Academic literature on the topic 'Protéines de liaison de la thyroxine'

Les tanins sont des métabolites secondaires importants dans le règne végétal. Ils s’intègrent dans la défense des végétaux contre les herbivores, en particulier pour les plantes se développant dans les zones difficiles. La structure chimique de ces polyphénols leur confère une capacité très développée à se fixer sur toutes sortes de molécules, essentiellement les protéines. Ces interactions faisant intervenir les différents types de liaison possibles sont dépendantes de nombreux facteurs liés au milieu et à la structure des molécules réactantes (importance de la présence de proline chez les protéines). Ces aspects biochimiques permettent de se rendre compte de l’incidence et de la complexité des actions des tanins dans l’alimentation. La principale conséquence chez les ruminants est une diminution de la dégradation des protéines alimentaires dans le rumen, mais aussi une perturbation des activités microbiennes (rumen, caecum), une diminution de l’ingestion et même une toxicité. Les herbivores adaptés à une alimentation riche en tanins ont su développer des mécanismes de protection, en particulier la synthèse de protéines salivaires riches en proline “neutralisant” les tanins ingérés. Le tannage des protéines alimentaires par les tanins naturels est un débouché potentiel en alimentation des ruminants.

La construction de cartes génétiques passe par l’analyse de la ségrégation de marqueurs génétiques (polymorphismes de l’ADN, des protéines ou à effets visibles) dans des familles de référence. La distance génétique (exprimée en centimorgan) est proportionnelle au taux de recombinaison existant entre marqueurs polymorphes portés par le même chromosome, au moins pour des distances faibles, observation qui constitue la base de l’établissement des cartes. Quand les distances deviennent très petites (inférieures à 1 cM), l’analyse génétique peut faire appel à l’étude d’haplotypes de marqueurs dans les régions concernées ou à l’analyse du déséquilibre de liaison dans la population.

Cet article traite des données récentes sur les relations d’équilibre entre les acides aminés dans l’alimentation du porc en croissance, au travers du concept de la protéine "idéale". Après avoir précisé les limites de ce concept, sur le plan de la constance des rapports entre les teneurs en acides aminés indispensables et celle en lysine, prise comme référence, sont considérés les ratios entre les acides aminés limitants secondaires (tryptophane, thréonine, méthionine et acides aminés soufrés) et la lysine, compte tenu des spécificités de leur rôle fonctionnel au plan métabolique et physiologique. Pour cela, l’incidence des écarts entre le profil de composition en acides aminés de la protéine alimentaire et celui de la protéine idéale (excès de protéines) sur l’ingestion alimentaire et les performances de croissance est étudiée selon la nature de l’acide aminé le plus limitant. En raison de sa faible contribution aux processus métaboliques autres que ceux concernant la synthèse de protéines corporelles, la lysine constitue une référence stable pour l’expression des rapports entre les acides aminés. A la différence de la lysine, le tryptophane interagit fortement et négativement avec les protéines excédentaires (acides aminés neutres de grande taille) au niveau de l’appétit et de la croissance, en liaison avec un dysfonctionnement du système sérotoninergique. Ceci met en défaut la constance du rapport tryptophane / lysine, qui devrait être corrigé sur la base d’un ratio minimum tryptophane / acides aminés neutres de 4 %, pour se prémunir d’un risque d’excès de ces derniers dans certaines protéines alimentaires. Dans le cas de la thréonine, lorsqu’elle est limitante, il ressort une interaction positive avec les acides aminés non indispensables (acide glutamique). L’équilibre méthionine / cystine a été reconsidéré en fonction des données récentes de la bibliographie. En conclusion, les recommandations concernant les rapports acides aminés / lysine pour le porc en croissance ont été réactualisées.

La pharmacocinétique de la sulfaméthoxypyridazine (SMPD) a été étudiée chez le dromadaire après administrations intraveineuse et orale. Les résultats obtenus, après injection intraveineuse, indiquent que la cinétique de cet antibactérien suit un modèle à deux compartiments. Le volume de distribution (Vss) de 0,47 l/kg suggère que la SMPD est essentiellement diffusée dans le compartiment vasculaire et les tissus hautement vascularisés. La demi-vie d'élimination [t1/2(ß)] et la clearance plasmatique (CL) ont des valeurs moyennes respectives de 9,5 h et 0,037 l/kg.h. Quant à l'administration orale, la concentration maximale du produit n'a été atteinte qu'après un délai de 17 h et la biodisponibilité absolue a été de l'ordre de 57 % Enfin, l'étude de la liaison de la SMPD aux protéines plasmatiques du dromadaire a montré que la fixation variait de 47 à 72 % et qu'elle dépendait de la concentration du médicament. La constante de dissociation à l'équilibre (Kd) a été de 196 µg/ml et la capacité maximale de fixation a été de l'ordre de 335 µg/ml.

