Academic literature on the topic 'Protéines inflammatoires des macrophages'

Les interleukines sont des médiateurs protéiques solubles qui peuvent déclencher une activation cellulaire. D’abord impliquée dans l’activation des cellules T dans la production d’immunoglobulines par les cellules B, l’interleukine 6 (IL6) provoque aussi l’induction de protéines de la phase aiguë par les hépatocytes. Ainsi, l’IL6 est impliquée dans les processus inflammatoires qui sont en grande partie responsables de la pathogénie de la cowdriose. Originellement produit par des macrophages et des cellules endothéliales activées, l’IL6 agit comme un stimulant de la réponse immunitaire. Néanmoins, quand elle est produite constamment et en grandes quantités, l’IL6 provoque des réactions inflammatoires non contrôlées. Afin de tester si l’IL6 est impliquée dans la cowdriose, une culture primaire de cellules endothéliales de cerveau bovin (BBEC) a été infectée in vitro par C. ruminantium. Les cellules infectées ont été récoltées tous les jours et ce jusqu’au sixième jour où toutes les cellules sont lysées. La même expérience a été effectuée sur des BBEC qui ont été simultanément infectées et traitées avec de l’INFγ. De l’ARN a été purifié à partir de ces cellules et après électrophorèse sur gel d’agarose transféré sur un filtre de nylon. Ce filtre a été sondé avec un ADNc radiomarqué codant pour l’IL6 bovine. Des signaux à 1 kb ont été détectés seulement sur les ARN de cellules après le quatrième jour de l’infection, que celles-ci aient été traitées ou non par l’INFγ. Tous les autres échantillons, incluant l’ARN de cellules qui n’ont pas été infectées mais traitées à l’INFγ, se sont révélés négatifs pour l’expression d’IL6. Ainsi, après infection par C. ruminantium, l’expression d’IL6 est induite peu avant que l’effet cytopathogène n’apparaisse. A l’heure actuelle, des surnageants de milieu de culture de ces cellules sont testés pour leur capacité à induire des réponses prolifératives des cellules T.

Les modifications métaboliques associées aux états inflammatoires et infectieux sont susceptibles de modifier les besoins nutritionnels des animaux notamment en protéines et en acides aminés. L’organisme réoriente le flux des acides aminés vers les tissus impliqués dans la réaction inflammatoire ou la réponse immunitaire au détriment des tissus assurant la croissance. Ces acides aminés sont utilisés pour la synthèse des protéines de l’inflammation et de l’immunité dont le profil est différent de celui des protéines participant à la croissance, engendrant alors des besoins spécifiques en acides aminés. Par exemple, le besoin en acides aminés soufrés, notamment en cystéine, est fortement augmenté chez les animaux en situation de sepsis (nom donné aux états inflammatoires généralisés). La cystéine est utilisée dans la synthèse de glutathion dont la production est fortement augmentée lors des états inflammatoires. Chez le porc, on dispose encore de très peu de données expérimentales permettant d’établir les besoins spécifiques en acides aminés. La lysine n’est probablement pas un acide aminé limitant pour la réaction immunitaire alors que les concentrations sériques d’immunoglobulines sont influencés par la teneur en thréonine de l’aliment. La couverture de ces besoins spécifiques permettrait de limiter la chute des performances de croissance observées chez des animaux dont le système immunitaire est activé.

Les examens de laboratoire jouent un rôle important dans le diagnostic et le suivi des maladies rhumatologiques inflammatoires. A côté des paramètres inflammatoires humoraux classiques (la vitesse de sédimentation, la protéine C réactive, l'électrophorèse des protéines), l'hématologie, la chimie clinique, la sérologie infectieuse et l'analyse du liquide synovial, ce travail se concentre sur le diagnostic par dosage affiné d'auto-anticorps et sur les méthodes modernes de biologie moléculaire (la technique par PCR).

L’œuf se compose d’une grande diversité de nutriments et de molécules actives «programmés» pour permettre le développement autonome d’un embryon dans un milieu confiné. Ces molécules d’intérêt sont réparties de manière équilibrée entre les différents compartiments de l’œuf (coquille, blanc, jaune, membranes) qui assurent chacun une fonction bien déterminée. Outre les éléments nutritifs essentiels à l’embryogenèse, on y trouve de multiples molécules participant au développement et à la protection de l’embryon qu’elle soit physique (coquille, membranes) ou chimique (molécules antibactériennes, antivirales, antioxydantes). Pour l’homme, l’œuf constitue un aliment de haute valeur nutritionnelle mais de plus en plus, il apparaît comme riche de nombreuses molécules actives d’intérêt majeur pour différents secteurs industriels tels que l’agroalimentaire, les biotechnologies, la cosmétique ou la santé humaine et animale. Les propriétés antibactériennes des protéines du blanc d’œuf sont connues depuis longtemps, mais il émerge depuis plusieurs années des activités particulièrement prometteuses en médecine humaine telles que des propriétés anti-adhésives, immuno-modulatrices, anti-hypertensives, anti-cancéreuses, anti-inflammatoires ou cryoprotectrices. Certaines de ces activités ne sont pas portées par les protéines natives mais par des peptides dérivés, générés in vitro par protéolyse ménagée des protéines de l’œuf. Ces peptides et protéines bioactifs présentent un intérêt grandissant depuis quelques années et de nombreux efforts sont actuellement menés pour tenter de mieux caractériser leurs applications potentielles.

