Dissertations / Theses on the topic 'Protéine SNARE'

CFTR est un canal chlorure localisée dans la membrane apicale des cellules épithéliales dont les mutations causent la mucoviscidose. Notre équipe a montré que la surexpression de la syntaxine 8 (protéine SNARE impliquée dans la fusion membranaire intracellulaire) inhibe l'activité et la localisation membranaire de CFTR. De plus, ces deux protéines interagissent faiblement. Or, la syntaxine 8 appartient au complexe SNARE endosomal également constitué de syntaxine 7, VAMP8 et vti1b. Nous avons donc caractérisé leurs interactions avec CFTR. Les trois protéines existent en complexe avec CFTR, et VAMP8 et vti1b interagissent fortement avec CFTR. La surexpression de ces protéines inhibe spécifiquement l'activité canal chlorure de CFTR et sa localisation membranaire apicale. Les protéines SNARE endosomales et CFTR étant alors co-localisées dans les endosomes du recyclage. Nos résultats montrent que le complexe SNARE endosomal participe au trafic et à la régulation de la protéine CFTR
CFTR is a chloride channel localized in the apical membrane of epithelial cells and mutations cause cystic fibrosis. Our lab has shown that syntaxin 8 overexpression (SNARE protein involved in membrane fusion events) inhibits CFTR activity and localization. Moreover, both proteins weakly interact. Syntaxin 8 belongs to the endosomal SNARE complex also constituted of syntaxin 7, VAMP8 and vti1b. Therefore, we have characterized their interactions with CFTR. The three proteins and CFTR are in a same complex, and VAMP8 and vti1b strongly interact with CFTR. Proteins overexpressions specifically inhibit CFTR activity and CFTR membrane localization. SNARE proteins and CFTR were then co-localized in recycling endosomes. Our results demonstrate the endosomal SNARE complex participate to CFTR traffic and regulation

Le maintien de l’homéostasie passe notamment par la sécrétion d’hormones provenant des cellules neuro-endocrines ou endocrines telles que les cellules chromaffines ou les cellules b pancréatiques. Par exemple, la régulation de la glycémie nécessite l’exocytose de l’insuline depuis les cellules b pancréatiques des îlots de Langerhans. Une famille de protéines membranaires est au cœur de la machinerie de fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique. Ce groupe appelé, la famille des protéines SNARE est composé de trois protéines. VAMP2 est localisée à la membrane vésiculaire alors que syntaxine 1A et SNAP25 sont localisées à la membrane plasmique. Syntaxine 1A et VAMP2 ont un domaine transmembranaire alors que SNAP25 est reliée à la membrane par prénylation de résidus cystéine. Cette famille forme le complexe cytosolique SNARE décrit comme essentiel à l’exocytose. La structure et la fonction du complexe cytosolique ont été étudiées en profondeur et ont mené au modèle du « zipper ». Celui-ci décrit un enroulement progressif des domaines cytosoliques SNARE permettant l’apposition des membranes puis la fusion. Le rôle des domaines transmembranaires reste encore peu décrit. Pourtant, leur étude est nécessaire afin d’établir un modèle complet de la fusion membranaire par les protéines SNARE. Nous avons donc mené une étude alliant une analyse structurale dynamique à une analyse biologique pour déterminer l’importance du domaine transmembranaire de VAMP2 dans la sécrétion. L’analyse biologique représente donc le centre de ma thèse. Le système biologique utilisé est basé sur l’extinction de l’expression de la protéine VAMP2 endogène et l’expression concomitante d’une protéine VAMP2 mutée dans son domaine transmembranaire. Deux lignées cellulaires considérées comme des modèles dans l’étude de la sécrétion hormonale et du trafic vésiculaire ont servi de support à notre étude. Par des approches de microscopies (confocal, TIRF) et d’analyses biochimiques, nous avons observé les conséquences fonctionnelles des mutations ponctuelles, établis par mutagénèse dirigée, sur le trafic vésiculaire et sur la capacité des cellules à sécréter.Les mutations induites présentent différents effets cellulaires. Certaines bloquent la sortie de VAMP2 du réseau golgien alors que d’autres ont un effet important sur la sécrétion hormonale et plus précisément sur l’exocytose. Les études structurales ont permis de corréler ces effets avec une diminution de la flexibilité structurale dans le cas de la diminution de l’exocytose, ou avec une restriction à la conformation hélice alpha dans le cas du sorting. Ce projet pluridisciplinaire a pu mettre en avant le rôle biologique du domaine transmembranaire de VAMP2 au cours de l’exocytose probablement soutenue par la dynamique conformationelle unique observée par le versant structural du projet
The hormonal secretion plays a key role in the maintenance of homeostasis. For example, the maintenance of normoglycaemia requires insulin exocytosis from the pancreatic beta cells. The SNARE membrane family protein has been described as the core machinery of fusion between the vesicle containing hormones and the plasma membrane. This family consists of 3 different membrane proteins that are essential during exocytosis. VAMP2 is localized on the vesicle and Syntaxin 1A - on the plasma membrane. They both are transmembrane protein whereas SNAP25 is linked to the plasma membrane by palmitoylation. The SNAREs appear to be essential as they form the cytosolic SNARE complex to dock the vesicle to the plasma membrane. Even though the role of this cytosolic domain has been studied in depth, much less is known on the role of their transmembrane domain during the fusion. Their study remains necessary to establish a complete model of membrane fusion mediated by the SNARE proteins.Here, we have studied the behavior and the role of the SNARE transmembrane domain during exocytosis. In a multidisciplinary project, we have combined a structural approach with a biological study to evaluate the role of this domain. Using mutagenesis in the transmembrane domain of VAMP2 and a cellular system with a clean background, we have assessed the effect of mutations on the secretion and exocytosis in two different cell lines (INS1E and PC12). The biological system is based on the silencing of endogenous VAMP2 and reconstitution of the expression of VAMP2 wt or mutated in the transmembrane domain. Using biochemistry assay and TIRF microscopy we have shown that mutations in this domain can lead to a missorting of the Golgi apparatus or a reduction of the stimulated secretion and exocytosis. This effect can be correlated to a modification of the structural dynamics of this domain.The obtained results clearly demonstrate the role of the transmembrane domain of VAMP2 during exocytosis probably sustained by its unique structural dynamics observed by physico-chemistry

Le trafic membranaire assure la communication entre les différents compartiments intracellulaires ainsi qu’entre les cellules et leur environnement via l’exocytose et l’endocytose. Les protéines SNARE vésiculaires (v-SNARE) et leurs partenaires à la membrane cible (t-SNARE) sont responsables de la fusion membranaire. Des travaux antérieurs ont montré le rôle de la v-SNARE TI-VAMP dans une voie d’exocytose impliquée dans la croissance neuritique et le remodelage de la membrane plasmique. Le domaine amino-terminal Longin de TI-VAMP régule l'activité fusogénique de la protéine et son ciblage. J'ai montré que ce domaine interagit avec la protéine Hrb, un nouveau partenaire de TI-VAMP. Hrb est localisée dans des structures membranaires recouvertes de clathrine et régule l’internalisation de TI-VAMP. Le domaine Longin interagit également avec certains lipides, indiquant que ces derniers pourraient réguler le ciblage ou l'activité de TI-VAMP. Ces nouvelles données moléculaires et cellulaires établissent des liens moléculaires inédits entre une protéine responsable de la fusion membranaire, une protéine régulatrice de l'endocytose et les lipides.

Les Chlamydia sont des bactéries intracellulaires strictes dont trois espèces sont pathogènes pour l'Homme. Elles sont responsables, selon les souches, d'infections oculaires et génitales et d'infections respiratoires. Après avoir induit leur propre entrée, les bactéries se développent dans un compartiment délimité par une membrane, appelé inclusion. Au cours du cycle infectieux, les bactéries transloquent, par leur appareil de sécrétion de type trois (STT), des protéines dont certaines s'ancrent dans la membrane de l'inclusion où elles sont en contact avec le cytosol de la cellule hôte, les protéines Inc. Mon travail de thèse a porté sur les protéines bactériennes sécrétées, au cours du cycle infectieux, dans la cellule hôte. Une approche globale nous a permis d'identifier de 24 nouvelles protéines de Chlamydia sécrétées par l'appareil de STT. Ce travail a ouvert la voie à l'étude fonctionnelle de ces protéines bactériennes qui sont en contact avec l'hôte. De manière plus spécifique, nous avons étudié la fonction d'une protéine de l'inclusion, IncA, au cours du cycle infectieux. Nous avons montré que IncA présente des similitudes structurales et fonctionnelles avec les protéines eucaryotes, les SNAREs, facteurs essentiels de la fusion des membranes cellulaires. IncA interagit dans un modèle cellulaire, et in vitro, avec certaines SNAREs. De plus, dans des expériences de fusion de liposomes in vitro, la fusion membranaire induite par un complexe SNARE des endosomes tardifs est inhibée par IncA. Ce travail a permis de proposer que IncA puisse mimer les SNAREs et participer au détournement du trafic intracellulaire induit par Chlamydia
Chlamydiae are obligate intracellular pathogens of humans and animals. Depending on the species, they are responsible for ocular and genital infections, and respiratory diseases. After inducing their own entry, the bacteria develop in a membrane-bound compartment, called the inclusion. During the infectious cycle, they translocate a subset of proteins via a type three secretion (TTS) apparatus into the host cytosol. Among these, the Inc proteins remain anchored in the inclusion membrane where they face the host cytosol. My work has focused on bacterial proteins secreted into the host cell. By a global approach, we have identified 24 new proteins secreted by the TTS apparatus of Chlamydia. This work has opened the functional studies of these bacterial proteins that are in contact with the host cell cytosol. More specifically, we have studied the function of an inclusion protein, IncA. We have shown that IncA, from different chlamydial species, share structural and functional homologies with the SNARE family of eukaryotic proteins, which are essential factors for cellular membrane fusion events. We have shown that IncA interact with SNAREs in both a cellular and an in vitro model. Moreover, in liposome fusion assays, IncA inhibit membrane fusion induced by a cognate SNARE complex specific from the late endosomal compartment. We propose that IncA, by mimicking SNAREs proteins, participate in the control of the interactions between the inclusion membrane and intracellular compartments of the host cell

