Academic literature on the topic 'Protéine se liant à l’ADN'

L’épithélium intestinal est une monocouche de cellules qui tapisse la lumière intestinale, constitué d’un compartiment différencié, les villosités dans l’intestin grêle et les plateaux épithéliaux dans le colon, et d’un compartiment prolifératif, les cryptes de Lieberkühn. Ce tissue se renouvelle de façon rapide et continue tout au long de la vie de l’individu, grâce à la présence de cellules souches adultes dans le fond des cryptes. Ces cellules s’autorenouvellent et donnent naissance à des progéniteurs prolifératifs (capables d’engendrer les différents cytotypes épithéliaux) qui se différencient tout en migrant vers le compartiment différencié. Mon travail de these a porté sur l’étude d’une marqueur putatif de ces cellules souches épithéliales intestinales: Musashi1 (Msi1).Dans ce contexte, mon premier axe d’étude s’est focalisé sur l’isolement et la caractérisation des cellules souches épithéliales intestinales chez la souris. Pour cela, nous avons généré des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur de Msi1. Les cellules souches intestinales de ces souris coexpriment donc Msi1 et la GFP. Ce modèle a été validé et nous à permis de isoler les cellules GFP/Msi1 positives dans l’intestin. A l'aide de différentes approches cellulaires et moléculaires, nous avons confirmé leur nature de cellules souches et nous avons apporté des nouvelles données sur la composition de la zone proliférative de l’épithélium intestinal murin.Le second axe de mes travaux de thèse a porté sur l’étude de la fonction de Msi1 dans l'homéostasie de l’épithélium intestinal chez la souris, par son sur-expression tous au long de l’épithélium. Nous avons montré que la sur-expression de cette protéine, qui est un régulateur des voies Wnt et Notch, perturbe l’architecture intestinale, a propriétés pro-prolifératives et un potentiel tumorigènique<br>The intestinal epithelium is a monolayer of cells surrounding the intestinal lumen. It consists of a differentiated compartment, the villi in the small intestine and a flat surface in the colon, and a proliferative compartment, the crypts of Lieberkühn. This tissue self-renews rapidly and continuously throughout life, due to the presence of adult stem cells in the bottom of the crypts. These cells are capable of self-renewing and give rise to proliferating progenitors (capable of generating all the different epithelial cytotypes) that differentiate and migrate toward the differentiated compartment. My thesis focused on the study of the intestinal epithelial stem cells marker Musashi1 (Msi1).In this context, the first part of my thesis work focused on the isolation and characterization of the intestinal epithelial stem cells that express Msi1 in the mouse. For this, we generated transgenic mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of Msi1. The intestinal stem cells of these mice co-express Msi1 and GFP. This model has been validated and allowed us to isolate GFP+/Msi-expressing cells in the intestine. By using different cellular and molecular approches, we confirmed their nature of stem cells and provided new data on the composition of the proliferative zone in the murine intestinal epithelium.The second part of my thesis has focused on the study of the function of Msi1 in the intestinal epithelium homeostasis in the mouse, by its over- and ectopic expression all along the epithelium. We have shown that the over-expression of this protein, which is a regulator of the Wnt and Notch pathways, perturbs the intestinal architecture, has pro-proliferative properties and tumorigenic potential

Le Ca[exposant]2+ joue un rôle majeur dans la régulation de processus physiologiques et biochimiques de l'organisme. Chez les cellules non-excitables, les TRPCs (transient receptor potential canonical) sont des canaux calciques impliqués dans l'influx de Ca[exposant]2+ à la membrane plasmique. Bien que de nombreux efforts soient déployés, le mécanisme régulant l'activité et le routage des TRPCs est encore mal connu. Au cours des dernières années, l'étude de domaines conservés au sein des protéines a connu un engouement. Tous les TRPCs possèdent un domaine de répétitions similaires à l'ankyrine (ANK), un motif bien connu pour son implication dans des