Dissertations / Theses on the topic 'Protéines à domaine G-patch'

De nombreuses hélicases d'ARN sont requises pour la synthèse des ribosomes. Il a précédemment été démontré que Prp43p, hélicase d'ARN de type DEAH impliquée dans l'épissage, était également requise chez la levure pour la synthèse de la petite et de la grande sous-unité du ribosome et était associée à la plupart des particules pré-ribosomiques. Nous émettons l'hypothèse que Prp43p participe au remodelage de plusieurs particules pré-ribosomiques. Durant la première partie de ma thèse, j'ai contribué à la démonstration que la protéine à domaine G-patch Pfa1p se fixe directement sur Prp43p, pour stimuler ses activités d'hydrolyse de l'ATP et hélicase. Les données obtenues suggèrent fortement que l'activation de Prp43p par Pfa1p est requise pour une maturation efficace du pré-ARNr 20S en ARNr mature 18S. Les résultats obtenus durant la seconde partie de ma thèse étayent l'hypothèse que la protéine à domaine G-patch Gno1p, et son orthologue humain, l'inhibiteur de la télomérase PINX1, sont également des activateurs de Prp43p. Gno1p et PINX1 humaine exprimée chez la levure interagissent avec Prp43p. De plus, PINX1 interagit avec DHX15, l'orthologue humain de Prp43p, dans des cellules HeLa. PINX1 recombinante purifiée se fixe directement sur Prp43p de levure et stimule fortement son activité ATPase, alors que des altérations du G-patch abolissent l'interaction PINX1/Prp43p et la stimulation de l'activité ATPase de Prp43p. J'ai montré que chez la levure, Gno1p est requise avant tout pour la synthèse de la grande sous-unité ribosomique. Gno1p s'associe avec des composants des particules pré-ribosomiques 90S et pré-60S précoces, mais pas avec des composants des particules pré-60S intermédiaires. L'absence de Gno1p ou des altérations du domaine G-patch de Gno1p conduisent à une forte diminution de la quantité de pré-ARNr 27SB, mais ont peu d'effet sur l'accumulation du pré-ARNr 27SA2. Collectivement, mes résultats suggèrent que l'activation de Prp43p par Gno1p au sein de particules pré-ribosomiques 90S et/ou pré-60S précoces conduit à un/des réarrangement(s) de conformation cruciaux pour la maturation ultérieure de ce dernier type de particules<br>Numerous RNA helicases are required for ribosome synthesis. It has previously been shown that the splicing DEAH RNA helicase Prp43p is required in Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of both large and small ribosomal subunits and is associated with most pre-ribosomal particles. We postulate that Prp43p remodels several pre-ribosomal particles. During the first part of my thesis, I have contributed to the demonstration that the G-patch protein Pfa1p directly binds to Prp43p, to stimulate its ATPase and helicase activities. The data obtained strongly suggest that activation of Prp43p by Pfa1p is required for efficient maturation of the 20S pre-rRNA into mature 18S rRNA. Data obtained in the second part of my thesis support the notion that the yeast G-patch protein Gno1p and its human orthologue, the telomerase inhibitor PINX1, are also activators of Prp43p. Gno1p and human PINX1 expressed in yeast interact with Prp43p. Moreover, PINX1 interacts with DHX15, the human orthologue of Prp43p, in HeLa cells. Purified recombinant PINX1 directly binds to yeast Prp43p and strongly stimulates its ATPase activity, while alterations of the G patch abolish both the PINX1/Prp43p interaction and the stimulation of Prp43p ATPase activity. In yeast cells, I have shown that Gno1p is above all required for the synthesis of the large ribosomal subunit. Gno1p associates with components of 90S and early pre-60S pre-ribosomal particles but not with components of intermediate nucleoplasmic pre-60S particles. Lack of Gno1p or alteration of the G patch of Gno1p lead to a strong decrease in 27SB pre-rRNA accumulation while levels of 27SA2 pre-rRNA are little affected. Altogether, my results suggest that activation of Prp43p by Gno1p within 90S and/or early pre-60S particles elicits (a) conformational rearrangement(s) crucial for the subsequent maturation of these latter particles

Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation<br>RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation

L'objectif principal de ma thèse était de développer de nouvelles technologies et des outils pour l’étude de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR).À la surface de la cellule se trouve une multitude de récepteurs qui jouent un rôle critique dans la communication cellule-cellule, dont les GPCR, une famille de récepteur utilisant les protéines G intracellulaires pour transmettre leurs signaux. Le ciblage de ces récepteurs à des fins thérapeutique est innovant et très prometteur. Mais à ce jour seuls quelques médicaments ciblant les GPCR ont été mis sur le marché, en partie en raison d'un manque d'outils permettant le suivi de leur action sur les cellules natives.L’objectif de cette thèse est donc de développer des tests simples pour suivre l’activation de n’importe quel GPCR. Pour développer ce type de test, nous avons décidé d'utiliser des fragments d'anticorps appelés nanobodies. Les anticorps sont des protéines du sang produites en réponse à un antigène spécifique qui sont capable de le neutraliser. Les nanobodies correspondent au domaine variable de certains anticorps de camélidés. En raison de leur faible taille (13 kDa) et de leur site de liaison à l'antigène réduit, les nanobodies se lient souvent à des cavités et présentent une grande sensibilité aux changements de conformation de l'antigène<br>The main objective of my thesis was to develop technologies and tools to study activation of G protein-coupled receptors (GPCRs).The cell surface is displaying a multitude of receptors, who play critical roles in cell-cell communication. Among them, GPCRs represent a large family relying on the use of intracellular G proteins for their signaling. Targeting these receptors for therapies is very promising and innovative. So far, only few new drugs have been put on the market, partly due to a lack of tools enabling the follow-up of their action on native cells.The aim of this thesis is thus to develop simple assays to study activation of any GPCRs. To develop this kind of test, we used antibody fragments called nanobodies. Antibodies are blood protein produced in response to and counteracting a specific antigen. Nanobodies correspond to antibody fragments derived from the variable domain of a special class of camelid antibodies. Because of their small size (13 kDa) and reduced antigen binding site, nanobodies often bind cavities and show a high sensitivity to antigen conformational changes