RÉSUMÉLe vieillissement s’allie à une augmentation d’inflammation intestinale et le risque élevé de maladies chroniques, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin et le cancer du côlon; nombreuses études épidémiologiques indiquent que l’exercice régulier réduit les risques. Cette étude a examiné les effets à long terme de l’exercice volontaire sur les médiateurs inflammatoires dans les intestins des souris âgées et en bonne santé C57BL/6 (âgées de 15–16 mois). On a désigné les animaux soit à quatre mois de roue d’exercice à souris (RES ; n – 20), soit à une groupe de contrôle « sédentaire » (NRL ; n = 20). Les lymphocytes intestinaux ont été récoltés et analysés pour la présence de (1) pro-inflammatoire (TNF-a, IL-1β) et de cytokines pléotropes (IL-6), et (2) de pro-(caspase-3/-7) et d’anti-(Bcl-2) protéines apoptotiques. L’efficacité d’exercise a été confirmée par l’activité des enzymes dans les muscles squelettiques ; l’évidence de stress a été confirmée par un plasma 8-iso-PGF2α et la corticostérone. Les RES souris ont réalisés une incidence inférieure de TNF-α, de la caspase-7, et de 8-isoprostanes (p < .05) par rapport aux contrôles sédentaires, ce qui suggère que l’exercice à long terme peut « protéger » l’intestin en réduisant la manifestation de cytokines inflammatoires et du protéine apoptotique.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie multifactorielle hautement héréditaire qui survient chez le sujet âgé et est causée par une combinaison de facteurs de risques génétiques et environnementaux. Les formes atrophiques de la maladie constituent aujourd’hui une impasse thérapeutique. La physiopathologie de la DMLA est invariablement associée à une accumulation dans l’espace sous-rétinien, de phagocytes mononucléés (PM), une famille de cellules qui inclue des macrophages résidents et inflammatoires. Nous aborderons dans cette revue l’ensemble des mécanismes de cette inflammation spécifique, de l’origine des PM aux conséquences de leur accumulation dans l’espace sous-rétinien. Finalement, nous discuterons de l’impact des facteurs de risques génétiques et environnementaux établis de la DMLA sur le passage d’une inflammation bénéfique aux stades précoces de la maladie à une inflammation délétère aux stades avancés.

L'activation du système du complément joue un rôle primordial dans la réaction inflammatoire. Les macrophages constituent une source locale en protéines du complément. Une perturbation dans la biosynthèse locale des protéines de ce système pourrait être à l'origine du développement incontrôlé d'une réaction inflammatoire locale et pourrait contribuer à la formation de lésions tissulaires locales observées au cours de diverses maladies inflammatoires. Les glucocorticoïdes sont de puissants anti-inflammatoires qui constituent un outil thérapeutique essentiel en immunopathologie. Nous avons voulu savoir si les glucocorticoïdes pouvaient influencer la biosynthèse des protéines de la voie alterne du système du complément par les cellules de la lignée monocyte/macrophage. Nos résultats montrent que la déxamethasone, un glucocorticoïde de synthèse, diminue la synthèse de deux protéines jouant un rôle positif dans l'activation du complément, C3 et le facteur B, alors qu'elle augmente, seule ou en association avec l'interféron-gamma, celle du facteur H, une protéine qui limite l'activation du système. Globalement, ces résultats indiquent que les glucocorticoïdes peuvent diminuer l'activation du complément en régulant de façon différentielle la synthèse des différentes protéines du système. Des résultats analogues ayant été décrits avec la cellule endothéliale et le fibroplaste, nous concluons que l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes pourrait résulter en partie d'un contrôle local de l'activation du complément.

