Academic literature on the topic 'Proteínas cinases'

Los efectos de los factores de crecimiento y de ciertas hormonas se deben a la activación de receptores con actividad intrínseca de cinasa de tirosina (o RTK’s, por receptor tyrosine kinases), cuya estimulación inicia cascadas de señalización intracelular que regulan eventos transcripcionales esenciales para la proliferación y la diferenciación celulares. Entre los efectos debidos a la estimulación de los RTK’s, destaca la activación de la familia de cinasas de proteína activadas por mitógeno o MAPK’s (mitogen-activated protein kinases). Existen evidencias que indican que la estimulación de algunos receptores acoplados a proteínas G (o GPCR’s, por G protein-coupled receptors) resulta en la activación de RTK’s en ausencia de un ligando para estos últimos. Este proceso ha sido denominado transactivación, y depende de señales intracelulares inducidas por la estimulación de GPCR’s en las que participan tanto las subunidades a como los complejos bg de las proteínas G, así como fenómenos de fosforilación mediados por diferentes cinasas. En este artículo se revisan las características estructurales de ambos tipos de receptores (GPCR’s y RTK’s), los mecanismos responsables de su activación y los procesos involucrados en el fenómeno de transactivación de RTK’s por activación de GPCR’s.

Introducción. La leptina es una hormona secretada por los adipocitos que se ha relacionado con el proceso de la transición de epitelio a mesénquima (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT). Promueve la migración e invasión de las células del epitelio mamario mediante la activación de las cinasas FAK y Src, un complejo regulador de vías de señalización que favorecen la expresión de las proteínas relacionadas con la formación de estructuras proteolíticas implicadas en la invasión y progresión del cáncer. Recientemente, se ha descrito que la sobreexpresión y activación de la proteína Hic-5 durante el mencionado proceso de transición, favorece la formación de los puntos de actina (indicativa de la formación y funcionalidad de los invadopodios), lo cual promueve la degradación local de los componentes de la matriz extracelular y la metástasis del cáncer.Objetivos. Evaluar el papel de las cinasas FAK y Src sobre la expresión y localización subcelular de Hic-5 y la formación de puntos de actina inducida por la leptina en la línea celular MCF10A de epitelio mamario no tumoral.Materiales y métodos. Se utilizaron los inhibidores específicos de la FAK (PF-573228) y la Src (PP2) para evaluar el papel de ambas cinasas en los niveles de expresión y localización subcelular de la proteína Hic-5 mediante Western blot e inmunofluorescencia, así como la formación de puntos de actina mediante la tinción con faloidina-TRITC en células MCF10A estimuladas con leptina.Resultados. La leptina indujo el incremento en la expresión de Hic-5 y la formación de puntos de actina. El tratamiento previo con los inhibidores de las cinasas FAK (PF-573228) y Src (PP2), promovió la disminución en la expresión de Hic-5 y de los puntos de actina en la línea celular MCF10A de epitelio mamario no tumoral.Conclusión. La leptina indujo la expresión y la localización perinuclear de Hic-5 y la formación de puntos de actina mediante un mecanismo dependiente de la actividad de las cinasas FAK y Src en las células MCF10A.

A Síndrome de Gilles de la Tourette (ST) é uma entidade neuropsiquiátrica caracterizada pela presença de tics e com importante componente hereditário. Muitos grupos vem estudando os aspectos genéticos da ST, mas frequentemente os achados não se sustentam em estudos subsequentes e fica clara toda a dificuldade em estabelecer os genes relacionados com a ST. Entretanto, no último ano foi publicado estudo que correlaciona mutação no gene da Slit and Trk-like family member 1 (SLITRK1) com a presença ST em um pequeno grupo de pacientes. Esse gene codifica a proteína SLITRK1 que é homóloga às proteínas SLIT e o receptor de tirosina cinase (TRK). A família das proteínas SLIT estão envolvidos no direcionamento axonal durante o cruzamento da linha média na medula vertebral. Enquanto o receptor de TRK acelera a diferenciação induzida pelo fator de crescimento neuronal. A SLITRK aparentemente está envolvida no crescimento de dendritos e axônios. Faltam estudos que avaliem a presença de mutações no gene da SLITRK1 em outras populações, assim como que avaliem a possibilidade de alteração de outros genes dessa via de sinalização. Entretanto, caso se confirmem as alterações no gene da SLITRK1, ou de genes correlacionados, o entendimento e o estudo de ST passará a envolver o direcionamento axonal e especialmente as proteínas da via SLITRK-SLIT-ROBO.

A Síndrome de Gilles de la Tourette (ST) é uma entidade neuropsiquiátrica caracterizada pela presença de tics e com importante componente hereditário. Muitos grupos vem estudando os aspectos genéticos da ST, mas frequentemente os achados não se sustentam em estudos subsequentes e fica clara toda a dificuldade em estabelecer os genes relacionados com a ST. Entretanto, no último ano foi publicado estudo que correlaciona mutação no gene da Slit and Trk-like family member 1 (SLITRK1) com a presença ST em um pequeno grupo de pacientes. Esse gene codifica a proteína SLITRK1 que é homóloga às proteínas SLIT e o receptor de tirosina cinase (TRK). A família das proteínas SLIT estão envolvidos no direcionamento axonal durante o cruzamento da linha média na medula vertebral. Enquanto o receptor de TRK acelera a diferenciação induzida pelo fator de crescimento neuronal. A SLITRK aparentemente está envolvida no crescimento de dendritos e axônios. Faltam estudos que avaliem a presença de mutações no gene da SLITRK1 em outras populações, assim como que avaliem a possibilidade de alteração de outros genes dessa via de sinalização. Entretanto, caso se confirmem as alterações no gene da SLITRK1, ou de genes correlacionados, o entendimento e o estudo de ST passará a envolver o direcionamento axonal e especialmente as proteínas da via SLITRK-SLIT-ROBO.

Os estudos relacionados ao armazenamento de memória têm apresentado notáveis avanços em sua abordagem molecular. Enzimas como a proteína cinase A (PKA) e a proteína cinase C (PKC), bem como fatores de transcrição como a CREB-1 e a CREB-2, participam da plasticidade neuronal de consolidação da memória. O objetivo do trabalho, portanto, foi apresentar, de maneira sistemática, a cadeia de eventos moleculares e celulares que acompanham o armazenamento da memória implícita em suas diferentes durações. A bibliografia deste trabalho descreve alguns estudos relacionados à transdução de sinal em circuitos neuronais simples. As pesquisas se pautam em duas modalidades de armazenamento convencionadas: facilitação de curta duração (STF) e facilitação de longa duração (LTF), cada uma apresentando seus mecanismos particulares. A facilitação de duração média (ITF) também é mencionada. Os avanços da biologia molecular prometem fornecer perspectivas cada vez mais íntimas dos mecanismos que governam as funções mentais, em especial da memória.

El cáncer cervicouterino (CaCu) es la segunda causa de muerte en México. La infección por el virus del papiloma humano es una condición necesaria durante el proceso de carcinogénesis. Una de las características del CaCu es que presenta un metabolismo alterado, las células tienden a captar más eficientemente la glucosa y aumentar la glucólisis. La glucosilación aberrante es un sello distintivo de algunos tipos de cáncer, que refleja cambios, como la expresión alterada de glucosiltransferasas y glucosidasas. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue describir el patrón de expresión de las proteínas CD43, piruvato cinasa II, y hexocinasa II en tejido cervical sano, tejido con cáncer cervicouterino y en lineas celulares de CaCu. Hasta el momento se encontró una mayor expresión de las proteínas al compararse con los tejidos sanos. Sin embargo, aun faltarían estudios para demostrar si pueden utilizarse como factor pronóstico para las pacientes conCaCu epidermoide.