La petite protéine G Arf6 et son facteur d'échange EFA6 sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels que le remodelage du cytosquelette d’actine, le transport vésiculaire et mise en place de la polarité épithéliale. Elles jouent également un rôle dans la voie d'endocytose dépendante de la clathrine. Ce travail de thèse nous a permis d’identifier différents mécanismes régulant l’interaction d’EFA6 avec ses différents partenaires. Nous avons pu mettre en évidence une interaction directe entre le domaine N-BAR de l’endophiline et le domaine Sec7 d’EFA6. Nous avons démontré que la courbure membranaire était un facteur régulant cette interaction. EFA6 est capable d’interagir et de recruter l’endophiline sur une membrane lipidique plane alors qu’en présence de vésicules courbées le complexe protéique ne se forme pas. Nous observons également que l’endophiline stimule l’activité d’échange nucléotidique d’EFA6 sur Arf6. Dans un second temps nous avons démontré, dans une étude menée par le Dr Cherfils, que l’activité catalytique d’EFA6 était régulée par une boucle de rétrocontrôle négatif exercée spécifiquement par la protéine Arf6-GTP. Celle-ci induit une diminution de l’activité d’échange d’EFA6 probablement grâce à sa capacité à interagir avec le domaine PH-C-terminal d’EFA6. Enfin, nous avons mis en évidence un repli intramoléculaire entre le domaine C-terminal et le domaine PH d’EFA6 qui semble contrôler l’interaction de cette extrémité C-terminale avec différents partenaires dont la β-arrestine et de façon surprenante la protéine Arf6 dans sa forme inactive<br>The small G protein Arf6 and its exchange factor EFA6 control numerous cellular processes such as actin cytoskeleton remodeling, vesicular transport and apico-basal cell polarity. They are also involved in clathrin-dependent endocytosis. In this work we identify different mechanisms by which EFA6 interaction with its various partners is regulated. We have highlighted a direct interaction between the N-BAR domain of endophilin and the Sec7 domain of EFA6. We demonstrated that this interaction is regulated by the membrane curvature. EFA6 interacts and recruits endophilin on a flat lipid membrane whereas the protein complex does not occur in the presence of curved vesicules. We showed that endophilin stimulates the nucleotidic exchange activity of EFA6 on Arf6. Next we demonstrated that the catalytic activity of EFA6 is regulated by a negative feedback loop specifically mediated by the Arf6-GTP. We observed in the presence of Arf6-GTP a decrease of EFA6 catalytic activity and we showed that this effect was due to an interaction between Arf6-GTP and PH-C-terminal domain of EFA6. Finally we demonstrated an intramolecular folding between the C-terminal domain and the PH domain of EFA6 that controls the interaction of the C-terminus domain with various partners including β-arrestin and surprisingly the inactive GDP form of Arf6