L’exocytose des neurotransmetteurs repose sur la fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique en réponse à l’influx calcique qui accompagne les potentiels d’action. La fusion nécessite l’assemblage des protéines SNAREs de la vésicule (la VAMP2) et de la membrane plasmique (la syntaxine 1 et la SNAP25) à l’interface des deux bicouches lipidiques, et elle est déclenchée par la synaptotagmine, un senseur de Ca2+ aux propriétés fusogènes. Des senseurs calciques additionnels semblent participer au déclenchement de la libération et à la dynamique du pore de fusion, en particulier la calmoduline dont le rôle au cours de l’exocytose demeure obscur. Au moyen d’une technique dérivée de la FRET, nous démontrons ici que la Ca2+/calmoduline inhibe l’assemblage du complexe SNARE et la fusion membranaire SNARE-dépendante in vitro en se liant aux domaines juxtamembranaires de la VAMP2 et de la syntaxine 1. De plus des données récentes indiquent que le secteur V0 de la pompe à protons V-ATPase peut participer à la fusion membranaire, et plus particulièrement qu’un hexamère formé de ses sous-unités c constitue un pore capable de libérer de l’acétylcholine en présence de calmoduline. Au moyen des techniques du double-hybride de levure et de SPR notamment, nous avons identifié un lien direct entre boucle 3-4 de la sous-unité c et VAMP2, impliquant le domaine de liaison à la calmoduline de cette dernière. La perturbation de cette interaction in vivo, par injection d’un peptide interférant, inhibe la neurotransmission, suggérant que l’interaction de la machinerie d’exocytose avec ce pore protéique potentiel est impliquée dans la libération des neurotransmetteurs
Action potential-evoked neurotransmitter release relies on Ca2+-driven synaptic vesicle fusion with the plasma membrane. Fusion involves assembly of the vesicular protein VAMP2 (a v-SNARE) with the plasma membrane proteins syntaxin 1 and SNAP25 (t-SNAREs) into a tight trans complex at the interface between the bilayers, and is triggered by synaptotagmin, a fusogenic Ca2+-sensor. Additional Ca2+-sensors are likely to participate in release triggering and fusion pore dynamics, and notably our understanding of calmodulins actions in exocytosis remains elusive. By means of a FRET-derived method, we demonstrate that Ca2+/calmodulin inhibits SNARE complex assembly and SNAREdependent membrane fusion in vitro, by binding to the juxtamembrane regions of VAMP2 and syntaxin 1. The newly-identified calmodulin binding site on syntaxin overlaps with the synaptotagmin- interacting region, and the two interactions are mutually exclusive, suggesting antagonistic roles for the two sensors in membrane fusion. Moreover, recent data point to the involvement of the V0 sector of the proton pump V-ATPase in various membrane fusion events. They indicate that pore-forming c-subunits hexamers confer Ca2+- dependent release of acetylcholine to synthetic liposomes in the presence of calmodulin. Using yeasttwo- hybrid and SPR, we have identified a direct link between the c-subunit loop 3-4 and the v-SNARE VAMP2, involving the calmodulin-binding domain of the latter. Disturbing this interaction in vivo by acute injection of an interfering peptide inhibited neurotransmission, suggesting that association of the exocytotic machinery with the putative proteic pore is involved in neurotransmitter release

Le locus soumis à empreinte en 6q24. 2 est associé à plusieurs pathologies métaboliques dont le diabète néonatal transitoire (DNT) et le diabète de type 2 (DT2). Des anomalies génétiques et épigénétiques sont trouvées dans le DNT mais le processus physiopathologique n’est pas élucidé. Un défaut général de la méthylation est suggéré dans le DT2 et le DNT est l’unique forme de diabète avec des anomalies épigénétiques. Durant ma thèse, j’ai recherché au locus 6q24. 2 des déterminants génétiques et épigénétiques pouvant participer à l’altération des processus de sécrétion d’insuline. Nous avons identifié un nouvel îlot CpG contenu dans l’EXON 2 / Exon 3 du gène STX11/Stx11. Cette région apparaît être impliquée dans l’établissement du statut épigénétique du domaine locus 6q24. 2 au cours du développement. Nos données suggèrent que Stx11 participe au trafic des vésicules d’insuline immatures et que ce gène contribue au diabète chez l’homme.

La cellule mastocytaire comporte un système sécrétoire très spécialisé. Elle possède des granules et plus de 80% de leur contenu peuvent être libères dans les quelques minutes suivant la stimulation. Les granules contiennent de nombreux médiateurs inflammatoires qui, secrètes dans le milieu extérieur, sont en grande partie responsables des réactions d'hypersensibilité immédiate. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé les protéines contrôlant les fonctions sécrétoires des mastocytes après leur activation via le récepteur de haute affinité pour les IGE (RFCI). Nous avons étudié le rôle des petites proteines g rab3 connues pour etre specifiquement impliquees dans l'exocytose regulee. L'identification de ces gtpases a montré que les iso formes RAB3A et RAB3D étaient exprimées et que seule l'iso forme RAB3D semble intervenir dans le contrôle de la dégranulation induite via le récepteur RFCI, dans les mastocytes. Nous avons ensuite entrepris l'analyse du complexe de fusion membranaire, le complexe snare. Le noyau de ce complexe est compose de trois grandes familles de protéines : les syntaxines, les snap et les vamp. Dans la famille des syntaxines, les isoformes 2, 3, et 4 sont exprimées, alors que les snap ne semblent être représentées que par l'isoforme snap23. Le groupe des vamp quant a lui comprend vamp2, cellubrevine, ti-vamp et vamp8. Nous avons ensuite montre que 1) la syntaxine 4 est un élément central dans la formation des complexes snare et 2) elle est impliquée fonctionnellement dans la degranulation des RBL-2H3. Enfin nous avons pu montrer que vamp8, présente sur les granules sécrétoires, est mobilisée au cours de la stimulation. Tous ces résultats sont en faveur de l'existence d'un complexe de fusion dans les cellules RBL-2H3, compose de la syntaxine 4, de snap23 et de la protéine vamp8.

Le trafic vésiculaire permet le transport des protéines et des lipides entre les compartiments intracellulaires. Les v-SNARE, à la membrane des vésicules et les t-SNARE, à la membrane des compartiments cibles, interagissent via leurs domaines SNARE, et forment un complexe permettant la fusion membranaire. TI-VAMPNAMP7 est un v-SNARE présent au niveau de l'appareil de Golgi, des endosomes tardifs et des lysosomes, qui intervient dans le transport apical, la croissance neuritique et la migration cellulaire. Nous avons montré d'une part que TI-VAMP est phosphorylée par c¬Src et qu'un mutant phospho-mimétique active son exocytose. D'autre part, par une approche protéomique, nous avons mis en évidence une interaction entre TI-VAMP et le t-SNARE SNAP-47. Nous avons montré que SNAP-47 interagit aussi avec VAMP4 et VAMP8, et présente une localisation périnucléaire, proche du réticulum endoplasmique et de l'ERGIC. Un mutant délété de son domaine carboxy-terminal, que nous avons généré, interagit toujours avec les v¬SNARE VAMP4,7, et 8 et affecte la distribution des VAMP4 et 7, suggérant un rôle de SNAP-47 dans leur localisation subcellulaire. Par ailleurs, ce mutant est partiellement délocalisé au noyau. SNAP-47 possède des signaux de localisation et d'export nucléaire et un traitement des cellules à la leptomycine B induit la relocalisation de la protéine sauvage au noyau, suggérant un transit entre noyau et cytoplasme. SNAP-47 apparaît donc différente des t-SNARE classiques et pourrait intervenir dans d'autres mécanismes, que la fusion membranaire. Nous suggérons que SNAP-47 pourrait notamment jouer un rôle de chaperonne en régulant la localisation des v-SNARE partenaires
Vesicular trafficking allows for protein and lipid transport between intracellular compartments. V-SNAREs, present at the vesicular membrane, and t-SNAREs, present at the target membrane, interact via their SNARE domains, and form a complex that allows membrane fusion. TI-VAMPNAMP7 is a v-SNARE localized in the Golgi apparatus, late endosomes and lysosomes, which plays a role in apical transport, neurite growth and cell migration. First, we showed that TI-VAMP is phosphorylated by c-src and that a phosphomimetic mutant activates its exocytosis. Secondly, by a proteomics approach, we found that TI-VAMP interacts with the t-SNARE SNAP-47. We highlighted that SNAP-47 interacts also with VAMP4 and VAMP8, and has a perinuclear localization, closed to the endoplasmic reticulum and the ERGIC. A carboxy-terminal domain deleted mutant still interacts with VAMPs 4, 7 and 8 and affects VAMPs 4 and 7 distribution, suggesting a role of SNAP-47 in the v-SNAREs' subcellular localization. Moreover, SNAP-47 mutant is partially delocalized to the nucleus. SNAP-47 possesses nuclear localization and export signais, and cell treatment with leptomycine B induces relocalization of the WT protein in the nucleus, suggesting a transit between nucleus and cytoplasm. Thus, SNAP-47 appears different from classical t-SNAREs and could potentially have a fonction in other mechanisms than membrane fusion. We suggest that SNAP-47 could play a role of chaperone by regulating its v-SNARE partners'localization

La structure des protéines SNAREs (VAMP1 et Syntaxine1A) et de leur domaines trans- et juxtamembranaires (VAMP22, Syn23 et Syn27 respectivement) a été étudiée dans des membranes lipidiques modèles. Nous avons fait varier la concentration peptidique et la composition lipidique afin de déterminer les paramètres contrôlant l’activité de ces molécules dans la membrane durant la fusion. L’étude tructurale (IR et CD) des peptides VAMP22 et Syn23 ont montré une transition structurale dépendante de la concentration, entre un feuillet béta à forte concentration et une hélice alpha à faible concentration. Cette transition était réversible pour le peptide VAMP22 uniquement. Des perturbations de la membrane lipidique ont été observées suite à ce changement de structure. Les analyses structurales en PM-IRRAS de la protéine VAMP1 seule ou dans un film lipidique neutre (DMPC) a montré une transition structurale réversible entre une hélice alpha et un feuillet béta en fonction de la compression. Dans un film lipidique chargé du DMPG, cette transition n’a pas été observée. Cela laisse suggérer une influence des charges membranaires sur l’organisation de cette protéine. En parallèle, la protéine Syntaxine1A a montré une structure secondaire stable en hélice alpha, indépendamment de la composition lipidique de la membrane. L’addition de quatre résidus juxtamembranaires au peptide Syn23 était associée à une nouvelle organisation structurale du domaine transmembranaire. L’étude structurale associée à l’étude cinétique de fusion ou d’agrégation des peptido-liposomes du peptide Syn 27, permettent de suggérer un éventuel lien entre la structure et la fonction de ce peptide dans la membrane
The structure of SNARE proteins (VAMP1 & Syntaxine1A) and of their trans- and juxtamembrane domains (respectively VAMP22, Syn23 & Syn27) was investigated in synthetic lipid membranes. Different protein concentrations and lipid compositions were used in this study. VAMP22 and Syn23 peptides were studied in IR and CD. A structural transition between an alpha helix and a beta sheet was observed depending on peptide concentration. This transition was reversible only for VAMP22. Membrane Lipid phase was disturbed upon this structural evolution. PM-IRRAS data of pure full length VAMP1 protein film and mixed DMPC/VAMP1 film showed a dynamic behavior of this protein on the interface with a reversible structural transition upon surface compression/decompression cycles. Negatively charged lipid membranes (DMPG, DMPG/DMPC) prohibited this protein from changing structure under same conditions. Syntaxine1A protein subjected to a similar analysis showed no consequences of lipid composition or surface pressure on the structure of the originally alpha helix structured protein. Addition of four juxtamembrane residues to the Syn23 peptide produced modifications within the structural organization of this transmembrane peptide in model membranes. This larger peptide facilitated vesicles membranes fusion when organized as beta sheet

