Dissertations / Theses on the topic 'Protéines inflammatoires des macrophages'

L'activation du système du complément joue un rôle primordial dans la réaction inflammatoire. Les macrophages constituent une source locale en protéines du complément. Une perturbation dans la biosynthèse locale des protéines de ce système pourrait être à l'origine du développement incontrôlé d'une réaction inflammatoire locale et pourrait contribuer à la formation de lésions tissulaires locales observées au cours de diverses maladies inflammatoires. Les glucocorticoïdes sont de puissants anti-inflammatoires qui constituent un outil thérapeutique essentiel en immunopathologie. Nous avons voulu savoir si les glucocorticoïdes pouvaient influencer la biosynthèse des protéines de la voie alterne du système du complément par les cellules de la lignée monocyte/macrophage. Nos résultats montrent que la déxamethasone, un glucocorticoïde de synthèse, diminue la synthèse de deux protéines jouant un rôle positif dans l'activation du complément, C3 et le facteur B, alors qu'elle augmente, seule ou en association avec l'interféron-gamma, celle du facteur H, une protéine qui limite l'activation du système. Globalement, ces résultats indiquent que les glucocorticoïdes peuvent diminuer l'activation du complément en régulant de façon différentielle la synthèse des différentes protéines du système. Des résultats analogues ayant été décrits avec la cellule endothéliale et le fibroplaste, nous concluons que l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes pourrait résulter en partie d'un contrôle local de l'activation du complément.

Au cours des dernières décennies, les modifications comportementales ont conduit à une forte augmentation de la prévalence des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. L’hyperglycémie chronique associée à ces maladies a des effets délétères sur de nombreux tissus, entraînant de graves complications (glucotoxicité). Parmi les différents mécanismes impliqués dans les effets toxiques du glucose, la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines joue un rôle très important. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible qui régule l'activité des protéines cytosoliques et nucléaires en fonction de la disponibilité en glucose. Deux enzymes seulement, l’O-GlcNAc transférase (OGT) et l’O-GlcNAcase (OGA), ajoutent ou retirent le groupement GlcNAc sur les protéines, respectivement. Cette modification dépend étroitement de la disponibilité en glucose et de son flux à travers la voie de biosynthèse des hexosamines (HBP). Les maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité se caractérisent par ailleurs par une inflammation chronique à bas bruit, qui participe également aux complications observées dans ces pathologies. Les perturbations métaboliques associées à ces maladies (augmentation des acides gras libres et du glucose) favorisent les processus pro-inflammatoires dans le macrophage. Cependant, les relations entre processus inflammatoires et O-GlcNAcylation des protéines restent peu explorées. Le but de ce travail était d’évaluer l’implication de la voie de O-GlcNAcylation dans le macrophage. Les études ont été réalisées en utilisant la lignée de macrophages murins RAW264.7 ou des macrophages, différenciés à partir de moelle osseuse de souris, des macrophages péritonéaux de souris ou des macrophages différenciés à partir à de monocytes humains. La O-GlcNAcylation des protéines a été mesurée dans les macrophages RAW264.7 à l’aide d’un biosenseur BRET adressé dans différents compartiments cellulaires. Nous avons observé que l'activation du Toll-like receptor (TLR) 4 par le LPS (lipopolysaccharide) augmente le signal de BRET à la membrane plasmique, dans le cytosol et le noyau des cellules RAW264.7. Une augmentation de la O-GlcNAcylation induite par le LPS était également observée par western blotting dans les cellules RAW264.7 et dans les macrophages primaires de souris et humains. Cette augmentation de O-GlcNAcylation était en particulier détectée sur la sous-unité p65 du facteur de transcription NFκB, suggérant un rôle de cette modification dans les effets pro-inflammatoires du LPS. En accord avec cette notion, l’inhibition de l’OGA, (responsable de la dé-GlcNAcylation des protéines) à l’aide d’un inhibiteur spécifique (Thiamet G), potentialise les effets du LPS sur l’expression des ARNm de la cytokine pro-inflammatoire IL1β. Nous avons en outre généré un modèle de souris OGT-KO inductible au tamoxifène. L’invalidation de l’OGT dans les macrophages primaires de ces souris réduit l’effet du LPS sur l’expression des ARNm de l’IL1β d’un facteur 2, suggérant que l’induction de la O-GlcNAcylation est au moins en partie impliquée dans la transmission des effets pro-inflammatoires du LPS. Afin d’élucider les mécanismes responsables de l’augmentation de O-GlcNAcylation induite par le LPS, nous avons étudié, dans les cellules RAW264.7, l’effet du LPS sur les enzymes impliquées dans la voie O-GlcNAc. Nous avons observé que le traitement au LPS n’a pas d’effet sur l’expression (ARNm et protéine) et sur les activités enzymatiques de l’OGT et de l’OGA. En revanche, le LPS induit une forte augmentation de l’expression (ARNm et protéine) de la glutamine : fructose-6-phosphate amidotransférase (GFAT), enzyme limitante de la voie HBP. (...)
In the last decades, changes in lifestyle have led to a dramatic increased prevalence of pathologies such as obesity and type 2 diabetes. Chronic hyperglycaemia associated with these diseases has deleterious effects on many tissues, resulting in serious complications (glucotoxicity). Among the different mechanisms involved in the toxic effects of glucose, O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAc) of proteins plays an important role. O-GlcNAcylation is a reversible post-translational modification that regulates the activities of cytosolic and nuclear proteins. Only two enzymes, O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA), control the level of O-linked N-acetyl glucosamine (O- GlcNAc) on proteins. OGT is the enzyme that O-GlcNAcylates proteins, whereas OGA removes O-GlcNAc from proteins. This post-translational modification tightly depends on glucose availability and its flux through the hexosamines biosynthesis pathway (HBP). Metabolic diseases such as diabetes and obesity are also characterized by chronic low level inflammation, which contributes to the complications observed in these pathologies. The metabolic disturbances associated with these diseases (increased free fatty acids and glucose) promote pro-inflammatory processes in the macrophage. However, the relationships between inflammatory processes and O-GlcNAcylation of proteins remain poorly explored. The aim of this work was to evaluate the involvement of the O-GlcNAcylation pathway in the macrophage. The studies were carried out using the RAW264.7 mouse macrophage cell line or primary macrophages differentiated from mouse bone marrow (BMDM), peritoneal mouse macrophages, or human monocytes derived macrophages (hMDM). O-GlcNAcylation of proteins was measured in RAW264.7 macrophages using a BRET biosensor targeted to different cell compartments. We have observed that activation of Toll-like receptor (TLR) 4 by LPS (lipopolysaccharide) increases the BRET signal at the plasma membrane, in the cytosol, and nucleus of RAW264.7 cells. An increase in LPS-induced O-GlcNAcylation was also observed by western blotting in RAW264.7 cells and primary mouse and human macrophages. This increase in O-GlcNAcylation was in particular detected on the p65 subunit of the NFκB transcription factor, suggesting a role for this modification in the pro-inflammatory effects of LPS. In agreement with this notion, inhibition of OGA, (responsible for de-GlcNAcylation of proteins) using a specific inhibitor (Thiamet G) potentiates the effects of LPS on mRNA expression of the pro-inflammatory cytokine IL1β. In addition, we generated a tamoxifen-inducible OTG-KO mouse model. Invalidation of OGT in primary macrophages of these mice reduces the effect of LPS on the expression of IL1β mRNAs by a factor of 2, suggesting that the induction of O-GlcNAcylation is at least in part involved in the transmission of the pro-inflammatory effects of LPS. In order to elucidate the mechanisms responsible for LPS-induced increase in O-GlcNAcylation, we studied the effect of LPS on the enzymes involved in the O-GlcNAc pathway in RAW264.7 cells. We observed that LPS treatment had no effect on the expression (mRNA and protein) and on the enzymatic activities of OGT and OGA. On the other hand, LPS induced a strong increase in the expression (mRNA and protein) of glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), the rate limiting enzyme of the HBP pathway. Inhibition of GFAT with 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) inhibited LPS-induced increase in O-GlcNAcylation and LPS effect on the expression of IL1β mRNA, but not NOS2 expression, confirming a partial dependence of the pro-inflammatory effects of LPS on the O-GlcNAc pathway. In conclusion, our results indicate that activation of the O-GlcNAcylation pathway could be considered as an integral part of the signal induced by TLR4, and suggest that this pathway is involved in some of the pro-inflammatory effects of LPS in the macrophage

Le rôle des macrophages dans le développement des gliomes, des tumeurs attaquant le système nerveux central, est controversé. Nous avons étudié le développement des gliomes chez des souris transgéniques permettant la déplétion spécifique des macrophages par l’administration d’un pro-médicament. Nos résultats indiquent qu’une réduction de la densité de macrophages augmente la croissance tumorale. Selon le modèle, leur activité est apparue dépendante ou non du recrutement des lymphocytes T. Nous avons ensuite émis l’hypothèse que les anti-inflammatoires pourraient favoriser le développement des gliomes. Au contraire, nous avons observé que l’administration de dexaméthasone à des souris implantées avec des cellules gliomales diminuait la progression des tumeurs. Nous avons établi que cet agent affectait le profil d’expression génique des cellules endothéliales en diminuant notamment l’expression de l’angiopoiétine-2, un facteur pro-angiogénique. L’utilisation d’un anticorps synthétique inhibant l’Angpt2 est apparue plus efficace que la dexaméthasone pour réduire la croissance des gliomes. Les inhibiteurs de l’Angpt-2 pourraient donc représenter des outils intéressants pour le traitement des gliomes.

Le locus CDKN2A/B contient le gène codant le suppresseur de tumeur p16INK4a. Des études d’association de gènes ont identifiées que le locus CDN2A/B est associé à un risque de développement de maladies inflammatoires, dans lesquelles les macrophages jouent un rôle important. Les macrophages constituent une population cellulaire hétérogène dont la forme d’activation et les fonctions sont déterminées par les signaux environnants. Les cytokines Th1, tel que l’interféron gamma, et les antigènes bactériens, tel que le lipopolysaccharide, induisent une activation classique ou M1 des macrophages alors que les cytokines Th2, telles que les interleukines 4 et 13, induisent une activation alternative ou M2 des macrophages. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans l’acquisition de ces phénotypes sont encore mal connus. Cette étude montre que l’absence d’expression de p16INK4a (p16-/-) inhibe la réponse inflammatoire et favorise l’activation alternative des macrophages primaires murins in vitro. Afin de déterminer la relevance de ces observations in vivo, la fonction de p16INK4a dans les macrophages a été étudiée chez la souris lors d’une infection parasitaire, dans laquelle le rôle des macrophages alternatifs est connu, puis au cours du développement de l’athérosclérose dans lequel le rôle des macrophages alternatifs reste à déterminer, en utilisant la transplantation de moelle osseuse. Les souris transplantées avec de la moelle osseuse p16-/- présentent une induction de l’expression génique des marqueurs de macrophages alternatifs dans le foie après infection parasitaire, démontrant que p16INK4a influence l’activation des macrophages in vivo. Cependant, l’absence de p16INK4a dans les cellules hématopoïétiques n’influence pas le développement de l’athérosclérose dans nos conditions expérimentales. Enfin, l’invalidation de l’expression de p16INK4a par ARN interférence dans les macrophages primaires humains et la mesure d’expression de p16INK4a dans les macrophages isolés du tissu adipeux de patient obèses montrent que l’absence de p16INK4a favorise un phénotype alternatif des macrophages proche de celui des macrophages du tissu adipeux. Ces travaux de recherche identifient p16INK4a comme modulateur de l’activation des macrophages murins et humains. Mots clés : CDKI-activation alternative-inflammation-infection parasitaire-athérosclérose-obésité
The CDKN2A/B locus, which contains the tumor suppressor gene p16INK4a, is associated with an increased risk of age-related inflammatory diseases, such as cardiovascular disease and type 2 diabetes, in which macrophages play a crucial role. Activation state and functions of macrophages are profoundly affected by environmental cytokines and microbial products. Indeed, Th1 cytokines, such as interferon gamma, and lipopolysaccharide induce a classical activation phenotype whereas Th2 cytokines, such as inteleukins 4 and 13, induce an alternative activation phenotype. However, the molecular mechanisms underlying the acquisition of these phenotypes are not well defined. In this study, we show that p16INK4a-deficiency (p16-/-) skews murine macrophages towards an alternative activation in vitro. The influence of p16INK4a-deficiency on macrophage activation in vivo was investigated using bone marrow transplantation, first in a parasite infectious model in which the role of alternatively activated macrophages is well characterized, then during atherosclerosis development, in which the role of alternatively activated macrophages is undefined. While mice transplanted with p16-/- bone marrow displayed higher hepatic marker expression levels of alternative activation upon parasite infection, no effect was observed on atherosclerosis development in our experimental conditions. Finally, confirming the data obtained in p16-/- macrophages, silencing of p16INK4a with siRNA in human blood-monocyte-derived macrophages also resulted in the induction of alternative activation. In addition, analysis of human adipose tissue macrophages from obese patients, which are typically alternatively activated, showed that p16ink4a expression levels were lower in ATM than in monocyte-derived macrophages of the same subjects. These findings identify a novel role for the tumor suppressor p16INK4a as modulator of murine and human macrophage activation. Keywords: CDKI-alternative activation-inflammation-parasite infectious-atherosclerosis-obesity