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) affichent à la fois une structure et des voies de signalisation conservées mais aussi une grande diversité fonctionnelle, nécessaire à la spécialisation. Une spécialisation importante au cours de l’évolution est sans nul doute l’apparition du caractère chimiotactique, qui permet le développement des organes et la vascularisation, ou encore les réponses immunitaires. Ces comportements chimiotactiques induits par les RCPGs peuvent impliquer des couplages de protéines G mais également une interaction avec des protéines intracellulaires telles que les β-Arrestines. Cependant, les questions portant sur les RCPGs dans 1) leur capacité à détecter de faibles concentrations/gradients moléculaires, 2) la transduction du signal depuis la poche de liaison jusqu’au domaine intracellulaire du récepteur, et 3) les modes d’interaction des β-Arrestines restent aujourd’hui l’objet de nombreuses recherches. Les données récentes fournies par les structures à haute résolution indiquent que les RCPG sont des entités dynamiques qui adoptent des conformations actives multiples, capables de lier des ligands et d’activer préférentiellement ou non certaines voies de couplage de manière dite « biaisée », conduisant ainsi à la sélectivité fonctionnelle. Sur la base de travaux antérieurs menés par l’équipe, nous avons émis l’hypothèse que les peptides dérivés de l’urotensine II (UII) présentent des effets physiologiques inattendus en raison d’une signalisation biaisée sur le RCPG urotensinergique UT. Dans un modèle de cellules HEK293 exprimant le récepteur UT humain recombinant, nous avons déterminé le couplage aux protéines G et aux β-Arrestines suite à l’activation du récepteur par l’UII, en utilisant la méthode de transfert d’énergie de bioluminescence par résonance (BRET), ainsi que la production d’IP1 et d’AMPc en utilisant le principe de HTR-FRET (high-time resolved-Froster resonance energy transfer). Nous avons montré que le récepteur UT active les protéines Gi1, Goᴀ, Gq et G₁₃ (et non G₈) et recrute les β-Arrestines 1 et 2. Ces premiers évènements conduisent à 2 phases de phosphorylation des kinases ERK1/2. Les peptides testés induisent trois profils différents : l’UII, l’urotensin II-related peptide (URP) et l’UII₄₋₁₁ présentent le profil d’agoniste entier ; l’[Orn⁸]UII et l’[Orn⁵]URP activent les protéines G avec cependant des pEC₅₀s 5 à 10 fois plus élevés, et ne recrutent pas ou peu chez les β-Arrestines ; l’urantide ne présente pas non plus la capacité d’induire le recrutement des β-Arrestines mais a montré une efficacité inversement proportionnelle à activer les protéines Gi et Gq vs. Go et se présente donc comme un agoniste partiel de toutes les voies des protéines G. Il est intéressant de noter que les peptides sont tous capables d’induire la migration et l’adhésion cellulaire, mais régulent différemment la survie cellulaire. Ainsi, nous démontrons une signalisation biaisée entre les protéines β-Arrestine et G, et entre les sous-types de protéines G, ce qui dicte les réponses cellulaires du récepteur et peut ouvrir de nouvelles opportunités thérapeutiques. Nous avons ensuite examiné si les propriétés chimiotactiques de l’UT, tout à fait inattendues puisque l’UII était principalement connu pour ses propriétés vasoactives, sont associées à une signature structural acquise précocement au cours de l’évolution. De fait, il avait été proposé qu’au sein des récepteurs de la famille Rhodopsine, une délétion ancestrale évolutive dans le DTM2 de récepteurs du groupe ancestral PEP (peptides), conduisant au repositionnement d’une proline en 2. 58, aurait accompagné l’expansion des récepteurs des groupes SO (somatostatinergique), CHEM (chimiokine) et PUR (purinergique), phylogénétiquement liés. Ainsi, en étudiant le prototype de récepteur PEP Kiss1R, présentant une proline en 2. 59, et les récepteurs UT et CXCR4, en tant que prototypes respectifs des récepteurs SO et CHEM, nous avons cherché à obtenir des informations sur le rôle de cette proline P2. 58 dans l’acquisition du comportement chimiotactique. Pour cela, nous avons généré des mutants des prototypes Kiss1R P2. 59 et des deux récepteurs P2. 58 UT et CXCR4 par substitution de la Pro du DTM2 en Ala, ou par insertion/délétion pour déplacer la proline en position 2. 58 ou 2. 59. Nous avons montré, dans un modèle de cellules HEK293 recombinantes, que les récepteurs Kiss1R, UT et CXCR4 mutants conservent une expression membranaire et pour la plupart, des capacités de liaison. Les récepteurs P2. 58 UT et CXCR4 activés par l’UII et le SDF-1α, montrent des couplages Gq/Ca²⁺/IP1 et/ou Gi/o et β-arrestine 2, et sont capables de stimuler la migration chimiotactique par ondes dynamiques d’assemblage/désassemblage de points focaux d’adhésion (FA) ainsi que via la sélection d’un lamellipode principal. En revanche, l’activation du récepteur Kiss1R (P2. 59) par la kisspeptine-10 (KP-10) évoque des couplages Gq/Ca²⁺/IP1 et une migration aléatoire par désassemblage incontrôlé des FA, et la production de nombreux lamellipodes par cellule. La mutation de la proline ou l’insertion/délétion conduit principalement à la perte des capacités de couplage Gq et/ou Gi1 et Goᴀ, établissant le rôle clé de cette proline du DTM2 dans les mécanismes d’activation de Kiss1R, UT et CXCR4. Ainsi, le repositionnement de la proline de la position 2. 59 à 2. 58 joue probablement un rôle dans la re-sensibilisation des récepteurs, déterminante pour la régulation de l’assemblage/désassemblage des FAs et la réduction du nombre de lamellipodes. L’ensemble de ces données nous amène à proposer que l’expansion massive des récepteurs P2. 58 au cours de l’évolution est corrélée à l’acquisition de mécanismes d’activation pro-chimiotactiques par la régulation spatio-temporelle de signaux intracellulaires. Notamment, ce mécanisme d’activation spécifique serait associé à une dynamique de désensibilisation/resensibilisation des RCPG, à des vagues d’adhésion/détachement locales et à la sélection des protrusions membranaires nécessaires à une migration chimiotactique efficace. Cette compétence spécifique aux récepteurs P2. 58, et en particulier de l’UT, implique probablement une sélectivité fonctionnelle clef vis-à-vis des β-Arrestines.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la croissance est orientée et nécessite l’apport de membranes et d’enzymes pour la synthèse de la paroi cellulaire. La régulation du transport des vésicules permettant cet apport est assuré par les GTPases de la famille Ypt/Rab. Sec4p, une Ypt/Rab GTPase, est impliquée dans l’exocytose en assurant la spécificité de l’ancrage des vésicules post-golgiennes envoyées aux sites de croissance. La régulation de son activité GTPase est essentielle pour sa fonction.Nous nous intéressons aux protéines Gyp5p et Gyl1p, deux membres de la famille des protéines activatrices des GTPases Ypt/Rab chez S. cerevisiae. Le laboratoire a montré l’implication du complexe Gyp5p-Gyl1p dans l’exocytose polarisée vraisemblablement par la régulation de Sec4p. Notre étude a montré une interaction directe in vitro de ces deux protéines, ainsi qu’une interdépendance pour une bonne localisation du complexe aux sites de croissance polarisée, c'est-à-dire au sommet du bourgeon durant la croissance apicale et au cou du bourgeon durant la cytocinèse. Cette localisation dépend de deux formines, d’éléments du polarisome et des câbles d’actine. De plus, nous avons montré par des expériences d’immunofluorescence et de microscopie électronique en collaboration avec J.-M. Verbavatz (iBiTec-S, CEA), que ces protéines sont transportées sur des vésicules de sécrétion jusqu’aux sites de croissance polarisée.Notre étude de l’interaction du complexe Gyp5p-Gyl1p avec Rvs167p, une protéine à domaine BAR (Bin1-Amphiphysin-Rvs167p) a montré que Gyp5p et Gyl1p sont nécessaires pour la bonne localisation de Rvs167p au sommet du petit bourgeon et que ces complexes se forment principalement dans des fractions enrichies en membrane plasmique. Pour mieux caractériser ces interactions, nous avons réalisé une mutation de la proline 473 dans le domaine SH3 de Rvs167p et des délétions des séquences riches en proline de Gyp5p et Gyl1p. Ces mutations entraînent un défaut d’interaction de Rvs167p avec Gyp5p et Gyl1p et la perte de la localisation de Rvs167p au sommet du petit bourgeon. Afin de comprendre la fonction de ces interactions, nous avons réalisé des expériences de microscopie électronique et des tests de sécrétion de l’endo-β-1,3-glucanase, Bgl2p dans une souche Δrvs167. Nous avons mis en évidence une accumulation de vésicules de sécrétion au niveau du petit bourgeon et un défaut de sécrétion de Bgl2p à 13°C dans cette souche. De plus, nous avons également observé une accumulation de vésicules de sécrétion dans une souche exprimant Rvs167p mutée pour la proline 473 et un défaut de sécrétion de Bgl2p dans une souche exprimant Gyp5p et Gyl1p dépourvues de leurs séquences riches en proline. Ces résultats montrent que Rvs167p joue un rôle dans l’exocytose polarisée au stade du petit bourgeon et que cette fonction dépend de son recrutement par Gyp5p et Gyl1p au sommet du petit bourgeon<br>In Saccharomyces cerevisiae, growth is oriented and requires the contribution of membranes and enzymes for the synthesis of the cell wall. Regulation of vesicles transport allowing this contribution is provided by the Ypt/Rab GTPases family. Sec4p, a Ypt/Rab GTPase, is involved in exocytosis by controlling the tethering of post-Golgi vesicles at sites of growth. Regulation of Sec4p GTPase activity by is essential for its function.We studied the proteins Gyp5p and Gyl1p, two members of the Ypt/Rab GTPases activiting proteins (RabGAP) family in S. cerevisiae. Gyp5p and Gyl1p interact with Sec4p and are involved in the control of exocytosis at the small-bud stage. Our study showed that Gyp5p and Gyl1p interact directly in vitro and are interdependent for their correct localization to the sites of polarized growth, e.g. the bud tip during apical growth and the bud neck during cytokinesis. We showed that the localization of Gyp5p and Gyl1p to the sites of polarized growth depends on the formins Bni1 and Bnr1, but also on polarisome components and actin cables. Moreover, we showed by immunofluorescence and electron microscopy (in collaboration with J.-M. Verbavatz), that Gyp5p and Gyl1p are transported onto secretory vesicles to access the sites of polarized growth.We studied the interaction of Gyp5p and Gyl1p with Rvs167p, a BAR domain (Bin1-Amphiphysin-Rvs167p) protein and showed that Gyp5p and Gyl1p are necessary for the recruitment of Rvs167p to the small-bud tip. Both the mutation of the proline 473 in the SH3 domain of Rvs167p and the deletion of the proline-rich regions of Gyp5p and Gyl1p disrupt the interaction of Rvs167p with Gyp5p and Gyl1p and impair the localization of Rvs167p to the tips of small buds. Electron microscopy experiments unraveled an accumulation of secretory vesicles in small buds of rvs167Δcells and β-1,3-endoglucanase Bgl2p secretion assays showed Bgl2p secretion defects in cultures enriched in small buds at 13°C. In addition, an accumulation of secretory vesicles was observed in Rvs167pP473L strain, and Bgl2p secretion defect were found in strains expressing Gyp5p and Gyl1p deleted of their proline-rich sequences. These results show that Rvs167p plays a role in polarized exocytosis at the small bud stage and that its function in exocytosis depends on its recruitment to the tip of small buds by the RabGAP proteins Gyp5p and Gyl1p