Le trafic membranaire est un processus universel qui est essentiel pour la fonction neuronale dans un large spectre de fonctions. De la croissance neuronale et le développement morphologique à la libération des neurotransmetteurs et la plasticité synaptique, il prend en charge l'activité neuronale et donne d'innombrables questions qui animent la recherche sur la neurobiologie d'aujourd'hui. Notamment, l’exocytose des endosomes de recyclage (ER) dans les compartiments somatodendritiques participe à la transmission synaptique et à la potentialisation synaptique à long terme (PLT). Cependant la machine moléculaire sous-tendant l’exocytose des ER reste encore méconnue. Afin d’identifier les protéines SNAREs vésiculaires (v-SNARE) impliquées dans les différentes formes d’exocytose des ER postsynaptiques, nous avons d'abord imagé les protéines VAMP neuronales fusionnées avec la pHluorine, une GFP mutée sensible au pH dans les neurones de l’hippocampe en culture. Nous avons constaté que seulement VAMP2 et VAMP4, mais pas VAMP7, rapportaient des événements d’exocytose somatodendritique dans les neurones matures. Après avoir identifié ces deux protéines candidates, nous avons utilisé la combinaison de différentes techniques de régulation négative chronique ou aiguë pour désactiver leur fonction et observer les conséquences sur l’exocytose des ER, la transmission synaptique basale ou la PLT. Nos résultats suggèrent que VAMP2 est impliqué dans une forme d’exocytose régulée importante pour la PLT, mais pas l’exocytose constitutive des récepteurs AMPA, qui stabilise la transmission basale. VAMP4 est nécessaire pour l'exocytose constitutive d'une grande partie des endosomes, mais l'implication fonctionnelle de ces endosomes doit encore être explorée, car la régulation négative de VAMP4 ne modifie pas la transmission basale
Membrane trafficking is a universal process that is essential for neuronal function in a wide spectrum of applications. From neuronal growth and morphological development to neurotransmitter release and synaptic plasticity, it supports neuronal activity and gives countless questions that drive today’s neurobiology research. Notably, the trafficking of recycling endosomes (REs) in somatodendritic compartments participates in synaptic transmission and plasticity, such as long-term synaptic potentiation (LTP). However, the fusion machinery mediating RE exocytosis is still unclear. To identify the vesicular SNAREs (v-SNAREs) involved in different forms of postsynaptic RE exocytosis, we first imaged neuronal VAMP proteins fused with pH-sensitive pHluorin in cultured hippocampal neurons, and found that only VAMP2 and VAMP4, but not VAMP7, underwent somatodendritic exocytosis in mature neurons. After identifying these two candidate proteins, we used a combination of different downregulation techniques to chronically or acutely deactivate their function and observe consequences on REs exocytosis, basal synaptic transmission and LTP. Our results suggest that VAMP2 is involved in activity-regulated exocytosis important for LTP, but not constitutive postsynaptic AMPARs exocytosis, supporting basal transmission. VAMP4 is required for constitutive exocytosis of at least a large proportion of REs, but the functional implication of these endosomes still need to be explored, as VAMP4 downregulation did not alter basal synaptic transmission

La compréhension des processus biologiques dans les membranes protéolipidiques est un défi majeur car les protéines membranaires représentent 2/3 des cibles des drogues actuelles et elles sont essentielles au fonctions importantes de la cellule. L'étude structurale des protéines membranaires étant par essence difficile et la connaissance des événements à un niveau moléculaire est rare. Nous proposons donc une étude par dynamique moléculaire qui grâce à son approche atomique nous a permis de disséquer les caractéristiques structurales : hélicité, orientation, rayon de gyration. . . , la dynamique et le comportement des protéines appelées SNARE impliquées dans la fusion membranaire au niveau des neurones. Nous nous sommes intéressés à l'étude des domaines transmembranaires, juxtamembranaires et cytosoliques de ces protéines dans différents environnements : eau, octanol et bicouche lipidique de DMPC.

Les mastocytes sont des cellules du système immunitaire hautement spécialisées, impliquées dans des réactions inflammatoires et allergiques. Suite à l'agrégation des récepteurs de haute affinité pour les IgE(RFc[epsilon]I)présents à la surface membranaire, les mastocytes sécrètent massivement et rapidement leur contenu granulaire. Cette dégranulation, mettant en jeu des mécanismes Ca2+- et PKC-dépendants, mobilise presque tous les granules intracellulaires par un mécanisme d'exocytose cumulative, impliquant, d'une part la fusion hétérotypique des granules avec la membrane plasmique et d'autre part la fusion homotypique des granules entre eux. Alors que les événements de signalisation permettant la dégranulation ont fait l'objet de nombreuses études, l'identité de la machinerie moléculaire contrôlant ces événements, et particulièrement la propagation de la fusion membranaire à la population granulaire, reste peu connue. Les mécanismes généraux du trafic intracellulaire vers la membrane plasmique dépendent de l'interaction de protéines SNAREs, situées d'une part sur la membrane cible (t-SNAREs) et d'autre part sur les vésicules sécrétoires (v-SNAREs), capables de former un complexe catalysant la fusion membranaire. En utilisant des mastocytes de rat de la lignée RBL-2H3, nous avons caractérisé certaines de ces protéines. Les complexes mis en évidence sont composés des t-SNAREs Syntaxine 2,3,4 et SNAP-23 et des V-SNAREsVAMP-2,-3, et -8. Le développement d'un test unicellulaire permettant de mesurer l'exocytose nous a permis de révéler le rôle fonctionnel de Syntaxine 2,3 et 4 dans la dégranulation mastocytaire. Certaines protéines comme les protéines Sec1/Munc18, capables de lier les SNAREs Syntaxines, ou les GTPases Rab3 peuvent réguler spécifiquement la formation de ce complexe [. . . ] Le lien entre la dégranulation mastocyrtaire médiée par le FRc[epsilon]I et la GTPase Rab3d a été révélé par la caractérisation d'une activité kinase associée, régulée par le Ca2+ et capable de phosphoryler Syntaxine 4 dans les mastocytes non activés, ce qui a pour effet d'empêcher sa liaison à son partenaire SNAP-23. Rab3D pourrait ainsi réguler la formation du complexe SNARE par des mécanismes de phosphorylation.

L'exocytose nécessite la formation d'un pore de fusion. Le pore initial est étroit ; seules de petites molécules sont libérées. Quand le pore s'élargit les macromolécules sont libérées. J'ai étudié le rôle de deux protéines sur la dilatation du pore: la protéine SNARE synaptobrévine 2 (Syb2), et la Rhô GTPase Cdc42. L'assemblage des SNAREs fournirait l'énergie nécessaire à la fusion. L'insertion d'un espacer dans le domaine juxtamembranaire de Syb2 ne modifie pas la fréquence des événements d'exocytose détectés par ampérométrie à 1|jM [Ca2+], mais empêche l'apparition d'une composante de sécrétion à de plus fortes [Ca2+]. Les événements peuvent être classés en deux groupes, liés à la vitesse et au degré de dilatation des pores; l'allongement de Syb2 réduit la population de pics rapides, mais n'affecte pas celle des pics lents. Les événements lents seraient dus à un assemblage partiel des SNAREs, alors que ceux dits rapides résulteraient d'un assemblage plus serré, assurant ainsi une dilatation rapide du pore. Cdc42 contrôle la dynamique de l'actine. Diminuer son expression dans les cellules BON réduit le nombre de granules fusionnant complètement avec la membrane, mais n'affecte pas leur recrutement et leur liaison à la membrane. Réduire l'expression de Cdc42 diminue le nombre de hauts pics dus à une dilatation rapide et complète des pores, et augmente le nombre de pieds seuls, dus à des pores ne s'élargissant pas. L'augmentation de tension de la membrane corrige les effets dus à l'absence de Cdc42 ; sa diminution par dépolymérisation de l'actine imite les effets obtenus en son absence. Cdc42 contrôlerait la dilatation du pore en modulant la tension de membrane
Exocytosis ends with the formation of a fusion pore. The initial pore is narrow, only small molecules flow through it. The pore then enlarges, releasing larger secretory products. I studied the role of two proteins on the dilation of the pore: the SNARE protein synaptobrevin 2 (Syb2), and the Rho GTPase Cdc42. Zippering of SNAREs in opposed membranes might give energy to catalyze fusion. Inserting a linker between the SNARE core and the transmembrane domain of Syb2 did not modify the frequency of exocytotic events detected by amperometry at 1|jM free [Ca2+] but prevented the occurrence of an extra component of release at higher [Ca2+]. Analysis of these events led to their classification into two groups, due to the rate and extent of dilation of the pore; lengthening Syb2 reduced the population of fast spikes, leaving the slow one unchanged. Slow fusion events might be due to a partial zippering of the SNAREpin while fast fusion events require a tight one, i. E. A short intermembrane distance to assure rapid dilation of the pore. Cdc42 controls actin dynamics. TIRFM experiments showed that its silencing in BON cells reduced the number of granules undergoing full fusion, with little effect on their recruitment and docking at the membrane. Using amperometry, we showed that this silencing reduced the number of high spikes due to fast and complete dilation of the pore, and increased stand-alone foot signals reflecting pores failing to enlarge. Increasing membrane tension rescued the effects of silencing while decreasing it through actin depolymerization mimicked Cdc42 silencing. Cdc42 might control fusion pore dilation by modulating membrane tension

