del pèptid senyal de secreció com a estratègia per millorar la secreció de proteïnes recombinants. Per tal de comparar-les, hem utilitzat el senyal de secreció de Saccharomyces cerevisiae anomenat ‘alfa mating factor’ (α-MF) que és el senyal de secreció més comú utilitzat per la comunitat científica per secretar proteïnes recombinants en P. pastoris. Es diu que aquest senyal de secreció condueix proteïnes mitjançant la traducció post-traduccional. Com a resultat, si el α-MF es fusiona amb una proteïna que es pot plegar en el citosol del llevat, és possible que la proteïna no pugui travessar el translocó del ER i entrar a la via secretora. La solució va ser substituir la seqüència senyal pre-α MF per la seqüència senyal pre-Ost1, que dirigeix la translocació de forma co-traduccional a través del ER, garantint així que les proteïnes heteròlogues només es pleguin després d’arribar al lumen del ER. Addicionalment, la pro-regió del α-MF contenia una regió propensa a l’agregació, que va ser fàcilment eliminada mitjançant l’intercanvi d’una treonina per una serina en la posició 42 (Ser42). Aquest senyal de secreció híbrid resultant va augmentar dràsticament la producció de tres proteïnes models diferents utilitzades en aquesta tesi: una proteïna model fluorescent anomenada E2-Crimson i dues lipases diferents d’interès industrial anomenades Lipasa 2 de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) i Lipasa de Rhizopus oryzae (ROL). Més important encara, es van provar aquestes troballes a escala bioreactor, obtenint així resultats similars als observats a escala matràs. En particular, les soques amb el senyal de secreció millorat van tenir un millor rendiment cel·lular en comparació amb l’α-MF. En resum, s’ha proposat un nou senyal de secreció híbrid per substituir el senyal de secreció α MF com a estàndard predeterminat per produir proteïnes heteròlogues en P. pastoris. No obstant això, per aprofitar plenament el potencial del senyal de secreció millorat, es necessita enginyeria cel·lular addicional per superar els colls d’ampolla que apareixen posteriorment de la translocació, particularment en condicions de bioprocessos com en un fed-batch.
La levadura metilotrófica Pichia pastoris (genero Komagataella) se ha convertido en una de las plataformas celulares más populares para producir proteínas de interés industrial, la mayoría de las que se secretan extracelularmente para facilitar el posterior proceso de purificación. La secreción de proteínas heterólogas fuera de la célula está mediada por la vía secretora, una ruta que engloba varios pasos y tiene diferentes orgánulos interconectados para conseguir una secreción eficiente. Sin embargo, cuando P. pastoris se ve obligada a producir proteínas heterólogas, el correcto funcionamiento de la vía de secreción podría verse comprometida. En este contexto, se han realizado diferentes estudios para identificar cuellos de botella específicos y maximizar la producción de proteínas. Se identificó la translocación de proteínas del citoplasma al retículo endoplasmático (ER) como un cuello de botella precoz importante que se encuentra en la vía secretora. El paso de translocación suele estar mediado por un péptido señal que se encuentra en el N-terminal de la proteína a traducir. Dependiendo de la secuencia señal, este paso se puede realizar mientras la proteína se traduce (translocación co-traduccional) o después de la traducción (post-traduccional). Además, la señal de secreción debe contener la llamada región “pro” para mediar una rápida exportación de la proteína recombinante desde el ER al Golgi para que acabe secretando. En la primera parte de este estudio, nos centramos en la ingeniería y la caracterización del péptido señal de secreción como estrategia para mejorar la secreción de proteínas recombinantes. Con el fin de compararlas, hemos utilizado la señal de secreción de Saccharomyces cerevisiae llamado “alfa mating factor” (α-MF) que es la señal de secreción más común utilizado por la comunidad científica para secretar proteínas recombinantes en P. pastoris. Se dice que esta señal de secreción conduce proteínas mediante la traducción post-traduccional. Como resultado, si el -MF se fusiona con una proteína que se puede plegar en el citosol de la levadura, es posible que la proteína no pueda atravesar el translocón del ER y entrar en la vía secretora. La solución fue sustituir la secuencia señal pre-α MF por la secuencia señal pre-Ost1, que dirige la translocación de forma co-traduccional a través del ER, garantizando así que las proteínas heterólogas sólo se plieguen después de llegar al lumen del ER. Adicionalmente, la pro-región del α-MF contenía una región