Academic literature on the topic 'Protéines à thiol'

Cette thèse est consacrée au développement d'assemblages supramoléculaires, qui miment la nature amphiphile des membranes cellulaires. A cette fin, des bicouches lipidiques supportées (SLB) ont été conçues pour l'insertion de la FhuA (protéine de membrane externe d'E. coli). L'interaction de FhuA présente dans la SLB, avec le pb5 (la protéine du bactériophage T5) a ensuite été étudiée par QCM-D. De plus, des bicouches lipidiques suspendues (tBLM) ont été construites sur des monocouches auto-assemblées (SAM) d'un nouveau thiol d'ancrage. Dans cette étude, la formation de tBLM a été minutieusement étudiée par différentes techniques telles que la QCM-D, l'AFM et l'EIS, afin de déduire le rôle du thiol d'ancrage dans le processus de formation de tBLM. En outre, un amphipol biotinylé (B-PCApol), a été employé pour l'immobilisation des protéines membranaires, par exemple la FhuA et de l'intégrine avß3 (humain) sur des surfaces contenant la streptavidine. Avec leurs assemblages respectifs, la constante de dissociation du complexe FhuA-pb5 a été déterminée, tandis que les interactions de l'intégrine avec vitronectine (son ligand naturel) ont été étudiées par SPR. La dernière partie de cette thèse est dédiée à l'étude d'événements de reconnaissance biomoléculaire entre une lectine (ConA) et des sucres multivalents présentés sur un châssis moléculaire, RAFT.

Des materiaux reactifs ont ete synthetisees et utilises comme phases stationnaires en chromatographie en phase liquide. Ils sont capables d'interagir avec les substances a analyser ou a purifier par l'intermediaire de liaisons covalentes. Deux types de reactions ont ete etudies: des reactions d'echange thiol-disulfure et des reactions de formation de complexes. Les materiaux portant des fonctions thiol ou disulfure ont ete obtenus par modification en deux etapes de gels de polyacrylamide reticule (biogelp) (0,2 mmole sh par g. ), par greffage sur de la silice de mercaptopropylsilane (0,35 mmole sh par g. ), et par modification de polymeres hydrophiles (pvi; pdma-ga) deposes sur de la silice (0,09 a 0,3 mmole sh par g. ). Les gels macromoleculaires et les silices recouvertes de polymeres ont ete utilises pour purifier par chromatographie de covalence des proteines contenant des fonctions thiol: la papaine et la bsa; apres purification, ces proteines ont une teneur en thiol voisine de la valeur theorique (1 sh/mole). La resistance mecanique des materiaux rigides est tres superieure a celle des biogels. De ce fait, seuls les supports a base de silice peuvent etre employes, apres activation par un disulfure chromophore, pour colorer des thiols issus d'une colonne hplc. Les conditions optimales de detection ont ete determinees; la limite de detection est alors egale a 0,02 nmoles. D'autre part des complexes metalliques immobilises ont ete obtenus par complexation du cu(ii) par du pvi depose sur de la silice (0,06 moles cu(ii). G##1 et analyses par rpe. Ceux-ci peuvent fixer des peptides et des proteines contenant des residus histidine ou tryptophane accessibles. Dans le cas des proteines, il a ete montre que les interactions de type donneur-accepteur etaient accompagnees d'autres effets de nature electrostatique et/ou hydrophobe

Ce travail de thèse porte sur la synthèse de (co)polymères thermosensibles présentant une fonctionnalité azlactone par polymérisation radicalaire contrôlée RAFT pour l'ancrage de biomolécules. Trois stratégies différentes ont été étudiées. La première stratégie a consisté en la synthèse d'un nouvel agent de transfert permettant d'obtenir des polymères thermosensibles à fonctionnalité azlactone en position . La seconde approche a permis d'introduire la fonctionnalité azlactone en position ω de copolymères thermosensibles via la combinaison de la polymérisation RAFT et de l'addition de Michaël " thiol-ène ". La dernière stratégie a conduit à des copolymères thermosensibles à fonctionnalité azlactone en position latérale par copolymérisation RAFT de la 2-vinyl-4,4-diméthylazlactone avec d'autres monomères. Enfin, la réactivité de ces copolymères thermosensibles pour l'ancrage d'une protéine modèle (lysozyme) a été mise en évidence.