interactions protéine-protéine. Le but de la présente étude était d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de double-hybride chez la levure afin de cribler une librairie d'ADNc, ce qui nous a permis d'identifier MxA et RNF24. MxA est une protéine faisant partie de la superfamille de la dynamine. Elle possède plusieurs propriétés de la dynamine classique, dont celle d'oligomériser. La première partie de l'étude démontre que MxA interagit au niveau de la deuxième répétition similaire à l'ankyrine de TRPC6 et que cette protéine peut lier tour les TRPCs, autant in vitro qu'in cellulo. Des mesures de Ca[exposant]2+ intracellulaire effectuées sur des cellules HEK 293T démontrent que l'interaction entre MxA et TRPC6 modifie significativement l'activité de TRPC6. De plus, l'utilisation de mutants de MxA démontre que la modulation de l'activité de TRPC6 s'effectue lorsque MxA est sous sa forme monomérique liée au GTP. Les résultats démontrent que MxA lie le domaine ANK de TRPC6 et modifie son activité. La découverte de RNF24 a permis d'identifier une nouvelle protéine membranaire localisée au niveau de l'appareil de Golgi. L'expression de RNF24 réduit spécifiquement l'insertion des TRPCs a la membrane plasmique, cause une rétention intracellulaire des TRPC3 et TRPC6, mais n'affecte pas le processus de maturation de TRPC6. De plus, dans les cellules HEK 293T stimulées par le carbachol, l'influx de Ca[exposant]2+ endogène ou médié par TRPC6 n'est pas affecté par la co-expression de RNF24. Ainsi, les résultats démontrent que RNF24 interagit avec les TRPCs, affecte le routage intracellulaire de ceux-ci sans modifier leur activité. Ces deux études ont permis d'identifier les premiers partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs, soit MxA et RNF24, et de caractériser l'effet des interactions sur la modulation du routage et de l'activité des TRPCs.

La rétine est un modèle très utilisé pour étudier la neurogenèse chez les vertébrés car elle est organisée simplement en trois couches et contient peu de types cellulaires. De nombreux facteurs de transcriptions ont été impliqués dans la rétinogenèse et parmi eux les facteurs bHLH jouent un rôle important. Les activateurs bHLH activent la différenciation des rétinoblastes tout en favorisant la formation des neurones et en contrôlant leur spécification. Les bHLH répresseurs de leur côté tendent à restreindre la différentiation des rétinoblastes et à promouvoir la gliogenèse. Au cours de ma thèse, j’ai recherché des facteurs post-transcriptionnels impliqués dans la rétinogenèse puisque jusqu’à présent les seuls régulateurs géniques connus pour êtres impliqués dans ce processus étaient des facteurs de transcription. Je me suis plus particulièrement intéressé à l’un d’eux, une protéine liant l’ARN potentielle nommée XSEB4R. Par des expériences de surexpression et de perte de fonction, j’ai pu montrer que le gène Xseb4R était impliqué dans la rétinogenèse et qu’il avait une fonction proche de celle des bHLH activateurs. J’ai par ailleurs montré que certains de ces facteurs se trouvaient en amont de Xseb4R. Je me suis aussi intéressé à un autre nouveau gène, Xhes2 (Hairy Enhancer of Split), dont j’ai aussi mis en évidence la fonction durant la rétinogenèse. Ce gène codant un répresseur bHLH en plus de favoriser la gliogenèse comme d’autres gènes de cette famille, a aussi un rôle sur la spécificité neuronale. J’ai enfin aussi participé à la mise en évidence du rôle de la cascade hh dans le développement de l’épithélium pigmenté rétinien, tissu contiguë à la rétine neurale<br>Retina is an interesting model to study vertebrate neurogenesis because it is simply organised in three layers and contains only few cell types. Numerous transcription factors are involved in retinogenesis. Among them, bHLH factors play important roles. BHLH activators promote neural differentiation, neurons formation and specification. BHLH repressors tend to limit neuroblasts differentiation and promote gliogenesis. During my thesis, I aimed to isolate post-transcriptionnal factors involved in retinogenesis since genetic regulators so far known to be involved in this process are all transcription factors. I have focused my studies on one of them, a new putative RNA binding protein called XSEB4R. Using overexpression and loss of function experiments, I have shown that Xseb4R is involved in retinogenesis and has a function related to bHLH activators function. I have also shown that some of these factors are upstream Xseb4R. During my thesis, I have also been interested in another novel gene, Xhes2 (Hairy Enhancer of Split). I highlighted that, in addition to promote gliogenesis, as other genes of this family, it also controls neuronal specificity. I have also participated to the determination of the function of the Hedgehog cascade in the development of retinal pigmented epithelium, which is adjacent to neural retina