propensa a la agregación, que fue fácilmente eliminada mediante el intercambio de una treonina por una serina en la posición 42 (Ser42). Esta señal de secreción híbrido resultante aumentó drásticamente la producción de tres proteínas modelos diferentes utilizadas en esta tesis: una proteína modelo fluorescente llamada E2-Crimson y dos lipasas diferentes de interés industrial llamadas Lipasa 2 de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) y lipasa de Rhizopus oryzae (ROL). Más importante aún, se probaron estos hallazgos a escala biorreactor, obteniendo así resultados similares a los observados a nivel matraz. En particular, las cepas con la señal de secreción mejorado tuvieron un mejor rendimiento celular en comparación con la α-MF. En resumen, se ha propuesto una nueva señal de secreción híbrido para sustituir la señal de secreción α-MF como estándar predeterminado para producir proteínas heterólogas en P. pastoris. Sin embargo, para aprovechar plenamente el potencial de la señal de secreción mejorado, se necesita ingeniería celular adicional para superar los cuellos de botella que aparecen posteriormente de la translocación, particularmente en condiciones de bioprocesos como en un fed-batch.
The methylotrophic yeast Pichia pastoris (Komagataella spp.) has become one of the most popular cellular platforms to produce industrially relevant proteins, most of which are secreted in the extracellular media to facilitate subsequent downstream processing. The secretion of heterologous proteins out of the cell is mediated by the secretory pathway, a route that encompasses several steps and has different organelles interconnected to achieve an efficient secretion. However, when P. pastoris is forced to produce heterologous proteins, the proper function of the secretion pathway might be compromised. In this context, different studies have been carried out to identify specific bottlenecks and maximize protein production. We identified the translocation of proteins from the cytoplasm to the Endoplasmic Reticulum (ER) as a major early bottleneck present in the secretory pathway. The translocation step is usually mediated by a signal sequence present at the N-terminal of the protein to be translocated. Depending on the signal sequence, this step can be performed while the protein is being translated (co-translational translocation) or after the translation (post-translational translocation). In addition, the secretion signal has to contain a so-called pro-region to mediate a fast export of the recombinant protein from the ER to the Golgi for subsequent secretion. In the first part of this study, we focused on the engineering and characterization of the secretion signal peptide as a strategy to improve recombinant protein secretion. For comparison, we used the secretion signal from the alpha mating factor (α-MF) from Saccharomyces cerevisiae, which is the most common secretion signal used by the scientific community to secrete recombinant proteins in P. pastoris. This secretion signal is reported to drive proteins through the post-translational translocation. As a result, if the α-MF is fused to a protein that can fold in the yeast cytosol, the protein may be unable to traverse the ER translocon and enter the secretory pathway. The solution was to replace the pre-α MF signal sequence with the pre-Ost1 signal sequence, which directs co-translational translocation across the ER membrane, thereby ensuring that heterologous proteins fold only after reaching the ER lumen. Additionally, the pro-region from the α-MF contained a region prone to aggregation, which was easily removed by exchanging a threonine by a serine at position 42 (Ser42). The resulting hybrid secretion signal drastically increased the production of three different model proteins used in this thesis: a fluorescent model protein called E2-Crimson and two different lipases of industrial interest, namely the lipase 2 from Bacillus thermocatenulatus (BTL2) and a lipase from Rhizopus oryzae (ROL). More importantly, these findings were then tested at bioreactor scale, thereby obtaining similar results to those observed at shake flask scale. Notably, strains with the improved secretion signal had a better cell performance in comparison with the α-MF. Overall, a new hybrid secretion signal has been proposed to replace the α factor secretion signal as the default standard for producing heterologous proteins in P. pastoris. However, to fully exploit the power of the improved secretion signal, additional cellular engineering is needed to overcome bottlenecks that appear downstream of the translocation event, particularly under bioprocess (fed-batch) conditions.