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune qui touche 0,5 à 1% de la population adulte mondiale. Bien que des facteurs génétiques et environnementaux de susceptibilité soient identifiés, son étiologie reste inconnue. Sur le plan clinique, elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales menant à une destruction ostéo-cartilagineuse. Sur le plan biologique, elle est marquée par la présence d'auto-anticorps chez la majorité des patients. Parmi ceux-ci, les auto-anticorps anti-protéines citrullinées (ACPA) et le facteur rhumatoïde (FR) sont détectés chez environ 80% des patients et associés aux formes les plus actives et les plus sévères de la maladie. Outre leur intérêt diagnostique et, à un moindre degré, pronostique, les ACPA et le FR sont synthétisés dans le tissu synovial où leurs cibles respectives, la fibrine citrullinée principalement et les IgG (fragments Fc), sont également abondantes. Au sein des articulations, ces auto-anticorps sont donc susceptibles de former des complexes immuns avec leurs antigènes-cibles articulaires, d'activer des voies effectrices mettant en jeu des récepteurs aux fragments Fc des immunoglobulines (FcR) et/ou l'activation du complément, et de participer ainsi à la promotion de l'inflammation articulaire. Notre laboratoire s'est précédemment intéressé au rôle des ACPA dans l'inflammation du tissu synovial rhumatoïde. Un modèle cellulaire entièrement humain a été développé dans le but de mimer l'interaction entre macrophages et complexes immuns issus de la fixation d'ACPA à la fibrine citrullinée, présente sous forme de dépôts dans le tissu synovial rhumatoïde. Ce modèle utilise des macrophages différenciés à partir de monocytes d'individus sains stimulés par des complexes immuns reconstitués par immunocapture sélective d'IgG ACPA de patients atteints de PR par du fibrinogène citrulliné immobilisé (CI-ACPA). Il a permis d'établir la capacité de ces complexes immuns à induire une sécrétion macrophagique de TNF-α via la fixation à des récepteurs aux fragments Fc des IgG (FcγR) activateurs, parmi lesquels le récepteur FcγRIIa joue un rôle prépondérant. Le TNF-α étant une cytokine-clé de la synovite rhumatoïde, ces résultats ont renforcé l'hypothèse selon laquelle les ACPA seraient un inducteur majeur de sa sécrétion. Nous avons poursuivi l'étude de l'implication des auto-anticorps dans la physiopathologie de la PR, en étudiant l'influence du FR sur l'effet pro inflammatoire des ACPA dans le même modèle in vitro. Nous avons tout d'abord évalué l'influence de deux FR de classe IgM (FR IgM) monoclonaux purifiés à partir de sérums de patients atteints de cryoglobulinémie de type II. Nous avons observé que l'incorporation de chacun de ces FR aux CI-ACPA amplifiait fortement la sécrétion macrophagique de TNF-α. Plus globalement, ceci s'accompagnait d'un déséquilibre de la réponse cytokinique des macrophages en faveur de l'inflammation : la sécrétion d'autres cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1β, l'IL-6 ou l'IL-8 et le rapport de sécrétion TNF α:IL-10 étaient augmentés, alors que le rapport IL1-Ra:IL-1β était diminué. En outre, le mélange de cytokines sécrétées par les macrophages a induit une sécrétion accrue d'IL-6 par des fibroblastes synoviaux provenant de patients atteints de PR. De plus, nous avons confirmé que les CI-ACPA n'induisaient pas la sécrétion de TNF α par les monocytes circulants dont étaient dérivés les macrophages et nous avons montré que l'incorporation de FR IgM dans les complexes immuns ne permettait pas non plus de l'induire. Par ailleurs, nous avons établi qu'à lui seul, le FR IgM ne provoquait pas de sécrétion de TNF α par les macrophages. L'amplification de la réponse cytokinique aux CI-ACPA qu'induit le FR IgM provient très probablement d'une augmentation de la signalisation activatrice en aval de FcγR, puisqu'elle est dépendante du recrutement d'un nombre accru d'IgG dans les complexes immuns, captées par l'IgM multivalente. Enfin, nous avons observé l'activation de la cascade du complément par les CI-ACPA, et la majoration de ce phénomène en présence de FR IgM. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'influence de « l'authentique » FR IgM, c'est-à-dire celui présent chez les patients atteints de PR, et posé la question de l'influence du FR de classe IgA (FR IgA) de la même provenance. Nous avons purifié ces deux classes de FR par différentes étapes de chromatographie d'affinité, à partir de plusieurs mélanges de sérums de patients atteints de PR. Avec chacune des deux classes de FR, nous avons montré que leur incorporation aux CI-ACPA induisait systématiquement l'amplification de la réponse TNF-α macrophagique et que la réponse cytokinique était globalement déséquilibrée en faveur de l'inflammation. Poursuivant l'étude des mécanismes de l'amplification de la réponse cytokinique par le FR IgM, nous avons définitivement écarté l'hypothèse d'une signalisation en aval d’un récepteur aux IgM. En effet, aucun des récepteurs aux IgM leucocytaires déjà décrits, c'est à dire ni le récepteur FcµR, ni le récepteur Fcα/µR, n'était exprimé à la surface des macrophages de notre modèle. En outre, la stimulation des macrophages par des IgM ou leur portion Fc ni n'a induit la sécrétion de TNF-α, ni n'a modulé celle induite par des complexes immuns contenant des IgG. Par contre, nous avons confirmé que le récepteur FcαRI aux IgA était exprimé à la surface des macrophages et, par blocage sélectif de la fixation des FR IgA à ce récepteur, nous avons montré sa participation dans l'activation des macrophages par les CI-ACPA ayant incorporé le FR IgA. Enfin, nous avons observé que l'amplification de la réponse TNF-α par les FR IgM et IgA augmentait drastiquement en présence de LPS. Ceci montre une possible coopération des voies des FcR et du TLR4 dans la synovite, en cas de présence simultanée de complexes immuns et de ligands de TLR4. Une telle coopération est probable puisque divers ligands endogènes potentiels de TLR4 ont été décrits au sein du tissu synovial rhumatoïde. Au total, FR IgM et FR IgA apparaissent comme des amplificateurs majeurs de la réaction inflammatoire induite par les ACPA au sein du tissu synovial rhumatoïde. Nous avons précisé leur mode d'action qui correspond à l'interaction des CI-ACPA avec les macrophages via leurs FcR mais aussi, très probablement, au moins pour le FR IgM, via les récepteurs du complément. Ces résultats apportent un éclairage inédit sur le rôle, suspecté mais jamais démontré du FR IgM mais aussi du FR IgA, dans la physiopathogénie de la PR. La pertinence de stratégies thérapeutiques qui viseraient à contrecarrer l'activation des mécanismes effecteurs pro-inflammatoires induits par les CI contenant ACPA et FR, ou à inhiber la production de ces auto-anticorps, est ainsi fortement renforcée
Rheumatoid Arthritis (RA) is the most frequent human auto-immune disease affecting 0. 5 to 1% of the population worldwide. The exact cause of RA is unknown, but joint inflammation is thought to be the result of an uncontrolled autoimmune response arising from a combination of environmental and genetic factors. Among autoantibodies found in RA patients, autoantibodies to citrullinated proteins (ACPA) and rheumatoid factors (RF) are present in the serum of about 80% of patients and are frequently associated with active and severe forms of RA. In addition to their diagnostic and prognostic interest, ACPA and RF are synthesized by plasma cells of the rheumatoid synovial membrane at the very place where their respective target, citrullinated fibrin and Fc fragment of IgG are also present and abundant. In the joints, these autoantibodies are likely to form immune complexes with their articular antigenic targets able to trigger inflammatory effector responses depending on Fc receptors to immunoglobulins and/or complement activation, thus to promote joint inflammation. During the last few years, our laboratory dedicated itself to the understanding of the role of ACPA in RA synovial tissue inflammation. A totally human in vitro model was developed in order to mimic the interactions between synovial macrophages and immune complexes formed by ACPA and citrullinated fibrin, their major target in the synovial tissue. In this model, ACPA immune complexes (ACPA-IC) are generated by selective immunocapture of IgG ACPA from the serum of RA patients by in vitro citrullinated human fibrinogen immobilized onto culture wells into which macrophages, differentiated from CD14-positive monocytes of healthy human donors, are then seeded. This model allowed demonstrating the ability of ACPA-IC to induce TNF-α secretion by macrophages through signalling downstream of activating Fc receptors to IgG (FcγR), predominantly the FcγRIIa receptor. Considering that TNF-α is a key pro-inflammatory cytokine in the disease, these results strengthened the hypothesis that ACPA have an inflammatory potential and a major role in RA. To further study the involvement of autoantibodies in the pathophysiology of RA we undertook to assess the influence of RF on the pro-inflammatory role of ACPA in the in vitro model. We first evaluated the influence of two monoclonal RF IgM paraproteins from patients with type II cryoglobulinemia. Each RF IgM strongly amplified the macrophage TNF-α secretion induced by ACPA-IC. Overall, incorporation into ACPA-IC of RF IgM shifted the macrophage secretion of cytokines toward an even more pronounced proinflammatory profile as it increased the TNF-α:IL 10 ratio and the IL 6 and IL-8 secretions and decreased the IL 1Ra:IL 1β ratio. Moreover, the secreted cytokine cocktail exhibited an enhanced capacity to prompt IL-6 secretion by RA synovial fibroblasts. Then, we confirmed that ACPA-IC did not induce TNF-α secretion by monocytes and showed that they remained unresponsive even after incorporation of RF IgM. Besides, we showed that RF IgM alone did not induce TNF-α macrophage secretion. The amplification of the macrophage cytokine responses probably arises from an increase in the activating signals downstream of FcγRs due to an RF IgM-mediated recruitment of more IgG into ACPA-IC. Finally, in vitro complement activation by immobilized ACPA-IC markedly increased when their formation occurred in the presence of RF IgM. Secondly, we evaluated the influence of the RF IgM and RF IgA found in RA patients. These were purified from RA serum pools by serial affinity chromatographies. Incorporation of each class of RF systematically amplified the macrophage cytokine secretion and skewed it in favour of proinflammatory cytokines. Further exploration of the mechanism of the RF IgM-mediated amplification allowed ruling out the involvement of any signalling downstream of an IgM receptor. Indeed, neither FcµR nor Fcα/µR, the only recognized leucocyte IgM receptors, was expressed by the macrophages of our model. Moreover, macrophages did not secrete any TNF α in response to IgM or IgM Fc portions and their TNF α response to IgG-containing immune complexes was not modulated by the simultaneous presence of IgM or Fc5µ fragments. However, we confirmed that the receptor FcαRI for IgA Fc was expressed and that it participates in the activating signalling cascade induced by ACPA-IC formed in the presence of RF IgA IC since selective blockade of the binding of RF IgA to this receptor inhibited the TNF-α response to these immune complexes. Finally, LPS substantially enhanced induction of macrophage TNF-α by ACPA-IC containing RF IgM or RF IgA. Considering that numerous endogenous TLR4 ligands have been described in the RA synovial tissue, this indicates that simultaneous FcR engagement by RA-associated IC and ligation of TLR4 by such endogenous ligands likely cooperate in promoting synovial tissue inflammation. Therefore, RF IgM and RF IgA appear as major enhancers of the inflammatory reaction induced by ACPA in the RA synovial tissue. We show that this is most probably mediated by FcR triggering but also, concerning RF IgM, by activation of the complement cascade. Our studies shed new light on the largely accepted but poorly mechanistically documented role of RF IgM and RF IgA in RA pathophysiology. They also emphasize the relevance of therapeutic strategies aiming at downregulating the proinflammatory effectors mechanisms triggered by immunes complexes containing ACPA and RF or seeking inhibition of the production of theses autoantibodies

Au cours de ma thèse, j'ai étudié la fonction cytotoxique des cellules dendritiques (DC) de patients cancéreux comparée à celle de sujets sains. Nous avons montré que les DC générées à partir des monocytes du sang périphérique peuvent acquérir des capacités cytotoxiques importantes après activation par des faibles doses de LPS. Le potentiel cytotoxique des DC générées à partir de patients cancéreux est comparable à celui de sujets sains. Nous avons identifié le mécanisme de cytotoxicité qui fait intervenir la production de peroxynitrite. Après avoir tué les cellules tumorales, les DC phagocytent des fragments tumoraux, surexpriment des molécules de costimulation et induisent la prolifération des lymphocytes. Un deuxième axe de recherche au cours de ma thèse a consisté en l'étude des macrophages inflammatoires et de leur implication dans l'athérosclérose. Les macrophages sécrètent la CETP (cholesteryl ester transfert protein), protéine-cible des récepteurs LXR (liver X receptor). Nous avons montré que l'expression de la CETP, en réponse aux agonistes LXR, n'est pas augmentée dans les macrophages inflammatoires. Ceci suggère que les macrophages inflammatoires ne participeraient pas à l'augmentation du pool plasmatique de CETP en cas de traitement par des agonistes LXR.

