Academic literature on the topic 'Protéines – Dénaturation'

<p style="text-align: justify;">La découverte récente de deux polysaccharides, une mannoprotéine de levure et un arabinogalactane- protéine (AGP) de raisin, présents en très faible quantité dans le vin et ayant un effet protecteur contre la dénaturation thermique des protéines, permet d'envisager l'obtention de vins stables sans recourir à l'élimination des protéines par collage à la bentonite. 15 polysaccharides aux compositions et structures variées ont été testés, mais sont pour la plupart sans effet ou bien provoquent une forte augmentation du trouble après passage du vin à la chaleur. Une activité protectrice des protéines a cependant été observée avec un AGP mineur de pomme et une gomme d'<em>Acacia senegal</em>.</p><p style="text-align: justify;">L'utilisation de ces polysaccharides actifs pour la stabilisation protéique des vins blancs passe par une meilleure compréhension de leur mode d'action ainsi que par l'augmentation de leur concentration dans les vins.</p>

Riche en protéines, le pois est une matière première d’origine européenne particulièrement intéressante pour l’alimentation des animaux monogastriques. Dans la graine de pois, la principale fonction des protéines est de servir de réserve d’azote et d’acides aminés. Cette fonction engendre, pour ces protéines, certaines caractéristiques particulières, telles qu’une structure particulièrement compacte, ou une résistance à l’hydrolyse avant la germination. En alimentation animale, les protéines de pois présentent une digestibilité assez variable, généralement inférieure à celle d’aliments témoins (soja). La digestibilité des protéines peut être limitée à plusieurs niveaux : au niveau de l’hydrolyse par les enzymes digestives, au niveau de l’absorption des produits d’hydrolyse et au niveau de la réaction de l’animal à l’aliment, pouvant se traduire par une perte accrue de protéines endogènes. Différents facteurs ont été proposés pour expliquer la limitation de la digestibilité des protéines de pois : présence d’inhibiteurs trypsiques, de lectines, de fibres, structure particulière des protéines, antigénicité de ces protéines. L’application de traitements technologiques peut avoir des conséquences positives (dénaturation de protéines, inactivation d’inhibiteurs, perte de la structure cellulaire...) ou négatives (réticulation, insolubilisation de protéines) sur la digestibilité des protéines.

L’évaluation des propriétés phytothérapeutiques, voire antioxydantes, antimicrobiennes et anti-inflammatoires, demeure une tâche très utile, une piste intéressante à explorer. De ce fait, la médecine actuelle remet de plus en plus à l’honneur les plantes médicinales. Les extraits bruts des plantes et des épices commencent à avoir beaucoup d’intérêt vu leur composition en molécules bioactives. Ce travail est une contribution pour évaluer les propriétés antihémolytiques et anti-inflammatoires des graines de Lepidium sativum L. « cresson alénois », une plante médicinale de la famille des Brassicaceae, largement utilisée en médecine traditionnelle à l’échelle du monde arabe grâce à sa richesse en constituants chimiques. L’extraction hydrométhanolique et aqueuse nous a permis de récupérer deux extraits avec des rendements variables. Le taux le plus élevé était enregistré par macération avec 16,43 %. L’analyse de l’effet anti-inflammatoire in vitro des deux extraits a prouvé une activité de stabilisation des protéines contre la dénaturation thermique avec une efficacité comparable à celle de l’anti-inflammatoire standard diclofénac (IC50 = 0,84 mg/ml). IC50 = 1,26 mg/ml macération et IC50 = 2,17 mg/ml pour l’extrait aqueux. Les résultats de l’activité antihémolytique réalisée in vitro indiquent que l’extrait hydrométhanolique de ces graines possède une capacité importante vis-à-vis l’inhibition de l’hémolyse des érythrocytes de 72,18 % (1 000 μg/ml).

