Dissertations / Theses: 'Proteínas cinases'

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Queiroz, Claudio Marcos Teixeira de [UNIFESP]. "Contribuição das proteínas tirosina cinases e cálcio-calmodulina cinase tipo II em modelos animais de epilepsia." Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2005. http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/20515.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) As epilepsias do lobo temporal são as que apresentam maior refratariedade ao tratamento farmacológico e perfazem 2/3 das intervenções cirúrgicas de epilepsia, sendo portanto de grande custo social, econômico e psicológico. Assim, modelos animais de epilepsia do lobo temporal são de grande relevância não só para o entendimento das bases neurais dessa patologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas capazes de evitar a instalação da doença. Esses são os objetivos da presente dissertação de doutorado. Após um evento traumático (no caso deste trabalho, um estado de mal epiléptico), diversas alterações morfológicas e fisiológicas acontecem, caracterizando a gênese da síndrome epiléptico (epileptogênese). Dentre as alterações podemos destacar a intensa fosforilação de proteínas em resíduos de tirosina e a ativação de diferentes segundos mensageiros. Os dois primeiros capítulos desta tese descrevem a tentativa de bloquear os processos de epileptogênese por meio da inibição da fosforilação de resíduos de tirosma através do tratamento farmacológico com inibidores das tirosina cinases, a herbimicina A e o K-252a. O terceiro capítulo analisa eletrofisiologicamente o circuito neural do giro denteado em animais que apresentavam uma mutação em um sítio inibitório da proteína cálcio/calmodulina cinase do tipo II (CaMK1I). No primeiro capítulo, mostramos que o tratamento agudo com herbimicina A (348M, 5L, icv), é capaz de bloquear a potenciação duradoura (LTP) induzida por um estímulo tetânico bem como de atenuar (~40 por cento) a ativação neuronal (expressão de c-Fos) decorrente de um estado de mal epiléptico induzido pela administração sistêmica de pilocarpina (SE). Apesar dos significativos efeitos agudos, este tratamento mostrou-se incapaz de atenuar a freqüência de crises espontâneas, bem como o padrão de morte neuronal observado após o estado de mal epiléptico induzido pela pilocarpina. Entretanto, o tratamento com herbimicina A alterou o padrão de marcação de metais pesados (Zn+2) no hilo do giro denteado e na região de CA, do hipocampo, porém não apresentou efeito sobre o padrão de brotamento das fibras musgosas observado na camada molecular do giro denteado. No segundo capítulo, mostramos que a herbimicina e o K252a modificam a atividade epileptiforme induzida pela administração intra-hipocampal de ácido caínico, sem alterar o padrão de morte neuronal. Esses resultados sugerem que o tratamento com inibidores de proteínas tirosina cinases é capaz de modificar o padrão de ativação agudo do hipocampo após um estímulo (ie., o estado de mal epiléptico ou a LTP), porém sem qualquer efeito sobre o processo de epileptogênese. No terceiro capítulo, estudamos a excitabilidade e a plasticidade do giro denteado à estimulação da via perfurante (principal aferência da formação hipocampal) em animais que apresentam uma CaMKII geneticamente modificada. Essa proteína uma vez ativada não pode ser inibida. A caracterização eletrofisiológica demonstrou que esses animais apresentam potenciais de campo evocados no giro denteado aparentemente semelhante aos animais controle (wild-type), porém sua responsividade a padrões de estimulação em salvas e sua plasticidade apresentaram clara alteração. Essa modificação foi caracterizada por uma maior variabilidade nas respostas à trens de estimulação (freqüências de 1 e 2 Hz) e maior inibição do pulso pareado em trens de estimulação (para pulsos pareados aplicados a freqüência de 5 Hz). Além disso, conforme já descrito na literatura, mostramos que a susceptibilidade a atividade epileptiforme depende do padrão de estimulação utilizado para os diferentes animais (mutantes vs. wild-type). Assim, utilizando o modelo clássico do abrasamento demonstramos que a mutação não altera a evolução da epileptogênese. Entretanto, ao utilizarmos duas variantes de um padrão de estimulação similar à freqüência teta (5Hz, Intermittent vs. Continuous theta-burst stimulations), demonstramos a importância da mutação na manutenção da excitabilidade do giro denteado. Esses resultados destacam a importância da CaMKII na atividade epileptiforme além de sugerir novas abordagens experimentais (ie., sensibilidade à padrões de estimulação eletrofisiológica) no estudo da epiloptogênese. Em resumo, os resultados apresentados nessa tese contribuem para um melhor entendimento dos fenômenos subjacentes aos processos de plasticidade neuronal e da contribuição destes para o fenômeno de epiloptogênese, além de sugerir abordagens promissoras de intervenção e estratégias farmacológicas de relevância clínica. Temporal lobe epilepsies are highly refractory to pharmacological treatment. Up to 70% of these patients undergo chirurgical resection of temporal region, procedure with important consequences for the social, economic and psychological spheres. Experimental animal models that mimic temporal lobe epilepsy provide an insightful approach to study the neural basis of epilepsy as well as create opportunities to test promising therapeutic drugs. The present thesis tests the antiepileptogenic activity of two protein tyrosine kinase inhibitors and the relevance of Ca+2/calmodulin kinase type II (CaMKII) mutants. Multiples morphological and physiological alterations take place after a traumatic brain injury (in this thesis, the status epilepticus) leading the animal to an epileptic conditions. During this period, the epileptogenesis process, there is strong tyrsine phosphorylation with the activation of many second messengers. The first two chapters of the thesis describe experiments in which herbimycin A and K-252a, two protein tyrosine kinase inhibitors, were used to attenuate synaptic plasticity and epileptogenesis. The third chapter, the dentate gyrus network was studied after angular bundle stimulation in animals presenting one punctual mutation at the autoinhibitory phosphorylation site of the CaMKII. In the first chapter, we showed that one single herbimycin A injection (348μM, 5μL, icv) was able to attenuate long-term potentiation (LTP) in the commissural CA3 neurons and also, to decrease status epilepticus- (SE-) induced neuronal activation (c-Fos expression) in almost 40%.Although markedly acute effects, the present herbimycin A treatment was not able to diminish spontaneous seizure frequency, cell death or aberrant mossy fiber sprouting observed after the pilocarpine-induced SE. Curiously, herbimycin-treated animals presented decreased neo-Timm staining in the hilus and CA3 region despite the epileptic condition. In the second chapter, we confirmed the ability of protein tyrosine kinase inhibitors to decrease SE-induced neuronal activation. Herbimycin A icv treatment altered the kainic acid-induced epileptiform profile in EEG recordings. Cell death pattern was not altered by any pharmacological treatment. These results suggest that protein tyrosine kinase inhibitiors are able to modify the acute neuronal activation and plasticity (ictogenesis or LTP) but is ineffective in attenuating the epileptogenesis process.In the third chapter, we studied the dentate gyrus excitability and plasticity after angular bundle stimulation in CaMKII mutant animals. Once in its self-sustained mode, this mutation does not allow the reduction of the catalytic activity of the kinase. These animals present normal electrophysiological profiles (similar to wild-type animals) but with reduced amplitude. Shortterm plasticity was clearly altered. Mutant animals presented increased variability in the responses to trains of stimulation at 1 and 2 Hz, and at at 5Hz stronger paired-pulse inhibition. Accordingly to the literature, we also showed that the epileptiform susceptibility depends on the stimulation pattern used in both animals (mutants vs. wild-type). Thus, although the mutation did not altered the behavior and the electrographic kindling evolution, we showed that mutant animals were prone to afterdischarges when stimulate by an intermittent theta-burst stimulation. On the other hand, the same animals needed more bursts to induce afterdischarges when the stimulation was set in the continuos mode.Taken together, the present results contribute to a better understanding of the protein tyrosine kinase and CaMKII function in neuronal plasticity underlying the epileptogenesis process and sum efforts in searching for a clinic antiepileptogenic drug. FAPESP: 00/10826-3 BV UNIFESP: Teses e dissertações

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Meirelles, Gabriela Vaz. "Estudos estruturais e funcionais das proteínas cinases humanas Nek1 e Nek6." [s.n.], 2011. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314351.

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Abstract:

Orientador: Jorg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Made available in DSpace on 2018-08-18T17:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Meirelles_GabrielaVaz_D.pdf: 11269390 bytes, checksum: bfd22a079ffc68a78b96b3e50dd60b1c (MD5) Previous issue date: 2011 Resumo: A proteína NIMA foi identificada e caracterizada funcionalmente em Aspergillus nidulans como sendo uma serina/treonina cinase critica para a progressão do ciclo celular. As Neks (NIMA-related kinases) constituem uma família de cinases composta por 11 membros em mamíferos, que compartilham 40-45% de identidade com a proteína NIMA no domínio catalítico N-terminal. As Neks estão associadas a funções do ciclo celular e diversas patologias, o que as torna potenciais alvos quimioterápicos. Mutações no gene da Nek1 levam ao desenvolvimento da doença renal policistica e ao aparecimento de diversos efeitos pleiotrópicos, sugerindo sua participação em vias reguladoras de vários processos celulares. A Nek6, por sua vez, e ativada durante a mitose, e a super-expressão de mutantes inativos ou a sua depleção por RNAi produz células exibindo defeitos no fuso, anormalidades nucleares, parada na metáfase e apoptose. A Nek6 humana foi recentemente associada a carcinogênese, mas, assim como para a maioria das Neks, sua estrutura molecular, parceiros de interação e vias de sinalização permanecem ainda desconhecidos. Nesse trabalho, introduzimos a hNek6 como uma hub no interactoma humano. Uma extensa comparação de bancos de dados baseada em analises de conectividade mostrou que o quinoma humano e enriquecido em hubs. Nossas redes de interação incluem um amplo espectro de novos parceiros de interação para a hNek6 identificados em screenings de duplo - hibrido em levedura, classificados em 18 categorias funcionais. Alguns novos parceiros de interação da hNek6 são também possíveis substratos e, ainda, colocalizam com a hNek6 e ?-tubulina em células humanas, apontando para uma possível interação centrossomal. Os diversos parceiros de interação conectam a hNek6 a novas vias, como a sinalização de Notch e a regulação do citoesqueleto de actina, ou fornecem novas pistas de como a hNek6 poderia regular vias previamente propostas, como ciclo celular, reparo de DNA e sinalização do NF-?B. Alem disso, obtivemos o primeiro modelo estrutural de baixa resolução para a hNek6 a partir de SAXS. Analises estruturais revelaram que a hNek6 e um monômero em solução, apresentando uma conformação predominantemente globular, mas levemente alongada. Particularmente, a curta região N-terminal desordenada da hNek6 e importante para mediar as interações com seus parceiros. No caso da hNek1, observamos que ela interage com Fez1 e Clasp2 através de seus motivos coiled-coil, e colocaliza com essas proteínas em uma região candidata ao centrossomo Abstract: NIMA was identified and functionally characterized in Aspergillus nidulans as a critical Ser/Thr kinase for cell cycle progression. The mammalian Neks (NIMA-related kinases) represent an evolutionarily conserved family of 11 serine/threonine kinases that share 40-45% identity with NIMA N-terminal domain. Neks are associated to cell cyclerelated functions and diverse pathologies, which highlight them as potential chemotherapeutic targets. Nek1 gene mutations lead to the development of polycystic kidney disease and the emergence of several pleiotropic effects, suggesting its involvement in pathways regulating various cellular processes. Nek6, in turn, is activated during mitosis, and overexpression of inactive mutants or its depletion by iRNA produces cells exhibiting mitotic spindle defects, nuclear abnormalities, metaphase arrest and apoptosis. Human Nek6 was recently found to be linked to carcinogenesis, but as for the majority of Neks, the molecular structure, interacting partners and signaling pathways remain elusive. Here we introduce hNek6 as a hub kinase in the human interactome. We performed a broad databank comparison based on degree distribution analysis and found that the human kinome is enriched in hubs. Our networks include a large set of novel hNek6 interactors identified in our yeast two-hybrid screens, classified into 18 functional categories. Some novel interactors are also putative substrates and colocalized with hNek6 and ?-tubulin in human cells, pointing to a possible centrosomal interaction. The interacting proteins link hNek6 to novel pathways, e.g. Notch signaling and actin cytoskeleton regulation, or give new insights on how hNek6 may regulate previously proposed pathways such as cell cycle, DNA repair and NF-?B signalings. Furthermore, we obtained the first low-resolution structural model of hNek6 by SAXS. Structural analysis revealed that hNek6 is a monomer in solution with a mostly globular, though slightly elongated conformation. Notably, we found that hNek6 unfolded short N-terminal region is important to mediate the interactions with its partners. In the case of hNek1, we found that it interacts with Fez1 and Clasp2 through coiled-coil motifs and colocalizes with these proteins in a candidate centrosomal region Doutorado Bioquimica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

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Oliveira, Sara Cristina da Costa. "Farmacocinética dos inibidores das proteínas tirosina-cinases e sua modulação terapêutica." Master's thesis, [s.n.], 2014. http://hdl.handle.net/10284/4419.

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Abstract:

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas A desregulação da actividade das proteínas tirosina-cinases está na base do desenvolvimento de algumas doenças oncológicas. O exemplo melhor documentado é o da actividade desregulada da tirosina-cinase BCR-ABL (Breakpoint Cluster Region-Abelson Leukaemia) originada da translocação cromossómica t(9;22), a qual é responsável pela apresentação fenotípica da leucemia mielóide crónica (LMC) (Martinelli et al., 2005). O conhecimento deste fenómeno celular desencadeou o desenvolvimento de fármacos direccionados especificamente para este tipo de oncogenes. O primeiro fármaco inibidor da actividade da oncoproteína BCR-ABL a ser utilizado na prática clínica foi o mesilato de imatinib, introduzido em Maio de 2001, para o tratamento da LMC, o qual continua a ser a primeira de linha de tratamento de todos os pacientes recém-diagnosticados de LMC (Duckett and Cameron, 2010). Com o aparecimento de casos de resistência e intolerância ao mesilato de imatinib, foram desenvolvidos, testados e aprovados novos fármacos. Outros fármacos foram desenvolvidos para inibir famílias de cinases responsáveis por outras neoplasias. Tratam-se de fármacos recentes na prática clínica, sendo fundamental acelerar o conhecimento aprofundado da sua farmacocinética. Pela compreensão adequada do perfil farmacocinético dos TKIs (inibidores das proteínas tirosina-cinases), os factores influenciadores da exposição a estes fármacos poderão ser reconhecidos, permitindo impedir a sua sub e sobrexposição terapêutica (van Erp et al., 2009). De uma forma resumida, os TKIs apresentam as seguintes características gerais: actuam especificamente em várias famílias proteicas tirosina-cinases mutadas e/ou sobrexpressas nos tecidos cancerígenos, alcançam os seus níveis plasmáticos relativamente rápido, apresentam distribuição extensa, estabelecem forte ligação proteica, são metabolizados primariamente pela CYP3A4 (citocromo P3A4) e são predominantemente excretados nas fezes. Utilizam transporte mediado por transportadores membranares específicos, tanto durante o processo de absorção, como para alcançar o interior celular, variando na sua intensidade e no tipo de transportadores de acordo com a natureza físico-química do TKI. Alguns deles inibem as enzimas responsáveis pela sua própria metabolização e os transportadores membranares responsáveis pela sua própria permeabilidade intracelular e extracelular. Algumas interacções entre fármacos estão bem estudadas e fundamentadas, sendo a maior parte delas comum a todos os TKIs (van Erp et al., 2009). Uncontrolled activity of tyrosine kinases proteins leads to development of some oncological diseases. The best documented example is the uncontrolled tyrosine kinase activity BCR-ABL (breakpoint cluster Region-Abelson Leukaemia) from the chromosomal translocation t(9; 22), which is responsible for the chronic myeloid leukemia (CML) phenotypic presentation (Martinelli et al., 2005). The knowledge of this cellular phenomenon triggered the development of drugs targeted specifically for this type of oncogenes. The first drug inhibiting the activity of BCR-ABL oncoprotein used in clinical practice, imatinib mesylate, was introduced in May 2001 for the treatment of CML, which remains the first-line treatment of all patients newly diagnosed CML (Duckett and Cameron, 2010). With the emergence of cases of resistance or intolerance to imatinib mesylate, it has been developed, tested and approved new drugs. Other drugs have been developed to inhibit families of kinases responsible for other cancers. These are newer drugs in clinical practice and it is central accelerate thorough knowledge of its pharmacokinetics. For proper understanding of the pharmacokinetic profile of TKIs (inhibitors of tyrosine protein kinases), the factors influencing exposure to these drugs may be recognized, allowing prevent their sub-therapeutic and overexposure (van Erp et al., 2009). Summarizing, TKIs have the following general characteristics: they act specifically in several protein families mutated tyrosine kinases in cancerous tissues, they reach their plasma levels relatively fast, they exhibit extensive distribution, they establish strong protein binding, they are metabolized primarily by CYP3A4 (cytochrome P3A4) and they are predominantly excreted in the feces. They are carried by specific membrane transport, both during the process of absorption as to reach the cell cytoplasm, ranging in intensity and type of the carriers according to the physico-chemical nature of the TKI. Some of them inhibit the enzymes responsible for their own metabolism and the membrane carriers responsible for their own intracellular and extracellular permeability. Some drug interactions are well researched and substantiated, and most of them are common to all TKIs (van Erp et al., 2009).

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Oliveira, Camila Salum de. "Estudo das proteínas cinases ativadas por mitógenos no desenvolvimento do sistema visual." Florianópolis, SC, 2008. http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/91848.