O triatlo é um esporte de destaque e ampla participação mundial. Incorpora três diferentes modalidades de endurance - natação, ciclismo e corrida - dentro de um único evento. Há uma variedade de distâncias sobre as quais os eventos de triatlo são realizados, sendo a prova de ultradistância (ironman) a mais extensa. Autores diversos já relataram a ocorrência de lesões após esforço intenso, seja diretamente, através de alterações histológicas no sarcômero, ou indiretamente, pela quantificação da concentração de proteínas musculares específicas (biomarcadoras de lesão) no plasma. Entre esses marcadores de lesão muscular destacam-se a mioglobina e a creatina cinase. Efetivamente, a creatina cinase é o indicador bioquímico mais utilizado na literatura como indicador da ocorrência de lesão muscular. Dentro desse contexto justifica-se o objetivo do presente trabalho que visa verificar o efeito do exercício nas concentrações séricas de creatina cinase em triatletas de ultradistância frente a um período de competição. Para tanto, foram avaliados os dados das concentrações séricas de CK de 10 atletas que participaram da prova do Ironman Brasil de 2007. As análises sanguíneas foram realizadas em cinco períodos distintos: 19 dias antes da prova do ironman (CK1), 48 horas antes da prova (CK2), imediatamente após (CK3), cinco dias após (CK4) e 12 dias depois da prova (CK5). Os resultados apontaram aumento significativo nas concentrações de CK nos períodos 3 e 4 em relação aos demais períodos avaliados. Estas alterações evidenciam a influência do exercício exaustivo sobre as concentrações de CK, revelando a possibilidade de desenvolvimento de lesões musculares durante essa competição. Este fato reforça a importância do monitoramento de biomarcadores, como a CK, que permite a treinadores e atletas ajustarem suas cargas de treinamento para aumentar os benefícios do treinamento e para evitar o supertreinamento, melhorando o desempenho, a saúde e a qualidade de vida do atleta.

O objetivo do estudo foi avaliar o hemograma e o perfil bioquímico sérico, inclusive hemogasométrico, de bezerros infectados experimentalmente com Salmonella Dublin. Foram utilizados 12 bezerros sadios da raça Holandesa com 10 a 15 dias de idade, distribuídos aleatoriamente em dois grupos experimentais: grupo-controle (n= 6) e grupo infectado com 10(8)UFC de Salmonella Dublin (n=6). Os bezerros foram submetidos ao exame físico diário, e as amostras de sangue foram coletadas minutos antes da inoculação (0h) e 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168h após a inoculação. Além do hemograma e das análises hemogasométricas, foram mensuradas as atividades séricas das enzimas aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (ALP), creatina cinase (CK), gamaglutamiltransferase (GGT) e lactato desidrogenase (LDH), e os teores de albumina, bilirrubinas, cálcio total, cálcio ionizado, sódio, potássio, cloretos, creatinina, ferro, fibrinogênio, fósforo, glicose, magnésio, proteína totais e ureia. As principais alterações foram: redução das concentrações de albumina, ferro, glicose, magnésio e proteína total, aumento do teor de fibrinogênio, leucocitose e acidose metabólica e hiponatremia.

Introducción. La isquemia cerebral es la tercera causa de riesgo de muerte en Colombia y la primera causa de discapacidad física en el mundo. En diversos estudios en los que se silenció la cinasa 5 dependiente de la ciclina (CDK5) se ha demostrado que la reducción de su actividad es beneficiosa frente a la isquemia. Sin embargo, su efecto sobre la neurogénesis después de la isquemia no se ha dilucidado suficientemente.Objetivo. Evaluar el silenciamiento de la CDK5 en la neurogénesis y la gliogénesis después de la isquemia cerebral focal en ratas.Materiales y métodos. Se usaron 40 machos de rata Wistar de ocho semanas de edad. Los grupos de control y los isquémicos sometidos a transducción en la región del hipocampo CA1, se inyectaron intraperitonealmente por estereotaxia con 50 mg/kg de bromodesoxiuridina (BrdU) a partir de las 24 horas y hasta el día 7 después de la isquemia, con un vector viral asociado a adenovirus usando una secuencia no interferente (SCRmiR) y una interferente (CDK5miR). Se evaluó la capacidad neurológica durante los quince días siguientes y se detectó la capacidad de inmunorreacción para la BrdU, la proteína doblecortina (DCX), los núcleos neuronales (NeuN), y la proteína fibrilar acídica de la glía (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) a los 15 y 30 días de la isquemia.Resultados. Los animales isquémicos tratados con CDK5miR mejoraron su puntuación neurológica y presentaron un incremento de la BrdU+ a los 15 días de la isquemia, lo cual se correlacionó con una mayor intensidad de la DCX+ y una menor de la GFAP+. No hubo modificación de los NeuN+, pero sí una reducción significativa de la GFAP+ a los 30 días de la isquemia en los animales tratados comparados con los animales isquémicos no tratados.Conclusión. La terapia con CDK5miR generó la recuperación neurológica de ratas isquémicas asociada con la inducción de la neurogénesis y el control de la capacidad de reacción de la proteína GFAP a corto y largo plazo después de la isquemia.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)<br>Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)<br>Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)<br>Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX)<br>As epilepsias do lobo temporal são as que apresentam maior refratariedade ao tratamento farmacológico e perfazem 2/3 das intervenções cirúrgicas de epilepsia, sendo portanto de grande custo social, econômico e psicológico. Assim, modelos animais de epilepsia do lobo temporal são de grande relevância não só para o entendimento das bases neurais dessa patologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas capazes de evitar a instalação da doença. Esses são os objetivos da presente dissertação de doutorado. Após um evento traumático (no caso deste trabalho, um estado de mal epiléptico), diversas alterações morfológicas e fisiológicas acontecem, caracterizando a gênese da síndrome epiléptico (epileptogênese). Dentre as alterações podemos destacar a intensa fosforilação de proteínas em resíduos de tirosina e a ativação de diferentes segundos mensageiros. Os dois primeiros capítulos desta tese descrevem a tentativa de bloquear os processos de epileptogênese por meio da inibição da fosforilação de resíduos de tirosma através do tratamento farmacológico com inibidores das tirosina cinases, a herbimicina A e o K-252a. O terceiro capítulo analisa eletrofisiologicamente o circuito neural do giro denteado em animais que apresentavam uma mutação em um sítio inibitório da proteína cálcio/calmodulina cinase do tipo II (CaMK1I). No primeiro capítulo, mostramos que o tratamento agudo com herbimicina A (348M, 5L, icv), é capaz de bloquear a potenciação duradoura (LTP) induzida por um estímulo tetânico bem como de atenuar (~40 por cento) a ativação neuronal (expressão de c-Fos) decorrente de um estado de mal epiléptico induzido pela administração sistêmica de pilocarpina (SE). Apesar dos significativos efeitos agudos, este tratamento mostrou-se incapaz de atenuar a freqüência de crises espontâneas, bem como o padrão de morte neuronal observado após o estado de mal epiléptico induzido pela pilocarpina. Entretanto, o tratamento com herbimicina A alterou o padrão de marcação de metais pesados (Zn+2) no hilo do giro denteado e na região de CA, do hipocampo, porém não apresentou efeito sobre o padrão de brotamento das fibras musgosas observado na camada molecular do giro denteado. No segundo capítulo, mostramos que a herbimicina e o K252a modificam a atividade epileptiforme induzida pela administração intra-hipocampal de ácido caínico, sem alterar o padrão de morte neuronal. Esses resultados sugerem que o tratamento com inibidores de proteínas tirosina cinases é capaz de modificar o padrão de ativação agudo do hipocampo após um estímulo (ie., o estado de mal epiléptico ou a LTP), porém sem qualquer efeito sobre o processo de epileptogênese. No terceiro capítulo, estudamos a excitabilidade e a plasticidade do giro denteado à estimulação da via perfurante (principal aferência da formação hipocampal) em animais que apresentam uma CaMKII geneticamente modificada. Essa