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Liu, Fangbing. "Monoclonal and recombinant antibodies to potyviral proteins and their application Monoklonale und recombinante Antikörper gegen potyvirale Proteine und ihre Anwendung /." [S.l.] : Universität Stuttgart , Fakultät Geo- und Biowissenschaften, 1999. http://www.bsz-bw.de/cgi-bin/xvms.cgi?SWB8473253.

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Alves, José Vitor Ferreira. "Avaliação da antigenicidade de proteínas recombinantes de L. (V.) braziliensis." Universidade Federal de Goiás, 2014. http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/4201.

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Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-27T17:20:49Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
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Leishmaniasis is a group of diseases with distinct clinical, histopathological and immunological characteristics, caused by parasites belonging to the Leishmania genus. The serological tests used until the moment have several limitations. There are a great interest to identify immunogenic proteins of Leishmania to be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of American cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of this study was to produce and purify the recombinant proteins "Leishmania activated C kinase" (rLACK); "Thiol Specific Antioxidant" (TSA), "Leishmania elongation initiation factor" (LeIF) and "Leishmania braziliensis stress inducible protein 1" (LbSTI) to evaluate the antigenicity. The recombinant proteins were produced by recombinant DNA techniques as described by Salay et al. (2007). To perform the ELISA, L.(V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) and L.(L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) species were cultivated and the antigenic extracts and recombinant proteins were used as antigens. Sixty serum samples from patients with ATL assisted at Anuar Auad hospital, Goiânia, Goiás, were assayed, and from them, 45 were from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL) and 15 were from mucosal leishmaniasis (ML). To analyze the specificity of the response of total extract and the recombinant proteins, sera from patients with other pathologies were tested. The total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI and rLeIF showed a sensitivity of 85%, 75%, 70%, 76.7% and 56.1% respectively. The specificity of total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF were 72.5%, 80%, 60%, 30% and 62.5% respectively. Thus, these results showed that recombinants proteins and total extract of L. (L.) amazonensis were antigenic and the total extract of L. (L.) amazonensis and rLACK were the antigen that had the best sensibility and specificity.
As leishmanioses compreendem um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas, é causada por parasitos intracelulares que pertencem ao gênero Leishmania. Os testes sorológicos utilizados até o presente, para o diagnóstico, apresentam várias limitações e por isto é de grande importância identificar proteínas imunogênicas da Leishmania, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA). O objetivo deste estudo foi produzir e purificar as proteínas recombinantes “Leishmania activated C kinase” (rLACK); “Thiol Specific Antioxidant” (TSA), “Leishmania elongation initiation factor” (LeIF) e “Leishmania braziliensis stress inducible protein 1” (LbSTI) e avaliar a sua antigenicidade. As proteínas recombinantes foram produzidas pela técnica de DNA recombinante segundo descrito por Salay et al. (2007). Para a realização do ELISA foram cultivadas as espécies L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) e L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) e seus extratos antigênicos e as proteínas recombinantes produzidas foram utilizados como antígenos. Foram utilizadas 60 amostras de pacientes com LTA, atendidos no hospital Anuar Auad, Goiânia, Goiás, sendo que destas, 45 eram de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) e 15 eram de leishmaniose mucosa (LM). Para a análise da especificidade foram utilizados o soro de pacientes com outras patologias. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF apresentarem sensibilidade de 85%, 75%, 70%, 76,7%, e 56,1% respectivamente. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF obtiveram especificidade de 72,5%, 80%, 60%, 30% e 62,5%, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstraram que as proteínas recombinantes e o extrato total de L. (L.) amazonensis foram antigênicas e o extrato total de L. (L.) amazonensis e a rLACK foram os antígenos que tiveram as melhores sensibilidades e especificidades.

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Bea, Joo-eun. "Generation of Baculovirus-Brucella Abortus Heat Shock Protein Recombinants; Mice Immune Responses Against the Recombinants, and B. Abortus Superoxide Dismutase and L7/L12 Recombinant Proteins." Diss., Virginia Tech, 1999. http://hdl.handle.net/10919/26244.

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Abstract:

Brucella abortus is capable of resisting the microbicidal mechanisms of phagocytic cells and growing within phagocytic cells, usually macrophages. B. abortus, like several other intracellular bacteria responds to the hostile environment in macrophages by producing heat shock proteins (HSPs) which are induced by environmental stresses. Bacterial HSPs are very immunogenic, eliciting both cellular and humoral immune responses in the infected host. The significance of host cellular and protective immune responses directed against these proteins is currently unresolved. Baculovirus recombinants were generated in Sf9 insect cells for B. abortus HSPs and the protein expression was optimized. Humoral (Western blot), cell mediated (CMI, IFN-g- release by splenocytes, and CD3+CD4+, CD3+CD8+ T cell/ total splenocytes ratios) and protective immune responses of BALB/c mice (challenge with virulent B. abortus 2308) against these recombinants, against B. abortus superoxide dismutase (SOD) and ribosomal L7/L12 proteins, inoculated alone or in various combinations with complete Freund's, Ribi and recombinant IL-12 as adjuvants, were analyzed. Vaccinia virus-GroEL recombinant as priming immunogen, followed by baculovirus-GroEL-Ribi booster, was explored. Androstenediol, an immune up-regulator, was tested for its ability to induce resistance against challenge. None of the mice inoculated with individual, divalent or trivalent HSP-expressing Sf9 cells combined with Freund's were protected against challenge and the Sf9 cell-induced response masked the recombinant protein-specific CMI responses. Recombinant HSPs were purified and combined with Ribi. Although significant IFN-g release was induced by immunization with the HtrA-Ribi combination, no mice were protected against challenge. Priming with vaccinia virus-GroEl recombinant and boosting with purified baculovirus-GroEL protein-Ribi combination did not induce protection. Androstenediol did not enhance in vivo resistance to challenge. IL-12 alone did not activate splenocytes but induced significant IFN-g release in mice when combined with killed B. abortus RB51 vaccine, purified recombinant HtrA or purified SOD proteins, or L7/L12 expressing Escherichia coli cells. Significant protection was induced by SOD combined with IL-12. No correlation was seen between IFN-g release by splenocytes and protection against challenge in the SOD/IL-12-immunized mice. The results suggest that B. abortus HSPs are not highly immunogenic in mice and though various immune responses may be induced by one or another HSPs, protective immune response, unfortunately, is not among them. The results of this study reflect the difficulties in experimenting with immune responses against single or a limited number of recombinant B. abortus proteins. This is particularly true when the task includes induction of a protective immune response and finding significant correlation between different types of immune response assays.
Ph. D.