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Abstract:

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. Made available in DSpace on 2012-10-24T03:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249280.pdf: 4207210 bytes, checksum: aedd92f8df093be8262293fce757903e (MD5) O Sistema Visual representa um excelente modelo para o estudo dos processos plásticos e de desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (SNC). Muitos fatores têm sido implicados na maturação do sistema visual, mas as vias de sinalização intracelular envolvidas ainda não são bem conhecidas. De particular interesse são as proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs), uma família de serina/treonina cinases que possuem um importante papel na transdução de sinal da superfície celular para o núcleo. Estas enzimas são importantes mediadores intracelulares de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento e recentemente têm sido implicadas no controle da plasticidade sináptica. Nos mamíferos, os membros desta família são cinases reguladas por sinal extracelular ½ (ERK1/2), cinase c-Jun amino-terminal (JNK) e p38MAPK. No sistema visual, foi demonstrado que a via de ERK regula processos de plasticidade durante o desenvolvimento em níveis retino-talâmicos e retinocorticais e que p38MAPK controla uma forma peculiar de depressão de longo prazo no córtex visual. Neste trabalho, para entender melhor o papel de duas MAPKs # ERK1/2 e p38MAPK # na maturação do sistema visual, foi caracterizado por western blot a regulação da fosforilação/ativação dessas enzimas na retina, colículo superior e córtex visual de rato durante o desenvolvimento pós-natal, do nascimento (P0) à idade adulta (P45). Os resultados demonstram que (i) na retina, a ativação de p38MAPK tem um pico em P4, e entre P15 e P45, tanto a fosforilação de ERK1/2 quanto de p38MAPK aumentam; (ii) no colículo superior, a fosforilação das duas MAPKs aumenta entre P4 e P15; (iii) no córtex visual, a fosforilação de ERK1/2 aumenta de P15 a P45 enquanto a fosforilação de p38MAPK aumenta a partir de P4. Os dados apresentados demonstram uma regulação distinta da ativação de ERK1/2 e p38MAPK nas três áreas visuais analisadas, que ocorrem em correlação temporal com eventos críticos da maturação do sistema visual. Estes resultados sugerem um importante papel de ERK1/2 e p38MAPK no desenvolvimento pós-natal do sistema visual de ratos. Porém, mudanças duradouras na circuitaria neuronal requerem expressão gênica e síntese protéica. Portanto, o padrão de ativação de cinases precisa ser traduzido num padrão de expressão gênica, provavelmente através da ativação de fatores de transcrição. Uma via nuclear que pode ser crítica no controle da plasticidade neural do cérebro de mamíferos é a via de CREB. O envolvimento deste fator de transcrição na plasticidade cortical e no refinamento das projeções retino-talâmicas já foi demonstrado, mas não se sabe se CREB teria um papel na plasticidade retino-colicular. Neste trabalho, nós analisamos a expressão da forma ativada e total de CREB no colículo superior de rato durante o desenvolvimento. Os resultados mostram que tanto a forma total quanto a fosforilada de CREB aumentam entre P4 e P9, em coincidência com o aumento da ativação das MAPKs e com o período crítico da plasticidade colicular. Estes resultados demonstram que CREB também tem sua expressão altamente regulada durante um período de refinamento das conexões coliculares, podendo ter um papel também na maturação do colículo superior. The visual system represents an excellent model for studying developmental and plastic processes in the Central Nervous System (CNS). Many factors have been shown to participate in visual system maturation, but the intracellular signaling pathways involved are still relatively unknown. Of particular interest are Mitogen-activated protein kinases (MAPKs), a family of kinases implicated in various cellular functions. MAPKs are serine/threonine kinases that play an instrumental role in signal transduction from the cell surface to the nucleus. These enzymes are major intracellular mediators of developmental events and recently have been shown to control also synaptic plasticity processes. Mammalian members of this family are extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2), c-Jun amino-terminal kinases or stress-activated protein kinases (JNK/SAPKs) and p38MAPK. At the level of the visual system, it has been demonstrated that the ERK pathway regulates developmental plastic processes at both retino-thalamic and thalamo-cortical level and that p38MAPK controls a peculiar form of long-term depression in the visual cortex. Here, as a first approach to gain more insight on the role of two MAPKs - ERK1/2 and p38MAPK - in visual system maturation, we characterized by western blot the regulation of their phosphorylation/activation in rat retina, superior colliculus and visual cortex, during postnatal development from birth (P0) to adult age (P45). Our main results show that: (i) in the retina p38MAPK activation peaks at P4, and then, from P15 to P45, both ERK1/2 and p38MAPK phosphorylation increases; (ii) in the superior colliculus phosphorylation of both MAPKs increases between P4 and P15; (iii) in the visual cortex ERK1/2 phosphorylation increases from P15 to P45, while phosphorylation of p38MAPK increases starting from P4. The present data demonstrate a distinct regulation of the activation of ERK1/2 and p38MAPK in the three visual areas analyzed which occurs in temporal correlation with critical events for visual system maturation. These results suggest an important role for ERK1/2 and p38MAPK in the postnatal development of the rat visual system. Longlasting changes in neuronal circuitry require gene expression and protein synthesis. Thus, the pattern of kinase activation has to be translated into a pattern of gene expression, probably through the activation of transcription factors. A candidate nuclear pathway that might be critical in the developmental control of neural plasticity in the mammalian brain is the CREB transcriptional pathway. The involvement of this transcription factor in cortical plasticity and in the refinement of retino-geniculate projections has already been demonstrated, but the role of CREB in the retino-collicular plasticity remains unclear. Here, we analyze the expression of the activated and the total form of CREB in the rat superior colliculus during development. The results show that both phosphorylated and total form of CREB increase between P4 and P9, in coincidence with the increase of the MAPKs activation and the critical period for collicular plasticity. These results show that CREB is highly regulated during a period of refinement of collicular connections and could also be involved in the maturation of the superior colliculus.

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Fragoso, Cristina Margarida Gomes Grangeio. "Fosforilação da HsPI3-Kinase-C2? = Phosphorylation of HsPI3-Kinase-C2?" Master's thesis, Universidade de Aveiro, 2002. http://hdl.handle.net/10773/23128.

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Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados Várias isoformas da enzima fosfoinositide-3-cinase (PI3-Cinase), uma vasta família de cinases lipidicas têm nos últimos anos vindo a ser clonada e caracterizada. P13-Cinases constituem uma família de cinases conservadas durante a evolução que catalisam a adição de uma molécula de fosfato ao fosfatidilinositol e seus derivados, esta adição tem lugar no anel inositol na posição D3. P13-Cinases estão agrupadas em três classes de acordo com as moléculas que preferencialmente utilizam como substrato in vitro e de acordo com as suas características estruturais. Fosfoinositide-3-Cinase-C2a (PI3-Cinase-C2a), pertence à classe I1 de P13- Cinases, esta classe é caracterizada pela utilização de fosfatidilinositol e fosfatidilinositol-4-P como substrato in vitro. Todos os membros da classes I1 possuem no seu C-terminal um domínio C2, característico da classe. Este trabalho permitiu a identificação do local de fosforilação da HsPI3-Cinase- C2a bem como a identificação de duas cinases envolvidas na sua fosforilação. A fosforilação de HsP13-Kinase-C2a ocorre na Ser259 e este resíduo é um alvo comum de fosforilação mitótica e de fosforilação induzida por radiação UV. Durante o ciclo celular HsP13-Cinase-C2a é predominantemente fosforilada na M fase e a cinase envolvida 6 a Cdk1,após radiação UV a fosforilação é mediada pela JNK. In recent years, a large family of Phosphoinositide-3-Kinases (PI3-Kinase) isozymes has been characterized and cloned. PI3-Kinases constitute a family of evolutionary conserved lipid kinases that catalyse the addition of a phosphate molecule to the D3 position of the inositol ring of phosphatidylinositol and its derivatives. P13-Kinases are grouped into three classes according to the molecules that they preferentially utilize as substrates and their structural characteristics. Phosphoinositide-3-Kinase-C2a (P13-Kinase-C2a) belongs to class II P13- Kinases, which are defined by their in vitro use of phosphatidylinositol and phosphatidylinositol-4-phosphate as substrates. All type II P13-Kinases contain a C2 domain at their C-terminus. This work resulted in the identification of a phosphorylation site on HsP13- Kinase-C2a as well the identification of two kinases involved in mitotic and UVinduced phosphorylation of HsP13-Kinase-C2a. The phosphorylation of HsP13- Kinase-C2a occurs in Ser259 and this serine is a common target in mitotic and UV-induced phosphorylation. We found that during the cell cycle HsP13- Kinase-C2a is predominantly phosphorylated in mitotic phase and the kinase involved is Cdkl and after UV irradiation the phosphorylation of HsPI3-Kinase- C2a is mediated by JNK.

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Moraes, Eduardo Cruz 1986. "Seleção de compostos como candidatos para a inibição da atividade de proteínas cinases humanas da família das Neks." [s.n.], 2012. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314363.

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Orientador: Jörg Kobarg Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Made available in DSpace on 2018-08-21T00:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_EduardoCruz_M.pdf: 2623796 bytes, checksum: 858f8566bae7879895e451ce06ad3bfb (MD5) Previous issue date: 2012 Resumo: Cinases desempenham um papel importante na ativação de vias bioquímicas em células eucarióticas. Neks (NIMA related kinases) são uma família conservada de proteínas cinases relacionadas à progressão do ciclo celular e divisão celular, contendo em torno de 40% de identidade no domínio catalítico N-terminal com a proteína NIMA (Never in Mitosis, gene A) de Aspergillus nidulans. As cinases Neks são também descritas como relacionadas a patologias, particularmente câncer. Por estas características, as Neks são alvos potenciais para o tratamento de cânceres e desenvolvimento de drogas anti-câncer. Neste trabalho foram selecionados compostos em uma biblioteca de 87 compostos para os domínios de cinase mutados de hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 e hNek9 e o domínio de cinase selvagem de hNek7, através de um ensaio de deslocamento térmico. Neste ensaio, foi identificado pelo menos um composto com um deslocamento da Tm significativo para a hNek1 ('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC); outro, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) para a hNek6(S206A), e vários compostos para a hNek7wt e hNek2(_272-445)-(T175A). Destes compostos, B03 e F04 foram validados por docking no sítio de ligação de ATP da hNek7wt, enquanto B08 e E03 foram validados por reduzir a atividade da hNek7wt até 26,4% e 43,3%, respectivamente, na concentração de 312,5 nM. Além disso, o composto E04 foi capaz de reduzir a atividade da hNek6(S206A) pela metade com um IC50 próximo de 1,25 ?M. São necessários experimentos funcionais adicionais para validação desses dados, e estudos estruturais com resolução atômica serão importantes para caracterizar a associação de hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) e hNek7 selvagem com esses e outros compostos Abstract: Kinases play an important role in the activation of biochemical pathways in eukaryotic cells. Neks (NIMA related kinases) are a conserved kinase protein family related to cell cycle progression and cell division, containing about 40% identity in the N-terminal catalytic domain with the protein NIMA (Never in Mitosis, gene A) of Aspergillus nidulans. Nek kinases are also described as related to pathologies, particularly cancer. For these characteristics, Neks are potential targets for treatment of cancers and development of anti-cancer drugs. Here we screened the recombinant activation loop mutant kinase domains of hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 and hNek9 and wild-type hNek7 against 87 compounds using thermal shift denaturation and identified at least one compound with significant Tm shift for hNek1('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC), another one, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) for hNek6(S206A), but not for the other hNek6 variants, and several hit compounds for hNek7wt and hNek2('delta'272-445)-(T175A). From these, compounds B03 and F04 were validated by docking into the ATP-binding site of hNek7wt, while B08 and E03 were validated by reducing hNek7wt activity up to 26.4% and 43.3%, respectively, at a 312.5 nM concentration. We also found that mutant hNek6, without the activation loop conserved phosphorylation, is a better target for inhibitor stabilization than an activated more phosphorylated hNek6 kinase. Moreover, compound E04 was later confirmed to reduce hNek6(S206A) activity by half with IC50 near to 1.25 ?M. Further functional experiments in living cells are required to validate this findings, and structural studies with atomic resolution will be important to characterize the association of hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) and wild-type hNek7 with these and other compounds Mestrado Bioquimica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Costa, Ana Paula. "Perfil de ativação de proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) no sistema nervoso central de ratos e seu papel no desenvolvimento." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2015. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/169491.

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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. Made available in DSpace on 2016-10-19T13:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339614.pdf: 2590718 bytes, checksum: 1167194006e4630cfa0a4984aba90e64 (MD5) Previous issue date: 2015 As proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina/treonina cinases ativadas por fosforilação em resposta a sinais extracelulares que incluem ERK 1/2, JNK p54/p46 e p38MAPK. No sistema nervoso central (SNC) estas enzimas medeiam eventos associados ao desenvolvimento e neuroplasticidade. No período inicial do desenvolvimento pós-natal ocorrem alterações significativas na estrutura do cérebro e sinalização intracelular. No hipocampo de roedores as MAPKs têm sido apontadas como proteínas fundamentais na modulação do desenvolvimento neural e plasticidade sináptica. Apesar dessas evidências a ontogenia pós-natal das MAPKs em estruturas específicas, bem como o seu papel, em determinadas fases do desenvolvimento, para o estabelecimento de funções motoras e cognitivas no adulto tem sido pouco caracterizada. A compreensão do padrão de ativação das MAPKs durante o neurodesenvolvimento é essencial, uma vez que pequenas alterações na atividade dessas proteínas em janelas específicas do desenvolvimento podem implicar em alterações funcionais tardias. No presente estudo foi determinado, em uma primeira etapa, o perfil ontogenético da fosforilação e conteúdo total das MAPKs no hipocampo de ratos Wistar machos durante o período pós-natal (PN) 1-60. Para isso a fosforilação e o conteúdo total das MAPKs foram avaliados por western blotting nas idades: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 e PN60. Os resultados foram expressos como percentual relativo à PN1 e demonstraram: (1) aumento significativo na fosforilação de p38MAPK de forma bimodal em PN4 e PN10-60; (2) aumento na fosforilação de ERK1 (PN4) e ERK2 (PN14) dependente da idade; (3) variação do conteúdo total de JNKp54 com perfil similar ao da ativação de p38MAPK; 4) ausência de variação na taxa de fosforilação de JNK p54/p46 nas idades analisadas. Em uma segunda etapa foi determinado o papel da atividade de ERK 1/2 durante o desenvolvimento em relação às alterações comportamentais, da estrutura sináptica e na proliferação celular hipocampal na vida adulta do animal. Para isso, foi utilizado um protocolo de inibição de MEK/ERK com U0126 (5 mg/kg; i.p.) durante um período crítico de sinaptogênese (PN7-14). Os resultados mostraram que o tratamento com o U0126 foi efetivo, pois foi observado inibição significativa da fosforilação de ERK 1, avaliada no hipocampo em PN7 e 6 h após a administração do inibidor. Adicionalmente, demonstraram que o tratamento com U0126 em PN7-14, quando comparado ao controle (DMSO 1%), tem consequências relevantes na vida adulta dos animais que incluem: (i) modificações na estrutura sináptica no hipocampo em PN30, com diminuição do diâmetro da densidade pós-sináptica e no número de vesículas no terminal pré-sináptico; (ii) danos permanentes na memória de curta duração; (iii) diminuição na proliferação celular analisado pela quantidade de células positivas para Ki-67 no giro denteado do hipocampo; e (iv) aumento na expressão de GFAP no hipocampo dos ratos quando comparado ao grupo controle (DMSO 1%). Em conjunto os resultados mostram a existência de um perfil específico de atividade das MAPKs durante o desenvolvimento pós-natal de ratos e sugerem que alteração da atividade dessas enzimas, por fatores ambientais diversos, podem acarretar alterações funcionais e estruturais permanentes do SNC. Abstract : The mitogen-activated protein kinases (MAPK) represent a family of serine/threonine kinases activated by phosphorylation in response to extracellular signals that includes ERK 1/2, JNK p54/p46 and p38MAPK. In the central nervous system (CNS), these enzymes mediate events associated with development and neuroplasticity. The early postnatal development is characterized by significant changes in brain structure, and intracellular signaling. In the hippocampus of rodents MAPKs have been identified as key proteins in the modulation of neural development and synaptic plasticity. Despite these evidences, studies characterizing the postnatal ontogeny of MAPKs in specific structures in the early periods of postnatal development in rodents are scarce. Thus, understanding the pattern of MAPK activation during brain development is critical, since minor changes in the activity of these proteins in specific developmental windows can result in later functional disorders. Accordingly, our study initially determined the profile of phosphorylation and total content of MAPKs in the hippocampus of male Wistar rats during the postnatal period (PN) 1-60. In order to target this aim MAPKs were evaluated by western blotting at ages: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 and PN60. The results were expressed as percentage related to PN1 and demonstrated: (1) significant increment in phosphorylation of p38MAPK displayed in two peaks one PN4 and a second at PN10-60; (2) age dependent increase in the phosphorylation of ERK1 (PN4) and ERK2 (PN14); (3) change in the total content JNKp54 with similar profile to that of p38MAPK activation; (4) no variation in the content of JNKp46 nether in the rate of phosphorylation of JNK p54/p46 in the ages analyzed. In a second stage we determined the role of ERK 1/2 activity during development regarding changes in synaptic structure, behavioral and cellular proliferation in the adult life. For this, rats were treated in the developmental period PN7-14 with the MEK/ERK inhibitor U0126 (5 mg/kg; ip). The results showed that the treatment with U0126 was effective, since it was detected a significant inhibition of ERK 1 phosphorylation, evaluated at PN7 and 6 h after the administration of the inhibitor. Moreover, the results demonstrated that the treatment with U0126 at PN7-14, as compared to the control (DMSO 1%), bring consequences for adulthood that include: (i) changes in hippocampal synaptic structure at PN30, decreasing the diameter of postsynaptic density and the number of vesicles in the presynaptic terminal; (ii) permanent damage in short term memory; (iii) a decrease in cell proliferation assessed by the number of cells positive for Ki-67 in the dentate gyrus of the hippocampus); and (iv) increased expression of GFAP in the hippocampus of rats compared with the control group (1% DMSO). Taken together the results show a specific profile of MAPKs activity during the postnatal development of rats and suggest that alteration of the activity of these enzymes by environmental factors may cause permanent functional changes in the CNS.

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Ben, Juliana. "Investigação de alterações no nível e na ativação de proteínas cinases no neocórtex e no hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de kindling por pentilenotetrazol." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2014. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/123360.