RésuméLe transporteur de la sérotonine sodium-dépendant est associé à la membrane plasmatique des plaquettes et des terminaisons nerveuses sérotoninergiques et constitue le mécanisme physiologique d’inactivation de la sérotonine. Un déficit en sérotonine est associé à la pathophysiologie de la dépression, et il a été suggéré que des modifications du transporteur de la sérotonine pouvaient exister au moment des épisodes dépressifs. En particulier, le nombre de sites transporteurs pourrait être diminué sur les plaquettes sanguines de patients déprimés, et des résultats comparables ont été obtenus dans certaines régions du cerveau humain post-mortem. Les inhibiteurs tricycliques et nontricycliques de la capture de sérotonine sont des antidépresseurs efficaces. Cependant, il existe une période de latence de 2 à 3 semaines entre le début du traitement et l’effet thérapeutique maximal. C’est pourquoi les études consacrées aux propriétés biochimiques et à la caractérisation moléculaire du transporteur de la sérotonine sont d’un intérêt particulier. La capture de la sérotonine par le transporteur êeut être inhibée sélectivement par le citalopram, la paroxétine, l’indalpine, la fluoxétine et le SL 81 0385. Cet effet se traduit in vitro par une augmentation de la neurotransmission sérotoninergique comme on a pu le montrer pour la paroxétine et le SL 81 0385 sur la libération de sérotonine induite par stimulation électrique dans des coupes de cortex frontal humain. Les dérivés marqués inhibiteurs de la capture tels que l’imipramine-[3H], la paroxétine-[3H] et le citalopram-[3H] ont été utilisés comme ligands spécifiques pour caractériser le transporteur. Dans les expériences de dissociation de la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat, le citalopram, l’indalpine, la fluoxétine, le SL 81 0385, l’imipramine et la sérotonine ont des valeurs de 1½ de dissociation similaires à celle obtenue pour la paroxétine. De plus, le SL 81 0385, la fluoxétine, l’imipramine et la sérotonine induisent une protection contre l’inactivation de la liaison de la paroxétine-[3H] par le N-éthylmaléimide aux membranes de cortex cérébral de rat. Ces résultats suggèrent que le domaine de liaison des inhibiteurs tricyliques et non-tricycliques de la capture de sérotonine correspond à un site d’exclusion mutuelle par rapport au site de reconnaissance du substrat. Le transporteur neuronal de la sérotonine des membranes de cortex cérébral de rat a été solubilisé et purifié par chromatographie d’affinité sur une résine agarose à laquelle un dérivé du citalopram a été fixé par liaison covalente. La liaison de la paroxétine-[3H] à la préparation purifiée est caractérisée par un Kd de 0.71 nM et un Bmax supérieur à 1 962 pmol/mg de protéines. La purification du transporteur se traduit par un accroissement de plus de 3 000 fois de l’activité de la liaison de la paroxétine-[3H] par rapport à celle de la préparation membranaire initiale. Le profil pharmacologique de la liaison de la paroxétine-[3H] à cette préparation purifiée est préservé puisque les valeurs de Ki pour le citalopram, l’imipramine et la sérotonine sont respectivement de 19 nM, 80 nM et 3,5 μM, comparables aux Ki de ces composés sur la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat. La purification du transporteur ainsi obtenue est la première étape qui doit permettre d’analyser les propriétés fonctionnelles du transporteur au niveau moléculaire.

