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Dissertations / Theses on the topic 'Protéines transmembranaires'
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Paulet, Damien. "Variation d'hydrophobicité et structure secondaire des protéines transmembranaires." Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13518/document.
Full textAbstract:
Contexte. Les protéines transmembranaires ont une importance considérable tant au niveau de la survie d'une cellule qu'au niveau de ces interactions avec les autres cellules. En raison de contraintes techniques, la cristallisation de ce type de protéine demeure très complexe, ce qui limite grandement l’exploration de leur structure. Pour contourner ces difficultés, différents outils de prédiction ont été développés,en se fondant originellement sur l'hydrophobicité des régions enfouies dans la membrane. Méthode. L'outil développé repose sur une dérivation de la moyenne d'hydrophobicité calculée sur deux ensembles de taille de fenêtres. Le premier ensemble (G1) contient des petites tailles de fenêtres ce qui correspond à des événements locaux, tandis que le second (G2) correspond à des tailles de fenêtres plus larges, adaptées à la taille des hélices formant certaines protéines transmembranaires. La variation d'hydrophobicité est obtenue en dérivant les moyennes d'hydrophobicité. Un consensus est établi pour chaque groupe, et les résultats sont comparés à un ensemble de protéines transmembranaires cristallisées. Résultats. Les variations d'hydrophobicité G2 sont liées aux extrémités des hélices transmembranaires,tandis que les variations G1 sont en relation avec la limites des structures et certaines irrégularités structurelles.Ces résultats nous ont amené à introduire une nouvelle notion : les unités transmembranaires(TMU). Les TMU consistent en un ensemble de sous-structures qui composent les structures transmembranairesBackground. Few high-resolution structures of integral membranes proteins are available, as crystallization of such proteins needs yet to overcome too many technical limitations. Nevertheless, prediction oftheir transmembrane (TM) structure by bioinformatics tools provides interesting insights on the topology of these proteins.Method. We describe here how to extract new information from the analysis of hydrophobicity variations or hydrophobic pulses (HPulses) in the sequence of integral membrane proteins using the Hydrophobic Pulse Predictor, a new tool we developed for this purpose. To analyze the primary sequence of 70 integralmembrane proteins we defined two levels of analysis : G1-HPulses for sliding windows of n=2 to 6 andG2-HPulses for sliding windows of n=12 to 16.Results. The G2-HPulse analysis of 541 transmembrane helices allowed the definition of the new conceptof transmembrane unit (TMU) that groups together transmembrane helices and segments with potentialadjacent structures. In addition, the G1-HPulse analysis identified helix irregularities that correspondedto kinks, partial helices or unannotated structural events. These irregularities could represent key dynamicelements that are alternatively activated depending on the channel status as illustrated by the crystalstructures of the lactose permease in different conformations. Our results open a new way in the understanding of transmembrane secondary structures : hydrophobicity through hydrophobic pulses stronglyimpacts on such embedded structures and is not confined to define the transmembrane status of aminoacids
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Tran, Van-Du Thuong. "Modélisation et prédictionde la structure super-secondaire des protéines transmembranaires canaux-beta." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2011. http://www.theses.fr/2011EPXX0104.
Full text
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Tran, Thuong Van Du. "Modélisation et prédiction de la structure super-secondaire des protéines transmembranaires canaux-beta." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2011. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00711285.
Full textAbstract:
Les protéines transmembranaires canaux-β (TMBs) se trouvent dans les membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries ainsi que des chloroplastes. Elles traversent entièrement la membrane cellulaire et exercent différentes fonctions importantes. Vu qu'il y a un petit nombre des structures des TMBs déterminées, en raison des difficultés avec les méthodes expérimentales, il est douteux que ces approches puis- sent bien trouver et prédire les TMBs qui ne sont pas homologues avec celles connues. Nous construisons un modèle de graphe pour la classification et la prédiction de structures super-secondaires permutées des TMBs à partir de leur séquence d'acides aminés, en se basant sur la minimisation d'énergie. Le modèle ne dépend essentiellement pas de l'apprentissage. Les algorithmes sont rapides, robustes avec des performances com- parables à celles des meilleures méthodes actuelles qui utilisent l'apprentissage. Cette méthode peut être donc utile pour le screening des génomes. Outre la performance de prédiction et de classification, cette étude donne une vue plus profonde de la structure des TMBs en tenant compte des contraintes physicochimiques des membranes biologiques. Les structures permutées prédites peuvent aussi aider à mieux comprendre le mécanisme du repliement des TMBs.
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Perret, Jason. "Clonage, expression et caractérisation de récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 1992. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/212891.
Full text
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Espesset, David. "Formation du canal ionique de la colicine A et inhibition par la protéine d'immunité : une affaire d'hélices transmembranaires." Aix-Marseille 1, 1995. http://www.theses.fr/1995AIX11033.
Full textAbstract:
La colicine a est une toxine produite par des enterobacteries et active sur des souches apparentees. Son mode d'action peut etre divise en trois etapes: la reception a la surface de la bacterie-cible, la translocation a travers l'enveloppe de cette bacterie, et la formation, dans la membrane cytoplasmique, d'un pore ionique dependant du potentiel electrique. Chacune de ces etapes est assuree par un domaine structural distinct dans la molecule de colicine, et c'est le domaine c-terminal qui porte l'activite letale ; c'est egalement ce domaine qui est reconnu et inactive dans la membrane interne par la proteine d'immunite, qui est le second partenaire en jeu dans ces recherches. Cette these presente l'etude de la facon dont la colicine a s'insere dans la membrane cytoplasmique des bacteries-cibles, soit pour les tuer, soit pour y etre en quelque sorte capturee par la proteine d'immunite. Apres la presentation de l'etendue actuelle des connaissances liees au couple colicine/immunite, ainsi que sur les aspects ayant trait a l'interaction d'une proteine avec une structure membranaire: exportation, machinerie de translocation, assemblage, stabilite, en insistant particulierement sur l'aspect fonctionnel plus que structural, la seconde partie sera reservee a l'analyse des resultats obtenus, dans le cadre de l'activite letale de la colicine a et de celle, protectrice, de la proteine d'immunite ; ces resultats sont classes dans l'ordre suivant: premierement, les relations structure-fonction des proteines d'immunite ; deuxiemement, le mode d'insertion membranaire du domaine c-terminal de la colicine a in vivo ; et troisiemement, l'interaction directe entre colicine et proteine d'immunite
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Gidon-Jeangirard, Carole. "Etude des relations entre les mouvements transmembranaires de phosphatidylserine, la vésiculation membranaire et l'apoptose." Paris 11, 1999. http://www.theses.fr/1999PA11T032.
Full textAbstract:
Dans la cellule « au repos », les phospholipides constitutifs de la membrane plasmique sont répartis de manière asymétrique entre les deux feuillets. La phosphatidylsérine (PhtdSer) est majoritairement séquestrée dans le feuillet cytoplasmique. Lors d'un remaniement membranaire, consécutif au déclenchement d'un processus apoptotique, à des stimulations procoagulantes ou pro-inflammatoires, la PhtdSer est exposée à la surface de la cellule. Une surcharge transitoire du feuillet externe peut alors conduire à l'émission de microparticules (MPs) exposant la PhtdSer à leur surface et porteuses d'antigènes de la cellule dont elles sont issues. Ces MPs sont ainsi capables de catalyser les réactions de la coagulation du sang et de véhiculer des messages biologiques. La première partie de 1'exposé des travaux est constituée de deux études qui ont mis en évidence un potentiel anti-apoptotique de l'annexine V, protéine de 37 kDa présentant une très forte affinité pour la PhtdSer. Ce travail a été réalisé sur la lignée humaine lymphocytaire T CEM. Dans la première étude nous avons évalué la possibilité de moduler le déroulement d'un programme de mort en imposant une contrainte externe sur la membrane plasmique de la cellule contrecarrant la vésiculation. L'annexine V a été choisie comme modulateur potentiel de l'apoptose en raison de sa capacité à former un réseau bidimensionnel constituant une sorte d'exosquelette s'ancrant sur les surfaces phospholipidiques et limitant le bourgeonnement membranaire. Cette protéine, de forte affinité pour les phospholipides anioniques, est en effet connue pour sa capacité à bloquer la libération de MPs plaquettaires sans empêcher l'exposition de PhtdSer. Cette étude a permis de mettre en évidence la capacité de l'annexine V à retarder la mort programmée par apoptose in vitro et in vivo dans un modèle murin. La capacité de l'annexine V à former un canal calcique et le résultat de ce premier travail nous ont conduit à examiner, dans la deuxième étude, les modifications du calcium cytosolique au cours de l'apoptose des cellules T CEM. En effet, le calcium est décrit comme l'un des médiateurs universels de l'apoptose et constitue un messager secondaire majeur. Les variations des flux calciques associées à l'apoptose et à son inhibition par l'annexine V nous ont amené à considérer l'effet d'autres annexines. L'annexine V interfère dans le processus apoptotique par sa capacité à former un exosquelette mais aussi en intervenant dans la signalisation intracellulaire puisqu'elle entraîne une augmentation de calcium cytosolique supplémentaire à celle observée au cours de l'apoptose induite. L'annexine I possède elle aussi un potentiel anti-apoptotique mais celui-ci n'est pas associé à une variation du calcium cytosolique. La deuxième partie des travaux présente une étude réalisée, exclusivement in vivo, dont le but était de déterminer l'association entre la vésiculation membranaire et les pathologies inflammatoires de l'intestin et d'en rechercher sa signification physiopathologique à l'aide d'un système de capture sur annexine V insolubilisée. Des taux élevés de MPs circulantes ont été détectés chez les patients atteints de maladie de Crohn comparés à ceux d'une population contrôle et d’individus atteints de recto-colite hémorragique. Ces MPs circulantes sont principalement d'origine plaquettaire et endothéliale. Ces résultats démontrent qu'en dépit du caractère localisé de l'affection, il peut y avoir des taux élevés de MPs dans la circulation systémique qui permettraient justement de discriminer ces deux maladies inflammatoires de l'intestin. L'exposition de PhtdSer et la vésiculation membranaire sont impliqués dans un grand nombre de processus physiopathologiques. L'étude des mécanismes impliqués dans la libération de MPs par les cellules stimulées ou apoptotiques et de leur rôle potentiel dans la communication intercellulaire est d'un intérêt certain. Dans cette approche, les annexines, et l'annexine V en particulier, semblent constituer des outils exceptionnels. Quant aux MPs, elles s'avèrent être des marqueurs biologiques des altérations cellulaires, pertinents à la fois pour le diagnostic de certaines affections et pour l'évaluation de la réponse à des traitements visant soit à induire la mort cellulaire soit à la prévenir.
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Giguère, Patrick. "La [bêta]-arrestine plus qu'une simple protéine adaptatrice dans la signalisation des récepteurs à sept segments transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPGs)." Thèse, Université de Sherbrooke, 2006. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4224.
Full textAbstract:
Bien que les [bêta]-arrestines soient connues comme étant des régulateurs négatifs de la signalisation engendrée par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), de nouvelles données indiquent qu'elles pourraient posséder des fonctions additionnelles en tant que protéines accessoires à large spectre régulant le trafic intracellulaire et la signalisation. Il a récemment été proposé qu'un complexe de signalisation associé aux récepteurs à sept domaines transmembranaires, soit formé avant d'atteindre la membrane plasmique, permettant ainsi la signalisation à d'autres localisations mais établissant également un autre mode de régulation du transport de ces récepteurs. Nos travaux mettent en évidence la formation d'un complexe multimoléculaire associé au récepteur du thromboxane A2 (TP[bêta]) comprenant les protéines ARF6 et ARNO. Nos résultats montrent également que le rôle important de ARF6 dans l'endocytose du TP[bêta] est dépendant de l'activation de la protéine G[alpha]q et implique une interaction directe entre les protéines G[alpha]q et ARNO. Dans le but de mieux comprendre le mécanisme par lequel ARF6 régule la signalisation et l'endocytose du TP[bêta], nous avons identifié de nouveaux partenaires pouvant chaperonner ce complexe. En plus de l'interaction entre les protéines G[alpha]q et ARNO, nous rapportons que G[alpha]q s'associe avec toutes les GEFs de ARF6, par l'intermédiaire d'une région commune de ces GEFs qui est le domaine"coiled-coil". De plus, nos travaux montrent que la [bêta]-arrestine lie G[alpha]q et G[alpha]s, suggérant que cette interaction pourrait réguler diverses fonctions des RCPGs. Nos travaux ont permis d'élaborer un mutant des [bêta]-arrestines par lequel cette interaction est interrompue de façon spécifique, ce qui a permis d'étudier son comportement vis-à-vis certains récepteurs. En premier lieu, nous avons mis en évidence que cette interaction régule le transport antérograde de récepteurs couplés à G[alpha]q et G[alpha]s mais non de ceux couplés à G[alpha]i, démontrant ainsi une sélectivité de reconnaissance. En second lieu, le mutant d'arrestines module de façon négatif la durée de l'activation des protéines Erk1/2. Cet effet semble être causée par la diminution de la force du signal engendrée par la perte d'expression de surface du récepteur causé par le mutant d'arrestine. Cependant, nos travaux ne nous permettent pas d'écarter la possibilité que le mutant perturbe directement la séquestration des Erk1/2 dans le cytoplasme, les exposant ainsi à l'inactivation par les MAPK phosphatases. Nous proposons, dans cette thèse, un nouveau mode de régulation du trafic et de la signalisation des récepteurs à sept domaines transmembranaires.
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Gaffet, Patrick. "Mouvements transmembranaires des phospholipides au cours de l'activation plaquettaire "in vitro"." Montpellier 2, 1995. http://www.theses.fr/1995MON20018.
Full textAbstract:
La perte de l'asymetrie phospholipidique dans la membrane plasmique est un des evenements majeurs de la reponse plaquettaire lors d'une activation. L'utilisation d'analogues paramagnetiques et fluorescents des phospholipides endogenes a permis l'etude des mouvements transmembranaires des phospholipides au cours de l'activation. Durant l'activation plaquettaire, l'inhibition de la translocase est correlee avec l'augmentation de la concentration calcique intracellulaire. Le changement de forme (formation de filopodes) est un phenomene dependant de la reorganisation du cytosquelette (polymerisation de l'actine et de la tubuline). La liberation de vesicules procoagulantes apparait comme un evenement consecutif au flux net des phospholipides du feuillet interne vers le feuillet externe et a la proteolyse du cytosquelette sous membranaire par la calpaine. L'absence de relation de cause a effet entre les evenements de l'activation (vesiculation, reorganisation et proteolyse du cytosquelette, formation de filopodes, inhibition de la translocase) et le deplacement massif et rapide des aminophospholipides (phosphatidylserine et phosphatidylethanolamine) du feuillet interne vers le feuillet externe, ainsi que la specificite de ce deplacement, permettent de proposer l'existence d'une activite catalytique membranaire du type aminophospholipide floppase activee par l'augmentation de la concentration intracellulaire en calcium lors de l'activation
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Galvagnion, Céline. "Etude structurale de la protéine de translocation et de ses domaine hélice - boucle - hélice transmembranaires par RMN en solution." Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066085.
Full textAbstract:
La protéine de translocation (TSPO) est une protéine membranaire (18kDa) principalement impliquée dans la translocation du cholestérol dans les mitochondries, étape limitante dans la biosynthèse de stéroïdes. L’objectif général de mon projet de thèse est d’établir les propriétés structure – fonction de TSPO. D’une part, l’étude structurale de TSPO a été réalisée dans différents environnements mimétiques membranaires en présence d’un ligand exogène très affin, PK11195 et a permis de mettre en évidence des conditions de solubilisation permettant l’acquisition de données RMN hétéro-nucléaires et multidimensionnelles, essentielles à la détermination de la structure de cette protéine membranaire. D’autre part, des domaines hélice – boucle – hélice de TSPO ont été étudiés afin d’obtenir des informations structurales et fonctionnelles sur la protéine à l’échelle de ces domaines. Un modèle 3D du domaine TM45, comportant le site d’interaction avec le cholestérol est proposé et discuté
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Bassé, François. "Mouvements phospholipidiques transmembranaires et formation de vésicules au cours de l'activation plaquettaire." Montpellier 2, 1992. http://www.theses.fr/1992MON20267.