La silicose est une maladie pulmonaire caracterisee par une inflammation interstitielle et par le developpement de nodules silicotiques conduisant a une fibrose. Le macrophage alveolaire joue un role fondamental dans l'evolution de la maladie en produisant des mediateurs comme les radicaux libres oxygenes (rlo) et le facteur de necrose tumorale-alpha (tnf-alpha). Cette etude, realisee apres instillation intratracheale de silice chez le rat, a permis d'etablir une chronologie d'apparition de ces mediateurs, et d'analyser les evenements biochimiques et moleculaires mis en jeu dans l'initiation et le developpement de la silicose. Le traitement, in vivo, par un piegeur de rlo ou un anticorps anti-tnf-alpha montre que (i) les rlo produits par le macrophage alveolaire jouent un role precoce et majeur dans l'initiation de la reponse inflammatoire, (ii) les rlo peuvent etre des messagers intracellulaires controlant l'expression de l'arnm et la synthese du tnf-alpha, et (iii) que cette cytokine proinflammatoire est fortement impliquee dans la pathogenese de la silicose. Par ailleurs, l'utilisation d'un inhibiteur de tyrosine kinase, in vivo, bloque le processus inflammatoire induit par la silice, et inhibe la tyrosine phosphorylation, ainsi que la production des rlo et du tnf-alpha. Ces resultats demontrent l'importance des tyrosine kinases dans le processus d'activation du macrophage par la silice. Dans un second temps, l'effet de l'interleukine-13, recemment proposee comme cytokine anti-inflammatoire et immunomodulatrice a ete etudie, in vitro, sur les macrophages alveolaires de rats silicotiques. L'il-13 peut inhiber la production des rlo et du tnf-alpha par un mecanisme impliquant une tyrosine phosphorylation, une elevation du taux de calcium intracellulaire et d'ampc, et l'activation de la pka. Ce travail permet de progresser dans la connaissance des mecanismes fondamentaux a l'origine du processus inflammatoire et fibrosant, et de fournir des bases suggestives pour de nouvelles therapeutiques dans le traitement de la silicose, et autres pathologies inflammatoires

La réaction inflammatoire est la première étape nécessaire pour restaurer l'homéostasie tissulaire lésée. Elle implique au cours de ses différentes étapes, le système immunitaire, notamment les macrophages qui présentent alors divers remaniements inflammatoires et métaboliques. Les macrophages sont capables de modifier et d'adapter leur métabolisme cellulaire afin de satisfaire leurs besoins énergétiques et réaliser de façon efficace la réaction inflammatoire en fonction des signaux du milieu environnant. Ces adaptations métaboliques influencent la physiologie des mitochondries et les oxydations phosphorylantes (OXPHOS), les sécrétions de molécules pro- et antiinflammatoires, ainsi que la capacité à réaliser la phagocytose (pathogènes, débris cellulaire, autophagie) dépendante de la physiologie des lysosomes. Ces adaptations métaboliques sont sous le contrôle de plusieurs facteurs de transcriptions comme NFkB, TFEB ou HIF1alpha. La compaction et l'accessibilité de la chromatine sont des éléments cruciaux pour la régulation indirecte de l'activité de ces facteurs de transcription. Dans le noyau, la compaction de l'ADN est régulée par les histones mais aussi par d'autres protéines de la famille des High Mobility Group (HMG). Parmi les protéines HMG, la protéine High Mobility Group B1 (HMGB1) principalement localisée dans le noyau est capable de réguler de façon indirecte la transcription de gènes dans de nombreux tissus. En plus de son rôle nucléaire, HMGB1 peut être activement relocalisé dans le cytoplasme puis sécrété par les cellules de l'immunité innée au cours d'inflammation aiguë ou chronique. Une fois dans la circulation sanguine HMGB1 joue le rôle d'alarmine qui initie et maintient l'inflammation. De plus, chez la souris au cours d'une inflammation aiguë ou chronique les concentrations d'HMGB1 circulant sont augmentées par rapport à la condition basale. Tous ces résultats suggèrent un rôle d'HMGB1 dans l'immunométabolisme des macrophages ainsi que dans les processus inflammatoires aiguës ou chroniques. Dans ce contexte, ce travail de thèse s'articule autour de deux objectifs : I/: Étudier le rôle d'HMGB1 dérivé des macrophages et de ses conséquences sur la survenue de la fibrose. II/: Étudier le rôle intracellulaire d'HMGB1 dérivé des macrophages au cours du choc inflammatoire aigu. Ces travaux ont permis de démontrer in vitro et in vivo qu'en tant qu'alarmine HMGB1 dérivé des macrophages n'a pas d'influence sur la survenue de la fibrose suite à une nécro-inflammation chronique. De plus, ces travaux ont permis de démontrer in vitro et in vivo qu'en tant que facteur nucléaire, HMGB1 exerce un puissant effet antiinflammatoire en favorisant la polarisation de type M2, en jouant notamment sur la biogénèse et la fonction des lysosomes. Tous ces résultats pris ensemble ont permis de mieux caractériser et comprendre les fonctions biologiques de la protéine HMGB1 dérivée des macrophages au cours du choc inflammatoire aigu. Ce travail permet aussi de mieux envisager des approches thérapeutiques autour de la fonction d'HMGB1 afin d'éviter toute hyper-réaction inflammatoire aux effets délétères pour l'organisme chez des patients atteints de pathologies inflammatoires aiguës/chroniques
The Inflammatory reaction is the first necessary step to combat all pathogens and tissue injuries and restore damaged tissue homeostasis. The immune system is particularly involved during each step, in particular the macrophages which display various inflammatory and metabolic changes. Macrophages can modify and adapt their cellular metabolism to meet their energy needs and efficiently perform the inflammatory reaction according to signals from the surrounding environment. These deep metabolic adaptations influence mitochondria physiology and oxidative phosphorylations (OXPHOS), the secretions of pro and anti-inflammatory molecules, as well as the ability to phagocytize various inflammatory compounds (pathogens, cell debris, and autophagy). These deep metabolic adaptations are under the control of several transcription factors such as NFkB, TFEB or HIF1alpha. The compaction and accessibility of chromatin are crucial for the regulation of the activity of these transcription factors. In the nucleus, DNA compaction is regulated by histones but also by High Mobility Group (HMG) proteins. Among this family of HMG proteins, the High Mobility Group B1 (HMGB1) protein, mainly located in the nucleus, is capable of regulating indirectly the transcription of genes in many tissues. In addition to its nuclear role, HMGB1 can be actively relocated into the cytoplasm and then secreted by innate immune cells during acute or chronic inflammation. Once in the bloodstream, HMGB1 acts as alarmine which initiates and maintains inflammation. Furthermore, during acute or chronic inflammation, concentrations of circulating HMGB1 are increased compared to the basal condition in mice. All these results suggest a role of HMGB1 in the immunometabolism of macrophages as well as in acute or chronic inflammatory processes. In this context, this thesis work has two objectives: I /: To study the role of HMGB1 derived from macrophages and its consequences on the occurrence of tissue fibrosis. II /: To study the intracellular role of HMGB1 derived from macrophages during acute inflammatory shock. This work has demonstrated in vitro and in vivo that, as an alarmine HMGB1 derived from macrophages, does not influence the occurrence of fibrosis following chronic inflammation. Moreover, we demonstrated in vitro and in vivo that as a nuclear factor HMGB1 exerts a potent anti-inflammatory action on macrophages by regulating lysosome biogenesis and function and skewing towards a M2 profile. All these results taken together helped to better characterize and understand the biological functions of HMGB1 proteins during the inflammatory reaction. Boosting these anti-inflammatory functions of HMGB1 may constitute a potential therapeutic approach to counteract the deleterious effect of hyper-inflammation in patients with acute/chronic inflammatory diseases

Mycobacterium abscessus est la principale mycobactérie à croissance rapide (MCR) responsable d’infections pulmonaires chez l’homme. M. Abscessus est caractérisée comme d’autres mycobactéries non tuberculeuses (MNT) par une hétérogénéité phénotypique avec l’existence d’un variant lisse (S) et d’un variant rugueux (R). Le variant R est associé à une réponse hyper-inflammatoire mais aussi à une plus grande virulence dans un modèle d’étude murin. Grâce à des approches biochimique, protéomique et transcriptomique, nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression de lipoprotéines agonistes TLR2 à la surface de M. Abscessus R responsables de son caractère «hyper-inflammatoire». Bien qu’appartenant au groupe des MCRs, certains éléments évoquent un comportement proche de celui des mycobactéries à croissance lente (MCLs) pathogènes. Différentes observations nous font penser que M. Abscessus serait un pathogène intracellulaire vrai. L’étude du comportement intracellulaire de M. Abscessus S/R nous a permis d’observer une croissance intracellulaire des variants S et R dans les macrophages murins, à l’inverse, aucune multiplication intracellulaire n’a pu être démontrée dans les cellules dendritiques murines. Après étude de l’acidification du phagosome, nous confirmons que sur le même modèle que les MCLs, M. Abscessus variant S entraîne un défaut d’acidification du phagosome à la fois après infection de macrophages mais aussi de cellules dendritiques. Seul le phagosome du variant R de M. Abscessus est acide au sein des macrophages. Enfin, un des résultats les plus surprenants est la mise en évidence de la sortie du phagosome dans le cytoplasme du variant S de M. Abscessus
Mycobacterium abscessus is recognized as the pulmonary pathogen inside the rapidly growing mycobacterium (RGM) group. Of interest, M. Abscessus, as other mycobacteria like M. Avium and M. Smegmatis, is able to present itself in two forms on solid agar media: a smooth variant (S) and a rough variant (R). The R variant is associated with a hyperinflammatory response but also a greater virulence in mice. Through biochemichal, proteomic and trancritptomic approaches, we demonstrated the overexpression of lipoproteinsTLR2 agonists at the surface of M. Abscessus R responsible for its hyper-inflammatory response. Although M. Abscessus belongs to the RGM group, some elements are in favor of a pathogenic behavior as the slow growing mycobacteria group. Several observations make us think that M. Abscessus is a true intracellular pathogen. The study of the intracellular behavior of M. Abscessus S /R allowed us to observe intracellular growth of S and R variants in murine macrophages; in contrast no intracellular growth was observed in murine dendritic cells. In parallel, measurements of intraphagosomal pH showed a clear difference between S and R variants, with an acidification process for the R variant as shown by its low pH in macrophages as compared to the S variant. Finally, one of the most surprising results was the observation of the phagosomal escape into the cytoplasm of the S variant of M. Abscessus

Il est établi que les œstrogènes influencent les réponses immunes et inflammatoires au cours de divers processus physiologiques et physiopathologiques. Afin de mieux caractériser les effets des œstrogènes sur le système immuno-inflammatoire, nous avons étudié les conséquences de l'exposition chronique à l'œstradiol (E2) in vivo sur les macrophages et leurs capacités de réponses inflammatoires. Des souris C57BI/6J ovariectomisées ont été traitées pendant 4 semaines avec des doses physiologiques et stables d'E2, dans le but d'étudier les réponses inflammatoires des macrophages péritonéaux suite à leur activation ex vivo par des LPS ou in vivo par l'injection de thioglycolate. Dans ces deux conditions d'activation, nous montrons que I'E2 majore l'expression de cytokines pro-inflammatoires induite par l'activation du TLR4 ou par le thioglycolate. Cet effet pro-inflammatoire de l'hormone semble être expliqué, au moins en partie, par l'inhibition de la voie de signalisation PI3K/Akt, régulateur négatif de l'activation des TLR. Nous montrons également que les concentrations endogènes d'oestrogènes sont suffisantes pour produire cet effet proinflammatoire dans les deux situations expérimentales. Enfin, des travaux sur différents modèles de souris, où l'expression du récepteur des œstrogènes alpha est invalidé soit dans l'organisme entier, soit dans le compartiment hématopoïétique ou encore exclusivement dans les cellules myéloïdes, nous ont permis de montrer que l'effet pro-inflammatoire de PE2 nécessite l'expression de ce récepteur dans les macrophages. Ces données constituent une première preuve d'un effet direct de I'E2 sur les réponses inflammatoires des macrophages in vivo
It's well established that estrogens influence immune and inflammatory responses during various physiologic and physiopathologic processes. In order to define the effects of estrogens on the immuno-inflammatory System, we have studied the consequences of a chronic exposure to estradiol (E2) in vivo on macrophages and their capacity to produce inflammatory responses. Ovariectomized C57BI/6J mice were treated for 4 weeks with physiological and stable doses of E2 to study the inflammatory responses of peritoneal macrophages, activated ex vivo by LPS or in vivo by an intraperitoneal injection of thioglycolate. In both conditions, we show that E2 exacerbates the expression of pro-inflammatory cytokines induced by the activation of TLR4 or by thioglycolate. This pro-inflammatory effect of the hormone appears to be explained, at least in part, by the inhibition of the PI3K/Akt signalling pathway which negatively regulates the TLR4 activation. We show also that endogenous concentrations of estrogens are sufficient to produce this pro-inflammatory effect in both experimental situations. Finally, experiments on different mice models, where the expression of estrogen receptor alpha is abolished either in the whole organism, in hematopoietic compartment or exclusively in myeloid cells, allowed us to conclude that the pro-inflammatory effect of E2 needs the expression of estrogen receptor alpha in macrophages. These data provide a new evidence of a direct effect of E2 on macrophage inflammatory responses

Les cellules de l'immunité innée sont impliquées dans divers processus tels que l'initiation d'une réponse inflammatoire et les mécanismes de résolution de l'inflammation. Le premier objectif de ma thèse a permis de caractériser, dans un modèle de péritonite aigüe induite par le thioglycolate, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les processus résolutifs à la fois dans la cavité péritonéale et l'omentum. Le second objectif visait à étudier la réponse inflammatoire mise en jeu au cours de la tuberculose. J'ai montré que M. Tuberculosis est capable de moduler à distance le phénotype et la fonction des monocytes, vers un profil immuno-régulateur. Ceci permettrait à la bactérie de recruter sur le site infectieux des cellules moins compétentes pour contrôler l'infection afin de favoriser sa multiplication et sa survie. Ensemble ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de l'inflammation lors de pathologies aigües et chroniques
Innate immune cells are involved in different processes such as the initiation of an inflammatory response and the resolution of inflammation mechanisms. The first part of my work characterized, in a model of acute peritonitis induced by thioglycolate, the molecular and cellular mechanisms involved during the resolutive processes both in the peritoneal cavity and in the omentum. The second part of my work aimed at studying the immune mechanisms involved during tuberculosis. I showed that M. Tuberculosis is able to remotely modulate the phenotype and the function of monocytes, towards an immune-regulatory phenotype. This would allow the bacterium to recruit to the infectious site immune cells less competent to control the infection in order to promote its own fitness. Together these results provide new insights for the understanding of the inflammatory mechanisms in acute and chronic contexts