Au cours des dernières décennies, les modifications comportementales ont conduit à une forte augmentation de la prévalence des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. L’hyperglycémie chronique associée à ces maladies a des effets délétères sur de nombreux tissus, entraînant de graves complications (glucotoxicité). Parmi les différents mécanismes impliqués dans les effets toxiques du glucose, la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines joue un rôle très important. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible qui régule l'activité des protéines cytosoliques et nucléaires en fonction de la disponibilité en glucose. Deux enzymes seulement, l’O-GlcNAc transférase (OGT) et l’O-GlcNAcase (OGA), ajoutent ou retirent le groupement GlcNAc sur les protéines, respectivement. Cette modification dépend étroitement de la disponibilité en glucose et de son flux à travers la voie de biosynthèse des hexosamines (HBP). Les maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité se caractérisent par ailleurs par une inflammation chronique à bas bruit, qui participe également aux complications observées dans ces pathologies. Les perturbations métaboliques associées à ces maladies (augmentation des acides gras libres et du glucose) favorisent les processus pro-inflammatoires dans le macrophage. Cependant, les relations entre processus inflammatoires et O-GlcNAcylation des protéines restent peu explorées. Le but de ce travail était d’évaluer l’implication de la voie de O-GlcNAcylation dans le macrophage. Les études ont été réalisées en utilisant la lignée de macrophages murins RAW264.7 ou des macrophages, différenciés à partir de moelle osseuse de souris, des macrophages péritonéaux de souris ou des macrophages différenciés à partir à de monocytes humains. La O-GlcNAcylation des protéines a été mesurée dans les macrophages RAW264.7 à l’aide d’un biosenseur BRET adressé dans différents compartiments cellulaires. Nous avons observé que l'activation du Toll-like receptor (TLR) 4 par le LPS (lipopolysaccharide) augmente le signal de BRET à la membrane plasmique, dans le cytosol et le noyau des cellules RAW264.7. Une augmentation de la O-GlcNAcylation induite par le LPS était également observée par western blotting dans les cellules RAW264.7 et dans les macrophages primaires de souris et humains. Cette augmentation de O-GlcNAcylation était en particulier détectée sur la sous-unité p65 du facteur de transcription NFκB, suggérant un rôle de cette modification dans les effets pro-inflammatoires du LPS. En accord avec cette notion, l’inhibition de l’OGA, (responsable de la dé-GlcNAcylation des protéines) à l’aide d’un inhibiteur spécifique (Thiamet G), potentialise les effets du LPS sur l’expression des ARNm de la cytokine pro-inflammatoire IL1β. Nous avons en outre généré un modèle de souris OGT-KO inductible au tamoxifène. L’invalidation de l’OGT dans les macrophages primaires de ces souris réduit l’effet du LPS sur l’expression des ARNm de l’IL1β d’un facteur 2, suggérant que l’induction de la O-GlcNAcylation est au moins en partie impliquée dans la transmission des effets pro-inflammatoires du LPS. Afin d’élucider les mécanismes responsables de l’augmentation de O-GlcNAcylation induite par le LPS, nous avons étudié, dans les cellules RAW264.7, l’effet du LPS sur les enzymes impliquées dans la voie O-GlcNAc. Nous avons observé que le traitement au LPS n’a pas d’effet sur l’expression (ARNm et protéine) et sur les activités enzymatiques de l’OGT et de l’OGA. En revanche, le LPS induit une forte augmentation de l’expression (ARNm et protéine) de la glutamine : fructose-6-phosphate amidotransférase (GFAT), enzyme limitante de la voie HBP. (...)
In the last decades, changes in lifestyle have led to a dramatic increased prevalence of pathologies such as obesity and type 2 diabetes. Chronic hyperglycaemia associated with these diseases has deleterious effects on many tissues, resulting in serious complications (glucotoxicity). Among the different mechanisms involved in the toxic effects of glucose, O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAc) of proteins plays an important role. O-GlcNAcylation is a reversible post-translational modification that regulates the activities of cytosolic and nuclear proteins. Only two enzymes, O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA), control the level of O-linked N-acetyl glucosamine (O- GlcNAc) on proteins. OGT is the enzyme that O-GlcNAcylates proteins, whereas OGA removes O-GlcNAc from proteins. This post-translational modification tightly depends on glucose availability and its flux through the hexosamines biosynthesis pathway (HBP). Metabolic diseases such as diabetes and obesity are also characterized by chronic low level inflammation, which contributes to the complications observed in these pathologies. The metabolic disturbances associated with these diseases (increased free fatty acids and glucose) promote pro-inflammatory processes in the macrophage. However, the relationships between inflammatory processes and O-GlcNAcylation of proteins remain poorly explored. The aim of this work was to evaluate the involvement of the O-GlcNAcylation pathway in the macrophage. The studies were carried out using the RAW264.7 mouse macrophage cell line or primary macrophages differentiated from mouse bone marrow (BMDM), peritoneal mouse macrophages, or human monocytes derived macrophages (hMDM). O-GlcNAcylation of proteins was measured in RAW264.7 macrophages using a BRET biosensor targeted to different cell compartments. We have observed that activation of Toll-like receptor (TLR) 4 by LPS (lipopolysaccharide) increases the BRET signal at the plasma membrane, in the cytosol, and nucleus of RAW264.7 cells. An increase in LPS-induced O-GlcNAcylation was also observed by western blotting in RAW264.7 cells and primary mouse and human macrophages. This increase in O-GlcNAcylation was in particular detected on the p65 subunit of the NFκB transcription factor, suggesting a role for this modification in the pro-inflammatory effects of LPS. In agreement with this notion, inhibition of OGA, (responsible for de-GlcNAcylation of proteins) using a specific inhibitor (Thiamet G) potentiates the effects of LPS on mRNA expression of the pro-inflammatory cytokine IL1β. In addition, we generated a tamoxifen-inducible OTG-KO mouse model. Invalidation of OGT in primary macrophages of these mice reduces the effect of LPS on the expression of IL1β mRNAs by a factor of 2, suggesting that the induction of O-GlcNAcylation is at least in part involved in the transmission of the pro-inflammatory effects of LPS. In order to elucidate the mechanisms responsible for LPS-induced increase in O-GlcNAcylation, we studied the effect of LPS on the enzymes involved in the O-GlcNAc pathway in RAW264.7 cells. We observed that LPS treatment had no effect on the expression (mRNA and protein) and on the enzymatic activities of OGT and OGA. On the other hand, LPS induced a strong increase in the expression (mRNA and protein) of glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), the rate limiting enzyme of the HBP pathway. Inhibition of GFAT with 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) inhibited LPS-induced increase in O-GlcNAcylation and LPS effect on the expression of IL1β mRNA, but not NOS2 expression, confirming a partial dependence of the pro-inflammatory effects of LPS on the O-GlcNAc pathway. In conclusion, our results indicate that activation of the O-GlcNAcylation pathway could be considered as an integral part of the signal induced by TLR4, and suggest that this pathway is involved in some of the pro-inflammatory effects of LPS in the macrophage

Le rôle des macrophages dans le développement des gliomes, des tumeurs attaquant le système nerveux central, est controversé. Nous avons étudié le développement des gliomes chez des souris transgéniques permettant la déplétion spécifique des macrophages par l’administration d’un pro-médicament. Nos résultats indiquent qu’une réduction de la densité de macrophages augmente la croissance tumorale. Selon le modèle, leur activité est apparue dépendante ou non du recrutement des lymphocytes T. Nous avons ensuite émis l’hypothèse que les anti-inflammatoires pourraient favoriser le développement des gliomes. Au contraire, nous avons observé que l’administration de dexaméthasone à des souris implantées avec des cellules gliomales diminuait la progression des tumeurs. Nous avons établi que cet agent affectait le profil d’expression génique des cellules endothéliales en diminuant notamment l’expression de l’angiopoiétine-2, un facteur pro-angiogénique. L’utilisation d’un anticorps synthétique inhibant l’Angpt2 est apparue plus efficace que la dexaméthasone pour réduire la croissance des gliomes. Les inhibiteurs de l’Angpt-2 pourraient donc représenter des outils intéressants pour le traitement des gliomes.