Le récepteur au goût sucré est un hétérodimère composé de 2 sous-unités appelées T1R2 et T1R3. Chaque sous-unité appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G de la classe C. Les membres de cette famille de récepteurs partagent une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) de grande taille lié au domaine transmembranaire par une région riche en cystéine. Il a été montré que les DNT de T1R2 et T1R3 de souris étaient capables de lier des sucres naturels (saccharose et glucose) et le sucralose, avec des affinités distinctes et avec différents changements de conformation du domaine induits la fixation du ligand (Nie et al., Curr Biol, 2005). Cependant, les propriétés de liaison du DNT de T1R3 humain, ainsi que la contribution respective des 2 sous-unités dans la fonctionnalité du récepteur restent encore largement méconnues. Lors de cette étude, nous avons exprimé les DNT de T1R3 humain (DNT-hT1R3) et de souris à l’aide de la bactérie Escherichia coli, sous forme de protéines insolubles, appelés corps d’inclusion (CI). Les CI ont été purifiés puis solubilisés en utilisant un agent chaotrope. Le transfert des DNT dans leur état natif par un repliement in vitro, nécessite un criblage des conditions de repliement. Pour cela nous avons utilisé une approche factorielle en faisant varier des facteurs tels que le tampon, le pH ou la présence d’additifs. Les protéines repliées ont ensuite été caractérisées par différentes approches parmi lesquelles l’électrophorèse, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroïsme circulaire. Leur fonctionnalité a ensuite été vérifiée en mesurant les variations de l’intensité de fluorescence intrinsèque des protéines engendrées par l’ajout de sucralose. Le dosage d’Ellman a permis de déterminer la présence d’une seule cystéine libre dans DNT-hT1R3, qui a été confirmée, par purification, puis analyse des peptides trypsiques de la protéine. La présence de structures secondaires a été montrée par dichroïsme circulaire. Afin de caractériser les propriétés de liaison de DNT-hT1R3, un marquage fluorescent a été réalisé en utilisant une sonde sensible à l’environnement greffée de manière covalente à la protéine. Nous avons montré que la fixation d’un ligand sur la protéine marquée provoque des modifications conformationnelles qui ont permis de mesurer l’affinité du DNT de T1R3 pour diverses molécules sapides, avec des affinités en accord avec les données sensorielles. Cette étude a également permis de montrer que le calcium et le magnésium étaient capables de se lier à la protéine. Enfin, les propriétés de liaison de certains ligands ont été validées par microcalorimétrie. Ces résultats montrent que le DNT de T1R3 joue un rôle important, jusqu’à présent insoupçonné dans la reconnaissance des composés sucrés<br>The sweet taste receptor is a heterodimer composed of two subunits called T1R2 and T1R3. Each subunit belongs to the class C of G protein-coupled receptors and is constituted by a large extracellular N-terminal domain (NTD) linked to the transmembrane domain by a cysteine-rich region. It has been shown that T1R2 and T1R3 NTDs are both able to bind natural sugars and sucralose with distinct affinities and undergo ligand-dependent conformational change (Nie et al., Curr Biol, 2005). However, the binding properties of T1R3 NTD and the relative contribution of the two subunits to the heterodimeric receptor function remained largely unknown. To characterize the binding properties of each subunit in greater depth a large quantity of proteins is required to use biochemical, biophysical and structural approaches. To accomplish this goal, we took advantage of bacterial expression strategy, which has been successfully used to produce functional mouse T1R2 and T1R3 NTDs (Nie et al., Curr Biol, 2005). Human T1R3 NTD was expressed in high level in Escherichia coli as insoluble aggregated protein (inclusion bodies). Transferring this protein into its native state by in vitro refolding requires screening to find buffer conditions and suitable additives. We established a factorial screen to detect folded functional T1R3 NTD based on intrinsic tryptophan fluorescence quenching by sucralose (known to bind mT1R3 NTD) and identified positive synergistic interactions between additives on refolding of T1R3 NTD. The soluble T1R3 NTD protein was then purified and characterized using electrophoresis, gel filtration, fluorescence and circular dichroism spectroscopy. T1R3 NTD is properly refolded and able to bind saccharide compounds with physiological relevant affinities. As expected, one free thiol could be measured in T1R3 NTD using Ellman’s assay suggesting that except one, all the cysteines are involved in disulfide linkages. This presence of this free cystein was also confirmed by mass spectrometry identification of the fluorescent peptide resulting from trypsin digestion. This free cysteine was used to covalently attach an environmentally sensitive fluorophore. This study also revealed that calcium and magnesium was able to bind T1R3 NTD. Due to the high quantities of functional NTD T1R3, the interactions with some sweeteners were characterized using microcalorimetry. Interestingly, we confirmed that T1R3 NTD is also able to bind numerous sweeteners with physiological affinities, suggesting that T1R3 NTD plays an important role in sweetener recognition

Les ribosomes sont les machines moléculaires responsables de la production des protéines, constituants majeurs de la cellule. La synthèse des ribosomes est un processus très important et très coûteux en énergie pour la cellule. Comme tous les processus de la vie de la cellule, la biogenèse des ribosomes doit être régulée de manière efficace. Si cette régulation est défectueuse, elle peut être à l'origine de certaines pathologies. Les mécanismes de cette régulation restent mal compris malgré leur caractère essentiel. Néanmoins, on sait que plusieurs enzymes interviennent dans la synthèse des ribosomes mais leur mode d'action reste toutefois très peu élucidé. L'activité de ces enzymes peut être régulée via l'interaction avec des protéines ayant des structures spécifiques. Ce projet de recherche vise à étudier Prp43p, une des enzymes intervenant dans la synthèse des ribosomes et à comprendre comment elle agit en association avec ces protéines. Une meilleure compréhension de ces interactions est nécessaire pour élucider le mécanisme d'activation de Prp43p<br>Ribosomes are molecular machines responsible for the production of proteins, which are major components of the cell. The synthesis of ribosomes is a very important and energy-consuming process for the cell. Like most processes of the cell, ribosome biogenesis must be regulated in an effective and coordinated manner. If this regulation is defective, it may be the cause of certain diseases. The mechanisms of this regulation remain poorly understood despite their essential character. However, it is known that several enzymes are involved in the synthesis of ribosomes but their mode of action remains little understood. The activity of these enzymes can be regulated via the interaction with proteins having specific structures. This research project aims at studying Prp43p, one of the enzymes involved in the synthesis of ribosomes and understand how it acts in association with these proteins. A better understanding of these interactions is needed to elucidate the mechanism of activation of Prp43p

Le récepteur GABAB est un acteur de la neurotransmission. Sa position de cible thérapeutique motive son étude. C'est un récepteur de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Le récepteur GABAB est un RCPG de la classe C, car il possède un large domaine extracellulaire (DEC) où se lie le ligand en plus du domaine heptahélice (HD) transmembranaire commun à tous les RCPG. C'est un hétérodimère obligatoire formé de deux récepteurs, GABAB1 et GABAB2, qui fonctionne de façon asymétrique : le GABA se lie au DEC de GABAB1 et c'est le HD de GABAB2 qui procède au couplage à la protéine G. Nous avons tenté de comprendre comment l'information passait du DEC vers la protéine G à travers le HD. Une approche pharmacologique nous a permis de montrer que le CGP7930, un modulateur allostérique positif, agissait directement au sein des HD. Parallèlement nous avons montré que le HD de GABAB2 peut se comporter comme un récepteur de type rhodopsine puisqu'il peut être directement activé le CGP7930. Nous avons ensuite montré que trois résidus des domaines transmembranaires III et VI du HD de GABAB2 sont impliqués dans l'activation du récepteur et jouent des rôles différents : passage à l'état actif, couplage à la protéine G. Nos résultats précisent le fonctionnement moléculaire du HD de GABAB2 et fournissent des informations complémentaires du mécanisme d'activation du récepteur GABAB et des RCPG de la classe C.