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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2014. Made available in DSpace on 2014-08-06T18:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326168.pdf: 2572167 bytes, checksum: 6637a7157532db924e4cd5aac6ec5978 (MD5) Previous issue date: 2014 A epileptogênese é um processo que envolve a sinalização celular e a neuroplasticidade. As proteínas cinases ativadas por mitógenos, MAPKs (subfamílias ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK), a fosfatidil-inositol 3-cinase (PI3K)/Akt (PKB ou Akt) e a glicogênio sintase cinase-3? (GSK-3?) regulam uma variedade de eventos intracelulares envolvidos na diferenciação, sobrevivência e morte celular e na plasticidade sináptica. Nós quantificamos através de western blotting, os níveis de MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK), Akt e GSK-3? totais e fosforiladas no neocórtex e no hipocampo de camundongos Swiss machos, 48 h após a última injeção do modelo de kindling por pentilenotetrazol (PTZ, 35 mg/kg, i.p., em dias alternados, total de 8 injeções). Os níveis totais das proteínas cinases nas estruturas estudadas não foram afetados pelo kindling por PTZ. Os níveis de MAPKs fosforiladas permaneceram inalterados nos animais que não apresentaram crises convulsivas. Os níveis de JNK2 fosforilada, mas não de JNK1 fosforilada, aumentaram no hipocampo dos animais que apresentaram poucos dias com crise convulsiva (1 a 3 dias), e permaneceram semelhantes aos controles nos animais que apresentaram mais de três dias com crise convulsiva. Os níveis de ERK1/2 fosforiladas diminuíram no neocórtex e aumentaram no hipocampo de animais com 1 a 4 dias com crise convulsiva, e permaneceram inalterados nos animais que tiveram mais de 4 dias com crise convulsiva. Já a GSK-3? teve os seus níveis de fosforilação aumentados no neocórtex, mas não no hipocampo, nos animais que tiveram de 0 a 3 dias com crise convulsiva, caindo drasticamente para níveis inferiores ao controle nos animais que apresentaram 4 ou mais dias com crise convulsiva. Uma regressão linear múltipla mostrou que 85% da variação na progressão do kindling por PTZ foi explicada pela latência para a ocorrência da crise no primeiro e no último dia de estimulação e pelos níveis de GSK-3? fosforilada no neocórtex. A análise também mostrou que 87% da variação na latência para a ocorrência da última crise convulsiva é explicada pela latência para a ocorrência da primeira crise convulsiva, progressão do kindling, níveis de GSK-3? fosforilada no neocórtex e de Akt fosforilada no hipocampo. Utilizando apenas os animais que evoluíram para o kindling evidenciou-se que os níveis de ERK1 fosforilada, JNK2 fosforilada, JNK1 total e JNK1 fosforilada no hipocampo estiveram independentemente associados negativa ou positivamente ao número de dias com crise convulsiva. No mesmo grupo de animais, apenas o nível de p38MAPK fosforilada no neocórtex esteve associado, positivamente, à latência para a ocorrência da crise convulsiva na última estimulação com PTZ. Os resultados do presente estudo sugerem uma dissociação entre os níveis cerebrais regionais de MAPKs, GSK-3? e Akt associados à epileptogênese (progressão do kindling) e ao limiar (latência) para a ocorrência da crise convulsiva em animais sensibilizados pelo PTZ. Esta dissociação pode contribuir para o entendimento da ausência de efeito anti-epileptogênico clinicamente relevante dos fármacos utilizados para o controle das crises epilépticas. Abstract : Epileptogenesis is a process that involves neuroplasticity and cellular signaling. The mitogen-activated protein kinases, MAPKs (subfamilies ERK1/2, JNK1/2, and p38MAPK), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt (PKB or Akt) and glycogen synthase kinase-3? (GSK-3?) regulate a variety of intracellular events involved in the cell differentiation, survival and death and synaptic plasticity. Herein we quantified by Western blotting the phosphorylation and total levels of MAPKs (ERK1/2, JNK1/2, and p38MAPK), Akt and GSK-3? in the neocortex and hippocampus from male Swiss mice, 48 hours after the last injection of the kindling pentylenetetrazol procedure (PTZ, 35 mg/kg, i.p., on alternate days, in a total of 8 injections). The total levels of such protein kinases in the investigated structures were not altered by PTZ kindling. The total levels of MAPKs were unchanged in animals that did not develop convulsive seizures. The levels of JNK2 phosphorylation, but not JNK1 phosphorylation, increased in the hippocampus of animals with fewer days with convulsive seizures (1-3 days), and remained similar to controls in animals that had more than three days with convulsive seizures. The levels of ERK1/2 phosphorylation decreased in the neocortex and increased in the hippocampus of animals with 1 to 4 days with convulsive seizures and remained unchanged in animals that had more than 4 days with convulsive seizures. The phosphorylation levels of GSK-3? was increased in the neocortex, but not in the hippocampus, in animals with 0-3 days with convulsive seizures, and reduced drastically in animals with 4 or more days with convulsive seizures. A multiple linear regression analysis showed that 85% of the kindling progression variance is explained by the latencies for the first and the last days with convulsive seizures and the neocortical levels of GSK-3? phosphorylation. This analysis also showed that 87% of the variance in the latency for the last day with convulsive seizure is explained by the latency for the first days with convulsive seizure, kindling progression, neocortical GSK-3? phosphorylation and hippocampal Akt phosphorylation. Analyzing only the animals that developed kindling, we showed that the levels of total ERK1, total JNK1, ERK1 phosphorylation and JNK1 phosphorylation in the hippocampus were independently associated with the number of days with convulsive seizures. In the same group of animals, only the level of p38MAPK phosphorylation in the neocortex was positvely or negatively associated with the latency to the occurrence of convulsive seizure in the last stimulation day with PTZ. These findings suggest dissociation between the MAPKs, GSK-3? and Akt regional brain levels and the seizure threshold and kindling progression in mice. These results may contribute to explain the absence of clinically relevant anti-epileptogenic effects of drugs currently used to treat seizures.

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Poiani, João Gabriel Curtolo. "Planejamento racional de candidatos a fármacos inibidores de glicogênio sintase cinase - 3 beta (GSK-3B) em doença de Alzheimer." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-25092017-151256/.

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A Doença de Alzheimer (DA) é um transtorno progressivo que acomete o Sistema Nervoso Central, causando demência em idosos. A doença leva a uma diminuição da memória, dificuldade no raciocínio e pensamento e alterações comportamentais. A fisiopatologia da doença corresponde ao aumento na concentração do peptídeo -amilóide com consequente deposição e formação da placa amiloide; e também ao aparecimento dos emaranhados neurofibrilares, que são agregados de proteína tau hiperfosforilada. A enzima glicogênio sintase cinase 3 beta (GSK-3) está diretamente envolvida nos dois processos e, por isso, a busca por novos inibidores dessa enzima é uma importante estratégia terapêutica para o tratamento da doença. Neste trabalho utilizou-se a triagem virtual em 7 bancos de dados de moléculas aplicando cinco diferentes estratégias in silico, através de planejamento de fármacos baseado em ligantes e baseado em estrutura, combinada com estudos in silico de farmacocinética, toxicidade e atividade biológica, seguido de posteriores ensaios de inibição enzimática in vitro. Obteve-se três compostos pela metodologia de farmacóforo, (Estratégia 3) dos quais dois deles demonstraram atividade inibitória interessante para GSK-3, na faixa de micromolar. A partir das outras quatro estratégias foram selecionados 16 compostos que futuramente serão também testados utilizando o mesmo protocolo de ensaio in vitro aqui utilizado. Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive disorder that affects the Central Nervous System, causing dementia in the elderly. The disease leads to decreased memory, difficulty in reasoning and thinking, and behavioral changes. The pathophysiology of the disease corresponds to the increase in -amyloid peptide concentration with consequent deposition and formation of the amyloid plaque and to the appearance of neurofibrillary tangles, which are aggregates of hyperphosphorylated tau protein. The enzyme glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3) is directly involved in both processes and, therefore, the search for new inhibitors of this enzyme is an important therapeutic strategy for the treatment of the disease. In this work, we used virtual screening in 7 molecule databases applying five different in silico strategies, using the ligand-based and structure-based drug design methodologies, combined with in silico studies of pharmacokinetics, toxicity and biological activity, followed by subsequent assays enzymatic inhibition in vitro. We obtained three compounds by the pharmacophore methodology (Strategy 3) of which two of them demonstrated interesting inhibitory activity for GSK-3 in the micromolar range. From the other four strategies, 16 compounds were selected which in future will also be tested using the same in vitro assay protocol used here.

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Rosso, Angela. "Estudo do envolvimento iônico e de proteínas cinases no mecanismo de ação da 1-a,25(OH)2 vitamina D3, no influxo de cálcio em células de Sertoli e em testículos de ratos." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2012. http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/94538.

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 Made available in DSpace on 2012-10-25T11:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276693.pdf: 1653605 bytes, checksum: 92e108206ef61f401325ee0b2476c79f (MD5) Tendo em mente que a 1,25D3, produto final do metabolismo da vitamina D3 é essencial para a integridade do sistema reprodutor masculino, e que, a homeostase do Ca+2 desempenha papel chave em muitos processos envolvidos na espermatogênese, avaliamos o efeito em nível membranar da 1,25D3 sobre o metabolismo do Ca+2 em testículo inteiro e célula de Sertoli de ratos imaturos. Foi demonstrado que em após 60 minutos de pré-incubação com o hormônio, não hove variação da captação basal de 45Ca+2 nos tempos de incubação de 30, 60, 150, 300 e 600 segundos. No tempo de incubação de 60 segundos, foi verificado que a 1,25D3 tem a capacidade de aumentar a captação de 45Ca+2 do meio extracelular em diferentes doses em ambos modelos experimentais, sendo este evento independente da ação genômica. Em testículos, observou-se que doses entre 10-15M e 10-9M foram eficazes em aumentar a captação de 45Ca+2, sendo o maior efeito evidenciado da dose de 10-10M (106%). Utilizando esta dose, foi demonstrado que os canais de CCDV do tipo L e T são as principais vias de entrada do íon nas células testiculares, e que há necessidade da manutenção das correntes de K+ e Cl- para que ocorra este evento. Em células de Sertoli também não foi verificada a variação da captação basal de 45Ca+2. Neste sistema, foi verificado que no tempo de 60 segundos de incubação, o hormônio foi capaz de elevar a captação de 45Ca+2 entre as doses de 10-12M e 10-8 M, onde a dose de 10-12 M aumentou em torno de140% a capatação do íon. Já a dose de 10-10 M elevou em 89% o influxo do íon. Desta forma, utilizando a dose de 10-10 M, verificamos que as células de Sertoli comportam- se assim como os testículos: há necessitadade da ativação dos CCDV-L e T para a entrada do Ca+2 assim como das correntes de K+ e Cl-. Também foi verificado que em células de Sertoli há necessidade da ativação das proteínas PKC e p38MAPK para a capatação de Ca+2 estimulada pela 1,25D3. Alé, disso, as proteínas PI3K e ERK1/2 também estão em parte envolvidas neste processo. Por fim, avaliamos que a integridade dos microtúbulos e a atividade dos canais ClC3 faz-se necessária para que ocorra a entrada do íon nas células de Sertoli, sendo esta elevação do íon necessária para que ocorra o processo de secreção celular já demosntrada anteriormente pela 1,25D3.

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Borges, Juliana Dametto Krás. "O gene codificador da "proteína-cinase ativada por mitógenos" 5 (MPK5) de Eucalyptus grandis." reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2014. http://hdl.handle.net/10183/104728.

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Abstract:

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

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Bonini, Juliana Sartori. "Papel da proteína cinase C (PKC) no processamento de memórias aversivas e espaciais." reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2006. http://hdl.handle.net/10183/6478.

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Abstract:

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

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Siteneski, Aline. "Natação de alta intensidade reduz nocicepção somática induzida por glutamato pela ativação de receptores acoplados a proteína G / inibição da proteína cinase A." reponame:Repositório Institucional da UNISUL, 2015. http://www.riuni.unisul.br/handle/12345/543.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2016-11-30T14:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 111846_Aline.pdf: 1636563 bytes, checksum: e2c62638d6b11fb08a152914d2c00176 (MD5) license.txt: 214 bytes, checksum: a5b8d016460874115603ed481bad9c47 (MD5) Previous issue date: 2015

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Girardi, Bruna Amanda. "A MELHORA DA RECONSOLIDAÇÃO DA MEMÓRIA INDUZIDA POR ESPERMIDINA ENVOLVE A PROTEÍNA CINASE DEPENDENTE DE CÁLCIO." Universidade Federal de Santa Maria, 2015. http://repositorio.ufsm.br/handle/1/9033.

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Abstract:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The reactivation of a memory results in its destabilization, requiring a process of memory reconsolidation to maintain it. Spermidine is an endogenous aliphatic amine with polycationic structure that modulates N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity and improves memory. Recent evidence suggests that systemic administration of spermidine improves the reconsolidation of fear memory. Here we determined whether the calcium-dependent protein kinase (PKC) signaling pathway is involved in the improvement of fear memory reconsolidation induced by intrahippocampal (ih) administration of spermidine in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty-four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, spermidine (2-200 ρmol/site); the PKC inhibitor, 3-[1- (dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl) maleimide hydrochloride (GF 109203X, 0.3 - 30 ρg/site); the antagonist of the polyamine-binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.2 - 200 ρmol/site) or the PKC activator, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 0.02 - 2 nmol/site) were injected intra-hipocampally (i.h.). Testing was carried out in the same apparatus, twenty-four hours after reactivation. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While the post-reactivation administration of spermidine (20 and 200 ρmol/site) improved, GF 109203X (1, 10 and 30 ρg/site) impaired memory reconsolidation. GF 109203X (0.3 ρg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. The post-reactivation administration of arcaine (200 pmol/site) impaired and PMA (2 nmol/site) improved memory reconsolidation. PMA (0.2 nmol/site) prevented arcaine (200 ρmol/site)-induced impairment of memory reconsolidation. The protein synthesis inhibitor anisomycin (2 μg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation. These results suggest that the enhancement of memory reconsolidation induced by the administration of spermidine involves PKC activation. A reativação de uma memória resulta na sua desestabilização, que exigem um processo de reconsolidação de memória para mantê-la. A espermidina é uma amina alifática endógena com estrutura policatiônica que modula a atividade do receptor Nmetil- D-aspartato (NMDA) e melhora a memória. Evidências recentes sugerem que a administração sistêmica de espermidina melhora a reconsolidação da memória de medo. No entanto não se sabe se a administração intra hipocampal de espermidina melhora a reconsolidação da memória e nem se a proteína cinase dependente de cálcio (PKC) e síntese proteica estão envolvidas neste efeito. Portanto, no presente estudo verificou-se o envolvimento da PKC e da síntese proteica na melhora da reconsolidação da memória do medo induzida pela administração intrahipocampal (ih) de espermidina em ratos. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual utilizando-se choque de 0,4 mA como estímulo incondicionado. Vinte e quatro horas após o treino, os animais foram re-expostos ao aparelho na ausência de choque (sessão reativação). Imediatamente após a sessão de reativação foram administradas, por via ih, espermidina (2-200 ρmol/sítio); o inibidor da PKC, 3- [1- (dimetilaminopropil) indol-3-il] -4- (indol-3-il) maleimida (GF 109203X, 0,3-30 ρg/sítio); o antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor de NMDA, arcaína (0,2-200 ρmol/sítio) ou o ativador de PKC, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 0,02-2 nmol/sítio). Os testes foram realizados no mesmo aparelho, 24 horas após a sessão de reativação. O tempo de imobilidade dos animais durante o teste foi considerado como medida de memória. Enquanto a administração de espermidina (20 e 200 ρmol/sítio) melhorou, GF 109203X (1, 10 e 30 ρg/sítio) prejudicou a reconsolidação da memória. O GF 109203X (0,3 ρg/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). A administração da arcaína (200 pmol/sítio) prejudicou e PMA (2 nmol/sítio) melhorou a reconsolidação da memória. O PMA (0,2 nmol/sítio) preveniu o prejuízo na reconsolidação da memória induzido por arcaína (200 ρmol/sítio). O inibidor de síntese de proteica, anisomicina (2 ug/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). Estas drogas não tiveram nenhum efeito sobre a memória quando foram administrados na ausência da sessão de reativação. Estes resultados sugerem que a melhora da reconsolidação da memória induzida pela administração ih de espermidina envolve a síntese proteica e a ativação de PKC.

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Vilà, de las Heras Josep M. "Cinasas intracelulares y señalización mediada por CD5." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2001. http://hdl.handle.net/10803/853.

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Abstract:

El receptor linfocitario CD5 es una glicoproteína monomérica de membrana de 67KDa. Funcionalmente, es una molécula accesoria, implicada en la modulación de los procesos de activación y diferenciación mediados por el receptor antigénico en células T y B. Su región citoplasmática no contiene ninguna actividad catalítica intrínseca, pero en cambio presenta diversos motivos potenciales de fosforilación para serin/treonin y tirosincinasas, y otros motivos estructurales compatibles con una función señalizadora intracelular. Se ha demostrado que esta región se encuentra constitutivamente fosforilada por CKII en las serinas carboxiterminales S458, S459 y S461, y es rápidamente hiperfosforilada en residuos serina, treonina y/o tirosina tras la activación linfocitaria inducida por agentes tales como PMA, anti-CD3, o anti-CD5 mAbs. Creemos que los ciclos de fosforilación-defosforilación podrían estar implicados en la regulación de la actividad y la función de CD5. De acuerdo con esta hipótesis nos planteamos el estudio de los mecanismos de fosforilación implicados en la señalización intracelular de CD5: - Mediante la técnica del yeast two-hybrid y ensayos de co-precipitación, demostramos la existencia de una interacción específica entre la subunidad reguladora ? de CKII y la región C-terminal de CD5 donde se localizan las serinas antes mencionadas. - Utilizando PMA como estímulo, identificamos dos residuos treonina (T410 y T412) como responsables de la fosforilación in vivo de CD5 por la serin/treonincinasa PKC. Estudios funcionales posteriores demostraron que la integridad de T410 y T412 es crítica para la activación mediada por CD5 de la fosfolipasa C específica de fosfatidilcolina (PC-PLC) y para la inhibición por ésteres de forbol de la internalización de CD5 mediada por anticuerpo. - Tras la estimulación con mAb anti-CD3 o pervanadato, los residuos Y429 e Y463, y no Y378 e Y463, son dianas únicas para tirosinacinasas. Se obtuvieron los mismos resultados en ensayos de fosforilación in vitro utilizando productos recombinantes purificados de las tirosincinasas Lck y Fyn. El análisis de células Jurkat deficientes en Lck y CD3 demostró además que la tirosinfosforilación de CD5 requiere la actividad Lck. - Demostramos la fosforilación y posterior asociación de las proteínas adaptadoras c-Cbl y LAT a Grb2 vía CD5. Los niveles de fosforilación de c-Cbl vía CD5 son similares a los inducidos vía CD3 y no se afectan por la deleción de 2/3 C-terminales de la región citoplasmática de CD5. Por el contrario, la fosforilación de LAT (36-38 kDa) vía CD5 es muy débil comparada con la inducida vía CD3. - Demostramos que la asociación de una actividad serin/treonincinasa, anteriormente identificada en los inmunoprecipitados de CD5 es específica y se localiza en su región citoplasmática proximal a la membrana. Además, demostramos que los sitios diana para la cinasa se encuentran en esta región, así como a lo largo de toda la cola citoplasmática. En conclusión, CD5 tiene una región citoplasmática adaptada para transducir señales intracelulares y nuestros resultados demuestran que los procesos de fosforilación juegan un papel muy relevante en ello. 1. La asociación de CKII? a CD5 apoya la fosforilación constitutiva de CD5 por esta cinasa, la cual es necesaria para la activación de la cascada enzimática PC-PLC/A-SMasa. 2. La fosforilación inducible de CD5 por PKC sobre los residuos T410 y T412 es crítica para la regulación de aspectos funcionales de la molécula, como la activación de la cascada enzimática PC-PLC/A-SMasa y la internalización de la molécula. 3. La fosforilación inducible de CD5 por PTK únicamente sobre las tirosinas Y429 e Y463, invalida la funcionalidad de los motivos ITAM-like e ITIM-like presentes en CD5. 4. CD5 activa una vía de señalización propia que incluye la tirosin-fosforilación de c-Cbl y LAT, la activación de una serin/treonincinasa todavía por identificar y su internalización mediada por clatrina.

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Rosales, Thiele Osvaldt. "Envolvimento da cinase de receptor acoplado à proteína G2 (GRK2) e do receptor a1 adrenérgico renal na sepse." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2017. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/180254.