Le locus CDKN2A/B contient le gène codant le suppresseur de tumeur p16INK4a. Des études d’association de gènes ont identifiées que le locus CDN2A/B est associé à un risque de développement de maladies inflammatoires, dans lesquelles les macrophages jouent un rôle important. Les macrophages constituent une population cellulaire hétérogène dont la forme d’activation et les fonctions sont déterminées par les signaux environnants. Les cytokines Th1, tel que l’interféron gamma, et les antigènes bactériens, tel que le lipopolysaccharide, induisent une activation classique ou M1 des macrophages alors que les cytokines Th2, telles que les interleukines 4 et 13, induisent une activation alternative ou M2 des macrophages. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans l’acquisition de ces phénotypes sont encore mal connus. Cette étude montre que l’absence d’expression de p16INK4a (p16-/-) inhibe la réponse inflammatoire et favorise l’activation alternative des macrophages primaires murins in vitro. Afin de déterminer la relevance de ces observations in vivo, la fonction de p16INK4a dans les macrophages a été étudiée chez la souris lors d’une infection parasitaire, dans laquelle le rôle des macrophages alternatifs est connu, puis au cours du développement de l’athérosclérose dans lequel le rôle des macrophages alternatifs reste à déterminer, en utilisant la transplantation de moelle osseuse. Les souris transplantées avec de la moelle osseuse p16-/- présentent une induction de l’expression génique des marqueurs de macrophages alternatifs dans le foie après infection parasitaire, démontrant que p16INK4a influence l’activation des macrophages in vivo. Cependant, l’absence de p16INK4a dans les cellules hématopoïétiques n’influence pas le développement de l’athérosclérose dans nos conditions expérimentales. Enfin, l’invalidation de l’expression de p16INK4a par ARN interférence dans les macrophages primaires humains et la mesure d’expression de p16INK4a dans les macrophages isolés du tissu adipeux de patient obèses montrent que l’absence de p16INK4a favorise un phénotype alternatif des macrophages proche de celui des macrophages du tissu adipeux. Ces travaux de recherche identifient p16INK4a comme modulateur de l’activation des macrophages murins et humains. Mots clés : CDKI-activation alternative-inflammation-infection parasitaire-athérosclérose-obésité
The CDKN2A/B locus, which contains the tumor suppressor gene p16INK4a, is associated with an increased risk of age-related inflammatory diseases, such as cardiovascular disease and type 2 diabetes, in which macrophages play a crucial role. Activation state and functions of macrophages are profoundly affected by environmental cytokines and microbial products. Indeed, Th1 cytokines, such as interferon gamma, and lipopolysaccharide induce a classical activation phenotype whereas Th2 cytokines, such as inteleukins 4 and 13, induce an alternative activation phenotype. However, the molecular mechanisms underlying the acquisition of these phenotypes are not well defined. In this study, we show that p16INK4a-deficiency (p16-/-) skews murine macrophages towards an alternative activation in vitro. The influence of p16INK4a-deficiency on macrophage activation in vivo was investigated using bone marrow transplantation, first in a parasite infectious model in which the role of alternatively activated macrophages is well characterized, then during atherosclerosis development, in which the role of alternatively activated macrophages is undefined. While mice transplanted with p16-/- bone marrow displayed higher hepatic marker expression levels of alternative activation upon parasite infection, no effect was observed on atherosclerosis development in our experimental conditions. Finally, confirming the data obtained in p16-/- macrophages, silencing of p16INK4a with siRNA in human blood-monocyte-derived macrophages also resulted in the induction of alternative activation. In addition, analysis of human adipose tissue macrophages from obese patients, which are typically alternatively activated, showed that p16ink4a expression levels were lower in ATM than in monocyte-derived macrophages of the same subjects. These findings identify a novel role for the tumor suppressor p16INK4a as modulator of murine and human macrophage activation. Keywords: CDKI-alternative activation-inflammation-parasite infectious-atherosclerosis-obesity