L’introduction commence avec la description de toxines d’origines bactérienne et végétale, en particulier la toxine Shiga ainsi que les toxines de la même famille (chapitre 9.1.2). Les petites molécules inhibitrices de ces toxines sont ensuite résumées dans le chapitre 9.1.3, en particulier le composé Retro-2. L’efficacité de ces toxines à atteindre leurs cibles reposant sur le trafic intracellulaire, un aperçu général de l’endocytose et du trafic endosomal sont présentés (chapitre 9.2). Puis, l’entrée de la voie rétrograde est décrite (chapitre 9.2.5), avec un intérêt particulier porté sur la clathrine, le rétromère et GPP130, une protéine qui circule de manière continue entre le Golgi, la membrane plasmique et les endosomes. Les protéines SNARE, en particulier la syntaxine-5 et le syntaxine-16, sont ensuite introduites (chapitre 9.2.6). Après une brève section sur les micro-ARNs de la famille 199 (chapitre 9.3), l’introduction se termine avec la description des techniques clés utilisées au cours de mon travail, tels que la chimie click bio-orthogonale, la synchronisation du trafic antérograde par rétention grâce à des hameçons spécifiques (RUSH), et la ligation par proximité basé sur des anticorps (chapitre 9.4).Ci-inclus, mon article en cours de soumission ouvre la partie résultats (chapitre 10.1), dans laquelle je présente l’intérêt de la chimie click bio-orthogonale pour identifier les cibles cellulaires de Retro-2. Je décris un des candidats potentiels, Sec16A, et illustre comment grâce à la technique de RUSH, perturber la fonction de Sec16A conduit à la relocalisation partielle de la syntaxin-5 au niveau du reticulum endoplasmique via l’inhibition du transport antérograde de la syntaxine-5. La seconde partie de l’article décrit comment la relocalisation de la syntaxine-5 induit l’inhibition du trafic de la toxine Shiga des endosomes au TGN. Je présente une nouvelle interaction entre la syntaxine-5 et la protéine TGN GPP130, qui ont déjà été caractérisées en relation avec le trafic de la toxine Shiga. Mon travail connecte à la fois les facteurs de trafic avec le trafic rétrograde au niveau de l’interface endosome-TGN. De manière frappante, cette interaction est très probablement basée sur une fonction non-SNARE de la syntaxine-5 car le domaine de fixation sur GPP130 est structurellement non lié à toute fonction SNARE.En collaboration avec Juan Francisco Aranda et Carlos Fernandez aux Etats-Unis, nous avons placés des micro-ARNs dans un contexte de régulation endogène du trafic rétrograde de la toxine Shiga (chapitre 11.2). Une discussion plus approfondie sera apportée dans le chapitre 12.Enfin, une vue d’ensemble des projets en cours est apportée dans la section des perspectives (chapitre 12), dans laquelle les collaborations plus approfondies sont mises en lumière.Mots clés : transport rétrograde, toxine Shiga, toxine de la famille Shiga, STxB, syntaxin-5, Sec16A, GPP130, Retro-2, Retro-2.1, chimie click sans cuivre, identification des cibles de petites molécules, spétrométrie de masse, function non-SNARE, inhibition du trafic antérograde, miARN, miR199, rétromère, VPS26
The introduction of my PhD manuscript starts with describing plant and bacterial toxins (chapter 9.1), in particular Shiga toxin and Shiga-like toxins (SLTs) (chapter 9.1.2). Small molecule inhibitors of these toxins are summarized afterwards in chapter 9.1.3, notably the Retro-2 compound. Since these toxins rely on intracellular trafficking to reach their molecular targets, a general overview of endocytosis and endosomal trafficking is provided (chapter 9.2). Next, the retrograde route entry is presented (chapter 9.2.5), with focus on clathrin, the retromer and GPP130, a protein that constantly cycles between Golgi, plasma membrane, and endosomes. SNARE proteins, particularly syntaxin-5 and syntaxin-16, are then introduced (chapter 9.2.6). After a brief section of the micro RNA family 199 (chapter 9.3), the introduction finishes with the description of some salient techniques that were used in my work, such as - bio-orthogonal Click-Chemistry, anterograde trafficking synchronization with the retention using selective hooks (RUSH) assay, and the antibody-based proximity ligation assay (chapter 10.6.1, 0, 10.11.1).Herein, my submitted publication opens the results part (chapter 11.1), in which I present the utility of biorthogonal click chemistry for the search of the cellular targets of Retro-2, a small molecule inhibitor that was previously shown to protect cells and animals against Shiga toxin and ricin. I describe that Sec16A is a likely cellular target candidate, and illustrate using the RUSH approach how interfering with Sec16A functions leads to the partial relocalization of syntaxin-5 to the endoplasmic reticulum (ER) by slowing-down its anterograde transport. The second part of the paper describes how syntaxin-5 relocalization causes the inhibition of Shiga toxin trafficking from endosomes to the TGN. I present a novel interaction between syntaxin-5 and the Golgi protein GPP130, which both have been already described in relation to Shiga toxin trafficking. My work connects both trafficking factors in retrograde trafficking at the endosomes-TGN interface. Strikingly, I demonstrate that this interaction is most probably based on a non-SNARE function of syntaxin-5.In collaboration with Juan Francisco Aranda and Carlos Fernandez in the US, we put micro RNAs into an endogenous regulation context of Shiga toxin retrograde trafficking (chapter 11.2). An extended discussion will be given in chapter 12.Last, a general outlook of ongoing projects is given in the perspectives section (chapter 13), in which further collaborations are highlighted.Keywords: Retrograde transport, Shiga toxin, Shiga-like toxin (SLT), STxB, syntaxin-5, Sec16A, GPP130, Retro-2, Retro-2.1, azide-functionalized Retro-2, copper-free click chemistry, small molecule target identification, mass spectrometry, non-SNARE function, anterograde trafficking inhibition, miRNA, miR199, retromer, VPS26

Yersinia pseudotuberculosis appartient à la famille des Enterobacteriaceae et peut être responsable de syndromes articulaires et digestifs. Au cours de la colonisation de l’hôte, une minorité des bactéries va, en plus de l’étape de multiplication extracellulaire présenter une phase de réplication intracellulaire dans les macrophages. Une partie des Y. pseudotuberculosis va se répliquer dans les macrophages en usurpant la voie de l’autophagie, afin de créer une niche réplicative au sein des autophagosomes bloqués dans leur maturation. Le trafic membranaire associé à l’infection de Y. pseudotuberculosis reste à ce jour peu caractérisé. Dans un premier temps, nous avons observé que lors de l’infection d’une cellule épithéliale par Y. pseudotuberculosis, la vacuole bactérienne est associée avec le marqueur des autophagosomes, la protéine LC3 mais de façon surprenante cette vacuole ne présente pas deux mais une membrane unique. Par ailleurs, nous avons montré que les protéines SNARE jouent un rôle majeur au cours du trafic intracellulaire de Y. pseudotuberculosis. VAMP3 et VAMP7 sont recrutées de manière séquentielle au niveau de la vacuole de Y. pseudotuberuclosis. VAMP7 va participer au recrutement de LC3 au niveau de la vacuole bactérienne et nous proposons que VAMP3 est un des constituants du check-point permettant l’adressage de la bactérie vers des vacuoles présentant une ou de multiple membranes positives pour LC3. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des protéines de la voie autophagique et des endosomes, recrutées au niveau de la vacuole bactérienne à membrane unique et positive pour LC3. Nous avons mis en évidence que les protéines impliquées dans la formation de l’autophagosome et les marqueurs des endosomes précoces sont recrutées au niveau de la vacuole contenant Y. pseudotuberculosis. Cette vacuole positive pour LC3 va en suite acquérir les marqueurs des endosomes tardifs et du lysosome mais n’est pas acidifiée. En outre, nous avons initié des travaux sur un criblage en haut contenu afin d’identifier les partenaires des protéines SNARE et leurs rôles dans le trafic intracellulaire de Y. pseudotuberuclosis. Ces travaux démontrent l’importance de l’analyse de l’ultrastructure des compartiments positifs pour LC3. Ils illustrent comment la bactérie s’adapte à son environnement pour établir sa niche réplicative. Ils présentent enfin l’importance de la régulation de l’autophagie avec la première mise en évidence d’un check-point entre deux voies de compartimentation positives pour LC3 mais morphologiquement différentes
Yersinia pseudotuberculosis is a member of the Enterobacteriaceae family. In human, Y. pseudotuberculosis infection is responsible for enteric and, in rare cases, erythema nodosum. During host colonization, a minor part of Y. pseudotuberculosis presents an intracellular replication step. Y. pseudotuberculosis can replicate inside macrophages by hijacking the autophagy pathway. The bacteria are able to block autophagosome maturation by acidification impairment, which allows to create a replicative niche. The membrane traffic during internalization of Yersinia remains poorly characterized. First, we highlighted that in epithelial cells, Y. pseudotuberculosis replicates mainly in vacuoles positive for LC3, a hallmark of autophagy. Surprisingly, this LC3-positive-vacuole presents only single limiting membrane. Second, we showed that SNARE proteins play a role in Y. pseudotuberculosis intracellular traffic. VAMP3 and VAMP7 are sequentially recruited to Yersinia-containing vacuoles (YCVs). VAMP7 is involved in the LC3 recruitment to YCVs with single- and double-membrane. We proposed that VAMP3 is a component of the molecular checkpoint for bacterial commitment to either single- or double-membrane LC3-positive pathway. Third, we characterized the traffic of endosomal proteins recruited to LC3-positive-YCV with single membrane in epithelial cells. We showed that markers of early endosome and proteins involved in autophagosome formation, are recruited to YCVs during the early stage of infection. Then, the vacuole acquire late endosomal and lysosomal proteins but acidification is not observed. Finally, we initiated a high-content screening approach for the identification of SNARE partners.Overall this work illustrates the importance of LC3-positive compartment ultrastructure analysis. Our result demonstrate how bacterial subvert the molecular machinery of the host in order to create a replicative niche. Finally, we present the importance of autophagy regulation by highlighting for the first times the existence of a molecular checkpoint between two LC3-positive vacuoles with different morphologies

Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) sont essentielles pour la fusion membranaire. J'ai étudié chez Arabidopsis thaliana la SNARE Memb11 de l’appareil de Golgi qui intervient au début de la voie sécrétoire à l'interface Réticulum endoplasmique (RE)-appareil de Golgi. Dans les cellules de mammifères, l'orthologue de Memb11 (Membrine) est un « récepteur » potentiel de la GTPase Arf1 à la membrane golgienne. Cette dernière est impliquée dans le recrutement de la machinerie COPI nécessaire au transport rétrograde de l'appareil de Golgi vers le RE. Le but de ce travail était de déterminer si Memb11 pouvait interagir avec Arf1 dans les cellules végétales. Des anticorps dirigés contre la partie cytosolique de Memb11 ont été obtenus et ont été utilisés sur tissus végétaux pour réaliser des immunomarquages en microscopie électronique à transmission et des immunoprécipitations sur extraits de plantes. Il a été démontré que Memb11 est située au niveau de la membrane cis-golgienne et qu'elle co-immunoprécipite avec Arf1, suggérant ainsi que Arf1 peut interagir avec Memb11. J'ai confirmé l'interaction de Memb11 et Arf1 au niveau de l'appareil de Golgi par des expériences de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) in vivo. Cette interaction est spécifique puisque ni Memb12 (90% d'identité avec Memb11) ni Sec22 interagissent avec Arf1. Grâce à une approche de bioinformatique structurale, j'ai déterminé les régions de Memb11 (différentes de Memb12) qui pourraient être critiques pour l'interaction et j’ai commencé à tester in vivo les mutants correspondants par BiFC. En outre, des expériences d’immunoprécipitations avec des protéines recombinantes produites in vitro suggèrent que la forme d’Arf1 liée au GTP interagit avec Memb11
The SNARE proteins (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) are critical for membrane fusion in the secretory pathway. I have studied the Golgi SNARE Memb11 in Arabidopsis thaliana cells. Memb11 is involved at the ER-Golgi interface. In mammalian cells, the ortholog of Memb11 (Membrin) is the potential “receptor” of the GTPase Arf1 in the Golgi membrane. This protein is involved for the recruitment of the COPI machinery, required for retrograde transport from the Golgi to the ER. The aim of this work was to determine whether Memb11 can interact with Arf1 in plant cells. Antibodies against the cytosolic part of Memb11 were obtained and were applied on plant tissues to perform immunolabeling by transmission electron microscopy and immunoprecipitation (IP) studies. It has been shown that Memb11 is located at the cis-Golgi and that it co-immunoprecipated with Arf1, suggesting that Arf1 may interact with Memb11. I confirmed the interaction of Memb11 and Arf1 at the Golgi by in vivo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) experiments. This interaction was specific since neither Memb12 (90% identity with Memb11) nor Sec22 interacted with ARF1. Thanks to a structural bioinformatic approach, I determined the regions in Memb11 (different from Memb12) that could be critical for the interaction and started to test corresponding mutants in vivo by BiFC. In addition, IP experiments with recombinant proteins produced in vitro suggest that the GTP-bound form of ARF1 interacts with Memb11

Les épilepsies représentent une des maladies neurologiques les plus fréquentes. Dans environ 40 % des cas, une composante génétique est retrouvée. Seuls de rares syndromes sont transmis selon un mode mendélien, facilitant l’identification des gènes en cause. Certaines épilepsies sont causées par des anomalies de gènes codant pour des canaux ioniques voltage- ou ligand-dépendants et font partie de la famille des canalopathies. Au cours de mon travail de thèse, la recherche de gènes candidats a permis d’identifier de nouvelles mutations responsables de certaines formes d’épilepsies familiales entrant dans le cadre des canalopathies. D’autres épilepsies sont causées par la mutation de gènes ne codant pas pour un canal ionique. L’étude d’une grande famille d’origine tchèque a conduit à l’identification d’une nouvelle mutation non-sens du gène KCNQ2, codant pour une sous-unité du canal potassium voltage-dépendant qui génère le courant de type M. Cette mutation entraîne la perte de la quasi totalité du domaine C-terminal de la protéine dont le rôle est essentiel pour la fonction et la régulation de ce canal. Certaines épilepsies peuvent être liées à la présence de remaniements chromosomiques ou de délétions. La caractérisation d’une délétion du chromosome 2q chez une patiente présentant une épilepsie sévère, un retard mental et des dysmorphies a permis de mettre en évidence la perte d’une région d’au moins 2,9 kb contenant les gènes SCN1A et SCN2A qui codent pour des sous-unités de canaux sodium voltage-dépendants. Nous avons réalisé une étude de liaison génétique chez une famille française atteinte du syndrome GEFS+ (Generalized Epilepsy and Febrile convulsions Syndrome). Ces travaux ont permis d’exclure, chez cette famille, les gènes déjà décrits comme étant responsables de ce syndrome (SCN1A,SCN2A et GABRA2). Deux projets portant sur l’étude de syndromes épileptiques nous ont amenés à étudier plus particulièrement trois gènes. Tout d’abord, j’ai participé à l’étude d’une grande famille strasbourgeoise dans laquelle co-ségrègent une épilepsie rolandique et un trouble du langage. Un gène a été localisé en Xq21-q22. Une mutation pathogène responsable de ce nouveau syndrome dominant lié à l’X a été identifiée dans le gène SRPX2. Ce gène ne code pas pour un canal ionique mais pour une protéine sécrétée de 465 acides aminés. Cette mutation identifiée, de type faux-sens (A1398G), crée un site de N-glycosylation. Une deuxième mutation a été découverte dans une famille australienne dont certains membres présentent une épilepsie rolandique, un retard mental et une polymicrogyrie. Ensuite au cours de la recherche du gène responsable du syndrome ICCA (Infantile Convulsions and ChoreoAthetosis), deux nouveaux gènes codant l’un pour un transporteur sodium/glucose, hKST1, et l’autre pour une nouvelle syntaxine humaine, STX1B2, ont été caractérisés. Ces études ont abouti non seulement à l’exclusion de ces gènes dans le syndrome ICCA mais aussi à l’étude plus approfondie de la syntaxine 1B2. Le gène STX1B2 code pour deux isoformes protéiques, l’une avec (STX1B2-TM) et l’autre sans domaine transmembranaire (STX1B2-TMD). La plupart des syntaxines sont insérées dans les membranes par un domaine transmembranaire (TMD) C-terminal. STX1B2-TMD est retrouvée exclusivement dans le nucléoplasme des neurones du cortex cérébral humain adulte et dans celui de divers types de cellules en culture : elle n’est pas localisée dans le nucléole, ni dans l’enveloppe nucléaire. Ceci constitue la première localisation nucléoplasmique d’une syntaxine. L’importation nucléaire de STX1B2-TMD dépend de la protéine Ran et son extrémité C-terminale riche en glycines (VSGAGGLGVGGGAQG) agit comme un NLS «non classique». Dans des cellules en interphase, STX1B2-TMD est colocalisée avec NuMA et avec les lamines A/C dans la lamina et la matrice nucléaire. Dans des cellules en division, STX1B2-TMD est colocalisée avec NuMA au niveau des centrosomes. L’isoforme de STX1B2 sans TMD présente donc un ensemble de caractéristiques originales qui sont autant d’arguments en faveur d’une fonction nouvelle pour cette protéine
Epilepsy represents one of the most common neurological diseases. In approximately 40% of the cases, a significant genetic component is found. However most of these idiopathic epilepsies display a complex transmission. Only few syndromes are transmitted with a mendelian mode, facilitating the identification of disease-responsible genes. Some idiopathic epilepsies, related to defects of genes encoding ionic voltage- or ligand-gated channels, are thus being considered as channelopathies. Nevertheless, many other types of genes which may be less « evident », and also probably more frequent, remain to be identified. For exemple, two genes, LGI1 and EFHC1, have recently been implicated in epileptic idiopathic syndromes. The study of a large Czech family led to the identification of a new nonsense mutation of KCNQ2 gene, encoding a voltage-gated K+ channel subunit, involved in the generation of M-current. This mutation led to a putative protein that lacked nearly all its cytoplasmic carboxyl terminus part, which plays a critical role for the accurate expression of the functional K+ channels. Our study confirms that KCNQ2 is a major gene involved in BNFC. In some cases epilepsies can be due to chromosomal deletions. We characterize a 2q deletion on a patient with severe epilepsy, retardation and dysmorphic features. The deletion spans a minimal size of 2,9 kb including SCN1A and SCN2A. Another study was a genetic linkage study in a large multigenerational family with GEFS+ in France. We excluded the candidate genes (SCN1A, SCN2A et GABRA2) and loci for febrile seizures and GEFS+. Two studies of epileptic syndromes led us to identify and characterize three new genes. We study a large family from Strasbourg, displaying a rolandic epilepsy associated with a language impairment, and oral and speech dyspraxia. Linkage on chromosome Xq21-q22 was obtained and the causal mutation for this new X-linked dominant syndrome (RESDX) was identified in SRPX2 gene. This gene does not encodes an ionic channel, but a secreted protein (465 amino acids), containing one HYR and three sushi domains. The identified missense mutation (A1398G) creates an extra N-glycosylation site, strongly suggesting a functional consequence. A second mutation was found in a Australian family in wich several members displayed a rolandic epilepsy, mental retardation and a polymicrogyria. Moreover, In the course of the in silico search for candidate genes within the ICCA critical genomic region, we have identified and characterized two human genes, that we named hKST1, encoding a Na+/Glucose cotransporter, and STX1B2, encoding a new human syntaxin. The syntaxins represent a group of proteins that are required for traffic between various intracellular membrane compartments. They are major participants in a large variety of physiological processes where membrane fusion occurs, including exocytosis. Additional functional diversity of the syntaxins might be sustained by alternative splicing. We have identified a human syntaxin gene, STX1B2, encoding two protein isoforms, one of which (STX1B2-TMD) lacks the classical C-terminal transmembrane domain. By contrast with the plasma membrane localization of the classical STX1B2-TM isoform, STX1B2-TMD localized to the nucleoplasm of various cell types in vitro and in vivo. Nuclear import of STX1B2-TMD protein occurred via a Ran-dependent pathway and a specific, glycine-rich, C-terminus of 15 amino acids (VSGAGGLGVGGGAQG) used as an unconventional nuclear localization signal. STX1B2-TMD co-localized with the nuclear matrix protein NuMA to the pericentrosomal region of the mitotic spindle and co-localized in interphasic nuclei with NuMA and lamin A/C. We thus report for the first time the nuclear localization of a member of the syntaxin family of proteins and its co-localization with nuclear matrix proteins raises new and exciting insights into its possible function in human cells