La myélopoïèse est finement régulée au niveau métabolique. Les cellules myéloïdes (monocytes et macrophages) sont au centre de nombreuses pathologies. Ma thèse étudie le rôle du métabolisme des cellules myéloïdes dans les pathologies inflammatoires. Je me suis intéressée au métabolisme du cholestérol dans la prolifération anarchique des monocytes (cancérisation) et j’ai étudié des mutations du transporteur ABCA1 (ATP-Binding Cassette A1) impliqué dans l’efflux de cholestérol, qui sont à l’origine d’une prolifération accrue des monocytes, soulignant l’impact du métabolisme lipidique dans la régulation de la prolifération cellulaire. Le métabolisme du glucose est lui aussi impliqué dans la régulation de la myélopoïèse. Nous avons étudié le rôle du transporteur au glucose, Glut-1, dans l’athérosclérose, qui est une pathologie inflammatoire chronique. Dans ce contexte, les CSH et les progéniteurs myéloïdes sur-expriment le transporteur Glut-1, induisant une monocytose, permettant l’accumulation de macrophages dans les lésions. La déficience en Glut-1 prévient la monocytose et le développement des plaques d’athérosclérose. Je me suis intéressée au rôle de la lipase acide lysosomale (LIPA) dans la phagocytose des cellules apoptotiques (efferocytose) par les macrophages, où une grande quantité de cholestérol ingérée doit être dégradée. LIPA en est un acteur central. L’inhibition de cette enzyme provoque un stress oxydatif mitochondrial, et active l’inflammasome NLRP3, contribuant à une inflammation chronique. Cela réduit aussi l’activation des Liver-X-Receptor et induit un défaut d’efferocytose des macrophages, ce qui participe à l’apparition d’une inflammatoire chronique
Myeloid cells are produced by hematopoiesis, from hematopoietic stem cells (HSCs), a metabolically fine-tuned process. In chronic inflammatory diseases, an increased amount of monocytes is observed (monocytosis). My thesis focuses on the role of myeloid cells metabolism in chronic inflammatory diseases. We focused on the impact of cholesterol metabolism alterations into the anarchic proliferation of monocytes (carcinogenesis). Novel somatic mutations in the cholesterol efflux transporter ATP-Binding Cassette A1 induce carcinogenesis of monocytes, highlighting the impact of cholesterol efflux pathway in monocyte proliferation. I studied glycolysis in atherosclerosis, a chronic inflammatory disease. HSCs and myeloid progenitors exhibited higher Glut-1 expression in a murine model of atherosclerosis, with an enhanced accumulation of macrophages into lesions. A partial deletion of Glut-1 reduced HSCs and progenitors proliferation, limiting monocytosis and atherosclerotic plaques development. I studied the role of lysosomal acid lipase (LIPA) in the phagocytosis of apoptotic cells (efferocytosis). When a macrophage phagocytized an apoptotic cell, an important amount of cholesterol has to be degraded. LIPA is a key player in this process. When LIPA is inhibited, we observed a reduced production of 25- and 27-hydroxycholesterol, leading to an increased mitochondrial oxidative stress, which activated NLRP3 inflammasome activation and a reduced LXR activation. LIPA inhibition leads to a defective efferocytosis in vitro and in vivo. LIPA enzyme is essential to prevent metabolic inflammation by maintaining effective efferocytosis

Ce projet de thèse se propose d'évaluer le devenir, la cytotoxicité et la réponse inflammatoire pulmonaire in vitro suite à l'exposition aux nanoparticules, et plus particulièrement vis-à-vis de la région alvéolaire.Les nanoparticules étudiées sont formulées à base d'acide poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) (polymère biodégradable), stabilisées, ou non, par différents polymères de surface (alcool polyvinylique (PVA), chitosane (CS), pluronic F68 (PF68)). Les nanoparticules ont une taille d'environ 200 nm, et présentent des charges de surface neutre (PLGA/PVA), positive (PLGA/CS) ou négative (PLGA/PF68 et PLGA sans stabilisant). Des nanoparticules non-biodégradables de dioxyde de titane (TiO2) et de polystyrène ont été choisies comme contrôle positif. Pour mimer les conditions alvéolaires, la lignée cellulaire A549 d'épithélium alvéolaire humain a été utilisée en mono-culture et en co-culture en contact direct avec des macrophages différenciés de monocytes humains (lignée THP-1). Les caractérisations phénotypique et microscopique de la co-culture, ont confirmé la présence de deux types cellulaires viables et en contact. Le CD14, récepteur membranaire exprimé uniquement par les macrophages, sera utilisé pour identifier chaque sous-population cellulaire. D'autre part, l'analyse du récepteur CD54 a montré la présence d'interactions intercellulaires en co-culture : exprimé uniquement par les macrophages en mono-culture, il est exprimé par les deux sous-populations cellulaires en co-culture. Ces interactions ont été confirmées lors de la quantification des cytokines sécrétées après exposition au lipopolysaccharide: les niveaux de sécrétions en co-culture étant jusqu'à 5 fois supérieurs aux niveaux théoriques (issus de la somme des sécrétions en mono-culture).L'analyse en microscopie confocale a confirmé que les nanoparticules sont internalisées par chaque type cellulaire, Les cinétiques d'internalisation suivies en cytométrie en flux ont montré que les nanoparticules de charge de surface négative sont internalisées en plus grande quantité que les autres, quelque soit le type cellulaire, en mono ou en co-culture, selon un mécanisme énergie-dépendant. Enfin, en co-culture, les macrophages internalisent davantage de nanoparticules que les cellules épithéliales.La cytotoxicité des nanoparticules a été évaluée par la mesure de l'activité mitochondriale, l'étude de l'intégrité membranaire, et le type de mort cellulaire. Les résultats montrent qu'à faible concentration toutes les nanoparticules de PLGA induisent une cytotoxicité généralement faible (60 à 80 % de viabilité), avec une mort exclusivement nécrotique, sans induire de forts dommages à la membrane. La toxicité des nanoparticules de PLGA/CS peut être expliquée par la toxicité propre du chitosane. A forte concentration, le cas des nanoparticules de PLGA sans stabilisant mérite d'être noté, car elles n'induisent aucune cytotoxicité vis-à-vis des macrophages, contrairement aux nanoparticules stabilisées. La cytotoxicité des nanoparticules de TiO2 est plus importante, mais peu de dommages à la membrane sont causés. La réponse inflammatoire a été évaluée par la quantification des cytokines sécrétées après 24 h d'exposition aux nanoparticules (0,1 mg/mL). En mono-culture, seules les nanoparticules de PLGA/PF68 induisent une réponse inflammatoire sur les cellules A549, corrélée à leur plus grande internalisation. En co-culture, la réponse inflammatoire est peu prononcée. En revanche, ni les polymères de surface ni les nanoparticules de PLGA sans stabilisant, n'induisent de réponse inflammatoire spécifique.Ces résultats montrent la faible toxicité des nanoparticules de PLGA vis-à-vis des conditions alvéolaires, et soulignent l'importance du recouvrement de surface. En conclusion, les nanoparticules de PLGA testées présentent un fort intérêt pour une application biomédicale, modulée par l'ajustement des propriétés de surface.

L’imagerie cellulaire par imagerie par résonance magnétique (IRM) est un nouveau champ de développement de l’imagerie médicale. Elle repose sur la mise en évidence in vivo et non invasive de cellules d’intérêt chez le sujet vivant. Les macrophages sont des cellules clés du système immunitaire impliquées dans de multiples mécanismes physiopathologiques tels que l’infection et l’inflammation. Les macrophages peuvent être marqués par des agents de contraste IRM appelés Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxyde (USPIO). Ces particules sont phagocytées par les macrophages et vont induire des modifications de signal IRM des zones tissulaires présentant une infiltration macrophagique. Ces techniques d’imagerie macrophagique permettent d’une part de caractériser de façon spécifique l’infection osseuse et d’autre part de la différencier de l’inflammation stérile en raison d’une distribution différente en macrophages
Cellular imaging using magnetic resonance imaging (MRI) is an emerging new field of development of medical imaging. Cellular imaging is based on the non invasive and in vivo identification of cells of interest in living subjects. Macrophages are keys cells of the immune system and are involved in several pathologic mechanisms such as infection and inflammation. Macrophages can be labelled by MRI contrast agents called Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxyde (USPIO). Those particles are phagocytosed by macrophages and will induce MRI signal modifications in areas with macrophage infiltration. MRI cellular imaging based on USPIO macrophages labelling can be applied in infectious osteomyelitis and can allow a specific characterization of infected areas. Moreover, in reason of a different macrophages distribution, MRI macrophage imaging can allow discrimination of infection from sterile inflammation

Les pathologies inflammatoires chroniques représentent la première cause de mortalité dans le monde avec une part importante des cardiopathies et autres maladies lipido-inflammatoires telles que l’athérosclérose. Ainsi, comprendre l’ensemble des mécanismes impliqués dans l’initiation mais aussi la résolution de ces maladies représente un enjeu majeur en santé publique. Nos travaux sur l’implication des phagocytes mononucléés dans des modèles murins d’athérosclérose montrent qu’en modulant la demi-vie de certaines cellules du système immunitaire on est capable de limiter le développement de la pathologie. Ces résultats sont associés à une diminution globale de l’inflammation dans les animaux et une amélioration du métabolisme lipidique. Ainsi, moduler les acteurs de l’inflammation au sein du système immunitaire peut s’avérer une nouvelle cible thérapeutique complémentaires aux médicaments hypocholestérolémiants actuels. Dans cette optique, nous avons réalisé la plus importante caractérisation d’une pathologie humaine : le xanthogranulome. Les patients atteints montrent une association entre une dérégulation du métabolisme des lipides et l’inflammation cutanée soutenue par les macrophages et les cellules dendritiques. Le traitement par injection intraveineuse d’immunoglobulines d’une des patientes montre une réduction globale de l’inflammation, une normalisation des acteurs cellulaires sanguins qui se traduit cliniquement par une amélioration des symptômes de la pathologie
Chronic inflammatory diseases are the leading cause of death worldwide with a significant proportion of heart disease and other lipid-inflammatory disorders such as atherosclerosis. Thus, understanding the mechanisms involved in the initiation but also the resolution of these diseases is a major issue in public health. Our work on the involvement of mononuclear phagocytes in murine models of atherosclerosis show that modulating the half-life of cell subtypes of the immune system can limit the development of the pathology. These results are associated with an overall decrease of the inflammation in animals and an improvement of lipid metabolism. Thus, modulating the actors of inflammation within the immune system may be a new therapeutic target complementary to the cholesterol-lowering drugs today. To this end, we realized the most important characterization of a human pathology: the xanthogranuloma. Patients show an association between dysregulation of lipid metabolism and inflammation of the skin supported by the macrophages and dendritic cells. Treatment with intravenous immunoglobulin infusions in a patient shows an overall reduction of inflammation, normalization of blood cell actors which results in improved clinical symptoms of the disease

Les macrpophages occupent un rôle central dans les réactions inflammatooires. Une des voies d'activation des macophages passe par la glycoprotéine de surface CD23. Le CD23 est un récepteur exprimé par de nombreuses cellules hématopoietiques et épithéliales. Quand il interagit avec ses ligands, le CD23 active les macrophages pour produire divers médiateurs dont les cytokines pro-inflammatoires et le monoxyde d'azote. Une augmentation du niveau de CD23 a été rapportée dans de nombreuses maladies inflammatoires dont la polyarthrite rhumatoide. Dans ce travail, nous avons tenté de bloquer la réaction inflammatoire, soit en bloquant spécifiquement le CD23 par des peptides, soit en cherchant des molécules à pouvoir anti-inflammatoire où la quercétine s'est avérée être un excellent candidat. Les perspectives thérapeutiques ouvertes par ce travail sont très encourageantes et nous incitent à développer ces nouvelles approches thérapeutiques pour soigner les pathologies inflammatoires chroniques
The macrophages have a central place in the inflammatory reactions. One of the macrophage activation way is the CD23 glycoprotein. CD23 is a receptor expressed by variety of hematopoietic cells and tissular epithelial cells. Interaction of CD23 with his ligands activates macrophages to produce various pro-inflammatory cytokines and nitric oxide. Increased levels of CD23 have been reported in various inflammatory diseases including rheumatoid arthritis. In this work, we have tried to block the inflammatory reaction by peptides which bind CD23 and block the activation of this receptor, or with new anti-inflammatory drugs where quercetin is a potential applicant for anti-inflammatory therapy. The therapeutic perspectives open by this work are exciting and incite us to develop this new therapeutic approaches to treat the chronic inflammatory diseases

