Academic literature on the topic 'Protéomique – Dissertations universitaires'

L'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) permet aujourd'hui de séparer plusieurs centaines de protéines sur un gel avec un pouvoir de résolution pouvant atteindre quelques centièmes d'unité pH ; par ailleurs, les techniques de spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight) et ESI-MS/MS (electospray ionizationtandem mass spectrometry) fournissent des données de masse et/ou de séquencepeptidique permettant leur identification. Nous avons utilisé cette association analytique pour étudier le contenu protéique global, ou protéome, des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs) en primocultures. Ce modèle, bien qu'imparfaitement représentatif de l'endothélium humain in vivo, est très utilisé en recherche et a fortement contribué à l'avancée des connaissances concernant la physiopathologie vasculaire. Près d'un millier de protéines d'HUVECs ont été séparées entre les pH 3 et 10 ; parmi elles, 162, fortement exprimées à pH acide, ont été identifiées. L'étude fonctionnelle de ces identifications a permis, d'une part, de mieux caractériser les cellules endothéliales humaines et a, d'autre part, révélé certaines protéines spécifiques de l'endothélium comme l'endothélial protein disulfide isomérase (endoPDI). L'étude protéomique différentielle des HUVECs traitées par l'étoposide, un anticancéreux inducteur d'apoptose, a montré les modulations d'expression significatives de huit protéines : la cofiline, les GRPs 78 et 94 (glucose regulated proteins), la laminin receptor protein, la valosin containing protein, la protease inhibitor 9, l'apolipoprotéine A1 et la tropomyosine. Ces variations ont confirmé l'implication de la voie mitochondriale dans notre modèle d'apoptose et ont également suggéré celle du réticulum endoplasmique. Enfin, l'étude protéomique des effets du phorbol myristate acétate, un activateur de la protéine kinase C, a montré de nombreuses différences d'expression par rapport à l'état quiescent qui devraient permettre de mieux comprendre les voies biochimiques de la régulation de la protéine anti-apoptotique bcl-2 ainsi que de l'initiation du processus d'angiogenèse. En perspective, ces résultats suggèrent qu'il sera bientôt possible d'identifier des molécules protectrices pour l'endothélium vasculaire et donc bénéfiques pour les patients traités par les chimiothérapies anticancéreuses
In this work, we have carried out the proteomic study of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) using the combination of 2D-electrophoresis, automated trypsin digestion, peptide mass fingerprinting analysis after MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nano LC-ESI-MS/MS. The overall functional characterization of the 162 identified proteins from primary cultures of HUVECs confirms the metabolic capabilities of endothelium and illustrates various cellular functions more related to cell motility and angiogenesis, protein folding, anti-oxidant defenses, signal transduction, proteasome and resistance to apoptosis. In comparison with controls cells, the differential proteomic analysis of HUVECs treated by the pro-apoptotic topoisomerase inhibitor etoposide further revealed the modulation of eight proteins namely, GRP78, GRP94, valosin-containing protein, proteinase inhibitor 9, cofilin, 37 kDa laminin receptor protein, bovine apolipoprotein and tropomyosin. These data suggest that etoposide-induced apoptosis of human vascular endothelial cells results from the intricate involvement of multiple apoptosis processes including at least the mitochondrial and the endoplasmic reticulum stress pathways. The presented 2D pattern and protein database,as well as the data related to apoptosis of HUVECs, are available at http://www. Huvec. Com

La stratification du risque des patients atteints d'insuffisance cardiaque (IC) systolique chronique est essentielle afin d'identifier ceux qui pourront bénéficier de stratégies invasives telle que la transplantation cardiaque. En dépit des avancées récentes, cette stratification nécessite d'être encore améliorée. En effet, certains patients caractérisés à faible risque vont décéder précocement ; et inversement, d'autres identifiés à haut risque auront une survie prolongée.Objectif - Notre objectif était d'investiguer la place d'une analyse protéomique du plasma dans la stratification du risque des patients IC et de découvrir des biomarqueurs circulants associés à la mortalité cardiovasculaire précoce de ces patients.Méthodes et résultats - Pour ce faire, nous avons d'abord désigné 2 populations : une population test et une de validation. Ces 2 populations étaient issues de la population INsuffisance CArdiaque (INCA) constituée de l'ensemble des patients référés à