Full textAbstract:
La repartition transverse asymetrique des phospholipides (pls) dans la membrane plasmique est modifiee lors de l'activation plaquettaire. L'apparition de phosphatidylserine sur la face externe engendre le caractere procoagulant de la surface plaquettaire. Cette perte d'asymetrie est accompagnee de la formation de vesicules et de la proteolyse du cytosquelette. L'utilisation d'analogues paramagnetiques de pls a permis l'etude de l'activite de l'aminopl translocase, ainsi que les deplacements transmembranaires des pls au cours de l'activation plaquettaire. Les resultats indiquent: i) l'inhibition ca2+-dependante de l'activite aminopl translocase, ii) un flux massif (50%) et rapide (1 min) des aminopls de la face interne vers la face externe, correle a l'activite procoagulante, iii) l'absence de flux plique reciproque, de l'exterieur vers l'interieur, iv) l'independance de ces phenomenes vis-a-vis de la formation des vesicules. De plus, nous montrons que les vesicules sont sans doute issues de la fragmentation des filopodes. Nous proposons un modele qui rassemble differents evenements de l'activation, dans lequel la perte d'asymetrie, couplee a la proteolyse du cytosquelette, induit la formation de vesicules. Ces travaux sont, a notre connaissance, la premiere etude quantitative et cinetique des deplacements pliques au cours de l'activation plaquettaire
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Ciczora, Yann. "Rôles fonctionnels des domaines transmembranaires des glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2 du virus de l'hépatite C." Lille 2, 2006. http://www.theses.fr/2006LIL2S064.
Full textAbstract:
Le virus de l’hépatite C (VHC) code pour deux protéines d’enveloppe E1 et E2 associées sous forme d’hétérodimères. Les résidus chargés du domaine transmembranaire (TMD) de E2 (D728 et R730) n’ont pas la même contribution dans les différentes fonctions des TMDs. Bien que ces deux résidus soient nécessaires à la rétention de E2 dans le réticulum endoplasmique, l’acide aspartique est essentiel à la formation des hétérodimères. De plus, la mutation des résidus chargés du TMD de E2 altère l’infectiosité du virus. Nous avons effectué une mutagenèse de substitution tryptophane de chacun des résidus de ces domaines. Nous avons ainsi montré qu’en plus du résidu D728, les glycines 354 et 358 sont en partie responsables de la formation des hétérodimères E1E2. Enfin, nos observations indiquent que les TMDs de E1 et E2 sont impliqués dans l’entrée virale, et notamment dans une étape précoce de la fusion entre les membranes virale et cellulaireHepatitis C virus (HCV) encodes two envelope glycoproteins, E1 and E2 associated as heterodimers. These proteins are essential for virus infectivity. The two charged residues (Asp728 and Arg 730) of transmembrane domain (TMD) of E2 do not contribute equally in the glycoprotein functions. The two charged residues are required for ER retention, but only the aspartic acid is necessary for heterodimerization. Moreover the mutation of this charged residues affects the entry functions of these proteins. We have done a tryptophane scanning mutagenesis of each residue of these segments. The Asp728 and the two glycine residues (Gly354 and Gly358) are required for the formation of the heterodimer. Moreover other residues (Lys370, Leu726, Ala727, Ala729) are also implicated in these interactions. Finally, our observations indicate that the TMDs are also involved in virus entry. Indeed, some mutants of the TMDs of E1 and E2 affected an early step of the fusion between the viral and cell membrane
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Gendrin, Claire. "Étude de l’adressage des protéines GRAs transmembranaires de Toxoplasma gondii aux granules denses et de leur insertion membranaire post-sécrétoire." Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10285.
Full textAbstract:
Parmi les mécanismes de survie intracellulaire connus, l’export de protéines solubles ou transmembranaires visant à modifier différents compartiments de la cellule-hôte est une stratégie employée par de nombreux pathogènes. Chez Toxoplasma gondii, il a été montré que les granules denses (GD) constituent la voie de sécrétion par défaut pour les protéines solubles. Par contre, le tri de protéines transmembranaires vers les GD et leur maintien sous forme soluble avant insertion membranaire post-sécrétoire font appel à des mécanismes originaux qui ont fait l’objet de ces travaux. Chez le Toxoplasme, la protéine de GD GRA5 est adressée à la membrane de la vacuole parasitophore (MVP) après sécrétion. Exprimée en cellules de mammifères, GRA5 est adressée à la membrane plasmique avec une topologie de type I, ce qui démontre la particularité des mécanismes de sécrétion chez T. Gondii. Par une approche basée sur des protéines chimériques présentant des domaines spécifiques de GRA5 et d’une protéine transmembranaire de la membrane plasmique parasitaire (MPP), nous avons pu identifier les déterminants de l’adressage à la MPP versus à la MVP. Nous avons ainsi pu démontrer que le domaine Nt de GRA5 est impliqué dans l’adressage soluble aux GD et est essentiel pour l’insertion membranaire post-sécrétoire dans la MVP. Ces résultats, qui ont été étendus à une autre protéine GRA transmembranaire (GRA6), divergent de l’idée largement répandue selon laquelle les signaux d’adressage des protéines transmembranaires seraient présents dans la queue C-terminale et/ou dépendraient de la longueur du domaine transmembranaire de ces protéinesThe success of many intracellular pathogens relies on the export of both soluble and membrane-bound proteins that are destined to modify various compartments of the host cell. In Toxoplasma gondii, it is well established that the dense granules (DG) constitute the default constitutive pathway for soluble proteins. By contrast, the mechanism by which transmembrane proteins are sorted to the DG and are maintained in a soluble state while adopting a transmembrane topology after secretion is not known. The GRA5 DG protein of T. Gondii is targeted to the parasitophorous vacuole membrane (PVM) after soluble secretion. Expression of GRA5 in mammalian cells revealed that the protein is targeted to the cell surface with a type I topology, providing evidence that soluble trafficking of GRA5 within the parasite is peculiar. By using chimeric proteins containing specific domains of GRA5 and of a parasite plasma membrane (PPM) targeted transmembrane protein, we investigated which are the determinant(s) of PPM versus PVM targeting. We demonstrated that the GRA5 Nt domain is involved in soluble targeting within the DG and is essential for insertion into the PVM. These results, that were extented to another transmembrane GRA protein (GRA6), contrast with the broad acceptance that sorting signals are present within the cytoplasmic tail of membranous proteins and/or depend on the size of their transmembrane domain
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Yaqub, Tahir. "Étude de l'interaction entre les domaines transmembranaires du récepteur du polypeptide insulinotrope glucose-dépendant (GIP) et la région amino terminale du peptide." Toulouse 3, 2009. http://www.theses.fr/2009TOU30314.
Full textAbstract:
Le récepteur du polypeptide insulinotrope glucose-dependant (GIP-R), membre de la sous-famille B des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), module la régulation des fonctions physiologiques et métaboliques de l'organisme telles que l'homéostasie glucidique et lipidique. Ces propriétés font du récepteur du GIP une cible thérapeutique potentielle pour le traitement du diabète sucré et de l'obésité. Le développement de nouveaux agents pharmacologiques, notamment des ligands non peptidiques du récepteur du GIP, constitue un enjeu important. Les mécanismes moléculaires responsables de l'activation des récepteurs de la famille B ne sont cependant pas bien compris, même si un mécanisme d'activation général en deux étapes a été postulé pour ces récepteurs. Cependant, les acides aminés qui participent au processus d'activation restent encore à définir. L'objectif majeur du projet de recherche était d'identifier le site de liaison du GIP-R humain en caractérisant précisément les principaux résidus du récepteur en interaction fonctionnelle avec les acides aminés du domaine N-terminal du GIP, connu pour correspondre au domaine d'activation du GIP. Par modélisation moléculaire, des modèles de complexes GIP. GIP-R ont été construits, sur la base des alignements multiples de séquences des récepteurs et des ligands. La partie contenant les domaines transmembranaires du récepteur du GIP a été modélisée par homologie sur la base des coordonnées du cristal du récepteur adénosine A2A. Puis, le modèle correspondant au cristal du complexe comprenant le GIP lié au domaine extracellulaire du récepteur GIP a été " docké " sur la partie transmembranaire du récepteur du GIP. Les acides aminés du récepteur identifiés comme étant en interaction avec le N-terminal du GIP ont été mutés. L'analyse pharmacologique des mutants a démontré que l'Arg183 et l'Arg190 de l'hélice transmembranaire II (TMH-II), l'Arg300 du TMH-V et la Phe357 du TMH-VI étaient importants pour l'activation du récepteur. En effet la mutation de ces acides aminés a entrainé une diminution significative de la capacité du récepteur à induire la formation d'AMPc. Une caractérisation plus poussée de ces mutants, ainsi que des tests utilisant des analogues du GIP dont certains résidus ont été substitués par une alanine, ont démontré l'interaction du Glu3 du GIP avec l'Arg183 du GIP-R. Nous avons également préparé du GIP (1-30)-Alexa-F-647 et vérifié sa capacité à stimuler le récepteur avec une puissance équivalente au GIP(1-30). Le peptide fluorescent a été ensuite utilisé pour démontrer que tous les récepteurs mutés étaient exprimés à la surface cellulaire HEK293 à un niveau similaire de celui du WT-GIP-R, ceci grâce à des expériences de cytométrie en flux et de microscopie confocale. Nous présentons donc un modèle du complexe GIP. GIP-R identifiant les résidus et les hélices du récepteur qui sont impliqués dans le processus d'activation, ainsi que leurs interactions avec les acides aminés de l'extrémité N-terminale du peptide. En outre, la région N-terminale du GIP se place à l'intérieur dune poche formée par les hélices transmembranaires 2, 3, 5 et 6 du récepteur, notamment du fait de l'interaction de Glu3 avec l'Arg183 du récepteur et de la Tyr1 biologiquement cruciale du GIP avec la Gln224 (TMH-3), l'Arg300 (TMH-5) et la Phe357 (TMH-6) du récepteur. Ce modèle validé expérimentalement représente une étape importante vers la compréhension du mécanisme d'activation du GIP-R qui devrait faciliter la conception rationnelle d'agents thérapeutiquesGlucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIP-R), a member of subfamily B of G-protein coupled receptor (GPCR), modulates the regulation of important physiologic and metabolic functions in the body such as glucose and lipid homeostasis that make it a potentially attractive therapeutic target for new pharmacological agents such as non-peptide ligands for the treatment of diabetes mellitus and obesity. However, the molecular mechanisms responsible for receptor activation are poorly understood in receptors belonging to family B. Although a general two step activation mechanism has been postulated for family B receptors yet the precise residues of the receptor that participate in the process remain to be delineated. One of the principal objectives of my research project was to identify the binding site of human GIP-R by precisely recognizing the residues that are implicated in interactions with the amino acids of the critically important N-terminal bioactive domain of the hormone that has been shown to be responsible for receptor activation. GIP. GIP-R complex models were constructed, based on multiple sequence alignments of both receptors and the ligands and the in-silico docking of the peptide using Adenosine A2a receptor as template for transmembrane domain of receptor while also taking X-ray structural data on the interaction of GIP and GIP-R ECD into consideration. Residues of the receptor identified to be involved in interaction with the ligand were subjected to site-directed mutagenesis. The pharmacological activity assays of the mutants demonstrated that Arg183 and Arg190 in TMH2, Arg300 in TMH5 and Phe357 in TMH6 were important determinants for receptor activation as demonstrated by their significant decrease in potency to induce cAMP formation, a measure of ligand induce receptor activation. Further characterization of these mutants, including tests with alanine substituted GIP analogues, demonstrated interaction of Glu3 in GIP with Arg183 in GIP-R. Furthermore, they strongly supported a binding mode of GIP to GIP-R in which the N-terminal moiety of GIP was sited within transmembrane helices 2, 3, 5, and 6 with biologically crucial Tyr1 interacting with Gln224 (TMH3), Arg300 (TMH5) and Phe357 (TMH6) of the receptor. We also prepared and ascertained the ability of GIP (1-30)-Alexa- F-647 to stimulate the receptor in comparison to GIP (1-30) and found that both activated the receptor with equal potency. The fluorescent peptide was then used to demonstrate that all the mutated receptors were expressed at HEK293 cell surface at levels similar to that of the WT-GIP-R by performing Flow cytometery and Confocal microscopy. We therefore present a model for GIP. GIP-R pin pointing the exact residues and the helixes involved of the receptor involved in activation process and the interactions with their partner amino acids in the N-terminal of the peptide. This experimentally validated model represents an important step towards understanding activation mechanism of GIP-R which should facilitate the rational design of therapeutic agents
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Arpel, Alexia. "Développement préclinique de peptides thérapeutiques transmembranaires appliqués au traitement du cancer du sein." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ050/document.
Full textAbstract:
Le domaine transmembranaire des récepteurs membranaires est aujourd’hui considéré comme essentiel dans l’activation et la régulation des voies de signalisation sous-jacentes. Ceci est tout particulièrement le cas pour neuropiline-1 et -2 (NRP1/2), et ErbB2, trois récepteurs impliqués dans la croissance tumorale. Notre laboratoire a initialement démontré qu’un peptide ciblant le domaine transmembrane du récepteur NRP1, bloque l’oligomérisation de ce récepteur et provoque ainsi l’inhibition de la prolifération/migration des cellules tumorales et l’angiogenèse in vivo. L’objectif principal de ce travail de thèse était d’élargir cette stratégie aux récepteurs membranaires NRP2 et ErbB2, et ce, dans le contexte du cancer du sein. Mes travaux montrent que ces peptides inhibent la pousse tumorale et les métastases associées dans différents modèles de cancer du sein. Les effets anti-tumoraux peuvent s’expliquer par les propriétés anti-angiogéniques et anti-prolifératives des peptides démontrées in vitro et in vivo. J’ai également disséqué le mécanisme d’action du peptide ErbB2 et montré que le peptide inhibiteur de NRP2 induit des effets secondaires rédhibitoires (promotion des métastases osseuses). Dans l’ensemble, mes recherches valident le potentiel thérapeutique de cette stratégie peptidique et renforce l’idée d’un développement clinique de ces composés. D’une terre inconnue à une terre d’espoir, le cœur de la membrane est incontestablement une nouvelle source d’inspiration pour le développement des médicaments de demainThe role of transmembrane domains (TMD) in membrane receptor activation and regulation is nowadays appearing as a key step of cell signaling. This has been indeed evaluated for neuropilin-1 and -2 (NRP1/2) and ErbB2 receptors, three membrane receptors whose signaling has clearly been implicated in tumorigenesis. Our team had demonstrated that a synthetic peptide blocking the transmembrane domain of NRP1 blocked NRP1-dependent signaling leading to the inhibition of glioma cell proliferation/migration and tumor associated angiogenesis in vivo. The major goal of this thesis project was to extend this novel strategy to NRP2 and ErbB2 in the breast cancer context. Thus, I was able to demonstrate for the first time that the use of peptides, inhibiting the TMD of these receptors, was able to inhibit tumor growth and related metastases in vivo, in three different breast cancer mouse models that I have developed in the laboratory. These results were supported by in vitro experiments demonstrating anti-proliferative and anti-angiogenic properties of these peptides. Besides, I was able to dissect the mechanism of action of the peptide targeting ErbB2 receptor in vitro and in vivo, and I provided data excluding NRP2 as a target because of an unexpected promotion of bone metastasis. Altogether, my data offer convincing evidences to further develop MTP-ErbB2 and MTP-NRP1 peptides as novel therapeutic compounds for patients suffering metastatic cancers. From terra incognita to the exploration of a world of hope, the heart of the membrane is becoming a new promising estate for drug design
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Sawma, Paul. "Rôle des domaines transmembraires dans les interactions helice-helice des protéines membranaires bitopiques." Thesis, Aix-Marseille, 2013. http://www.theses.fr/2013AIXM4031.
Full textAbstract:
Les protéines membranaires représentent environ le tiers des gènes dans les différents génomes séquencés. La prépondérance de ce type de protéines en terme de cibles thérapeutiques (50 % des médicaments) ainsi que leur implication dans beaucoup de phénomènes cellulaires tel que la transduction d'énergie, le transport de nutriments et la signalisation reflètent leur importance. Les interactions entre protéines membranaires jouent un rôle primordial dans leur structure, leurs fonctions et leur assemblage en complexes. La fonction de la plupart des protéines membranaires est liée à l'assemblage de leurs segments transmembranaires TMs dans la bicouche lipidique. Les segments TMs sont des morceaux de séquences majoritairement hydrophobes d'environ 20 résidus adoptant une structure en hélice alpha. En fait, les interactions entre hélices TMs sont essentielles pour le repliement des protéines membranaires et leur organisation dans la membrane. Pour cette raison, des interactions qualitatives entre domaines TMs de différentes protéines bitopiques ont été caractérisé en utilisant le système du double hybride bactérien (BACTH) basé sur une complémentation protéique de type adénylate cyclase. Ce système a révélé des interactions homo- et hétérologues entre des domaines TMs appartenant à deux familles de récepteurs humains, la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique à activité tyrosine kinase (EGFRs) et les NeuropilinesMany cellular and biochemical processes/activities are actually carried out by the complexome, which is defined as a set of protein complexes. Identification and characterization of the complexome are essential for a comprehensive understanding and global visioning of cell functions since protein-protein interactions are the core of an entire interactomics system of any living cell. Membrane proteins make up to 30% of proteomes in eukaryotes and prokaryotes. They form a major class of proteins that are essentially involved in vital processes including bioenergetics, signal transduction, cell adhesion, catalysis and so on. Thus, they also represent more than 50% of all currently available drug targets. The function of most membrane proteins is inextricably linked to the proper packing and assembly of their transmembrane (TM) segments in the lipid bilayer. So, deciphering the contribution of TM domains interaction in the assembly of protein complexes will help to understand the dynamic assembly of membrane proteins complexes which are most important in cell signaling. For this reason, qualitative interactions between the TM domains of different bitopic proteins have been characterized using the bacterial adenylate cyclase complementation assay (BACTH). This system has been successfully adapted in the lab to study the homo- and heteromeric associations of selected TM sequences, using well characterized interactions as controls. Moreover, BACTH has revealed TM interactions of two major classes of mammalian membrane receptors, the family of epidermal growth factor receptors (EGFRs) which belongs to receptor tyrosine kinases (RTKs) superfamily and the neuropilins
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Chadli, Meriem. "Développement de la technologie "transMembraChip" : biopuces à membranes pour la réinsertion et le criblage d'agonistes / antagonistes de protéines membranaires." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1118.