RÉSUMÉLes fibroblastes diploïdes humains subissent un nombre limité de dédoublements de population in vitro et sont largement utilisés comme modèle de vieillissement cellulaire. Malgré l'évidence grandissante que le vieillissement cellulaire est dû à une modification de l'expression du gène, l'activité des facteurs de transcription des cellules âgées est encore mal connue. Ici, nous rapportons que la réduction dramatique de l'expression du facteur de transcription fos durant le vieillissement cellulaire semble due à l'incapacité d'un autre facteur de transcription, le facteur réponse de sérum (FRS), de se lier à son site de reconnaissance appelé élément de réponse du sérum (ERS). Ce site est situé en amont de plusieurs gènes comprenant le gène humain c-fos. À l'opposé, les activités des protéines liées à la boîte TATA de la polymérase ARN ainsi qu'à l'élément réponse AMPc sont conservées chez les fibroblastes humains vieillissants. Nous présentons l'évidence que l'hyperphosphorilation du FRS induit une baisse du pouvoir de liaison observée au cours des dernières divisions cellulaires comme ceci a été précédemment suggéré pour la protéine fos.

La population inuite du Nunavik est exposée aux polluants organiques persistants (POP) par son alimentation traditionnelle. Certains POP (métabolites des BPC, pentachlorophénol et perfluorooctane sulfonate) peuvent interférer avec la liaison de la thyroxine (T4) à la transthyrétine (TTR), une protéine de transport des hormones thyroïdiennes. Pour vérifier s’il y avait perturbation du transport, la T4 liée à la TTR a été mesurée dans le plasma de 120 femmes inuites âgées entre 18 et 39 ans, recrutées lors de l’Étude sur la santé des Inuit 2004 – Qanuippitaa? How are we?. Les niveaux de TTR, TBG (thyroxin-binding globulin) et T4 total sont associés (p < 0,002) aux concentrations de T4 liée à la TTR, alors que les POP ne le sont pas (R-carré ajusté du modèle = 0,27, p < 0,0001). Ces résultats suggèrent des concentrations circulantes de POP trop faibles pour compromettre le transport de la T4 par la TTR.
The Inuit population of Nunavik is exposed to persistent organic pollutants (POPs) through its traditional diet. Some POPs (i.e. hydroxylated metabolites of polychlorinated biphenyls, pentachlorophenol and perfluorooctane sulfonate) compete with thyroxin (T4) for binding sites on transthyretin (TTR), a transport protein of thyroid hormones. We tested the hypothesis that POPs decrease circulating concentrations of T4 bound to TTR (T4-TTR) in Inuit women of reproductive age, who were previously enrolled in the 2004 Inuit health study Qanuippitaa? How are we?. We measured the concentration of T4-TTR in plasma samples obtained from 120 Inuit women (18-39 years old). Linear regression analyses revealed that TTR, TBG and total T4 concentrations were significant predictors (p < 0.002) of T4-TTR levels but not POPs levels (model adjusted R-square = 0.27, p < 0.0001). Our results suggest that circulating levels of POPs in these women are not high enough to affect TTR-mediated thyroid hormone transport.

Après la sélection de différents ensembles de protéines d'intérêt pharmacologique (banque sc-PDB) et l'identification de leur site de liaison, ces ensembles ont été utilisés pour valider et faire des criblages avec un programme d'alignement structural, SiteAlign. SiteAlign utilise une sphère discrétisée et des scores normalisés pour comparer deux sites de liaison. Un protocole de score puis les applications possibles du programme, ont été déterminés. SiteAlign peut être utilisé pour l'annotation fonctionnelle de protéines génomiques, pour la prédiction de réactivités croisées, et la prédiction de cibles pour des ligands (validation expérimentale des calculs). SiteAlign a ensuite été utilisé, dans le cadre de la chémogénomique, pour étudier en 3D les récepteurs couplés aux protéines G et proposer des ligands pour des récepteurs orphelins, ainsi que pour comparer l'espace structural des sites de la sc-PDB
After the selection of different sets of proteins with a pharmacological interest (sc-PDB databank) and the identification of their binding sites, these sets have been used to validate and to do screenings with a structural alignment program, SiteAlign. SiteAlign use a discretized sphere and normalized scores to compare two binding sites. A scoring protocol, then the possible applications of the program have been determined. SiteAlign can be used for functional annotations of genomic proteins, for predictions of cross reactivity and predictions of ligands targets (experimental validation of this calculation). SiteAlign has then been used, in the chemogenomic part of the project, for studying in 3D the G-coupled protein receptors and for suggesting new ligands for orphan receptors. Last, SiteAlign has been used to compare the structural space of sc-PDB sites