La première partie de cette thèse décrit la dénaturation comparée de plusieurs guanidino kinases (GdnK) de structures quaternaires variées (monomère, dimère ou octamère). Ces enzymes catalysent le transfert réversible du phosphate γ de l’ATP vers un accepteur guanidylique (créatine, arginine). Nous avons montré que, pour les créatine kinases multimériques, l’association des sous-unités est requise pour l’expression de l’activité enzymatique mais que cette association ne leur apporte pas une plus grande stabilité conformationnelle par rapport à une arginine kinase monomérique. Dans la seconde partie, nous décrivons la caractérisation d’une nouvelle guanidino kinase à la structure dupliquée qui est exprimée dans les cercaires de Schistosoma mansoni. Nous avons mis au point un protocole d’expression et de purification pour cette enzyme, identifié ses substrats physiologiques, défini les paramètres enzymatiques pour ces substrats dans le sens de formation du phosphagène, cristallisé cette enzyme et résolu sa structure tridimensionnelle par diffraction des rayons X
The first part of this thesis describes the comparative unfolding of guanidino kinases with differing quaternary structure (monomer, dimer or octamer). These enzymes catalyze the reversible transfer of the ATP γ phosphate to a guanidylic acceptor (creatine, arginine). We have shown, that for dimer or octamer creatine kinases, association of subunits is required for expression of catalytic activity. However, a higher level of quaternary structure does not provide these enzymes an increased conformational stability as compared to a monomeric arginine kinase. In a second part, we describe the characterization of a new guanidino kinase displaying a duplicated structure and which is expressed in Schistosoma mansoni cercariae. We have developed expression and purification protocols for the untagged protein, identified its physiological substrates, defined its enzymatic parameters in the direction of phosphagene formation, crystallized this enzyme and determined its three-dimensional structure by X-ray diffraction

Les modifications post-traductionnelles constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. Le travail présenté décrit le mode de régulation d'un facteur anti-apoptotique, Bag-1 (Bcl-2 AnthanoGene-1). Le contrôle de son niveau d'expression fait intervenir la voie ubiquitine-protéasome. L'enzyme de ligation de l'ubiquitine Siah2 (Seven In Absencia Homolog 2) a par ailleurs été identifiée comme étant potentiellement impliquée dans l'ubiquitination de Bag-1, stimulée par l'induction de l'apoptose. La caractérisation d'autres modulateurs de l'apoptose régulés par la voie ubiquitine-protéasome a été un objectif de notre travail. Un outil moléculaire nouveau a été mis au point et testés dans ce but. Il devrait permettre la purification des cibles d'ubiquitination et leur identification par les techniques de la protéomique.

L'effet de la modification de la surface de la b-galactosidase et sur sa stabilité thermique a été étudié. Deux types de molécules ont été utilisées pour la modification : la dextrane qui a un caractère nettement hydrophile et le polyéthylène glycol qui est un polymère amphiphile. La liaison covalente de la dextrane a été effectué grâce à l'aide du CNBr. Alors que la molécule de PEG a été fixé covalente à l'enzyme en utilisant du metoxypolyéthylène glycol activé avec s-chlorotriazine. Les propriétés de la b-galactosidase ainsi modifiées ont été étudiées. Des variations de la charge et du caractère hydrophobe de la surface consécutives aux modifications ont été observées par chromatographie. Des propriétés des enzymes modifiées par rapport à sa stabilité à été observée grâce à la détermination de d'effet protecteur et de la dénaturation par calorimétrie différentielle à balayage. Nous avons pu montrer que la liaison de la dextrane induit une faible augmentation de l'hydrophilie de la surface de l'enzyme, ainsi qu'une augmentation de sa stabilité thermique en milieu aqueux. La dérivatisation réalisée avec du PEG (bas niveau) donne lieu à un accroissement du caractère hydrophobe de la b-galactosidase. Toutefois une diminution très prononcée de l'activité de la b-galactosidase a pu être observée après ces modifications. La dénaturation de la b-galactosidase a été étudie en présence d'additifs tels comme la dextrane et le polyéthylène glycol, dans sa forme libre à plusieurs concentrations. Dans le deux cas se montre un effet protecteur par rapport à l'enzyme native sans additifs
Two types of molecules were used for the chemical modification of th beta-galactosidase : The dextran that has a hydrophile character and the glycol polyethylene that is an amphiphile polymer. The property of the modified beta-galactosidase were studied. The variations such that the hydrodynamics volume, the charge and the hydrophobe character of the surface ; also variations of catalytic parameters of the enzyme and his thermal stability. Property of modified enzymes in comparison with his stability to been observed thanks to the determination the protective effect and deactivation by differential determination scanning. We were able to show that the liaison of the dextran induces an increase of his thermal stability in aqueous environment. The realized modification with PEG (low level) give place to increase of the hydrophobe character of the beta-galactosidase. Nevertheless a very pronounced decrease of the activity of the beta-galactosidase could be observed after these modifications