L’objectif de cette thèse est la caractérisation et l’étude de séquences géniques régulées différentiellement au cours du développement de Dictyostelium discoideum. Par sélection d’une banque d’ADN génomique de D. Discoideum avec une sonde d’ADNc correspondant à un gêne régulé au cours du développement, nous avons isolé une séquence d’ADN génomique. L’analyse structurale des gènes et l’établissement des séquences nucléotidiques ont montré une organisation différente et une faible identité nucléotidique globale (25%) entre ces deux gènes. Cependant d’importants homologies ont été trouvées au niveau des séquences protéiques correspondantes, particulièrement dans une région correspondant au site actif de diverses thiol-protéases (cathepsine H et B. , papaïne, actinidine). Ces résultats suggèrent donc que les gènes correspondant à ces deux séquences clonées codent vraisemblablement pour des enzymes protéolytiques distinctes appartement à la classe des thiol-protéases. L’étude de la régulation de ‘l’expression de ces deux gènes a révélé que les ARNms spécifiques apparaissaient dans le cytoplasme au stade de l’agrégation et qu’ils s’accumulaient à des étapes différentes du développement. Par ailleurs, les travaux de distribution subcellulaire et de transcription in vitro ont montré que l’expression de ces deux gènes était principalement régulée au niveau de la transcription. Cependant, dans le cas du gène correspondant au clone génomique, certains mécanismes post-transcriptionnels pourraient également intervenir de façon additive. Les perspectives de travail proposées devraient permettre de mieux comprendre la régulation de la synthèse de ces protases et leur rôle dans le processus de différenciation cellulaire de Dictyostelium discoideum.

L'oxydation des résidus cystéines est une modification biochimique très répandue survenant dans tous les compartiments des cellules eucaryotes. Ce phénomène sert le repliement oxydatif des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), l'importation de protéines dans l'espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS). De plus, il a un rôle régulateur dans la matrice mitochondriale et dans le cytosol où il contrôle l’activité des enzymes et des protéines de signalisation et de régulation. Dans tous ces procédés, la réversibilité de l'oxydation des résidus Cys est une caractéristique essentielle. Deux systèmes oxydoréductase puissants existent : les voies de glutathion (GSH) et la thiorédoxine ; ils catalysent la réduction des ponts disulfure, et contrôlent la plupart des processus cellulaires thiol-redox dépendant. Cependant, en dépit d'énormes connaissances portant sur leur enzymologie, peu est connu sur les caractéristiques physiologiques de ces systèmes chez les eucaryotes. Pour déterminer l'importance physiologique de ces systèmes et indiquer lequel est à la base de l'exigence du GSH pour la viabilité, nous avons effectué une analyse complète des cellules de levure épuisée ou contenant des niveaux toxiques de GSH. Les deux conditions déclenchent une réponse « iron-starvation-like » et une altération de l'activité des enzymes d’assemblage des centres fer-soufre (Iron sulfure cluster : ISC) extra-mitochondriales. Cependant, elles n’ont pas d'impact sur l’entretien thiol redox, à l’exception des niveaux élevés de glutathion qui ont altéré le repliement oxydatif des protéines dans le reticulum endoplasmique. Alors que le fer sauve partiellement la maturation des ISC et les défauts de croissance des cellules appauvries eh GSH, des expériences génétiques ont indiqué que, contrairement à la thiorédoxine, le glutathion ne peut pas assurer par lui-même les fonctions thiol-redox de la cellule. Nous proposons que le glutathion soit essentiel par son exigence dans l’assemblage des centres fer-soufre, mais ne serve comme backup que pour maintenir l’état thiol-redox de la cellule. Des niveaux physiologiques élevés de GSH sont ainsi destinés à isoler sa fonction dans le métabolisme du fer des variations de sa concentration pendant le stress redox, ce qui constitue un modèle contestant la vision traditionnelle du GSH comme acteur primordial du contrôle thiol-redox cytosolique.Nos données préliminaires sur la distribution de GSH dans les cellules recueillies par lasurveillance de l'état redox de rxYFP ciblée pour différents compartiments cellulaires (RE,Matrice, cytosol et IMS) dans les cellules HGT1 indiquent un transport spécifique du GSH vers le RE et l'exportation de GSSG de ce compartiment. Nous avons pu caractériser deuxtransporteurs ABC dont la suppression modifie le RE plus oxydant et entraîne une accumulation de GSSG par rapport aux cellules sauvages. Ces données ont été confirmées par le suivi de l'état redox de PDI1 et ERO1 (WT et hyper active). Elles suggèrent un rôle de ces transporteurs dans l'exportation du GSSG du la RE, et que le flux de GSH entre les différents compartiments est très régulé
Cys residue oxidation is a widespread biochemical modification occurring in all eukaryotic cells compartments. It serves oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum (ER), protein import in the intermembrane space of mitochondria (IMS), and it has a regulatory role in the mitochondrial matrix and in the cytosol where it controls enzymes and signaling regulatory proteins activity. In all these processes, reversibility of Cys residue oxidation is a crucial feature. Two potent oxidoreductase systems, the glutathione (GSH) and thioredoxin pathways, catalyze disulfide bond reduction, and presumably control most thiol-redox-dependent cellular processes. However, despite tremendous knowledge of their enzymology, little is known about the physiological features of these systems in eukaryotes. To determine the physiologic importance of these functions and sort out which of them accounts for the GSH requirement for viability, we performed a comprehensive analysis of yeast cells depleted of or containing toxic levels of GSH. Both conditions triggered an intense iron-starvation-like response and impaired the activity of extra-mitochondrial ISC enzymes, but did not impact thiol-redox maintenance, except high glutathione levels that altered oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. While iron partially rescued the ISC maturation and growth defects of GSH-depleted cells, genetic experiments indicated that unlike thioredoxin, glutathione could not support by itself the thiolredox duties of the cell. We propose that glutathione is essential by its requirement in ISC assembly but only serves as a thioredoxin back up in cytosolic thiol-redox maintenance. Glutathione high physiologic levels are thus meant to insulate its function in iron metabolism from variations of its concentration during redox stresses, a model challenging the traditional view of it as prime actor in cytosolic thiol-redox control.Our preliminary data on the distribution of GSH inside cells collected by monitoring the redox state of rxYFP targeted to different cell compartments (ER, Matrix, Cytosol and IMS) in HGT1 cells indicate a specific transport of GSH into the ER and export of GSSG out of it. We were able to characterize two ABC transporters on which their deletion modify the redox state of the ER to more oxidizing and result in accumulation of higher GSSG content compared to WT. These data were confirmed by looking to the redox state of the PDI1 and ERO1 (WT and hyper active), all together suggest a role of these transporters in GSSG export from the ER, and that GSH flux between the different compartments is highly regulated