Cette thèse de doctorat porte sur le transport du silicium (Si) par les aquaporines animales. Le Si est un élément abondant dans la nature où il joue des rôles im-portants, chez les plantes notamment. Il jouerait également des rôles importants en physiologie animale en contribuant à l’intégrité osseuse, à la santé tégumen-taire et au maintien du collagène. Bien que des transporteurs de Si soient déjà connus chez les diatomées et les plantes, aucun n’a encore été décrit chez l’animal. Toutefois, la compartimentalisation du Si au sein de l’organisme et son assimilation nutritionnelle suppose l’existence de tels transporteurs. En raison de l’homologie qu’elles partagent avec les transporteurs de Si chez les plantes, les aquaporines (AQPs) animales correspondent à des candidats pertinents. Dans ce contexte, les objectifs de la thèse étaient de déterminer si les AQPs sont per-méables au Si et, le cas échéant, de caractériser le rôle physiologique du trans-port en Si par les AQPs et d’identifier des résidus qui permettent à ces canaux d’agir ainsi. Nos travaux ont permis de constater que les AQP3, AQP7, AQP9 et AQP10 humaines, connues sous le nom d’aquaglycéroporines (AQGPs), peuvent toutes agir comme des transporteurs de Si ou plus spécifiquement de l’acide or-thosilicique qui permet à l’atome d’exister sous forme soluble. Le transport obser-vé est de nature michaelienne, sensible à la phlorétine (AQP7 et AQP9) mais in-sensible aux changements de pH et d’osmolalité extracellulaire. Aussi, la distribu-tion tissulaire de ces transporteurs concorde avec celle du Si, et l’expression des AQP3, AQP7 AQP9 dans le petit intestin de la souris est augmentée avec une diète faible en Si. Par ailleurs, nous avons démontré que la région des AQPs connue sous le nom de filtre aromatique/Arginine joue un rôle important dans la sélectivité à l’OSA, et que les résidus L84 chez AQP1 et N208 chez AQP10 jouent un rôle dans la sélectivité à l’eau et au Si respectivement. Ces travaux ont mené à la première description de transporteurs de Si chez l’animal, et à une meilleure compréhension de la physiologie de l’atome chez les mammifères.
Cette thèse de doctorat porte sur le transport du silicium (Si) par les aquaporines animales. Le Si est un élément abondant dans la nature où il joue des rôles im-portants, chez les plantes notamment. Il jouerait également des rôles importants en physiologie animale en contribuant à l’intégrité osseuse, à la santé tégumen-taire et au maintien du collagène. Bien que des transporteurs de Si soient déjà connus chez les diatomées et les plantes, aucun n’a encore été décrit chez l’animal. Toutefois, la compartimentalisation du Si au sein de l’organisme et son assimilation nutritionnelle suppose l’existence de tels transporteurs. En raison de l’homologie qu’elles partagent avec les transporteurs de Si chez les plantes, les aquaporines (AQPs) animales correspondent à des candidats pertinents. Dans ce contexte, les objectifs de la thèse étaient de déterminer si les AQPs sont per-méables au Si et, le cas échéant, de caractériser le rôle physiologique du trans-port en Si par les AQPs et d’identifier des résidus qui permettent à ces canaux d’agir ainsi. Nos travaux ont permis de constater que les AQP3, AQP7, AQP9 et AQP10 humaines, connues sous le nom d’aquaglycéroporines (AQGPs), peuvent toutes agir comme des transporteurs de Si ou plus spécifiquement de l’acide or-thosilicique qui permet à l’atome d’exister sous forme soluble. Le transport obser-vé est de nature michaelienne, sensible à la phlorétine (AQP7 et AQP9) mais in-sensible aux changements de pH et d’osmolalité extracellulaire. Aussi, la distribu-tion tissulaire de ces transporteurs concorde avec celle du Si, et l’expression des AQP3, AQP7 AQP9 dans le petit intestin de la souris est augmentée avec une diète faible en Si. Par ailleurs, nous avons démontré que la région des AQPs connue sous le nom de filtre aromatique/Arginine joue un rôle important dans la sélectivité à l’OSA, et que les résidus L84 chez AQP1 et N208 chez AQP10 jouent un rôle dans la sélectivité à l’eau et au Si respectivement. Ces travaux ont mené à la première description de transporteurs de Si chez l’animal, et à une meilleure compréhension de la physiologie de l’atome chez les mammifères.