proteína uma vez ativada não pode ser inibida. A caracterização eletrofisiológica demonstrou que esses animais apresentam potenciais de campo evocados no giro denteado aparentemente semelhante aos animais controle (wild-type), porém sua responsividade a padrões de estimulação em salvas e sua plasticidade apresentaram clara alteração. Essa modificação foi caracterizada por uma maior variabilidade nas respostas à trens de estimulação (freqüências de 1 e 2 Hz) e maior inibição do pulso pareado em trens de estimulação (para pulsos pareados aplicados a freqüência de 5 Hz). Além disso, conforme já descrito na literatura, mostramos que a susceptibilidade a atividade epileptiforme depende do padrão de estimulação utilizado para os diferentes animais (mutantes vs. wild-type). Assim, utilizando o modelo clássico do abrasamento demonstramos que a mutação não altera a evolução da epileptogênese. Entretanto, ao utilizarmos duas variantes de um padrão de estimulação similar à freqüência teta (5Hz, Intermittent vs. Continuous theta-burst stimulations), demonstramos a importância da mutação na manutenção da excitabilidade do giro denteado. Esses resultados destacam a importância da CaMKII na atividade epileptiforme além de sugerir novas abordagens experimentais (ie., sensibilidade à padrões de estimulação eletrofisiológica) no estudo da epiloptogênese. Em resumo, os resultados apresentados nessa tese contribuem para um melhor entendimento dos fenômenos subjacentes aos processos de plasticidade neuronal e da contribuição destes para o fenômeno de epiloptogênese, além de sugerir abordagens promissoras de intervenção e estratégias farmacológicas de relevância clínica.<br>Temporal lobe epilepsies are highly refractory to pharmacological treatment. Up to 70% of these patients undergo chirurgical resection of temporal region, procedure with important consequences for the social, economic and psychological spheres. Experimental animal models that mimic temporal lobe epilepsy provide an insightful approach to study the neural basis of epilepsy as well as create opportunities to test promising therapeutic drugs. The present thesis tests the antiepileptogenic activity of two protein tyrosine kinase inhibitors and the relevance of Ca+2/calmodulin kinase type II (CaMKII) mutants. Multiples morphological and physiological alterations take place after a traumatic brain injury (in this thesis, the status epilepticus) leading the animal to an epileptic conditions. During this period, the epileptogenesis process, there is strong tyrsine phosphorylation with the activation of many second messengers. The first two chapters of the thesis describe experiments in which herbimycin A and K-252a, two protein tyrosine kinase inhibitors, were used to attenuate synaptic plasticity and epileptogenesis. The third chapter, the dentate gyrus network was studied after angular bundle stimulation in animals presenting one punctual mutation at the autoinhibitory phosphorylation site of the CaMKII. In the first chapter, we showed that one single herbimycin A injection (348μM, 5μL, icv) was able to attenuate long-term potentiation (LTP) in the commissural CA3 neurons and also, to decrease status epilepticus- (SE-) induced neuronal activation (c-Fos expression) in almost 40%.Although markedly acute effects, the present herbimycin A treatment was not able to diminish spontaneous seizure frequency, cell death or aberrant mossy fiber sprouting observed after the pilocarpine-induced SE. Curiously, herbimycin-treated animals presented decreased neo-Timm staining in the hilus and CA3 region despite the epileptic condition. In the second chapter, we confirmed the ability of protein tyrosine kinase inhibitors to decrease SE-induced neuronal activation. Herbimycin A icv treatment altered the kainic acid-induced epileptiform profile in EEG recordings. Cell death pattern was not altered by any pharmacological treatment. These results suggest that protein tyrosine kinase inhibitiors are able to modify the acute neuronal activation and plasticity (ictogenesis or LTP) but is ineffective in attenuating the epileptogenesis process.In the third chapter, we studied the dentate gyrus excitability and plasticity after angular bundle stimulation in CaMKII mutant animals. Once in its self-sustained mode, this mutation does not allow the reduction of the catalytic activity of the kinase. These animals present normal electrophysiological profiles (similar to wild-type animals) but with reduced amplitude. Shortterm plasticity was clearly altered. Mutant animals presented increased variability in the responses to trains of stimulation at 1 and 2 Hz, and at at 5Hz stronger paired-pulse inhibition. Accordingly to the literature, we also showed that the epileptiform susceptibility depends on the stimulation pattern used in both animals (mutants vs. wild-type). Thus, although the mutation did not altered the behavior and the electrographic kindling evolution, we showed that mutant animals were prone to afterdischarges when stimulate by an intermittent theta-burst stimulation. On the other hand, the same animals needed more bursts to induce afterdischarges when the stimulation was set in the continuos mode.Taken together, the present results contribute to a better understanding of the protein tyrosine kinase and CaMKII function in neuronal plasticity underlying the epileptogenesis process and sum efforts in searching for a clinic antiepileptogenic drug.<br>FAPESP: 00/10826-3<br>BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Jorg Kobarg<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-18T17:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Meirelles_GabrielaVaz_D.pdf: 11269390 bytes, checksum: bfd22a079ffc68a78b96b3e50dd60b1c (MD5) Previous issue date: 2011<br>Resumo: A proteína NIMA foi identificada e caracterizada funcionalmente em Aspergillus nidulans como sendo uma serina/treonina cinase critica para a progressão do ciclo celular. As Neks (NIMA-related kinases) constituem uma família de cinases composta por 11 membros em mamíferos, que compartilham 40-45% de identidade com a proteína NIMA no domínio catalítico N-terminal. As Neks estão associadas a funções do ciclo celular e diversas patologias, o que as torna potenciais alvos quimioterápicos. Mutações no gene da Nek1 levam ao desenvolvimento da doença renal policistica e ao aparecimento de diversos efeitos pleiotrópicos, sugerindo sua participação em vias reguladoras de vários processos celulares. A Nek6, por sua vez, e ativada durante a mitose, e a super-expressão de mutantes inativos ou a sua depleção por RNAi produz células exibindo defeitos no fuso, anormalidades nucleares, parada na metáfase e apoptose. A Nek6 humana foi recentemente associada a carcinogênese, mas, assim como para a maioria das Neks, sua estrutura molecular, parceiros de interação e vias de sinalização permanecem ainda desconhecidos. Nesse trabalho, introduzimos a hNek6 como uma hub no interactoma humano. Uma extensa comparação de bancos de dados baseada em analises de conectividade mostrou que o quinoma humano e enriquecido em hubs. Nossas redes de interação incluem um amplo espectro de novos parceiros de interação para a hNek6 identificados em screenings de duplo - hibrido em levedura, classificados em 18 categorias funcionais. Alguns novos parceiros de interação da hNek6 são também possíveis substratos e, ainda, colocalizam com a hNek6 e ?