Les gliomes malins sont les tumeurs primitives du système nerveux central humain adulte les plus fréquentes. Malgré les récentes avancées thérapeutiques, ces cancers restent incurables. Pour commencer, nous avons établi le profil protéomique des oligodendrogliomes (ODG) de l’adulte présentant la mutation de l’isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1). Nous avons établi une signature des cellules tumorales, parmi une série de 68 protéines dérégulées dans le tissu tumoral. Nous avons ensuite établi un profil moléculaire de 42 protéines spécifiquement dérégulées dans les ODG mutés, en comparaison aux non mutés. Ensuite, nous avons établi les protéomes des cellules souches cancéreuses issues de glioblastomes de l’adulte (CSC), et les avons comparées à celui de cellules souches neurales normales (CSN), et au tissu tumoral d’origine. Parmi les protéines dérégulées dans les CSC, nous avons identifié le facteur Hepatoma-derived growth factor (HDGF) et montré qu’il est spécifiquement sécrété par les CSC, entrainant la prolifération et la migration des cellules endothéliales in vitro, et la formation d’une angiogénèse in vivo. Nous avons également testé le Résveratrol, une molécule naturelle aux propriétés anti-cancéreuses. Nous avons démontré que cette drogue est capable de cibler spécifiquement les CSC en épargnant les CSN, suggérant une application clinique potentielle. Enfin, nous avons pu identifier des cellules souches cancéreuses parmi les gliomes de l’enfant quel que soient le type et le grade de gliome. Nous les avons caractérisées et avons montré une corrélation entre le devenir des patients et le potentiel d’auto-renouvellement, proposé donc comme facteur de mauvais pronostic.

Cette thèse présente l’étude de la transition de dénaturation­ renaturation de la phosphoglycérate kinase (PGK) induite par le chlorure de guanidine. Dans la première partie, la transition conformationnelle a été étudiée à l’équilibre à l’aide de trois signaux: l’activité enzymatique, la fluorescence des tryptophanes et l’ellipcité. A partir de ces données, il a éte clairement constaté que le processus dévie significativement d’un modèle à deux états et qu’il existe des intermédiaires: les courbes de transition obtenues par les différents signaux ne coïncident pas et celle mesurée par dichroïsme circulaire est nettement asymétrique. Dans la seconde partie, les cinétiques de dénaturation et de renaturation ont été suivies par les mêmes signaux. Nous avons pu détecter plusieurs phases cinétiques. Les cinétiques expérimentales ont été comparées aux propriétés cinétiques de plusieurs schémas simulés. Un schéma minimum, tenant compte des diverses observations expérimentale été proposé. Dans la troisième partie, la réversibilité du processus de dénaturation a été étudiée en mesurant la réapparition de l’activité enzymatique. Certaines conditions expérimentales (0,8 M de chlorure de guanidine) permettent de piéger un intermédiaire structuré mal dépourvu de propriétés fonctionnelles. Cet intermédiaire correspond à une partie structurée du domaine C-terminal de la PGK. Ceci a été confirmé dans la dernière partie de la thèse où est présentée l’obtention du domaine C-terminal isolé par protéolyse ménagée. En conclusion, nous proposons un schéma pour la formation de la structure fonctionnelle de la phosphoglycérate kinase.

La creatine kinase est un enzyme essentiel a la repartition de l'energie dans certains tissus comme les muscles squelettique et cardiaque ou le systeme nerveux. Il existe des isoenzymes mitochondriaux et cytosoliques. Ces derniers sont exclusivement dimeriques et formes de deux sous-unites qui peuvent etre de type different (m: muscle, b: systeme nerveux). Ainsi, trois isoformes distinctes de creatine kinase cytosoliques peuvent etre mise en evidence (mm, bb, mb). Les isoenzymes mitochondriaux presentent la caracteristique unique d'exister sous deux formes moleculaires (octamerique ou dimerique) interconvertibles sous l'effet du ph et des substrats de l'enzyme. Les deux types d'isoenzymes differents dans leur comportement et leur localisation ont cependant une similitude de sequence elevee, de l'ordre de 65 a 70%. Neanmoins, leur structure tridimensionnelle n'a pas encore ete resolue, les cristaux obtenus n'etant pas exploitables. Notre etude a ete focalisee sur la forme mm. Nous avons dans un premier temps etudie les caracteristiques structurales de cet enzyme en combinant des techniques biochimiques et biophysiques. Nous avons ensuite entrepris une etude de denaturation et de renaturation. Differents agents (comme l'uree, le chlorure de guanidine, le ph, les fortes concentrations salines) dont le mode d'action est variable ont ete utilises pour caracteriser les interactions qui stabilisent le monomere, le centre actif et la structure globale de l'enzyme. Nous avons aussi recherche la presence d'etats intermediaires stables et plus particulierement, nous avons recherche la presence d'un etat type globule fondu. Enfin, la derniere etape de notre travail a consiste a suivre les modifications induites par le dodecyl sulfate de sodium (sds). La structure des complexes sds-proteine a ete discutee par rapport aux differents modeles existants

