Academic literature on the topic 'Protéines de choc thermique – Immunologie'

Pour la survie des cellules, en particulier dans des conditions difficiles, l’un des mécanismes qui s’est le plus maintenu lors de l’évolution est celui de l’expression de protéines connues sous le nom de protéines de choc thermique, ou protéines de stress. Ces protéines assurent une protection lors d’un second stress et induisent ainsi une tolérance aux agressions qui suivent. Trois grandes familles de protéines de choc thermique ont été décrites selon leurs tailles : 27 kDa, 70 kDa et 90 kDa. Ces protéines sont exprimées à la suite de toute situation qui compromet la survie cellulaire. Parmi ces situations se trouvent d’abord l’augmentation de température, l’exposition à des métaux lourds ou à d’autres agents chimiques comme l’ozone, l’hypoxie, l’anoxie, le manque de glucose ou les infections. Leur rôle consiste alors à protéger l’ensemble vital des protéines cellulaires. Cette protection s’effectue de façon préférentielle selon les tissus mais leur expression est fortement atténuée quand les cellules et tissus sont en phase de récupération après un premier stress. Ainsi, la réponse des protéines de choc thermique peut être considérée comme un mécanisme universel de défense contre toute forme d’agression. Mieux connaître la réponse des protéines de choc thermique à des agressions diverses chez les animaux domestiques peut amener à une meilleure connaissance de leur état de santé en général et de celle de la qualité de leur production.

Au cours de processus infectieux, les interactions entre pathogenes intracellulaires et macrophages peuvent declencher des reactions cellulaires apparentees a la reponse au choc thermique. Ces reactions impliquant des proteines specifiques appelees proteines de stress (hsp) ont ete etudiees en utilisant comme modele la lignee leucemique humaine u937 et la bacterie brucella. Nous avons montre qu'un choc thermique sub-lethal permet d'induire la differenciation des cellules myelomonocytaires. Les resultats obtenus suggerent une adaptation fonctionnelle au stress des cellules monocytaires permettant d'accelerer leur maturation en macrophages lors d'etats febriles. Les hsp majeure dnak (hsp70) et dnaj (hsp40), groe1 (hsp60) et groes (hsp10) de brucella ovis ont ete clonees. L'operon dnak-j a ete sequence; il est exprime dans e. Coli et permet de complementer un mutant deficient en dnak. La dnak de brucella ovis est d'autre part apparue comme un antigene majeur au cours de l'infection. La caracterisation moleculaire d'un fragment de hsp60 a permis de preciser la taxonomie du genre brucella. La conservation structurale des hsp70 au cours de l'evolution a permis d'analyser l'origine phylogenetique de brucella ovis

Les petites protéines de choc thermique (sHsps : small heat shock proteins) sont présentes en nombre variable dans tous les organismes. Le génome de Drosophila melanogaster encode 12 sHsps, avec une expression au cours de développement, une localisation intracellulaire et une spécificité de substrats différents. DmHsp27 est l’une des rares sHsps à avoir une localisation nucléaire avant et après un choc thermique. Cette localisation nucléaire est inhabituelle, d’autant plus qu’aucune fonction spécifique de cette protéine n’a encore été identifiée. Les mécanismes responsables de la localisation nucléaire de DmHsp27 ainsi que sa probable fonction dans le noyau restent peu connus. L’étude des orthologues de DmHsp27 chez les insectes a permis de déterminer que la localisation nucléaire n’est pas spécifique à DmHsp27 et d’autres sHsps chez les insectes présentent le même signal de localisation nucléaire que DmHsp27. Le réseau d’interaction de DmHsp27 nous laisse croire que cette protéine ne joue pas seulement le rôle de chaperon moléculaire, mais qu’elle est probablement impliquée dans différents processus nucléaires. Au niveau structurel, contrairement aux sHsps chez les métazoaires, DmHsp27 forme deux populations d'oligomères non en équilibre. Des mutations indépendantes de trois arginines hautement conservées au niveau du domaine alpha-cristallin (R122, R131 et R135) à la glycine affectent l’oligomérisation par formation d’une seule population de grand poids moléculaire. In vitro, l'activité de chaperon de DmHsp27WT est comparable à celle de ses deux populations isolées et à celle des mutants R122G, R131G et R135G utilisant la