Full textAbstract:
Ces travaux de thèse concernent le développement d'une biopuce à membranes permettant de réincorporer de manière fonctionnelle une protéine transmembranaire de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), CXCR4, dans une bicouche lipidique attachée et espacée sur un substrat d'or par pilotis peptidiques (pep-tBLM), sous un format miniaturisé et parallélisé. Le peptide pilotis utilisé, P19-4H, possède une cystéine en position N-terminale pour son greffage covalent sur la surface d'or et quatre résidus Histidine en position C-terminale pour l'attachement par chélation, en présence de Nickel, de protéoliposomes réintégrant CXCR4. La synthèse de cette protéine s'effectue par expression acellulaire sous forme de protéoliposomes, dans une composition lipidique adaptée et en présence d'un lipide chélatant, le DOGS-NTA, à 2% de la quantité molaire totale des lipides. Le peptide AH, un peptide fusogène, est utilisé dans une dernière étape pour fusionner les protéoliposomes attachés. La caractérisation approfondie des protéoliposomes et l'optimisation des conditions expérimentales ont permis d'aboutir à l'attachement robuste des protéoliposomes avec une densité lipidique suffisante pour leur fusion par le peptide AH et la formation d'une pep-tBLM réintégrant CXCR4. Des études de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que la pep-tBLM réinsérant CXCR4 était fluide, homogène et continue, avec un coefficient de diffusion de 2.10-7 cm2/s. Des études d'interaction entre CXCR4 et un ligand antagoniste, le T22, ont révélé que la protéine s'insère dans la pep-tBLM de manière fonctionnelle et orientée. Le processus de formation de la pep-tBLM a été miniaturisé par microstructuration du support consistant à recouvrir la surface d'or de polystyrène puis à former des micropuits exposant la surface d'or en leur fond. Le peptide P19-4H a été déposé de manière contrôlée dans les micropuits à l'aide d'un robot de dépôt pour former des plots de pep-tBLM intégrant CXCR4. La fonctionnalité de CXCR4 réinsérée dans ces plots de membranes a été attestée par des études d'interaction avec son ligand T22. L'ensemble des étapes de formation, d'optimisation et de miniaturisation des pep-tBLM a été suivi, visualisé et caractérisé en temps réel et sans marquage par la technique d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La technologie « TransMembraChip » développée au cours de cette thèse représente une méthode de choix pour la réincorporation et l'étude fonctionnelle de protéines transmembranaires dans une composition lipidique adaptée. Les protéines transmembranaires, en particulier les RCPG, représentent des cibles thérapeutiques intéressantes. Ainsi, dans le cadre de la recherche de candidats médicaments pour le traitement de pathologies impliquant des protéines transmembranaires, cette nouvelle génération de biopuce à membranes constitue un outil prometteur adapté au criblage de ligands agonistes ou antagonistes de ces protéinesThis thesis presents the development of a membrane biochip allowing to functionally reincorporate a transmembrane protein of the G-protein coupled receptor (GPCR) family, CXCR4, in a peptide-tethered bilayer lipid membrane (pep-tBLM), in a miniaturized and parallelized format. The peptide tether used, P19-4H, possesses a cysteine in its N-terminal extremity for covalent grafting onto the gold surface and four Histidine residues in its C-terminal extremity for attachment of proteoliposomes integrating CXCR4 by metal-chelate interaction in the presence of nickel. The synthesis of CXCR4 was carried out by cell-free expression in the form of proteoliposomes, in a suitable lipid composition and in the presence of a chelating lipid, DOGS-NTA, at 2% molar ratio. The AH peptide, a fusogenic peptide, was employed in a last step to fuse the attached proteoliposomes. The thorough characterization of proteoliposomes and the optimization of experimental conditions led to the robust attachment of proteoliposomes with sufficient lipid density to perform their fusion by the AH peptide and the formation of a pep-tBLM integrating CXCR4. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies have shown that the pep-tBLM reinserting CXCR4 was fluid, homogeneous and continuous, with a diffusion coefficient of 2 x 10-7 cm2/s. Ligand binding studies between CXCR4 and T22, an antagonist, revealed that the protein was functional and well-oriented in the peptBLM. The formation process of the pep-tBLM was miniaturized by support microstructuration, consisting in covering the gold surface with polystyrene and then, forming microwells exposing the gold surface at their bottom. The P19-4H peptide was spotted in a controlled manner into the microwells to form microspots of pep-tBLM incorporating CXCR4. The functionality of CXCR4 reinserted into these membrane microspots was confirmed by T22 ligand binding studies. All the steps of formation, optimization and miniaturization of the pep-tBLM were monitored, visualized and characterized by surface plasmon resonance imaging (SPRi), a real time and label-free technique for the detection of interactions. The "TransMembraChip" technology developed in this work represents a method of choice for the reincorporation and functional study of transmembrane proteins in a suitable lipid composition. Transmembrane proteins, particularly GPCRs, form interesting therapeutic targets. Thus, in the context of pharmaceutical research of drug candidates for the treatment of pathologies involving transmembrane proteins, this new generation of membrane biochip is a promising tool for screening agonist or antagonist ligands of these proteins
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Jacob, Laurent. "Propriétés anti-angiogéniques et anti-migratoires de peptides transmembranaires ciblant le complexe neuropiline-1/plexine-A1 dans le glioblastome." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ064/document.
Full textAbstract:
Ce travail poursuit l’exploration du potentiel thérapeutique de peptides antagonistes des domaines transmembranaires (TM) de récepteurs impliqués dans la croissance tumorale. J’ai montré l’effet anti-angiogénique de MTP-NRP1, un peptide ciblant le récepteur Neuropline-1 et confirmé sa capacité d’inhibition de prolifération, migration et de croissance d’une lignée de glioblastome (GBM) humain. J’ai ensuite démontré que le récepteur Plexine-A1 est corrélé à l’agressivité des gliomes et semble être un marqueur pronostique négatif de la survie des patients atteints de GBM. J’ai démontré le rôle du segment TM de PlexA1 dans ses interactions. Le peptide MTP-PlexA1, inhibe la signalisation et la formation du complexe NRP1-PlexA1, réduit la prolifération et la migration des cellules de GBM, impacte la croissance tumorale in vivo y compris de cellules souches tumorales. J’ai décrit le rôle pro-angiogénique de PlexA1 par des tests d’angiogenèse et de CAM où MTP-PlexA1 bloque cette fonctionThis thesis work continues the exploration of the therapeutic potential using peptides targeting transmembrane (TM) domains of receptors involved in tumor growth. I showed the anti-angiogenic effect of MTP-NRP1, a peptide targeting Neuropilin-1 and confirmed its capability to impact proliferation, migration and in vivo growth of a human glioblastoma (GBM) cell line. Then, I demonstrated that the expression of Plexin-A1 is correlated with glioma aggressiveness and seems to be a bad prognosis marker for GBM patients. We described the importance of PlexA1 TM domain in the control of their interactions. The peptide MTP-PlexA1 inhibits complex formation and signaling of NRP1-PlexA1, impacts tumor growth in vivo and cancer stem cells engrafting and development. I demonstrated the pro-angiogenic role of PlexA1 with in vitro angiogenesis assays and CAM assay in which MTP-PlexA1 is able to block this function
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Duban, Matthieu. "Clonage et caractérisation de deux gènes codant des récepteurs transmembranaires à activité kinase chez Cichorium intybus L. : expression au cours des phases précoces de l'embryogenèse somatique et du développement de la graine." Lille 1, 2004. https://ori-nuxeo.univ-lille1.fr/nuxeo/site/esupversions/fbe870e9-e5ad-4add-8e69-85beb3d4c600.
Full textAbstract:
L'embryogenèse somatique est le processus par lequel des. Cellules somatiques, après une phase de dédifférenciation, se redifférencient pour former un embryon, présentant des caractéristiques morphologiques semblables à celles d'un embryon zygotique. Certains génotypes de chicorée ont la capacité à produire des embryons somatiques d'origine unicellulaire et directe ce qui en fait un bon modèle pour l'étude des phases précoces de l'induction de l'embryogenèse somatique, lorsque les cellules différenciées se dédifférencient pour acquérir la compétence embryogène. SERK (Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase) est un gène qui a été mis en évidence initialement chez la carotte et dont l'expression marque la compétence embryogène des cellules dédifférenèiées. Ce gène a par ailleurs été également mis en évidence au cours des phases précoces de l'embryogenese zygotique. Il code un récepteur transmembranaire à activité sérine/thréonine kinase. Lors de ce travail, nous nous sommes proposés d'identifier chez la chicorée des gènes apparentés à SERK et d'étudier leur implication potentielle au cours des phases précoces de l'embryogenèse somatique ainsi que lors de l'embryogenèse zygotique. Deux gènes (CiSERK1 et CiSERK2) ont ainsi été mis en évidence. Les protéines déduites montrent une forte identité de séquence avec les séquences de SERK de carotte et d'ArabidopsisL'étude de l'expression des produits de ces gènes au cours de l'embryogenèse somatique de génotypes embryogène et non embryogène ainsi que lors de l'embryogenèse zygotique a été réalisée selon deux approches. Une analyse de la variation des niveaux. De transcrits a été réalisée par RT-PCR en temps réel. Parallèlement, l'accumulation de protéines a été suivie après obtention et purification d'anticorps polyclonaux dirigés contre le domaine kinase de CiSERK1. Les résultats indiquent que l'expression des gènes identifiés chez la chicorée n'est pas induite au cours des phases précoces de l'embryogenèse somatique. Le gène CiSERK2 ne présente pas de variation de son profil d'expression quel que soit le type d'embryogenèse. Le niveau de transcrits de CiSERK1 diminue au cours de la première demi-journée de culture en conditions embryogènes indépendamment du génotype. Au cours de l'embryogenèse zygotique, le niveau de transcrits de CiSERK1 augmente au stade cotylédonaire. L'approche immunologique a permis de détecter plusieurs protéines au cours de l'induction de l'embryogenèse somatique dont 2 (75 kDa et 62 kDa) sont accumulées de façon corrélée à des états cellulaires caractéristiques de l'induction de l'embryogenèse somatique. Au cours de l'embryogenèse zygotique, plusieurs protéines ont été détectées. Dont une de 62 kDa qui s'accumule au cours du développement de l'embryon.
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Bonaccorsi, Marta. "Protein dynamics with fast magic-angle spinning NMR." Thesis, Lyon, 2020. http://www.theses.fr/2020LYSEN090.
Full textAbstract:
L'objectif de cette thèse est de développer la Résonance Magnetique Nucléaire en Rotation à l'Angle Magique (MAS NMR) pour caractériser la structure et la dynamique d' échantillons biologiques complexes, avec un accent particulier sur le rôle des ions métalliques dans les enzymes et les canaux transmembranaires. MAS NMR est une technique performante qui permet d'extraire des informations au niveau atomique, de caractériser la dynamique sur de larges échelles de temps, et d'étudier les états fonctionnels dans des échantillons en conditions natives, une exigence particulièrement importante pour les protéines transmembranaires dans les bicouches lipidiques, par exemple. Néanmoins, un certain nombre de difficultés empêchent son application généralisée en biologie structurelle.Dans mon travail, j'ai développé et appliqué des techniques basées sur des champs magnétiques élevés (fréquence de Larmor du 1H 800 MHz et 1 GHz ) et des sondes MAS avec des rotors de diamètre inférieur au millimètre, tournant à des vitesses supérieures à 100 kHz, ce qui a contribué à faire progresser les capacités de cette technique : i) en augmentant la taille moléculaire des systèmes qui peuvent être étudiés avec un détail du niveau du résidu ; ii) en réduisant les exigences en termes de marquage isotopique, notamment la deutération ; iii) en accélérant les processus laborieux d'attribution de résonance et d'acquisition de paramètres dynamiques ; iv) en enrichissant la palette des paramètres mesurables liés à la dynamique. Tout au long de cette thèse, les méthodes ont été évaluées sur des échantillons microcristallins du domaine modèle GB1, et appliquées à la Cu,Zn-superoxyde dismutase (une métalloenzyme dimérique de Cu de 2x16 kDa) sous forme microcristalline et fonctionnelle, ainsi qu'à deux canaux transmembranaires reconstitués en bicouches lipidiques, CorA (un canal cationique pentamérique bactérien de 5x40 kDa) et l'Aqp-1 humaine (aquaporin-1, canal d'eau tétramérique de 4x25 kDa). Les résultats obtenus éclaircissent d'avantage la relation entre la dynamique interne et la fonction des protéinesThe aim of my thesis is to develop Magic-Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance (MAS NMR) to characterize structure and dynamics in complex biological samples, with a particular focus on the role of metal ions in enzymes and channels.MAS NMR is a powerful technique that allows to extract atomic level information, characterize broad timescales of motions, and investigate functional states in native-like sample conditions, a particularly important requirement e.g. for transmembrane proteins in lipid bilayers. Nonetheless, a number of bottlenecks prevents its widespread application in structural biology.In my work I developed and applied tailored techniques based on high magnetic fields (800 MHz and 1 GHz 1H Lamor frequency) and MAS probes with sub-mm diameter rotors spinning at rates above 100 kHz, which contributed to push forward the capability of this technique: i) by enlarging the molecular size of the systems that can be investigated with site specificity; ii) by reducing the requirements in terms of isotopic labeling, notably deuteration; iii) by speeding up the tedious processes of resonance assignment and acquisition of dynamical parameters; iv) by enriching the palette of measurable parameters connected to dynamics.All along this thesis, the methods were benchmarked on microcrystalline samples of the model domain GB1, and applied to Cu,Zn-superoxide dismutase (a dimeric 2x16 kDa Cu metalloenzyme) in functional microcrystalline form, as well as to two transmembrane channels reconstituted in lipid bilayers, bacterial CorA (a pentameric 5x40 kDa cation channel) and human Aqp-1 (tetrameric 4x25 kDa aquaporin-1 water channel). The data obtained shed new light on the relation between internal dynamics and function
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De, Keukeleire Béatrice. "Identification d'une voie de dégradation dépendante du GTP dans le réticulum endoplasmique : cas de la protéine CFTR-F508del." Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10122.
Full textAbstract:
70% des mutations identifiées sur le gène responsable de la mucoviscidose correspondent à la délétion de la phénylalanine en position 508 du domaine NBDI de la protéine CFTR. Cette mutation est responsable, à 37°C, d'un mauvais repliement, du blocage et de la dégradation rapide de CFTR au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Plusieurs études ont montré que CFTR-L". F508 est dégradée au niveau du cytoplasme par le protéasome après translocation à travers le canal Sec61. Cependant cette dégradation n'est pas affectée par l'A TP et n'est inhibée que partiellement par les inhibiteurs les plus spécifiques du protéasome. Par ailleurs, une série d'observations a suggéré que la dégradation de CFTR-L". F508 est un processus impliquant d'autres voies protéolytiques dont la nature reste encore lllconnue. Au cours de mon doctorat, j'ai essayé de caractériser ces voies de dégradation en approfondissant le rôle de l'ATP et du protéasome et surtout en mettant en évidence l'implication de voies dépendantes du GTP. Mon travail a été réalisé en deux étapes. La première a porté sur l'étude de la dégradation de CFTR mutée au niveau microsomale, et la deuxième sur la caractérisation de cette voie au niveau cellulaire. L'ensemble des résultats montre, pour la première fois, qu'il n'y a pas de corrélation entre l'activité protéasomale et la dégradation de CFTR-L". F508 au niveau du RE. Cette dernière est dégradée par une voie GTP-dépendante impliquant les protéines G hétérotrimériques et localisée au niveau du REL". F508-CFTR, the most frequent mutation found in patients with cystic fibrosis (CF), was among the first misfolded membrane proteins for which a role of ubiquitin and proteasome in ERAD was described. However, proteasome-mediated ERAD of membrane proteins is a challenging process because substrate and degradation machinery are located in different cellular compartments. Luminal domains and transmembrane segments of membrane proteins not only need to be unfolded, but should also undergo retrograde translocation and/or extraction from lipid bilayer in order to reach proteolytic sites within the 20S particle. However in the absence of A TP and in the presence of protéasome inhibitors, the degradation of L". F508-CFTR is only modestly inhibited, suggesting that other proteolytic system may contribute to the degradation of the mutant CFTR. To date, no other proteases or proteolytic systems have been demonstrated to contribute to the L". F508-CFTR elimination. Our present study represents the initial attempt to characterize the proteasome-independent proteolytic pathway of L". F508-CFTR. For the first time, we point out the role of GTP and heterotrimeric G proteins in the disposaI of the mutant CFTR. Through our results, we demonstrate that this proteolytic pathway is restricted to RE. Ln parallel, we also investigated the role of protéasome and A TP in the degradation of L". F508-CFTR and showed the absence of correlation between proteasomal activity and the elimination of the mutant CFTR. AIl together our results suggest that the ER-GTP dependent degradation pathway may be a complementary system that contributes to the disposaI of ER-misfolded membrane proteins
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Le, Marchand Tanguy. "Protein Dynamics by Solid-State NMR with Ultra-Fast Magic-Angle Spinning : from Microcrystals to Amyloid Fibrils and Membrane Proteins." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN023/document.