Domain swapping is a wide spread phenomenon which involves the association between two or more protein subunits such that intra-molecular interactions between domains in each subunit are replaced by equivalent inter-molecular interactions between the same domains in different subunits. This thesis is devoted to the analysis of the factors that drive proteins to undergo such association modes. The specific system analyzed is the monomer to swapped dimer formation of the B1 domain of the immunoglobulin G binding protein (GB1). The formation of this dimer was shown to be fostered by 4 amino acid substitutions (L5V, F30V, Y33F, A34F) (Byeon et al. 2003). In this work, computational protein design and molecular dynamics simulations, both with detailed atomic models, were used to gain insight into how these 4 mutations may promote the domain swapping reaction.<p>The stability of the wt and quadruple mutant GB1 monomers was assessed using the software DESIGNER, a fully automatic procedure that selects amino acid sequences likely to stabilize a given backbone structure (Wernisch et al. 2000). Results suggest that 3 of the mutations (L5V, F30V, A34F) have a destabilizing effect. The first mutation (L5V) forms destabilizing interactions with surrounding residues, while the second (F30V) is engaged in unfavorable interactions with the protein backbone, consequently causing local strain. Although the A34F substitution itself is found to contribute favorably to the stability of the monomer, this is achieved only at the expense of forcing the wild type W43 into a highly strained conformation concomitant with the formation of unfavorable interactions with both W43 and V54.<p>Finally, we also provide evidence that A34F mutation stabilizes the swapped dimer structure. Although we were unable to perform detailed protein design calculations on the dimer, due to the lower accuracy of the model, inspection of its 3D structure reveals that the 34F side chains pack against one another in the core of the swapped structure, thereby forming extensive non-native interactions that have no counterparts in the individual monomers. Their replacement by the much smaller Ala residue is suggested to be significantly destabilizing by creating a large internal cavity, a phenomenon, well known to be destabilizing in other proteins. Our analysis hence proposes that the A34F mutation plays a dual role, that of destabilizing the GB1 monomer structure while stabilizing the swapped dimer conformation.<p>In addition to the above study, molecular dynamics simulations of the wild type and modeled quadruple mutant GB1 structures were carried out at room and elevated temperatures (450 K) in order to sample the conformational landscape of the protein near its native monomeric state, and to characterize the deformations that occur during early unfolding. This part of the study was aimed at investigating the influence of the amino acid sequence on the conformational properties of the GB1 monomer and the possible link between these properties and the swapping process. Analysis of the room temperature simulations indicates that the mutant GB1 monomer fluctuates more than its wild type counter part. In addition, we find that the C-terminal beta-hairpin is pushed away from the remainder of the structure, in agreement with the fact that this hairpin is the structural element that is exchanged upon domain swapping. The simulations at 450 K reveal that the mutant protein unfolds more readily than the wt, in agreement with its decreased stability. Also, among the regions that unfold early is the alpha-helix C-terminus, where 2 out of the 4 mutations reside. NMR experiments by our collaborators have shown this region to display increased flexibility in the monomeric state of the quadruple mutant.<p>Our atomic scale investigation has thus provided insights into how sequence modifications can foster domain swapping of GB1. Our findings indicate that the role of the amino acid substitutions is to decrease the stability of individual monomers while at the same time increase the stability of the swapped dimer, through the formation of non-native interactions. Both roles cooperate to foster swapping.<br>Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

La protéine hnRNP G est impliquée dans l’épissage alternatif de plusieurs précurseurs d’ARN messager. Pour mieux comprendre la spécificité de cette protéine, j’ai étudié ses interactions avec les ARNs in vitro et in vivo. Un motif d’ARN structuré dans une tige-boucle qui contient la séquence GGAAA a été identifié in vitro comme une cible potentielle d’hnRNP G. Cet ARN m’a permis d’identifier un nouveau domaine d’interaction avec l’ARN dans la structure de l’hnRNP G, situé dans sa région C-terminale et désigné « C-ter RBD ». Le modèle des chromosomes en écouvillon chez l’amphibien m’a permis de montrer qu’un nouveau domaine situé au centre de la structure de la protéine et distinct de ses domaines d’interaction avec l’ARN est responsable de son recrutement au niveau des transcrits naissants des chromosomes. Ce domaine a été désigné Nascent transcripts Targeting Domain (NTD). Cette étude montre que l’hnRNP G s’associe avec la majorité des ARNs transcrits par l’ARN polymérase II tout en montrant un recrutement plus important au niveau de quelques boucles des chromosomes. En particulier, l’association de l’hnRNP G avec les transcrits du bivalent sexuel ZW chez Pleurodeles waltl, montre un recrutement hétéromorphe au niveau de certains sites de ce bivalent. Au cours de ma thèse, j’ai participé à la mise en évidence d’une activité différentielle de liaison à l’ARN liée au génotype sexuel, pour les isoformes de l’hnRNP G dans l’ovocyte de P. Waltl. Les résultats suggèrent la présence d’une famille multigénique de l’hnRNP G répartie sur un autosome et sur les chromosomes sexuels. Cette étude contribue à la caractérisation de l’hnRNP G et à la compréhension de ses fonctions.

L'adn complementaire correspondant a la sous-unite de cs, la proteine c stimulant l'adenylate cyclase, a ete transcrit et traduit in vitro. Gs ainsi synthetisee est capable de reconstituer fonctionnellement des membranes de s49 cyc- qui n'expriment cette proteine. Ce modele de reconstitution in vitro nous a permis de caracteriser divers domaines fonctionnels de gs. La deletion des 28 premiers amino-acides de gs donne naissance a une proteine qui n'est capable d'interagir avec des sous-unites purifiees. Comme dans le cas des autres sous-unites g, le domaine n-terminal de gs est donc responsable de l'interaction avec les sous-unites. La proteolyse menagee par la protease v8 nous a permis de determiner que le domaine c-terminal de gs est essentiel pour l'association membranaire de la forme activee. La construction de proteines de fusion chimeriques nous a permis de caracteriser une sequence amino-acidique carboxyterminale (367-376) qui entraine l'association membranaire d'une g proteine soluble

Les Récepteurs Couplés à un Canal Ionique (ICCRs) sont des canaux ioniques artificielscréés par fusion d'un Récepteur Couplé aux Protéines G (RCPG) au canal ionique Kir6.2. Dansce concept, le canal agit comme un rapporteur direct des changements conformationnels desRCPGs permettant de détecter par simple mesure de courant, la fixation d'agonistes etd'antagonistes proportionnellement à leur concentration.Le signal induit étant directement corrélé à l'activité du récepteur, indépendamment desvoies de signalisation des protéines G, nous avons exploité cet avantage pour étendre le champd'applications des ICCRs au cours de cette thèse. Nous avons développé quatre applications quisont: 1) la caractérisation fonctionnelle des RCPG optimisés pour la cristallisation par insertionde domaine du lysozyme du phage T4 dans la boucle ICL3; 2) la détection de la dépendance desRCPGs au cholestérol; 3) la détection de ligands dits "biaisés" pour faciliter leur criblage; et 4) lacartographie fonctionnelle des portes du canal Kir6.2 régulées par des protéines membranairesinteragissant par le domaine N-terminal.

Les récepteurs 5-HT2 de la sérotonine sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de séquences proches, activant des voies de signalisation communes, mais aussi des voies plus spécifiques. Les récepteurs 5-HT2 expriment au niveau de leur extrémité C-terminale un motif de liaison des domaines d'interaction protéine-protéine PDZ (PSD-95 / Dlg / ZO-1). Grâce à une approche protéomique combinant des expériences de chromatographies d'affinité et la spectrométrie de masse, nous avons démontré que les récepteurs 5-HT2A et 5-HT2C recrutaient des ensemble de protéines à domaines PDZ spécifiques. La spécificité de ces interactions implique des résidus du motif ligand PDZ canonique, mais aussi des résidus localisés en amont. Dans des systèmes hétérologues, nous avons montré que les protéines à domaines PDZ exerçaient des effets différentiels sur la désensibilisation de la réponse calcique induite par le récepteur 5-HT2C et que ceux-ci étaient corrélés à leur effet sur l'internalisation du récepteur. Enfin, les protéines à domaines PDZ exercent un effet global inhibiteur sur la désensibilisation du récepteur 5-HT2C dans les neurones.