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune caractérisée par une fibrose cutanée et viscérale ainsi que par des anomalies microcirculatoires. Son origine multifactorielle et ses manifestations cliniques variées en font une maladie à la physiopathologie complexe. Cette maladie rare demeure une affection dont l’étiologie est encore inconnue et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Notre laboratoire a mis en évidence le rôle des formes réactives de l’oxygène en mettant au point un modèle animal induit par l’acide hypochloreux. Ce modèle nous a permis d’explorer différentes voies de signalisation intracellulaire, impliquées dans la formation de FRO, favorisant la fibrose. Dans ce travail, nous avons choisi d’explorer dans la sclérodermie systémique différentes voies de signalisation impliquées dans l’inflammation à l’aide d’un modèle de réaction du greffon contre l’hôte sclérodermiforme (GVH-Scl) et d’un modèle de sclérodermie induit par les formes réactives de l’oxygène. De plus, nous avons étudié l’impact de molécules ciblant ces voies afin de fournir de nouvelles données permettent d’enrichir l’arsenal thérapeutique de cette maladie, actuellement pauvre. Les souris obtenues à partir du premier modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire, une alopécie, une diarrhée et une inflammation hépatique. Une quantité importante d’auto-anticorps ainsi qu’une activation du système immunitaire sont retrouvées. Nous avons observés une activation de la voie de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, d’ERK1/2 et de Notch dans la GVH-Scl. L’inhibition de la voie de l’EGFR par l’erlotinib a montré une amélioration clinique associée à une réduction de la fibrose cutanée et de l’inflammation cutanée et hépatique. De plus, l’erlotinib agit sur le système immunitaire et restaure la proportion de LT CD4+ naïfs chez les souris malades ainsi que le taux d’auto-anticorps anti-topoisomérase 1. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine, AKT, ERK1/2 et Notch par le niclosamide améliore les symptômes de la GVH-Scl chez la souris. Nous avons noté une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire, une diminution de l’inflammation cutanée, hépatique et gastro-intestinale et une diminution de la production d’auto-anticorps. La proportion de cellules naïves parmi les LT CD4+ et CD8+ est plus élevée chez les souris malades traitées que chez les malades non traitées. Les souris du second modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire et une activation du système immunitaire accompagnée d’une production d’autoanticorps anti-topoisomérase. Nous avons retrouvé une activation des voies de signalisation de STAT3, de Wnt/β-caténine et d’AKT chez les souris sclérodermiques. Nous avons également observés une activation de la voie de signalisation de STAT6 et une surexpression de KLF4 chez ces souris malades. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine et AKT par le niclosamide améliore la fibrose cutanée et pulmonaire chez les souris sclérodermiques. Cette molécule diminue le nombre et l’activation des LB et des LT CD4+ et CD8+ ainsi que la production des auto-anticorps chez les souris malades. Le traitement de souris sclérodermique par le léflunomide, inhibiteur de STAT6, a aussi montré une amélioration de la fibrose cutanée et pulmonaire et des anomalies immunitaires présentées par les souris sclérodermiques. De plus l’inhibition de STAT6 et de KLF4 par le léflunomide inhibe la polarisation des macrophages en macrophages M2. Ainsi nous avons mis en évidence le rôle des voies de signalisation de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, de STAT6 et de KLF4 dans la physiopathologie de la sclérodermie systémique. (...)
Systemic sclerosis (SSc) is a connective tissue disorder that results in skin and inner organs fibrosis, microvascular injuries and auto-immunity. This rare disease has a complex physiopathology which is due to its multifactorial origin and its various clinical manifestations. Its etiology remains unknown and no curative treatment exists at present. Our team highlighted the role of reactive oxygen species (ROS) by developing a hypochlorous acid (HOCl)-induced mouse model of SSc. This model allowed the exploration of several intracellular signalizing pathways which were involved in ROS production and promote fibrosis. In this work, we choose to investigate inflammatory signalizing pathways in SSc with a sclerodermatous graft versus host disease (Scl-GVHD) mouse model and a ROS-induced mouse model. Moreover, we studied the effects of drugs targeting these pathways in order to reinforce data providing new therapeutics. Mice from Scl-GVHD model developed a diffuse cutaneous SSc with pulmonary fibrosis, alopecia, diarrhea and liver inflammation. Production of anti-DNA topoisomerase 1 auto-antibodies and immunological activation was also found. We observed an activation of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch signaling pathways in Scl-GVHD. Inhibition of EGFR by Erlotinib showed clinical amelioration with a decreased skin fibrosis and decreased skin and liver inflammation. Moreover, Erlotinib decreased production of activated/memory CD4+ T cells and of auto-antibody anti-topoisomerase1. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch pathways by Niclosamide reversed clinical symptoms of Scl-GVHD in mice. We observed an improvement of skin and lung fibrosis, of cutaneous, hepatic and intestinal inflammation, and a reduced production of auto-antibodies. The ratio of CD4 and CD8 naive T cells was higher in Niclosamide-treated GVHD mice than in untreated GVHD mice. Mice from HOCl-model present skin and lung fibrosis and an immune activation along with the production of auto-antibodies anti-topoisomerase. We found an activation of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT signaling pathways in HOCl-mice. We also observed an activation of STAT6 signaling pathway and an overexpression of KLF4 in these sicked mice. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT pathways by Niclosamide improves skin and lung fibrosis in HOCl-mice. This drug decreased number and activation of B cells and CD4+ and CD8+ T cells and auto-antibodies production in mice. Treatment of HOCl-mice with Leflunomide, STAT6 inhibitor, also showed an improvement of skin and lung fibrosis and of immunological abnormalities in HOCl-mice. Moreover, inhibition of STAT6 and KLF4 by Leflunomide inhibits M2 polarization of macrophages. Thus, we highlighted the role of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, STAT6 and KLF4 signaling pathways in physiopathology of SSc. Use of inhibitors of these pathways such as Etrlotinib, Niclosamide and Leflunomide, indicate a clinical and biological efficacity in mouse. These drugs allow the control of the 3 characteristic features of SSc reproduced in these animal models: fibrosis, inflammation and autoimmunity and could thus be effective in fighting the development of clinical-biological abnormalities of SSc

Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polysaccharides sulfatés qui participent à de nombreux processus physiologiques, via leurs interactions avec un large panel de médiateurs extracellulaires. Parmi ces facteurs, l’interleukine-4 (IL-4) joue un rôle central dans la polarisation M2 des macrophages. Bien que cette cytokine soit un ligand des GAGs, peu d’études ont été réalisées sur le rôle de ces interactions. Dans ce contexte, la première partie de ma thèse a porté sur le rôle des GAGs dans la polarisation M2 des macrophages. Nous avons montré que les activités de l’IL-4 sont dépendantes de sa fixation sur des GAGs 6-O-sulfatés. La sulfatation des GAGs est finement régulée par plusieurs familles d’enzymes, dont l’expression varie en fonction du type cellulaire et de l’environnement. Nous avons alors analysé les variations d’expression de ces enzymes de sulfatation au cours de la polarisation des macrophages. Nos résultats montrent qu’en fonction de leur phénotype, les macrophages expriment des GAGs différents, ce qui peut leur conférer des fonctions spécifiques. En effet, contrairement aux M1 pro-inflammatoires, les M2 sécrètent des facteurs de remodelage tissulaire et de tolérance immunitaire, ce qui peut favoriser la progression des tumeurs. Nous avons vérifié que les GAGs des M2 présentent le FGF-2 aux cellules cancéreuses, suggérant leur participation dans les mécanismes pro-tumoraux. Finalement, le dernier volet de ma thèse a porté sur le rôle des GAGs dans le cancer du sein. Nous avons confirmé que les GAGs sont de bons ligands pour les sélectines et qu’ils pourraient favoriser la promotion des métastases distantes
Glycosaminoglycans (GAGs) are sulfated polysaccharides involved in many physiological processes, through their interactions with a wide range of extracellular mediators. Among these factors, interleukin-4 (IL-4) has a central role in the M2 polarization of macrophages. Although this cytokine is a ligand of GAGs, only a few studies have been performed on the physiological role of these interactions. In this context, the first part of my thesis focused on the role of GAGs in M2 macrophage polarization. We showed that the responses induced by IL-4 are dependent on the binding to 6-O-sulfated GAGs. The reactions of GAG sulfation are tightly regulated by several families of enzymes, for which the expression is dependent on cell type and environment. Then we analyzed changes in the expression of these sulfating enzymes during macrophage polarization. Our results showed that macrophages produced different GAGs based on their phenotype, which may give them specific functions. In contrast to pro-inflammatory M1 cells, M2 macrophages release factors involved in tissue remodeling and immune tolerance, which may enhance tumor progression. We verified that GAGs are capable of presenting FGF-2 to cancer cells, thus suggesting their involvement in pro-tumoral mechanisms. Finally, the role of GAGs in breast cancer was investigated in the last part of my thesis. Our results confirmed that GAGs are good ligands for selectins, so that they could promote distant metastasis

L'endométriose est une maladie gynécologique, touchant les femmes en âge de procréer. Cette pathologie est caractérisée par la présence de tissu endométrial ectopique, c'est-à-dire en dehors de la cavité utérine. Des dysfonctions du système immunitaire sont de plus en plus souvent suspectées comme étant un des éléments responsables de la pathogenèse de cette maladie. L’objectif général de ce projet a donc été d’étudier les mécanismes cellulaires de molécules pro-inflammatoires aux propriétés variées et à l'expression anormalement élevée dans cette pathologie, que sont MIF et les prostaglandines PGE2 et PGF2α, dans les anomalies inflammatoires et invasives en cause dans cette pathologie. La première partie de nos travaux a porté sur l’étude d’un modèle murin de l’endométriose déficient du gène MIF. Le nombre et le volume des lésions collectées à partir des souris déficientes pour le gène MIF sont significativement inférieurs à ceux mesurés dans des souris sauvages utilisées comme contrôle. L’analyse par PCR des cellules isolées des lésions de souris déficientes du gène MIF a révélé une expression réprimée des protéines d’adhésion, d’inflammation et d’angiogenèse. Ces données démontrent pour la première fois que le MIF agit directement sur la croissance et la progression de lésions d’endométriose in vivo. Une partie de nos travaux a porté sur les molécules nécessaires au métabolisme de PGE2 et PGF2α dans l'endomètre eutopique des femmes normales et l'endomètre eutopique et ectopique des femmes atteintes d'endométriose. Selon nos données, l'expression de certains de ces facteurs est perturbée durant cette maladie, ce qui peut avoir des effets délétères sur la physiologie de la procréation. La stimulation des cellules ectopiques par PGF2α entraîne une libération accrue de VEGF et CXCL-8, ceci via l'induction de COX-2 et des deux variants d’épissage du récepteur FP. De plus, la PKC joue un rôle dans ce phénomène, dépendamment et indépendamment de la PLC. Par son effet inducteur sur la libération de VEGF et CXCL-8, PGF2α pourrait favoriser l'aspect inflammatoire et le développement ectopique des lésions d'endométriose, notamment par des phénomènes d’angiogenèse et de prolifération cellulaire accrus. L'effet de PGF2α sur la libération de VEGF et CXCL-8 par les cellules endométriales ectopiques pourrait également expliquer les quantités élevées de ces cytokines dans le liquide péritonéal des femmes atteintes d'endométriose, un phénomène suspecté dans l'infertilité et les douleurs associées à cette maladie. Nos derniers résultats obtenus à partir du liquide péritonéal montrent un profil cytokinique en faveur de l’angiogenèse et la prolifération des lésions d’endométriose, avec une forte augmentation des facteurs suivants : EGF, FGF-2, IL-1α, MIP-1β, TGFα, PDGF-AA, PDGF-BB, MCP-3, sCD40L, Gro Pan, IL-17α, MDC et Rantes, confortant nos observations préalables redéfinissant la maladie comme étant d’origine angio-inflammatoire. L'endométriose et ses symptômes sont des phénomènes complexes ayant probablement plus qu'une seule origine. Parmi les nombreux facteurs à l'expression altérée dans l'endométriose, notre étude montre que MIF, PGE2 et PGF2α, ainsi qu’une pléthore de facteurs pro-angiogéniques pourraient être de ceux jouant un rôle dans l'infertilité et les douleurs reliées à cette maladie.
Endometriosis is a menstrual disorders, is mainly diagnosed in the peritoneal cavity by the presence of lesions, which are thought to originate from the endometrium. Little is known about the causes of endometriosis and no targeted treatment is available. Our studies were the first to show functional defects involving the immune system in the endometrium, i.e. before this tissue migrates and grows into abnormal locations. Our current main hypothesis is that endometriosis development requires a combination of immune dysfunction involving factors, such as MIF, PGE2 and PGF2α. Using a mouse model where MIF-knock out (KO) mice received intra-peritoneal injection of endometrial tissue from MIF-KO or syngenic wild type (WT) mice and vice versa, we first revealed that MIF genetic depletion resulted in a marked reduction ectopic endometrial tissue growth, a disrupted tissue structure and a significant downregulation of the expression of major inflammatory, cell adhesion, survival and angiogenic factors relevant to endometriosis pathogenesis, whereas MIF add-back to MIF-KO mice significantly restored endometriosis-like lesions number and size. This study provides compelling evidence for the role of MIF in endometriosis development and its possible interest for a targeted treatment of endometriosis. We then revealed for the first time multiple defects in PG biosynthesis and receptivity pathways, which differ between eutopic intrauterine and ectopic endometrial tissues and may, owing to the wide spectrum of PG properties, contribute to the initial steps of endometrial tissue growth and development and have an important role to play in the pathogenesis and symptoms of this disease. Afterward, we focussed on PGF2α which markedly up-regulated PGE2, CXCL-8 and VEGF secretion in endometriotic cells, through COX-2 activation. Such an effect was abolished by AL8810, a specific FP antagonist, and significantly down-regulated after specific inhibition of FP different variants signalling pathways. PGF2α enhanced angiogenesis through endothelial tubal formation and proliferation processes. These results show for the first time that PGF2α exerts an indirect angiogenic effects by interacting with ectopic stromal cells and induces the secretion of major angiogenic factors via FP signalling pathways. This study provides evidence for a new mechanism underlying endometriosis development and pathophysiology. As our last data showed distinct patterns of peritoneal fluid cytokine concentrations in endometriotic women most notably a marked increase in EGF, FGF-2, IL-1α, MIP-1β, TGFα, PDGF-AA, PDGF-BB, MCP-3, sCD40L, Gro Pan, IL-17α, MDC and Rantes. These changes may exacerbate the local peritoneal angiogenic and proliferative reaction observed in women with endometriosis, and contributes to its pathophysiology. Inflammation is a major hallmark of endometriosis and angiogenesis is crucial to ectopic endometrial tissue growth. Once viewed as archetypical mediators of inflammation and pain, prostaglandins and angiogenic cytokines should be now regarded major promoters of endometriotic lesions growth.