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Abstract:

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2017. Made available in DSpace on 2017-10-17T03:26:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347916.pdf: 1804718 bytes, checksum: 5f75e83f09bdce04f900fef237ec0e0f (MD5) Previous issue date: 2017 Sepse é uma condição médica grave causada por uma ativação exacerbada do sistema imune em resposta à infecção. A sepse é uma das principais causas de mortalidade e representa um grande desafio em unidades de terapia intensiva (UTIs). Sabe-se que a fisiopatologia da sepse é caracterizada por hipotensão, vasodilatação, diminuição da resistência vascular, hiporreatividade a agentes vasoconstritores e que o NO é um importante mediador na disfunção cardiovascular. Em contraste, a vasculatura renal é marcada por vasoconstrição durante a sepse. Cinases de receptores acoplados a proteína G (GRKs) fosforilam diversos receptores acoplados à proteína G (GPCRs), incluindo os receptores adrenérgicos, resultando na internalização destes. Dados prévios do laboratório demonstraram que a hiporreatividade às catecolaminas está associada com uma diminuição na densidade de receptores a e ß na aorta e no coração, respectivamente, bem como à um aumento nos níveis de GRK2 e que o NO contribui para o aumento desta cinase na sepse. Considerando a oposição da vasculatura renal com a circulação sistêmica o objetivo deste trabalho foi avaliar a modulação da GRK2 e investigar se há participação do NO (em termos de expressão de NOS-2) nessa regulação no rim de camundongos submetidos a sepse pelo modelo de CLP. Nossos resultados mostram que a sepse diminui substancialmente os níveis de GRK2 e aumenta a densidade de receptores a1 adrenérgicos no tecido renal. Além disso, ocorreu aumento da expressão de NOS-2 renal. A inibição da NOS-2 com aminoguanidina evitou a queda do conteúdo de GRK2, enquanto o tratamento com doador NO reduziu substancialmente a GRK2 renal em animais com sepse. Os achados sugerem que a falência renal na sepse abrange um mecanismo com regulação negativa de GRK2 renal com consequente aumento na densidade de receptores a1 adrenérgicos e que o NO parece estar envolvido nessa disfunção. Abstract : Sepsis is a serious medical condition caused by an overwhelming immune response to infection. Sepsis is a major challenge in the intensive care unit, where it?s one of the leading causes of death. Pathophysiology of sepsis is characterized by hypotension, vasodilatation, decrease systemic vascular resistance, impaired vascular reactivity to vasoconstrictors, being nitric oxide (NO) a prominent player in all these findings. In contrast, a renal vasculature is marked by vasoconstriction during sepsis. G protein-coupled receptor kinases (GRKs) phosphorylate several G protein-coupled receptors (GPCRs), including the adrenergic receptors, which results in their labeling for internalization. Previous data of our laboratory show that sepsis activates GRK in the aorta and heart, leading to the decrease in alpha-1 and beta adrenergic receptor density. Considering the opposite vascular status between the kidney and the systemic circulation during sepsis the present study aimed to evaluate the expression of G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2), and the putative role of NO (in terms of NOS-2 expression) in renal tissue in sepsis induced by CLP model in mice. Our results show that sepsis decreases GRK2 levels and increases a1 adrenergic receptors density contributing to a renal vasoconstrictor response. Sepsis induced increased NOS-2 expression in renal tissue. Inhibition of NOS-2 with aminoguanidine prevented a decrease in GRK2 level, whereas treatment with NO donor substantially reduce renal GRK2 in septic animals. The findings suggest that renal failure in sepsis includes a mechanism of negative regulation of GRK2 in kidney with consequent increase of a1 adrenergic receptors density and that NO appears to be involved in this dysfunction.

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Silva, Talita Prato da. "Avaliação do potencial antioxidante do licopeno e a influência da via de sinalização de PKC na produção de eros em células de hepatocarcinoma SK-HEP- 1." reponame:Repositório Institucional da UFOP, 2015. http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/5465.

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Abstract:

Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição. Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-20T21:01:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) Made available in DSpace on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) Previous issue date: 2015 Carcinogênese é um processo multipassos que pode ser induzido e/ou modulado por agentes químicos ou físicos, incluindo aqueles que induzem espécies reativas de oxigênio (EROs). Estas espécies são geradas a partir de uma grande variedade de processos como a respiração mitocondrial e a NADPH oxidase. A produção excessiva de EROs pode oxidar biomoléculas e facilitar processos relacionados com a carcinogênese. Em baixas doses, estas moléculas podem agir como importantes mediadores do crescimento celular, adesão, diferenciação e apoptose. As EROs podem, por exemplo, modular a via da PKC. PKC é uma família de serina-treonina cinases que regulam uma variedade de funções celulares. A ativação aberrante da PKC está relacionada a doenças como o câncer e o diabetes. A PKC pode ser ativada por EROs e a produção de EROs pode requerer a ativação da PKC porque essas cinases tem um papel na ativação da NADPH oxidase. Dessa forma, a ativação da PKC e da NADPH oxidase podem elevar os níveis de EROs, causando danos celulares. Estas reações potencialmente deletérias podem ser controladas por um sistema de antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase - SOD e catalase - CAT) e não enzimáticos (flavonóides e carotenóides). O licopeno é um carotenóide de coloração vermelha que está presente em vários vegetais e frutas. Trata-se de um dos antioxidantes mais potentes e tem demonstrado desempenhar um importante papel na prevenção de vários tipos de câncer, incluindo o hepatocarcinoma. Sendo assim, este estudo objetivou investigar o potencial antioxidante do licopeno e avaliar o efeito deste carotenóide na via da PKC, em células SK-Hep-1, uma linhagem de hepatocarcinoma altamente invasiva. O potencial antioxidante do licopeno foi examinado através da quantificação celular de EROs e das atividades das enzimas SOD e CAT. O efeito do licopeno na via da PKC foi examinado pela quantificação celular de EROs após estimulação com PMA e ionomicina. O papel da NADPH oxidase foi avaliado através da sua inibição com DPI, um inibidor desta enzima. Nossos resultados mostram que o DPI inibiu a produção de EROs, demonstrando a importância da enzima NADPH oxidase na geração de EROs na linhagem celular estudada. O licopeno diminuiu a produção basal de EROs e aumentou a atividade da SOD. Além disso, o licopeno inibiu a produção de EROs induzida por ionomicina e PMA. Estes resultados analisados em conjunto sugerem que um dos mecanismos antioxidantes do licopeno seja através da modulação da proteína cinase C. Entretanto, mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT: Carcinogenesis is a multistep process which can be induced and/ or modulated by chemical and physical agents, including those that induce reactive oxygen species (ROS).These species are generated by a wide variety of processes like mitochondrial respiration and NADPH oxidase. The excessive generation of ROS might oxidize cellular biomolecules and facilitate carcinogenesis-related processes. In lower doses, these molecules can act as important mediators of cell growth, adhesion, differentiation and apoptosis. ROS can, for example, modulate the PKC pathway. PKC is a family of serine/threonine kinases that regulates a variety of cell functions. Aberrant PKC activation is related to diseases such as cancer and diabetes. PKC can be activated by ROS and ROS production can require PKC activation because these kinases have a role in NADPH oxidase activation. On this way, the PKC and NADPH oxidase activation might elevate intracellular levels of ROS causing damage. These potentially deleterious reactions can be controlled by a system of enzymatic (SOD and CAT) and nonenzymatic antioxidants (flavonoids and carotenoids). Lycopene is a red colored carotenoid present in many vegetables and fruits. It‟s one of the most potent antioxidants and has been shown to play an important role in preventing from various types of cancer, including hepatoma. This study aimed to investigate the antioxidant potential of lycopene and evaluate the effect of this carotenoid on PKC pathway, in SK-Hep-1 cells, a highly invasive hepatoma cell line. The antioxidant potential of lycopene was examined by quantification of cellular ROS and of SOD and CAT activities. The effect of lycopene on PKC pathway was examined by quantification of cellular ROS after stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin. The role of NADPH oxidase was examined by its inhibition with DPI, an NADPH oxidase inhibitor. Our results show that DPI inhibited ROS production, demonstrating the importance of NADPH oxidase in ROS generation in SK-Hep-1cell. Lycopene decreased basal ROS production and increased SOD activity. Furthermore, lycopene inhibit ROS by ionomycin and PMA-induced. Taken together, these results suggest lycopene antioxidant mechanisms are through modulation of protein kinase C. However, more studies are needed to confirm this hypothesis.

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Silva, Robinson Sabino da. "A atividade simpática regula, via proteína cinase A (PKA), a proteína cotransportadora Na+/glicose 1 (SGLT1) em glândula salivar: efeitos do Diabetes Mellitus e da hipertensão arterial." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-20052010-135156/.

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Abstract:

Disfunções em glândulas salivares são frequentes no diabetes e na hipertensão arterial. Glândulas salivares foram removidas para analisar o conteúdo das proteinas SGLT1 e PKA em ratos Wistar Kyoto (WKY), WKY diabéticos (WKY-D), espontaneamente hipertensos (SHR) e SHR diabéticos (SHR-D). A atividade simpática para as glândulas salivares também foi avaliada. A atividade simpática foi aumentada em SHR (P<0,001) comparado com WKY; e diminuída após a induçao do diabetes em WKY and SHR (P<0,05). A regulação da subunidade catalítica da PKA e da proteína SGLT1 em membrana plasmática foram paralelas com a atividade simpática. Em ratos diabéticos e/ou hipertensos, a análise da imunohistoquímica mostrou aumento da proteína SGLT1 na membrana luminal de células ductais, onde isto pode promover captação de água, reduzindo o fluxo salivar. Confirmando isso, a secreção salivar não-estimulada foi reduzida (P<0,001) em WKY-D, SHR e SHR-D. Os resultados mostram que o aumento da SGLT1 luminal foi inversamente proporcional com o fluxo salivar em ratos diabéticos e hipertensos. Isto indica o papel do transporte de água da SGLT1 e, pelo aumento da reabsorção de água, pode explicar a hiposalivação em indivíduos diabéticos e hipertensos. Salivary gland dysfunction is a feature in diabetes and hypertension. In Wistar Kyoto rats (WKY), diabetic WKY (WKY-D), spontaneously hypertensive rats (SHR) and diabetic SHR (SHR-D), salivary glands were harvested for SGLT1 and PKA protein expression analysis. Moreover, sympathetic nerve activity to the salivary glands was measured. Diabetes decreased the nerve activity in WKY and SHR (P<0.05), pointing out that it was higher in SHR, as compared to WKY (P<0.001). The regulation of catalytic subunit of PKA and plasma membrane SGLT1 protein were parallel to the sympathetic nerve activity. In diabetic and/or hypertensive rats, imunohistochemical analysis showed increased SGLT1 protein in luminal membrane of ductal cells, where it may promote water uptake, reducing the salivary flow. Confirming that, nonstimulated salivary secretion was reduced (P<0.001) in WKY-D, SHR and SHR-D rats. The results show in luminal membrane of ductal cells SGLT1 protein increased inversely proportional to the nonstimulated salivary flux in diabetic and hypertensive rats. This indicates the water transporter role of SGLT1 and, by increasing salivary water reabsorption, may explain the hyposalivation complained by diabetic subjects.

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Regis, Eduardo Garcia Necco Peixoto. "O papel da Interleucina 27 (IL-27) na replicação da Leishmania em Macrófagos." Instituto Oswaldo Cruz, 2012. https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/6988.

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Abstract:

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

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Saraiva, Lucília Helena Ataíde. "Implementação do ensaio fenotípico das leveduras e sua aplicação na pesquisa de moduladores selectivos para isoformas individuais da PKC de mamífero." Tese, Porto : [Edição do Autor], 2003. http://catalogo.up.pt/F?func=find-b&local_base=UPB01&find_code=SYS&request=000095611.

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Saraiva, Lucília Helena Ataíde. "Implementação do ensaio fenotípico das leveduras e sua aplicação na pesquisa de moduladores selectivos para isoformas individuais da PKC de mamífero." Doctoral thesis, Porto : [Edição do Autor], 2003. http://hdl.handle.net/10216/64005.

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Quetglas, Maria Daniela. "Efeito do bloqueio meiótico na expressão, atividade e distribuição do fator promotor da meiose (MPF) e da proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) em oócitos bovinos." Universidade de São Paulo, 2008. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/74/74131/tde-11032008-102815/.

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Abstract:

Apesar dos grandes avanços na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a produção de blastocistos se mantém ainda aquém do observado in vivo, indicando que melhorais ainda são necessárias no processo de PIV. A competência para o desenvolvimento de oócitos tem sido relacionada, entre outros fatores, à interrupção do período de capacitação. Foi sugerido que o bloqueio meiótico poderia permitir ao oócito um tempo adicional para adquirir a competência. Embora ainda não se tenha melhorado o desenvolvimento embrionário com esse procedimento, o bloqueio meiótico com inibidores de cinases dependentes de ciclinas (CDK), como a butirolactona I (BLI), pode ser uma ferramenta útil na compreensão do desenvolvimento do oócito. O presente trabalho teve por objetivo averiguar o efeito da inibição de CDK com BLI, para bloquear temporariamente a retomada da meiose, sobre fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos. Oócitos bovinos obtidos de abatedouros foram bloqueados em vesícula germinativa (VG) in vitro com 10 µM de BLI por 24 h (BVG - bloqueado imaturo). Parte desses oócitos foi depois maturada in vitro por mais 24 h (BMII - bloqueado maturado). Como controles foram utilizados oócitos recém-aspirados dos folículos (VG - controle imaturo) ou maturados in vitro sem bloqueio meiótico prévio (MII - controle maturado). Os diferentes grupos de oócitos foram avaliados quanto a: 1) expressão de RNAm dos componentes do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e da MAPK; 2) expressão das proteínas do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e MAPK (p44 e p42); 3) atividade das proteínas MPF e MAPK durante a maturação in vitro de oócito submetidos ou não ao bloqueio da meiose pré-maturação e 4) a localização subcelular das proteínas p34cdc2, ciclina B1 e MAPK nos oócitos. Foi observado que: 1) a abundância relativa do RNAm de p34cdc2 e MAPK reduziu-se com a maturação, enquanto a ciclina B1 menteve-se estável; o bloqueio meiótico manteve o mesmo padrão de acordo com o estádio de maturação; 2) as proteínas de p34cdc2 e MAPK mantiveram-se estáveis durante a maturação, enquanto a ciclina B1 não foi detectada em oócitos imaturos e o foi nos maturados; o bloqueio meiótico também manteve a expressão das proteínas de acordo com o estádio de maturação; 3) as atividades de MPF e MAPK foram pouco afetadas pelo bloqueio meiótico; 4) as proteínas foram todas detectadas no citoplasma dos oócitos imaturos (bloqueados ou não) e maturados (bloqueados ou não), sendo apenas a p34cdc2 também localizada no núcleo de oócitos imaturos (bloqueados ou não). Diante dos resultados conclui-se que o bloqueio da meiose mantém o mesmo padrão de expressão, atividade e localização subcelular do MPF e da MAPK em oócitos imaturos e maturados, sugerindo que a tradução das mensagens, a ativação das cinases e a distribuição das proteínas foram controladas de acordo com o estádio da meiose, não sendo afetadas pelo bloqueio. Although there have been great improvements in in vitro production (IVP) of bovine embryos, blastocyst production is still beyond that observed in vivo, indicating that more improvements are necessary in the IVP system. Developmental competence of oocytes has been related to, among other factors, the interruption in oocyte capacitation. Is has been suggested that meiosis block would allow the oocyte additional time to acquire competence. Although this procedure has not been successful in increasing embryo development, meiosis block with cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors, such as butyrolactone I (BLI) can be a useful tool to study oocyte development. The present study aimed to assess the effects CDK inhibition with BLI, to temporarily block meiosis resumption, on factors involved in meiosis cell cycle control in bovine oocytes. Oocytes, obtained form slaughterhouse ovaries, were maintained in germinal vesicle (GV) arrest in vitro with 10 µM BLI for 24 h (BVG - blocked immature). A part of these oocytes was matured in vitro for another 24 h (BMII - blocked and matured). As controls, oocytes were also assessed soon after follicle aspiration (GV -immature control) or matured in vitro for 24 h without prior meiosis block (MII - matured control). The different groups of oocytes were assessed for: 1) mRNA expression for the MPF components (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK; 2) expression of MPF (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK (p44 and p42) proteins; 3) MPF and MAPK activities during maturation of oocytes submitted or not to prematuration meiosis block and 4) p34cdc2, cyclin B1 and MAPK subcellular localization within oocytes. During the study it was observed that: 1) relative abundance of p34cdc2 and MAPK mRNA was reduced after maturation, while cyclin B1 mRNA remained stable; meiosis block maintained the same pattern according to maturation stage; 2) p34cdc2 and MAPK proteins remained stable after maturation while cyclin B1 protein was undetected in immature oocytes and detected in the matured ones; meiosis block also maintained the same protein expression according to maturation stage; 3) MPF and MAPK activities were little affected by meiosis block and 4) all proteins were detected in the cytoplasm of immature (blocked or not) and matured (blocked or not) oocytes, and only showed a specific nuclear localizations in immature oocytes (blocked or not). According to the results it may be concluded that meiosis block maintained the same pattern of MPF and MAPK expression, activity and subcellular localization in immature and matured oocytes, suggesting that mRNA translation, kinase activation and protein distribution were controlled according to the maturation stage and were not affected by meiosis block.

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Sales, Paula Cristiane Motta. "Regulação da expressão da proteína cinase PKR na ausência de interferons (IFNs) e seu papel na resposta celular mediada por agonistas dos receptores TLR2 e TLR4." Universidade Federal de Minas Gerais, 2012. http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9L7NEM.

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Abstract:

The role of protein kinase R (PKR) in the antiviral cell state induced by interferons (IFNs) is well known. The increase in its expression in response to stimulation by IFNs results in its autophosphorylation and phosphorylation of its substrate eIF2-alpha. This molecular event interferes with translation initiation of mRNA, which in turn results in inhibition of protein synthesis. Recent studies suggest the involvement of PKR in bacterial infections. However, how PKR is activated and what is its biological role in these infections is still largely unexplored. Thus, the central objective of our study was to examine the regulation of expression of PKR in the signaling pathway triggered by agonists of TLR2 and TLR4 in a human promonocytic, THP-1. THP-1 monocytes were treated with LPS (TLR4 agonist) or Pam3CSK4 (TLR2 agonist) in increasing doses or at different time intervals. At the end of these treatments, total RNA and protein extracts were obtained for analysis of the relative abundance of mRNA PKR by real time PCR and protein levels by western blot assays, respectively. The results showed a significant increase in the levels of mRNA PKR and PKR protein. Surprisingly, we did not observe any increase in the levels of transcripts of IFN-beta or subtypes of IFN-alpha. Moreover, treatment of THP-1 cells with LPS or Pam3CSK4 did not result in STAT1 phosphorylation. Supernatants taken from THP-1 cells treated with LPS or Pam3CSK4 did not caused the activation of PKR or ISG56 promoters in reporter gene assays carried out in HEK293T cells. These results provide evidence that in THP-1 monocytes exposed to stimulation with TLR4 and TLR2 agonists, neither transcriptional activation nor production of type I IFNs is observed, and therefore the PKR expression occurs in the absence of IFNs. Once the promoter region of PKR contains other regulatory elements as candidates for its expression regulation, including NF-IL6, NF-kB, Sp1 and Sp3, we decided to assess the effect of three pharmacological inhibitors. The pretreatment of the THP-1 cells with TPCK or Bay11 7082, pharmacological inhibitors of the transcription factor NF-B, inhibited the PKR expression induced by bacterial agonists. The same was observed when cells were pretreated with Mithramycin, an inhibitor of Sp1/Sp3 transcription factor. However, analysis of the phosphorylation of STAT1 in THP-1 cells differentiated to macrophages suggests the involvement of IFNs in cells treated with the TLR4 agonist, but not with TLR2. The monocytes are one of the major cells of the innate immune responses and are essential for host defense against a wide range of pathogens, having an important role in sepsis. We analyzed and compared the survival of WT and PKR-/-polymicrobial sepsis model. The results indicated that PKR appears to play a detrimental role to the host, as PKR-deficient mice survive from sepsis. Our results demonstrate that PKR expression in human monocytes stimulated with bacterial agonists TLRs occurs independently of IFNs, and that the regulatory mechanisms of its expression involve transcription factors that are critical in the inflammatory response. Furthermore, results obtained from the experiments in vivo demonstrate that PKR is an important target for studies of sepsis. Therefore, our study provides new insight into the mechanisms of transcriptional activation of PKR and its role on the innate immune response against bacterial pathogens. O papel da proteína cinase dependente de RNA de dupla fita (PKR) no estado celular antiviral induzido por interferons (IFNs) é bastante conhecido. O aumento de sua expressão em resposta à estimulação por IFNs pode resultar em sua autofosforilação levando à fosforilação de seu substrato eIF2-alfa. Este evento molecular interfere no início da tradução do mRNA, que por sua vez resulta em inibição da síntese protéica. Estudos recentes sugerem o envolvimento de PKR em infecções bacterianas. No entanto, como PKR é ativada e qual é o seu papel biológico nessas infecções é ainda pouco explorado. Assim, o objetivo central do nosso trabalho foi examinar a regulação da expressão da proteína cinase PKR na via de sinalização disparada por agonistas dos receptores TLR2 e TLR4 em uma linhagem promonocítica humana THP-1. Monócitos THP-1 foram tratados com LPS (agonista de TLR4) ou Pam3CSK4 (agonista de TLR2) em doses crescentes ou em diferentes intervalos de tempo. Ao final desses tratamentos, o RNA total e extratos protéicos foram obtidos para análise da abundância relativa do mRNA de PKR por PCR em tempo real e de seus níveis protéicos por ensaios de western-blot, respectivamente. Os resultados mostram um aumento significativo dos níveis do mRNA e protéicos de PKR. De modo surpreendente, não foi observado qualquer aumento nos níveis dos transcritos de IFN-beta ou dos subtipos de IFN-alfa. Além disso, o tratamento das células THP-1 com LPS ou Pam3CSK4 não resultou na fosforilação de STAT1. Os sobrenadantes das células THP-1 tratadas com LPS ou Pam3CSK4 não acaretaram na ativação dos promotores de PKR ou ISG56 em ensaios de gene repórter conduzidos em células HEK293T. Esses resultados fornecem vidências que em monócitos THP-1 expostos à estimulação com agonistas TLR2 e TLR4 não ocorre a ativação transcricional nem tanto a produção de IFNs do tipo I, e que portanto, a expressão de PKR ocorre na ausência de IFNs. Uma vez que a região promotora de PKR contém outros elementos regulatórios candidatos para sua regulação como NF-IL6, NF-kB, Sp1 e Sp3, decidimos avaliar o efeito de três inibidores farmacológicos. O pré-tratamento das células THP-1 com TPCK ou com Bay11-7082, inibidores farmacológicos do fator de transcrição NF-B, inibiu a expressão de PKR induzida pelos agonistas bacterianos. O mesmo foi observado quando as células foram pré-tratadas com Mitramicina, um inibidor do fator de transcrição Sp1/Sp3. No entanto, análises da fosforilação de STAT1 em células THP-1 diferenciadas a macrófagos sugerem a participação de IFNs em células tratadas com o agonista de TLR4, mas não com TLR2. Os monócitos são uma das principais células da resposta imune inata sendo essenciais para defesa do hospedeiro contra uma gama de patógenos, tendo papel importante na septicemia. Assim, avaliamos e comparamos a sobrevivência de camundongos WT e PKR-/- em modelo de sepse polimicrobiana. Os resultados revelaram que PKR parece ter um papel prejudicial ao hospedeiro, uma vez que a deficiência de PKR impede que os camundongos sucumbam à sepse grave. Nossos resultados demonstram que a expressão de PKR em monócitos humanos estimulados com agonistas TLRs bacterianos ocorre de modo independente de IFNs, e que os mecanismos de regulação de sua expressão envolvem fatores de transcrição críticos da resposta inflamatória. Além disso, os resultados obtidos de experimentos in vivo demonstram que PKR é um importante alvo para estudos de septicemia. Portanto, nosso estudo fornece uma nova visão sobre os mecanismos de ativação transcricional de PKR e de seu papel sobre a resposta imune inata contra componentes bacterianos.

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Moraes, Paulo Alexandre de Carvalho. "A participação da proteína cinase mTOR (mammalian target of rapamycin) e do fator transcricional NF-kB na regulação da expressão do GLUT4 em músculo sóleo de ratos." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-23052012-092050/.

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Abstract:

A insulina regula a expressão de GLUT4, porém os mecanismos envolvidos nesta regulação não estão definidos. Alguns fatores de transcrição e proteínas cinases estão relacionados com a expressão de GLUT4. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar a participação dos fatores de transcrição MEF2, HIF-1a e NF-kB, e das proteínas cinases mTOR, PI3K e AKT na regulação da expressão de Slc2a4/GLUT4 induzida pela insulina. Para isso, músculos sóleos de ratos foram incubados por 3 horas em tampão Krebs, tratados ou não com insulina, wortmanina, rapamicina, ML-9 ou TNF-a. Nesses tecidos foram avaliados o conteúdo das proteínas GLUT4 e mTOR (Western), o conteúdo de mRNA de GLUT4, NF-kB1, HIF-1a e MEF2A/C/D (PCR) e a atividade de ligação de proteínas nucleares no sítio de ligação de NF-kB, AT-rich element e E-Box do promotor do gene Slc2a4 (EMSA). O tratamento com insulina aumentou a expressão de Slc2a4/GLUT4 no músculo sóleo, in vitro, ativando os fatores de transcrição MEF2A/D e possivelmente MyoD, através da via da PI3K/AKT e diminuindo a expressão e atividade de NF-kB. Insulin regulates the GLUT4 expression, but the mechanisms involved in this regulation are not defined. Some transcription factors and protein kinases are related to the expression of GLUT4. Thus, the aim of this research was to investigate the role of the transcription factors MEF2, HIF-1a and NF-kB, and the proteins kinases mTOR, PI3K and AKT, in regulation of Slc2a4 and GLUT4 expression by insulin. For this, rat soleus muscles were incubated for 3 hours in Krebs buffer, treated or not with insulin, wortmanina, rapamycin, ML-9 or TNF-a. In these tissues were evaluated the GLUT4 and mTOR protein content (Western), the content of GLUT4, NF-kB1, HIF-1a and MEF2A/C/D mRNAs (PCR) and the binding activity of protein nuclear in binding site of NF-kB, AT-rich element and E-Box in the promoter of the gene Slc2a4 (EMSA). Insulin treatment increased the expression of Slc2a4/GLUT4 in the soleus muscle in vitro, activating the transcription factors MEF2A/D and possibly MyoD, via PI3K/AKT and decreasing the expression and activity of NF-kB.

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Oliveira, Fernanda Souza de. "Avaliação do papel da proteína Cinase associada ao receptor de interleucina-1 4 (IRAK-4) na resposta imuneinata durante a infecção causada pela bactéria intracelular Brucella abortus." Universidade Federal de Minas Gerais, 2012. http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8VPJ7Q.

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Abstract:

Interleukin-1 receptor associated kinase 4 (IRAK-4) is a kinase that plays an important role in immune responses as a mediator on cellular signaling in responses to IL-1 receptor and various TLR ligands. This study aimed to determine the role of the IRAK-4 in host innate immune response against Brucella abortus infection. IRAK-4 knockout mice(IRAK-4-/-) and heterozygous mice (IRAK-4+/-) were infected with Brucella abortus strain S2308. Herein, it was shown that the number of colony-forming units (CFU) in IRAK-4-/- mice spleen was higher compared to IRAK-4+/- animals only at one week post-infection. At3 and 6 weeks post-infection, knockout mice were able to control the infection as the heterozygous mice. Furthermore, it was evaluated in vivo and in vitro production of type 1 cytokines crucial for brucellosis control. IRAK-4 deficient mice (IRAK-4-/-) showed lower production of systemic IL-12, and lower production of IFN- and TNF- by spleen cellswhen compared to IRAK-4+/- mice. However, the difference in IFN- production between IRAK-4+/- and IRAK-4-/- animals was higher only at first week post-infection, in agreement with the increased susceptibility of IRAK-4-/- mice. That reduction of IFN- production by IRAK-4-/- mice was observed in CD4+, CD8+ T cells and NK1.1+CD3- cells, indicating theinvolvement of IRAK-4 in activation of those cells. Also, the production of IL-12 and TNF- by macrophages and dendritic cells from IRAK-4-/- mice was abolished at 24hrs after stimulation with B. abortus. Additionally, macrophages from IRAK-4-/- mice stimulated with B. abortus, showed a deficient phosphorylation of MAPK, ERK1/2 and p38, and p65 subunit of NF-B. Furthermore, macrophages from MyD88 deficient mice also demonstrated total absence of MAPK and NF-B activation. Therefore, the results summarized in this study suggest that the IRAK-4 molecule is critical to trigger the initial immune response against B. abortus but not to late phases of infection. A Cinase Associada ao Receptor de Interleucina-1 4 (IRAK-4) uma proteína cinase que possui um papel fundamental na resposta imune, como mediadora da sinalizador intracelular via receptor de IL-1 e receptores do tipo Toll (TLR). Este trabalho teve como objetivo determinar a participaçao de IRAK-4 na resposta imune inata durante ainfecão causada pela bacteria intracelular Brucella abortus. Camundongos deficientes em IRAK-4 (IRAK-4-/-) e camundongos heterozigotos para esta molecula (IRAK-4+/-) foram infectados com B. abortus S2308. Foi possível observar, uma semana apos a infecção, que os animais IRAK-4-/- apresentaram um maior numero de bacterias recuperadas do baço quando comparado aos animais IRAK-4+/-. Entretanto, após 3 e 6 semanas, os animais foram capazes de controlar a infecão de maneira similar aos animais controle. Além disso, foi avaliada in vivo e in vitro a produzir o de citocinas pertencentes ao perfil imunologico de resposta do tipo 1, importante para o controle da brucelose. Os animais deficientes em IRAK-4 apresentaram uma menor produção de IL-12 sistêmica, bem como uma menor produção de IFN- e TNF- pelas celulas esplênicas. Contudo, a maior diferença naprodução IFN- entre os animais IRAK-4+/- e IRAK-4-/- foi observada na 1 semana de infecção, coincidente com a maior susceptibilidade dos animais IRAK-4-/- neste período. Essa redução da produção de IFN- pelos camundongos IRAK-4-/- foi observada em linfitos T CD4+, T CD8+ e em células NK1.1+/CD3-, indicando a participação de IRAK-4 na ativação destes tipos celulares. A produção de IL-12 e TNF-, analisada no sobrenadante dos macrófagos e células dendríticas dos animais IRAK-4-/-, foi drasticamente reduzida. Além disso, a fosforilação das MAP cinases, ERK1/2 e p38, e da subunidade p65 do NF-B em macrófagos provenientes de animais IRAK-4-/- estimuladoscom B. abortus, demonstrou ser dependente de IRAK-4. Paralelamente, observou-se ainda VIII um total bloqueio da ativação dessas vias nos macrófagos deficientes em MyD88. Os resultados obtidos demonstram que IRAK-4 crucial para o controle inicial da infecção por B. abortus, porém o controle da infecçaão em fases mais tardias demonstrou não ser dependente desta moléula.

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Silva, Olivia Beloto da. "A PKA modula a localização do SGLT1 e indiretamente a recuperação do pHi, no tratamento com alta concentração de glicose." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-17092012-110833/.

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Abstract:

Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.

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Gentz, Solange Henschke Lima. "A apoptose induzida pelo anti-inflamatório não esteróide salicilato de sódio requer a participação da proteína cinase gcn2 e o envolvimento de vias do estresse do retículo endoplasmático." Universidade Federal de Minas Gerais, 2011. http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8UBJNE.

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Abstract:

Salicylates are non-steroidal anti-inflammatory drugs with the well-known ability to inhibit cyclooxygenase activity, the key enzyme in prostaglandin biosynthesis. The salicylates also induce the phosphorylation of the alpha-subunit of eukaryotic translation initiation factor (eiF2 alpha). Under different stress conditions, kinases such as PERK and GCN2 can phosphorylate eIF2 alpha and trigger the activation of signaling pathways such as the unfolded protein response (UPR) elicited in the endoplasmic reticulum. In addition to their anti-inflammatory actions, salicylates have been reported to induce apoptosis in a number of cell types by regulating multiple molecules. In this study we wanted to identify genes related to the UPR that are activated upon sodium salicylate (NaSal) treatment and determine the possible role of the eIF2 alpha kinase GCN2 in the cell death induced by NaSal. Transcriptional profiling by PCR array was used to compare 84 mRNAs in untreated and NaSal treated wild type and GCN2-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs). We found that NaSal treatment strongly induces apoptosis of wild-type, but to a much less extent in GCN2-/-MEFs. NaSal treatment led to the induction of several UPR responsive genes, especially involved in apoptosis, transcriptional regulation and metabolism. The transcriptional activation of the pro-apoptotic transcription factor CHOP/GADD153, the most highly expressed gene induced upon NaSal treatment, was dependent on GCN2. GCN2 loss in cells renders them resistant to apoptosis induced by salicylates. We conclude that the GCN2 kinase plays a key role in cell death induced by NaSal treatment by regulating a number of genes in the UPR pathway Salicilatos são fármacos anti-inflamatórios não esteróides com ação conhecida na inibição da atividade da cicloxigenase, uma enzima chave na biosíntese de prostaglandina. Os salicilatos possuem também a capacidade de induzir a fosforilação da subunidade alfa do fator de iniciação da tradução (eIF2 alfa). Sob diferentes condições de estresse, cinases como PERK e GCN2 podem fosforilar eIF2-alfa e levar a ativação de vias de sinalização tais como a da resposta de protéinas mal enoveladas (UPR) induzida no retículo endoplasmático. Além de suas atividades anti-inflamatórias, já foi relatado que os salicilatos induzem a apoptose em vários tipos de células através da regulação de múltiplas moléculas. Neste estudo, nós almejamos identificar genes relacionados a UPR que são ativados após o tratamento com salicilato de sódio (NaSal) e determinar uma possível função da eiF2-alfa cinase GCN2 na morte celular induzida pelo tratamento com NaSal. O perfil transcricional foi avaliado por um arranjo de PCR contendo 84 mRNAs, comparando-se fibroblastos embrionários murinos (MEFs) selvagens e deficientes de GCN2, tratados ou não com NaSal. O tratamento com NaSal levou a indução de vários genes responsivos a UPR, especialmente envolvidos na apoptose, regulação da transcrição e no metabolismo. A ativação transcricional do fator de transcrição pró-apoptótico CHOP/GADD153, o gene de expressão mais induzida após tratamento com NaSal, foi dependente de GCN2. A perda de GCN2 nas células faz com que estas se tornem resistentes a apoptose induzida pelos salicilatos. Nós concluímos que a cinase GCN2 tem papel central na morte induzida pelo tratamento com NaSal através da regulação de vários genes da via da UPR

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Gouveia, Bianca Castro. "Avaliação da ativação do sistema imune de planta pelo receptor NIK (NSP- interacting kinase) e identificação de um novo parceiro de NSP (Nuclear Shuttle Protein) de geminivírus." Universidade Federal de Viçosa, 2014. http://locus.ufv.br/handle/123456789/4811.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 478603 bytes, checksum: 2f73d62b9c5b69dd70468c095488ebaf (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico NIK (NSP-Interacting Kinase) is a receptor-like kinase involved in defense against geminiviruses, which was first identified as a virulence target of the begomovirus transport protein NSP (Nuclear Shuttle Protein). We have previously identified that NIK activation mediates an indirect phosphorylation of the ribosomal protein L10 causing the translocation of the cytosolic protein to the nucleus, where it interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to regulate genes involved in the translation machinery resulting in a global translation suppression. Constitutive activation of NIK, through ectopic expression of the mutant T474D in Arabidopsis, has been previously shown to induce the plant immune system. In this investigation, we examined further whether activation of the signaling module NIK-RPL10-LIMYB would transduce a typical defense signal that promotes the induction of the plant immune system. However, the current results suggest that the NIK-mediated antiviral signaling does not induces the basal immune system. Firstly, the global variation of gene expression by ectopic expression of the constitutively activated mutant receptor T474D or LIMYB does not cause a gene enrichment in the up-regulated list of typical defense categories, such as response to pathogens, response to virus and virus-induced gene silencing. Secondly and very importantly, quantitative RT-PCR of a representative sample of defense genes confirmed that they are not up-regulated by expression of T474D or LIMYB. In contrary, expression of LIMYB in the transgenic lines caused a down-regulation of the defense genes examined. We have also examined new host targets that interact with NSP. Initially, we used a 12000 Arabidopsis protein expression-based microarray to isolate a t-SNARE-like protein with the capacity to bind NSP in vitro. This interaction NSP-At4g30240 protein was further confirmed by two- hybrid assay in yeast and by bimolecular fluorescence complementation assay in planta. Our results indicate that At4g30240 interacts with NSP in vivo to mediate or facilitate the viral protein transport among cell compartments. NIK (NSP-Interacting Kinase) é um receptor cinase envolvido na resposta de defesa contra geminivírus, e foi primeiramente identificado como alvo de virulência da proteína de transporte NSP (Nuclear Shuttle Protein) de begomovírus. Previamente, foi identificado que a ativação de NIK medeia a fosforilação indireta da proteína ribossomal L10, promovendo a translocação da proteína citosólica para o núcleo, onde interage com a proteína LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein), para regular genes envolvidos na maquinaria de tradução da célula, resultando em supressão da tradução global. Foi também demonstrado que a ativação constitutiva de NIK1, através da expressão ectópica do mutante T474D, induz o sistema imune de plantas em Arabidopsis. Nesta investigação, foi analisado em maiores detalhes se a ativação do módulo de sinalização NIK-RPL10-LIMYB também transmitiria um sinal típico de defesa, resultando na indução do sistema imune de plantas. Entretanto, os resultados encontrados sugerem que a via de sinalização antiviral mediada por NIK não transmite o sinal de defesa típico que culmina na ativação de genes relacionados ao sistema imune de plantas. Em primeiro lugar, por meio de estudos de variação global de expressão gênica, induzida por expressão ecotópica do mutante constitutivo T474D ou LIMYB, foi constatado que não houve enriquecimento gênico significativo na lista dos genes regulados positivamente nas categorias de defesa, como resposta de defesa a patógenos, resposta de defesa a vírus e silenciamento gênico induzido por vírus. Além disso, RT- PCR quantitativo de uma amostra representativa dos genes de defesa confirmou que estes genes de defesa não foram regulados positivamente pela expressão de T474D ou LIMYB. Ao contrário, a expressão de LIMYB nas linhagens transgênicas promoveu a regulação negativa dos referidos genes de defesa. Nesta investigação, também se avaliou novos alvos do hospederio que interagem com NSP. Inicialmente, foi isolada, por meio de microarranjos de expressão de 12.000 proteínas de Arabidopsis, uma proteína com características de uma t-SNARE, codificada pelo locus At4g30240 com a capacidade de interagir com NSP in vitro. Esta interação NSP- proteína At4g30240 foi confirmada em ensaios de duplo hibrido em leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular in planta. Os resultados indicam que At4g30240 interage com NSP in vivo, e pode mediar ou mesmo facilitar o transporte dessa proteína viral entre compartimentos celulares.

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Zanotto, Camila Ziliotto. "Papel da O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) no influxo e recaptação de cálcio pelo retículo sarcoplasmático em aorta de ratos: análise funcional." Universidade de São Paulo, 2013. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-09092013-133940/.