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune qui touche 0,5 à 1% de la population adulte mondiale. Bien que des facteurs génétiques et environnementaux de susceptibilité soient identifiés, son étiologie reste inconnue. Sur le plan clinique, elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales menant à une destruction ostéo-cartilagineuse. Sur le plan biologique, elle est marquée par la présence d'auto-anticorps chez la majorité des patients. Parmi ceux-ci, les auto-anticorps anti-protéines citrullinées (ACPA) et le facteur rhumatoïde (FR) sont détectés chez environ 80% des patients et associés aux formes les plus actives et les plus sévères de la maladie. Outre leur intérêt diagnostique et, à un moindre degré, pronostique, les ACPA et le FR sont synthétisés dans le tissu synovial où leurs cibles respectives, la fibrine citrullinée principalement et les IgG (fragments Fc), sont également abondantes. Au sein des articulations, ces auto-anticorps sont donc susceptibles de former des complexes immuns avec leurs antigènes-cibles articulaires, d'activer des voies effectrices mettant en jeu des récepteurs aux fragments Fc des immunoglobulines (FcR) et/ou l'activation du complément, et de participer ainsi à la promotion de l'inflammation articulaire. Notre laboratoire s'est précédemment intéressé au rôle des ACPA dans l'inflammation du tissu synovial rhumatoïde. Un modèle cellulaire entièrement humain a été développé dans le but de mimer l'interaction entre macrophages et complexes immuns issus de la fixation d'ACPA à la fibrine citrullinée, présente sous forme de dépôts dans le tissu synovial rhumatoïde. Ce modèle utilise des macrophages différenciés à partir de monocytes d'individus sains stimulés par des complexes immuns reconstitués par immunocapture sélective d'IgG ACPA de patients atteints de PR par du fibrinogène citrulliné immobilisé (CI-ACPA). Il a permis d'établir la capacité de ces complexes immuns à induire une sécrétion macrophagique de TNF-α via la fixation à des récepteurs aux fragments Fc des IgG (FcγR) activateurs, parmi lesquels le récepteur FcγRIIa joue un rôle prépondérant. Le TNF-α étant une cytokine-clé de la synovite rhumatoïde, ces résultats ont renforcé l'hypothèse selon laquelle les ACPA seraient un inducteur majeur de sa sécrétion. Nous avons poursuivi l'étude de l'implication des auto-anticorps dans la physiopathologie de la PR, en étudiant l'influence du FR sur l'effet pro inflammatoire des ACPA dans le même modèle in vitro. Nous avons tout d'abord évalué l'influence de deux FR de classe IgM (FR IgM) monoclonaux purifiés à partir de sérums de patients atteints de cryoglobulinémie de type II. Nous avons observé que l'incorporation de chacun de ces FR aux CI-ACPA amplifiait fortement la sécrétion macrophagique de TNF-α. Plus globalement, ceci s'accompagnait d'un déséquilibre de la réponse cytokinique des macrophages en faveur de l'inflammation : la sécrétion d'autres cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1β, l'IL-6 ou l'IL-8 et le rapport de sécrétion TNF α:IL-10 étaient augmentés, alors que le rapport IL1-Ra:IL-1β était diminué. En outre, le mélange de cytokines sécrétées par les macrophages a induit une sécrétion accrue d'IL-6 par des fibroblastes synoviaux provenant de patients atteints de PR. De plus, nous avons confirmé que les CI-ACPA n'induisaient pas la sécrétion de TNF α par les monocytes circulants dont étaient dérivés les macrophages et nous avons montré que l'incorporation de FR IgM dans les complexes immuns ne permettait pas non plus de l'induire. Par ailleurs, nous avons établi qu'à lui seul, le FR IgM ne provoquait pas de sécrétion de TNF α par les macrophages. L'amplification de la réponse cytokinique aux CI-ACPA qu'induit le FR IgM provient très probablement d'une augmentation de la signalisation activatrice en aval de FcγR, puisqu'elle est dépendante du recrutement d'un nombre accru d'IgG dans les complexes immuns, captées par l'IgM multivalente. Enfin, nous avons observé l'activation de la cascade du complément par les CI-ACPA, et la majoration de ce phénomène en présence de FR IgM. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'influence de « l'authentique » FR IgM, c'est-à-dire celui présent chez les patients atteints de PR, et posé la question de l'influence du FR de classe IgA (FR IgA) de la même provenance. Nous avons purifié ces deux classes de FR par différentes étapes de chromatographie d'affinité, à partir de plusieurs mélanges de sérums de patients atteints de PR. Avec chacune des deux classes de FR, nous avons montré que leur incorporation aux CI-ACPA induisait systématiquement l'amplification de la réponse TNF-α macrophagique et que la réponse cytokinique était globalement déséquilibrée en faveur de l'inflammation. Poursuivant l'étude des mécanismes de l'amplification de la réponse cytokinique par le FR IgM, nous avons définitivement écarté l'hypothèse d'une signalisation en aval d’un récepteur aux IgM. En effet, aucun des récepteurs aux IgM leucocytaires déjà décrits, c'est à dire ni le récepteur FcµR, ni le récepteur Fcα/µR, n'était exprimé à la surface des macrophages de notre modèle. En outre, la stimulation des macrophages par des IgM ou leur portion Fc ni n'a induit la sécrétion de TNF-α, ni n'a modulé celle induite par des complexes immuns contenant des IgG. Par contre, nous avons confirmé que le récepteur FcαRI aux IgA était exprimé à la surface des macrophages et, par blocage sélectif de la fixation des FR IgA à ce récepteur, nous avons montré sa participation dans l'activation des macrophages par les CI-ACPA ayant incorporé le FR IgA. Enfin, nous avons observé que l'amplification de la réponse TNF-α par les FR IgM et IgA augmentait drastiquement en présence de LPS. Ceci montre une possible coopération des voies des FcR et du TLR4 dans la synovite, en cas de présence simultanée de complexes immuns et de ligands de TLR4. Une telle coopération est probable puisque divers ligands endogènes potentiels de TLR4 ont été décrits au sein du tissu synovial rhumatoïde. Au total, FR IgM et FR IgA apparaissent comme des amplificateurs majeurs de la réaction inflammatoire induite par les ACPA au sein du tissu synovial rhumatoïde. Nous avons précisé leur mode d'action qui correspond à l'interaction des CI-ACPA avec les macrophages via leurs FcR mais aussi, très probablement, au moins pour le FR IgM, via les récepteurs du complément. Ces résultats apportent un éclairage inédit sur le rôle, suspecté mais jamais démontré du FR IgM mais aussi du FR IgA, dans la physiopathogénie de la PR. La pertinence de stratégies thérapeutiques qui viseraient à contrecarrer l'activation des mécanismes effecteurs pro-inflammatoires induits par les CI contenant ACPA et FR, ou à inhiber la production de ces auto-anticorps, est ainsi fortement renforcée
Rheumatoid Arthritis (RA) is the most frequent human auto-immune disease affecting 0. 5 to 1% of the population worldwide. The exact cause of RA is unknown, but joint inflammation is thought to be the result of an uncontrolled autoimmune response arising from a combination of environmental and genetic factors. Among autoantibodies found in RA patients, autoantibodies to citrullinated proteins (ACPA) and rheumatoid factors (RF) are present in the serum of about 80% of patients and are frequently associated with active and severe forms of RA. In addition to their diagnostic and prognostic interest, ACPA and RF are synthesized by plasma cells of the rheumatoid synovial membrane at the very place where their respective target, citrullinated fibrin and Fc fragment of IgG are also present and abundant. In the joints, these autoantibodies are likely to form immune complexes with their articular antigenic targets able to trigger inflammatory effector responses depending on Fc receptors to immunoglobulins and/or complement activation, thus to promote joint inflammation. During the last few years, our laboratory dedicated itself to the understanding of the role of ACPA in RA synovial tissue inflammation. A totally human in vitro model was developed in order to mimic the interactions between synovial macrophages and immune complexes formed by ACPA and citrullinated fibrin, their major target in the synovial tissue. In this model, ACPA immune complexes (ACPA-IC) are generated by selective immunocapture of IgG ACPA from the serum of RA patients by in vitro citrullinated human fibrinogen immobilized onto culture wells into which macrophages, differentiated from CD14-positive monocytes of healthy human donors, are then seeded. This model allowed demonstrating the ability of ACPA-IC to induce TNF-α secretion by macrophages through signalling downstream of activating Fc receptors to IgG (FcγR), predominantly the FcγRIIa receptor. Considering that TNF-α is a key pro-inflammatory cytokine in the disease, these results strengthened the hypothesis that ACPA have an inflammatory potential and a major role in RA. To further study the involvement of autoantibodies in the pathophysiology of RA we undertook to assess the influence of RF on the pro-inflammatory role of ACPA in the in vitro model. We first evaluated the influence of two monoclonal RF IgM paraproteins from patients with type II cryoglobulinemia. Each RF IgM strongly amplified the macrophage TNF-α secretion induced by ACPA-IC. Overall, incorporation into ACPA-IC of RF IgM shifted the macrophage secretion of cytokines toward an even more pronounced proinflammatory profile as it increased the TNF-α:IL 10 ratio and the IL 6 and IL-8 secretions and decreased the IL 1Ra:IL 1β ratio. Moreover, the secreted cytokine cocktail exhibited an enhanced capacity to prompt IL-6 secretion by RA synovial fibroblasts. Then, we confirmed that ACPA-IC did not induce TNF-α secretion by monocytes and showed that they remained unresponsive even after incorporation of RF IgM. Besides, we showed that RF IgM alone did not induce TNF-α macrophage secretion. The amplification of the macrophage cytokine responses probably arises from an increase in the activating signals downstream of FcγRs due to an RF IgM-mediated recruitment of more IgG into ACPA-IC. Finally, in vitro complement activation by immobilized ACPA-IC markedly increased when their formation occurred in the presence of RF IgM. Secondly, we evaluated the influence of the RF IgM and RF IgA found in RA patients. These were purified from RA serum pools by serial affinity chromatographies. Incorporation of each class of RF systematically amplified the macrophage cytokine secretion and skewed it in favour of proinflammatory cytokines. Further exploration of the mechanism of the RF IgM-mediated amplification allowed ruling out the involvement of any signalling downstream of an IgM receptor. Indeed, neither FcµR nor Fcα/µR, the only recognized leucocyte IgM receptors, was expressed by the macrophages of our model. Moreover, macrophages did not secrete any TNF α in response to IgM or IgM Fc portions and their TNF α response to IgG-containing immune complexes was not modulated by the simultaneous presence of IgM or Fc5µ fragments. However, we confirmed that the receptor FcαRI for IgA Fc was expressed and that it participates in the activating signalling cascade induced by ACPA-IC formed in the presence of RF IgA IC since selective blockade of the binding of RF IgA to this receptor inhibited the TNF-α response to these immune complexes. Finally, LPS substantially enhanced induction of macrophage TNF-α by ACPA-IC containing RF IgM or RF IgA. Considering that numerous endogenous TLR4 ligands have been described in the RA synovial tissue, this indicates that simultaneous FcR engagement by RA-associated IC and ligation of TLR4 by such endogenous ligands likely cooperate in promoting synovial tissue inflammation. Therefore, RF IgM and RF IgA appear as major enhancers of the inflammatory reaction induced by ACPA in the RA synovial tissue. We show that this is most probably mediated by FcR triggering but also, concerning RF IgM, by activation of the complement cascade. Our studies shed new light on the largely accepted but poorly mechanistically documented role of RF IgM and RF IgA in RA pathophysiology. They also emphasize the relevance of therapeutic strategies aiming at downregulating the proinflammatory effectors mechanisms triggered by immunes complexes containing ACPA and RF or seeking inhibition of the production of theses autoantibodies