Full textAbstract:
La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) à l’état solide avec rotation à l’angle magique (MAS) est une technique de choix pour l’étude de la structure et de la dynamique de molécules biologiques peu ou non solubles. Un grand nombre d’approches ont été développées pour la reconstitution de structures tridimensionelles à partir de mesures précises de proximités internucléaires, ainsi que pour la détection de mouvements moléculaires avec une résolution atomique sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Malgré d’impressionnants progrès, les études par RMN MAS sont cependant loin d’être réalisées en routine. Les déterminations structurelles et de dynamique sont souvent démontrées sur des préparations microcristallines modèles, mais sont encore rares pour des systèmes plus complexes tels que les fibrilles amyloïdes non cristallines ou les protéines trans-membranaires insérées dans des bi- couches lipidiques. Mon travail a pour objectif d’étendre les possibilités de la RMN MAS pour l’étude de systèmes biomoléculaires complexes dans différents états d’agrégation. Pour cela, j’ai exploité les possibilités uniques offertes par les hauts champs magnétiques (fréquence de Larmor du 1H 700, 800 et 1000 MHz) combinés avec les sondes MAS de dernières générations capables d’atteindre des vitesses de rotations supérieures à 60 kHz. Ces conditions expérimentales per- mettent d’augmenter la sensibilité de la RMN MAS à l’aide de la détection 1H à haute résolution et d’enrichir la palette de paramètres RMN rapporteurs de la dynamique des protéines. La première partie de cette thèse décrit le développement de nouvelles stratégies pour l’attribution des résonances du squelette de protéines, pour l’élucidation de structures, et pour l’étude de la dynamique du squelette peptidique et des chaînes latérales. Les méthodes présentées réduisent significative- ment les besoins en termes de temps expérimental, de quantités d’échantillon et de marquage isotopique, et permettent d’analyser par RMN des systèmes de plus hauts poids moléculaire. La seconde partie décrit l’application de la RMN MAS avec détection en 1H pour l’évaluation du rôle de la dynamique des protéines dans des processus tels que la formation de fibrilles amyloïdes et le fonctionnement de protéines membranaires. Une première application est l’étude de la tendance de la β-2 microglobuline humaine à former des fibrilles amyloïdes. Une comparaison de la dynamique du squelette peptidique de la protéine sauvage et du mutant D76N dans leur forme cristalline, ainsi que la détermination de propriétés structurales de la forme fibrillaire m’ont permis d’identifier la présence de repliements pathologiques et de formuler des hypothèses sur le mécanisme de formation des fibrilles. Finalement, la dynamique locale et globale de protéines membranaires dans des bicouches lipidiques a été étudiée. En particulier, le mécanisme d’action d’un transporteur d’alkanes, AlkL, de P. putida a été examiné dans un environnement lipidique. La détermination de paramètres pour la dynamique rapide (ps-ns) et lente (μs-ms) du squelette peptidique de la protéine en présence ou en absence de substrat met en évidence des acheminements possibles pour le transfert de molécules vers la membrane et jette les bases pour une meilleure compréhension du processusSolid-state NMR with magic angle spinning (MAS) has emerged as a powerful technique for investigating structure and dynamics of insoluble or poorly soluble biomolecules. A number of approaches has been designed for reconstructing molecular structures from the accurate measurement of internuclear proximities, and for probing motions at atomic resolution over timescales spanning several orders of magnitude. Despite this impressive progress, however, MAS NMR studies are still far from routine. Complete determinations, which are often demonstrated on model microcrystalline preparations, are still rare when it comes to more complex systems such as non-crystalline amyloid fibrils or transmembrane proteins in lipid bilayers. My work aimed at extending the possibilities of MAS NMR for applications on complex biomolecular systems in different aggregation states. For this, I exploited the unique possibilities provided by high magnetic fields (700, 800 and 1000 MHz 1H Larmor frequency) in combination with the newest MAS probes capable of spinning rates exceeding 60 kHz. These experimental conditions al- low to boost the sensitivity of MAS NMR through 1H detection at high resolution and to enrich the palette of probes for protein dynamics. The first part of the thesis reports on my contribution to the development of new strategies for backbone resonance assignment, for structure elucidation, and for investigation of backbone and side-chain dynamics. These methodologies significantly reduce the requirements in terms of experimental time, sample quantities and isotopic labeling, and enlarge the molecular size of systems amenable to NMR analysis. The second part describes the application of 1H detected MAS NMR to evaluate the role of protein dynamics in problems such as amyloid fibril formation and membrane protein function. I first addressed the amyloid fibril formation propensity of human beta-2 microglobulin, the light chain of the major histocompatibility complex I. I performed comparative studies of backbone dynamics of the wild type protein as well as a D76N mutant in crystals, and determined some of the structural features of the fibrillar form. This allowed to identify the presence of pathological folding intermediates and to formulate hypotheses on the mechanism of fibrils formation. Finally, I studied the local and global dynamics of membrane proteins in lipid bilayers. In particular, I investigated the mechanism of action of the alkane trans- porter AlkL from P. putida in lipid bilayers. The measurement of parameters for fast (ps-ns) and slow (μs-ms) backbone dynamics of the protein in presence or in absence of a substrate highlights possible routes for molecular uptake and lays the basis for a more detailed mechanistic understanding of the process
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Ziani, Widade. "Interactions des protéines du complexe de transduction du signal transmembranaire CnrYXH chez Cupriavidus metallidurans CH34." Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV059/document.
Full textAbstract:
Chez Cupriavidus metallidurans CH34, le complexe CnrYXH contribue à réguler l'expression des gènes de régulation et de résistance au cobalt et au nickel en fonction de la concentration environnementale de ces cations. La fixation de cobalt ou de nickel sur le domaine périplasmique senseur de CnrX induit des modifications conformationnelles à l'origine de la transduction du signal transmembranaire. Cela conduit à rendre le facteur sigma CnrH disponible pour sa liaison à l'ARN polymérase (ARNP) dans le cytoplasme. Le complexe CnrH:ARNP se fixe alors spécifiquement sur les promoteurs des gènes cnrY et cnrC pour initier la transcription des gènes de régulation (cnrYXH) et de résistance (cnrCBAT). Dans le but de déterminer la nature de ce signal, mon projet de thèse visait à cartographier les interactions protéine:protéine au sein du complexe CnrYXH dans les trois compartiments concernés : le périplasme, la membrane plasmique et le cytoplasme. La documentation des déterminants d'interaction entre CnrX, CnrY et CnrH a permis d'élaborer un modèle structural et fonctionnel pour le complexe CnrYXH et ses homologues soulevant des hypothèses nouvelles sur le fonctionnement du système CnrThe CnrYXH complex contributes to regulate the expression of the regulatory genes and resistance genes involved in cobalt and nickel resistance in Cupriavidus metallidurans CH34. The binding of nickel or cobalt to CnrX in the periplasm induces conformational modifications that could trigger transmembrane signal transduction. As a result, CnrH is made available in cytoplasm for binding to RNA polymerase. The CnrH:RNA polymerase complex binds specifically the cnr promoters and initiates transcription of both the regulatory genes (cnrYXH) and resistance genes (cnrCBAT). In order to delineate the mechanism of signal transduction through the membrane, I studied the interactions between the three partners in the different cellular compartments: periplasm, plasmic membrane and cytoplasm. The identification of the interaction determinants between CnrX, CnrY and CnrH allowed us to propose a structural and functional model for the CnrYXH complex and its homologues. This model brings up new hypothesis on the function of Cnr system
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Zoonens, Manuela. "Caractérisation des complexes formés entre le domaine transmembranaire de la protéine OMPA et des polymères amphiphiles, les amphipols : application à l'étude structurale des protéines membranaires par RMN à haute résolution." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066415.
Full text
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Hastoy, Benoit. "Structure et dynamique fonctionnelle du domaine transmembranaire de la protéine SNARE VAMP2 lors de l’exocytose." Thesis, Bordeaux 1, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR14467/document.
Full textAbstract:
Le maintien de l’homéostasie passe notamment par la sécrétion d’hormones provenant des cellules neuro-endocrines ou endocrines telles que les cellules chromaffines ou les cellules b pancréatiques. Par exemple, la régulation de la glycémie nécessite l’exocytose de l’insuline depuis les cellules b pancréatiques des îlots de Langerhans. Une famille de protéines membranaires est au cœur de la machinerie de fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique. Ce groupe appelé, la famille des protéines SNARE est composé de trois protéines. VAMP2 est localisée à la membrane vésiculaire alors que syntaxine 1A et SNAP25 sont localisées à la membrane plasmique. Syntaxine 1A et VAMP2 ont un domaine transmembranaire alors que SNAP25 est reliée à la membrane par prénylation de résidus cystéine. Cette famille forme le complexe cytosolique SNARE décrit comme essentiel à l’exocytose. La structure et la fonction du complexe cytosolique ont été étudiées en profondeur et ont mené au modèle du « zipper ». Celui-ci décrit un enroulement progressif des domaines cytosoliques SNARE permettant l’apposition des membranes puis la fusion. Le rôle des domaines transmembranaires reste encore peu décrit. Pourtant, leur étude est nécessaire afin d’établir un modèle complet de la fusion membranaire par les protéines SNARE. Nous avons donc mené une étude alliant une analyse structurale dynamique à une analyse biologique pour déterminer l’importance du domaine transmembranaire de VAMP2 dans la sécrétion. L’analyse biologique représente donc le centre de ma thèse. Le système biologique utilisé est basé sur l’extinction de l’expression de la protéine VAMP2 endogène et l’expression concomitante d’une protéine VAMP2 mutée dans son domaine transmembranaire. Deux lignées cellulaires considérées comme des modèles dans l’étude de la sécrétion hormonale et du trafic vésiculaire ont servi de support à notre étude. Par des approches de microscopies (confocal, TIRF) et d’analyses biochimiques, nous avons observé les conséquences fonctionnelles des mutations ponctuelles, établis par mutagénèse dirigée, sur le trafic vésiculaire et sur la capacité des cellules à sécréter.Les mutations induites présentent différents effets cellulaires. Certaines bloquent la sortie de VAMP2 du réseau golgien alors que d’autres ont un effet important sur la sécrétion hormonale et plus précisément sur l’exocytose. Les études structurales ont permis de corréler ces effets avec une diminution de la flexibilité structurale dans le cas de la diminution de l’exocytose, ou avec une restriction à la conformation hélice alpha dans le cas du sorting. Ce projet pluridisciplinaire a pu mettre en avant le rôle biologique du domaine transmembranaire de VAMP2 au cours de l’exocytose probablement soutenue par la dynamique conformationelle unique observée par le versant structural du projetThe hormonal secretion plays a key role in the maintenance of homeostasis. For example, the maintenance of normoglycaemia requires insulin exocytosis from the pancreatic beta cells. The SNARE membrane family protein has been described as the core machinery of fusion between the vesicle containing hormones and the plasma membrane. This family consists of 3 different membrane proteins that are essential during exocytosis. VAMP2 is localized on the vesicle and Syntaxin 1A - on the plasma membrane. They both are transmembrane protein whereas SNAP25 is linked to the plasma membrane by palmitoylation. The SNAREs appear to be essential as they form the cytosolic SNARE complex to dock the vesicle to the plasma membrane. Even though the role of this cytosolic domain has been studied in depth, much less is known on the role of their transmembrane domain during the fusion. Their study remains necessary to establish a complete model of membrane fusion mediated by the SNARE proteins.Here, we have studied the behavior and the role of the SNARE transmembrane domain during exocytosis. In a multidisciplinary project, we have combined a structural approach with a biological study to evaluate the role of this domain. Using mutagenesis in the transmembrane domain of VAMP2 and a cellular system with a clean background, we have assessed the effect of mutations on the secretion and exocytosis in two different cell lines (INS1E and PC12). The biological system is based on the silencing of endogenous VAMP2 and reconstitution of the expression of VAMP2 wt or mutated in the transmembrane domain. Using biochemistry assay and TIRF microscopy we have shown that mutations in this domain can lead to a missorting of the Golgi apparatus or a reduction of the stimulated secretion and exocytosis. This effect can be correlated to a modification of the structural dynamics of this domain.The obtained results clearly demonstrate the role of the transmembrane domain of VAMP2 during exocytosis probably sustained by its unique structural dynamics observed by physico-chemistry
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Zhang, Xiang. "Organisation fonctionnelle des segments transmembranaires d'un moteur moléculaire Tol et d'une protéine active conte une toxine bactérienne." Thesis, Aix-Marseille 2, 2010. http://www.theses.fr/2010AIX22109/document.
Full textAbstract:
Le système Tol-Pal est un complexe de l’enveloppe d’Escherichia coli composé de CINQ protéines. Les protéines ToIQ, ToIR, TolA forment un complexe dans la membrane interne; la lipoprotéine Pal interagit avec le peptidoglycane avec la protéine périplasmique TolB. Ce système est conservé chez la plupart des bactéries à Gram négatif. Il joue un rôle important dans le maintien de la stabilité de l’enveloppe et dans l’étape tardive de la division cellulaire. Une interaction entre TolA et Pal relie les membranes interne et externe, et dépend des protéines ToIQ, TolR et de la force proton motrice (PMF). Les protéines ToIQ-R-A formeraient un moteur moléculaire utilisant la PMF afin de relier membranes interne, externe et le peptidoglycane. Mon travail a consisté à étudier l’organisation des segments transmembranaires (STs) de TolQ et TolR au sein de la membrane interne d’E. coli en utilisant l’approche expérimentale du « cysteine scanning ». Ainsi, nous avons pu identifier les résidus impliqués dans les interactions entre les STs et améliorer la connaissance de l’organisation moléculaire de ce système. Nous avons aussi démontré la dimérisation du ST de TolRet l’importance de la dynamique dans le fonctionnement de ce moteur. Le système Tol est parasité par certaines toxines (comme les colicines) et par des phages filamenteux. Les colicines sont produites par des souches d’Escherichia coli et active contre les entérobactéries. Je me suis aussi intéressé à l’organisation structurale de la protéine d’immunité de la colicine A. La colicine A forme un canal ionique dans la membrane interne pour tuer la bactérie cible. Les cellules produisant la Colicine A synthétisent également une protéine d’immunité (Cai) qui les protègent de l’action de la colicine A. Par une approche combinant « cysteine scanning » classique et un « anti-cysteinescanning », nous avons pu apporter des informations nouvelles sur l’organisation des quatre STs deCai. Nous avons montré que Cai forme un dimère dans la membrane et que ce dimère se dissocie au contact de sa cible, la colicine AThe Tol-Pal system is a protein complex of the Escherichia coli cell envelope. It consists offive proteins. The ToIQ, TolR, TolA proteins form a complex in the inner membrane, the lipoproteinPal interacts with the peptidoglycan and with the periplasmic protein TolB. This system is conservedin most Gram-negative bacteria. It plays an important role in maintaining the integrity of the outermembrane and in the late stage of cell division. The interaction between Pal and TolA connects innerand outer membranes and depends on ToIQ, TolR and the proton motive force (pmf). The ToIQ-R-Aproteins are suspected to form a molecular motor using pmf to connect the inner and outermembranes and the peptidoglycan. The first aim of my work was to study the organization of thetransmembrane helices (TMHs) of E. coli TolQ and TolR using the cysteine scanning approaches. Weidentified residues involved in the interactions between the TMHs and improved the knowledge ofthe molecular organization of this system. We have also demonstrated the dimerization of the TMHof TolR and the importance of its dynamic movement in the system. The second aim of my work wasto analyze the structural organization of the immunity protein to colicin A. The colicins are producedby certain strains of E. coli and are active against other Enterobacteriaceae. The colicin A forms anion channel in the bacterial inner membrane which kill the bacteria. It hijacks the Tol system to enterin the cell. Cells producing colicin A also synthesize the colicin A immunity protein (Cai) whichprotects the producing cells against the action of colicin A. The approaches combining "cysteinescanning" and "anti-cysteine-scanning”, we found that Cai form a dimer in the membrane whichdissociates upon contact with its target, the colicin A
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Chenal, Alexandre. "Mécanisme d'insertion dans les membranes du domaine transmembranaire de la toxine diphtérique et conception d'ancres membranaires par ingénierie du domaine T." Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2001. http://www.theses.fr/2001MNHN0037.