The subject of this Ph.D. thesis is the transport of silicon (Si) by animal aqua-porins. Si is an abundant element in nature where it plays important roles, namely in plants. It also appears to play important physiological roles in animal physiolo-gy, by contributing to bone integrity, tegumentary health and collagen mainte-nance. Even though Si transporters have already been identified in diatoms and plants, none have been described in animals thus far. However, compartmentali-zation of Si throughout the mammalian body and nutritional assimilation suggest the existence of such transporters. Given the homology that they share with the Si transporters of plants, the mammalian aquaporins (AQPs) correspond to relevant candidates. In this context, the thesis’ objectives were, to determine whether AQPs are permeable to Si, and if so, to characterize the physiological role of Si transport by the AQP and to identify residues that allow these channels to act as such. Our work has allowed us to observe that human AQP3, AQP7, AQP9 and AQP10, also known as aquaglyceroporins (AQGPs), can all act as transporters for Si or more specifically for orthosilicic acid (OSA) that allow Si to be soluble in this form. The observed transport is michaelian in behavior, sensitive to phloretin (AQP7 and AQP9), but insensitive to changes in pH and extracellular osmolality. Also, tissular distribution of these carriers concords with that of Si, and expression of AQP3, AQP7 and AQP9 in the small intestine of mice is upregulated through a Si-poor diet. Otherwise, we have demonstrated that the region within the AQP that is knows as that aromatic/arginine filter (ar/R) plays an important role in OSA selec-tivity, and that residues L84 in AQP1 and N208 in AQP10 plays an important role in water permeability and Si permeability respectively. These results have led to the first description of Si transporters in animals, and a better understanding of the role played by this atom in mammalian physiology.
The subject of this Ph.D. thesis is the transport of silicon (Si) by animal aqua-porins. Si is an abundant element in nature where it plays important roles, namely in plants. It also appears to play important physiological roles in animal physiolo-gy, by contributing to bone integrity, tegumentary health and collagen mainte-nance. Even though Si transporters have already been identified in diatoms and plants, none have been described in animals thus far. However, compartmentali-zation of Si throughout the mammalian body and nutritional assimilation suggest the existence of such transporters. Given the homology that they share with the Si transporters of plants, the mammalian aquaporins (AQPs) correspond to relevant candidates. In this context, the thesis’ objectives were, to determine whether AQPs are permeable to Si, and if so, to characterize the physiological role of Si transport by the AQP and to identify residues that allow these channels to act as such. Our work has allowed us to observe that human AQP3, AQP7, AQP9 and AQP10, also known as aquaglyceroporins (AQGPs), can all act as transporters for Si or more specifically for orthosilicic acid (OSA) that allow Si to be soluble in this form. The observed transport is michaelian in behavior, sensitive to phloretin (AQP7 and AQP9), but insensitive to changes in pH and extracellular osmolality. Also, tissular distribution of these carriers concords with that of Si, and expression of AQP3, AQP7 and AQP9 in the small intestine of mice is upregulated through a Si-poor diet. Otherwise, we have demonstrated that the region within the AQP that is knows as that aromatic/arginine filter (ar/R) plays an important role in OSA selec-tivity, and that residues L84 in AQP1 and N208 in AQP10 plays an important role in water permeability and Si permeability respectively. These results have led to the first description of Si transporters in animals, and a better understanding of the role played by this atom in mammalian physiology.