luciférase comme substrat. Cependant, dans un essai de protection contre l’aggrégation de l’insuline, l'activité de chaperon de DmHsp27 est inférieure à celle des mutants R122G et R131G. Une stratégie de délétion et mutation a été utilsée pour étudier le rôle de la région N-terminale sur l’oligomérisation et la fonction chaperon de DmHsp27. Tel que déterminé par chromatographie d'exclusion et gel natif, des mutations au niveau de F29, G30 et G32 présentent des structures oligomériques différentes de celle du type sauvage. Aucun de ces mutants sauf l'élimination complète de la région N-terminale n’a montré une perte d'activité chaperon, suggérant un rôle important dans la reconnaissance et liaison de substrat. Étonnamment, les deux glycines (G30 et G32) conservées chez les orthologues de DmHsp27 agissent comme régulateurs négatifs de l'activité chaperon; leurs mutations améliorent grandement la prévention d’agrégation d’insuline. La différence du rendement de la protéine sauvage et des mutants G30R et G32R à prévenir l’agrégation de l’insuline à 20 °C et à 42 °C a permis d’établir un lien entre la structure et la fonction chaperon de DmHsp27 et de définir le mode d’action de DmHsp27 suite au stress thermique. En résumé, cette étude a permis de caractériser DmHsp27 et ses mutants au niveau du domaine alpha cristallin et de la région N-terminale et a donné un aperçu d’un nouveau mécanisme de protection contre l’agrégation des sHsps. Le rôle de chaperon moléculaire joué par DmHsp27 et son induction durant le développement embryonnaire laisse cependant présumer que cette protéine remplit d’autres fonctions cellulaires importantes.
Small heat shock proteins are present in varying numbers in all organisms. In Drosophila melanogaster there are 12 sHsps, which have distinctive developmental expression patterns, intracellular localizations and substrate specificities. DmHsp27 is one of the very few sHsps that have a nuclear localization before and after heat shock. This nuclear localization is unusual, especially since no specific function has yet been identified. The mechanisms responsible for the nuclear localization of DmHsp27 and its function in the nucleus remain poorly understood. First, the study of DmHsp27 orthologs helped to determine that nuclear localization is not specific to DmHsp27 and other sHsps in insects have the same nuclear localization signal as DmHsp27. The DmHsp27 interaction network leads to believe that this protein does not only play the role of chaperone, but it is also involved in various nuclear processes. Second, unlike metazoan sHsps, DmHsp27 forms two populations of oligomers not in equilibrium. Mutations of highly conserved arginine residues in the ACD domain in mammalian sHsps has been reported to be associated with protein conformational defects and intracellular aggregation. Independent mutation of three highly conserved arginines (R122, R131 and R135) to glycine in DmHsp27 results in only one population of higher molecular weight form. In vitro, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was comparable with that of its two isolated populations and to the single population of the R122G, R131G and R135G using luciferase as substrate. However, using insulin, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was lower than that of R122G and R131G mutants. Finaly, we established the importance of the N-terminal region for oligomerization and we investigated the heat activation under in vitro experimental conditions using size exclusion chromatography and gradient native gels electrophoresis. By deletion strategy, we have examined the role of the N-terminal region and delineated a motif (FGFG) important for the oligomeric structure and chaperone-like activity of this sHsp. Deletion of the full N-terminal domain, resulted in total loss of chaperon-like activity; intriguingly deletion of the (FGFG) at position 29 to 32 or single mutation of G30R and G32R enhanced oligomerization and chaperoning capacity under non heat shock conditions using the insulin assay suggesting the importance of this site for chaperone activity. Unlike mammalian sHsps heat activation of DmHsp27 leads to enhanced dissociation/association of oligomers to form large structures about 1000 kDa. We suggest a new mechanism of heat activation for DmHsp27. In summary, this study characterized DmHsp27 and mutant in the alpha crystallin domain and the N-terminal region and provided an overview of a new protection mechanism. The role played by DmHsp27 as molecular chaperone and its induction during embryonic development, suggest that this protein may perform other important cellular functions