Full textAbstract:
Lors de l'intoxication cellulaire par la toxine diphtérique, le domaine transmembranaire (T) de la toxine s'insert dans la membrane de l'endosome à pH acide et participe à la translocation du domaine létal vers le cytosol. Nous avons montré que T subit un changement de conformation en fonction du pH et adopte un état partiellement replié, caractérisé par le maintien des structures secondaires, la rupture des interactions tertiaires, une mobilité des chaînes latérales et une exposition au solvant de zones hydrophobes organisées. Cet état est compétent pour initier l'interaction avec les membranes. A mesure que le pH décroît, les interactions hydrophobes puis électrostatiques sont séquentiellement requises pour aboutir à la pénétration du domaine T dans la membrane. Nous avons développé une méthode pour établir la topographie des protéines associées aux membranes. Ceci a été réalisé en utilisant l'α-lactalbumine comme protéine modèle. Nos résultats montrent que l'α-lactalbumine doit adopter un état partiellement déstructuré pour interagir avec la membrane. Ainsi, certaines structures secondaires sont désorganisées, tandis que d'autres sont préservées et assurent la liaison de la protéine à la membrane par le biais d'interactions électroniques. Enfin, nous avons conçu un dispositif pour ancrer des protéines solubles aux membranes. Le domaine T est fusionné à la protéine soluble. La liaison à la membrane est déclenchée par une baisse de pH. Nos résultats montrent que le domaine T et la protéine soluble qui lui est fusionnée préservent leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Les applications de ce système sont discutées.
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Floch, Aurélie. "Mécanismes d'adressage de Pom33, protéine transmembranaire associée aux pores nucléaires chez la levure Saccharomyces cerevisiae levure Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112182.
Full textAbstract:
Chez les eucaryotes, les pores nucléaires (NPCs), ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN), régulent les échanges nucléocytoplasmiques. Ces complexes, très conservés, sont composés d’une trentaine de protéines appelées nucléoporines (Nups) présentes en multiples copies au sein de chaque NPC. Chez la levure S. cerevisiae, seules quatre Nups, dont la protéine Pom33, possèdent des domaines transmembranaires. Une étude réalisée en amont de ce projet a permis de caractériser Pom33 et de montrer que le mutant pom33∆ est viable et ne présente pas de défaut apparent de transport nucléocytoplasmique mais se caractérise par un défaut de distribution des NPCs. Pom33 joue également un rôle dans l’assemblage des pores nucléaires au sein de l’EN (biogenèse de novo des NPCs). POM33 appartient à une famille de gènes très conservés. Il possède un paralogue chez S. cerevisiae, PER33, qui code pour une protéine localisée majoritairement au réticulum endoplasmique et minoritairement aux NPCs et qui n’est pas impliquée dans la biogenèse des NPCs. Chez les mammifères, il n’existe qu’un homologue de Pom33/Per33, TMEM33. Dans le cadre de ce doctorat, nous nous sommes demandés quels étaient les déterminants contribuant à l’adressage spécifique de Pom33 au niveau des NPCs et à sa fonction dans la biogenèse de ces structures. La purification de Pom33-ProtA, suivie de spectrométrie de masse, nous a permis d’identifier un nouveau partenaire de Pom33, le facteur d’import Kap123. Des approches in vitro ont montré une interaction directe entre Kap123 et le domaine C-terminal (CTD) de Pom33, qui est perturbée en présence de RanGTP. Par ailleurs, des prédictions in silico ont révélé la présence dans ce domaine CTD de deux hélices amphipathiques, conservées chez l’humain. Des analyses par dichroïsme circulaire et flottaisons ont confirmé la capacité du CTD à s’organiser en hélice en présence de membranes lipidiques et à interagir préférentiellement avec les membranes très courbées. L’expression d’une version mutée de Pom33-CTD, incapable de se lier aux membranes et couplée à la GFP, a révélé la capacité de ce domaine à agir comme un NLS, importé spécifiquement dans le noyau par Kap123. Alors que la délétion du domaine CTD affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs, la mutation des résidus basiques impliqués dans l’interaction avec Kap123 ou des résidus permettant sa liaison aux membranes lipidiques ne récapitule pas ce phénotype. En revanche, la perte combinée de ces deux déterminants affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs ainsi qu'une interaction génétique avec le mutant nup133∆, impliqué dans la biogenèse de novo des NPCs. Les résultats obtenus lors de cette étude indiquent donc que l’adressage de Pom33 est un mécanisme actif et multifactoriel, qui met en jeu au moins deux déterminants dans son domaine CTD. Ces données indiquent également un rôle de ce domaine dans la biogenèse de novo des NPCs, qui pourrait néanmoins n’être qu’un effet indirect de son rôle dans l’adressage de Pom33 aux NPCs. Au cours de cette étude, nous avons également mis en évidence d’autres partenaires potentiels de Pom33, en particulier Myo2, une localisation de Pom33 au niveau du bourgeon lors de la division et une interaction génétique entre POM33 et KAP123. Ces observations préliminaires ouvrent de nouvelles pistes de réflexion quant au rôle de Pom33 lors de la division cellulaireIn eukaryotic cells, nucleocytoplasmic exchanges take place through the nuclear pores complexes (NPCs). These conserved macromolecular assemblies are embedded in the nuclear envelope (NE) and composed of ~30 distinct proteins called nucleoporins (Nups), each presents in multiple copies. In the budding yeast Sacharomyces cerevisiae, there are only four transmembrane Nups, including Pom33. A previous study leds to the characterization of Pom33 and revealed that pom33∆ mutant cells, although viable and without apparent alteration in nucleocytoplasmic transport, display NPCs distribution defect. Pom33 also contributes to the biogenesis of NPCs into the intact NE (de novo biogenesis). Pom33 is highly conserved among species and has a paralogue in S. cerevisiae, Per33, which can associate with NPCs but is mainly localized at the endoplasmic reticulum (ER) and NE. Unlike Pom33, Per33 is not involved in NPCs distribution and biogenesis. In mammalian cells, there is a unique homologue of Pom33/Per33, named TMEM33. In the context of this thesis, we aimed to identify the determinants involved in the specific targeting of Pom33 to NPCs and in its function in pore biogenesis. To characterize these determinants, we first performed affinity-purification experiments followed by mass spectrometry analyses. This identified a novel Pom33 partner, the nuclear import factor Kap123. In vitro experiments revealed a direct interaction between Pom33 C-terminal domain (CTD) and Kap123 that involves positively-charged residues within Pom33-CTD and is altered in the presence of Ran-GTP. Moreover, in silico analyses predicted the presence of two evolutionarily-conserved amphipathic ~-helices within Pom33-CTD. Circular dichroism studies and liposome co-floatation assays confirmed that this CTD domain is able to fold into ~-helices in the presence of liposomes and revealed its preferential binding to highly curved lipid membranes. When expressed in yeast, under conditions abolishing Pom33-CTD membrane association, Pom33-CTD behaves as a Kap123-dependent nuclear localization domain. While deletion of Pom33 C-terminal domain (Pom33-∆CTD-GFP) impairs Pom33 NPC targeting and stability and leads to a NPC distribution phenotype, mutants affecting either Kap123 binding or the amphipathic properties of the ~-helices do not display any detectable defect. However, combined impairment of lipid and Kap123 binding affects Pom33 targeting to NPCs and leads to an altered NPC distribution and a genetic interaction with the deletion of NUP133, a gene coding for a nucleoporin involved in NPCs biogenesis. Together, these results indicate that Pom33 targeting to NPCs is an active and multifactorial process that requires at least two determinants within its CTD. They also suggest a role of Pom33-CTD in the de novo NPCs biogenesis process, which could however only be an indirect consequence of its requirement for Pom33 targeting to NPCs. Our mass spectrometry analysis also identified other partners of Pom33, in particular Myo2, a molecular motor required for the cell cycle-regulated transport of various organelles and proteins and for correct alignment of the spindle during mitosis. Our studies also revealed a specific localization of Pom33 at the bud tip during mitosis and a genetic interaction between POM33 and KAP123. Taken together, these preliminary observations open new perspectives regarding additional functions of Pom33 during cell division
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Yu, Huifeng. "Interaction de la protéine transmembranaire gp-41 d'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine avec les cellules cibles muqueuses." Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066693.
Full textAbstract:
Les épithéliums muqueux, porte d’entrée majeure du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), jouent un rôle important dans la transmission du VIH. Les cellules épithéliales dans les muqueuses monostratifiées et les cellules dendritiques dans les muqueuses pluristratifiées sont des cibles initiales pour la transmission sexuelle de VIH-1. Nous avons montré que la formation d’une synapse virologique entre les cellules mononuclées infectées par VIH-1 et les cellules épithéliales, dans les muqueuses monostratifiées, était requise pour une endocytose/transcytose efficace du VIH-1. Le peptide P1 (a. A. 649-683) possède un site lectine liant le récepteur galactosyl céramide (GalCer), exprimé sur les cellules épithéliales et dendritiques, et initie la transcytose du VIH par une voie dépendante des rafts. L'étude structurale du MPR-gp41-peptides : P1, P5 (a. A. 628-683), P6 (a. A. 628-667) et T20 (a. A. 637-673) en relation avec leur affinité pour GalCer a permis de suggérer que cette affinité est dépendante également de leur structure secondaire et tertiaire. L’étude de structure de P1 par RMN à pH acide et physiologique en présence des micelles de DPC a montré que P1 présente une forme hélicoïdale à pH acide. Par contre à pH physiologique, P1 perd progressivement sa forme hélicoïdale dans la région Q653-L664. Il est intéressant de mentionner que la structure des epitopes ELDKWA, NWFDIT liés à 2F5 et 4E10 et définie par cristallographie, est proche de celle identifiée par NMR pour ces régions de P1. Les études de propriétés antivirales des peptides P5, P1 par rapport à T20 indiquent que P5 possède une forte activité antivirale et semble être une nouvel inhibiteur de fusionThe mucosal surface, as the major site for HIV-1 entry, plays an important role in early HIV-1 transmission. The initial target cells for HIV-1 at mucosal sites include epithelial cells in simple monostratified mucosa and dendritic cells in pluristratified mucosa. Formation of a virological synapse between HIV-1 infected mononuclear cells and epithelial cells at the monostratified mucosa is required for efficient HIV-1 transcytosis. Peptide P1 (a. A. 649-683) derived from the membrane proximal region (MPR) of gp41 acts as a galactose-specific lectin to bind Galactosylceramide (GalCer), the HIV-1 mucosal receptor expressed on both epithelial and dendritic cells, mediating HIV-1 endocytosis/transcytosis in a raft dependent pathway. P1 contains continuous epitopes, ELDKWA and NWFDIT, recognized by the neutralizing IgG antibodies 2F5 and 4E10. The structural studies by circular dichroism (CD) of gp41 MPR derived peptides such as P1, P5 (a. A. 628-683), P6 (a. A. 628-667) and T20 (a. A. 637-673) in relation to their binding affinity to GalCer suggested that this affinity is dependent on their secondary and tertiary structure. The structural studies of peptide P1 by NMR at acidic and near physiological pH in the presence of DPC micelles indicated that the conformation of P1 undergoes a change from a well-defined helix at pH 3. 3 to the progressive loss of helical structure in the N-terminal region Q650-D665 at near physiological pH. It is interesting that the structures of the two epitopes ELDKWA, NWFDIT recognized by neutralizing antibodies 2F5 and 4E10 within peptide P1, which are close to observed by crystallography those in antibody-peptide complexes. Moreover, observation of the MPR-gp41 derived peptides P1, P5 in different environments, such as in the presence of liposomes, as well as function of ion concentration, namely Ca2+ and H+, allowed us to define novel characteristics of gp41 and might represent a new step in the characterization of immunogenic epitopes able to elicit HIV-1-neutralizing antibodies. Studying of the antiviral properties of peptides P5, P1 as compared to T20 suggested that peptide P5 has strong anti-HIV-1 activities and could possibly serve as a new generation of fusion inhibitor
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Blot, Guillaume. "Caractérisation de deux nouveaux partenaires du domaine cytoplasmique de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1 : tIP47 et Luman." Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077202.
Full text
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Bijani, Christian. "Les lipoamino acides : des vecteurs d'absorption pour l'administration transmembranaire de biomécules." Thesis, Bordeaux 1, 2010. http://www.theses.fr/2010BOR14006/document.
Full textAbstract:
Ce travail de thèse a pour objectif de développer des voies d’administrations moins contraignantes pour le patient que la voie injectable traditionnellement utilisée pour la délivrance de peptides et de protéines thérapeutiques. Nous nous sommes donc intéressés dans ce travail à la formulation de ces peptides et protéines par la réalisation de systèmes colloïdaux formés de vecteurs amphiphiles, les lipoamino acides (LAAs). Ces systèmes colloïdaux protéines/LAAs sont destinés à l’administration de peptides et protéines par voie nasale et par voie cutanée. Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec une industrie bordelaise spécialisée dans la formulation de principes actifs. La première partie de la thèse décrit la formation colloïdale de LAAs et de protéines thérapeutiques pour l’administration par voie nasale. Des études en dichroïsme circulaire nous ont donné des informations sur la structure secondaire des protéines dans le colloïde formé. L’analyse en diffusion dynamique de la lumière nous a apporté des informations sur la taille des complexes colloïdaux protéine-LAAs. La modélisation moléculaire nous a permis d’étudier la structure atomique de ces complexes colloïdaux. Enfin, pour évaluer la perméabilité membranaire de ces colloïdes, des études in vitro sur cellules nasales et des études précliniques ont été réalisées. Dans la deuxième partie, nous nous sommes intéressés au développement d’une formulation colloïdale à base de LAAs et de cyclosporine en vue du traitement par voie locale du psoriasis. L’efficacité de la formulation a été testée par RMN du deutérium grâce au développement et à la validation de modèles lipidiques de peau saine et psoriasiqueThe aim of this thesis is to develop less constraining administration pathways than the injectable way traditionnaly used for the delivery of therapeutic peptides and proteins. In this work we focus in the formulation of these peptides and proteins by formation of colloidal system with amphiphilic vectors, the lipoamino acids (LAAs). These colloidal systems proteins/LAAs are intended for the administration of peptides and proteins by nasal and cutaneous pathways. This work was completed in collaboration with an industry located in Bordeaux and in the formulation of active ingredients. The first part of the thesis describes the colloidal formation of LAAs and therapeutic proteins for an administration by nasal route. Studies with circular dichroism gave information on the secondary structure of proteins in the colloid. Analysis using dynamic light scattering brought information on the size of the protein-LAAs colloidal complexes. Molecular modeling enabled us to study the atomic structure of these colloidal complexes. Finally, to evaluate the membrane permeability of these colloids, in vitro studies on nasal cells and preclinical studies were performed. In the second part, we developed a colloidal formulation containing LAAs and cyclosporine for treatment of psoriasis by local/topical administration. The effectiveness of the formulation was tested by solid state deuterium NMR on original lipidic models of healthy and psoriatic skin developed in the laboratory
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Toutain, Christine. "Etude structure/fonction de DjlA, une protéine membranaire de la famille des chaperons DnaJ/Hsp40." Paris 11, 2001. http://www.theses.fr/2001PA112268.
Full textAbstract:
Les bactéries, comme Escherichia coli, doivent continuellement faire face à des variations environnementales et leur survie dépend de leur capacité d'adaptation. Elles ont alors développé de nombreux systèmes de transduction de signaux et, entre autres, le système RcsC/B qui régule en particulier l'opéron cps, responsable de la production d'acide colanique, composant de la capsule bactérienne. Seuls des signaux liés à une modification de l'enveloppe dans des conditions de laboratoire sont connus pour déclencher RcsC/B, et en particulier une surexpression modérée de la chaperon membranaire DjlA. DjlA appartient à la famille des chaperons DnaJ, eux-mêmes membres du système DnaK-DnaJ-GrpE. Ce système chaperon est non seulement très largement répandu chez tous les types cellulaires, mais il est également impliqué dans de très nombreux processus de la vie de la cellule. DjlA en est un membre particulier à cause de son insertion dans la membrane interne qui est une caractéristique rare dans la famille DnaJ. .Bacteria, such as Escherchia coli, must constantly deal with changes in their environment and their survival depends upon their ability to adapt. They have therefore developed numerous signal transduction systems including, amongst others, the RcsC/B system, which regulates the cps operon responsible for the production of a component of the bacterial capsule, colanic acid. Only signals which are linked to envelope modification, in laboratory conditions, are known to turn on the RcsC/B system, and notably a slight overexpression of the inner membrane chaperone DjlA. DjlA belongs to the DnaJ family of chaperones, which are themselves members of the DnaK-DnaJ-GrpE system. This chaperone system is not only found in all cell types, but is also implicated in many cellular processes. DjlA is a rather interesting member because it is inserted into the internal membrane, a rare characteristic of proteins in the DnaJ family. .