Au cours de ma thèse, j'ai étudié la fonction cytotoxique des cellules dendritiques (DC) de patients cancéreux comparée à celle de sujets sains. Nous avons montré que les DC générées à partir des monocytes du sang périphérique peuvent acquérir des capacités cytotoxiques importantes après activation par des faibles doses de LPS. Le potentiel cytotoxique des DC générées à partir de patients cancéreux est comparable à celui de sujets sains. Nous avons identifié le mécanisme de cytotoxicité qui fait intervenir la production de peroxynitrite. Après avoir tué les cellules tumorales, les DC phagocytent des fragments tumoraux, surexpriment des molécules de costimulation et induisent la prolifération des lymphocytes. Un deuxième axe de recherche au cours de ma thèse a consisté en l'étude des macrophages inflammatoires et de leur implication dans l'athérosclérose. Les macrophages sécrètent la CETP (cholesteryl ester transfert protein), protéine-cible des récepteurs LXR (liver X receptor). Nous avons montré que l'expression de la CETP, en réponse aux agonistes LXR, n'est pas augmentée dans les macrophages inflammatoires. Ceci suggère que les macrophages inflammatoires ne participeraient pas à l'augmentation du pool plasmatique de CETP en cas de traitement par des agonistes LXR.

La silicose est une maladie pulmonaire caracterisee par une inflammation interstitielle et par le developpement de nodules silicotiques conduisant a une fibrose. Le macrophage alveolaire joue un role fondamental dans l'evolution de la maladie en produisant des mediateurs comme les radicaux libres oxygenes (rlo) et le facteur de necrose tumorale-alpha (tnf-alpha). Cette etude, realisee apres instillation intratracheale de silice chez le rat, a permis d'etablir une chronologie d'apparition de ces mediateurs, et d'analyser les evenements biochimiques et moleculaires mis en jeu dans l'initiation et le developpement de la silicose. Le traitement, in vivo, par un piegeur de rlo ou un anticorps anti-tnf-alpha montre que (i) les rlo produits par le macrophage alveolaire jouent un role precoce et majeur dans l'initiation de la reponse inflammatoire, (ii) les rlo peuvent etre des messagers intracellulaires controlant l'expression de l'arnm et la synthese du tnf-alpha, et (iii) que cette cytokine proinflammatoire est fortement impliquee dans la pathogenese de la silicose. Par ailleurs, l'utilisation d'un inhibiteur de tyrosine kinase, in vivo, bloque le processus inflammatoire induit par la silice, et inhibe la tyrosine phosphorylation, ainsi que la production des rlo et du tnf-alpha. Ces resultats demontrent l'importance des tyrosine kinases dans le processus d'activation du macrophage par la silice. Dans un second temps, l'effet de l'interleukine-13, recemment proposee comme cytokine anti-inflammatoire et immunomodulatrice a ete etudie, in vitro, sur les macrophages alveolaires de rats silicotiques. L'il-13 peut inhiber la production des rlo et du tnf-alpha par un mecanisme impliquant une tyrosine phosphorylation, une elevation du taux de calcium intracellulaire et d'ampc, et l'activation de la pka. Ce travail permet de progresser dans la connaissance des mecanismes fondamentaux a l'origine du processus inflammatoire et fibrosant, et de fournir des bases suggestives pour de nouvelles therapeutiques dans le traitement de la silicose, et autres pathologies inflammatoires