-tubulina em células humanas, apontando para uma possível interação centrossomal. Os diversos parceiros de interação conectam a hNek6 a novas vias, como a sinalização de Notch e a regulação do citoesqueleto de actina, ou fornecem novas pistas de como a hNek6 poderia regular vias previamente propostas, como ciclo celular, reparo de DNA e sinalização do NF-?B. Alem disso, obtivemos o primeiro modelo estrutural de baixa resolução para a hNek6 a partir de SAXS. Analises estruturais revelaram que a hNek6 e um monômero em solução, apresentando uma conformação predominantemente globular, mas levemente alongada. Particularmente, a curta região N-terminal desordenada da hNek6 e importante para mediar as interações com seus parceiros. No caso da hNek1, observamos que ela interage com Fez1 e Clasp2 através de seus motivos coiled-coil, e colocaliza com essas proteínas em uma região candidata ao centrossomo<br>Abstract: NIMA was identified and functionally characterized in Aspergillus nidulans as a critical Ser/Thr kinase for cell cycle progression. The mammalian Neks (NIMA-related kinases) represent an evolutionarily conserved family of 11 serine/threonine kinases that share 40-45% identity with NIMA N-terminal domain. Neks are associated to cell cyclerelated functions and diverse pathologies, which highlight them as potential chemotherapeutic targets. Nek1 gene mutations lead to the development of polycystic kidney disease and the emergence of several pleiotropic effects, suggesting its involvement in pathways regulating various cellular processes. Nek6, in turn, is activated during mitosis, and overexpression of inactive mutants or its depletion by iRNA produces cells exhibiting mitotic spindle defects, nuclear abnormalities, metaphase arrest and apoptosis. Human Nek6 was recently found to be linked to carcinogenesis, but as for the majority of Neks, the molecular structure, interacting partners and signaling pathways remain elusive. Here we introduce hNek6 as a hub kinase in the human interactome. We performed a broad databank comparison based on degree distribution analysis and found that the human kinome is enriched in hubs. Our networks include a large set of novel hNek6 interactors identified in our yeast two-hybrid screens, classified into 18 functional categories. Some novel interactors are also putative substrates and colocalized with hNek6 and ?-tubulin in human cells, pointing to a possible centrosomal interaction. The interacting proteins link hNek6 to novel pathways, e.g. Notch signaling and actin cytoskeleton regulation, or give new insights on how hNek6 may regulate previously proposed pathways such as cell cycle, DNA repair and NF-?B signalings. Furthermore, we obtained the first low-resolution structural model of hNek6 by SAXS. Structural analysis revealed that hNek6 is a monomer in solution with a mostly globular, though slightly elongated conformation. Notably, we found that hNek6 unfolded short N-terminal region is important to mediate the interactions with its partners. In the case of hNek1, we found that it interacts with Fez1 and Clasp2 through coiled-coil motifs and colocalizes with these proteins in a candidate centrosomal region<br>Doutorado<br>Bioquimica<br>Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas<br>A desregulação da actividade das proteínas tirosina-cinases está na base do desenvolvimento de algumas doenças oncológicas. O exemplo melhor documentado é o da actividade desregulada da tirosina-cinase BCR-ABL (Breakpoint Cluster Region-Abelson Leukaemia) originada da translocação cromossómica t(9;22), a qual é responsável pela apresentação fenotípica da leucemia mielóide crónica (LMC) (Martinelli et al., 2005). O conhecimento deste fenómeno celular desencadeou o desenvolvimento de fármacos direccionados especificamente para este tipo de oncogenes. O primeiro fármaco inibidor da actividade da oncoproteína BCR-ABL a ser utilizado na prática clínica foi o mesilato de imatinib, introduzido em Maio de 2001, para o tratamento da LMC, o qual continua a ser a primeira de linha de tratamento de todos os pacientes recém-diagnosticados de LMC (Duckett and Cameron, 2010). Com o aparecimento de casos de resistência e intolerância ao mesilato de imatinib, foram desenvolvidos, testados e aprovados novos fármacos. Outros fármacos foram desenvolvidos para inibir famílias de cinases responsáveis por outras neoplasias. Tratam-se de fármacos recentes na prática clínica, sendo fundamental acelerar o conhecimento aprofundado da sua farmacocinética. Pela compreensão adequada do perfil farmacocinético dos TKIs (inibidores das proteínas tirosina-cinases), os factores influenciadores da exposição a estes fármacos poderão ser reconhecidos, permitindo impedir a sua sub e sobrexposição terapêutica (van Erp et al., 2009). De uma forma resumida, os TKIs apresentam as seguintes características gerais: actuam especificamente em várias famílias proteicas tirosina-cinases mutadas e/ou sobrexpressas nos tecidos cancerígenos, alcançam os seus níveis plasmáticos relativamente rápido, apresentam distribuição extensa, estabelecem forte ligação proteica, são metabolizados primariamente pela CYP3A4 (citocromo P3A4) e são predominantemente excretados nas fezes. Utilizam transporte mediado por transportadores membranares específicos, tanto durante o processo de absorção, como para alcançar o interior celular, variando na sua intensidade e no tipo de transportadores de acordo com a natureza físico-química do TKI. Alguns deles inibem as enzimas responsáveis pela sua própria metabolização e os transportadores membranares responsáveis pela sua própria permeabilidade intracelular e extracelular. Algumas interacções entre fármacos estão bem estudadas e fundamentadas, sendo a maior parte delas comum a todos os TKIs (van Erp et al., 2009). Uncontrolled activity of tyrosine kinases proteins leads to development of some oncological diseases. The best documented example is the uncontrolled tyrosine kinase activity BCR-ABL (breakpoint cluster Region-Abelson Leukaemia) from the chromosomal translocation t(9; 22), which is responsible for the chronic myeloid leukemia (CML) phenotypic presentation (Martinelli et al., 2005). The knowledge of this cellular phenomenon triggered the development of drugs targeted specifically for this type of oncogenes. The first drug inhibiting the activity of BCR-ABL oncoprotein used in clinical practice, imatinib mesylate, was introduced in May 2001 for the treatment of CML, which remains the first-line treatment of all patients newly diagnosed CML (Duckett and Cameron, 2010). With the emergence of cases of resistance or intolerance to imatinib mesylate, it has been developed, tested and approved new drugs. Other drugs have been developed to inhibit families of kinases responsible for other cancers. These are newer drugs in clinical practice and it is central accelerate thorough knowledge of its pharmacokinetics. For proper understanding of the pharmacokinetic profile of TKIs (inhibitors of tyrosine protein kinases), the factors influencing exposure to these drugs may be recognized, allowing prevent their sub-therapeutic and overexposure (van Erp et al., 2009). Summarizing, TKIs have the following general characteristics: they act specifically in several protein families mutated tyrosine kinases in cancerous tissues, they reach their plasma levels relatively fast, they exhibit extensive distribution, they establish strong protein binding, they are metabolized primarily by CYP3A4 (cytochrome P3A4) and they are predominantly excreted in the feces. They are carried by specific membrane transport, both during the process of absorption as to reach the cell cytoplasm, ranging in intensity and type of the carriers according to the physico-chemical nature of the TKI. Some of them inhibit the enzymes responsible for their own metabolism and the membrane carriers responsible for their own intracellular and extracellular permeability. Some drug interactions are well researched and substantiated, and most of them are common to all TKIs (van Erp et al., 2009).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências.<br>Made available in DSpace on 2012-10-24T03:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249280.pdf: 4207210 bytes, checksum: aedd92f8df093be8262293fce757903e (MD5)<br>O Sistema Visual representa um excelente modelo para o estudo dos processos plásticos e de desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (SNC). Muitos fatores têm sido implicados na maturação do sistema visual, mas as vias de sinalização intracelular envolvidas ainda não são bem conhecidas. De particular interesse são as proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs), uma família de serina/treonina cinases que possuem um importante papel na transdução de sinal da superfície celular para o núcleo. Estas enzimas são importantes mediadores intracelulares de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento e recentemente têm sido implicadas no controle da plasticidade sináptica. Nos mamíferos, os membros desta família são cinases reguladas por sinal extracelular ½ (ERK1/2), cinase c-Jun amino-terminal (JNK) e p38MAPK. No sistema visual, foi demonstrado que a via de ERK regula processos de plasticidade durante o desenvolvimento em níveis retino-talâmicos e retinocorticais e que p38MAPK controla uma forma peculiar de depressão de longo prazo no córtex visual. Neste trabalho, para entender melhor o papel de duas MAPKs # ERK1/2 e p38MAPK # na maturação do sistema visual, foi caracterizado por western blot a regulação da fosforilação/ativação dessas enzimas na retina, colículo superior e córtex visual de rato durante o desenvolvimento pós-natal, do nascimento (P0) à idade adulta (P45). Os resultados demonstram que (i) na retina, a ativação de p38MAPK tem um pico em P4, e entre P15 e P45, tanto a fosforilação de ERK1/2 quanto de p38MAPK aumentam; (ii) no colículo superior, a fosforilação das duas MAPKs aumenta entre P4 e P15; (iii) no córtex visual, a fosforilação de ERK1/2 aumenta de P15 a P45 enquanto a fosforilação de p38MAPK aumenta a partir de P4. Os dados apresentados demonstram uma regulação distinta da ativação de ERK1/2 e p38MAPK nas três áreas visuais analisadas, que ocorrem em correlação temporal com eventos críticos da maturação do sistema visual. Estes resultados sugerem um importante papel de ERK1/2 e p38MAPK no desenvolvimento pós-natal do sistema visual de ratos. Porém, mudanças duradouras na circuitaria neuronal requerem expressão gênica e síntese protéica. Portanto, o padrão de ativação de cinases precisa ser traduzido num padrão de expressão gênica, provavelmente através da ativação de fatores de transcrição. Uma via nuclear que pode ser crítica no controle da plasticidade neural do cérebro de mamíferos é a via de CREB. O envolvimento deste fator de transcrição na plasticidade cortical e no refinamento das projeções retino-talâmicas já foi demonstrado, mas não se sabe se CREB teria um papel na plasticidade retino-colicular. Neste trabalho, nós analisamos a expressão da forma ativada e total de CREB no colículo superior de rato durante o desenvolvimento. Os resultados mostram que tanto a forma total quanto a fosforilada de CREB aumentam entre P4 e P9, em coincidência com o aumento da ativação das MAPKs e com o período crítico da plasticidade colicular. Estes resultados demonstram que CREB também tem sua expressão altamente regulada durante um período de refinamento das conexões coliculares, podendo ter um papel também na maturação do colículo superior. The visual system represents an excellent model for studying developmental and plastic processes in the Central Nervous System (CNS). Many factors have been shown to participate in visual system maturation, but the intracellular signaling pathways involved are still relatively unknown. Of particular interest are Mitogen-activated protein kinases (MAPKs), a family of kinases implicated in various cellular functions. MAPKs are serine/threonine kinases that play an instrumental role in signal transduction from the cell surface to the nucleus. These enzymes are major intracellular mediators of developmental events and recently have been shown to control also synaptic plasticity processes. Mammalian members of this family are extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2), c-Jun amino-terminal kinases or stress-activated protein kinases (JNK/SAPKs) and p38MAPK. At the level of the visual system, it has been demonstrated that the ERK pathway regulates developmental plastic processes at both retino-thalamic and thalamo-cortical level and that p38MAPK controls a peculiar form of long-term depression in the visual cortex. Here, as a first approach to gain more insight on the role of two MAPKs - ERK1/2 and p38MAPK - in visual system maturation, we characterized by western blot the regulation of their phosphorylation/activation in rat retina, superior colliculus and visual cortex, during postnatal development from birth (P0) to adult age (P45). Our main results show that: (i) in the retina p38MAPK activation peaks at P4, and then, from P15 to P45, both ERK1/2 and p38MAPK phosphorylation increases; (ii) in the superior colliculus phosphorylation of both MAPKs increases between P4 and P15; (iii) in the visual cortex ERK1/2 phosphorylation increases from P15 to P45, while phosphorylation of p38MAPK increases starting from P4. The present data demonstrate a distinct regulation of the activation of ERK1/2 and p38MAPK in the three visual areas analyzed which occurs in temporal correlation with critical events for visual system maturation. These results suggest an important role for ERK1/2 and p38MAPK in the postnatal development of the rat visual system. Longlasting changes in neuronal circuitry require gene expression and protein synthesis. Thus, the pattern of kinase activation has to be translated into a pattern of gene expression, probably through the activation of transcription factors. A candidate nuclear pathway that might be critical in the developmental control of neural plasticity in the mammalian brain is the CREB transcriptional pathway. The involvement of this transcription factor in cortical plasticity and in the refinement of retino-geniculate projections has already been demonstrated, but the role of CREB in the retino-collicular plasticity remains unclear. Here, we analyze the expression of the activated and the total form of CREB in the rat superior colliculus during development. The results show that both phosphorylated and total form of CREB increase between P4 and P9, in coincidence with the increase of the MAPKs activation and the critical period for collicular plasticity. These results show that CREB is highly regulated during a period of refinement of collicular connections and could also be involved in the maturation of the superior colliculus.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados<br>Várias isoformas da enzima fosfoinositide-3-cinase (PI3-Cinase), uma vasta família de cinases lipidicas têm nos últimos anos vindo a ser clonada e caracterizada. P13-Cinases constituem uma família de cinases conservadas durante a evolução que catalisam a adição de uma molécula de fosfato ao fosfatidilinositol e seus derivados, esta adição tem lugar no anel inositol na posição D3. P13-Cinases estão agrupadas em três classes de acordo com as moléculas que preferencialmente utilizam como substrato in vitro e de acordo com as suas características estruturais. Fosfoinositide-3-Cinase-C2a (PI3-Cinase-C2a), pertence à classe I1 de P13- Cinases, esta classe é caracterizada pela utilização de fosfatidilinositol e fosfatidilinositol-4-P como substrato in vitro. Todos os membros da classes I1 possuem no seu C-terminal um domínio C2, característico da classe. Este trabalho permitiu a identificação do local de fosforilação da HsPI3-Cinase- C2a bem como a identificação de duas cinases envolvidas na sua fosforilação. A fosforilação de HsP13-Kinase-C2a ocorre na Ser259 e este resíduo é um alvo comum de fosforilação mitótica e de fosforilação induzida por radiação UV. Durante o ciclo celular HsP13-Cinase-C2a é predominantemente fosforilada na M fase e a cinase envolvida 6 a Cdk1,após radiação UV a fosforilação é mediada pela JNK.<br>In recent years, a large family of Phosphoinositide-3-Kinases (PI3-Kinase) isozymes has been characterized and cloned. PI3-Kinases constitute a family of evolutionary conserved lipid kinases that catalyse the addition of a phosphate molecule to the D3 position of the inositol ring of phosphatidylinositol and its derivatives. P13-Kinases are grouped into three classes according to the molecules that they preferentially utilize as substrates and their structural characteristics. Phosphoinositide-3-Kinase-C2a (P13-Kinase-C2a) belongs to class II P13- Kinases, which are defined by their in vitro use of phosphatidylinositol and phosphatidylinositol-4-phosphate as substrates. All type II P13-Kinases contain a C2 domain at their C-terminus. This work resulted in the identification of a phosphorylation site on HsP13- Kinase-C2a as well the identification of two kinases involved in mitotic and UVinduced phosphorylation of HsP13-Kinase-C2a. The phosphorylation of HsP13- Kinase-C2a occurs in Ser259 and this serine is a common target in mitotic and UV-induced phosphorylation. We found that during the cell cycle HsP13- Kinase-C2a is predominantly phosphorylated in mitotic phase and the kinase involved is Cdkl and after UV irradiation the phosphorylation of HsPI3-Kinase- C2a is mediated by JNK.