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Roth, Lise. "Importance du segment transmembranaire dans la dimérisation de la neuropiline 1 : Implications physiopathologiques dans la régénération nerveuse et la croissance tumorale." Strasbourg 1, 2008. https://publication-theses.unistra.fr/restreint/theses_doctorat/2008/ROTH_Lise_2008.pdf.
Full textAbstract:
La neuropiline 1 (NRP1) est le récepteur de ligands appartenant à deux familles différentes, les sémaphorines d’une part, et le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) d’autre part. La dimérisation de ce récepteur bitopique est nécessaire à l’activation de la signalisation intracellulaire. Or NRP1 possède un motif transmembranaire (TM) de dimérisation GxxxGxxxG. Nous avons donc décidé d’étudier l’importance du domaine TM dans la dimérisation de NRP1. Nous avons d’abord montré que ce domaine, via le motif GxxxGxxxG, présente une forte capacité de dimérisation L’importance biologique du motif GxxxGxxxG a été confirmée par l’absence de collapsus des cellules COS exprimant NRP1 mutée au niveau du motif de dimérisation. Un peptide synthétique mimant le segment TM nous a ensuite permis d’inhiber sélectivement les effets induits par Sema3A dans trois modèles cellulaires différents. Des analyses de constantes de sédimentation suivant des centrifugations en gradients de saccharose ont montré que l’effet inhibiteur du peptide synthétique passe par la déstabilisation du complexe récepteur. L’ensemble de ces résultats fait apparaître le segment TM comme un acteur majeur de la dimérisation de NRP1 et de la signalisation qui en découle. Par ailleurs, pas son rôle de récepteur de Sema3A et du VEGF, NRP1 est impliquée aussi bien dans le guidage axonal que dans l’angiogenèse, que ce soit dans des conditions physiologiques (développement du système nerveux central et du système vasculaire), ou pathologiques (maladies neurodégénératives et tumorigenèse). Le peptide TM pourrait ainsi constituer une approche innovante dans l’inhibition de phénomènes pathologiques in vivoNeuropilin 1 (NRP1) is a bitopic receptor for the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and for class 3 semaphorins, and dimerization of NRP1 is essential for intracellular signalling. We discovered that NRP1 exhibits a transmembrane dimerization motif named GxxxGxxxG. Hence, we decided to study the role of the transmembrane domain in NRP1 dimerization. We first demonstrated the dimerization capacity of this domain, which relies on the GxxxGxxxG motif. We were not able to detect any functional effect with NRP1 mutated in its transmembrane domain, which confirmed the biological importance of the GxxxGxxxG motif. Moreover, a synthetic peptide mimicking the TM domain allowed us to inhibit selectively Sema3A functions in three different cellular models. Centrifugations in sucrose gradients revealed that this inhibitory effect is due to receptor complex destabilization. Taken together, these results show the crucial role of the transmembrane domain in NRP1 dimerization, and thereby in NRP1 signal transduction. Moreover, NRP1 is involved in axonal guidance and in angiogenesis in normal (vascular system and central nervous system development) and pathological (neurodegenerative diseases and tumour growth) conditions. Hence, the synthetic peptide may constitute a new way to inhibit pathological phenomenon in vivo
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Marchetti, Gino. "Modélisation moléculaire du phénomène du transport du calcium dans la protéine ATPase-Ca2+ (SERCA1a) : une première étude." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066382.
Full textAbstract:
Cette thèse propose l’étude par Dynamique Moléculaire (DM) de la structure de l’ATPase-Ca2+ (SERCA1a) pendant le processus de transport des ions à travers la membrane. On a considéré trois structures, représentant trois étapes conformationnelles successives du processus de pompage. Les simulations sur les structures ont été faites en utilisant deux types de recouvrement de la région transmembranaire: en monocouche de surfactant (LDAO) et en bicouche lipidique (POPC). L’étude structurale s’est intéressée à la mobilité relative des domaines cytoplasmiques ainsi qu’à celle des hélices transmembranaires. Une étude sur l’hydratation des différentes régions transmembranaires a révélé la formation de canaux de solvant à l’intérieur de la protéine. Le surfactant LDAO a été séparément étudié par DM dans sa forme micellaire. L’étude de l’hydratation de la micelle a été présentée dans un article publié dans J. Phys. Chem. B 110: 11504 (2006) comparant la micelle de LDAO avec une micelle de C12E6.
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Joubert, Jane-Eileen. "Etude des mécanismes d'activation des récepteurs chimiotactiques couplés aux protéines G : biais de signalisation et rôle d'une proline dans le deuxième domaine transmembranaire." Rouen, 2016. http://www.theses.fr/2016ROUES064.
Full textAbstract:
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) affichent à la fois une structure et des voies de signalisation conservées mais aussi une grande diversité fonctionnelle, nécessaire à la spécialisation. Une spécialisation importante au cours de l’évolution est sans nul doute l’apparition du caractère chimiotactique, qui permet le développement des organes et la vascularisation, ou encore les réponses immunitaires. Ces comportements chimiotactiques induits par les RCPGs peuvent impliquer des couplages de protéines G mais également une interaction avec des protéines intracellulaires telles que les β-Arrestines. Cependant, les questions portant sur les RCPGs dans 1) leur capacité à détecter de faibles concentrations/gradients moléculaires, 2) la transduction du signal depuis la poche de liaison jusqu’au domaine intracellulaire du récepteur, et 3) les modes d’interaction des β-Arrestines restent aujourd’hui l’objet de nombreuses recherches. Les données récentes fournies par les structures à haute résolution indiquent que les RCPG sont des entités dynamiques qui adoptent des conformations actives multiples, capables de lier des ligands et d’activer préférentiellement ou non certaines voies de couplage de manière dite « biaisée », conduisant ainsi à la sélectivité fonctionnelle. Sur la base de travaux antérieurs menés par l’équipe, nous avons émis l’hypothèse que les peptides dérivés de l’urotensine II (UII) présentent des effets physiologiques inattendus en raison d’une signalisation biaisée sur le RCPG urotensinergique UT. Dans un modèle de cellules HEK293 exprimant le récepteur UT humain recombinant, nous avons déterminé le couplage aux protéines G et aux β-Arrestines suite à l’activation du récepteur par l’UII, en utilisant la méthode de transfert d’énergie de bioluminescence par résonance (BRET), ainsi que la production d’IP1 et d’AMPc en utilisant le principe de HTR-FRET (high-time resolved-Froster resonance energy transfer). Nous avons montré que le récepteur UT active les protéines Gi1, Goᴀ, Gq et G₁₃ (et non G₈) et recrute les β-Arrestines 1 et 2. Ces premiers évènements conduisent à 2 phases de phosphorylation des kinases ERK1/2. Les peptides testés induisent trois profils différents : l’UII, l’urotensin II-related peptide (URP) et l’UII₄₋₁₁ présentent le profil d’agoniste entier ; l’[Orn⁸]UII et l’[Orn⁵]URP activent les protéines G avec cependant des pEC₅₀s 5 à 10 fois plus élevés, et ne recrutent pas ou peu chez les β-Arrestines ; l’urantide ne présente pas non plus la capacité d’induire le recrutement des β-Arrestines mais a montré une efficacité inversement proportionnelle à activer les protéines Gi et Gq vs. Go et se présente donc comme un agoniste partiel de toutes les voies des protéines G. Il est intéressant de noter que les peptides sont tous capables d’induire la migration et l’adhésion cellulaire, mais régulent différemment la survie cellulaire. Ainsi, nous démontrons une signalisation biaisée entre les protéines β-Arrestine et G, et entre les sous-types de protéines G, ce qui dicte les réponses cellulaires du récepteur et peut ouvrir de nouvelles opportunités thérapeutiques. Nous avons ensuite examiné si les propriétés chimiotactiques de l’UT, tout à fait inattendues puisque l’UII était principalement connu pour ses propriétés vasoactives, sont associées à une signature structural acquise précocement au cours de l’évolution. De fait, il avait été proposé qu’au sein des récepteurs de la famille Rhodopsine, une délétion ancestrale évolutive dans le DTM2 de récepteurs du groupe ancestral PEP (peptides), conduisant au repositionnement d’une proline en 2. 58, aurait accompagné l’expansion des récepteurs des groupes SO (somatostatinergique), CHEM (chimiokine) et PUR (purinergique), phylogénétiquement liés. Ainsi, en étudiant le prototype de récepteur PEP Kiss1R, présentant une proline en 2. 59, et les récepteurs UT et CXCR4, en tant que prototypes respectifs des récepteurs SO et CHEM, nous avons cherché à obtenir des informations sur le rôle de cette proline P2. 58 dans l’acquisition du comportement chimiotactique. Pour cela, nous avons généré des mutants des prototypes Kiss1R P2. 59 et des deux récepteurs P2. 58 UT et CXCR4 par substitution de la Pro du DTM2 en Ala, ou par insertion/délétion pour déplacer la proline en position 2. 58 ou 2. 59. Nous avons montré, dans un modèle de cellules HEK293 recombinantes, que les récepteurs Kiss1R, UT et CXCR4 mutants conservent une expression membranaire et pour la plupart, des capacités de liaison. Les récepteurs P2. 58 UT et CXCR4 activés par l’UII et le SDF-1α, montrent des couplages Gq/Ca²⁺/IP1 et/ou Gi/o et β-arrestine 2, et sont capables de stimuler la migration chimiotactique par ondes dynamiques d’assemblage/désassemblage de points focaux d’adhésion (FA) ainsi que via la sélection d’un lamellipode principal. En revanche, l’activation du récepteur Kiss1R (P2. 59) par la kisspeptine-10 (KP-10) évoque des couplages Gq/Ca²⁺/IP1 et une migration aléatoire par désassemblage incontrôlé des FA, et la production de nombreux lamellipodes par cellule. La mutation de la proline ou l’insertion/délétion conduit principalement à la perte des capacités de couplage Gq et/ou Gi1 et Goᴀ, établissant le rôle clé de cette proline du DTM2 dans les mécanismes d’activation de Kiss1R, UT et CXCR4. Ainsi, le repositionnement de la proline de la position 2. 59 à 2. 58 joue probablement un rôle dans la re-sensibilisation des récepteurs, déterminante pour la régulation de l’assemblage/désassemblage des FAs et la réduction du nombre de lamellipodes. L’ensemble de ces données nous amène à proposer que l’expansion massive des récepteurs P2. 58 au cours de l’évolution est corrélée à l’acquisition de mécanismes d’activation pro-chimiotactiques par la régulation spatio-temporelle de signaux intracellulaires. Notamment, ce mécanisme d’activation spécifique serait associé à une dynamique de désensibilisation/resensibilisation des RCPG, à des vagues d’adhésion/détachement locales et à la sélection des protrusions membranaires nécessaires à une migration chimiotactique efficace. Cette compétence spécifique aux récepteurs P2. 58, et en particulier de l’UT, implique probablement une sélectivité fonctionnelle clef vis-à-vis des β-Arrestines.
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Potelle, Sven. "TMEM165 : un nouvel acteur de la régulation de l’homéostasie golgienne du Mn2+, impliqué dans les anomalies congénitales de la glycosylation." Thesis, Lille 1, 2017. http://www.theses.fr/2017LIL10149/document.
Full textAbstract:
Les anomalies congénitales de la glycosylation (CDG) sont des maladies génétiques rares caractérisées par une glycosylation aberrante des protéines. Récemment, un sous-groupe de CDG dues à des perturbations de l'homéostasie de l’appareil de Golgi a fait son apparition. En 2012, notre équipe a identifié TMEM165 comme étant une protéine golgienne impliquée dans les CDG, mais dont les fonctions biologiques et cellulaires demeurent inconnues. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que l'homéostasie golgienne du Mn2+ était altérée en absence de TMEM165. Alors que de forts défauts de glycosylation, en particulier des défauts de galactosylation, ont été observés dans des cellules déficientes en TMEM165, nous avons découvert que la supplémentation en Mn2+ était suffisante pour rétablir une glycosylation normale. De façon intéressante, nous avons également démontré que ce défaut de glycosylation pouvait également être supprimé par une supplémentation en galactose. Fort de cette observation, la supplémentation orale en galactose a été testée chez des patients déficients en TMEM165 et il a été prouvé que ce traitement améliorait significativement les paramètres biochimiques et cliniques. De plus, nous avons mis en évidence que la stabilité de TMEM165 était altérée en présence d'une concentration élevée de Mn2+. En effet, nous avons montré que l'exposition à des concentrations élevées de Mn2+ entraînait une dégradation lysosomale rapide de TMEM165. Dans l'ensemble, notre étude montre que TMEM165 est (i) un acteur clé de la glycosylation golgienne en régulant finement l'homéostasie du Mn2+ et (ii) une nouvelle protéine de l’appareil de Golgi sensible au manganèseCongenital Disorders of Glycosylation (CDG) are severe inherited diseases in which aberrant protein glycosylation is a hallmark. From this genetically and clinically heterogeneous group, a significant subgroup due to Golgi homeostasis defects is emerging. Our team previously identified TMEM165 as a Golgi protein involved in CDG. But despite strong efforts, the biological and cellular functions of TMEM165 were not known so far. During my thesis, we highlighted that Golgi Mn2+ homeostasis was impaired due to TMEM165 deficiency. While strong glycosylation defects, especially galactosylation defects, were observed in TMEM165 depleted cells, we discovered that Mn2+ supplementation was sufficient to fully restore a normal glycosylation. Interestingly, we also demonstrated that the observed glycosylation defects in mammalian cells could be overcome by galactose supplementation. Strong of this observation, oral galactose supplementation in TMEM165 deficient patients was assayed and this treatment was proven to significantly improve biochemical and clinical parameters. Moreover, we highlighted TMEM165 as a novel Golgi protein whose stability is altered in the presence of high manganese concentration. Indeed, we showed that exposure to high Mn2+ concentrations led to a rapid lysosomal degradation of TMEM165. Altogether, our study points TMEM165 as (i) a key player in Golgi glycosylation by finely regulating Golgi Mn2+ homeostasis and (ii) a novel Golgi protein sensitive to manganese
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Pouliot, Benoît. "Abc3, un transporteur vacuolaire exprimé en carence de fer chez la levure à fission." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2010. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4028.
Full textAbstract:
De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.
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Boukadida, Célia. "Analyses structurales et fonctionnelles comparées de la protéine non structurale NS2 des hepacivirus : topologie transmembranaire, activité protéolytique et rôle dans la morphogenèse des particules virales." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077154.
Full textAbstract:
Environ 150 millions de personnes sont infectées par le virus de l'hépatite C (VHC) et présentent un risque de développer à terme un carcinome hépatocellulaire. Ce travail a eu pour objectif d'étudier le rôle de la protéine non structurale 2 (NS2) du VHC et, plus particulièrement, de déterminer si les caractéristiques structurales et fonctionnelles de NS2 du VHC sont conservées pour deux virus phylogénétiquement proches, le virus GB-B (GBV-B) et l'hepacivirus non primate (NPHV) qui infectent respectivement des petits primates et des chevaux. Nos études structurales ont révélé que, malgré une identité de séquence limitée, les protéines NS2 du VHC et du GBV-B possédaient des organisations topologiques similaires, avec trois segments transmembranaires dans leur région N-terminale et un domaine cytosolique C-terminal. Nous avons démontré que NS2 du GBV-B et du NPHV étaient des protéases à cystéine permettant le clivage de la jonction NS2/NS3 et que NS2 du GBV-B était une protéase dimérique possédant une triade catalytique composite, comme NS2 du VHC. Cependant, contrairement au VHC et au NPHV, la région transmembranaire de NS2 du GBV-B est indispensable à son activité protéolytique. Nous avons montré que le rôle de NS2 dans l'assemblage des particules virales est virus- et génotype-spécifique. De plus, des interactions spécifiques entre les domaines N- et C-terminaux de NS2 du VHC semblent critiques pour la morphogenèse des virions. Nous avons également entrepris de développer une méthodologie d'imagerie permettant le suivi dynamique de NS2 du VHC dans des cellules vivantes infectées afin de mieux comprendre les mécanismes d'action de cette protéine dans le cycle des hepacivirusHepatitis C virus (HCV) chronically infects approximately 150 million persons worldwide and is associated with cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The objective of this work was to gain insight into the role of HCV nonstructural protein 2 (NS2) in the viral life cycle. With this aim, we undertook to determine whether structural and functional features of NS2 were conserved between HCV and two phylogenetically related viruses, GB virus B (GBV-B) and the non-primate hepacivirus (NPHV) that infect small primates and horses, respectively. Our membrane association and structural analyses revealed that despite limited sequence similarity, HCV and GBV-B NS2 proteins share a similar topological organization, with three transmembrane segments located in their N-terminal region and a cytosolic C-terminal domain. We further demohstrated that GBV-B and NPHV NS2 are cysteine auto-proteases responsible for the cleavage at the NS2/NS3 junction and that GBV-B NS2 is a dimeric protease containing a composite catalytic triad, as previously shown for HCV NS2. However, unlike for HCV and NPHV NS2, the transmembrane region of GBV-B NS2 is required for its proteolytic activity. Chimeric and trans-complementation approaches revealed that the role of HCV NS2 in particle assembly is virus and genotype specific. Moreover, our data suggested that functional interactions between the N- and C-terminal subdomains of HCV NS2 are critically involved in virion morphogenesis. Finally, we developed a fluorescent microscopy approach to follow HCV NS2 trafficking in live infected cells in order to gain further insight into the mechanisms of action of this protein during HCV life cycle
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Suréna, Anne-Laure. "Contrôle de l'activité du couple TGFα-EGFR dans les gliomes via la formation de complexes protéiques autour du précuseur transmembranaire du TGFα." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066760.