La réaction inflammatoire est la première étape nécessaire pour restaurer l'homéostasie tissulaire lésée. Elle implique au cours de ses différentes étapes, le système immunitaire, notamment les macrophages qui présentent alors divers remaniements inflammatoires et métaboliques. Les macrophages sont capables de modifier et d'adapter leur métabolisme cellulaire afin de satisfaire leurs besoins énergétiques et réaliser de façon efficace la réaction inflammatoire en fonction des signaux du milieu environnant. Ces adaptations métaboliques influencent la physiologie des mitochondries et les oxydations phosphorylantes (OXPHOS), les sécrétions de molécules pro- et antiinflammatoires, ainsi que la capacité à réaliser la phagocytose (pathogènes, débris cellulaire, autophagie) dépendante de la physiologie des lysosomes. Ces adaptations métaboliques sont sous le contrôle de plusieurs facteurs de transcriptions comme NFkB, TFEB ou HIF1alpha. La compaction et l'accessibilité de la chromatine sont des éléments cruciaux pour la régulation indirecte de l'activité de ces facteurs de transcription. Dans le noyau, la compaction de l'ADN est régulée par les histones mais aussi par d'autres protéines de la famille des High Mobility Group (HMG). Parmi les protéines HMG, la protéine High Mobility Group B1 (HMGB1) principalement localisée dans le noyau est capable de réguler de façon indirecte la transcription de gènes dans de nombreux tissus. En plus de son rôle nucléaire, HMGB1 peut être activement relocalisé dans le cytoplasme puis sécrété par les cellules de l'immunité innée au cours d'inflammation aiguë ou chronique. Une fois dans la circulation sanguine HMGB1 joue le rôle d'alarmine qui initie et maintient l'inflammation. De plus, chez la souris au cours d'une inflammation aiguë ou chronique les concentrations d'HMGB1 circulant sont augmentées par rapport à la condition basale. Tous ces résultats suggèrent un rôle d'HMGB1 dans l'immunométabolisme des macrophages ainsi que dans les processus inflammatoires aiguës ou chroniques. Dans ce contexte, ce travail de thèse s'articule autour de deux objectifs : I/: Étudier le rôle d'HMGB1 dérivé des macrophages et de ses conséquences sur la survenue de la fibrose. II/: Étudier le rôle intracellulaire d'HMGB1 dérivé des macrophages au cours du choc inflammatoire aigu. Ces travaux ont permis de démontrer in vitro et in vivo qu'en tant qu'alarmine HMGB1 dérivé des macrophages n'a pas d'influence sur la survenue de la fibrose suite à une nécro-inflammation chronique. De plus, ces travaux ont permis de démontrer in vitro et in vivo qu'en tant que facteur nucléaire, HMGB1 exerce un puissant effet antiinflammatoire en favorisant la polarisation de type M2, en jouant notamment sur la biogénèse et la fonction des lysosomes. Tous ces résultats pris ensemble ont permis de mieux caractériser et comprendre les fonctions biologiques de la protéine HMGB1 dérivée des macrophages au cours du choc inflammatoire aigu. Ce travail permet aussi de mieux envisager des approches thérapeutiques autour de la fonction d'HMGB1 afin d'éviter toute hyper-réaction inflammatoire aux effets délétères pour l'organisme chez des patients atteints de pathologies inflammatoires aiguës/chroniques
The Inflammatory reaction is the first necessary step to combat all pathogens and tissue injuries and restore damaged tissue homeostasis. The immune system is particularly involved during each step, in particular the macrophages which display various inflammatory and metabolic changes. Macrophages can modify and adapt their cellular metabolism to meet their energy needs and efficiently perform the inflammatory reaction according to signals from the surrounding environment. These deep metabolic adaptations influence mitochondria physiology and oxidative phosphorylations (OXPHOS), the secretions of pro and anti-inflammatory molecules, as well as the ability to phagocytize various inflammatory compounds (pathogens, cell debris, and autophagy). These deep metabolic adaptations are under the control of several transcription factors such as NFkB, TFEB or HIF1alpha. The compaction and accessibility of chromatin are crucial for the regulation of the activity of these transcription factors. In the nucleus, DNA compaction is regulated by histones but also by High Mobility Group (HMG) proteins. Among this family of HMG proteins, the High Mobility Group B1 (HMGB1) protein, mainly located in the nucleus, is capable of regulating indirectly the transcription of genes in many tissues. In addition to its nuclear role, HMGB1 can be actively relocated into the cytoplasm and then secreted by innate immune cells during acute or chronic inflammation. Once in the bloodstream, HMGB1 acts as alarmine which initiates and maintains inflammation. Furthermore, during acute or chronic inflammation, concentrations of circulating HMGB1 are increased compared to the basal condition in mice. All these results suggest a role of HMGB1 in the immunometabolism of macrophages as well as in acute or chronic inflammatory processes. In this context, this thesis work has two objectives: I /: To study the role of HMGB1 derived from macrophages and its consequences on the occurrence of tissue fibrosis. II /: To study the intracellular role of HMGB1 derived from macrophages during acute inflammatory shock. This work has demonstrated in vitro and in vivo that, as an alarmine HMGB1 derived from macrophages, does not influence the occurrence of fibrosis following chronic inflammation. Moreover, we demonstrated in vitro and in vivo that as a nuclear factor HMGB1 exerts a potent anti-inflammatory action on macrophages by regulating lysosome biogenesis and function and skewing towards a M2 profile. All these results taken together helped to better characterize and understand the biological functions of HMGB1 proteins during the inflammatory reaction. Boosting these anti-inflammatory functions of HMGB1 may constitute a potential therapeutic approach to counteract the deleterious effect of hyper-inflammation in patients with acute/chronic inflammatory diseases