Orientador: Jörg Kobarg<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-21T00:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_EduardoCruz_M.pdf: 2623796 bytes, checksum: 858f8566bae7879895e451ce06ad3bfb (MD5) Previous issue date: 2012<br>Resumo: Cinases desempenham um papel importante na ativação de vias bioquímicas em células eucarióticas. Neks (NIMA related kinases) são uma família conservada de proteínas cinases relacionadas à progressão do ciclo celular e divisão celular, contendo em torno de 40% de identidade no domínio catalítico N-terminal com a proteína NIMA (Never in Mitosis, gene A) de Aspergillus nidulans. As cinases Neks são também descritas como relacionadas a patologias, particularmente câncer. Por estas características, as Neks são alvos potenciais para o tratamento de cânceres e desenvolvimento de drogas anti-câncer. Neste trabalho foram selecionados compostos em uma biblioteca de 87 compostos para os domínios de cinase mutados de hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 e hNek9 e o domínio de cinase selvagem de hNek7, através de um ensaio de deslocamento térmico. Neste ensaio, foi identificado pelo menos um composto com um deslocamento da Tm significativo para a hNek1 ('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC); outro, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) para a hNek6(S206A), e vários compostos para a hNek7wt e hNek2(_272-445)-(T175A). Destes compostos, B03 e F04 foram validados por docking no sítio de ligação de ATP da hNek7wt, enquanto B08 e E03 foram validados por reduzir a atividade da hNek7wt até 26,4% e 43,3%, respectivamente, na concentração de 312,5 nM. Além disso, o composto E04 foi capaz de reduzir a atividade da hNek6(S206A) pela metade com um IC50 próximo de 1,25 ?M. São necessários experimentos funcionais adicionais para validação desses dados, e estudos estruturais com resolução atômica serão importantes para caracterizar a associação de hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) e hNek7 selvagem com esses e outros compostos<br>Abstract: Kinases play an important role in the activation of biochemical pathways in eukaryotic cells. Neks (NIMA related kinases) are a conserved kinase protein family related to cell cycle progression and cell division, containing about 40% identity in the N-terminal catalytic domain with the protein NIMA (Never in Mitosis, gene A) of Aspergillus nidulans. Nek kinases are also described as related to pathologies, particularly cancer. For these characteristics, Neks are potential targets for treatment of cancers and development of anti-cancer drugs. Here we screened the recombinant activation loop mutant kinase domains of hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 and hNek9 and wild-type hNek7 against 87 compounds using thermal shift denaturation and identified at least one compound with significant Tm shift for hNek1('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC), another one, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) for hNek6(S206A), but not for the other hNek6 variants, and several hit compounds for hNek7wt and hNek2('delta'272-445)-(T175A). From these, compounds B03 and F04 were validated by docking into the ATP-binding site of hNek7wt, while B08 and E03 were validated by reducing hNek7wt activity up to 26.4% and 43.3%, respectively, at a 312.5 nM concentration. We also found that mutant hNek6, without the activation loop conserved phosphorylation, is a better target for inhibitor stabilization than an activated more phosphorylated hNek6 kinase. Moreover, compound E04 was later confirmed to reduce hNek6(S206A) activity by half with IC50 near to 1.25 ?M. Further functional experiments in living cells are required to validate this findings, and structural studies with atomic resolution will be important to characterize the association of hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) and wild-type hNek7 with these and other compounds<br>Mestrado<br>Bioquimica<br>Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015.<br>Made available in DSpace on 2016-10-19T13:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339614.pdf: 2590718 bytes, checksum: 1167194006e4630cfa0a4984aba90e64 (MD5) Previous issue date: 2015<br>As proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina/treonina cinases ativadas por fosforilação em resposta a sinais extracelulares que incluem ERK 1/2, JNK p54/p46 e p38MAPK. No sistema nervoso central (SNC) estas enzimas medeiam eventos associados ao desenvolvimento e neuroplasticidade. No período inicial do desenvolvimento pós-natal ocorrem alterações significativas na estrutura do cérebro e sinalização intracelular. No hipocampo de roedores as MAPKs têm sido apontadas como proteínas fundamentais na modulação do desenvolvimento neural e plasticidade sináptica. Apesar dessas evidências a ontogenia pós-natal das MAPKs em estruturas específicas, bem como o seu papel, em determinadas fases do desenvolvimento, para o estabelecimento de funções motoras e cognitivas no adulto tem sido pouco caracterizada. A compreensão do padrão de ativação das MAPKs durante o neurodesenvolvimento é essencial, uma vez que pequenas alterações na atividade dessas proteínas em janelas específicas do desenvolvimento podem implicar em alterações funcionais tardias. No presente estudo foi determinado, em uma primeira etapa, o perfil ontogenético da fosforilação e conteúdo total das MAPKs no hipocampo de ratos Wistar machos durante o período pós-natal (PN) 1-60. Para isso a fosforilação e o conteúdo total das MAPKs foram avaliados por western blotting nas idades: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 e PN60. Os resultados foram expressos como percentual relativo à PN1 e demonstraram: (1) aumento significativo na fosforilação de p38MAPK de forma bimodal em PN4 e PN10-60; (2) aumento na fosforilação de ERK1 (PN4) e ERK2 (PN14) dependente da idade; (3) variação do conteúdo total de JNKp54 com perfil similar ao da ativação de p38MAPK; 4) ausência de variação na taxa de fosforilação de JNK p54/p46 nas idades analisadas. Em uma segunda etapa foi determinado o papel da atividade de ERK 1/2 durante o desenvolvimento em relação às alterações comportamentais, da estrutura sináptica e na proliferação celular hipocampal na vida adulta do animal. Para isso, foi utilizado um protocolo de inibição de MEK/ERK com U0126 (5 mg/kg; i.p.) durante um período crítico de sinaptogênese (PN7-14). Os resultados mostraram que o tratamento com o U0126 foi efetivo, pois foi observado inibição significativa da fosforilação de ERK 1, avaliada no hipocampo em PN7 e 6 h após a administração do inibidor. Adicionalmente, demonstraram que o tratamento com U0126 em PN7-14, quando comparado ao controle (DMSO 1%), tem consequências relevantes na vida adulta dos animais que incluem: (i) modificações na estrutura sináptica no hipocampo em PN30, com diminuição do diâmetro da densidade pós-sináptica e no número de vesículas no terminal pré-sináptico; (ii) danos permanentes na memória de curta duração; (iii) diminuição na proliferação celular analisado pela quantidade de células positivas para Ki-67 no giro denteado do hipocampo; e (iv) aumento na expressão de GFAP no hipocampo dos ratos quando comparado ao grupo controle (DMSO 1%). Em conjunto os resultados mostram a existência de um perfil específico de atividade das MAPKs durante o desenvolvimento pós-natal de ratos e sugerem que alteração da atividade dessas enzimas, por fatores ambientais diversos, podem acarretar alterações funcionais e estruturais permanentes do SNC.