La proctoline, premier neuropeptide purifié chez l'insecte est connu pour son action myotrope sur les muscles squelettiques et viscéraux. En test biologique de contractions d'intestins de blatte, la proctoline agit à une EC50 de 1nM. Des études de liaison avec la proctoline tritiée ont permis de préciser les caractéristiques pharmacologiques (Kd=100nM et Bmax=2,5 pmoles/mg de protéines) des récepteurs potentiels sur les intestins. La nature des seconds messagers impliqués correspond à une production d'IP3 et de DG. Après cinq étapes de séparation par chromatographie, deux bandes de 76 et 80 kDa ont été obtenues en électrophorèse. Après le séquençage partiel des deux bandes et la recherche dans les banques de données, une protéine de drosophile de 723 acides aminés (82 kDa) présentant 50% d'identité avec la DPP III de rat a été déduite. Des anticorps anti-DPP III ont permis par Western blot de confirmer la nature de la protéine purifiée (DPP d'insecte). Les caractéristiques enzymatiques de la DPP de blatte ont été définies pour la proctoline (Km=3,78uM ; Vmax=1,107 umoles/mg/min. ). La tyn rphine (Ki=75nM), inhibiteur de la DPP III de vertébrés,inhibe la dégradation de la proctoline. Des tests biologiques ont révélé un accroissement des contractions induites par la proctoline en présence d'anticorps anti-DPP III (de 25% à 70%) ou de tynorphine (de 20% à 45%). La présence de la DPP chez la drosophile a été vérifiée par purification chromatographique, PAGE et électrotransfert. Deux bandes protéiques de 82 et 86 kDa furent identifiées par les anticorps anti-DPP III. Deux bandes similaires étaient visualisées après surexpression en système cellulaire S2 d'un clone cDNA de drosophile codant pour la protéine de 723 acides aminés. La DPP III-like purifiée à partir de drosophiles ou après surexpression présente les caractéristiques enzymatiques spécifique de la DPP III de vertébrés, confirmant ainsi l'existence de cette enzyme chez les insectes.

Le développement d'une résistance à l'action de l'insuline est fréquemment observée au cours de l'obésité et est à l'origine du diabète de type 2. L'amélioration du signal insulinique au sein de la cellule adipeuse (i.e adipocyte) est une stratégie thérapeutique intéressante en vue d'améliorer la sensibilité à l'insuline systémique de patients pré-diabétiques et diabétiques. Dans cette optique, l'inhibition de la lipase hormono-sensible (LHS) adipocytaire (enzyme responsable de la libération d'acides gras par le tissu adipeux) protège de l'insulino-résistance. Les mécanismes impliqués dans l'amélioration de la sensibilité à l'insuline n'étaient cependant pas encore connus. Mon travail de thèse a donc été axé sur l'identification des mécanismes liant l'inhibition de la LHS et l'amélioration de la sensibilité à l'insuline. Dans des adipocytes humains, l'invalidation de la LHS augmente le transport du glucose, la voie de la lipogenèse de novo (synthèse d'acides gras à partir du glucose) et le signal insulinique. Parmi les enzymes lipogéniques, l'élongase des acides gras à longue chaîne ELOVL6 voit son expression très fortement induite in vitro et in vivo lors d'une déficience pour la LHS, conduisant à un enrichissement en oléate des phospholopides et des triglycérides. L'invalidation d'ELOVL6 dans des adipocytes humains a permis de démontrer le rôle clé de l'élongase dans la médiation des effets bénéfiques de l'invalidation de la LHS. In vivo, une déficience pour ELOVL6 conduit également à une détérioration du signal insulinique dans le tissu adipeux. Dans des études cliniques, l'expression d'ELOVL6 s'effondre au cours de l'insulino-résistance et est restaurée après une chirurgie