Lors du développement, les molécules de guidage attractives et répulsives, telles que les Sémaphorines (Sema), sont responsables de la formation du réseau neuronal des axones et des dendrites. Les molécules de guidage extracellulaire se lient à des récepteurs qui activent les voies de signalisation intracellulaire et remodèlent le cône de croissance. Le rôle du trafic membranaire dans le guidage axonale est encore largement inconnu. Le trafic membranaire nécessite les protéines SNARE pour la fusion membranaire. La SNARE vésiculaire Synaptobrévine2 (Syb2) est connue pour son rôle dans la libération des neurotransmetteurs dans les neurones matures tandis que TI-VAMP est principalement connue pour son rôle dans la croissance axonale. Leurs rôles potentiels dans le guidage axonale demeurent inconnus. J'ai montré que Syb2 est nécessaire pour la répulsion SemaSA-dépendante, mais pas pour l'attraction SemaSC-dépendante dans des neurones en culture et dans le cerveau murin. Syb2 interagit aussi avec Neuropilinel et PlexinAl, les deux éléments du récepteur à la SemaSA, via son domaine juxta-transmembranaire. Nous concluons que signalisation et la répulsion axonale SemaSA-dépendante nécessitent le trafic vésiculaire Syb2-dépendante. Nous proposons donc un modèle dans lequel la répulsion induite par la SemaSA requiert une endocytose locale accrue et une diminution de l'exocytose. La SemaSA est également impliquée dans le guidage de cellules non neuronales. Certaines de nos observations ont été obtenues dans des cellules non neuronales, suggérant que nos conclusions peuvent s'appliquer généralement à la signalisation de la SemaSA
During development, attractive and repulsive guidance molecules, such as semaphorins (Sema), are responsible for proper wiring of axons and dendrites. Attractive and repulsive external guidance cues bind to receptors which activate intracellular signalling pathways and reshape the growth cone. The role of vesicular traffic in axonal guidance is still largely unknown. Vesicular traffic requires SNAREs proteins for membrane fusion. The exocytic vesicular SNARE Synaptobrevin2 (Syb2) mediates neurotransmitter release in mature neurons while TI-VAMP is mainly known for mediating axon growth. Their potential roles in axon guidance remain elusive. According to a previous model, attraction would rely solely on Syb2-dependent exocytosis while repulsion would exclusively require endocytosis. However, my PhD work has hinted a more complex view on guidance mechanisms. I showed that Syb2 is required for SemaSA-dependent repulsion but not SemaSC-dependent attraction in cultured neurons and in the mouse brain. Syb2 associates with Neuropilinl and PlexinAl, two essential components of the SemaSA receptor, via its juxta-transmembrane domain. We concluded that SemaS A-mediated signalling and axonal repulsion require Syb2-dependent vesicular traffic. We thus propose a model in which SemaSA-induced repulsion is mediated by local increased endocytosis and decreased exocytosis. SemaSA is also involved in non neuronal cell navigation, Some of our observations were obtained in non-neuronal cells further suggesting that our conclusions may more generally apply to SemaSA signaling

Les exosomes sont des vésicules membranaires de 30 à 100 nm de diamètre, formées dans les endosomes multivésiculaires et sécrétées par la plupart des cellules. Les propriétés biophysiques et biochimiques des exosomes ainsi que les mécanismes permettant leur biogénèse et sécrétion ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, ces derniers sont encore méconnus, limitant l'analyse des fonctions des exosomes in vivo. Au moins deux mécanismes ont été proposés pour la biogénèse des exosomes : un mécanisme nécessiterait l’action de protéines impliquées dans le tri endosomal, les ESCRT (« endosomalsorting complex required for transport »). Un autre mécanisme serait indépendant de leur fonction. La sécrétion des exosomes, une fois générés dans les endosomes, requiert la petite GTPase, Rab27a, comme montré dans un modèle cellulaire humain. Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la biogénèse et la sécrétion des exosomes. Une première étude visant à analyser la fonction de Rab27a dans des cellules murines, m’a permis de mettre en évidence l’existence de différentes populations d’exosomes, dont la sécrétion dépend ou non de Rab27a. Une deuxième étude a eu pour objectif d’analyser l’implication des ESCRT dans la biogénèse des exosomes dans des cellules HeLa CIITA. Le criblage d’une librairie d’ARN d’interférence dirigés contre les différentes protéines ESCRT, a permis l’identification de 7 molécules potentiellement impliquées dans cette voie : HRS, STAM1, TSG101, leur inactivation induisant la diminution de la sécrétion des exosomes. L’inactivation de CHMP4C, VPS4B,VTA1 et ALIX, au contraire, l’augmente. L’inhibition de l’expression de ces candidats suivie de l’analyse des exosomes sécrétés a démontré l’hétérogénéité des vésicules sécrétées, et une modification de leur taille et de leur composition protéique par rapport aux cellules contrôle. Plus particulièrement, l’inactivation d’ALIX induit une augmentation de lasécrétion d‘exosomes de plus grande taille, et l’enrichissement sélectif en molécules de CMH de classe II. En accord, j’ai montré que les cellules inactivées pour ALIX, aussi bien des cellules HeLa que des cellules dendritiques humaines ont une plus forte expression de CMH de classe II à la surface et dans des compartiments intracellulaires. Ces résultats suggèrent l’implication de certains membres de la famille ESCRT dans la voie de biogenèse et sécrétion des exosomes, ainsi qu’un rôle potentiel d’Alix dans le trafic des molécules CMH de classe II, et dans la modulation de la composition protéique des exosomes
Exosomes are small membrane vesicles with sizes ranging from 30 to 100 nm in diameter, which are formed in multivesicular endosomes and secreted by most cell types. Numerous studies have focused on the biophysical and biochemical properties of exosomes, as well as the mechanisms of biogenesis and secretion of these vesicles. However, these aspects are not fully understood, which limits the analysis of the functions of exosomes in vivo. At least two mechanisms have been proposed for the biogenesis of exosomes : one would rely on the function of proteins involved in endosomal sorting, the ESCRT family (for “endosomal sorting complex required for transport”). Another mechanism would be independent of their activity. Once exosomes are formed in endosomes, their secretion requires the small GTPase RAB27A, as shown in a human cell line. The objective of my PhD project was to gain insights into the molecular mechanisms that drive exosome biogenesis and secretion. A first study performed to analyze the function of Rab27a in murine cells allowed me to show the existence of different populations of exosomes, dependent or not on Rab27a for their secretion. A second study was aimed at analyzing the involvement of ESCRT proteins in exosome biogenesis in HeLa-CIITA cells. Seven molecules potentially involved in this process were identified on the basis of the screening of an RNA interference library directed against the different ESCRT proteins: the inactivation of HRS, STAM1 and TSG101 induced a decrease in exosome secretion, whereas the down regulation of CHMP4C, VPS4B, VTA1 and ALIX increased it. Gene expression of the different candidate proteins was inhibited and exosomes secreted by these cells were analyzed: we showed the heterogeneity of the secreted vesicles, as well as an alteration of their size and protein composition, as compared to control cells. In particular, the inactivation of ALIX induced an increase in the secretion of larger vesicles, and the selective enrichment of these vesicles in MHC class II molecules. Accordingly, I showed that both HeLa-CIITA and human primary dendritic cells inactivated for ALIX possess a higher expression of MHC class II molecules at the cell surface and in intracellular compartments. These results suggest that some members of the ESCRT family are involved in the exosome biogenesis and secretion pathway, and propose a potential role of ALIX in the trafficking of MHC class II molecules and in the modulation of the protein composition of exosomes

La croissance des neurites au cours du développement neuronal nécessite une expansion de la membrane plasmique (MP) via l’insertion de nouveaux lipides et protéines. Cet événement se produit à la suite de la fusion des vésicules de sécrétion avec la MP. Cependant, plusieurs études ont montré que le transfert non-vésiculaire de lipides au niveau des sites de contact entre le réticulum endoplasmique (RE) et la MP joue aussi un rôle dans la croissance des cellules. Des membres de la famille de synaptotagmines étendues (E-Syts) ont été identifiés comme protéines de transfert des lipides dépendantes du Ca2+ au niveau des jonctions RE-MP.Nous avons découvert qu’un nouveau complexe SNARE aux sites de contact RE-MP, composé par Sec22b et Stx1, est impliqué dans la croissance des neurites bien qu’il soit incapable de favoriser la fusion membranaire. Cependant, la manière dont ce complexe participe à l’extension des neurites reste à élucider. Chez la levure, Sec22 interagit avec les protéines de transfert des lipides de la famille OSH, enrichis aux sites de contact RE-MP.Sur la base de ces observations, notre hypothèse est que le transfert non-vésiculaire de lipides induit par E-Syts au niveau des jonctions RE-MP contenant Sec22b pourrait contribuer à la croissance neuronale. L’objectif de ma thèse était d’explorer cette hypothèse. Nous montrons que Sec22b interagit avec E-Syt2 et Stx1 dans les cellules PC12 et avec E-Syt2, E-Syt3 et Stx3 dans les cellules HeLa. L’interaction Sec22b/E-Syt2 dépend du domaine Longin de Sec22b. La surexpression des E-Syts stabilise l’association Sec22b/Stx1, alors que l’inactivation des E-Syts provoque l’effet inverse. La surexpression de E-Syt2 de type sauvage, mais pas des mutants incapables de transférer les lipides ou non fixés au RE, augmentent la formation de filopodes axonaux et la ramification de neurites dans les neurones en développement. Cet effet est inhibé par une neurotoxine clostridiale clivant Stx1, par l’expression du domaine Sec22b Longin et par un mutant Sec22b ayant une extension entre les domaines SNARE et transmembranaire.En conclusion, mes résultats soutiennent l’idée que les sites de contact Sec22b/Stx1 contribuent à l’expansion de la MP via une interaction avec des protéines de transfert de phospholipides comme E-Syts
The growth of neurites during neuronal development requires a massive increase of surface area via the insertion of new proteins and lipids. This event occurs through the fusion of secretory vesicles with the plasma membrane (PM), the final step of the secretory pathway. Recently, non-vesicular transfer of lipids at contacts between endoplasmic reticulum (ER) and PM was shown to contribute to membrane expansion. Members of the ER-integral membrane protein Extended-Synaptotagmin (E-Syt) family have been identified as Ca2+-dependent lipid transfer proteins at ER-PM contact sites, and shown to transfer glycerophospholipids via their lipid binding domains. The laboratory previously found that a novel ER-PM SNARE complex, composed of the ER-resident Sec22b and the neuronal plasmalemmal Stx1, is involved in neurite growth despite being unable to mediate membrane fusion. However, how this complex participates to neurite extension remained to be elucidated. In yeast, Sec22 interacts with lipid transfer proteins of the OSH family, enriched at the ER- PM contacts, supporting a role for Sec22b-populated ER- PM junctions in non-vesicular lipid transport between these bilayers. Based on these observations, our starting hypothesis was that E-Syts-mediated non-vesicular lipid transfer at Sec22b-populated ER-PM contacts, might contribute to neurite growth. The goal of my PhD was to explore this hypothesis with two specific questions: 1-What are the partners of Sec22b complexes which might be involved in the unconventional mechanisms of membrane expansion? 2-What is the mechanism whereby the non-fusogenic SNARE Sec22b/Stx1 complex acts in neuronal development?Here we show that Sec22b interacts with E-Syt2 and Stx1 in PC12 cells and with E-Syt2, E-Syt3 and Stx3 in HeLa cells. Overexpression of E-Syt2 stabilized Sec22b-Stx3 association, whereas silencing of E-Syt2 had the opposite effect. Overexpression of E-Syt2 full length, but not the mutant forms which are unable to transfer lipids or attach to the ER, increased the formation of filopodia particularly in the growing axon. Finally, this effect was inhibited by a clostridial neurotoxin cleaving Stx1, by the expression of Sec22b Longin domain and a by a Sec22b mutant with extended linker between SNARE and transmembrane domains.In conclusion, these results support the hypothesis that Sec22b/Stx1 junctions may contribute to membrane expansion via an interaction with phospholipid transfer proteins like E-Syts