Les canaux calciques neuronaux activés par le potentiel électrique de membrane (VGCCs) représentent une des voies majeures d'entrée du calcium dans la cellule nerveuse, où ils participent activement aux processus moléculaires de la transmission synaptique. De ce fait, leur activité est finement régulée, afin de garantir une parfaite coordination entre le flux calcique et les processus cellulaires qui lui sont associés. Aussi, les récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPGs) occupent un rôle central dans le rétrocontrôle négatif de l'activité des VGCCs suite à la libération de neuromédiateurs. Cette régulation, directe et spatialement délimitée, est conduite par le dimère Gβγ, dont la fixation sur différents déterminants structuraux de la sous-unité Cav2.x conduit à l'inhibition drastique du courant calcique (régulation "ON"), indépendamment de la présence d'une sous-unité β. Le décrochage du dimère Gβγ, en réponse à l'activation du canal, reverse cette inhibition, et induit un ensemble de modifications phénotypiques apparentes de l'activité du canal (régulation "OFF"). Aussi, nous avons mis en évidence que la notion de "reluctance", décrite par le shift dépolarisant de la courbe d'activation du canal, communément accepté comme un caractère de la régulation "ON", ne traduit en définitive qu'une caractéristique particulière de la régulation "OFF". En revanche, la fixation du dimère Gβγ sur la sous-unité Cav2.x, est à l'origine d'un ralentissement de la cinétique d'inactivation du canal, et représente un caractère nouveau de la régulation "ON". Enfin, nous avons caractérisé l'implication majeure de l'inactivation rapide du canal, dans le caractère "OFF" de cette régulation. L'inactivation se présente comme un catalyseur du décrochage du dimère Gβγ, et délimite une fenêtre temporelle durant laquelle le processus peut avoir lieu. Ensemble, ces résultats permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à la base de la régulation directe de l'activité synaptique par les récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d'être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l'hypothèse qu'ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l'accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu'ABCG2 transporte de l'hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d'ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d'ABCG2, ECL3, composé d'environ 70 acides aminés. L'affinité d'ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l'albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l'hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L'ensemble de ce travail a donc permis d'une part de mieux comprendre le rôle d'ABCG2 dans la régulation de l'homéostasie des porphyrines, notamment l'hème, et d'autre part, de façon originale, d'identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s'effectue.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d’être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l’hypothèse qu’ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l’accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu’ABCG2 transporte de l’hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d’ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d’ABCG2, ECL3, composé d’environ 70 acides aminés. L’affinité d’ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l’albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l’hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L’ensemble de ce travail a donc permis d’une part de mieux comprendre le rôle d’ABCG2 dans la régulation de l’homéostasie des porphyrines, notamment l’hème, et d’autre part, de façon originale, d’identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s’effectue<br>ABCG2 belongs to the ABC-transporter family, involved in drug resistance developed by cells, notably cancer cells. This transporter has also a physiological role of endobiotic detoxification, in particular porphyrins that are essential but potentially toxic molecules. This toxicity implies a specific handle, to avoid them to remain free in solution. In that context, we hypothesized that ABCG2 participate to this detoxification, limiting the intracellular porphyrin accumulation by presenting them to an extracellular partner. We show that ABCG2 transports heme and some of its derivatives and precursors. Interestingly, these porphyrins, unlike other ABCG2 (non-porphyric) substrates, can bind to an extracellular domain, specific of ABCG2, ECL3, 70 residues-long. ECL3 displays affinities for porphyrins in the range of 0.5 to 3.5 μM, high enough to allow their binding after transport. We also show that human serum albumin, implicated in heme detoxification, releases porphyrins bound to ECL3 by a direct interaction with ABCG2. This work established a better comprehension of ABCG2 role in porphyrin and in particular heme homeostasis regulation. In addition, our results contribute to elucidate part of the molecular mechanism by which such regulation is carried out

Les neutrophiles constituent la premiere ligne de defense contre les pathogenes d'origine bacterienne ou fongique. Leur capacite a tuer les microorganismes au niveau de foyers d'infection depend pour une large part du fonctionnement d'un systeme enzymatique producteur d'ions sueproxyde o#2#-, le complexe nadph oxydase, forme d'un flavocytochrome b heterodimerique qui reside dans la membrane plasmique. Ce composant redox transporte les electrons du nadph vers l'oxygene via un fad et un heme de type b sous le controle de la proteine g monomerique geranyl-geranylee rac suite au transfert des proteines cytosoliques, p67phox, p47phox, p40phox. Le travail experimental presente dans ce memoire porte sur 1) les parametres moleculaires et topographiques relatifs a rac, pour une activation maximale de l'oxydase en milieu acellulaire: p47phox, p67phox et rac1 ont ete clonees et surexprimees dans le systeme d'expression cellules d'insecte/baculovirus puis purifiees et utilisees avec une preparation de membranes de neutrophiles pour etudier l'activation de la nadph oxydase. Le role de la geranyl-geranylation post traductionnelle de rac et de la nature du guanine-nucleotide fixe par rac a ete precise. 2) la localisation des zones d'interaction dans p47phox, p67phox et p40phox proteines riches en domaines sh3 et motifs polyproline lors de l'assemblage du complexe oxydase, grace a l'utilisation d'un systeme de clonage par interaction in vivo, le systeme double-hybride: l'emploi de differentes constructions impliquant les proteines p47, p67 et p40 entieres ou tronquees a conduit a localiser plusieurs sites specifiques d'interaction et a permis de construire un modele du complexe oxydase faisant apparaitre de facon coherente les assemblages des composants du complexe, ainsi que leur evolution au cours de l'activation