Full textAbstract:
La surexpression de TGFα participe au développement des tumeurs cérébrales appelées gliomes. Je me suis attachée à identifier les partenaires protéiques du précurseur du TGFα (pro-TGFα) susceptibles de participer au contrôle de la libération du TGFα dans le milieu extracellulaire. Dans un premier temps, par la technique de double hybride chez la levure, nous avons mis en évidence un nouveau mode de contrôle de la libération du TGFα s’appuyant sur DLG1, un gène suppresseur de tumeur. Par une seconde approche couplant immunoprécipitation du pro-TGFα et identification des partenaires protéiques par spectrométrie de masse nous avons identifier d’autres partenaires qui se regroupent en différentes unités fonctionnelles et qui sont susceptibles de participer à l’adressage membranaire et/ou aux fonctions du pro-TGFα. Une optimisation de ce protocole et la confirmation de ces premiers résultats pour d’autres techniques biochimiques sont nécessaires avant toutes études approfondies de ces unités fonctionnelles organisées autour du pro-TGFα.
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Lallemand, Mathilde. "Dissection des interactions entre les composants du système de sécrétion de type II chez la bacterie phytopathogène Erwinia chrysanthemi (Dickeya dadantii)." Phd thesis, INSA de Lyon, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00665584.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d'enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l'une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et -C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l'activité d'adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d'OutL et d'OutM, est directement impliqué dans l'homo- et l'hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu'OutL empêche l'interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l'activation de l'ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d'analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d'OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne.
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Furois-Corbin, Sylvie. "Contribution à l'étude théorique des biopolymères : acides nucléiques et protéines membranaires." Paris 6, 1987. http://www.theses.fr/1987PA066384.
Full text
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Lebredonchel, Elodie. "Etude de la fonction de TMEM165 dans la glycosylation golgienne et de sa dégradation induite par le manganèse." Thesis, Lille 1, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL1S103.
Full textAbstract:
Les déficits congénitaux de la glycosylation (CDG) sont un groupe de maladies génétiques rares, résultant d’altérations dans le processus de biosynthèse des glycannes. En 2012, un nouveau sous-type de CDG de type II, le TMEM165-CDG, conséquence de mutations dans le gène codant pour la protéine transmembranaire TMEM165 est découvert. Cette protéine est localisée au niveau de l’appareil de Golgi et serait le principal transporteur de manganèse dans l’appareil de Golgi. Nous savons désormais que le défaut de glycosylation du TMEM165-CDG est due à une altération de l’homéostasie du manganèse et que ce défaut peut être restauré par une supplémentation en cet ion. De façon intéressante, de fortes concentrations en manganèse entrainent la dégradation de TMEM165 au niveau des lysosomes.Au cours de mon doctorat, nous avons identifiés les acides aminés de TMEM165 responsables de sa fonction dans la glycosylation et sa sensibilité au manganèse, essentiellement deux séquences « signature » de la famille UPF0016. Nous avons également démontré pour la première fois que TMEM165 avait un lien fonctionnel avec la protéine SPCA1, une pompe calcium/manganèse golgienne. Une absence de SPCA1 engage TMEM165 dans la voie de la dégradation lysosomaleCongenital Disorders of Glycosylation (CDG) are a group of rare genetic diseases affecting the process of glycans biosynthesis. In 2012, a new subtype of CDG type II was discovered, TMEM165-CDG, resulting from mutations in the gene encoding TMEM165, a transmembrane protein. This protein is localized in the Golgi apparatus and might be the major Golgi manganese importer. The glycosylation defect observed in TMEM165-CDG results of a lack of manganese in this compartment, that is restored by manganese supplementation. Interestingly, high manganese concentrations lead to the degradation of TMEM165 in the lysosomes.During my PhD, we have identified the amino acids of TMEM165 implied in the function in glycosylation and its manganese sensitivity, essentially the two signature motifs of the UPF0016 family. We also demonstrated the first evidence of a functional link between TMEM165 and SPCA1, a Golgi calcium/manganese pump. The absence of SPCA1 targets TMEM165 to the lysosomes for degradation
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Damm, Alicia. "Interplay between the conformational dynamics of a transmembrane protein and the mechanical properties of its surrounding membrane." Thesis, Sorbonne université, 2019. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03330142.
Full textAbstract:
Les membranes des cellules sont composées d’une bicouche lipidique et de protéines transmembranaires qui sont responsables de la plupart des fonctions membranaires. Les membranes peuvent exercer une contrainte mécanique capable d’altérer la forme de la protéine et donc sa fonction. Réciproquement, une inclusion dans la membrane peut lui imposer une tension ou une courbure. Cette interaction peut s’avérer cruciale pour des protéines qui subissent un changement de conformation. Nous étudions BmrA, un transporteur ABC bactérien issu de B.subtillis. Les transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) sont une des plus grande familles de protéines membranaires. Le transporteur humain P-glycoprotéine (P-gp) exporte des agents anti-cancéreux à l’extérieur de la cellule et crée ainsi un phénotype de résistance aux médicaments. BmrA est un homologue de P-gp et subit un large changement de conformation entre une forme dite « ouverte » et une « fermée ». L’objectif est d’étudier l’interaction entre le cycle conformationnel de BmrA et la courbure membranaire à l’échelle de la molécule unique. Les différentes conformations sont discriminées grâce à la méthode FRET en microscopie TIRF : une faible (resp. haute) efficacité de FRET correspond à la conformation ouverte (resp. fermée). BmrA est purifiée, marquée avec des sondes fluorescentes compatibles avec la méthode FRET et incorporée dans des petits liposomes. Trois tailles de liposomes sont étudiées pour faire varier la courbure membranaire avec des diamètres de 140, 60 et 40nm. Nous avons observé un comportement différent pour la protéine dans les liposomes de 40nm, indiquant un effet de la courbure membranaire sur les conformations de BmrACell membranes are composed of a lipid bilayer, crowded with transmembrane proteins that mediate nearly all of the membrane functions, such as detoxification and communication. There is a tight interaction between lipids and transmembrane proteins. Membrane can apply mechanical stress and impact transmembrane proteins shape and function. Reciprocally, the inclusion of a transmembrane protein can bend or stretch the membrane. In particular, this interplay might play a crucial role for proteins that change conformation to mediate cargoes transport. We study BmrA, a bacterial ABC exporter from B.subtillis. ABC (ATP Binding Cassette) transporters represent one of the largest families of membrane proteins. Some ABC exporters lead to a phenotype of multi-drug resistance, such as human P-glycoprotein (P-gp) which transports anti-cancer agents out the cell. BmrA shares high homology with P-gp and is expected to undergo a large conformational change between “open” and “closed” conformations. The objective is to characterize the interplay between the conformation cycle of BmrA and membrane curvature, at the single molecule level. BmrA is purified in detergent, labelled with dyes suitable for FRET experiments, and incorporated in small liposomes. Conformations of BmrA are probed by single-molecule FRET in TIRF microscopy: a low (resp. high) FRET efficiency corresponds to a protein in open (resp. closed) conformation. Three different liposome sizes are used in order to vary the membrane curvature: diameter 140, 60 and 40nm. We have found a different protein behavior in 40nm liposomes as compared to larger ones, indicating an effect of the membrane curvature on BmrA conformations
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Paik, Su-Jin. "Couplages entre un transporteur membranaire de type ABC, BmrA et son environnement membranaire." Electronic Thesis or Diss., Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLET010.
Full textAbstract:
Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ...Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée.L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonctionABCs (ATP binding cassettes) transporters constitute a large family of transmembrane proteins present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP to translocate an immense quantity of amphiphilic substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs from bacteria against antibiotics to humans against anticancer agents, antivirals...A fundamental question for understanding drug transport at the molecular level is how the properties of membranes modulate the function and spatial temporal organization of ABCs. We studied in detail these coupling with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in vitro membrane systems and different biochemical and membrane biophysical approaches. Firstly, after expression and purification of proteins in detergent, we characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to its membrane environment, solubilized in detergent micelles and in mixed lipid/detergent micelles. Proteoliposomes were characterized according to protein orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This allowed us to modulate in a controlled manner lipid composition, protein density and conformation and membrane curvature to quantitatively determine the respective contributions of these membrane parameters. Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid specificity when the protein is embedded in a bilayer. This lipid specificity is provided by negative lipids and phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was decreased in high positive membrane curvature. Secondly, we determined the conditions of reconstitution of BmrA in Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our collaborator to study the respective roles of membrane curvature and tension in the spatial organization of BmrA. Nanotube pulling experiments performed in collaboration show that BmrA has a strong preference for highly curved membrane regions leading to protein cluster formation and that this preference varies according to the catalytic state of the protein. Finally, we developed a method to study the dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer at the single molecule level in reconstituted system via fluorescence cross-correlation spectroscopy.The data set suggest that spatial organizations of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are different with the possibility of sorting during membrane remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong membrane curvatures but without significant change in function
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Doisy, Anne. "Analyse de la migration et de la déformation cellulaires : application à l'étude du rôle de la protéine CD9/MRP1 dans le carcinome colorectal." Université Joseph Fourier (Grenoble), 1999. http://www.theses.fr/1999GRE10229.
Full textAbstract:
Le processus metastatique reste une des causes majeures de l'echec des traitements anticancereux. Les differentes etapes impliquees dans la formation de metastases font intervenir la migration cellulaire. De nombreuses etudes s'interessent a la correlation pouvant exister entre l'invasion tumorale et la migration cellulaire. Nous avons utilise une methode de quantification basee sur une approche de flot optique qui permet d'estimer le mouvement a partir de sequences d'images en contraste de phase sans segmentation prealable. Nous avons valide la pertinence de cette approche sur des images de synthese puis dans differents contextes biologiques : au niveau individuel ou nous avons observe l'existence d'une periodicite dans la deformation spontanee de cellules et au niveau de la population ou nous avons pu quantifier la dynamique de l'ensemble de la couche cellulaire lors du processus de recolonisation apres blessure in vitro, en presence ou non d'un marqueur de l'adn le hchst 3342. Cette approche a ete appliquee a un systeme experimental constitue de cellules issues d'un carcinome colorectal et de cellules issues de metastase peritoneale, provenant d'un meme patient. Nous avons etudie la migration de ces cellules en relation avec l'expression de la proteine cd9/mrp1. Il s'agit d'une proteine transmembranaire qui a ete decrite comme etant associee au potentiel metastatique de certaines tumeurs. Dans notre cas, cette proteine est plus fortement exprimee dans les cellules issues de la tumeur primaire et a une contribution positive dans la migration cellulaire.
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Roy, Anne-Sophie. "Etude du lien fonctionnel entre deux régulateurs de l'homéostasie golgienne du Ca2+ et du Mn2+, TMEM165 et SPCA1, dans un modèle pathologique, la maladie de Hailey-Hailey." Thesis, Lille 1, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL1S110.
Full textAbstract:
SPCA1 est une ATPase de type P transportant un ion Ca2+ ou un ion Mn2+ du cytosol vers la lumière de l’appareil de Golgi en hydrolysant une molécule d’ATP. Au niveau du Golgi, une autre protéine semble impliquée dans la régulation de l’homéostasie du Ca2+ et du Mn2+, il s’agit de TMEM165. Les mutations dans le gène ATP2C1, codant la protéine SPCA1, et dans le gène TMEM165, codant la protéine du même nom, provoquent deux pathologies différentes : une maladie de peau nommée Hailey-Hailey et une pathologie congénitale de glycosylation (CDG), respectivement. Alors que rien ne semblait relier ces deux protéines, nos résultats suggèrent un lien fonctionnel. Nous avons démontré, dans deux lignées cellulaires différentes (cellules HeLa et fibroblastes), que SPCA1 et TMEM165 sont proches l’une de l’autre au sein de l’appareil de Golgi. De plus, la fonction de SPCA1 semble gouverner l’expression de TMEM165. Cette dernière est sensible aux concentrations de Mn2+ cytosolique. Dans les fibroblastes et kératinocytes de patients atteints de la maladie de Hailey-Hailey, en présence de concentrations élevées de Mn2+ extracellulaire, l’expression de TMEM165 est beaucoup plus sensible au Mn2+ que dans les cellules contrôles. En utilisant la technique d’ICP-MS, nous avons mesurer le taux de Mn cellulaire et découvert une accumulation de Mn plus importante dans les cellules de patients par rapport aux cellules contrôles. Grâce à GPP130, une protéine sensible aux concentrations de Mn2+ golgien, nous avons relié cette plus forte accumulation de Mn2+ dans les cellules de patients avec une élévation de la concentration du Mn2+ dans le cytosol de ces cellules. En outre, SPCA1 interagit également avec Cab45, une protéine qui fixe le Ca2+, et toutes les deux interviennent dans une nouvelle voie de tri de certaines protéines au niveau du TGN. Nous avons montré, pour la première fois, que la localisation subcellulaire de Cab45 est sensible à l’utilisation de fortes concentrations en MnCl2 dans le milieu de culture des fibroblastes de patients HHD par rapport aux fibroblastes contrôles. A ce jour, le mécanisme moléculaire intervenant dans cette perte de localisation de Cab45 induite par le Mn2+ reste incompris. Une autre preuve est l’observation de l’augmentation de la quantité de SPCA1 qui est concomitante à la dégradation de TMEM165 en présence de fortes concentrations en MnCl2 dans le milieu de culture des cellules HeLa et des fibroblastes. Cette augmentation est probablement due à une augmentation transcriptionnelle du gène ATP2C1. De plus, nous avons montré que lorsque l’expression de l’une de ces protéines est réduite par la technique de CRISPR/Cas9, l’expression de l’autre est perturbée. Toutes ces données tendent à suggérer un lien fonctionnel entre SPCA1 et TMEM165, deux régulateurs de l’homéostasie du Mn2+ et du Ca2+ golgienSPCA1 is a P-type ATPase that transports a Ca2+ ion or a Mn2+ ion from the cytosol to the Golgi lumen by hydrolyzing one molecule of ATP. Another protein seems to be involved in the regulation of Ca2+ and Mn2+ homeostasis, namely TMEM165. Mutations in the ATP2C1 gene, encoding SPCA1 protein, and in the TMEM165 gene, encoding the protein of the same name, cause two different pathologies : a skin disease called Hailey-Hailey and a congenital disorder of glycosylation (CDG), respectively. While nothing seemed to link these two proteins, our results suggest a functional link. We have demonstrated, in two different cell lines (HeLa cells and fibroblasts), that SPCA1 and TMEM165 are close to each other within the Golgi apparatus. In addition, the function of SPCA1 appears to govern the expression of TMEM165. The latter is sensitive to cytosolic Mn2+ concentrations. In fibroblasts and keratinocytes of patients with Hailey-Hailey disease, in the presence of high concentrations of extracellular Mn2+, the expression of TMEM165 is much more sensitive to Mn2+ than in control cells. Using ICP-MS, we measured cellular Mn levels and found greater Mn accumulation in patient cells compared to control cells. Thanks to GPP130, a protein sensitive to the concentrations of Golgi Mn2+ concentrations, we have linked this higher accumulation of Mn2+ in the cells of patients with an increase of the Mn2+ concentration in the cytosol of these cells. In addition, SPCA1 also interacts with Cab45, a protein that binds Ca2+ in the Golgi, and both are involved in a novel way of proteins sorting at the TGN. We have shown, for the first time that the subcellular localization of Cab45 is disturbed in presence of higher concentration of MnCl2 in the culture medium of HHD fibroblasts compared to control fibroblasts. To date, we don’t know the molecular mechanism involved in this loss of Cab45 localization induced by Mn2+.Another evidence is the observation of the increase in the amount of SPCA1 which is concomitant with the degradation of TMEM165 in the presence of high concentrations of MnCl2 in the culture medium of HeLa cells and fibroblasts. This increase is probably due to a transcriptional increase in the ATP2C1 gene. In addition, we have shown that when the expression of one of these proteins is reduced by the CRISPR/Cas9 technique, the expression of the other is disrupted. All of these data tend to suggest a functional link between SPCA1 and TMEM165, two regulators of Mn2+ and Ca2+ homeostasis
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Robil, Noemie. "Recherche d'antigènes spécifiques de tumeurs et analyse des cellules souches de glioblastomes." Thesis, Strasbourg, 2015. http://www.theses.fr/2015STRAJ057/document.