Le facteur positif d'élongation de la transcription P-TEFb est un facteur de transcription général, requis non seulement pour une expression efficace de la majorité des gènes codant des protéines, mais également pour la production de transcrits viraux pleine taille à partir du génome du VIH-1 intégré dans le génome de la cellule hôte. Composé de la kinase CDK9 et d'une cycline T associée, le complexe P-TEFb stimule l'élongation de la transcription en phosphorylant l'ARN polymérase II (ARN pol II), l'enzyme responsable de la synthèse de tous les ARN messagers de la cellule. L'activité du complexe P-TEFb est régulée négativement par sa séquestration réversible et dynamique au sein de la petite particule ribonucléoprotéique nucléaire 7SK (snRNP 7SK) par le petit ARN nucléaire 7SK (snARN 7SK), en coopération avec la protéine HEXIM. La snRNP 7SK contient également les protéines LARP7 et MePCE qui sont associées stablement au snARN 7SK et le stabilisent. La transcription initiée à partir du promoteur LTR (Long Terminal Repeat) du génome du VIH-1 intégré est régulée principalement à l'étape d'élongation. La processivité de la transcription du génome viral dépend de la protéine virale Tat qui recrute P-TEFb au niveau de l'ARN pol II. En plus de son rôle dans le recrutement de P-TEFb, la protéine Tat entraîne le désassemblage de la snRNP 7SK pour augmenter le niveau de P-TEFb actif dans les cellules infectées. Mes travaux de thèse ont visé à mieux définir comment la snRNP 7SK est assemblée et comment la protéine Tat du VIH-1 est capable de la désassembler. Nous avons démontré que la structure en tige-boucle située à l'extrémité 5' du snARN 7SK contient deux motifs de liaison pour les protéines HEXIM ; in vivo, ces deux motifs recrutent deux protéines HEXIM de manière interdépendante. Nous avons ensuite montré que Tat et HEXIM se lient au snARN 7SK de manière mutuellement exclusive. Tat remplace efficacement HEXIM sur le snARN 7SK in vivo permettant ainsi le désassemblage de la snRNP 7SK/HEXIM/P-TEFb pour augmenter le niveau de P-TEFb actif. Enfin, nous avons identifié les éléments du snARN 7SK impliqués dans la liaison des proteins LARP7 et MePCE
Synthesis of mRNAs by RNA Pol II is tightly controlled at the step of transcription elongation by the positive transcription elongation factor b (P-TEFb) that is a cyclin-dependent kinase composed of Cdk9 and cyclin T. P-TEFb is a general transcription factor that is required for efficient expression of most protein-coding genes as well as for production of full-length transcripts from the integrated HIV-1 genome. In human cells, about half of P-TEFb forms a kinase-inactive ribonucleoprotein (RNP) with the 7SK snRNA and the HEXIM, LARP7, and MePCE proteins. While LARP7 and MePCE bind stably to and provide stability for 7SK snRNA, P-TEFb and HEXIM show a dynamic, transcription-dependent association with 7SK snRNA. Transcription initiated from the long terminal repeat (LTR) promoter of the integrated HIV-1 genome is controlled predominantly at the level of elongation. The processivity of HIV transcription depends on the viral transactivator Tat that recruits P-TEFb to the RNA Pol II. Besides tethering P-TEFb to the RNA pol II, Tat also promotes the disassembly of the 7SK/HEXIM/P-TEFb snRNP to increase the nuclear level of active P-TEFb in infected cells. I focused my research on trying to understand how the 7SK snRNP is assembled and how the HIV-1 Tat protein is able to disrupt it. We have demonstrated that the 5' hairpin of 7SK contains two binding sites for the HEXIM protein; under in vivo conditions these two HEXIM binding sites of 7SK snRNA recruit two copies of HEXIM in a tightly interdependent manner. We then showed that Tat and HEXIM bind to the 7SK snRNA in a mutually exclusive manner. Tat efficiently replaces HEXIM1 on the 7SK RNA in vivo and therefore, it promotes the disassembly of the 7SK/HEXIM/P-TEFb negative transcriptional regulatory RNP to increase the nuclear level of active P-TEFb. Finally, we have identified the 7SK snRNA elements involved in the binding of the LARP7 and MePCE proteins

Un large spectre de bactéries pathogènes est capable d'interagir avec la cellule hôte via des microdomaines membranaires appelés radeaux lipidiques. Après l'invasion, certaines bactéries transitent vers la voie de l'autophagie. Dans ce travail, j'ai examiné le mécanisme d'entrée de la bactérie entéroinvasive Yersinia pseudotuberculosis dans les macrophages. Après avoir utilisés les radeaux lipidiques, la bactérie détourne la voie de l'autophagie pour se répliquer. Les autophagosomes contenant les bactéries présentent également des composants de ces microdomaines lipidiques. Lors de l'infection, la maturation de l'autophagosome est bloquée et l'inhibition de l'autophagie induit une mort cellulaire par apoptose. Cette étude présente un mécanisme original de subversion de la voie d'autophagie par un pathogène avec des conséquences majeurs sur la compréhension des mécanismes de défense et de l'immunité

La v-ATPase est une pompe à protons. Elle permet l’acidification d’organelles, ce qui est indispensable à de nombreux processus cellulaires. Cette enzyme est composée de 14 sous-unités différentes, organisées en deux domaines, le domaine catalytique V1 et le domaine membranaire V0. La sous-unité a du domaine V0 est essentielle au transport des protons. Il en existe 4 isoformes (a1 à a4) et des variants d’épissage (a1-I à a1-IV pour a1) permettant à la v-ATPase d’être adressée vers différents compartiments et donc d’être impliquée dans différents processus. Deux projets visant à étudier cette sous-unité ont été réalisés.En plus de son rôle dans le transport des protons, il a été montré que le domaine V0 de la v-ATPase est impliqué dans des évènements de trafic membranaire, tel que l’exocytose de vésicules de sécrétion. Ce rôle semble nécessiter des interactions avec les protéines SNAREs. J’ai montré, pendant la première partie de ma thèse, que les sous-unités flag-a1-I et flag-a1-IV sont toutes deux adressées aux granules de sécrétion de cellules neurosécrétrices et interagissent avec les protéines SNAREs VAMP2 et syntaxine-1. De façon intéressante la syntaxine-1 semble interagir préférentiellement avec la sous-unité a1-I qui dans les neurones est l’isoforme adressée aux terminaisons nerveuses. Les sous-unités a1-IV ne diffèrent d’a1-I que par l’ajout de 7 acides aminés dans sa moitié N-terminale. Le domaine d’interaction de la sous-unité a avec la syntaxine-1 semble donc être localisé dans cette région.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence et étudié l’expression de la sous-unité rénale a4 dans des gliomes humains. Ces tumeurs sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et sont en général associées à un mauvais pronostic. L’OMS distingue, en fonction de paramètres histologiques, les astrocytomes (de grade I à IV), les oligodendrogliomes et les gliomes mixtes (chacun de grade II ou III). Cette classification est controversée, notamment à cause de son manque de reproductibilité, et la prise en compte de marqueurs moléculaires semble s’imposer comme une solution pour la renforcer.J’ai quantifié par RT-PCR quantitative l’expression du gène ATP6V0A4 (codant la sous-unité a4) dans 188 prélèvements de gliomes humains. Nous avons ainsi montré que l’expression de la sous-unité a4 peut être utilisée comme marqueur diagnostique des oligodendrogliomes anaplasiques (35 % l’expriment). Dans un prélèvement, la présence de la codélétion 1p/19q et l’expression de a4, tout deux marqueurs indépendants des oligodendrogliomes, permettra le renforcement du diagnostique oligodendrogliome anaplasique. De plus a4 est fréquemment exprimée par les astrocytomes pilocytiques (70%), où elle est associée à la duplication en tandem de la région chromosomique 7q34 située à proximité directe du gène ATP6V0A4. Enfin une observation prometteuse est que l’expression de a4 pourrait être un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints d’oligodendrogliome anaplasique ne présentant pas la co-délétion 1p/19q, observation qui devra être confirmée sur une plus grande cohorte de patients
Vacuolar type H+-ATPase is a proton pump, which acidifies numerous organelles, crucial for many cellular processes. This enzyme is composed of 14 different subunits organized in two domains, a catalytic V1 domain and a V0 membrane domain. The a-subunit of V0 is essential for proton transport. There are 4 isoforms of a (a1 to a4) and splicing variants (a1-I to a1-IV for the a1 subunit). v-ATPases containing different a-subunit isoforms are localized in different compartments allowing v-ATPase to participate in different processes. The a-subunits were studied in this work in two distinct projects.Besides its role in proton pumping, V0 domain of v-ATPase is implicated in organelles trafficking events, like vesicles exocytosis. This role seems to require interactions of V0 with SNARE proteins. During my thesis work, I showed that flag-a1-I and flag-a1-IV are both targeted to secretion granules in PC12 neurosecretory cells. These subunits interact with the SNARE proteins VAMP2 and syntaxin-1. Interestingly, syntaxin-1 seems to preferentially interact with the a1-I subunit, isoform which in neurons is sorted to nerve terminals. The only difference between a1-I and a1-IV subunits is the addition of 7 amino acids in the N-terminal half of a1-IV. So syntaxin-1 probably interacts with a1-I at this location. In a second project, I studied the expression of the renal a4-subunit in human gliomas. These tumors are the most frequent brain tumors and are generally associated with a poor prognosis. Based on histological parameters,WHO distinguishes, astrocytomas (grade I to IV), oligodendrogliomas and oligoastrogliomas (each of grade II or III). This classification suffers of a lack of reproducibility, which could be overcome by the identification of specific molecular markers.In the present work, by real time quantitative PCR, ATP6V0A4 gene (encoding the renal a4) expression was quantified in 188 human glioma biopsies. We established a4 expression as a new marker of grade III oligodendrogliomas (35 % express it), independent of the 1p/19q codeletion, an established marker of oligodendrogliomas. Moreover, a4 is expressed in 70% of pilocytic astrocytomas, in which it is associated with the tandem duplication of 7q34, localized at direct proximity of the ATP6V0A4 gene. Of promising interest is the observation that a4 expression could be considered as a bad prognostic marker for patients with 1p/19q non-deleted oligodendrogliomas, an observation that should be confirmed on larger cohorts of patients