La vision est rendue possible grâce à la conversion du signal lumineux en un signal électrique par la cascade de phototransduction visuelle, qui implique plusieurs protéines incluant la phosphodiestérase (PDE). L’inactivation des différentes protéines de la phototransduction est primordiale pour que les photorécepteurs retrouvent leur sensibilité aux changements d’intensité lumineuse. Au cours de ce processus, un complexe de protéines incluant la R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactive la PDE. La R9AP permet l’ancrage d’un complexe protéique à la membrane des disques des photorécepteurs via son segment C-terminal hydrophobe. Des mutations au niveau de la séquence de la R9AP mènent à une maladie appelée bradyopsie qui se caractérise notamment par une photophobie et une difficulté à suivre des objets en mouvement. Cette maladie peut être causée par la perte de la liaison membranaire de la R9AP en raison de mutations menant à une modification de la séquence en acides aminés de son segment C-terminal. La liaison membranaire de la R9AP joue donc un rôle majeur dans l’inactivation de la PDE. Par contre, aucune donnée de liaison membranaire et structurale n’est disponible pour cette protéine. Nous avons donc initié la caractérisation de la structure et de la liaison membranaire de différentes formes de la R9AP, soit la protéine avec et sans son segment C-terminal (∆TM, R9AP∆TM) ainsi que le segment C-terminal seul. Afin d’obtenir la R9AP pure, nous avons cloné, surexprimé et purifié la R9AP∆TM en fusion avec différentes étiquettes de solubilisation/purification. Les protéines recombinantes ont été produites à l’aide d’un système d’expression bactérien. En plus de permettre d’obtenir la R9AP pure pour caractériser sa structure et sa liaison membranaire, ces travaux ont significativement contribué à faire avancer les connaissances à propos de l’utilisation des étiquettes de purification/solubilisation en fusion avec une protéine d’intérêt. En effet, nous avons effectué une étude systématique pour étudier l’impact de la conception des protéines de fusion sur la solubilité, l’expression et la purification de protéine d’intérêt. Il s’agit de la première étude systématique évaluant l’effet du positionnement et de l’identité des différentes étiquettes de purification/solubilisation sur ces paramètres. Également, la production des protéines recombinantes a permis d’identifier un site alternatif d’initiation de la traduction dans la séquence de l’étiquette GST (glutathione S-transférase) qui cause l’expression d’une protéine de fusion tronquée. Cette observation aura certainement un fort impact compte tenu de l’utilisation répandue de l’étiquette GST. Concernant les résultats obtenus avec la R9AP, des données de centrifugation ont montré que la protéine complète est beaucoup moins soluble que la R9AP∆TM, ce qui suggère un rôle important du segment C-terminal hydrophobe dans la solubilité de cette protéine. Ainsi, seulement la structure et la liaison membranaire de la R9AP∆TM ont pu être investiguées dans le cadre de cette thèse. Des mesures par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont montré que la R9AP∆TM ainsi que le peptide C-terminal sont majoritairement constitués d’hélices alpha, ce qui appuie les prédictions structurales de cette protéine et un rôle d’ancrage membranaire de son segment C-terminal. Également, les mesures de liaison membranaire à l’aide des monocouches de Langmuir ont montré que ce segment C-terminal seul possède une forte affinité pour la majorité des phospholipides qui sont représentatifs de la composition lipidique des photorécepteurs. En revanche, la R9AP sans son segment transmembranaire a montré une faible affinité pour la majorité de ces phospholipides. Ainsi, nos travaux suggèrent fortement que la spécificité de liaison membranaire de la R9AP est en majorité dictée par son segment C-terminal, ce qui supporte son rôle important dans l’ancrage du complexe protéique aux membranes des disques des photorécepteurs et dans la bradyopsie.
Visual phototransduction involves many proteins including phosphodiesterase, which leads to photoreceptor hyperpolarization and then signal transmission to the brain. Inactivation of the different proteins involved in this process is essential such that photoreceptors remain sensitive to changes in light intensity. In the course of this inactivation, a protein complex including R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactivates phosphodiesterase (PDE). R9AP anchors a protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments most likely by use of its C-terminal hydrophobic domain. Mutations in the coding sequence of R9AP lead to a visual disease called bradyopsia, which results in problems with adjusting to light variations and difficulties to follow moving objects. This disease can be caused by the loss of the membrane binding of R9AP as a result of mutations that modify the amino acid sequence of its C-terminal domain. Membrane binding of R9AP thus plays a major role in the inactivation process of PDE. However, membrane binding and structural data are still lacking for this particular protein. We have thus initiated the characterization