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A O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-translacional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: a enzima OGT é responsável por catalisar a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina e treonina, enquanto a OGA catalisa a remoção de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvo de O-GlcNAc e o aumento da expressão de proteínas modificadas por O-GlcNAc promove aumento da reatividade vascular para estímulos contráteis. Um dos mecanismos de extrema importância no controle do tônus vascular está ligado à regulação da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular, onde destacamos a participação do sistema STIM1/Orai1. As moléculas de interação estromal (STIM) atuam como sensores dos estoques intracelulares de Ca2+ e as proteínas Orai representam as subunidades que formam os canais de Ca2+ ativados pela liberação de Ca2+ (CRAC). Neste estudo investigamos a hipótese de que o aumento dos níveis vasculares de proteínas glicosiladas aumenta a resposta contrátil em aorta de ratos, por mecanismos relacionados ao controle da concentração intracelular de Ca2+.Em nossos experimentos, utilizamos aortas torácicas de ratos incubadas com PugNAc (inibidor seletivo da OGA, ), por 24h. Utilizando protocolo experimental que permite avaliar contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ e liberação de Ca2+ intracelular, demonstramos que a incubação com PugNAc aumentou a resposta contrátil à PE bem como a contração durante o período de influxo de Ca2+, induzida pela reintrodução de solução fisiológica contendo Ca2+ (1,56 mM). O bloqueio dos canais CRAC com 2-APB (100 ) e gadolíneo (Gd3+, 100 ) diminuiu significativamente as contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ em aortas incubadas com PugNAc. Além disso, estas aortas apresentaram aumento da expressão protéica de STIM1, o que resultaria em maior influxo de Ca2+. A contração induzida por cafeína (20 mM) e serotonina (10 ), a qual reflete a capacidade funcional do retículo sarcoplasmático (RS) em captar Ca2+, foi maior em aortas incubadas com PugNAc. O papel da Ca2+-ATPase (SERCA) foi avaliado com a utilização de tapsigargina, bloqueador da SERCA. O efeito da tapsigargina foi semelhante em artérias incubadas com PugNAc e veículo, apesar do aumento de expressão proteica da SERCA em aortas incubadas com PugNAc. Como a proteína cinase C (PKC) é ativada por aumentos de Ca2+ intracelular, determinamos se a atividade de proteínas alvo da PKC estavam aumentadas. A incubação com PugNAc aumentou a expressão das formas fosforiladas da CPI-17, MYPT-1 e MLC. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação de STIM1/Orai1, aumento da liberação de Ca2+ intracelular e ativação da via de sinalização da PKC podem representar mecanismos que modulam as alterações vasculares em resposta ao aumento de proteínas glicosiladas por O-GlcNAc. Glycosylation with O-linked -N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification. The process of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: the OGT enzyme catalyses the addition of N-acetyl-glucosamine to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, while OGA catalyzes the cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified proteins. Proteins with an important role in vascular function are targets of O-GlcNAc and increased levels of proteins modified by O-GlcNAc increase vascular reactivity to contractile stimuli. The regulation of intracellular calcium (Ca2+) concentration, including the activation of STIM1/Orai1, is key in the control of vascular tone. The stromal interaction molecules (STIM) act as sensors of intracellular Ca2+ stores whereas the Orai proteins represent subunits of the Ca2+ release-activated Ca2+ channels (CRAC). We hypothesized that increased levels of vascular O-GlcNAc proteins augment vascular contractile responses by altering mechanisms that regulate the intracellular Ca2+. Rat thoracic aortas were incubated with PugNAc (OGA selective inhibitor, ) for 24h. Using an experimental protocol that evaluates contractions induced by Ca2+ influx and release, we demonstrated that incubation with PugNAc increases contractile responses to phenylephrine (PE) as well as the contraction induced by Ca2+ influx, after depletion of intracellular Ca2+ stores. The CRAC channel blockers, 2-APB (100 ) and gadolinium (Gd3+, 100 ), significantly reduced the contractions induced by Ca2+ influx in aortas incubated with PugNAc. Furthermore, these aortas showed increased STIM1 protein expression, which could result in increased influx of Ca2+ and, in turn, increase vascular contraction. The contraction induced by the release of intracellular Ca2+ stores, stimulated by caffeine (20 mM) and serotonin (10 ), was increased in aortas incubated with PugNAc. The Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor thapsigargin produced similar effects in arteries incubated with PugNAc or vehicle, despite the increased SERCA protein expression in aortas incubated with PugNAc. Since PKC is activated by increases in intracellular Ca2+ and arteries incubated with PugNAc show activation of PKC, we determined whether the activity of proteins that are targets of PKC was increased in PugNAc-treated aortas. Incubation with PugNAc increased the expression of phosphorylated forms of CPI-17, MYPT-1 and MLC. Together, these results suggest that activation of STIM1/Orai1, increased release of intracellular Ca2+ and PKC activation may represent mechanisms that modulate vascular responses upon increased O-GlcNAc proteins.

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Matsumoto, João Paulo de Pontes. "Receptor A2a de adenosina: estudo da modulação da liberação de neurotransmissores em modelo in vitro." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-03042013-115748/.

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Abstract:

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

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Silva, Simone Sandy da. "Influência da ck2 no processo de interação Leishmania donovani-macrófagos." Universidade do Estado do Rio de Janeiro, 2012. http://www.bdtd.uerj.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=7180.

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Abstract:

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2α em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2α. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos. The genus Leishmania contains multiple species that are responsible for a group of diseases, leishmaniasis. Current estimates suggest that 12 million people are infected. When parasites enter a human host, they undergo metacyclogenesis and acquire the ability to interact with macrophages. This interaction activites signal transduction pathways inducing numerous biological activities, including protein kinase CK2. CK2 has been observed in all eukaryotic cells residing in the nucleus, the cytoplasm and on the cell surface. It appears to have an essential function and recognizes serine/threonine or tyrosine residues in target proteins for phosphorylation. In the present study, we demonstrate that the treatment of L. donovani promastigotes with TBB resulted in inhibition of cell growth and showed an irreversible mechanism of action, however was not able to induce apoptosis in L. donovani promastigotes. The pre-treatment of promastigotes and macrophages, as well as the addition of TBB during infection induced a significant reduction in the number of amastigotes per macrophages, possibly via the mechanism of programmed cell death showed by TUNEL technique. Treatment of macrophages with TBB did not induce the increase of nitric oxide. Immunofluorescence assays demonstrated the presence of CK2α distributed throughout the surface the promastigotes. Uninfected macrophages showed little to no CK2α. After initiating the interaction of parasites with macrophages, CK2α was observed distributed preferentially in the nucleus of macrophages. Job data suggest that CK2 is an important enzyme for the biological activity of Leishmania donovani, and its study important relevance to the discovery of new therapeutic targets.

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MACHADO, Patrícia Isabel Pires. "Pyruvate kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficies and their association with malaria - population genetics and proteomic studies." Doctoral thesis, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 2013. http://hdl.handle.net/10362/11346.

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Abstract:

A malária é reconhecida como uma das principais forças selectivas a actuar na história recente no genoma humano. Inúmeros polimorfismos genéticos têm sido descritos como protectores contra a gravidade da malária, como o alelo HbS (designado de traço falciforme) e o alelo G6PD A- (associado à deficiência de G6PD). Mais recentemente, também a deficiência de PK foi associada com a protecção contra a malária. Evidências desta associação foram obtidas em estudos com modelos de roedor e estudos in vitro utilizando GV humanos deficientes em PK. Até à data, não foram obtidos dados em populações humanas que revelem esta associação: ainda não foi identificada uma variante de PK com uma prevalência elevada em regiões endémicas de malária e não foram identificadas marcas de selecção na região do gene que codifica para a PK (gene PKLR). Além disso, os mecanismos subjacentes à protecção contra a malária por deficiências enzimáticas dos GV não estão bem esclarecidos. Assim, os objectivos do presente estudo foram: investigar os polimorfismos genéticos humanos com associação com a malária em Cabo Verde; pesquisar marcas de selecção da malária na região do gene PKLR em populações Africanas; determinar a frequência da deficiência em PK e identificar uma eventual variante da enzima que possa estar sob selecção positiva em regiões endémicas de malária; avaliar o efeito das duas deficiências enzimáticas (PK e G6PD) na invasão e maturação do parasita em culturas in vitro de Plasmodium usando GV normais e deficientes; e analisar o perfil proteómico de GV infectados e não infectados, normais e com deficiência (em PK e G6PD), bem como de parasitas isolados de GV tanto deficientes como normais. Em Cabo Verde (área epidémica), não foram identificadas marcas de selecção pela malária, através da análise dos vários polimorfismos. No entanto, quando a análise foi realizada em dois países endémicos (Angola e Moçambique), foram detectadas várias marcas de selecção: a genotipagem de microssatélites (STRs) e polimorfismos de base única (SNPs) localizados na vizinhança do gene PKLR revelou uma diferenciação consideravelmente maior entre as populações Africana e Europeia (Portuguesa), do que a diferenciação determinada aquando da utilização de marcadores genéticos neutros. Além disso, uma região genómica de maior amplitude apresentou um Desequilíbrio de Ligação (LD) significativo no grupo de malária não grave (e não no grupo de malária grave), sugerindo que a malária poderá estar a exercer pressão selectiva sobre a região do genoma humano que envolve o gene PKLR. No estudo que incidiu na determinação da prevalência da deficiência de PK no continente Africano (realizado em Moçambique), esta revelou-se elevada - 4,1% - sendo o valor mais elevado descrito até ao momento a nível mundial para esta enzimopatia. Na pesquisa de mutações que pudessem estar na causa deste fenótipo (baixa actividade de PK), foi identificada uma mutação não sinónima 829G>A (277Glu>Lys), significativamente associada à baixa actividade enzimática. Esta mutação foi também identificada em Angola, São Tomé e Príncipe e Guiné Equatorial, onde a frequência de portadores heterozigóticos foi entre 2,6 e 6,7% (valores que se encontram entre os mais elevados descritos globalmente para mutações associadas à deficiência em PK). Não foi possível concluir acerca da associação entre a deficiência de PK e o grau de severidade da malária e da associação entre o alelo 829A e a mesma, devido ao baixo número de amostras. Os resultados dos ensaios de invasão/maturação do parasita sugeriram que, nos GV com deficiência de PK ou G6PD, a invasão (onde está envolvida a membrana do GV hospedeiro e o complexo apical do parasita) é mais relevante para a eventual protecção contra a malária do que a maturação. Os resultados da análise proteómica revelaram respostas diferentes por parte do parasita nas duas condições de crescimento (GV com deficiência de PK e GV com deficiência de G6PD). Esta resposta parece ser proporcional à gravidade da deficiência enzimática. Nos parasitas que cresceram em GV deficientes em G6PD (provenientes de um indivíduo assintomático), a principal alteração observada (relativamente às condições normais) foi o aumento do número de proteínas de choque térmico e chaperones, mostrando que os parasitas responderam às condições de stress oxidativo, aumentando a expressão de moléculas de protecção. Nos parasitas que cresceram em condições de deficit de PK (GV de indivíduo com crises hemolíticas regulares, dependente de transfusões sanguíneas), houve alteração da expressão de um maior número de proteínas (relativamente ao observado em condições normais), em que a maioria apresentou uma repressão da expressão. Os processos biológicos mais representados nesta resposta do parasita foram a digestão da hemoglobina e a troca de proteínas entre hospedeiro e parasita/remodelação da superfície do GV. Além disso, uma elevada percentagem destas proteínas com expressão alterada está relacionada com as fendas de Maurer, que desempenham um papel importante na patologia da infecção malárica. É colocada a hipótese de que a protecção contra a malária em GV deficientes em PK está relacionada com o processo de remodelação da membrana dos GV pelo parasita, o que pode condicionar a invasão por novos parasitas e a própria virulência da malária. Os resultados da análise do proteoma dos GV contribuirão para confirmar esta hipótese. Malaria has been recognized as the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Several human genetic polymorphisms have been described as protective against malaria severity, as the HbS allele (sickle cell trait) and G6PD A- allele (causing G6PD deficiency). More recently, PK deficiency has also been described as protective against malaria. Evidences were obtained in murine models and in vitro studies using PK-deficient human RBC. Human population data has not been obtained so far: a high prevalent PK variant has yet to be identified in malaria endemic regions and selection signatures in the genome region around RBC PKencoding gene (PKLR) have not been detected to date. Also, the mechanisms underlying malaria protection by RBC enzyme deficiencies are not clear. So, the objectives of this study were: to investigate malaria associated genetic traits in Cape Verde; to look for selection signatures in the PKLR gene region in African populations; to determine PK deficiency frequency and identify a prevalent PK variant that could be under selection by malaria in endemic African regions; to assess parasite invasion and maturation of Plasmodium falciparum growing in vitro in PK and G6PDdeficient and normal RBC; and to analyze the proteomic profile of non-infected and infected PK and G6PD-deficient and normal RBC as well as of parasites isolated from both deficient and normal host cells. In Cape Verde (epidemic area), no malaria selection signatures were found. However, when the analysis was performed in two malaria endemic countries (Angola and Mozambique), several selection marks were detected: data from Short Tandem Repeat (STR) and Single Nucleotide Polymorphic (SNP) loci spread along the PKLR gene region showed considerably higher differentiation between African and European (Portuguese) populations than that usually found for neutral markers, and a wider region showing strong Linkage Disequilibrium (LD) was found in the uncomplicated malaria group (and not in severe malaria group), suggesting that malaria may be shaping this genomic region in malaria countries. Additionally, when we performed the first study concerning the determination of PK deficiency prevalence in the African continent (in Mozambique), we were surprised with a high value: 4.1%. This was the higher frequency ever obtained for PK deficiency worldwide. Then, we looked for a mutation that could be in the origin of this phenotype and the missense mutation 829G>A (277Glu>Lys) was significantly associated. When we did a research of this mutation in other African countries (Angola, Sao Tome and Principe and Equatorial Guinea), the heterozygous carrier frequency was 2.6-6.7%, which is also among the highest heterozygous frequencies associated to PK deficiency described so far. We could not conclude about the association of PK deficiency and allele 829A with malaria outcome due to low sample number. Parasite invasion/maturation assays suggested that, in deficient RBC, the invasion step (or the cellular membranes) are more relevant for protection than maturation (the intracellular environment). Proteomic data from parasites growing in both G6PD and PK-deficient RBC revealed a distinct response from parasites growing in both deficient conditions, proportional to the phenotype severity. In parasites growing in G6PDdeficient RBC (asymptomatic individual), the main alteration was the increase of parasitic heat shock proteins and chaperones, showing that parasites are responding to oxidative stress conditions increasing the expression of protective molecules. In PKdeficient (transfusion-dependent individual with regular hemolytic crisis), a wider range of proteins displayed abundance alterations, the majority being down-expressed. The most represented biological processes in this response were hemoglobin digestion and protein trafficking/RBC remodeling. A high proportion of these altered proteins are related to Maurer’s clefts, which play important roles in the pathology of malaria infection. We hypothesized that protection against malaria in PK-deficient RBC is associated with the RBC membrane remodeling process by the parasite, which may lead to a reduction in invasion by new parasites and malaria virulence itself. Data on the RBC proteome will contribute to confirm this hypothesis.

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Galve, Murillo Iñaki. "Síntesis de pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-onas 2-arilamino sustituidas y derivados." Doctoral thesis, Universitat Ramon Llull, 2013. http://hdl.handle.net/10803/101403.

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Abstract:

Les Cinases de Proteïna (PKs) estan implicades en processos fonamentals de la regulació del cicle cel•lular. L’acumulació d’anomalies als mecanismes de control i el comportament disfuncional que se’n deriva han estat detectats a cèl•lules de diferents teixits afectades per càncer, desordres immunològics, endocrins, nerviosos, neurodegenaratius, cardiovasculars, malalties infeccioses, diabetis, Alzheimer, asma, restenosi, arteriosclerosi, leucèmia, artritis, etc. Però d’entre totes les PKs, les Cinases de Tirosina (TKs) han estat destacades com a l’element central de tots aquests processos i, per tant, han estat objecte d’una gegantina tasca investigadora que n’ha augmentat el seu innegable interès com a diana terapèutica. És per aquest motiu, que el desenvolupament d’inhibidors selectius de TKs ha esdevingut una àrea d’investigació molt activa. El Laboratori de Síntesi de l’IQS disposa d’una dilatada experiència de síntesi de compostos heterocíclics, especialment pirido[2,3-d]pirimidines, de gran semblança amb coneguts inhibidors de TKs. Malauradament, d’entre tots els building blocks emprats per les estratègies sintétiques desenvolupades, les guanidines (especialment les arilguanidines) sempre han limitat l’espai químic assequible per culpa de la poca diversitat d’aquests reactius comercialment disponibles. Per tant, l’objectiu fonamental d’aquest treball és desenvolupar una metodologia com més genèrica millor que permeti obtenir guanidines i, especialment arilguanidines, i que sigui compatible amb les eines sintètiques disponibles emprades per a l’obtenció massiva de pirido[2,3-d]pirimidines. Amb aquest objectiu s’optimitza un procediment de guanidinació d’amines amb àcid aminoiminometanosulfònic (AIMSOA, acrònim de l’anglès aminoiminomethanesulfonic acid) en metanol procurant acoblar-lo amb la reacció multicomponent de Victory. Desgraciadament els rendiments amb arilguanidines són baixos com a resultat de llur baixa nucleofília, llur degradació causada pel metanol i per la competència amb el dissolvent de reacció. Com a alternativa, s’assagen protocols de condensació de piridones en 1,4-dioxà per tal d’afavorir la nucleofília d’aquestes arilguanidines. Sorprenentment no s’obtenen directament les piridopirimidines sinó uns intermedis que després d’un procés de transposició de Dimroth donen lloc als heterobicicles esperats amb rendiments força superiors als descrits mitjançant altres metodologies. En darrer lloc, es planteja i estudia una nova proposta estratègica alternativa al tradicional plantejament del Laboratori de Síntesi de l’IQS per a la síntesi orientada a diversitat. Aquesta proposta implica la construcció de l’esquelet pirido[2,3-d]pirimidínic, seguida de la seva activació mitjançant bromació i diazotizació, i finalment introducció de la diversitat química desitjada. Arran d’aquest estudi s’ha obtingut i aïllat un intermedi de Wheland bicíclic mai descrit fins ara i que posteriorment és transformat per tractament amb DMSO en un terme piropirimidínic dibromat i deshidrogenat a l’anell piridònic. A més a més, s’han desenvolupat eines sintètiques per obtenir sistemes 4-oxopirido[2,3-d]pirimidínics partint de llurs anàlegs 4-amino, metodologies que són una alternativa molt atractiva de les estratègies ja desenvolupades. Las Quinasas de Proteína (PKs) se hallan implicadas en procesos fundamentales de la regulación del ciclo celular. La acumulación de anomalías en los mecanismos de control y el consiguiente comportamiento disfuncional han sido detectados en células de diferentes tejidos afectadas por cáncer, desórdenes inmunológicos, endocrinos, nerviosos, neurodegenarativos, cardiovasculares, enfermedades infecciosas, diabetes, Alzheimer, asma, restenosis, arteriosclerosis, leucemia, artritis, etc. Pero de entre todas las PKs, las Quinasas de Tirosina (TKs) han demostrado ser un elemento central en todos estos procesos y, por tanto, han atraído sobre sí un enorme esfuerzo investigador que ha remarcado, su innegable interés como diana terapéutica. Así pues, el desarrollo de inhibidores selectivos de TKs se ha convertido en un área muy activa de investigación. El Laboratorio de Síntesis del IQS posee amplia experiencia en la síntesis de compuestos heterocíclicos, en especial pirido[2,3-d]pirimidinas, de gran similitud con inhibidores conocidos de TKs. Ahora bien, de todos los building blocks empleados en las estrategias sintéticas desarrolladas, las guanidinas (especialmente las arilguanidinas) siempre han limitado el espacio químico asequible por la poca diversidad de estos reactivos comercialmente asequibles. Por consiguiente, el objetivo fundamental del presente estudio es desarrollar una metodología para la obtención de guanidinas y, en especial de arilguanidinas, que sea compatible con las herramientas sintéticas disponibles para la obtención masiva de pirido[2,3-d]pirimidinas. A tal efecto se optimiza una guanidinación de aminas con ácido aminoiminometanosulfónico en metanol con vistas a poder acoplarlo con la reacción multicomponente de Victory. Desgraciadamente los rendimientos con arilguanidinas son bajos como consecuencia de su baja nucleofilia, su degradación por efecto del metanol y el efecto competente del disolvente de reacción. Para circunvalar este contratiempo se ensayan reacciones de condensación de piridonas en 1,4-dioxano para favorecer la nucleofilia de estas guanidinas. Sorpredentemente no se obtienen directamente las piridopirimidinas sino unos intermedios que tras un proceso de transposición de Dimroth rinden los heterobiciclos deseados con rendimientos bastante superiores a los referidos para otras metodologías. Por último, se propone y estudia una estrategia alternativa de síntesis orientado a diversidad. En este sentido, se construye el esqueleto pirido[2,3-d]pirimidínico para después activarlo mediante bromación y diazotización, y finalmente introducir la diversidad deseada. Fruto de este estudio se ha obtenido y aislado un intermedio de Wheland bicíclico que posteriormente rinde un término piropirimidínico dibromado y deshidrogenado en el anillo piridónico. Adicionalmente, se han desarrollado herramientas sintéticas para la obtención de sistemas 4-oxopirido[2,3-d]pirimidínicos a partir de sus análogos 4-amino. Protein Kinases (PKs) are involved in basic cellular cycle regulatory mechanisms. Deregulation of those has been found on cells of different tissues with cancer, immunological disorders, endocrine disorders, nervous disorders, neurodegenerative disorders, cardiovascular disorders, infectious diseases, diabetes, Alzheimer syndrome, asthma, restenosis, atherosclerosis, leukemia, arthritis, and more. Among all the PKs huge family, Tyrosine Kinases (TKs) have been described as key point of those regulatory mechanisms and so stated as promising drug targets for treating such diseases. As a result of this biological knowledge, there have been a lot of developments in this field, resulting in some interesting and commercial TKs selective inhibitors. The Laboratori de Síntesi de l’IQS has developed some highly efficient heterocyclic synthetic procedures, especially for the synthesis of pyrido[2,3-d]pyrimidines that are structurally closely related to some well stated TKs inhibitors. Unfortunately, some of the building blocks used in those methodologies have a very narrow commercial variety and are only available from unusual vendors. This is the case for arylguanidines. As a result, the accessible chemical space is shortened. So then, the present work deals with the establishment of general procedures for the synthesis of arylguanidines and how to couple them with our previous described methodologies in order to obtain pyrido[2,3-d]pyrimidine libraries. Aminoiminomethanesulfonic acid (AIMSOA) is selected as guanidination agent and a protocol is optimized by Experimental Design. The coupling of this guanidination with the one-pot multicomponent Victory reaction is also studied. Unfortunately, coupling reaction yields with arylguanidines are very low as a result of lack of nucleophilicity, methanol mediated degradation and nucleophilic competition with this reaction solvent. Pyridone condensation with arylguanidines in 1,4-dioxane is stated as methodological alternative in order to improve nucleophilicity of the arylguanidines. Surprisingly, this procedure does not yield the expected pyridopyrimidines but a family of new, not previously described, heterobicyclic compunds that can be converted to the desired pyridopyrimidines through Dimroth rearrangement. The overall yields for the final pyridopyrimidines are higher with this new procedure than with the previous methodologies. Finally, a new global strategy is developed for the diversity oriented synthesis of 2-arylamino substituted pirido[2,3-d]pyrimidines. Firstly, the heterobicyclic skeleton is build and, secondly, this skeleton is activated by bromination and diazotization. Finally, diversity is introduced by substitution reactions. During this development a pyridopyrimidine Wheland intermediate, never described before ,has been isolated and its structure spectroscopically confirmed. The subsequent treatment of this compound with DMSO yields a new dibrominated pyridopyrimidine dehydrogenated on the pyridone ring. In addition, some synthetic procedures for the conversion of 4-aminopirido[2,3-d]pyrimidines into their 4-oxo analogues have been established. Such methodologies are auseful alternative to our old strategies for the synthesis of this kind of compounds.

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Nobre, Raquel Margarida de Albuquerque. "Inibidores de tirosina cinases utilizados na quimioterapia do cancro." Master's thesis, 2014. http://hdl.handle.net/10451/26863.

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Abstract:

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014 A maioria dos fármacos com aplicação em oncologia que se encontram actualmente em desenvolvimento baseiam-se no conceito de targeted therapy. As proteínas tirosina cinases (TKP) são um alvo particularmente importante uma vez que a sua desregulação tem sido associada a uma grande variedade de doenças oncológicas. As TKP são mediadores cruciais em vias de sinalização associadas à proliferação celular, diferenciação, migração, angiogénese, regulação do ciclo celular, entre outras. Nas células cancerígenas, a ocorrência de mutações tornam as TKP constitutivamente activas, conduzindo a um descontrolo destes processos. As opções terapêuticas para doentes oncológicos têm sido decepcionantes, uma vez que a quimioterapia citotóxica standard está associada a graves efeitos secundários e não é eficaz contra alguns tipos de cancro. A aplicação prática do conceito de targeted therapy, que foi introduzida nos últimos anos, permite uma terapêutica dirigida contra moléculas e vias de sinalização associadas ao cancro, com menor toxicidade. A selectividade apresentada pelos diferentes inibidores de tirosina cinases (TKI) desenvolvidos é conseguida por diferentes mecanismos. A selecção preferencial de um determinado inibidor dependerá da constituição genética do doente e do tumor.

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Pereira, Daniela Barroso da Cunha. "Modulação da libertação de glutamato por mecanismos de sinalização intracelular envolvento cinases de resíduos de tirosina no hipocampo adulto." Doctoral thesis, 2003. http://hdl.handle.net/10316/10174.

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Ferreira, Elisa Margarida Martinho. "Novos fármacos no tratamento do carcinoma da tiroide." Master's thesis, 2014. http://hdl.handle.net/10316/37300.

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Baldeiras, Inês Esteves. "Regulação da secreção pulsátil de insulina em ilhéus pancreáticos por isoformas da proteína cinase C." Doctoral thesis, 2003. http://hdl.handle.net/10316/1607.

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Abstract:

Tese de doutoramento em Bioquímica (Biofísica Celular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de Coimbra A célula b pancreática tem a capacidade de libertar, de forma pulsátil, a insulina pré-armazenada, em resposta a um aumento da concentração plasmática de glicose. Embora os mecanismos iónicos subjacentes à iniciação da secreção de insulina pela glicose estejam razoavelmente bem caracterizados e o Ca2+ esteja bem estabelecido como o principal indutor de secreção, é sabido que estes não constituem os únicos factores que regulam o processo secretor. De facto, na base da segunda fase da secreção encontram-se mecanismos de amplificação, dependentes do metabolismo da glicose, que premitem que um aumento da [Ca2+]i dê origem a uma secreção sustentada de insulina. Por outro lado, a resposta secretora da célula b à glicose é modulada pela activação de receptores membranares acoplados a sistemas de amplificação da libertação de insulina. O objectivo principal deste trabalho consistiu em contribuir para o esclarecimento dos factores amplificadores da secreção pulsátil de insulina induzida por Ca2+ intracelular em ilhéus isolados, com particular destaque para a proteína cinase C. Para levar a cabo este trabalho utilizaram-se ilhéus isolados de ratinho e várias técnicas bioquímicas e de biofísica celular (com especial destaque para a medição da [Ca2+]i por microfluorescência de fura-2 e de secreção de 5-HT/insulina por microamperometria). Em extractos totais de ilhéus de ratinho foram detectadas uma isoforma ‘convencional’(PKC-a), uma ‘nova’(PKC-e) e duas ‘atípicas’ (PKC-l e -?). Os resultados indicam que a activação da PKC desempenha um importante papel na estimulação colinérgica da secreção pulsátil de insulina, muito embora não tenha um efeito detectável na secreção induzida por glicose. A estimulação colinérgica é especificamente mediada por PKC –a, enquanto que a acção do éster de forbol PMA parece resultar da activação conjunta das duas isoformas da PKC dependentes de DAG (PKC-a e-e).

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Correia, Susana Maria dos Santos. "Endereçamento da subunidade GluR4 dos receptores AMPA para a sinapse : função da interação com a proteína cinase Cy." Doctoral thesis, 2004. http://hdl.handle.net/10316/1655.

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Sena, Cristina Maria Tristão. "Regulação de canais de Ca2+ e receptores membranares por isoformas da proteína cinase C em células cromafins." Doctoral thesis, 2000. http://hdl.handle.net/10316/1603.

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Abstract:

Tese de doutoramento em Bioquímica (Biofísica Celular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia da Univ. de Coimbra As células cromafins da medula adrenal segregam catecolaminas, neuropéptidos e outras substâncias em resposta a estimulação do nervo esplâncnico. Canais de Ca2+ sensíveis à voltagem (VSCCs) são sujeitos a regulação por processos de fosforilação mediados por várias cinases incluindo a proteína cinase C (PKC). O principal objectivo deste trabalho consistiu em identificar e caracterizar as isoformas da PKC presentes nas células cromafins, determinar os VSCCs sensíveis à PKC e determinar as isoformas eventualmente envolvidas na regulação dos canais por processos de fosforilação mediados pela PKC. Immunoblots de extractos celulares detectaram a presença de quatro isoformas da PKC: PKC- a, e, z e i. A caracterização dos padrões cinéticos, de down-regulation (após tratamento prolongado com ésteres de forbol) e translocação do citossol para a membrana (exposições relativamente breves) destas isoformas foi utilizado para determinar a especificidade de isoformas envolvida na regulação de VSCCs/receptores por processos de fosforilação mediados pela PKC. Os ésteres de forbol inibem VSCCs em células cromafins. Este efeito é mediado por mecanismos que envolvem a activação da PKC e parecem envolver preferencialmente o canal de Ca2+ do tipo L. Activadores e inibidores selectivos da PKC foram utilizados para investigar o envolvimento das diferentes isoformas da PKC na modulação dos VSCCs. As correntes de Ca2+ foram registadas por patch-clamp (configuração whole-cell). A inibição das correntes de Ca2+ induzida por PDBu foi revertida pelo inibidor específico da PKC Ro 31-8220 (10 µM) mas não foi afectada por Gö 6976 (10 µM), um inibidor selectivo das cPKC (PKC clássicas: PKC-a nestas células cromafins). A inibição dos VSCCs pela PKC é especificamente mediada pela PKC-e. As diferentes isoformas da PKC poderão ter um papel muito importante na regulação de processo neuronais que envolvem neurotransmissores inibitórios. Diferentes receptores acoplados a fosfolipase C são diferencialmente regulados pelas isoformas da PKC, em células cromafins de bovino. Assim, a PKC-e regula resposta mediadas pelo receptor B2 de bradiquinina. Em contraste, respostas mediadas pelo receptor H1 de histamina são reguladas pela PKC-a.

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Loureiro, Cláudia Almeida. "Reguação dos níveis de transportadores de cloreto na membrana plasmática de células renais pela nova via de sinalização WNK4/SYK." Master's thesis, 2012. http://hdl.handle.net/10451/9263.

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Abstract:

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012 A hipertensão arterial afeta, em países ocidentais, quase um terço da população adulta, sendo um fator de alto risco para a doença cardiovascular ou o acidente vascular cerebral. O pseudohipoaldosteronismo tipo II, ou síndroma de Gordon, é uma forma rara de hipertensão familiar, caracterizada pela ocorrência de hipertensão acompanhada por hipercalemia, e causado por mutações nos genes WNK1 e WNK4. Os mecanismos moleculares subjacentes a esta condição envolvem a regulação da homeostase renal de eletrólitos, principalmente nos túbulos distais do nefrónio onde ocorre a modulação de diversos canais iónicos e transportadores através da cooperação das proteínas cinases WNK, como do canal de potássio ROMK e do cotransportador de sódio e cloreto NCC. A WNK1 e WNK4 ativam as cinases OSR1 e SPAK, que por sua vez fosforilam diretamente as proteínas da família SLC12 (NCC, NKCC1 e NKCC2), ativando o transporte iónico. A subfamília das proteínas cinases WNK (with-no-lysine [K]) pode regular a atividade dos vários canais iónicos envolvidos na homeostase de sódio, potássio e cloreto através da sua fosforilação como também o número de canais proteicos expressos na membrana plasmática (MP). Num estudo realizado recentemente sobre a regulação do canal de cloreto CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Condutance Regulator), verificou-se que a presença de WNK4 aumenta também a quantidade de CFTR na MP. O mecanismo é diferente e envolve um papel antagonista ao da tirosina cinase Syk (spleen tyrosine kinase), que fosforila a proteína CFTR e promove a sua remoção da MP, uma atividade inibida pela WNK4. O alvo da regulação é o resíduo tirosina 512 da CFTR, localizado num motivo de consenso da cinase Syk. Este motivo peptídico especifico foi, por sua vez encontrado na sequência primária de mais dois canais iónicos: NKCC2 e KCC3. O primeiro é um cotransportador renal de sódio, potássio e cloreto que facilita o influxo de sódio e cloreto nas células enquanto o segundo compensa com o efluxo de potássio e cloreto e tem expressão renal e neuronal. Ambos são importantes para a homeostase eletrolítica nos rins e na manutenção da tensão arterial. O presente estudo teve como objetivo verificar experimentalmente o envolvimento da via WNK4/Syk na regulação dos canais renais NKCC2 e KCC3, nomeadamente se a Syk fosforila os canais in vitro, e realizou-se em três fases. Numa primeira fase, foram analisadas as sequências dos canais renais NKCC2 e KCC3 no sentido de selecionar fragmentos dos respetivos domínios N-terminais que contêm os motivos de fosforilação pela Syk e que apresentavam uma previsão computacional de gerarem proteínas recombinantes solúveis. Estes fragmentos foram clonados no plasmídeo pET-28a e as respetivas proteínas recombinantes expressas em bactérias. Após a lise das bactérias por sonicação, verificou-se que a maioria das proteínas se encontrou na fração solúvel, confirmando experimentalmente a previsão bioinformática. De seguida, procedeu-se à purificação das proteínas recombinantes a partir do lisado bacteriano. Na segunda fase, foi avaliado em ensaios de fosforilação in vitro se os substratos recombinantes produzidos anteriormente são substratos da cinase Syk. Estes ensaios foram realizados com a cinase imunoprecipitada a partir de células HEK 293T transfectadas com os construtos Syk-wt, Syk-kd e com o vetor não recombinante. Para além dos fragmentos recombinantes das proteínas NKCC2 wt e KCC3 wt foram também utilizados os fragmentos mutantes, NKCC2 Y45F e KCC3 Y63F. Estes mutantes possuem uma substituição no resíduo de tirosina, local de fosforilação pela cinase Syk. Nestes ensaios, observou-se claramente a fosforilação dos canais renais NKCC2 wt e KCC3 wt por parte da cinase Syk-wt. Para além disso, observou-se também uma fosforilação residual dos canais mutantes pela Syk-wt. Numa terceira fase, identificou-se a expressão da proteína NKCC2 endógena numa linha celular renal, indicando assim um modelo celular para o estudo do canal in vivo. Esta fase tem como objetivo determinar o efeito que a transfecção de células renais com Syk e WNK4 terá sobre a quantidade na membrana plasmática dos dois canais renais em estudo. O presente trabalho contribuiu para a compreensão da regulação dos referidos canais iónicos a partir da via Syk/WNK4. A validação da fosforilação dos dois canais justifica agora um estudo mais alargado que visa caracterizar mais um modo de atuação de WNK4 sobre a homeostase eletrolítica nos rins, como também a contribuição desta via para a hipertensão. Assim, este estudo poderá identificar novos alvos terapêuticos no tratamento da hipertensão arterial. Arterial hypertension affects one third of the Western population and constitutes a remarkable risk factor for cardiovascular disease and stroke. Pseudohypoaldosteronism type II or Gordon's syndrome is a rare familial form of hypertension characterized by increased renal salt reabsorption accompanied by hyperkalemia, and caused by mutations in the WNK1 and WNK4 genes. These encode protein kinases regulating renal electrolyte homeostasis through modulation of several membrane transporters and ion channels. In a recent study on the regulation of the chloride channel CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Condutance), the presence of WNK4 was described to increase the amount of CFTR at the cell surface. The underlying mechanism involves tyrosine kinase Syk (Spleen tyrosine kinase), that phosphorylates CFTR protein and promotes its removal from the plasma membrane being this activity inhibited by WNK4. The target residue is CFTR tyrosine 512, located in a Syk-consensus motif. Thus, the WNK4/Syk interplay identified may also operate in the regulation of other chloride cotransporters that contain this consensus motif. Among different transport proteins, this motif was identified in the sequence of two ion channels, NKCC2 and KCC3, which are important for electrolyte homeostasis in the kidney and blood pressure regulation. The goal of this work was to assess experimentally whether the WNK4/Syk pathway could be involved in the regulation of renal channels NKCC2 and KCC3, particularly if Syk can phosphorylate these channels in vitro. In order to achieve this, NKCC2 and KCC3 peptide sequences were first analysed with the objective of selecting fragments that contain the recognition motifs of Syk and that have a computational prediction of generating recombinant soluble proteins. Then, the recombinant proteins were expressed in bacteria, which were lysed by sonication and the soluble fraction purified. Subsequently, the recombinant substrates produced above were tested in in vitro phosphorylation assays and a strong phosphorylation of renal channels NKCC2 wt and KCC3 wt by Syk was observed. Finally, expression of the endogenous NKCC2 protein was identified in a renal cell line, suggesting that this line can be a suitable model for studying the effect of channel phosphorylation in vivo. The results of this study contribute to understand the regulation of ion channels via the WNK4/Syk pathway and a new mode of operation of WNK4 in the regulation of electrolyte homeostasis in the kidney, related to hypertension.

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Rodrigues, Maria do Amaral. "ALK e Cancro do Pulmão: o futuro é hoje?" Master's thesis, 2016. http://hdl.handle.net/10316/37157.