notre centre pour une évaluation pronostique extensive d'une IC systolique chronique (FEVG <45%) entre novembre 1998 et mai 2010. Pour la phase test (population cas/témoins), nous avons sélectionné 198 patients entre novembre 1998 et décembre 2005: 99 patients décédés de cause cardiovasculaire dans les 3 ans suivant l'inclusion (cas) ont été comparés à 99 survivants à 3 ans appariés sur l'âge, le sexe et la cause de l'IC (témoins). Pour la phase de validation, nous avons évalué une cohorte de 344 patients consécutifs inclus entre janvier 2006 et mai 2010. Les populations ont été parfaitement caractérisées. La mortalité cardiovasculaire était définie comme un décès de cause cardiovasculaire, une transplantation en urgence (critère United Network for Organ Sharing status 1) ou une assistance cardiaque en urgence.Une analyse protéomique utilisant la technique SELDI-TOF-MS a ensuite été réalisée dans la population test sur des échantillons de plasma prélevés à l'inclusion. Les échantillons ont été déplétés des protéines majoritaires et analysés après randomisation en duplicate en utilisant des puces CM10 (échangeur de cations) et H50 (hydrophobie). Au total, 42 pics m/z étaient différentiellement abondants entre les cas et les témoins et ont été utilisés pour développer des scores protéomiques prédicteurs de la mortalité cardiovasculaire à l'aide de 3 méthodes statistiques de régression : machine à vecteur de support, régression des moindres carrés partiels et régression logistique de Lasso. Les scores protéomiques ont ensuite été testés dans la population de validation et étaient significativement plus élevés chez les patients qui vont décéder dans les 3 ans avec les 3 méthodes. Ces scores protéomiques persistaient associés à la mortalité cardiovasculaire après ajustement sur les facteurs confondants. De plus, l'utilisation de ces scores permettait une amélioration significative de la discrimination des patients IC par rapport à une évaluation pronostique classique selon les index suivants : "integrated discrimination improvement" et "net reclassification improvement".L'étape suivante a été de procéder à la purification et à l'identification des protéines correspondant aux pics m/z différentiellement abondants dans les 2 populations (n=13). Actuellement, nous avons pu identifier plusieurs apolipoprotéines : 14511 CM10-BM (ApoA1), 29024 CM10-BM (ApoA1), 3267 H50-BM (ApoC1), 6416 H50-BM (ApoC1), 6616 H50-BM (ApoC1), 6825 H50-BM (ApoC1), 8764 H50-BM (ApoC3), 9421 H50-BM (ApoC3). ceci a conduit à la quantification de ces apolipoprotéines dans la population INCA par une technique de "mass reaction monitoring".Conclusion - Une analyse protéomique des protéines du plasma semble améliorer la stratification du risque de mortalité précoce chez les patients atteints d’une IC chronique.Perspectives - Des investigations complémentaires sont en cours afin de déterminer l'impact des apoplipoprotéines dans la stratification du risque de ces patients
Risk stratification of patients with systolic chronic heart failure (HF) is critical to better identify those who may benefit the most from invasive therapeutic strategies such as cardiac transplantation. In spite of recent advances, risk stratification of HF patients needs to be further improved. Indeed, there remains variability in the prognosis with some patients who are categorized at low risk but experience early mortality; and conversely, patients categorized as severe but have an unexpectedly prolonged survival. Proteomics has been used to provide prognostic information in various diseases.Aim – Our aim was to investigate the potential value of plasma proteomic profiling for risk stratification in HF and to find new circulating biomarkers that are associated with early cardiovascular mortality of chronic HF patients.Methods and results – For that purpose, we first designed 2 populations: a discovery and a validation population. Both populations issued from the INsuffisance CArdiaque (INCA) cohort, which is constituted of all consecutive patients referred in our institution for extensive prognostic evaluation of systolic chronic HF (LVEF <45%) between November 1998 and May 2010. For the discovery phase (case/control population), we selected 198 patients included between November 1998 and December 2005: 99 patients who died from cardiovascular cause within 3 years after the initial evaluation (cases) were individually matched for age, sex, and HF etiology with 99 patients who were still alive at 3 years (controls). For the validation phase, we evaluated a cohort of 344 consecutive patients included between January 2006 and May 2010. Study populations were carefully phenotyped. Cardiovascular death included cardiovascular-related death, urgent transplantations defined as United Network