Le récepteur du polypeptide insulinotrope glucose-dependant (GIP-R), membre de la sous-famille B des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), module la régulation des fonctions physiologiques et métaboliques de l'organisme telles que l'homéostasie glucidique et lipidique. Ces propriétés font du récepteur du GIP une cible thérapeutique potentielle pour le traitement du diabète sucré et de l'obésité. Le développement de nouveaux agents pharmacologiques, notamment des ligands non peptidiques du récepteur du GIP, constitue un enjeu important. Les mécanismes moléculaires responsables de l'activation des récepteurs de la famille B ne sont cependant pas bien compris, même si un mécanisme d'activation général en deux étapes a été postulé pour ces récepteurs. Cependant, les acides aminés qui participent au processus d'activation restent encore à définir. L'objectif majeur du projet de recherche était d'identifier le site de liaison du GIP-R humain en caractérisant précisément les principaux résidus du récepteur en interaction fonctionnelle avec les acides aminés du domaine N-terminal du GIP, connu pour correspondre au domaine d'activation du GIP. Par modélisation moléculaire, des modèles de complexes GIP. GIP-R ont été construits, sur la base des alignements multiples de séquences des récepteurs et des ligands. La partie contenant les domaines transmembranaires du récepteur du GIP a été modélisée par homologie sur la base des coordonnées du cristal du récepteur adénosine A2A. Puis, le modèle correspondant au cristal du complexe comprenant le GIP lié au domaine extracellulaire du récepteur GIP a été " docké " sur la partie transmembranaire du récepteur du GIP. Les acides aminés du récepteur identifiés comme étant en interaction avec le N-terminal du GIP ont été mutés. L'analyse pharmacologique des mutants a démontré que l'Arg183 et l'Arg190 de l'hélice transmembranaire II (TMH-II), l'Arg300 du TMH-V et la Phe357 du TMH-VI étaient importants pour l'activation du récepteur. En effet la mutation de ces acides aminés a entrainé une diminution significative de la capacité du récepteur à induire la formation d'AMPc. Une caractérisation plus poussée de ces mutants, ainsi que des tests utilisant des analogues du GIP dont certains résidus ont été substitués par une alanine, ont démontré l'interaction du Glu3 du GIP avec l'Arg183 du GIP-R. Nous avons également préparé du GIP (1-30)-Alexa-F-647 et vérifié sa capacité à stimuler le récepteur avec une puissance équivalente au GIP(1-30). Le peptide fluorescent a été ensuite utilisé pour démontrer que tous les récepteurs mutés étaient exprimés à la surface cellulaire HEK293 à un niveau similaire de celui du WT-GIP-R, ceci grâce à des expériences de cytométrie en flux et de microscopie confocale. Nous présentons donc un modèle du complexe GIP. GIP-R identifiant les résidus et les hélices du récepteur qui sont impliqués dans le processus d'activation, ainsi que leurs interactions avec les acides aminés de l'extrémité N-terminale du peptide. En outre, la région N-terminale du GIP se place à l'intérieur dune poche formée par les hélices transmembranaires 2, 3, 5 et 6 du récepteur, notamment du fait de l'interaction de Glu3 avec l'Arg183 du récepteur et de la Tyr1 biologiquement cruciale du GIP avec la Gln224 (TMH-3), l'Arg300 (TMH-5) et la Phe357 (TMH-6) du récepteur. Ce modèle validé expérimentalement représente une étape importante vers la compréhension du mécanisme d'activation du GIP-R qui devrait faciliter la conception rationnelle d'agents thérapeutiques<br>Glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIP-R), a member of subfamily B of G-protein coupled receptor (GPCR), modulates the regulation of important physiologic and metabolic functions in the body such as glucose and lipid homeostasis that make it a potentially attractive therapeutic target for new pharmacological agents such as non-peptide ligands for the treatment of diabetes mellitus and obesity. However, the molecular mechanisms responsible for receptor activation are poorly understood in receptors belonging to family B. Although a general two step activation mechanism has been postulated for family B receptors yet the precise residues of the receptor that participate in the process remain to be delineated. One of the principal objectives of my research project was to identify the binding site of human GIP-R by precisely recognizing the residues that are implicated in interactions with the amino acids of the critically important N-terminal bioactive domain of the hormone that has been shown to be responsible for receptor activation. GIP. GIP-R complex models were constructed, based on multiple sequence alignments of both receptors and the ligands and the in-silico docking of the peptide using Adenosine A2a receptor as template for transmembrane domain of receptor while also taking X-ray structural data on the interaction of GIP and GIP-R ECD into consideration. Residues of the receptor identified to be involved in interaction with the ligand were subjected to site-directed mutagenesis. The pharmacological activity assays of the mutants demonstrated that Arg183 and Arg190 in TMH2, Arg300 in TMH5 and Phe357 in TMH6 were important determinants for receptor activation as demonstrated by their significant decrease in potency to induce cAMP formation, a measure of ligand induce receptor activation. Further characterization of these mutants, including tests with alanine substituted GIP analogues, demonstrated interaction of Glu3 in GIP with Arg183 in GIP-R. Furthermore, they strongly supported a binding mode of GIP to GIP-R in which the N-terminal moiety of GIP was sited within transmembrane helices 2, 3, 5, and 6 with biologically crucial Tyr1 interacting with Gln224 (TMH3), Arg300 (TMH5) and Phe357 (TMH6) of the receptor. We also prepared and ascertained the ability of GIP (1-30)-Alexa- F-647 to stimulate the receptor in comparison to GIP (1-30) and found that both activated the receptor with equal potency. The fluorescent peptide was then used to demonstrate that all the mutated receptors were expressed at HEK293 cell surface at levels similar to that of the WT-GIP-R by performing Flow cytometery and Confocal microscopy. We therefore present a model for GIP. GIP-R pin pointing the exact residues and the helixes involved of the receptor involved in activation process and the interactions with their partner amino acids in the N-terminal of the peptide. This experimentally validated model represents an important step towards understanding activation mechanism of GIP-R which should facilitate the rational design of therapeutic agents

Le lobe intermédiaire de l’hypophyse des amphibiens est constitué d’une seule population de cellules endocrines, les cellules mélanotropes, qui synthétisent l’hormone mélanotrope α (α-MSH). Les cellules mélanotropes expriment les sous-unités α2, α3, β2/β3, γ2 et/ou γ3 qui présentent des séquences consensus de phosphorylation par la PKA, la PKC, la PKG, la CaM KII et la PTK. Des études histochimiques ont démontré la présence de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote (NO), la NO synthase (NOS), dans le lobe neurointermédiaire de l’hypophyse. Le but de notre travail était de déterminer le rôle de la phosphorylation des sous-unités du récepteur GABA-A et d’étudier les voies de transduction mises en jeu par le NO impliquées dans la régulation du courant évoqué par le GABA. Deux inhibiteurs de PTK, le genistein (10⁻⁹ à 10⁻⁵ M) et la lavendustin A (10⁻¹² à 10⁻⁷ M), provoquent une potentialisation du courant induit par le GABA, tandis que leurs analogues inactifs respectifs, le daidzein et le lavendustin B, n’entraînent aucune modification des réponses au GABA. En configuration inside-out, le genistein (10⁻⁷ M) prévient l’effet inhibiteur direct de la PTK pp60ͨͭͨͨᶜ⁻ᶳᵗᶜ sur la probabilité d’ouverture du canal Cl⁻. De plus, il inhibe le taux de phosphorylation de résidus tyrosine des sous-unités β2/β3 du récepteur GABA-A. Un inhibiteur de tyrosine phosphatase , l’orthovanadate de sodium, entraîne à la fois une diminution du courant contrôle et du courant potentialisé par le genistein. Ces données indiquent que la phosphorylation des sous-unités β2/β3 du récepteur GABA-A par une PTK endogène provoque une diminution de la transmission GABAergique. Les études histochimiques et immunohistochimiques montrent qu’une NOS neuronale (nNOS) est exprimée dans les cellules mélanotropes. Le substrat de la NOS, la L-arginine (L-Arg), et un donneur de NO, le SNP, induisent une inhibition persistante du courant évoqué par le GABA. Par ailleurs, l’inhibiteur sélectif de nNOS, le 7-NI et l’inhibiteur spécifique de NOS inductible, l’aminoguanidine, provoquent une diminution transitoire suivie d’une potentialisation prolongée du courant. La formation de GMPc dans les lobes neurointermédiaires est augmentée en orésence de L-Arg ou de caféine, et bloquée par un inhibiteur du complexe Ca²⁺/calmoduline, le W7. De plus, l’activation d’une PKG par le 8pCPTcGMP inhibe l’amplitude des réponses au GABA. Ces résultats démontrent que le NO, synthétisé dans les cellules mélanotropes par une nNOS, entraîne une diminution du courant évoqué par le GABA via l’activation de la voie de transduction GMPc/PKG. En présence des inhibiteurs de GCs, le LY 83583 ou l’ODQ, le SNP provoque une potentialisation des courants macroscopiques évoqués par le GABA. Dans la configuration de patch-clamp inside-out, la probabilité d’ouverture du canal Cl⁻ est augmentée par les donneurs de NO, tels que le SNP et le DEA/NO, ou les agents alkylants, comme le H2O2 et le DTNB. Les agents réducteurs, le β-mercaptoéthanol et le DTT, abaissent la probabilité d’ouverture du canal et antagonisent l’effet des donneurs de NO ou des agents alkylants. Ces résultats suggèrent que le NO potentialise les courants évoqués par le GABA en agissant sur des résidus cystéines des sous-unités du récepteur GABA-A et/ou d’une protéine qui lui est étroitement associée. En conclusion, nos résultats démontrent pour la première fois que, dans les cellules endocrines, la phosphorylation constitutive des sous-unités β2/β3 du récepteur GABA-A par la PTK et l’activation de la PKG résultant de la stimulation de la GCs par le NO endogène, entraînent une inhibition des réponses au GABA. Par ailleurs, le NO exercerait un effet potentialisateur direct sur l’ouverture du canal Cl⁻ en induisant la S-nitrolysation des sous-unités du récepteur GABA-A et/ou de protéines étroitement associées.