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Abstract:

Trabalho final do 6º ano médico com vista à atribuição do grau de mestre (área científica de pneumologia) no âmbito do ciclo de estudos de Mestrado Integrado em Medicina. O cancro do pulmão ocupa um lugar de destaque no que diz respeito ao número de mortes por patologia tumoral. É responsável pela maior taxa de mortalidade a nível mundial, pelo que o seu tratamento constitui um claro desafio para a medicina moderna. Na última década, testemunhámos uma mudança significativa na abordagem terapêutica dos doentes com cancro do pulmão de não pequenas células (CPNPC), principalmente devido à identificação de alterações oncogénicas-chave que abriram portas à utilização de terapêuticas direcionadas com resultados entusiasmantes. O presente artigo de revisão focou a modificação recente das linhas orientadoras do tratamento de um subgrupo específico de doentes com cancro do pulmão, doentes com CPNPC ALK positivos, no contexto da oncologia moderna, e foi conseguido através de uma revisão da literatura referente ao surgimento, aplicabilidade e desenvolvimento destas novas terapêuticas. Este paradigma foi estabelecido pela primeira vez com a descoberta de mutações no recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), associadas a elevada sensibilidade ao inibidor da tirosina-cinase (TKI) Gefitinib. Posteriormente, o ALK, um gene que codifica uma proteína tirosina cinase recetora identificada primariamente em linfomas anaplásicos, foi também ligado à atividade tumoral nos CPNPC em 2007, através da descoberta de rearranjos surpreendentemente responsivos a um inibidor da ALK-cinase, o Crizotinib. A sua extraordinária atividade e franco benefício clínico, nos doentes selecionados com os rearranjos (ALK positivos), levaram à sua aprovação acelerada pela FDA (Food and Drug Administration) em 2013. Contudo, e apesar deste novo fármaco constituir uma primeira linha em doentes devidamente selecionados, conduzir a um aumento da sobrevida, da qualidade de vida e induzir remissões, parece ainda não assegurar a cura, visto que, durante o tratamento, os doentes desenvolvem resistências. Este obstáculo tem motivado novas linhas de investigação com o aparecimento de inibidores de segunda geração e redirecionamento de abordagens, fazendo crer que é efetivamente possível melhorar o prognóstico destes doentes, num futuro próximo. Lung neoplasms are the number one cause of cancer related deaths. They are responsible for the highest mortality rate worldwide and constitute an imminent challenge to modern medicine. Over the last decade, we witnessed a significant change in therapies concerning patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), mainly due to the identification of key oncogenic markers that widened the use of targeted therapies with encouraging results. This review focused on the recent changes in the guidelines concerning the treatment of a specific subgroup of patients with lung cancer, positive for NSCLC ALK, and was achieved through a review of the literature concerning the appearance, applicability and development of these new therapies. This paradigm was first established with the discovery of mutations in the epidermal growth fator receptor (EGFR) that were highly sensitive to the tyrosine kinase inhibitor (TKI) Gefitinib. Subsequently, ALK, a gene encoding a tyrosine kinase receptor identified primarily in anaplastic lymphomas, was linked to tumor activity in NSCLC in 2007, through the discovery of rearrangements that are surprisingly responsive to an ALK kinase inhibitor, Crizotinib. Furthermore, its extraordinary activity and clear clinical benefit in selected patients (ALK positive), led to its accelerated approval by the FDA (Food and Drug Administration) in 2013. However, despite being the first-line of treatment in selected patients, leading to increased survival rates, quality of life and even inducing remissions, it does not seem to be a definitive cure, since patients are likely to develop resistances during treatment. This setback motivated not only new researches, leading to the arrival of second generation inhibitors but also changes in the approach of these patients. These developments made us believe that it is indeed possible to improve the prognosis of these patients in a nearby future.

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Castanheira, Sara Antunes. "Efeitos genómicos dos androgénios na atividade dos canais de potássio a nível vascular." Master's thesis, 2014. http://hdl.handle.net/10400.6/5664.

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Abstract:

Globalmente, as doenças cardiovasculares são consideradas umas das principais causas de morbilidade e mortalidade. O papel dos androgénios no envolvimento destas doenças tem vindo a ser estudado e evidenciam um efeito protetor sobre o sistema cardiovascular. Diversos estudos indicam que a testosterona possui um efeito vasodilatador sobre diversos vasos sanguíneos, incluindo a artéria umbilical humana. Este efeito é mediado pela ativação da PKG que posteriormente ativa os canais BKCa e KV. Estudos recentes demonstram que os efeitos genómicos dos androgénios promovem alterações nas subunidades dos canais iónicos, nomeadamente na subunidade ß1 dos canais BKCa e na subunidade a1c dos canais de Ca2+ tipo L. Estas modificações parecem influenciar a funcionalidade destes canais. O principal objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos genómicos dos androgénios nas células musculares lisas de artérias umbilicais humanas a nível da atividade dos canais de potássio. Utilizou-se técnica de Patch-clamp para analisar a corrente de potássio nas células musculares lisas da artéria umbilical. Foi estudado o efeito de diferentes inibidores de canais de potássio em células incubadas e não incubadas com DHT (10nM) para posterior comparação. Estudou-se também o efeito dos androgénios nestas células a nível da contratilidade através da técnica de PCSA. Foram utilizadas células não incubadas e incubadas com DHT (10nM) e adicionados inibidores de proteínas cinases (KTa e KTg) de modo a averiguar se o efeito sobre a PKA e PKG seria igual em efeitos genómicos. Os resultados demonstram que a corrente de K+ observada em HUASMC é devida aos canais BKCa e KV e que os efeitos genómicos dos androgénios envolvem a ativação de canais KV. Também se verificou que a adição da KTg promove uma diminuição no relaxamento induzido pelo ANP e SNP, por conseguinte o efeito vasodilatador do SNP e ANP envolve a ativação da PKG. Finalmente demonstrou-se que os efeitos genómicos e não genómicos dos androgénios contribuem para o mesmo efeito. Assim, os efeitos genómicos dos androgénios na atividade dos canais de potássio mostraram ser dependentes dos canais KV e similares aos efeitos não genómicos. Globally cardiovascular diseases are considered a major cause of morbidity and mortality. The role played by androgens in these diseases has been studied and evidences a protective effect on the cardiovascular system. Several studies indicate that testosterone has a vasodilatory effect on various blood vessels, including the human umbilical artery. This effect is mediated by activation of PKG which subsequently activates BKCa and KV channels. Recent studies show that the genomic effects of androgens promote changes in ion channel subunits, including ß1 subunit of the BKCa channels and a1c subunit of the L-type Ca2+ channels. These changes appear to influence the functioning of these channels. The main objective of this work was to analyze the genomic effects of androgens on smooth muscle cells of the human umbilical arteries at the level of activity of potassium channels. Patch-clamp technique was used to analyze the potassium current in smooth muscle cells from the umbilical artery. The effect of different potassium channels inhibitors was studied in cells incubated and not incubated with DHT (10 nM) for comparison. Also studied was the effect of androgens in these cells at the level of contractility throught the PCSA technique. Cells which were incubated with DHT (10 nM) and cells which were not incubated were used and added protein kinase inhibitors (KTa and KTg) in order to determine that the effect on PKA and PKG is equal in genomic effects. The results demonstrate that the K+ current in HUASMC is due to the BKCa and KV channels and genomic effects of androgens involving activation of KV channels. Another conclusion was that the addition of KTg promotes a decrease in the relaxation induced by SNP and ANP, so the vasodilator effect of SNP and ANP involve the activation of PKG. Finally it was proved that genomic and non-genomic effects of androgen contribute to the same effect. Thus, the genomic effects of androgens on the activity of potassium channels are dependent on KV channels and similars to the non-genomic effects.

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Ribeiro, Sérgio Tiago de Freitas 1989. "Molecular mechanisms controlling the survival and differentiation of human yσ thymocytes". Doctoral thesis, 2016. http://hdl.handle.net/10451/28402.

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Abstract:

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Imunologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017 Among the various leukocyte populations that build up the immune defense against infections and tumors, γδ T lymphocytes constitute an enigmatic lineage whose molecular mechanisms of differentiation and activation are still poorly understood. The key roles played by γδ T cells in immunity critically depend on their survival, activation and differentiation into effectors capable of secreting cytokines and killing infected or transformed cells. These processes are controlled, at the molecular level, by surface receptors that capture key extracellular cues and convey downstream intracellular signals that regulate both lymphocyte physiology and pathology. In this PhD thesis we evaluated the contribution of cell receptor signaling pathways to human γδ T cell differentiation and activation. Firstly, we showed that human γδ thymocytes are functionally immature and their differentiation program requires additional IL-2 or IL-15 signals to drive their differentiation into IFN-γ and TNF-α producers endowed with potent cytotoxicity against leukemia targets. We further elucidated the signals involved in normal/ healthy γδ T cell maintenance as well as in γδ T cell tumorigenesis. We identified that the protein kinase CK2 (Casein Kinase 2) is overactivated in the γδ T cell lineage compared to αβ counterparts. We further showed that the clinical grade-inhibitor of CK2, CX- 4945, impairs γδ T cell survival by inhibiting the CK2/AKT/mTOR/GSK3β signaling pathway. Moreover, we showed that CK2 is hyperactivated in γδ T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) samples, compared to both normal γδ T cells and αβ T-ALL. Importantly, we demonstrated a high sensitivity of γδ T-ALL cells to CX- 4945 treatment in vitro and in vivo, thus supporting the use of CK2 inhibitors as a putative therapy for γδ T-ALL. Overall, the data presented in this thesis provided new evidences indicating that: (i) human γδ thymocytes are functionally immature and require IL-2 or IL-15 to differentiate into type 1 cytotoxic effector lymphocytes; (ii) the protein kinase CK2 is a novel determinant of both healthy and leukemic γδ T cell survival; and (iii) the CX-4945 chemical inhibitor is a promising therapeutic approach for γδ T-ALL. European Research Council (ERC); Excellence in Life Sciences (EMBO); Foundation Arc Pour Sur Le Cancer; Sociedade Portuguesa de Imunologia; European Federation of Immunological Societies (EFIS); Gabinete de Apoio à Investigação Científica Tecnológica e Inovação (GAPIC)

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Barata, Joana Ribeiro. "The role of PKCd [delta] as a regulator of the Nox1 contribution for the mechanism of paraquat induced dopaminergic neurotoxicity." Master's thesis, 2010. http://hdl.handle.net/10400.6/3938.

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Abstract:

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by the selective loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SN) pars compacta (SNpc), to which contribute the combination of aging and genetic and environmental factors. Several studies clearly showed an increase in the incidence of PD in rural environments, and hypothesized the involvement of pesticides, like paraquat (PQ), in the mechanisms of neurodegeneration. PQ can be reduced by the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (Nox) enzyme and can induce its toxicity through the production of superoxide anions, which leads to the accumulation of reactive oxygen species (ROS) in the cell. Matsuzaki and its collaborators showed that ROS formation induced by PQ facilitate α-synuclein association, a biochemical hallmark of PD. The Nox system generates ROS in a regulated manner, producing ROS in various tissues. It has been suggested that Nox1 subunit plays a role in plays a role in the oxidative stress and subsequent DA cell death elicited by PQ. Protein kinase C delta (PKCδ) has been showed to be involved in apoptotic signaling pathways, by phosphorylation and activation of several inducers of cell death. PQ induces an increase of ROS production and death of DA neurons. In the present work we aimed to investigate in PQ exposed cells the possible relationship between ROS generation by Nox1 and the putative regulatory effect of PKCδ in the process. To investigate whether PKCδ influences ROS production, DA cell death and Nox1 expression, short interference RNA (siRNA) was used to specifically knockdown PKCδ. Transfection with PKCδ-siRNA decrease mRNA levels by 32% and protein levels by 54%. We observed that ROS and DA cell death induced by PQ were significantly reduced by PKCδ knockdown, in N27 cells transfected with PKCδ-siRNA. This study also revealed that, in DA neurons, the upregulation of Nox1 mRNA and protein induced by PQ exposure is reversed when PKCδ is knockdown, suggesting a possible involvement of PKCδ in the regulation of Nox1 expression pathways affected by PQ.

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Gonçalves, Maria Inês Cardoso. "O papel do DNA-PKcs na transcrição mediada pelo promotor LTR do HIV-1." Master's thesis, 2017. http://hdl.handle.net/10451/31528.

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Abstract:

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 O DNA-PK (Cinase dependente de DNA) é um complexo proteico nuclear que requer uma associação com o DNA para exercer a sua atividade cinásica. Este complexo é constituído por duas componentes: uma subunidade catalítica de 450 kDa (DNA-PKcs) que se trata de uma cinase de serinas e treoninas, e um heterodímero regulador designado por autoantigénio Ku composto por duas subunidades (Ku70/80). Atualmente, sabe-se que DNA-PK participa em vários processos celulares, nomeadamente ao nível do controlo da transcrição, na regulação dos genes do metabolismo celular e na manutenção dos telómeros. No entanto, a sua principal função está relacionada com a reparação de quebras de cadeia dupla no DNA, através do mecanismo NHEJ (Non-homologous end joining), que é crucial para a integridade dos linfócitos e para a reparação de quebras de dupla cadeia no DNA. Em consequência, levantou-se a hipótese do envolvimento de DNA-PK no processo de integração do provírus do HIV-1, mas os resultados obtidos geraram controvérsia. Anteriormente, neste laboratório, surgiram evidências de que DNA-PK poderia estar envolvido na transcrição, a partir do LTR do HIV-1 (HIV-1 Long-Terminal Repeat): observou-se que o silenciamento de DNA-PKcs, através da aplicação de shRNA, resulta numa diminuição dos níveis de transcrição viral. No entanto, os mecanismos subjacentes à função deste complexo no processo de transcrição ainda estão por esclarecer. Neste estudo, examinou-se a capacidade do complexo DNA-PK modular a atividade transcricional, a partir do promotor localizado ao nível do LTR viral. Para isso, transfetaram-se células HeLa-P4 e TZM-bl com várias quantidades do plasmídeo pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg) apenas ou na presença de pCMV-Tat, que expressa Tat, o transativador do LTR. Os resultados destas experiências demonstraram que DNA-PK não tem a capacidade de transativar, por si só, o LTR do HIV-1 e o promotor pCMV, existente nos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs. Para além disto, observou-se um aumento dos níveis de transativação, a partir do LTR viral, na presença de pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs, apenas nas células TZM-bl que têm um LTR do HIV-1 integrado completo (nt -454 a +181). As células HeLa-P4 também têm um LTR integrado mas de tamanho pequeno (nt -138 a +80), o que indica que podem existir elementos cis em falta neste LTR, necessários para a sinergia observada entre a proteína Tat e o complexo DNA-PK, no processo de transcrição, a partir do LTR do HIV-1. Para confirmar estes resultados, foram produzidos três LTR de diferentes tamanhos e posteriormente, células 293T foram transfetadas com cada um dos LTR em separado e duas quantidades de pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg), apenas ou na presença de pCMV-Tat. Contrariamente aos resultados obtidos previamente, verificou-se que afinal o LTR pequeno (nt -138 a +80), presente nas células HeLa-P4, tem os elementos cis suficientes para o aumento da transativação do LTR viral, mediada por Tat, na presença de DNA-PK. Estudos recentes demostraram que três locais de ligação para o fator de transcrição Sp1 (Proteína de Especificidade 1) no promotor, e dois locais de ligação para NF-kB, na região enhancer, parecem ser os elementos chave envolvidos na regulação da transcrição viral, a partir do LTR do HIV-1. Para além disto, Tat e DNA-PK parecem interagir, aumentando o estado de fosforilação de Sp1, que resulta no aumento da expressão do LTR viral. Colocou-se então a hipótese dos locais de ligação para Sp1 corresponderem aos elementos cis responsáveis pelo aumento da transativação do LTR pela Tat, na presença de DNA-PKcs. Deste modo, construiu-se um novo LTR apenas com os três locais de ligação para o fator de transcrição Sp1, presentes na região nuclear do promotor viral, através de experiências de clonagem simples. Uma vez construído o novo LTR, ao qual se atribui a designação de LTRSp1, transfetaram-se células 293T com este LTR e duas quantidades de pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg) apenas ou na presença de Tat. Os resultados destas experiências demonstraram que houve atividade sinergética entre Tat e DNA-PK, que leva ao aumento da transativação do novo LTR viral. Por último, experiências recorrendo ao inibidor NU7026, específico para a atividade catalítica de DNA-PK, permitiram concluir que é a subunidade catalítica deste complexo (DNA-PKcs) que está envolvida no aumento dos níveis de transativação viral. Em qualquer conjunto de experiências efetuadas, no decorrer deste estudo, não se observou transativação do LTR do HIV-1 e do promotor pCMV, existente nos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs, apenas na presença do complexo DNA-PK. Finalmente, a viabilidade celular não foi afetada pelos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs. No geral, este trabalho permitiu identificar alguns dos elementos cis necessários para a sinergia observada na transativação do LTR do HIV-1, na presença de Tat e DNA-PK, o que facilitará a descoberta com maior precisão de outros fatores de transcrição envolvidos no processo e novas vias de sinalização subjacentes. DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is a multimeric complex composed by a 450 kDa catalytic subunit (DNA-PKcs), and by a regulatory DNA-binding heterodimer Ku70/80. DNA-PK is a Ser/Thr kinase identified as a crucial regulator of the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA-repair. More recently, DNA-PK has also been described to participate in diverse other cellular functions such as telomere maintenance, metabolic gene regulation and transcriptional control, becoming clear that its cellular activity goes far beyond its role in DNA double-strand break repair. DNA-PKcs has been suggested to have a role in HIV-1 life cycle by either helping the virus integration in genomic host DNA or in the HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR)-driven transcription. We have previously shown that DNA-PKcs knockdown impairs HIV-1 LTR-driven transcription. However, the underlying mechanisms whereby DNA-PKcs helps HIV-1 transcription are still unclear. In this study, we have examined the capacity of DNA-PKcs to modulate transcriptional activity of the HIV-1 promoter sequence located within the LTR. For this, HeLa P4 and TZM-bl cells with an integrated minimal (-138 to + 80) and a full length (-450 to +96) HIV-1 LTR promoter were transfected with several amounts of PCMV6DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg) alone or in the presence of Tat, the LTR transactivator. Our results show that DNA-PKcs only enhanced Tat-full length LTR driven transcription suggesting that HIV-1 promoter sequence not present in a minimal LTR is needed to observe a synergism between DNA-PKcs and Tat on LTR transcription. To confirm these results, 293T cells were co-transfected with several constructs of LTR with different lengths and Tat alone or in the presence of DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg). However, and in contrast with our previous results, we observed that the cis-elements presents in a minimal LTR are sufficient for the DNA-PKcs enhancement of Tat LTR-driven transcription. Early reports showed the three Sp1 core promoter binding sites and two NF-kB core enhancer motifs to be key elements involved in the regulation of HIV-1 transcription. Besides that, Tat and DNA-PK may seem to interact to increase the phosphorylation state of the Specificity protein 1 (Sp1), leading to an increase in Tat-full length LTR driven transcription. Therefore, we hypothesized that the three Sp1 binding sites could be the cis-elements present in the minimal LTR responsible for DNA-PKcs increase in LTR transcription mediated by Tat. To accomplish that, we have constructed a new LTR with only the three Sp1 core binding sites, through simple cloning experiments. Once constructed the new LTR named LTRSp1, 293T cells were co-transfected with this LTR with different lengths and Tat alone or in the presence of DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg). The results showed a synergism between Tat and DNA-PK, resulting in the enhancement of Tat-LTRSp1 driven transcription. At last, experiments with NU7026, a DNA-PKcs-specific inhibitor, showed that the catalytic subunit is responsible for the increase of Tat-LTR transactivation. In each set of experiments, it was not observed LTR or pCMV transactivation by pCMV6DNA-PKcs itself. Finally, the cellular viability was not affected by the plasmids pCMV-Tat and pCMV6DNA-PKcs. Overall, this work was important to identify one of the cis-elements responsible for the synergism between Tat and DNA-PK, leading to the enhancement of Tat-LTR driven transcription. Discovering the cis elements will possibly reveal other transcription factors involved in the DNA-PK enhancement process and new signaling pathways.

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Dissertations / Theses on the topic 'Proteínas cinases'

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