for Organ Sharing status 1 and urgent assist device implantation. A proteomic profiling using surface enhanced laser desorption ionization - time of flight - mass spectrometry was then performed in the case/control discovery population on plasma samples collected at inclusion. Plasma samples were depleted for major proteins and randomly analyzed in duplicate using CM10 (Weak Cation Exchanger) and H50 (Reverse Phase) proteinchip arrays. Forty two ion m/z peaks were found differentially abundant between cases and controls in the discovery population and were used to develop proteomic scores predicting cardiovascular death using 3 statistical regression methods: support vector machine, sparse partial least square discriminant analysis and lasso logistic regression. The proteomic scores were then tested in the validation population and score levels were significantly higher in patients who subsequently died within 3 years with the 3 methods. Proteomic scores remained significantly associated with cardiovascular mortality after adjustment on confounders. Furthermore, use of the proteomic scores allowed a significant improvement in discrimination of HF patients as determined by integrated discrimination improvement and net reclassification improvement indexes on top of “classic” prognostic evaluation. The next step was the purification and identification of the proteins related to the different m/z peaks (n=13) that were found significantly differentially abundant in both populations. We have currently identified several peaks as apolipoproteins: 14511 CM10-BM (ApoA1), 29024 CM10-BM (ApoA1), 3267 H50-BM (ApoC1), 6416 H50-BM (ApoC1), 6616 H50-BM (ApoC1), 6825 H50-BM (ApoC1), 8764 H50-BM (ApoC3), 9421 H50-BM (ApoC3). This has led to the quantification of these apolipoproteins in the INCA population using mass reaction monitoring technique.Conclusion – Proteomic analysis of plasma proteins may help to improve risk prediction of early mortality in HF patients.Perspectives – Further investigations are ongoing in order to determine the impact of the different apolipoproteins tested in risk stratification of chronic HF patients

La peau humaine se compose de l’épiderme et du derme. Dans l’épiderme, les mélanocytes transfèrent la mélanine aux kératinocytes, protégeant ainsi la peau des effets néfastes des rayons ultraviolets. Au cours de leur transformation en cellules de mélanome, les mélanocytes expriment des facteurs de croissance ou récepteurs d'adhésion qui leur permettent d'interagir avec les fibroblastes et les cellules endothéliales. Ces interactions favorisent la dissémination des cellules tumorales et la formation de métastases. A ce jour aucune thérapie ne s'est avérée efficace pour le traitement du mélanome. Des données de la littérature indiquent que les radeaux lipidiques, microdomaines membranaires riches en lipides et protéines, jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire. Nous avons émis l'hypothèse que l'association de certaines protéines aux radeaux lipidiques pourrait jouer un rôle crucial dans la progression du mélanome. Nous donc avons étudié par protéomique le contenu des radeaux lipidiques de lignées cellulaires de mélanome issues de tumeurs à différents stades de la progression et effectué une analyse comparative. Nous avons constaté que 46 protéines étaient exprimées de manière différentielle dans les microdomaines de lignées métastatiques par rapport à des lignées peu ou pas invasives. Nous avons démontré que la Lactadhérine se trouve uniquement dans les microdomaines des cellules métastatiques. La caractérisation de cette protéine nous a permis de montrer qu'une forme tronquée de la protéine était impliquée dans le développement du mélanome primaire chez la souris, ce qui fait de ce variant une cible thérapeutique potentielle pour le traitement du mélanome
Human skin is composed of the epidermis and the dermis separated by a basement membrane. In the basal layer of the epidermis, melanocytes deliver melanin to keratinocytes, thereby protecting the skin from the deleterious effects of ultraviolet light. During their malignant transformation into melanoma cells, melanocytes physically dissociate from keratinocytes and express new growth factors or adhesion receptors, allowing them to interact with cell partners like fibroblasts and endothelial cells. Such interactions promote malignant cells dissemination and metastases formation in distant organs. Up to date, no therapy was successfully used for melanoma treatment. The idea is to assess molecular changes occurring in melanoma cells in order to develop new therapeutic targets. Data in the literature support the role of lipid rafts, specialized membrane microdomains enriched in particular lipids and proteins, in the modulation of important