<br><br>Abstract : The mitogen-activated protein kinases (MAPK) represent a family of serine/threonine kinases activated by phosphorylation in response to extracellular signals that includes ERK 1/2, JNK p54/p46 and p38MAPK. In the central nervous system (CNS), these enzymes mediate events associated with development and neuroplasticity. The early postnatal development is characterized by significant changes in brain structure, and intracellular signaling. In the hippocampus of rodents MAPKs have been identified as key proteins in the modulation of neural development and synaptic plasticity. Despite these evidences, studies characterizing the postnatal ontogeny of MAPKs in specific structures in the early periods of postnatal development in rodents are scarce. Thus, understanding the pattern of MAPK activation during brain development is critical, since minor changes in the activity of these proteins in specific developmental windows can result in later functional disorders. Accordingly, our study initially determined the profile of phosphorylation and total content of MAPKs in the hippocampus of male Wistar rats during the postnatal period (PN) 1-60. In order to target this aim MAPKs were evaluated by western blotting at ages: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 and PN60. The results were expressed as percentage related to PN1 and demonstrated: (1) significant increment in phosphorylation of p38MAPK displayed in two peaks one PN4 and a second at PN10-60; (2) age dependent increase in the phosphorylation of ERK1 (PN4) and ERK2 (PN14); (3) change in the total content JNKp54 with similar profile to that of p38MAPK activation; (4) no variation in the content of JNKp46 nether in the rate of phosphorylation of JNK p54/p46 in the ages analyzed. In a second stage we determined the role of ERK 1/2 activity during development regarding changes in synaptic structure, behavioral and cellular proliferation in the adult life. For this, rats were treated in the developmental period PN7-14 with the MEK/ERK inhibitor U0126 (5 mg/kg; ip). The results showed that the treatment with U0126 was effective, since it was detected a significant inhibition of ERK 1 phosphorylation, evaluated at PN7 and 6 h after the administration of the inhibitor. Moreover, the results demonstrated that the treatment with U0126 at PN7-14, as compared to the control (DMSO 1%), bring consequences for adulthood that include: (i) changes in hippocampal synaptic structure at PN30, decreasing the diameter of postsynaptic density and the number of vesicles in the presynaptic terminal; (ii) permanent damage in short term memory; (iii) a decrease in cell proliferation assessed by the number of cells positive for Ki-67 in the dentate gyrus of the hippocampus); and (iv) increased expression of GFAP in the hippocampus of rats compared with the control group (1% DMSO). Taken together the results show a specific profile of MAPKs activity during the postnatal development of rats and suggest that alteration of the activity of these enzymes by environmental factors may cause permanent functional changes in the CNS.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2014.<br>Made available in DSpace on 2014-08-06T18:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326168.pdf: 2572167 bytes, checksum: 6637a7157532db924e4cd5aac6ec5978 (MD5) Previous issue date: 2014<br>A epileptogênese é um processo que envolve a sinalização celular e a neuroplasticidade. As proteínas cinases ativadas por mitógenos, MAPKs (subfamílias ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK), a fosfatidil-inositol 3-cinase (PI3K)/Akt (PKB ou Akt) e a glicogênio sintase cinase-3? (GSK-3?) regulam uma variedade de eventos intracelulares envolvidos na diferenciação, sobrevivência e morte celular e na plasticidade sináptica. Nós quantificamos através de western blotting, os níveis de MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK), Akt e GSK-3? totais e fosforiladas no neocórtex e no hipocampo de camundongos Swiss machos, 48 h após a última injeção do modelo de kindling por pentilenotetrazol (PTZ, 35 mg/kg, i.p., em dias alternados, total de 8 injeções). Os níveis totais das proteínas cinases nas estruturas estudadas não foram afetados pelo kindling por PTZ. Os níveis de MAPKs fosforiladas permaneceram inalterados nos animais que não apresentaram crises convulsivas. Os níveis de JNK2 fosforilada, mas não de JNK1 fosforilada, aumentaram no hipocampo dos animais que apresentaram poucos dias com crise convulsiva (1 a 3 dias), e permaneceram semelhantes aos controles nos animais que apresentaram mais de três dias com crise convulsiva. Os níveis de ERK1/2 fosforiladas diminuíram no neocórtex e aumentaram no hipocampo de animais com 1 a 4 dias com crise convulsiva, e permaneceram inalterados nos animais que tiveram mais de 4 dias com crise convulsiva. Já a GSK-3? teve os seus níveis de fosforilação aumentados no neocórtex, mas não no hipocampo, nos animais que tiveram de 0 a 3 dias com crise convulsiva, caindo drasticamente para níveis inferiores ao controle nos animais que apresentaram 4 ou mais dias com crise convulsiva. Uma regressão linear múltipla mostrou que 85% da variação na progressão do kindling por PTZ foi explicada pela latência para a ocorrência da crise no primeiro e no último dia de estimulação e pelos níveis de GSK-3? fosforilada no neocórtex. A análise também mostrou que 87% da variação na latência para a ocorrência da última crise convulsiva é explicada pela latência para a ocorrência da primeira crise convulsiva, progressão do kindling, níveis de GSK-3? fosforilada no neocórtex e de Akt fosforilada no hipocampo. Utilizando apenas os animais que evoluíram para o kindling evidenciou-se que os níveis de ERK1 fosforilada, JNK2 fosforilada, JNK1 total e JNK1 fosforilada no hipocampo estiveram independentemente associados negativa ou positivamente ao número de dias com crise convulsiva. No mesmo grupo de animais, apenas o nível de p38MAPK fosforilada no neocórtex esteve associado, positivamente, à latência para a ocorrência da crise convulsiva na última estimulação com PTZ. Os resultados do presente estudo sugerem uma dissociação entre os níveis cerebrais regionais de MAPKs, GSK-3? e Akt associados à epileptogênese (progressão do kindling) e ao limiar (latência) para a ocorrência da crise convulsiva em animais sensibilizados pelo PTZ. Esta dissociação pode contribuir para o entendimento da ausência de efeito anti-epileptogênico clinicamente relevante dos fármacos utilizados para o controle das crises epilépticas.