"L'oncoprotéine E6 des papillomavirus humains (HPV) à " haut-risque " est à l'origine du cancer du col de l'utérus. Elle participe à l'oncogénèse notamment en dégradant p53, la protéine cellulaire suppresseur de tumeurs. Le but de la thèse était d'obtenir la structure tridimensionnelle par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) de la protéine E6. Le manuscrit revient d'abord sur les différents états (micro- et macroscopique) d'une protéine globulaire en solution, et sur des notions telles que repliement et stabilité. Il rappelle ensuite les principes et limites de différentes techniques biophysiques appliquées à l'étude de protéines. Enfin, il décrit brièvement le contexte biologique de E6. Bien que sa séquence primaire soit connue depuis 1985, la protéine E6 n'avait pas encore été purifiée. Nous décrivons ici un protocole d'expression et de purification de cette molécule, en montrant tout d'abord que l'expression bactérienne de fusions MBP-E6 (Maltose Binding Protein) génère des " corps d'inclusion solubles ". Ces particules, engendrés par l'agrégation de protéines E6 mal repliées, restent toutefois en solution grâce à la haute solubilité de MBP. Grâce à ces observations, nous avons pu produire des échantillons de la protéine E6 entière soluble et repliée, puis de ses deux domaines à zinc. Nous avons finalement obtenu la détermination de la structure tridimensionnelle par RMN du domaine C-terminal de E6. L'amélioration de la qualité de E6 recombinante a permis également de démontrer l'interaction de E6 avec un motif structural d'ADN présent dans l'ADN cruciforme, puis de déterminer les paramètres cinétiques de cette interaction par BIAcore. Ce travail ouvre donc la voie à une meilleure compréhension moléculaire des modes d'actions de E6, et donc à de nouvelles stratégies de thérapie du cancer du col de l'utérus. De plus, nos méthodologies de contrôle et d'optimisation de la qualité des protéines de fusion sont généralisables à l'étude de toute protéine récalcitrante. "
E6 is an oncoprotein produced by "high risk" Human Papillomaviruses (HPVs) involved in cervical cancers. E6 participates oncogenesis through different pathways, in particular by degrading the cellular tumor suppressor protein p53. The aim of this thesis was to solve the solution structure of E6 by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The introduction chapter first focuses on the different states (micro- and macroscopic) adopted by globular proteins in solution, including notions such as folding and stability. Then we record the principles, applications and limits of various biophysical techniques for the study of proteins. Finally, we briefly introduce the biological context of E6 protein. At the start of this work, E6 had never been purified although its sequence was known since 1985. In the results section, we first demonstrate that bacterial expression of E6 fused to the C-terminus of MBP (Maltose Binding Protein) generates " soluble inclusion bodies ". These particles, which originate from agregation of misfolded E6 moieties, remain soluble thanks to the high solubility of MBP moities. These observations have allowed us to produce soluble and folded samples of full-length E6 as well as its two zinc-binding domains. Finally, we have managed to solve the NMR structure of the C-terminal zinc-binding domain. On another hand, the optimized quality of our E6 samples have allowed us to demonstrate E6 binding to a particular DNA structural motif found in four-way DNA junctions. The kinetic parameters of this interaction have been determined by BIAcore. This work will provide a better understanding of the molecular pathways of E6 action and opens the way for new therapeutic strategies against cervical cancers. Furthermore, our methods for control and optimization of protein fusion quality can be generalized for future studies of other recalcitrant proteins