Le Sepsis et le choc septique, associés à une inflammation systémique sévère et incontrôlée, sont les principales causes de mortalité dans les unités de soins intensifs. Les macrophages jouent un rôle central dans ces pathologies. Ils participent à l'initiation et à la régulation de l'inflammation. Lors d'une infection bactérienne, ils reconnaissent le LPS de la paroi bactérienne par l’intermédiaire du TLR4 ce qui déclenche l’activation des MAPK, des facteurs de transcription NF-kB et AP1 et, in fine, la production des cytokines pro-inflammatoires dont le TNF et l'IL6. L’expression de la protéine GILZ dans les macrophages limite, in vitro, la production d'IL6 et de TNF en réponse au LPS. Cet effet est attribué à une inactivation de NF-kB. D’autre part, l'expression de GILZ décroît dans les macrophages humains et murins après une stimulation par du LPS.Compte tenu des effets régulateurs de GILZ dans les macrophages, les objectifs de notre étude sont 1) de déterminer si l’expression de GILZ est altérée dans les monocytes/macrophages (M/M) au cours du Sepsis, 2) de déterminer si une modulation de l’expression de GILZ dans les M/M est suffisante pour influencer l’inflammation systémique, et 3) d’identifier le mécanisme d'action de GILZ dans les M/M humains.Nous avons mesuré l’expression de GILZ dans les M/M de patients atteints de choc septique ou de syndrome de détresse respiratoire aiguë, et dans un modèle murin d’endotoxémie. Nous avons observé une diminution significative de GILZ dans ces contextes pathologiques chez l’homme et la souris. L'impact de cette altération a été exploré dans des souris transgéniques uniques dont les macrophages surexpriment GILZ de façon non régulable. Nous avons confirmé que la surexpression de GILZ limite la production de TNF et favorise celle de l'IL-10 dans les macrophages stimulés in vitro par du LPS. Nous avons ensuite étudié la réponse inflammatoire et la survie de ces souris dans un modèle d’endotoxémie et de choc septique, et montré que cette surexpression de GILZ restreinte aux macrophages limite la production sérique de cytokines pro-inflammatoires et, par conséquent, l'inflammation systémique en améliorant significativement la survie des souris. Ces résultats mettent en évidence les conséquences, au niveau systémique, de la régulation des macrophages par GILZ.Dans l’optique d’élucider les mécanismes impliqués dans la régulation des macrophages par GILZ, nous avons confirmé que GILZ inhibe NF-kB dans les macrophages humains sans toutefois retrouver l’interaction directe décrite entre GILZ murin et la sous-unité p65 de NF-kB.Ce résultat nous a conforté dans la nécessité de caractériser l’interactome de GILZ dans les macrophages humains. Deux approches complémentaires ont été utilisées. La première est un criblage pan-génomique des interactants de GILZ humain par la technique du double-hybride. La seconde méthode consiste en une purification d'affinité en tandem (TAP-TAG) de la protéine GILZ et de ses interactants, suivie d'une identification de ces protéines par spectrométrie de masse. Ce complexe a été isolé à partir d'extraits nucléaires ou cytoplasmiques de cellules humaines différenciées en macrophages et génétiquement modifiées afin d’exprimer la protéine GILZ flanquée des deux étiquettes nécessaires à sa purification. Ces deux approches ont mis en évidence des interactions nouvelles entre GILZ et des protéines clés de la signalisation du TLR4 dans les macrophages humains ainsi qu'un rôle probable de GILZ comme facteur régulateur de la transcription.Ces résultats montrent que la régulation de la réponse anti-inflammatoire des macrophages par GILZ a un impact sur l’inflammation systémique in vivo et améliore la survie dans un modèle de choc septique sévère. De plus, ces travaux identifient pour la première fois les partenaires cytoplasmiques et nucléaires de GILZ dans les macrophages humains et devraient permettre dans le futur, une meilleure compréhension de cette protéine
Sepsis and septic shock, associated with a severe and uncontrolled systemic inflammation, are the main causes of death in intensive care units. Macrophages play a central role in these pathologies. They are involved in the initiation and regulation of inflammation. They recognize LPS from the bacterial cell wall via TLR4, which triggers the activation of MAPK signaling pathway and transcription factors such as NF-KB and AP1 and ultimately, the production of pro-inflammatory cytokines including TNF and IL6. The expression of the protein GILZ in macrophages limits in vitro the production of IL6 and TNF in response to LPS. This effect is attributed to inactivation of NF-kB. Moreover, GILZ expression decreases in human and mouse macrophages exposed to LPS.Given the regulatory effects of GILZ in macrophages, the objectives of our study were 1) to determine whether GILZ expression is down-regulated in monocytes / macrophages (M/M) in the sepsis, 2) to determine whether the modulation of GILZ expression in M/M is sufficient to influence systemic inflammation, and 3) to identify GILZ mechanism of action in human M/M.GILZ expression was measured in the M/M of patients with septic shock or acute respiratory distress syndrome, and in a murine model of endotoxemia. We observed a significant reduced expression of GILZ in these pathological contexts in human and mice. The impact of this alteration was explored in unique transgenic mouse model in which macrophages stably overexpress GILZ (CD68-GILZ).We confirmed that GILZ overexpression limits TNF production and promotes IL-10 production in in vitro LPS-stimulated macrophages. We further studied the inflammatory response and survival of these mice in models of endotoxemia and septic shock. We showed that GILZ overexpression restricted to macrophages, limits serum pro-inflammatory cytokines production, therefore decreases systemic inflammation and significantly improves mice survival. These results highlight the effects of macrophage polarization by GILZ at a systemic level.This result confirmed the need to characterize GILZ interactome in human macrophages. Two complementary approaches have been used. The first one consists of a pan-genomic double hybrid screening of human GILZ partners. The second method consists of a tandem affinity purification (TAP-TAG) of GILZ protein and its associated partners, followed by the identification of these partners by mass spectrometry. Analyses have been performed independently on nuclear and cytoplasmic extracts from human macrophage cells, genetically engineered to express GILZ protein with the two tags required for purification. This dual approach led us to identify new direct and indirect interactions between GILZ and other key proteins of TLR4 signaling pathway in human macrophages and highlight a likely role of GILZ as a transcription regulatory factor.These results confirm the anti-inflammatory role of GILZ on systemic inflammation and enhancement of lifetime in murine models of endotoxemia and septic shock. Furthermore, this work identifies for the first time the cytoplasmic and nuclear GILZ partners in human macrophages and would allow in the future, a better understanding of GILZ mechanism of action

Divers facteurs de risques ont été incriminés dans la genèse des maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI). Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les facteurs qui pourraient contribuer à la survenue de maladie de Crohn (MC) ou de rectocolite hémorragique (RCH) au sein d'une cohorte prospective. La cohorte E3N est une cohorte de 98997 femmes âgées de 40 à 65 ans, affiliées à la Mutuelle Générale de l'Education Nationale suivies prospectivement depuis 1990. Des variables liées à l'environnement étaient recueillies à l'entrée dans l'étude incluant un interrogatoire alimentaire détaillé. Des questionnaires auto administrés tous les deux ans recueillaient les évènements de vie, les maladies chroniques et cancers. Les données concernant les MICI étaient recueillies tous les deux ans jusqu'au dernier questionnaire (juin 2005). 123 femmes ont déclaré un cas d'incident de MICI après l'inclusion dans la cohorte dont 77 après remplissage du questionnaire alimentaire. Un excès d'apport de protéines était statistiquement corrélé au risque de survenue de MICI (Hazard ratio (HR) pour le 3ème vs. Le 1er tertile = 3,31 ; IC à 95 % : 1,41-7,77 ; p trend = 0,007). Cette association était exclusivement liée aux protéines animales (HR pour le 3ème vs. Le 1er tertile = 3,03 ; IC à 95 % : 1,45-6,34 ; p trend = 0,005). L'analyse des classes d'apports protéiques révélait que l'apport de viande et de poissons était corrélé à un risque élevé de survenue de MICI contrairement à l'apport d'oeufs ou de produits laitiers. Par ailleurs, sur l'ensemble de cette cohorte, une forte exposition solaire surtout en hiver, était associée à une diminution du risque de MC (HR pour le 3ème vs. Le 1er tertile = 0,46 ; IC à 95 % : 0,22 à 0,98 ; p trend = 0,03) mais pas de RCH. L'ajustement sur l'activité physique, le tabagisme, la prise de traitements hormonaux, l'index de masse corporelle et le niveau socio-économique ne modifiaient pas notablement ces deux principaux résultats. Une analyse multivariée (prenant en compte le niveau d'UV, la consommation de protéines, l'apport en vitamine D et l'apport calorique) incluant les patientes atteintes de MC ayant rempli le questionnaire alimentaire à l'inclusion (n = 35) et les non cas (n = 70987) était effectuée. Le risque de MC était diminué chez les femmes qui avaient un niveau élevé d'exposition solaire (HR = 0,32 ; IC à 95 % : 0,13 à 0,81 ; p trend = 0,01 et celles qui avaient un apport élevé en vitamine D (HR = 0,40 ; IC à 95 % : 0,15 à 1,03 ; p trend = 0,07).

Les tachykinines, neuropeptides presents dans les voies aeriennes, suscitent un interet croissant en raison de leurs effets bronchoconstricteurs et pro-inflammatoires qui en font des co-facteurs possibles de l'hyperreactivite bronchique. Le but de notre travail a ete de rechercher l'implication des tachykinines dans l'hyperreactivite et les phenomenes inflammatoires des voies aeriennes observes dans deux modeles experimentaux chez le cobaye: un modele de bronchoconstriction et d'hyperpermeabilite vasculaire par inhalation d'un agent anti-parasitaire, l'isethionate de pentamidine et un modele d'hyperreactivite bronchique en reponse a un agent infectieux, l'endotoxine. L'endotoxine inhalee est en outre un puissant stimulant de l'afflux de polynucleaires neutrophiles retrouves dans le lavage broncho-alveolaire et nous avons evalue le role des tachykinines dans cet afflux. Pour avancer dans la comprehension de l'effet des tachykinines sur les cellules inflammatoires, nous avons etudie la capacite des tachykinines a faire secreter par les macrophages alveolaires des metalloproteinases de la matrice extra-cellulaire, molecules qui pourraient etre impliquees dans l'hyperreactivite bronchique et l'deme pulmonaire lesionnel. Dans ce travail, nous avons montre que les tachykinines jouent un role dans les effets bronchoconstricteurs de l'isethionate de pentamidine, mais ne semblent pas directement responsables de l'hypermeabilite vasculaire observee apres inhalation de cet irritant. Nous avons aussi montre que les tachykinines etaient impliquees dans l'hyperreactivite bronchique et l'afflux de cellules inflammatoires observes apres administration intra-tracheale d'endotoxine. Enfin, nous avons mis en evidence l'effet stimulateur des tachykinines pour la secretion de gelatinase/collagenase de type iv par le macrophage alveolaire et montre que le recepteur nk#2 etait implique dans cet effet. Ces resultats sont en accord avec ceux de plusieurs autres etudes montrant egalement l'implication des tachykinines dans les effets broncho-pulmonaires observes dans d'autres modeles chez le cobaye et le rat. Ils confirment l'importance des interactions existant entre le systeme nerveux autonome et les cellules inflammatoires

L'etude de la liaison des oxicams aux differentes proteines plasmatiques, realisee en dialyse a l'equilibre, montre que ces medicaments se lient fortement et principalement a la serum albumine humaine. Ils se lient preferentiellement au site de l'azapropazone et plus faiblement au site du diazepam. Selon l'oxicam considere, le modele mathematique (scatchard ou stchiometrique) qui decrit le mieux l'interaction albumine-oxicam n'est pas le meme. Ainsi pour les thienothiazines (tenoxicam et lornoxicam), la meilleure evaluation des parametres est obtenue avec le modele stchiometrique, suggerant un processus d'induction allosterique de l'albumine lors de leur liaison. La liaison des benzothiazines (isoxicam, piroxicam, meloxicam) se fait sans modification allosterique. Les forces impliquees dans ces interactions ont aussi ete determinees par une etude thermodynamique ainsi que par l'evolution de la titration de l'albumine en presence ou en absence d'oxicam. La liaison au site principal, site i, est pour tous les oxicams entropie dependante, temoin d'une interaction hydrophobe. Au site secondaire, site ii, la liaison a l'albumine est soit entropie dependante (tenoxicam, lornoxicam, isoxicam), soit enthalpie dependante (meloxicam, piroxicam)

Les pathologies inflammatoires chroniques représentent la première cause de mortalité dans le monde avec une part importante des cardiopathies et autres maladies lipido-inflammatoires telles que l'athérosclérose. Ainsi, comprendre l'ensemble des mécanismes impliqués dans l'initiation mais aussi la résolution de ces maladies représente un enjeu majeur en santé publique. Nos travaux sur l'implication des phagocytes mononucléés dans des modèles murins d'athérosclérose montrent qu'en modulant la demi-vie de certaines cellules du système immunitaire on est capable de limiter le développement de la pathologie. Ces résultats sont associés à une diminution globale de l'inflammation dans les animaux et une amélioration du métabolisme lipidique. Ainsi, moduler les acteurs de l'inflammation au sein du système immunitaire peut s'avérer une nouvelle cible thérapeutique complémentaires aux médicaments hypocholestérolémiants actuels. Dans cette optique, nous avons réalisé la plus importante caractérisation d'une pathologie humaine : le xanthogranulome. Les patients atteints montrent une association entre une dérégulation du métabolisme des lipides et l'inflammation cutanée soutenue par les macrophages et les cellules dendritiques. Le traitement par injection intraveineuse d'immunoglobulines d'une des patientes montre une réduction globale de l'inflammation, une normalisation des acteurs cellulaires sanguins qui se traduit cliniquement par une amélioration des symptômes de la pathologie.