Un des enjeux en génie microbien est de produire des quantités élevées de protéines. Parmi les hôtes disponibles pour la production hétérologue de protéines, Lactococcus lactis est une bactérie à fort potentiel. Son innocuité et son caractère gram positif en fait un hôte de choix pour la production de protéines d'intérêt. Parmi ces protéines figurent des bactériocines, qui sont des proteines antibactériennes pouvant être utilisées à des fins de sécurité sanitaires des aliments voire comme antibiotique. Ces travaux ont pour ambition d'améliorer la production hétérologue de la bactériocine pédiocine chez L. lactis au niveau quantitatif et qualitatif en ciblant respectivement les étapes de sécrétion et de maturation post-traductionnelle. La sécrétion a été améliorée en insérant les pro-peptides SD ou LEISSTCDA entre le peptide signal de sécrétion et la séquence de la bactériocine. Il a été montré que cette insertions n’affectent pas l’activité antibactérienne. L’analyse in silico de l’opéron responsable de la production de pédiocine chez la bactérie productrice sauvage a révélé que le gène pedC code une protéine prédite comme thiol-disulfide oxydoréductase, suggérant un rôle de cette protéine dans le statut redox des cystéines de la pédiocine. La co-expression de PedC avec la pédiocine recombinante a permis d’augmenter son pouvoir antibactérien. Les résultats obtenus pendant cette thèse ont ainsi montré que la production de pédiocine par L. lactis peut être améliorée par fonctionnalisation de l’extrémité N-terminale sans effet significatif sur le potentiel antibactérien et que PedC joue un rôle majeur dans le potentiel antibactérien de la pédiocine
Lactococcus lactis is considered an efficient cell factory for recombinant protein production. It is able to produce and secrete class IIa bacteriocins such as pediocin PA-1 via the general secretion (Sec) pathway. However, the positive charges at the N-terminus of pediocin PA-1 might impair secretion via the Sec secretion pathway and the obtained recombinant pediocin has been described as less potent than the pediocin from the natural producer. The impact of two propeptides on the production yield and on the potency of recombinant pediocins was investigated. The nucleotide sequences encoding the propeptides SD or LEISSTCDA were inserted between the sequence encoding the signal peptide of Usp45 and the structural gene of the mature pediocin PA-1. Both propeptides improved secretion of the recombinant pediocins. Although no major impact on the antibacterial activity of recombinant pediocins was observed, all recombinant bacteriocins produced in L. lactis were less potent than wildtype pediocin. Co-expression of the putative thiol-disulfide oxidoreductase PedC, which is encoded by the pediocin PA-1 operon, with the recombinant pediocins allowed to significantly decrease the minimal inhibitory concentration of the produced bacteriocins. To our knowledge, this report shows for the first time that the propeptides SD or LEISSTCDA lead to an improved secretion of recombinant pediocins with apparently no effect on the antibacterial potency and that PedC plays a major role in the potency of pediocin