<br><br>Abstract : Epileptogenesis is a process that involves neuroplasticity and cellular signaling. The mitogen-activated protein kinases, MAPKs (subfamilies ERK1/2, JNK1/2, and p38MAPK), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt (PKB or Akt) and glycogen synthase kinase-3? (GSK-3?) regulate a variety of intracellular events involved in the cell differentiation, survival and death and synaptic plasticity. Herein we quantified by Western blotting the phosphorylation and total levels of MAPKs (ERK1/2, JNK1/2, and p38MAPK), Akt and GSK-3? in the neocortex and hippocampus from male Swiss mice, 48 hours after the last injection of the kindling pentylenetetrazol procedure (PTZ, 35 mg/kg, i.p., on alternate days, in a total of 8 injections). The total levels of such protein kinases in the investigated structures were not altered by PTZ kindling. The total levels of MAPKs were unchanged in animals that did not develop convulsive seizures. The levels of JNK2 phosphorylation, but not JNK1 phosphorylation, increased in the hippocampus of animals with fewer days with convulsive seizures (1-3 days), and remained similar to controls in animals that had more than three days with convulsive seizures. The levels of ERK1/2 phosphorylation decreased in the neocortex and increased in the hippocampus of animals with 1 to 4 days with convulsive seizures and remained unchanged in animals that had more than 4 days with convulsive seizures. The phosphorylation levels of GSK-3? was increased in the neocortex, but not in the hippocampus, in animals with 0-3 days with convulsive seizures, and reduced drastically in animals with 4 or more days with convulsive seizures. A multiple linear regression analysis showed that 85% of the kindling progression variance is explained by the latencies for the first and the last days with convulsive seizures and the neocortical levels of GSK-3? phosphorylation. This analysis also showed that 87% of the variance in the latency for the last day with convulsive seizure is explained by the latency for the first days with convulsive seizure, kindling progression, neocortical GSK-3? phosphorylation and hippocampal Akt phosphorylation. Analyzing only the animals that developed kindling, we showed that the levels of total ERK1, total JNK1, ERK1 phosphorylation and JNK1 phosphorylation in the hippocampus were independently associated with the number of days with convulsive seizures. In the same group of animals, only the level of p38MAPK phosphorylation in the neocortex was positvely or negatively associated with the latency to the occurrence of convulsive seizure in the last stimulation day with PTZ. These findings suggest dissociation between the MAPKs, GSK-3? and Akt regional brain levels and the seizure threshold and kindling progression in mice. These results may contribute to explain the absence of clinically relevant anti-epileptogenic effects of drugs currently used to treat seizures.

A Doença de Alzheimer (DA) é um transtorno progressivo que acomete o Sistema Nervoso Central, causando demência em idosos. A doença leva a uma diminuição da memória, dificuldade no raciocínio e pensamento e alterações comportamentais. A fisiopatologia da doença corresponde ao aumento na concentração do peptídeo -amilóide com consequente deposição e formação da placa amiloide; e também ao aparecimento dos emaranhados neurofibrilares, que são agregados de proteína tau hiperfosforilada. A enzima glicogênio sintase cinase 3 beta (GSK-3) está diretamente envolvida nos dois processos e, por isso, a busca por novos inibidores dessa enzima é uma importante estratégia terapêutica para o tratamento da doença. Neste trabalho utilizou-se a triagem virtual em 7 bancos de dados de moléculas aplicando cinco diferentes estratégias in silico, através de planejamento de fármacos baseado em ligantes e baseado em estrutura, combinada com estudos in silico de farmacocinética, toxicidade e atividade biológica, seguido de posteriores ensaios de inibição enzimática in vitro. Obteve-se três compostos pela metodologia de farmacóforo, (Estratégia 3) dos quais dois deles demonstraram atividade inibitória interessante para GSK-3, na faixa de micromolar. A partir das outras quatro estratégias foram selecionados 16 compostos que futuramente serão também testados utilizando o mesmo protocolo de ensaio in vitro aqui utilizado.<br>Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive disorder that affects the Central Nervous System, causing dementia in the elderly. The disease leads to decreased memory, difficulty in reasoning and thinking, and behavioral changes. The pathophysiology of the disease corresponds to the increase in -amyloid peptide concentration with consequent deposition and formation of the amyloid plaque and to the appearance of neurofibrillary tangles, which are aggregates of hyperphosphorylated tau protein. The enzyme glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3) is directly involved in both processes and, therefore, the search for new inhibitors of this enzyme is an important therapeutic strategy for the treatment of the disease. In this work, we used virtual screening in 7 molecule databases applying five different in silico strategies, using the ligand-based and structure-based drug design methodologies, combined with in silico studies of pharmacokinetics, toxicity and biological activity, followed by subsequent assays enzymatic inhibition in vitro. We obtained three compounds by the pharmacophore methodology (Strategy 3) of which two of them demonstrated interesting inhibitory activity for GSK-3 in the micromolar range. From the other four strategies, 16 compounds were selected which in future will also be tested using the same in vitro assay protocol used here.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010<br>Made available in DSpace on 2012-10-25T11:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276693.pdf: 1653605 bytes, checksum: 92e108206ef61f401325ee0b2476c79f (MD5)<br>Tendo em mente que a 1,25D3, produto final do metabolismo da vitamina D3 é essencial para a integridade do sistema reprodutor masculino, e que, a homeostase do Ca+2 desempenha papel chave em muitos processos envolvidos na espermatogênese, avaliamos o efeito em nível membranar da 1,25D3 sobre o metabolismo do Ca+2 em testículo inteiro e célula de Sertoli de ratos imaturos. Foi demonstrado que em após 60 minutos de pré-incubação com o hormônio, não hove variação da captação basal de 45Ca+2 nos tempos de incubação de 30, 60, 150, 300 e 600 segundos. No tempo de incubação de 60 segundos, foi verificado que a 1,25D3 tem a capacidade de aumentar a captação de 45Ca+2 do meio extracelular em diferentes doses em ambos modelos experimentais, sendo este evento independente da ação genômica. Em testículos, observou-se que doses entre 10-15M e 10-9M foram eficazes em aumentar a captação de 45Ca+2, sendo o maior efeito evidenciado da dose de 10-10M (106%). Utilizando esta dose, foi demonstrado que os canais de CCDV do tipo L e T são as principais vias de entrada do íon nas células testiculares, e que há necessidade da manutenção das correntes de K+ e Cl- para que ocorra este evento. Em células de Sertoli também não foi verificada a variação da captação basal de 45Ca+2. Neste sistema, foi verificado que no tempo de 60 segundos de incubação, o hormônio foi capaz de elevar a captação de 45Ca+2 entre as doses de 10-12M e 10-8 M, onde a dose de 10-12 M aumentou em torno de140% a capatação do íon. Já a dose de 10-10 M elevou em 89% o influxo do íon. Desta forma, utilizando a dose de 10-10 M, verificamos que as células de Sertoli comportam- se assim como os testículos: há necessitadade da ativação dos CCDV-L e T para a entrada do Ca+2 assim como das correntes de K+ e Cl-. Também foi verificado que em células de Sertoli há necessidade da ativação das proteínas PKC e p38MAPK para a capatação de Ca+2 estimulada pela 1,25D3. Alé, disso, as proteínas PI3K e ERK1/2 também estão em parte envolvidas neste processo. Por fim, avaliamos que a integridade dos microtúbulos e a atividade dos canais ClC3 faz-se necessária para que ocorra a entrada do íon nas células de Sertoli, sendo esta elevação do íon necessária para que ocorra o processo de secreção celular já demosntrada anteriormente pela 1,25D3.