Mycobacterium abscessus est la principale mycobactérie à croissance rapide (MCR) responsable d’infections pulmonaires chez l’homme. M. Abscessus est caractérisée comme d’autres mycobactéries non tuberculeuses (MNT) par une hétérogénéité phénotypique avec l’existence d’un variant lisse (S) et d’un variant rugueux (R). Le variant R est associé à une réponse hyper-inflammatoire mais aussi à une plus grande virulence dans un modèle d’étude murin. Grâce à des approches biochimique, protéomique et transcriptomique, nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression de lipoprotéines agonistes TLR2 à la surface de M. Abscessus R responsables de son caractère «hyper-inflammatoire». Bien qu’appartenant au groupe des MCRs, certains éléments évoquent un comportement proche de celui des mycobactéries à croissance lente (MCLs) pathogènes. Différentes observations nous font penser que M. Abscessus serait un pathogène intracellulaire vrai. L’étude du comportement intracellulaire de M. Abscessus S/R nous a permis d’observer une croissance intracellulaire des variants S et R dans les macrophages murins, à l’inverse, aucune multiplication intracellulaire n’a pu être démontrée dans les cellules dendritiques murines. Après étude de l’acidification du phagosome, nous confirmons que sur le même modèle que les MCLs, M. Abscessus variant S entraîne un défaut d’acidification du phagosome à la fois après infection de macrophages mais aussi de cellules dendritiques. Seul le phagosome du variant R de M. Abscessus est acide au sein des macrophages. Enfin, un des résultats les plus surprenants est la mise en évidence de la sortie du phagosome dans le cytoplasme du variant S de M. Abscessus
Mycobacterium abscessus is recognized as the pulmonary pathogen inside the rapidly growing mycobacterium (RGM) group. Of interest, M. Abscessus, as other mycobacteria like M. Avium and M. Smegmatis, is able to present itself in two forms on solid agar media: a smooth variant (S) and a rough variant (R). The R variant is associated with a hyperinflammatory response but also a greater virulence in mice. Through biochemichal, proteomic and trancritptomic approaches, we demonstrated the overexpression of lipoproteinsTLR2 agonists at the surface of M. Abscessus R responsible for its hyper-inflammatory response. Although M. Abscessus belongs to the RGM group, some elements are in favor of a pathogenic behavior as the slow growing mycobacteria group. Several observations make us think that M. Abscessus is a true intracellular pathogen. The study of the intracellular behavior of M. Abscessus S /R allowed us to observe intracellular growth of S and R variants in murine macrophages; in contrast no intracellular growth was observed in murine dendritic cells. In parallel, measurements of intraphagosomal pH showed a clear difference between S and R variants, with an acidification process for the R variant as shown by its low pH in macrophages as compared to the S variant. Finally, one of the most surprising results was the observation of the phagosomal escape into the cytoplasm of the S variant of M. Abscessus

Il est établi que les œstrogènes influencent les réponses immunes et inflammatoires au cours de divers processus physiologiques et physiopathologiques. Afin de mieux caractériser les effets des œstrogènes sur le système immuno-inflammatoire, nous avons étudié les conséquences de l'exposition chronique à l'œstradiol (E2) in vivo sur les macrophages et leurs capacités de réponses inflammatoires. Des souris C57BI/6J ovariectomisées ont été traitées pendant 4 semaines avec des doses physiologiques et stables d'E2, dans le but d'étudier les réponses inflammatoires des macrophages péritonéaux suite à leur activation ex vivo par des LPS ou in vivo par l'injection de thioglycolate. Dans ces deux conditions d'activation, nous montrons que I'E2 majore l'expression de cytokines pro-inflammatoires induite par l'activation du TLR4 ou par le thioglycolate. Cet effet pro-inflammatoire de l'hormone semble être expliqué, au moins en partie, par l'inhibition de la voie de signalisation PI3K/Akt, régulateur négatif de l'activation des TLR. Nous montrons également que les concentrations endogènes d'oestrogènes sont suffisantes pour produire cet effet proinflammatoire dans les deux situations expérimentales. Enfin, des travaux sur différents modèles de souris, où l'expression du récepteur des œstrogènes alpha est invalidé soit dans l'organisme entier, soit dans le compartiment hématopoïétique ou encore exclusivement dans les cellules myéloïdes, nous ont permis de montrer que l'effet pro-inflammatoire de PE2 nécessite l'expression de ce récepteur dans les macrophages. Ces données constituent une première preuve d'un effet direct de I'E2 sur les réponses inflammatoires des macrophages in vivo
It's well established that estrogens influence immune and inflammatory responses during various physiologic and physiopathologic processes. In order to define the effects of estrogens on the immuno-inflammatory System, we have studied the consequences of a chronic exposure to estradiol (E2) in vivo on macrophages and their capacity to produce inflammatory responses. Ovariectomized C57BI/6J mice were treated for 4 weeks with physiological and stable doses of E2 to study the inflammatory responses of peritoneal macrophages, activated ex vivo by LPS or in vivo by an intraperitoneal injection of thioglycolate. In both conditions, we show that E2 exacerbates the expression of pro-inflammatory cytokines induced by the activation of TLR4 or by thioglycolate. This pro-inflammatory effect of the hormone appears to be explained, at least in part, by the inhibition of the PI3K/Akt signalling pathway which negatively regulates the TLR4 activation. We show also that endogenous concentrations of estrogens are sufficient to produce this pro-inflammatory effect in both experimental situations. Finally, experiments on different mice models, where the expression of estrogen receptor alpha is abolished either in the whole organism, in hematopoietic compartment or exclusively in myeloid cells, allowed us to conclude that the pro-inflammatory effect of E2 needs the expression of estrogen receptor alpha in macrophages. These data provide a new evidence of a direct effect of E2 on macrophage inflammatory responses