La synthèse des protéines de choc thermique (HSPs) est un moyen de défense développé par la cellule pour faire face aux diverses agressions auxquelles elle peut être soumise. En tant que chaperons, les HSPs participent aux mouvements intracellulaires des protéines, préviennent l'agrégation des protéines altérées, éliminent les protéines anormales et contribuent à la conformation correcte des peptides nouvellement synthétisées. Mon équipe d'accueil s'intéresse aux rôles des HSPs dans des processus cellulaires tels que l'apoptose et la différenciation cellulaire. Le but de mon travail de thèse consiste à étudier le rôle des protéines de choc thermique HSP90 et HSP70 au cours de la différenciation des monocytes en macrophages. J'ai dans un premier temps étudié l'implication de HSP90 dans la différenciation macrophagique. c-IAP1 est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l'apoptose impliqué dans la régulation de l'apoptose, dans le cycle cellulaire et dans la signalisation cellulaire. Nous avons précédemment montré que c-IAP1 migre du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. Nous démontrons dans ce travail que c-IAP1 est une protéine cliente de la protéine de choc thermique HSP90β. Dans trois différents modèles de différenciation, ces protéines interagissent et migrent ensemble du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. L'inhibition de HSP90 ou la déplétion spécifique de l'isoforme β par des siRNA conduisent à sa dégradation par le protéasome. La fonction de chaperon moléculaire de HSP90 envers c-IAP1 est spécifique de l'isoforme β car la déplétion de l'isoforme α n'a pas d'effets sur c-IAP1. De plus l'inhibition de HSP90 ou la déplétion de HSP90β bloquent la différenciation cellulaire tout comme la déplétion de c-IAP1 par siRNA. La deuxième partie de montre travail a consisté à étudier le rôle de HSP70 dans la différenciation macrophagique. Nous montrons que cette protéine est fortement induite après stimulation des cellules par le facteur de croissance M-CSF et que son inhibition bloque la différenciation des monocytes en macrophage. HSP70 interagit avec la protéine Spi-1/Pu.1, facteur de transcription clé de la différenciation macrophagique. L'expression de Spi-1/Pu.1 augmente également au cours de la différenciation macrophagique et ce de manière similaire à celle de HSP70. Ceci suggère l'implication des facteurs de transcription responsables de l'induction des HSPs, les Heat Shock Factor (HSF). L'étude du promoteur de Spi-1/Pu.1 a révélé la présence d'une séquence ressemblant fortement aux éléments de réponse classiques sur lesquels se fixe HSF1. HSF1 est capable de se fixer sur le promoteur de Spi-1/Pu.1 et l'inhibition de HSF1 bloque l'expression de Spi-1/Pu.1. HSF1 participe donc au contrôle de l'expression de Spi-1/Pu.1 lors de la différenciation macrophagique. HSP90 et HSP70 sont donc essentielles à la différenciation macrophagique. Comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans les voies de différenciation se révèle extrêmement important puisque des altérations des mécanismes de l'hématopoïèse sont retrouvées dans plusieurs types de leucémies (leucémies aiguës myéloblastiques et leucémies myélo-monocytaires chroniques). Connaître le rôle des HSPs dans la différenciation cellulaire permettrait donc de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

La Hsp90 est une protéine chaperon qui intervient en conditions physiologiques à des étapes tardives du repliement protéique, selon un « cycle de chaperonnage » du dimère régulé par l'ATP et des protéines co-chaperons. La Hsp90, qui possède de nombreuses protéines clientes impliquées dans les processus d'oncogenèse, est devenue une cible pour le développement de traitement anti-cancéreux. La Hsp90 s'oligomérise in vitro sous l'influence de la température (oligomères stables) ou des cations divalents (oligomères en équilibre dynamique). Ces oligomères semblent être actifs en conditions de stress. Nous avons démontré que l'activité protectrice de la Hsp90 vis-à-vis d'une protéine cible labile, la tubuline, est ATP-indépendante. Ces travaux ont permis la mise au point d'un test d'activité