bariatrique. L'enrichissement en oléate dans les phospholipides par ELOVL6 est responsable des effets protecteurs de l'inhibition de la LHS sur le signal insulinique. Des adipocytes surexprimant ELOVL6 présentent d'ailleurs une augmentation de la fluidité membranaire associée à une amélioration du signal insulinique. Dans le foie, ELOVL6 est une cible du facteur de transcription ChREBP. ChREBP adipocytaire, notamment l'isoforme ChREBPß, a récemment été mis en évidence pour son rôle déterminant sur la sensibilité à l'insuline systémique. Chez l'Homme, nous avons observé in vitro et in vivo d'étroites corrélations positives entre les expressions adipocytaires de ChREBPß et d'ELOVL6. L'inhibition simultanée de la LHS et ChREBP réduit fortement l'expression d'ELOVL6 et annule l'enrichissement en oléate des phospholipides ainsi que l'amélioration du signal insulinique. De manière particulièrement intéressante, nous avons mis en évidence qu'une interaction physique entre la LHS et ChREBP inhibe la translocation nucléaire du facteur et son activité transcriptionnelle. L'activité catalytique de la LHS n'est pas requise pour assurer l'interaction. Nous avons aussi montré que cette interaction est spécifique de la LHS et est restreinte à l'adipocyte. En conclusion, notre travail a mis au jour une nouvelle voie déterminante pour la sensibilité à l'insuline adipocytaire, liant la LHS au facteur de transcription ChREBP et à sa cible, l'élongase des acides gras ELOVL6. L'enrichissement consécutif en oléate des phospholipides conduit à une augmentation de la fluidité membranaire et à une amélioration du signal insulinique. L'inhibition de l'interaction entre la LHS et ChREBP dans le tissu adipeux pourrait donc être bénéfique dans la prise en charge de l'insulino-résistance associée à l'obésité<br>Insulin resistance is a feature frequently associated to obesity and an early defect in the development of type 2 diabetes. Improvement of fat cell insulin signaling may favor recovery of whole body systemic insulin sensitivity in pre-diabetic and diabetic states. In this context, inhibition of hormone-sensitive lipase (HSL) in adipocytes (an enzyme responsible for fatty acid release by adipose tissue) was demonstrated to be protective against insulin resistance. However, the mechanisms remained unclear. Consequently, my PhD work aimed at understanding the mechanisms linking HSL inhibition and improvement of insulin sensitivity. In human adipocytes, HSL gene silencing increased glucose transport, de novo lipogenesis and insulin signaling. Among de novo lipogenesis enzymes, ELOVL6 was preferentially induced in vitro and in vivo during HSL partial deficiency, resulting in enrichment of phospholipids and triglycerides in oleic acid. ELOVL6 gene silencing in human adipocytes provided the direct demonstration of the role of the enzyme in the beneficial effect of HSL inhibition. Fat cell insulin signaling was also impaired in adipose tissue of Elovl6 null mice. In clinical studies, ELOVL6 expression was blunted in insulin resistant states and restored after bariatric surgery. ELOVL6-mediated oleic acid enrichment of phospholipids was responsible for the positive effect of HSL inhibition on insulin signaling. FRAP studies revealed an increase in plasma membrane fluidity and insulin signaling in adipocytes overexpressing ELOVL6. In the liver, ELOVL6 is a target of ChREBP. Adipose ChREBP, notably the constitutively active isoform ChREBPß, recently emerged as a major determinant of systemic insulin action on glucose metabolism. In humans, we observed in several in vitro models and in vivo studies a strong positive association between adipose ChREBPß and ELOVL6. Dual HSL-ChREBP inhibition blunted adipose ELOVL6 expression in vivo and in vitro and mirrored ELOVL6 gene silencing on fatty acid profile and insulin signaling. Importantly, we found that physical interaction between HSL and ChREBP impairs ChREBP translocation into the nucleus and its transcriptional activity. A naturally short form of HSL devoid of catalytic activity retained the capacity to bind ChREBP. We also demonstrated that ChREBP-HSL interaction was specific of the lipase and restricted to adipocyte. To conclude, our work identifies a novel pathway critical for optimal insulin signaling in fat cells which links the neutral lipase HSL to the glucose-responsive transcription factor ChREBP and its target gene, the fatty acid elongase, ELOVL6. ELOVL6-mediated oleate enrichment in phospholipids increases membrane fluidity and improves insulin signaling. Inhibition of HSL/ChREBP interaction in adipose tissue may be beneficial in the treatment of obesity-associated insulin resistance