Depuis le début des années 2000, la connaissance précise du kinome a entraîné l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant des protéines kinases impliquées dans de nombreuses pathologies en oncologie et dans les maladies du système nerveux central. Afin de cibler les kinases d’intérêts identifiées au sein de ces travaux, nous avons effectué, dans une démarche orientée vers la diversité moléculaire, la synthèse de nouveaux hétérocycliques a fort potentiel de valorisation. Nous nous sommes appuyé sur la création et la fonctionnalisation de bicycles à 5 ou 6chaînons de type [6-5] ou [5-5], ces espèces chimiques représentant la voie d’accès à des inhibiteurs compétitifs du substrat naturel des kinases, l’ATP. Nous avons dans un premier temps travaillé autour des imidazo[1,2-b]pyridazines puis des[1,2,4] triazolo[4,3-b]pyridazines, scaffold plus original, pour concevoir des inhibiteurs plus actifs et spécifiques de la kinase HASPIN, nouvelle cible prometteuse en oncologie.Nous avons ensuite poursuivi les études précédentes du laboratoire sur les imidazo[2,1-b][1,3,4]thiadiazoles. Nous basant sur une méthodologie de synthèse bien développée, nous avons créé une librairie de composés dirigés contre les kinases DYRK1A et CLK1 impliquées dans les processus de neuro dégénération, notamment dans la maladie d’Alzheimer. Ainsi, au travers d’analogues des imidazothiadiazoles originaux, nous avons proposé des méthodologies de synthèses de ces nouveaux hétérocycles permettant des pharmaco modulations aisées.Ces divers projets de chimie médicinale ont pu être entrepris de façon à améliorer les connaissances des relations structure-activité, et concevoir de nouveaux inhibiteurs puissants des kinases HASPIN, DYRK1A etCLK1
Since the early 2000s, precise knowledge of kinome has induced the emergence of novel therapies targeting kinases involved in several kinds of pathologies in oncology and nervous central systems disorders.In order to target original kinases of interest identified in this work, we have developed diversity-oriented synthesis to create new high-valuable heterocycles. We have focused our efforts on the design and functionalization of [6-5] or [5-5] fused ring bicycles. Those chemical species representing a great pathway tocreate competitive inhibitors of ATP; the natural substrate of kinases.First-of-all, we have worked on imidazo[1,2-b]pyridazines and then on [1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazinesscaffolds, to create more active and selective HASPIN kinase inhibitors, a new hot-target in oncology.Then, we have pursued previous laboratory studies on imidazo[2,1-b][1,3,4]thiadiazoles. Based on a well-built methodology, we have synthesized severals DYRK1A and CLK1 kinases inhibitors involved in neurodegenerative disorders, as Alzheimer’s disease. Thus, through original imidazothiadiazoles analogues,we have proposed synthetic methodologies to design these novel heterocycles allowding esay pharmacomodulations.These medicinal chemistry projects have been undertaken to improved knowledge of structure-activityrelashionship, and providing novel strong inhibitors of HASPIN, DYRK1A or CLK1 kinases

Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer
From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

Les travaux présentés dans ce mémoire concernent l'étude de la biogenèse de la membrane plasmique des végétaux supérieurs, sur le modèle des plantules étiolées d'Allium porrum. La membrane plasmique des eucaryotes est nrichie en phosphatidylsérine, où elle joue un rôle fondamental dans diverses activités biologiques, notamment dans le trafic membranaire mettant en relation la cellule avec le milieu extracellulaire. Les études menées sur la relation entre la synthèse et le transport de la phosphatidylsérine à la surface cellulaire ont permis d'envisager le fait que ce phospholipide peut y avoir une double origine : vésiculaire, en provenance de la voie réticulum endoplasmique-Golgi-membrane plasmique, par une activité de synthèse à la surface cellulaire. Les espèces à acides gras à très longues chaînes sont triées et acheminées prioritairement vers la voie de sécrétion. Elles sont synthétisées en amont dans le réticulum endoplasmique par une activité d'échange de base, mais également dans la membrane plasmique avec la même activité enzymatique. Afin de caractériser des vésicules riches en phosphatidylsérine, formées et isolées dans un système acellulaire à partir du réticulum endoplasmique, des travaux ont été initiés sur la recherche d'ADNc codant pour des protéines membres potentiels de la famille des SNAREs Ykt6p. Chez l'animal et la levure, cette famille est impliquée dans le ciblage spécifique des vésicules issues du RE et destinées à l'appareil de Golgi
The work presented in this thesis concerns the study of the biogenesis of the plasma membrane in higher plants, on the model of Allium porrum. The plasma membrane of the eukaryotes is enriched in phosphatidylserine, where it plays a fundamental role in various biological activities, notably in the membrane traffic, allowing for exchanges in the extracellular environment. The studies carried out on the relationship between the synthesis and the transport of this phospholipid to the cellular surface, have demonstrated that there may be two different origins : vesicular, through the endoplasmic reticulum-Golgi apparatus pathway, and locally, by synthesis activity on the plasma membrane. Very long chain fatty acid species are sorted and directed in priority towards the secretion pathway. They are synthetized in the endoplasmic reticulum by a Base exchange activity, but also at the cellular surface with the same enzyme activity. In order to characterise vesicles which are rich in phosphatidylserine, formed and isolated from the endoplasmic reticulum in an cell-free system, studies have been carried out on the research of cDNA coding for proteins which are potentially members of Ykt6p SNAREs. In animals and yeast cells, this family is involved in the specific targeting of vesicles which come from the endoplasmic reticulum and which are to be used in the Golgi apparatus

La motivation première de mes travaux de recherche est de combiner des approches expérimentales et théoriques dans le domaine de la chimie physique pour atteindre une meilleure compréhension des phénomènes à l'échelle atomique. Mes travaux en cours traitent de systèmes d'intérêt biologique concernant les processus membranaires et des phénomènes accessibles par des méthodes de nanomanipulation. Les problèmes de la biophysique et biochimie sont au c?ur de mes recherches. J'ai effectué des simulations complexes de protéines membranaires dans une bicouche lipidique qui se sont montrées tout à fait complémentaires et révélatrices par rapport aux études expérimentales de biologie structurale. Une récente collaboration exploitant cette complémentarité a donné lieu à une publication dans la revue Nature en début 2009. [[i]] Les travaux récents visent à développer des approches combinant la réalité virtuelle avec les simulations moléculaires. [[ii]] Les systèmes biologiques étudiés présentent à la fois un intérêt physico-chimique, biologique et médical et peuvent atteindre un grand nombre d'atomes. En parallèle, je mène un travail de fond sur les méthodes de simulation et des approches novatrices. ----------------------- [[i]] N. Bocquet, H. Nury, M. Baaden, C. Le Poupon, J.P. Changeux, M. Delarue et P.J. Corringer: "X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation", 2009, Nature, 457, 111-114. [[ii]] O. Delalande, N. Férey, G. Grasseau et M. Baaden : "Complex Molecular Assemblies at hand via Interactive Simulations", 2009, J. Comput. Chem., 30, 2009, 2375-2387.

Les cellules dendritiques (DCs) jouent un rôle essentiel dans l’initiation des réponses immunitaires adaptatives par les lymphocytes T. Ces cellules présentent des antigènes phagocytés sur les molécules de classe I et II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) pour activer les lymphocytes T CD8+ et CD4+, respectivement. Contrairement à la présentation restreinte aux molécules de classe II du CMH, les voies intracellulaires impliquées dans la présentation des antigènes internalisés sur des molécules du CMH de classe I, un processus appelé présentation croisée, sont encore largement inconnus. Les DCs sont les seules cellules présentatrices d’antigènes à effectuer efficacement la présentation croisée. Ce processus a été impliqué dans l’établissement des réponses immunitaires cytotoxiques contre des bactéries, des tumeurs et certains virus qui n’infectent pas les DCs. Parmi les nombreuses caractéristiques, qui ont été proposées comme étant importantes pour la présentation croisée, la présence de composants du réticulum endoplasmique (RE) dans les phagosomes a généré une grande controverse. Ceci est en partie dû au fait que les mécanismes par lesquels ces composants sont recrutés dans la voie d’internalisation pour rencontrer les antigènes sont inconnus. En particulier, il reste à déterminer si des évènements de fusion entre le RE et les phagosomes ont lieu et s’ils sont nécessaires à la présentation croisée. Nos résultats ont identifié Sec22b comme un régulateur clé de la présentation croisée et des fonctions phagosomales dans les DCs. Cette molécule qui appartient à la famille des protéines SNARE est localisée dans le compartiment intermédiaire RE-Golgi et s’associe avec la Syntaxine 4, une SNARE de la membrane plasmique, qui est présente dans les phagosomes. La déplétion de Sec22b inhibe le recrutement de protéines résidentes du RE vers le phagosome et vers la vacuole contenant le parasite Toxoplasma gondii. Cette déplétion inhibe également la présentation croisée par les DCs d’antigènes phagocytés, endocytés, ou exprimés par T. Gondii ou E. Coli dans les DCs infectées par ces pathogènes. De plus, dans les DCs Sec22b déficientes, dans lesquelles les phagosomes sont dépourvus de composants du RE, la maturation phagosomale est accélérée et l’activité protéolytique est augmentée. L’ensemble de nos résultats montre que la fusion entre le RE et les phagosomes régule les fonctions de la voie d’internalisation des antigènes de manière à la rendre compatible et efficace pour leur présentation croisée
Dendritic cells (DCs) are essential players in the initiation of adaptive T cell-mediated immune responses. They present phagocytosed antigens on class I and II molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) to activate CD8+ and CD4+ T lymphocytes, respectively. In contrast to MHC class II-restricted presentation, the intracellular pathways involved in the presentation of internalized antigens on MHC class I molecules, a process known as cross presentation, remain unclear. DCs have been shown to be the only antigen presenting cells that can perform efficiently antigen cross presentation, and this process has been involved in establishing cytotoxic immune responses against bacteria, tumours and certain viruses that do not infect DCs. Among the many features that have been proposed to be important for cross presentation, the presence of endoplasmic reticulum (ER) components in phagosomes has generated a big controversy in the field. This is in part due to the fact that there is no evidence about the mechanism by which these components are recruited to the internalization pathway to encounter the antigens. Also, it is not clear if such fusion between phagosomes and the ER is absolutely required for cross presentation. Here we identify Sec22b as key regulator of cross presentation and of phagosomal functions in DCs. This protein that belongs to the SNARE family localizes to the ER-Golgi intermediate compartment and pairs to the plasma membrane SNARE Syntaxin 4, which is present in phagosomes. Depletion of Sec22b in DCs inhibits the recruitment of ER-resident proteins to phagosomes and to the vacuole containing the Toxoplasma gondii parasite. In Sec22b silenced DCs, cross presentation is compromised after antigen phagocytosis or endocytosis, as well as after invasion by T. Gondii or infection by E. Coli. We also observed that ER-deficient phagosomes acquire more rapidly lysosomal markers and display a higher proteolytic activity than normal DC phagosomes. Our results suggest that the fusion of the ER to phagosomes is essential for cross presentation not only by contributing with the MHC class I presentation machinery, but also by delaying phagosome maturation and promoting cross presentation conditions