chaperon permettant le criblage de nouveaux inhibiteurs. Nous avons ensuite caractérisé biochimiquement les stoechiométries d'association des oligomères et avons résolu la structure de l'hexamère de Hsp90 par cryo-microscopie électronique. Cette structure quaternaire en forme de nid pourrait accueillir des protéines cibles. P23, un co-chaperon inhibiteur de l'activité ATPase de la Hsp90, se lie principalement au niveau du dimère. Aha1, un activateur, possède une plus grande affinité pour les oligomères de Hsp90. Ceci suggère un rôle de ces structures quaternaires. Enfin, nous avons démontré qu'en conditions de stress thermique modéré, l'oligomérisation stable est prédominante, et que la présence de nucléotides permet le maintien des oligomères en équilibre dynamique. Cette régulation renforce le caractère fonctionnel des oligomères, qui seraient les espèces actives en tant que chaperon
Hsp90 is a chaperone protein involved in late-stage protein folding under physiological conditions, according to a « chaperone cycle » of the dimer regulated by ATP and co-chaperone proteins. Hsp90 has many client proteins that are mainly involved in oncogenesis, thus making Hsp90 a target for the development of new anti-cancer drugs. Hsp90 self-oligomerizes in vitro under the influence of temperature (irreversible oligomers) or divalent cations (oligomers in a dynamic equilibrium). These oligomers are supposed to be active as chaperones under stress conditions. We demonstrated that the protective effect of Hsp90 towards a labile protein, tubulin, is ATP-independent. This finding allowed us to design a chaperone activity test for new Hsp90 inhibitors screening. We then characterized biochemically the stoichiometries of the oligomers association, and resolved the Hsp90 hexamer's structure by cryo-electron microscopy. This quaternary structure exhibits a nest-like shape that could bind a substrate protein. P23, a co-chaperone known as an Hsp90 ATPase inhibitor, binds mainly the Hsp90 dimer, whereas Aha1 an activator, has a greater affinity for the oligomeric species. This suggests a function of these quaternary structures. Finally, we demonstrated that under mild heat shock conditions, irreversible oligomers are predominating, and that nucleotide binding reverses the process, maintaining the oligomers in a dynamic equilibrium. This regulation strengthens the functionality of the Hsp90 oligomers, which would be the quaternary structures endowed with chaperone activity

HIF1α et HIF2α sont des protéines largement impliquées dans le développement de pathologies posant des problèmes majeurs de santé publique, comme le cancer. Leur activité, qui est régulée prioritairement par leur stabilité via le système ubiquitine-protéasome, coordonne de nombreux processus cellulaires susceptibles de favoriser le développement de ces maladies. Un enjeu récent de la recherche thérapeutique est d'identifier des partenaires protéiques pouvant réguler les protéines HIFα, afin de mettre au point des thérapies ciblées. Les protéines de choc thermique (HSPs) sont une classe de protéines dont une des fonctions essentielles est de réguler l'homéostasie protéique dans la cellule, en interagissant avec le protéasome. Certaines d'entre elles, HSP27 et HSP90, ont la faculté de pouvoir réguler spécifiquement la stabilité de nombreuses protéines souvent elles-mêmes impliquées dans l'apparition de ces pathologies. L'objectif de ce travail était de savoir si ces deux HSPs peuvent contrôler la stabilité de la protéine HIF2α. Nos résultats suggèrent qu'HSP27 pourrait stimuler la dégradation de HIF2α en favorisant son ubiquitination. Ce résultat est surprenant, en raison du rôle connu d'HSP27 dans la progression tumorale. Il est donc nécessaire de le confirmer et d'en préciser les processus biologiques sous-jacents. D'autre part, nos autres résultats semblent confirmer qu'HIF2α est une protéine cliente d'HSP90. De plus, nous montrons pour la première fois que l'inhibition d'HSP90 par le 17-DMAG diminue la production de VEGF dépendante de HIF2α. Des travaux récents suggèrent qu'HIF2α a un rôle prédominant dans la progression tumorale, et peut constituer une cible globale de choix dans plusieurs types de cancer. Il conviendrait d'évaluer la capacité des inhibiteurs d'HSP90 à supprimer des fonctions de HIF2α nouvellement décrites, comme son rôle dans la maintenance des cellules souches cancéreuses.