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016<br>L’anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare due à un défaut de réparation de l’ADN au niveau des pontages inter-brins. La protéine FANCG est impliquée, avec 15 autres protéines, dans cette réparation via la voie de Fanconi. En plus de ce rôle, FANCG a été identifié comme faisant partie du complexe B2D2GX3. Néanmoins, le rôle exact de ce complexe reste à être élucidé. Cette étude a permis de mettre en évidence de nouveaux interacteurs de FANCG, connus pour être impliqués dans diverses voies de réparation de l’ADN et dans le choix de la voie de réparation à utiliser. Ainsi, nous posons l’hypothèse que FANCG possède des fonctions additionnelles, via ces nouveaux partenaires. Les données recueillies montrent qu’indépendamment de son rôle dans la voie de Fanconi, et bien que ne liant pas l’ADN, FANCG est recruté aux sites de dommages à l’ADN et permet d’engendrer sa réparation.

La perte de ZBTB4 caractérise les cancers de stade -avancé et favorise la survie des cellules suite aux dommages à l'ADN et la progression métastasique. Mes travaux de thèse ont porté sur l'identification des mécanismes moléculaires associant ZBTB4 au cancer. Ces travaux m'ont permis de montrer que la perte de ZBTB4 induit des défauts de ségrégation des chromosomes. ZBTB4 régule la transcription de gènes du SAC comme BUBRJ, MAD2LI et AuroraB. Ainsi, la perte de ZBTB4 accélère la transition métaphase-anaphase en condition physiologique, ainsi qu'après l'activation du SAC dans des cellules en mitose par traitement au nocodazole, malgré la présence de chromosomes mal alignés. ZBTB4 localise également aux régions péri-centromériques et semble importante pour la transcription des séquences satellites péri-centromériques pendant la mitose. Il est possible que sa localisation aux péri-centromères, ainsi que son rôle dans la transcription des satellites en mitose, jouent un rôle dans la déstabilisation du kinétochore dans les cellules sous-exprimant ZBTB4. De plus, les souris Zbtb4 développent davantage de papillomes que les souris Zbtb4 suite à l'induction de tumeurs de la peau par traitement au DMBA/TPA. Ces éléments viennent confirmer in vivo chez la souris un rôle de ZBTB4 dans la formation des tumeurs. La dérégulation des protéines du SAC, de même que la dérégulation de la transcription des satellites, sont souvent retrouvées dans les cancers et causent de l'aneuploïdie. La perte de ZBTB4 participe à la progression tumorale en favorisant la présence de cellules aneuploïdes, causant de l'instabilité génomique et favorisant la diversité génétique des cellules cancéreuses<br>ZBTB4 is a mammalian transcription factor with Zinc fingers and a BTB/POZ domains, which can bind methylated CpGs, as well as certain unmethylated consensus sequences. ZBTB4 is frequently downregulated in human cancers, for reasons that are unclear. To address the potential role of ZBTB4 we depleted it from human cells in culture, this led to heightened chromosome missegregation, as evidenced by increases in lagging chromosomes, micronuclei, and binucleation. We could detect a defect in the mitotic checkpoint, which was weakened in cells lacking ZBTB4, maybe as a direct consequence of decreased checkpoint protein abundance. To validate our findings in a more physiological setting, we generated mice. Primary Zbtb4⁻/⁻cells show the satine signs of genome instability seen in human cells in culture. The Zbtb4⁻/⁻ animals are viable and fertile, but smaller than their littermates and with reduced organ size. In addition, we report that mice lacking ZBTB4 are more susceptible to DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis. Our results show that the epigenetic regulator ZBTB4 is essential for genome stability in mammals. Its loss in cancer cells may be under positive selection because it promotes faster genome evolution in the tumour cells