Les CPPs peuvent transporter à l’intérieur des cellules différents types de molécules bioactives. Nous avons étudié, à l’aide d’une méthode basée sur l’analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF, l’effet de la présence de cystéines lors de l’internalisation de deux séquences : pAntp et (R/W)9. L’importance des propriétés redox des cystéines lors de la translocation a été montrée ; cette interactivité conduirait à la séquestration du peptide dans la membrane ou à une nouvelle voie d’internalisation. Deux nouveaux protocoles permettant de différencier chimiquement le peptide membranaire ont permis de montrer que la cyclisation ou la conjugaison améliore l’internalisation. De plus, ces deux séquences non cytotoxiques présentent de fortes activités antibactériennes, modulées par l’état structural du peptide. Nous avons enfin montré que, lors d’analyses par microscopie confocale, les informations obtenues sur cellules vivantes ou après reconnaissance biotine/avidine sont complémentaires.

La synthèse contrôlée par la cible sous contrôle cinétique (Kinetic Target-Guided Synthesis, KTGS) est une stratégie d’approche par fragments, où la cible biologique est directement employée afin d’assembler son propre ligand via une réaction biocompatible et irréversible. Bien que prometteuse pour la découverte de nouvelles molécules biologiquement actives, il existe toujours différentes limitations inhérentes à cette technique comme la formation de très faibles quantités de ligands, pouvant conduire à des faux négatifs lors des analyses, ou encore le nombre limité de réactions éligibles en KTGS, ne permettant pas une couverture optimale de l’espace chimique. Afin de répondre à ces différentes limitations, deux approches principales ont été imaginées en tant qu’objectifs de ces travaux. La première stratégie consiste à élaborer une séquence réactionnelle permettant d’une part de former le ligand au sein de la cible, et d’autre part de réaliser son marquage afin d’augmenter sa détectabilité par spectrométrie de masse ou par émission de fluorescence. Le second objectif est d’étudier l’éligibilité de diverses réactions biocompatibles (réactions de Diels-Alder et de thiol-yne) pour des applications en KTGS afin de compléter l’éventail de réactions applicables
The kinetic target-guided synthesis (KTGS) is a fragment-based strategy which involves the biological target for the assembly of its own ligand via a biocompatible and irreversible reaction. Although promising for the discovery of new biologically active molecules, this approach is still suffering from various limitations, namely the very low quantities of ligand which are formed during the experiments, which may afford false-negative results during analyses, or the limited range of applicable reactions in KTGS, which do not allow an optimal covering of the chemical space. In order to address these issues, two main approaches were envisioned as goals of this thesis work. The first one is the development of new reactional sequences, allowing at first the formation of the ligand within the target, and then its labelling so as to increase its detectability by mass spectrometry analysis or by fluorescence emission. The second goal was to study the eligibility of various biocompatible reactions (Diels-Alder and thiol-yne reactions) for KTGS application so as to complete the range of available reactions