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Sousa, Eduardo Martins de. "Construção de uma vacina de subunidade proteica de mycobacterium tuberculosis e avaliação da imunogenicidade e antigenicidade." Universidade Federal de Goiás, 2013. http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/3130.

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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Tuberculosis is a re-emerging infectious disease that remains a major public health problem worldwide. Although there is the BCG vaccine that is effective against severe forms of childhood TB, in adults its efficacy is variable (0-85%). In this context there is a need to develop new vaccines to control the spread of TB. This thesis proposes the development of a new recombinant fusion M. tuberculosis protein (Ag85C-MPT51-HspX) by molecular cloning, expression in E. coli with a histidine tag and purified by ion exchange chromatography. The fusion protein was constructed successfully, expressed in E. coli BL21 and purified. Tests in mice were performed to evaluate the immunogenicity of the recombinant fusion protein Ag85C-MPT51-HspX of M. tuberculosis. Mice were immunized three times with the protein Ag85C-MPT51-HspX formulated with CpG-DNA encapsulated in liposomes, CpG-DNA encapsulated in liposomes, liposome or saline as negative control and the humoral and cellular immune response was evaluated. The immunization with the vaccine formulation induced the production of high titers of specific anti-fusion protein Ag85C-MPT51-HspX IgG1 = 3.08 ± 0.04; IgG2a = 3.10 ± 0.03) and, favored the increase of specific CD4+ IFN-γ (2.14% ± 0.17), CD4+ TNF-α (2.16 ± 0.34%). The recognizing of this protein by seric IgG and IgM discriminated patients with active TB infection from healthy individuals. We conclude that CMX protein has potential to be used for the development of vaccine against M. tuberculosis as well also for TB diagnostic kits.
A tuberculose é uma doença infecciosa re-emergente que permanece como um dos maiores problemas de saúde pública mundial. Embora exista a vacina BCG que é eficiente contra formas graves de TB na infância, em adultos a eficácia é variável (0 a 85%). Nesse contexto existe a necessidade do desenvolvimento de novas vacinas para controlar a disseminação da TB. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nova proteína de fusão recombinante (Ag85C-MPT51-HspX) de M. tuberculosis a partir da clonagem molecular, expressão em E. coli com uma cauda de histidina e purificação através de cromatografia de troca iônica. A proteína de fusão foi construída com sucesso expressa em E. coli BL21 e purificada. Ensaios em camundongos foram realizados para avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante de fusão Ag85C-MPT51-HspX de M. tuberculosis. Os camundongos foram imunizados três vezes com a proteína Ag85C-MPT51-HspX formulada com CpG-DNA encapsulada em lipossoma, CpG-DNA encapsulado em lipossoma, lipossoma ou salina como controle negativo e a resposta imune humoral e celular foi avaliada . A imunização com a formulação vacinal induziu a produção de altos títulos de anticorpos específicos anti-proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX (IgG1 =3,08±0,04; IgG2a=3,10±0,03), bem como, favoreceu o aumento de células T CD4+IFN-γ (2,14%±0,17), CD4+TNF-α (2,16%±0,34) específicas. A avaliação do reconhecimento desta proteína de fusão tanto por IgM quanto IgG humana sérica permitiu discriminar pacientes com tuberculose ativa de controles saudáveis, demonstrando a antigenicidade desta molécula em humanos. Conclui-se que a proteína CMX poderá ser testada tanto como vacina, assim como para o desenvolvimento de testes de diagnóstico para a tuberculose.

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Dissertations / Theses on the topic 'ProteÃna recombinante'

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