Dans la première partie de ma thèse nous nous sommes intéressés à l'étude de la résistance de M. Abscessus aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Nous avons démontré la présence de quatre différentes mutations dans i la partie 3'du gène rrs (T1406A, A1408G, C1409T and G1491T) qui code pour TARN 16S de l'opéron ARNr, et qui est présent en une seule copie chez M. Abscessus. Ces mutations conféraient un niveau élevé de résistance (>1 mg/ml) aux 2 deoxystreptamine aminoglycosides testés (kanamycine, amikacine, gentamycine et tobramycine) mais ne conférait pas de résistance à la streptomycine. Nous avons ensuite démontré le caractère récessif de ces mutations après avoir clone les différents gènes rrs mutés indépendamment dans les quatre positions (T1406A, A1408G, C1409T et G1491T) dans le vecteur réplicatif pNBVl-ZeoR et avoir transformé la souche sauvage de M. Abscessus. Dans un dernier point nous nous somme intéressés à l'étude de coût conféré par ces mutations parraport à la croissance de M. Abscessus, phénomène assez fréquent chez les bactéries multi-résistantes à plusieurs antibiotiques. Nos résultats montrent que dans nos conditions expérimentales les mutations ne conféraient pas de « coût » à la croissance de la bactérie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai mis au point un procédé dans le système de mutagénèse utilisé pour la construction de mutants chez M. Abscessus (système de recombineering adapté pour M. Abscessus par Dr Medjahed Halima, et qui a fait l'objet de sa thèse), ce procédé permettait de s'affranchir des isolats spontanés rencontrés. Ces outils m'ont permis de construire un mutant du gène mmpL4b dans la souche isogénique M. Abscessus 390S. Ce gène joue potentiellement un rôle dans le transfert des glycopeptidolipides (GPL) vers la surface cellulaire de la bactérie, la souche mutante M. Abscessus AmmpL4b présente un phénotype rugueux, alors que la souche sauvage possède un phénotype lisse. La complémentation par le gène sauvage mmpL4b restaure le phénotype muqueux de la souche sauvage M. Abscessus 390S(S). Ensuite j'ai montré que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b perdait la faculté de se mouvoir par glissement sur milieu solide. Le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b ainsi que la souche complémentée ont été utilisées dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Dr Thomas F Byrd (New-Mexico, USA), cette équipe a montré que le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b était incapable de former des biofilmes contrairement à la souche sauvage et à la souche complémentée par le gène sauvage ΔmmpL4b. En outre, cette équipe a démontré le rôle des glycopeptidolipides (GPL) dans la virulence de M. Abscessus au niveau cellulaire. En effet, les résultats obtenus montrent que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b (qui produit un taux faible de GPL) pouvait se répliquer dans les macrophages et à stimuler le récepteur toll-like 2 des macrophages (TLR2), alors que les souches sauvage et complémentée n'activaient pas le récepteur TLR2 des macrophages
My thesis work was focused on the study of M. Abscessus resistance to aminoglycoside drugs, including kanamycin, amikacin gentamycin and streptomycin. In this study, we reported the presence of four mutations affecting the gene coding for the 16S rRNA (rrs) within a single rRNA operon, these mutations conferred drugs résistance to M. Abscessus. Besides the substitution A1408G (E. Coli numbering) found in earlier study i found three new substitutions T1406A, ; C1409T and G1491T conferring high level résistance to kanamycin, amikacin and gentamycin (MICs > 1000 ug/ml) but not to streptomycin. These mutations were shown to confer the same drugs résistance profil in clinical isolates of M. Tuberculosis (7). On the other hand, by complementing the different spontaneous mutants of M. Abscessus with wild-type rrs gene cloned into replicative plasmid pNBVl, l showed that these mutations are recessive compared to the wild type rrs gene. The absence of the three new mutations found in this study in clinical isolates of M. Abscessus, led us to consider their potential fitness cost. Our data showed that these mutations are no-cost (the mutations have no effect on the fitness of M. Abscessus) in our in-vitro competition System. This work lead to a publication submitted to Antimicrobial Agents and Chemotherapy journal this month. Another part of my project concerns the optimization of the recombineering System; this System was successfully used in M. Abscessus to generate mutants. However its low effkiency (7% of double cross over DCO) led us to develop a better System in order to improve the method. Three major phenomenons are responsible for the low level of the double cross-over (DCO) event in M. Abscessus : singles cross over (SCO), illegitimate recombination and the presence of spontaneous kanamycin resistant isolates. I have replaced the antibiotic résistance cassette kanamycin by zeocin (a Bleomycin family of antibiotic) in order to suppress the spontaneous background, in the linear construct used to make the homologous recombination; our System improved the method (15-20 % of double cross-over). In the final part of my project I have constructed by using the optimized recombineering System a mutant in mmpL4b gene in 390S isogenic strain of M. Abscessus and have complemented this M. Abscessus mmpL4b knock out strain by cloning the gene mmpL4b into replicative vector pNBVl and transforming the mutant strain with the construct pNBVl mmpL4b. The product of this gene is predicted to be involved in the transport of GPL to the cell surface. The mutant has rough phenotype (deprived from glycopeptidolipids (GPL) at the cell surface) the complemented strain has a smooth phenotype like the wild-type M. Abscessus 390S strain. I have shown that unlike the wild type and complemented strains, The mmpL4b deletion mutant lost sliding motility, demonstrating a role of the glycopeptidolipids in conferring motility. In collaboration with Dr Thomas F Byrd's group, we have shown that the M. Abscessus 390S mmpL4b knock out strain lost the ability to form biofilm. Importantly, the deletion mutant has regained the ability to replicate in macrophage and stimulate macrophage toll-like receptor 2. This study indicates that a single genetic change associated with loss of GPL is sufficient to convert M. Abscessus to a virulent phenotype. This study lead to a publication submitted this month to Microbiology Journal

L'αfoetoproteine (afp) est produite par le fœtus pendant l'ontogenèse et le foie pendant des régénérations actives. L'-1 acide glycoprotéine (AGP), principalement synthétisée par le foie, a un taux très élevé lors de la phase aigue des infections. Ces deux glycoprotéines naturelles du sérum humain ont un rôle physiologique partiellement défini. Dans notre laboratoire, nous avons démontré que ces glycoprotéines inhibent in vitro l'infection par VIH-1 de macrophages dérivés des monocytes humains en culture (mdm). Le but de notre étude a été de déterminer les mécanismes possibles d'inhibition de cette infection par l'AFP et l'AGP. Nous avons démontré dans ce mémoire que l'AFP et l'AGP se lient spécifiquement aux mdm. Ces liaisons impliquent des sites de forte affinité caractérisés respectivement par des kda de 5 nm et 16 nm, et des sites de faible affinité caractérisés respectivement par des kda de 100 nm et 4,6 m. De plus, l'AFP et l'AGP se lient spécifiquement au corécepteur ccr5 du vih-1 exprime à la membrane des mdm, et leurs glycines sont impliquées dans leurs liaisons à ces cellules. L'AFP et l'AGP constitueraient ainsi, à des concentrations physiologiques des mécanismes de défenses naturelles contre l'infection par VIH-1. L'identification des domaines de l'AFP et l'AGP impliques dans leur liaison aux macrophages, ainsi que ceux de ccr5 intervenant dans le positionnement de ces glycoprotéines devront être définis afin d'élaborer de nouvelles constructions de synthèse, inhibitrices de l'infection par VIH.

La régulation dynamique de la synthèse des protéines en fonction des besoins de la cellule facilite son adaptation face aux fluctuations de l’environnement. Malgré l’importance de la régulation de la traduction au cours du processus d’expression des gènes, l’impact de ce mécanisme sur des processus biologiques fondamentaux, comme la mise en place d’une réponse immunitaire, reste mal compris. Grâce au développement de nouvelles technologies basées sur l’utilisation du séquençage à haut débit, comme le ribosome profiling, il est désormais possible d’étudier en détails la façon dont la synthèse des protéines est contrôlée. Le monosome vs polysome footprinting est une nouvelle méthode qui permet d’étudier la traduction des ARN messagers (ARNm) selon leur association avec un seul ribosome (monosome) ou avec plusieurs ribosomes (polysomes). Au cours de ma thèse, j’ai identifié les paramètres essentiels pour la mise en place d’une expérience de monosome vs polysome footprinting donnant des résultats fiables en utilisant des macrophages primaires dérivés de la moëlle osseuse de souris. Je me suis intéressée à ce type de cellules immunitaires particulier car elles présentent une grande capacité à détecter des modifications dans leur environnement et à modifier leur taux d’expression de protéines en fonction des signaux reçus. Leur grande plasticité est notamment essentielle pour assurer leurs diverses fonctions de protection de l’organisme, comme le déclenchement et la résolution de la réponse inflammatoire. La méthode de monosome vs polysome footprinting ayant été initialement développée chez la levure, son utilisation avec un modèle d’étude différent a nécessité de nombreuses modifications du protocole. Suite à cette phase de développement technologique, j’ai pu confirmer que les monosomes, une population de ribosomes historiquement considérés comme inactifs, sont activement impliqués dans le processus de traduction dans les macrophages primaires de souris. Les données obtenues ont également permis d’identifier des caractéristiques communes entre les ARNm enrichis dans les monosomes chez la levure et dans les macrophages murins. La régulation de la synthèse des protéines via l’association à des monosomes ou à des polysomes pourrait donc être un mécanisme conservé chez les organismes eucaryotes. Enfin, le travail d’optimisation réalisé dans les macrophages primaires murins ouvre la possibilité d’étudier l’effet de la régulation de la traduction sur la mise en place et la résolution de la réponse inflammatoire de façon très détaillée
The dynamic regulation of the protein synthesis process participates in the cell adaptation to a constantly evolving environment. Despite its critical role in gene expression regulation, the understanding of translational control in fundamental biological processes, such as immune responses, is still incomplete. The implementation of new approaches based on deep sequencing can be used to fill the gap in the knowledge of protein synthesis regulation. Notably, monosome vs polysome footprinting is an innovative approach derived from ribosome profiling that allow the characterization of 80S footprints derived either from monosomes or polysomes associated ribosomes. In this work, I identified the key parameters required to obtain a robust picture of ribosomal densities across cellular mRNAs using monosome vs polysome footprinting in murine primary bone-marrow derived macrophages (pBMDM). These immune cells are particularly interesting to study protein synthesis regulation in evolving conditions as they display a high sensitivity towards their environment and have the ability to trigger different gene expression programs depending on external cues. Their high phenotypic plasticity is in fact essential to ensure their protective functions in the organism such as the triggering and the resolution of the inflammatory response. As monosome vs polysome footprinting was initially developed in yeast, the adaptation of this method to study murine immune cells required extensive optimizations. The resulting protocol developed in this work was used to confirm that, contrary to a long lasting belief in the scientific community, murine pBMDM monosomes are actively involved in the translation process. Interestingly, we were able to recapitulate similar observations to what was previously observed in yeast regarding the features of mRNAs preferentially bound to monosomes or polysomes in murine pBMDM. This could suggest that the differential trafficking of ribosomes depending on specific features of the cellular mRNAs is a conserved mechanism of translational control. Importantly, the distribution of ribosomes across the different mRNAs is not random and the proper ribosome allocation pattern could be critical to adapt protein synthesis levels to the cellular needs. Here we developed a robust strategy to study this overlooked transcript-specific mechanism of translational control. Moreover, our optimized protocol can now be used to study the impact of translation through monosomes or polysomes at different stages of the inflammatory response in murine macrophages

Les synucléinopathies et les tauopathies sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une accumulation anormale et une agrégation des protéines α-synucléine et Tau, respectivement. La neuroinflammation joue un rôle central sur les fonctions physiologiques et l’agrégation de ces deux protéines. Parallèlement, au cours de la maladie de Parkinson, on retrouve les inclusions d’α-synucléine tout au long du tractus digestif et de nombreuses études ont mis en évidence la présence d’une inflammation intestinale chez les patients parkinsoniens. Dans ce contexte, nous avions émis l’hypothèse que l’inflammation intestinale pourrait altérer la régulation de ces deux protéines, mener à leur agrégation et possiblement leur propagation vers le SNC, et que le concept de synucléinopathie entérique pourrait s’étendre aux tauopathies. Ainsi, les objectifs de notre projet visaient à étudier le rôle de l’inflammation intestinale aiguë et chronique sur la régulation et l’agréation de l’α-synucléine et Tau. Nous avons montré, in vitro et in vivo, qu’une inflammation intestinale aiguë régulait à la baisse l’α-synucléine via une voie p38 dépendante. Inversement, dans des biopsies de patients Crohn, nous avons observé une régulation à la hausse de l’α-synucléine et de Tau, en l’absence de formes pathologiques. Cette régulation n’était pas liée à un mécanisme transcriptionnel mais serait due à une diminution de la dégradation de ces deux protéines via une voie NRF2/NDP52 dépendante. Ainsi, nos travaux suggèrent que l’inflammation intestinale altère l’expression de ces deux protéines clés et pourrait, sur le long terme, participer à leur pathogénicité
Synucleinopathies and tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by abnormal accumulation and aggregation of the proteins α-synuclein and Tau, respectively. Neuroinflammation plays a central role in the physiological functions and aggregation of these two proteins. During Parkinson's disease, α-synuclein inclusions are found throughout the digestive tract and many studies have shown the presence of intestinal inflammation in Parkinson's patients. In this context, we hypothesized that intestinal inflammation could alter the regulation of these two proteins and that the concept of enteric synucleinopathy could extend to tauopathies. Thus, the objectives of our project aimed to study the role of acute and chronic intestinal inflammation on the regulation and aggregation of α-synuclein and Tau. We have shown, in vitro and in vivo, that acute intestinal inflammation downregulates α-synuclein via a p38 pathway, and that this regulation is specific to enteric neurons. On the other hand, in biopsies of Crohn’s disease patients, we have observed an upregulation of α-synuclein and Tau, in the absence of pathological forms. This regulation was not linked to a transcriptional mechanism but to a decrease in the degradation of these two proteins throughout a NRF2/NDP52 pathway. Therefore, our work suggests that intestinal inflammation dysregulates the expression of these two key proteins and could, in the long term, contribute to their pathogenicity

Le macrophage est une des cellules effectrices des réactions de défense de l'organisme contre les infections. Mais les macrophages ne sont capables de s’opposer à la multiplication des microbes à developpement intacellulaire et les cellules tumorales que s'ils sont dans un état activé. Nous avons montré que l'action cytotoxique des macrophages activés vis-à-vis de cellules de nastocytome P815 dépend de l'intégrité des structures membranaires spécialement susceptibles à la trypsine. Nous avons d'autre part recherché les modifications apportées au profil de glycosylation des protéines macrophagiques lors. Du phénomène d'activation nous avons démontré que l'activation s'accompagne d'une réduction de 30 à 40 du taux d'acide sialique; 2) d'une réduction, hezles protéines N-glycosylées, des chaines deglycanes detypecomplexe au profit deglycanes hybrides ou oligomannosidiques. Une augmentation du nombre de résidus mannose et de galactose exposés à la surface des macrophages pourrait modifier leur capacité d'interaction avec les parasites et les cellules tumorales. Pour l'expression d'une activité cytotoxique, les macrophages sont activés, par l'application séquentielle de 2 stimuli (injection de dimycolate de tréhalose (TOM) puis traitement in vitro par le LPS). Nous avons recherché quelle était la contribution propre de chacun de ces 2 signaux pour l'induction d'une activité microbicide vis-à-vis d'une bactérie à croissance intracellulaire comme le BCG: le TOM induit une activité anti-BCG qui s'exprime in de façon transitoire; le traitement par le LPS renforce et/ou prolonge l'activité microbicide des macrophages. L'eau oxygénée que les macrophages-TOM sont capables d'émettre ne semble pas très responsable de l'arrêt de la croissance du BCG; par contre, les lysats de macrophages activés ont une activité bactériostatique.