Les maladies cardio-vasculaires, et notamment l’insulino-résistance et l’athérosclérose, représentent désormais la cause majeure de décès dans les pays industrialisés. Puisqu’elles sont caractérisées par une augmentation de stress oxydant, nous avons recherché au niveau cellulaire un régulateur redox pouvant expliquer les effets délétères d’une hyperlipidémie. Des cellules endothéliales aortiques soumises à des LDL oxydées produisent une quantité importante de peroxynitrite et présentent une forte activation de l’activité de la protéine p21Ras qui est dépendante de la S-glutathiolation de sa cystéine 118. En conséquence, l’activation en aval de Erk provoque la phosphorylation du récepteur substrat à l’insuline qui empêche son bon fonctionnement. De même, des souris LDLr-/- sous régime diabétogénique présentent une perte importante de leur relaxation vasculaire qui peut être prévenue par inhibition ou mutation de la protéine p21Ras. Aussi, un traitement par une statine, un agent pharmacologique hypolipidémiant couramment utilisé, provoque la défarnésylation de p21Ras par oxydation de la cystéine terminal 186 et une translocation mitochondriale où elle se lie avec la protéine Bcl-xl et déclenche l’apoptose des cellules endothéliales. Cette étude démontre donc l’importance croissante de l’oxydation de groupements thiols protéiques dans la conduction du signal moléculaire pathologique et présente la protéine p21Ras comme une cible pharmacologique potentielle de la réduction du risque vasculaire
Cardiovascular diseases, and especially insulin resistance and atherosclerosis, represent nowadays the major cause of death in industrialized countries. Since they are characterized by an increase of oxidative stress, we decided to look for a cellular redox sensor that would account for deleterious effects of hyperlipidemia. Aortic endothelial cells exposed to oxidized LDL exert an important oxidant production as well as an increase of p21Ras activity due to S-glutathiolation of its cysteine 118. Consequently, downstream signaling to Erk leads to insulin receptor substrate serine phosphorylation that prevents its normal function. Also, LDLr-/- mice under diabetogenic diet undergo a major impairment of their endothelium-dependent vascular relaxation that could be restored by inhibition or mutation of p21Ras. Finally, treatment by a statin, a widely prescribed hypolipidemic drug, triggered unfarnesylation of p21Ras as well as its translocation to mitochondria where it binds to Bcl-xl and induces endothelial cells apoptosis. This study therefore demonstrates the increasing relevance of protein thiols oxidation in modulation of pathological cellular molecular signaling and suggests the protein GTPase p21Ras as a potential pharmacological target for reduction of cardiovascular risk

L'étude des fonctions thiols de la carboxylestérase intestinale de porc (CEIP) a conduit, d'une part, à l'identification de deux ponts disulfure intrachaînés, nommés Cys70-Cys99 et Cys256-Cys267 et, d'autre part, à la mise en évidence d'une fonction thiol (Cys71) bloquée. Nous observons que les deux ponts disulfure sont présents dans les cholinestérases bien que la CEIP ne présente que 35 % d'identité de séquence avec celles des cholinestérases. Le premier pont disulfure ou boucle O (omega). Par analogie aux cholinestérases, semble être important pour la conformation active de l'enzyme en raison de son inactivation dans des conditions réductrices. Enfin, la CEIP est capable d'hydrolyser les substrats cholinergiques alors que les résidus essentiels impliqués dans l'attachement de ces substrats, présents entre autre dans la boucle O (omega) des cholinestérases, ne sont pas conservés dans la CEIP. .
The study of thiol groups of porcine intestinal carboxylesterase (PICE) led us on the one hand, to the identification of two intra-chain disulfide bridges, namely Cys70-Cys99 and Cys256-Cys267 and, on the other hand, to the identification of a blocked sulfhydryl group (Cys71). We observe that the two disulfide bridges are present in the cholinesterase family,although PICE showed only about 35 % identity with these proteins. The first disulfide bridge or loop O (omega), by analogy with the cholinesterases, seems to be important for the enzyme conformation because of its inactivation under reducing conditions. Lastly, PICE was also found to hydrolyze cholinergic substrates, although essential residues responsible for substrate binding in cholinesterases were lacking in loop O (omega) of PICE. Other amino acid residues in PICE may therefore be responsible for the binding of cholinergic substrates to the enzyme. Using the anti-peptide K281-E296 of PICE polyclonal antibodies, we showed that the enzyme was only found to be expressed in the porcine small intestine, liver, submaxillary and parotid glands, kidney cortex, lungs, and cerebral cortex, which have in particular a secretory function. In the intestinal mucosa, the pi 5. 1 enzyme was distributed in several subcellular fractions (microsomal, mitochondrial, soluble), as well as in the microvillar fraction. .