of the structure and membrane binding of R9AP, including the fulllength protein, R9AP without its C-terminal domain (R9AP∆TM), as well as its Cterminal domain alone. In order to get pure R9AP, we have cloned, overexpressed and purified R9AP∆TM in fusion with solubility-enhancing/purification tags. Recombinant proteins were expressed using a bacterial expression system. This study allowed us to develop a procedure to obtain pure R9AP∆TM as well as to significantly improve our understanding of the use of fusion proteins. Indeed, we have performed a systematic analysis of the impact of the design of fusion proteins on their solubility, expression and purification. This study was the first one to evaluate the effect of both the identity and the position of the tags on the solubility, expression and purification of proteins of interest. Also, the production of R9AP∆TM recombinant proteins allowed us to identify an alternative translation initiation site in the coding sequence of the GST (glutathione S-transferase) tag, which results in the expression of a truncated fusion protein. This finding will certainly have an important impact when considering the extensive use of the GST tag. Results have shown that the R9AP∆TM protein is much more soluble than the fulllength protein, which suggests a major role of the C-terminal domain of R9AP for its solubility. Thus, the structure and the membrane binding of R9AP∆TM have been investigated within the scope of this thesis. Infrared spectroscopy as well as circular dichroism measurements have allowed determining that R9AP∆TM as well as the C-terminal domain adopt an alpha-helical structure, which is in good agreement with both the predicted structure of R9AP and the transmembrane role of its C-terminal domain. Also, Langmuir monolayer measurements revealed that the C-terminal segment has a high affinity for most of the phospholipids found in photoreceptor membranes. In contrast, R9AP∆TM has a low affinity for these phospholipids. Thus, our results demonstrate that the membrane binding of R9AP is highly dependent on its C-terminal segment, which is consistent with its important role in anchoring the protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments and in bradyopsia.

Les protéines activatrices de la guanylate cyclase (GCAPs) font partie de la famille des neuroprotéines sensibles au Ca²⁺ (NCS) et celle des protéines à EF-Hand. Il a été proposé que le mécanisme de Ca²⁺-myristoyl switch avait lieu chez toutes les protéines de la famille des NCS. Les travaux présentés dans ce mémoire permettent de déterminer si ce mécanisme est observé chez la GCAP1. En effet, des travaux de liaison membranaire à des monocouches de Langmuir effectués avec la GCAP1 ont permis d’observer ce mécanisme. De plus, l’utilisation d’un analogue du myristoyle, le 13-oxa-myristoyle, a aussi permis d’observer un Ca²⁺-myristoyl switch chez la GCAP1. Effectivement, des mesures en résonance magnétique nucléaire (RMN) ont démontré que la présence de cet analogue favorise l’extrusion du myristoyle. Finalement, différentes analyses par RMN ont été effectuées afin de déterminer si cette méthode pourrait permettre de déterminer la structure de la forme active de la GCAP1.

La régulation de la virulence chez Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche, est sous la dépendance d'un système à deux composants complexe appelé BvgA/S. Ce système est composé d'une protéine senseur membranaire appelée BvgS et d'un régulateur transcriptionnel cytoplasmique, BvgA. En présence d'activateurs de la virulence (non encore définis), BvgS s'autophosphoryle, l'accepteur terminal du phosphate étant BvgA qui est alors actif et va réguler la transcription des gènes impliqués dans la virulence. Par contre, lorsque la bactérie est en présence d'inhibiteurs de la virulence, comme l'acide nicotinique ou le MgSO4, il y a absence d'autophosphorylation de BvgS, BvgA n'est plus activé et les gènes réprimés lors de la virulence sont actifs. Malgré toutes ces informations, nous ne connaissons pas encore les domaines de BvgS impliqués dans la perception des signaux environnementaux activateurs ou inhibiteurs de la virulence. Nous nous sommes donc intéressés à deux domaines de BvgS qui pourraient être impliqués dans ce mécanisme. Le premier domaine est le domaine périplasmique de BvgS homologue à des PBP (Periplasmic Binding Protein). Il pourrait intervenir dans la fixation de ligands activateurs ou inhibiteurs de la virulence. Le deuxième domaine, cytoplasmique, est appelé domaine PAS. Il est très répandu chez les eucaryotes et procaryotes et est impliqué dans l'adaptation du métabolisme de la cellule à des variations de conditions environnementales (comme des variations de potentiel redox, de luminosité ou à la en présence d'oxygène ou de fer. . . ). Ce domaine pourrait intervenir dans la fixation d'inhibiteur ou d'activateur de la virulence. Ce travail permettra donc d'avoir une meilleure compréhension du fonctionnement du complexe BvgAS dans la régulation de la virulence, d'identifier les domaines impliqués dans la perception des signaux positifs ou négatifs de la virulence, et de connaître l'identité de ces différents signaux