Notre étude porte sur l'effet des ligands sigma sur l'activité électrique des cellules mélanotopes du lobe intermédiaire de l'hypophyse de grenouille en culture primaire. Les données obtenues démontrent que l'activation des récepteurs sigma par des ligands sigma spécifiques comme la (+)pentazocine et le DTG, augmente le taux de calcium intracellulaire par trois mécanismes distincts : i) une dépolarisation membranaire induite par la réduction d'un courant potassique de type M, et probablement d'une autre conductance potassique de fond, insensible au potentiel, ii) une augmentation de la fréquence et de la durée des potentiels d'action faisant suite à la réduction de deux conductances potassiques activées par le potentiel, le courant de la rectification retardée (I K ( V )) et le courant transitoire sortant (I A) et iii) une potentialisation des courants calciques dépendants du potentiel. Ainsi, les ligands sigma exercent un effet stimulateur sur l'activité électrique des cellules mélanotropes, par l'intermédiaire d'une protéine G sensible à la toxine cholérique. L'inhibition très rapide des conductances potassiques serait responsable d'une libération instantanée de l'α-MSH, alors que la potentialisation à plus long terme des conductances calciques pourrait être à l'origine d'une augmentation prolongée de la sécrétion. En conclusion, notre étude démontre pour la première fois un effet direct des ligands sigma sur les cellules mélanotropes. En outre, nos travaux apportent également pour la première fois, un argument fonctionnel en faveur d'une interaction entre les récepteurs sigma et une protéine Gs.

Les domaines PDZ reconnaissent des motifs C-terminaux (PBMs), à l'origine de nombreuses interactions qui sont souvent impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié divers aspects de la spécificité des interactions PDZ-PBM. Nous avons mis en évidence les faibles performances de deux prédicteurs d'interaction entre PDZs et PBMs, considérés sous leurs formes les plus courtes. Ensuite, nous avons développé des protocoles basés sur les méthodes BIAcore et HoldUp pour valider expérimentalement et à grande échelle des prédicteurs d'interaction PDZ-PBM et pour étudier l'influence du contexte de séquence (comme les séquences flanquantes ou les domaines voisins) des PDZs et des PBMs sur l'affinité et la spécificité de leurs interactions. Nous avons identifié des interactions potentielles impliquant les protéines humaines à PDZ MAGI1 et SCRIB soulignant leur implication dans les réseaux de signalisation des protéines G. Une revue de la littérature, combinée avec nos propres résultats, a révélé des mécanismes par lesquels le contexte de séquence influence les affinités et spécificités des interactions impliquant les PDZs. Nous avons discuté ces mécanismes dans une revue publiée. Les connaissances obtenues à partir de cette thèse pourront influencer positivement de futures études sur les interactions PDZ-PBM, en particulier, et sur les interactions domaine-motif linéaire en général.

Les étapes membranaires de la transduction du signal médiée par les récepteurs couplés aux protéines G ne sont pas complètement compris. Grâce à une approche de suivi de particule unique nous avons étudié la diffusion latérale du récepteur æ au opioi͏̈des à la surface de fibroblastes transfectés de façon stable par un récepteur " taggé ". Nos travaux ont permis de distinguer deux types de comportements diffusionnels : 10 % des récepteurs présentent une diffusion dirigée ou lente et 90 % une diffusion " confinée avec marche " combinant une diffusion confinée aux temps courts et une marche aléatoire aux temps longs. Une analyse statistique montre que le confinement observé est dû à des interactions attractives inter-protéines à longue distance en l'absence de barrières extra ou intra-membranaires. Nous proposons un modèle théorique simple qui explique les comportements diffusionnels aux temps courts et aux temps longs ainsi que les variations des coefficients de diffusion avec la taille des domaines. .<br>G protein coupled receptors are involved with other partners in a signal transduction pathway whose mechanism is still not completely understood. We used single particle tracking to study the real time lateral movements of the æ opioid receptor on the surface of fibroblast cells stably transfected by a T7-tagged æ opioid receptor. Two populations could be distinguished : 10% of the receptors exhibit a directed diffusion mode and 90% have a "walking confined diffusion" mode combining a short term confined diffusion with a long term random walk. .

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies<br>G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies

Les canaux sensibles à l'ATP (KATP) résultent de l'association unique d'une protéine ABC (le récepteur des sulfonylurées, SUR) et d'un canal potassique rectifiant entrant (Kir6.x). Suite à la liaison de divers effecteurs (nucléotides, molécules pharmacologiques), SUR module l'activité de Kir6.x. Dans l'organisme, les canaux KATP lient le niveau énergétique de la cellule au potentiel membranaire. De ce fait, leur implication dans diverses fonctions physiologiques telles que la sécrétion pancréatique d'insuline ou le contrôle du tonus vasculaire en fait des cibles thérapeutiques. Ainsi, dans le cadre d'une collaboration, nous avons testé des composés (dérivés benzothiazine) sur le canal KATP. Quatre d'entre eux se sont avérés être des ouvreurs des canaux KATP. Nous avons également exploré l'effet de deux insecticides, l'amitraz et le diflubenzuron sur le canal KATP. En outre, dans une optique de généralisation du concept d'Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR) mis au point par l'équipe, nous avons élaboré des biocapteurs reposant sur l'assemblage de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et Kir6.2. Cette association, inspirée par le canal KATP, est réalisée de telle manière que la fixation d'un ligand sur le GPCR entraîne la modulation de l'activité de Kir6.2. L'ingénierie moléculaire nous a permis de fusionner Kir6.2 aux récepteurs β2 adrénergique, dopaminergique D3, cannabinoïde 1 (CB1), des CC-chimiokines 2 et à l'opsine. La méthode de double-microélectrodes nous a permis d'identifier trois ICCR fonctionnels basés sur les récepteurs β2, D3 et CB1. Ces biocapteurs présentent des applications dans le cadre du criblage haut débit, la caractérisation fonctionnelle des GPCR ou la compréhension de la régulation de l'activité de Kir6.2.