Au laboratoire, sont etudies les problemes lies a l'intervention du calcium dans la chaine de transduction de signaux extracellulaires chez les vegetaux. Dans ce contexte, a partir d'une banque d'adnc de haricot, un travail de clonage de calciproteines a ete entrepris. Le but de cette these a ete de caracteriser le produit d'un de ces clones sur les plans structural et fonctionnel. Le clone retenu code pour une proteine de choc thermique de masse moleculaire de 70 kda ou hsp70 qui comprend une extension de sequence en n-terminal. A l'aide d'experiences d'import dans des organites isoles des produits de transcription-traduction in vitro, il a ete demontre que le clone code pour le precurseur d'une hsp70 mitochondriale ou mthsp70. L'immunodetection, a l'aide d'anticorps site-specifique, a montre que cette proteine s'accumule dans la matrice sous forme de complexes de 270 et 420 kda. L'expression de mthsp70 est constitutive, cependant, lors d'un choc thermique, son expression est regulee au niveau post-transcriptionnel car le taux de son arnm augmente fortement sans variation apparente de la quantite de mthsp70. La caracterisation fonctionnelle a montre que mthsp70 est d'une part, phosphorylee de maniere calcium dependante, la forme phosphorylee etant un oligomere de 170 kda, d'autre part, affine pour l'atp et le calcium suggerant un mecanisme d'autophosphorylation. Ainsi, une hsp70 codee par un gene nucleaire et specifiquement vectorisee vers les mitochondries a ete caracterisee. Par son aptitude a s'associer a des proteines, elle pourrait intervenir dans les mecanismes de protection d'enzymes-cles, l'interaction reversible etant sous controle de la phosphorylation

La protéine de choc thermique HSP27 est un chaperon ATP indépendant qui s’accumule dans les cellules suite à divers stress et qui leur permet ainsi de survivre dans des conditions défavorables. Les fonctions intracellulaires d’HSP27 sont modulées par sa capacité à s’oligomériser. Dans ce travail, nous démontrons qu’HSP27 en fonction de son état d’oligomérisation peut être impliqué dans 2 processus de modifications post-traductionnelles apparentés : l’ubiquitination et la SUMOylation. Tout d’abord, nous avons démontré que, en réponse à divers stress, p27Kip1, une protéine régulatrice du cycle cellulaire (inhibitrice de CDK), s’accumule d’abord dans les cellules puis diminue lorsque les cellules commencent à mourir. Ces observations sont associées à une augmentation de l’expression d’HSP27 qui sous forme de petits oligomères favorise l’ubiquitination de p27Kip1 et sa dégradation par le protéasome. Les petits oligomères d’HSP27 semblent donc faciliter la transition G1/S du cycle cellulaire et pourraient donc permettre aux cellules quiescentes de reprendre un cycle. Par la suite, nous avons déterminé que, dans des conditions de stress, les grands oligomères d’HSP27s’accumulent dans le noyau, se lient à HSF1, facteur de transcription responsable de l’expression inductible des HSP, et à la SUMO E2 ligase Ubc9, et favorisent de ce fait la SUMOylation par SUMO-2/-3 d’HSF1. En conséquence, HSF1, tout en conservant sa capacité de liaison à l’ADN, perd sa capacité de transactivation. Ces données nous montrent qu’HSP27 permet une boucle d’autorégulation ne��gative de l’activité transcriptionnelle d’HSF1, et mettent en relief l’étroite collaboration entre HSP et HSF1
The small heat shock protein HSP27 is a chaperone ATP independent that accumulates in cells in response to various stresses and that enables the cells to survive in adverse conditions. The intra-cellular functions of Hsp27 are modulated by its ability to form small or large oligomers according to its phosphorylation status. In this work, we demonstrate that HSP27 according to its oligomerization status may be involved in 2 related post-translational modifications mechanisms: ubiquitination and SUMOylation. At first, we have shown that, in response to various stresses, p27Kip1, a protein regulating the cell cycle (CDK inhibitor), first accumulates in cells then decreases when the cells begin to die. These observations are associated with an enhanced expression of HSP27 that in the form of small oligomers promotes ubiquitination of p27Kip1 and its proteasomal degradation. HSP27 small oligomers seem to facilitate the transition G1/S and could therefore enable quiescent cells to re-enter the cell cycle. Thereafter, we demonstrated that, under stress, large oligomers of HSP27 store in the nucleus, bind to HSF1, the transcription factor responsible for the inducible expression of HSP, and the E2 SUMO ligase Ubc9 and thus promote SUMOylation of HSF1 by SUMO-2/-3. Accordingly, HSF1, while keeping its DNA binding ability, loses its transactivation capacity. These data demonstrate that HSP27 exerts a feedback inhibition of HSF1 transactivation activity, enlighten the strictly regulated interplay between HSP and HSF1