Il existe plusieurs types d’agressions environnementales : biologiques (virus, bactéries…), chimiques (gaz, fumées, métaux…), physiques (bruits, rayonnements…), et d’autres telles que le stress par exemple. L’appareil respiratoire, qui représente une interface majeure avec l’environnement, est particulièrement vulnérable vis-à-vis de ces agressions, qui ont souvent des conséquences pulmonaires, pouvant parfois conduire au décès. Le tabac notamment est la cause de près de 100 millions de décès au cours du XXème siècle d’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), et sera la cause d’environ un milliard de décès au prochain siècle. L’exposition à la fumée de cigarette engendre une inflammation chronique et est souvent corrélée au développement de cancers (1), mais induit aussi de nombreuses autres pathologies pulmonaires telles que la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO)
There are several types of environmental attacks: biological (viruses, bacteria …), chemical (gases, smokes, metals …), physical appearances (rumours, brilliances …), and others such as the stress for example. The respiratory system, which represents a major interface with the environment, is particularly vulnerable towards these attacks, which often have lung consequences, being able to sometimes lead to the death. The tobacco in particular is the cause of about 100 million deaths during the XXth century according to the World Health Organization (WHO), and will be the cause about a billion deaths in the next century. The exhibition in the smoke of cigarette engenders a chronic inflammation and is often correlated in the development of cancers (1), but also leads of numerous

L’efficacité des anticorps anti-TNFα peut être particulièrement affectée par leur immunogénicité. Elle se traduit par la production d’anticorps dirigés contre la protéine thérapeutique (ADA) et induisant des effets indésirables. Pour l’adalimumab (Humira®), qui est l’anti-TNFα le plus utilisé, ce phénomène est observé chez plus de 30% des patients pour certaines pathologies. Les épitopes T responsables de cette immunogénicité sont principalement localisés dans les régions CDR impliquées dans l’interaction avec le TNFα. L’objectif de ce travail est de retirer les séquences épitopes T de l’anticorps sans altérer sa fonctionnalité. Afin de maitriser ce problème d’immunogénicité, ces travaux de thèse proposent d’utiliser le Yeast Surface Display (YSD) afin de contrôler la fonctionnalité de l’anticorps tout au long du processus de mutagénèse. Pour cela, une première étape de comparaison des différents formats d’expression d’anticorps en YSD a permis de définir le format d’affichage à utiliser pour la suite du projet. La stratégie de déimmunisation adoptée ensuite est basée sur la suppression des épitopes T. Dans un premier temps, elle réunit une approche de mutagénèse exhaustive (DMS) et l’utilisation d’algorithme afin d’identifier les substitutions délétères pour l’interaction HLA II/épitope T, mais neutre pour la fonction de l’anticorps. Dans un second temps, ces substitutions sont combinées dans des banques pré-enrichies en mutants fonctionnels. Des mutants ayant une immunogénicité potentielle réduite ont ensuite été sélectionnés à partir de ces banques. Plusieurs mutants de l’adalimumab à l’immunogénicité réduite selon l’algorithme de prédiction ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent tous une affinité augmentée pour le TNFα se traduisant par une activité au moins doublée par rapport à l’adalimumab
Efficacy of anti-TNFα antibodies is well known to be affected by their immunogenicity. Some patients developp anti-drug antibodies (ADA) which can elicit adverse effects and neutralize the therapeutic protein. Adalimumab (Humira®), which is the most used anti-TNFα, is reported to be immunogenic for more than 30% of patients in some diseases. T-cell epitopes that account for its immunogenicity are mostly carried by regions implied in the interaction with TNFα. In the present work, we propose to remove T-cell epitopes from the antibody sequence while maintaining its functionality.To undertake this issue, this PhD project uses Yeast Surface Display (YSD) to monitor the affinity of the biologic during the mutagenesis process. To do so, a comparison of different expression formats of antibody in YSD has been performed in order to define the format that will be used for the deimmunization method. Then, the strategy chosen to reduce immunogenicity is based on T-cell epitopes removal. First, it merges deep mutational scanning and in silico HLA II binding prediction to identify substitutions deleterious for HLA II/T-cell epitopes interaction while neutral for the function of the biologic. Secondly, these substitutions were combined to obtain libraries pre-enriched with functional sequences. Mutants with reduced immunogenic potential were then selected from these libraries. Several mutants of adalimumab with reduced immunogenicity potential according to HLA II binding prediction were identified and caracterized. All of them show an increased affinity for TNFα associated with an improvement of activity of at least two fold in comparison to adalimumab

Les monocytes/macrophages sont des réservoirs majeurs du VIH-1 qui, contrairement aux lymphocytes T, sont plus résistants à la mort cellulaire, lors de l'infection par le VIH-1. Les macrophages infectés sont encore détectés aux phases tardives de la maladie alors que les lymphocytes T deviennent indétectables. De plus, grâce à leur capacité à pénétrer dans les tissus, les macrophages servent de réservoirs viraux dans les tissus infectés, permettent la transmission du virus à de nouvelles cellules cibles et produisent différentes cytokines, modulant ainsi les fonctions des cellules cibles ainsi que la réplication virale. Le macrophage joue donc un rôle essentiel dans la pathogenèse de l'infection à VIH-1. Des protéines virales, telles que Tat, Nef et Vpr sont détectées dans le sérum des patients et pourraient moduler l'état d'activation des macrophages infectés par le VIH-1. --- Au cours de nos travaux, nous avons ainsi montré que les protéines exogènes Nef et Vpr, présentes toutes les deux dans le sérum des patients infectés par le VIH-I, activent le facteur de transcription NF-kB. (. . . ) Les facteurs de transcription AP-1 et NF-kB, activés par Vpr et Nef exogènes, présentent des éléments de réponse au niveau du LTR du VIH -1. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de ces deux protéines sur la transcription et la réplication virale. (. . . ) L'activation de ces deux facteurs de transcription est également associée à une augmentation de la réplication virale. Nous avons ainsi montré que Nef et Vpr exogènes activent la réplication du VIH-l dans les cellules promonocytaires chroniquement infectées U1. De plus, Vpr stimule également la réplication dans des macrophages primaires infectés par différentes souches virales du VIH -1. Nous avons ainsi pu montrer que les protéines virales, détectées dans le sérum des patients, peuvent jouer le même rôle que certaines cytokines dans la progression de la maladie, en stimulant, de manière faible mais permanente, la réplication du provirus dans les réservoirs macrophagiques. --- Nous nous sommes également intéressés à la stimulation des différentes voies d'activation des macrophages primaires au cours d'une infection bactérienne, pathologie détectée fréquemment chez des patients infectés par le VIH-1. (. . . ) Nous avons ainsi montré que HDAC3 contrôle la production de certaines cytokines proinflammatoires, telles que le TNFα, par une modulation de la voie p38/ATF2. --- L'ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre les mécanismes d'activation des macrophages au cours de l'infection par le VIH-1

Un large spectre de bactéries pathogènes est capable d'interagir avec la cellule hôte via des microdomaines membranaires appelés radeaux lipidiques. Après l'invasion, certaines bactéries transitent vers la voie de l'autophagie. Dans ce travail, j'ai examiné le mécanisme d'entrée de la bactérie entéroinvasive Yersinia pseudotuberculosis dans les macrophages. Après avoir utilisés les radeaux lipidiques, la bactérie détourne la voie de l'autophagie pour se répliquer. Les autophagosomes contenant les bactéries présentent également des composants de ces microdomaines lipidiques. Lors de l'infection, la maturation de l'autophagosome est bloquée et l'inhibition de l'autophagie induit une mort cellulaire par apoptose. Cette étude présente un mécanisme original de subversion de la voie d'autophagie par un pathogène avec des conséquences majeurs sur la compréhension des mécanismes de défense et de l'immunité

A travers l'évolution, les agents pathogènes ont développé des stratégies leur permettant de survivre au sein de leur hôte en interférant avec la biogénèse des phagolysosomes. Comme C. burnetii vit dans un phagosome acide incapable de fusionner avec les lysosomes et que sa virulence est associée à l'expression de son LPS, nous avons étudié le rôle du LPS de C. burnetii dans le détournement de la conversion phagosomale. En effet, nous avons montré que C. burnetii virulent ainsi que son LPS se localisent dans des compartiments Lamp-1+ qui n'acquièrent pas la CathepsineD et Rab7 n'est pas recruté à leur surface. Contrairement au LPS du variant avirulent de C. burnetii, qui est localisé dans les lysosomes, le LPS de C. burnetii virulent (vLPS) n'induit pas l'activation de la MAPKinase p38, empêche le recrutement de Rab7 à la surface des compartiments en déstabilisant le complexe HOPS. Finalement, nous avons démontré que la bactérie virulente exprimant le vLPS détourne la conversion phagosomale pour survivre et pour se multiplier dans les macrophages en évitant l'activation de l'axe MAPK-p38/Vps41-HOPS. Nous avons également étudié les mécanismes permettant à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple, de se répliquer dans les macrophages puisque les macrophages sont la cible in vivo de cette bactérie. Nous avons montré que T. whipplei bloque la conversion de son phagosome
Through evolution, pathogens have developed strategies to survive within their host by interfering with the biogenesis of phagolysosomes. As it is known that C. burnetii lives in acidic phagosome which is unable to fuse with the lysosomes and that its virulence is associated with the expression of LPS, we studied the role of C. burnetii LPS in hijacking of phagosomal conversion. Indeed, we showed that the virulent C. burnetii and its LPS are located in Lamp-1+ compartments which do not acquire CathepsineD and Rab7 is not recruited to their surface. Contrary to LPS of avirulent C. burnetii, which is located in the lysosomes, the LPS of virulent C. burnetii (vLPS) does not induce activation of the p38 MAPKinase and it prevents the recruitment of Rab7 to the surface of compartments by destabilizing the HOPS complex. Finally, we demonstrated that virulent bacteria expressing virulent LPS hijack phagosomal conversion to survive and multiply in macrophages by preventing activation of p38-MAPK/Vps41HOPS axis. We also studied the mechanisms by which Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease, replicates in macrophages, which are its target in vivo. We have shown that T. whipplei blocks the conversion of its phagosome. Indeed, after purification of phagosomes containing-T. whipplei, we observed by Western blot and confocal microscopy that T. whipplei survives in an immature phagosome with characteristics of both early and late phagosomes (presence of Rab5 and Rab7) making it unable to fuse with lysosomes. As the IL-16 is known to induce replication of T. whipplei, we studied the effect of this cytokine on the phagosome biogenesis of T. whipplei

La galactosémie congénitale est une maladie métabolique affectant la voie du galactose. En effet, l'enzyme responsable de la transformation du galactose-1-phosphate en glucose-1-phosphate, la galactose-1-phosphate uridyltransférase, est déficiente et rend donc l'utilisation du galactose par l'organisme quasiment impossible. Ceci entraîne une accumulation de galactose ainsi que ses produits dérivés, le galactose-1-phosphate et le galactitol. Ainsi, notre hypothèse de travail est que les métabolites impliqués dans cette pathologie provoquent des modifications post-traductionnelles des protéines induisant ainsi leur vieillissement prématuré. Nous avons donc étudié l'impact de la « galactation » sur la structure du collagène de type I et montré que ces modifications structurales sont beaucoup plus importantes avec le galactose qu'avec le glucose à la même concentration, aussi bien sur la structure primaire que fibrillaire. Au contact du collagène « galacté », les fonctions des cellules inflammatoires sont modifiées. La technique de spectroscopie infrarouge a été utilisée pour caractériser les métabolites impliqués dans la galactosémie ainsi que les collagènes modifiés. Dans un but de dépistage, une étude en spectroscopie infrarouge de plasmas galactosémiques nous a permis de mettre en évidence le potentiel de cette technique, du fait de sa bonne sensibilité et de son faible coût de revient. En conclusion, les modifications post-traductionnelles des protéines semblent très fortement impliquées dans la physiopathologie de la galactosémie congénitale
The congenital galactosemia is a metabolic disease involved in the galactose pathway. Indeed, the enzyme responsible of the galactose-1-phosphate transformation in glucose-1-phosphate, the galactose-1-phosphate uridyltransferase, is deficient and then leads to a use of galactose almost impossible. This leads to an accumulation of galactose and its derived products, the galactose-1-phosphate and the galactitol. Thus, our work hypothesis is that metabolites involved in this disease cause post-translational modifications of proteins inducing their premature aging. We then studied the impact of the « galactation » on the type I collagen and showed that the structural modifications are more important with galactose than with glucose at the same concentration, on both the primary and the fibrillar structure. On contact with « galacted » collagen, the inflammatory cells functions are also modified. The infrared spectroscopy technique has been used to characterize the metabolites involved in the galactosemia, just as the modified collagens. With the aim of screening, an infrared spectroscopy study of galactosemic plasmas allowed us to highlight the potential of this technique, with its good sensibility and its low cost price. To conclude, the post-translational modifications of proteins seem strongly involved in the physiopathology of the congenital galactosemia