Full textAbstract:
Les glioblastomes sont les tumeurs du système nerveux central les plus fréquentes et agressives. Avec une survie médiane inférieure à 2 ans, les thérapies actuelles restent inefficaces. Cet échec pourrait être expliqué en partie par l’existence de cellules particulières, les cellules souches cancéreuses. Ces cellules ont plusieurs propriétés communes aux cellules souches, qui les rendent résistantes aux traitements des glioblastomes. Il est donc important de pouvoir les identifier et les cibler pour pouvoir éliminer totalement la tumeur. L’objectif de ce travail de thèse est de déterminer des biomarqueurs des cellules souches de glioblastomes (gCSCs). Pour cela, nous avons d’abord développé une méthode générique permettant de prédire des antigènes spécifiques de cancer à partir de données de puces d’expression. Puis, nous avons travaillé sur les gCSCs, en identifiant des biomarqueurs potentiels, puis en étudiant les modifications du signal calcium, dérégulé dans de nombreux cancersGlioblastoma are the most common and aggressive nervous system tumors. With a median overall survival smaller than 2 years, usual therapies remain inefficient. This failure could be explained in part by the existence of cancer stem cells. These cells share several properties with stem cells which make them resistant to glioblastoma treatments. This is why it is important to identify and target them to suppress the whole tumor.The goal of this thesis work is to identify glioblastoma stem cells (gCSCs) biomarkers. To this end, we first developed a global method predicting cancer antigens from microarray data. Then, by studying gCSCs we identified several putative biomarkers and generated insights concerning the calcium signals which are deregulated in numerous cancers
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Tran, Thuong Van Du. "Modeling and predicting super-secondary structures of transmembrane beta-barrel proteins." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00647947.
Full textAbstract:
Les protéines transmembranaires canaux-β (TMBs) se trouvent dans les membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries ainsi que des chloroplastes. Elles traversent entièrement la membrane cellulaire et exercent différentes fonctions importantes. Vu qu'il y a un petit nombre des structures des TMBs déterminées, en raison des difficultés avec les méthodes expérimentales, il est douteux que ces approches puis- sent bien trouver et prédire les TMBs qui ne sont pas homologues avec celles connues. Nous construisons un modèle de graphe pour la classification et la prédiction de structures super-secondaires permutées des TMBs à partir de leur séquence d'acides aminés, en se basant sur la minimisation d'énergie. Le modèle ne dépend essentiellement pas de l'apprentissage. Les algorithmes sont rapides, robustes avec des performances com- parables à celles des meilleures méthodes actuelles qui utilisent l'apprentissage. Cette méthode peut être donc utile pour le screening des génomes. Outre la performance de prédiction et de classification, cette étude donne une vue plus profonde de la structure des TMBs en tenant compte des contraintes physicochimiques des membranes biologiques. Les structures permutées prédites peuvent aussi aider à mieux comprendre le mécanisme du repliement des TMBs.
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Houdou, Marine. "Regulation of cellular Mn homeostasis : unexpected functions of TMEM165, SERCA and SPCA1." Thesis, Lille 1, 2020. https://pepite-depot.univ-lille.fr/ToutIDP/EDBSL/2020/2020LILUS111.pdf.
Full textAbstract:
La glycosylation est un processus cellulaire universel chez tous les organismes vivants visant aux transferts successifs de monosaccharides sur une molécule acceptrice, le plus souvent une protéine, un lipide ou un autre monosaccharide. Chez les eucaryotes, différentes voies de glycosylation coexistent, aboutissant à la biosynthèse d’une grande diversité de structures glycanniques aux fonctions diverses. Chez l’homme, des perturbations au cours d’une ou plusieurs réactions de glycosylation sont à l’origine de glycopathologies génétiques rares appelées Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). L’une d’entre elles, TMEM165-CDG, a été identifiée en 2012 par notre équipe et est au cœur de ces travaux. Des mutations pathogéniques dans le gène TMEM165 sont en effet responsables de l’apparition de sévères défauts de glycosylation caractérisés par la présence de structures N-glycanniques principalement sous-galactosylées. Lors de la caractérisation de ces anomalies de glycosylation, les travaux de l’équipe ont rapidement établi un lien entre déficience en TMEM165 et dérégulation de l’homéostasie du manganèse (Mn2+) de l’appareil de Golgi. Dès lors, et au regard de précédents résultats de l’équipe, une fonction d’antiport Ca2+/Mn2+ fut assignée à TMEM165, permettant l’import d’ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi afin d’assurer un environnement ionique adéquat et nécessaire au bon déroulement des réactions de glycosylation. De façon extrêmement intéressante, il s’avère qu’un apport exogène de Mn2+ dans le milieu de culture de cellules déficientes en TMEM165 corrige complètement les défauts de N-glycosylation observés dans ces cellules. Par ailleurs, TMEM165, tout comme Gdt1p son orthologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae, est une protéine extrêmement sensible aux ions Mn2+ étant rapidement dégradée via la voie lysosomale en présence de fortes concentrations de Mn2+. Un lien étroit s’établit donc entre fonctions de TMEM165/Gdt1p, homéostasie du Mn2+ de l’appareil de Golgi et glycosylation golgienne ; trois aspects qui furent au centre de mes travaux. Plus particulièrement, ma thèse porte sur (i) la compréhension des mécanismes de correction des défauts de glycosylation observés dans les cellules déficientes en TMEM165 et induits par le Mn2+ et (ii) les liens potentiels entre différents acteurs essentiels au maintien de l’homéostasie ionique de la voie de sécrétion que sont les pompes calciques (Ca2+) réticulaires SERCA2, TMEM165 et SPCA1, seule pompe ATPasique de l’appareil de Golgi connue à ce jour pour importer à la fois des ions Ca2+ et Mn2+. A travers l’utilisation de lignées cellulaires humaines génétiquement invalidées pour TMEM165 ou ATP2C1 et de levures déficientes en Gdt1p et/ou Pmr1p, notre étude a conduit à l’élaboration de différents concepts reliant intimement ces protéines. D’une part, nous avons démontré que l’activité des pompes SERCA était cruciale au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de TMEM165 par leur contribution dans le pompage et la redistribution des ions Mn2+ depuis le cytosol vers l’appareil de Golgi. D’autre part, TMEM165 est indispensable au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de SPCA1 et lorsque SERCA2 est inhibée par des agents pharmacologiques. Parallèlement, nos travaux ont mis en évidence que l’expression et la stabilité des protéines TMEM165, chez l’homme et Gdt1p, chez la levure étaient directement liées aux capacités de SPCA1 et Pmr1p à importer des ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi. Bien que des différences s’observent entre l’homme et la levure Saccharomyces cerevisiae, l’ensemble de mes travaux illustre l’importance de l’homéostasie ionique de l’appareil de Golgi dans le maintien du processus de glycosylation golgienGlycosylation is a universal cellular process in all living organisms where monosaccharides are added one by one onto an acceptor molecule, most of the time a protein, a lipid or another monosaccharide. In eukaryotes, many glycosylation pathways occur simultaneously, resulting in the biosynthesis of a broad variety of glycan structures with different functions. In humans, if one -or more- glycosylation reactions are genetically impaired, Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) appear. One of them, TMEM165-CDG, was identified in 2012 by our group and is at the heart of this work. Pathogenic mutations in TMEM165 gene cause severe glycosylation defects mainly characterized by hypo-galactosylated N-glycan structures. While characterizing these glycosylation abnormalities, a link has rapidly been established by the team between TMEM165 deficiency and Golgi manganese (Mn2+) homeostasis disruption. Therefore, and based on previous work, TMEM165 was assumed to act as a Ca2+/Mn2+ antiporter, allowing the import of Mn2+ into the Golgi lumen in order to sustain an adequate ionic environment, required for all glycosylation reactions. Interestingly, we also found that exogenous addition of Mn2+ in the culture medium of TMEM165 deficient cells completely rescues the N-glycosylation defects observed in these cells. Moreover, TMEM165, like Gdt1p its yeast ortholog, is a protein highly sensitive to Mn2+, being rapidly degraded via the lysosomal pathway in the presence of high Mn2+ concentrations. All in all, a close link exists between TMEM165/Gdt1p, Golgi Mn2+ homeostasis and Golgi glycosylation; the three major aspects focused in my PhD research. More precisely, my thesis focuses on (i) understanding the mechanisms of Mn2+-induced glycosylation rescue in TMEM165 deficient cells and (ii) the potential links between different key players acting in the regulation of the secretory pathway ionic homeostasis which are the Sarco/Endoplasmic Reticulum calcium (Ca2+)-ATPase SERCA2, TMEM165 and SPCA1 (Secretory Pathway Ca2+/Mn2+-ATPase), the only pump of the Golgi apparatus known to import both Ca2+ and Mn2+ in the Golgi lumen. Through the use of isogenic human cell lines knockout for either TMEM165 or ATP2C1 and yeasts lacking Gdt1p and/or Pmr1p, we highlighted three main concepts that closely link these proteins: TMEM165 (Gdt1p), SPCA1 (Pmr1p) and SERCA2. On the one hand, we demonstrated that the activity of SERCA pumps is crucial to sustain Golgi glycosylation reactions in absence of TMEM165 by their contribution in Mn2+ pumping and redistribution into the Golgi lumen. On the other hand, TMEM165 was found essential for maintaining Golgi glycosylation reactions in absence of both SPCA1 and when SERCA2 are inhibited by pharmacological agents. Moreover, we also shed light on the fact that expression and stability of TMEM165 (in humans) and Gdt1p (in yeast) were directly linked to the capacities of SPCA1 and Pmr1p to import Mn2+ into the Golgi lumen. Although differences exist between humans and yeast Saccharomyces cerevisiae, all of our work illustrates the crucial importance of the ionic homeostasis of the Golgi apparatus to sustain Golgi glycosylation reactions
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Simsir, Méliné. "Modélisation structurale des pompes à efflux de la famille des RND : de la résistance aux antibiotiques à la résistance à la chimiothérapie." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur, 2020. http://www.theses.fr/2020COAZ6040.
Full textAbstract:
La résistance à la chimiothérapie peut-être étudiée comparativement à l’étude de la résistance chez les microorganismes. Parmi les superfamilles de protéine identifiées comme étant responsables de résistance aux drogues, il y a les RND. Ses membres sont très répandus dans les organismes bactériens, mais aussi les archaea et les eucaryotes. Ptch1, protéine transmembranaire récepteur du morphogène Hedgehog (Hh), membre des RND, a une activité d’efflux de cholestérol, mais aussi de médicaments chimiothérapeutiques qui confère aux cellules cancéreuses une résistance à la chimiothérapie. Or, une activité aberrante de la voie de signalisation Hh a été observée dans près de 25 % des cancers. Parmi les caractéristiques communes à la résistance aux drogues des RND, il y a la capacité de ces protéines transmembranaires à faire de l’efflux d’un large spectre de substrats et de drogues, et ce, en utilisant la force proton motrice.L’objectif de ce projet est l’étude structurale du mécanisme d’efflux de drogues de Ptch1.Dans un premier temps, n’ayant pas encore accès à une structure de Ptch1, nous avons réalisé une analyse des nombreuses structures disponibles de son homologue bactérien AcrB, modèle paradigme des RND responsable de résistance aux antibiotiques chez les bactéries gram négatives, afin de mieux comprendre le mécanisme d’efflux de drogues de ces protéines. Nous avons mis en place une stratégie d’analyse conformationnelle de l’ensemble des structures disponibles de façon à expliquer le mécanisme complexe, notamment ceux d’efflux de drogues de ces protéines, en fonction des propriétés structurales et dynamiques de sous-domaines. Les outils développés ont été mis à disposition de la communauté.Les structures de Ptch1 publiées en 2018 et 2019 ont révélé que le mécanisme d’efflux de drogues de Ptch1 était probablement très différent de celui d’AcrB. Dans un second temps, en utilisant ces structures, nous avons étudié le mécanisme d’efflux de cholestérol de Ptch1 par dynamique moléculaire afin d’étudier par la suite celui des drogues. Nous avons ainsi identifié certaines caractéristiques des changements conformationnels pouvant avoir lieu afin de permettre cet efflux. Enfin, le docking des agents chimiothérapeutiques transportés par Ptch1 suggère que les drogues utilisent les mêmes sites d’interaction que le cholestérol et potentiellement le même mécanisme d’effluxResistance to chemotherapy can be studied comparatively to the study of resistance in microorganisms. Among the protein superfamily identified as being responsible for multidrug resistance are RND. Its members are widespread in bacterial organisms, but also in Archaea and Eukaryotes. Ptch1, a transmembrane protein, receptor of morphogen Hedgehog (Hh), a member of the RND, has cholesterol efflux activity, but also of chemotherapeutic drugs which confers resistanceto chemotherapy to cancer cells. In fact, an aberrant activity of the Hh signaling pathway has been observed in nearly 25% of cancers. Among the common features of multidrug resistance in RND is the ability of these transmembrane proteins to efflux a broad spectrum of substrates and drugs using protonmotive force.The goal of this project is the structural study of the drug efflux mechanism of Ptch1.In a first step, since we did not yet have access to a structure of Ptch1, we have performed an analysis of the numerous available structures of its bacterial counterpart AcrB, the RND paradigm model responsible for antibiotic resistance in gram-negative bacteria, in order to better understand the drug efflux mechanism of these proteins. We have implemented a strategy of conformational analysis of all available structures in order to explain the complex mechanism, including the drug efflux mechanism of these proteins, as a function of the structural and dynamic properties of sub-domains. The tools developed have been made available to the community.The structures of Ptch1 published in 2018 and 2019 revealed that the drug efflux mechanism of Ptch1 was probably very different from that of AcrB. In a second step, using these structures, we studied the cholesterol efflux mechanism of Ptch1 by molecular dynamics in order to subsequently study the drug efflux mechanism. We thus identified certain characteristics of the conformational changes that cantake place to allow this efflux. Finally, the docking of chemotherapeutic agents carried by Ptch1 suggests that drugs use the same interaction sites as cholesterol and potentially the same efflux mechanism
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Meyer, Lionel. "Contribution des cellules souches de glioblastome à l'hétérogénéité tumorale : aspect thérapeutique et développement d'un système d'expression mosaïque fluorescent." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAJ109/document.
Full textAbstract:
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus agressive comportant une sous-population de cellules souches tumorales (CSG). Elles sont capables d’auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation en cellules exprimant les marqueurs neuraux et de trans-différenciation en cellules de types vasculaires. Dans ce contexte, j’ai dérivé et caractérisé plusieurs lignées de CSG à partir de biopsies de patients. Puis j’ai évalué l’impact des peptides thérapeutiques transmembranaires développés au laboratoire, visant les plateformes de récepteurs de neuropiline-1 et de plexine-A1 surexprimées dans les CSG. Les deux peptides diminuent la croissance des CSG in vitro et in vivo. Finalement, j’ai développé un outil génétique fluorescent permettant de suivre le destin des CSG en direct. Basé sur l’expression de 4 rapporteurs fluorescents contrôlés par des promoteurs spécifiques des types cellulaires, il permet d’identifier l’hétérogénéité de ces cellules en différenciationThe glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive primary brain tumor and includes a subpopulation of tumoral stem cells (CSG). Those cells can self-renew, proliferate and differentiate by expressing specific neural markers and/or transdifferentiate into vascular-like cells. In this context, my work consisted first to produce and characterize several CSG lines from patient biopsies to constitute a bank of cell lines with different properties. We also evaluated the impact of in house therapeutic transmembrane peptides targeting the neuropilin-1 / plexin-A1 receptor platforms overexpressed in GBM. We thus showed that both targeting peptides decrease the growth of GSC in in vitro and in vivo models. Finally, I developed an inducible mosaic expression system to track the live differentiation of CSG. This system is based on the expression of four different fluorescent reporters controlled by the activity of cell type specific promoters