signaling events. We raised the hypothesis that the association of specific proteins with lipid rafts might be relevant to melanoma progression. We investigated by proteomics the lipid raft content of human melanoma cell lines derived from tumors at different stages of the disease and performed a differential analysis. We showed that 46 proteins were up- or down- regulated in lipid rafts of metastatic melanoma cells compared to non-invasive cells. For instance, Lactadherin was found to partition only in microdomains of the metastatic cells. Our characterization of this glycoprotein suggests that a Lactadherin splice form is implicated in primary tumor development and would thus constitute a promising molecular target for melanoma treatment

Introduction. La physiopathologie de la sclérodermie systémique (ScS) et de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique n’est pas clairement établie. En recherchant de nouvelles cibles d'auto-anticorps (Ac) de patients, nous avons cherché à améliorer la compréhension de la physiopathologie de ces maladies. Méthodes. Les réactivités de préparations d'immunoglobulines intraveineuses et des IgG sériques de patients ayant une ScS et/ou une HTAP ont été testées en immunofluorescence indirecte, immunoblots 1-D et 2-D sur des extraits protéiques de cellules HEp-2, de fibroblastes, de cellules endothéliales (CE) et de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), puis identifiées en spectrométrie de masse et analysées à l'aide du logiciel Pathway Studio. Des tests ELISA utilisant des protéines recombinantes et des expériences de contraction des CMLV ont été réalisés. Résultats. Nous avons caractérisé les cibles antigéniques des IgG humaines normales sur des extraits de cellules HEp-2 et de CE. De plus, de nouvelles cibles des Ac anti-nucléaires, impliquées dans la voie du TGF-β, ont été identifiées chez les patients sclérodermiques. Nous avons également détecté des Ac anti-fibroblastes chez les patients présentant une HTAP, et la lamine A/C et la chaîne beta de la tubuline comme cibles des Ac anti-CE. Enfin, nous avons observé que les IgG de patients reconnaissaient les CMLV, reconnaissaient des cibles définies et induisaient la contraction cellulaire. Conclusion. De nouvelles cibles antigéniques des auto-Ac ont été identifiées au cours de la ScS et de l’HTAP, ce qui pourrait permettre de développer de nouveaux outils diagnostiques, pronostiques et/ou thérapeutiques
Introduction. Pathophysiology of systemic sclerosis (SSc) and idiopathic pulmonary arterial hypertension (PAH) is not clearly established. By identifying new targets of auto-antibodies from patients, we tried to better understand the pathophysiology of these conditions. Methods. Reactivities contained in intravenous immunoglobulin preparations and of serum IgG from patients with SSc and/or PAH were tested by indirect immunofluorescence, 1-D and 2-D immunoblots on HEp-2 cell, fibroblast, endothelial cell (EC) and vascular smooth muscle cell (VSMC) protein extracts, then identified by mass spectrometry and analysed using Pathway Studio software. ELISA using recombinant proteins and VSMC contraction assays were performed. Results. We characterized target antigens of normal human IgG on HEp-2 cell and EC protein extracts. In addition, new target antigens of anti-nuclear antibodies, involved in TGF-β pathway, were identified in patients with SSc. We also detected anti-fibroblast antibodies in the serum of patients with PAH, and lamin A/C and tubulin beta chain were identified as targets of anti-EC antibodies. Finally, we demonstrated that serum IgG from patients recognized VSMC, recognized well-defined targets and led to cellular contraction. Conclusion. New target antigens of auto-antibodies were identified in patients with SScand/or PAH, that could allow the development of diagnostic, prognostic and/or therapeutic tools

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, responsable d'une infection cosmopolite très répandue, la toxoplasmose. Les différents schémas de traitement de la toxoplasmose reposent sur l'association de la pyriméthamine et d'un sulfamide qui agissent en synergie pour bloquer la voie de synthèse des folates. Cependant des échecs thérapeutiques ont été rapportés dans la littérature, et trois souches naturellement résistantes à la sulfadiazine, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) et TgH 32045 (Type II variant), ont été décrites. Notre travail a porté sur l'étude des mécanismes de résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l'implication des gènes cibles, dhps et dhfr, ainsi que les ABC transporteurs TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 et TgABC.C2 dans la résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Cependant aucun polymorphisme ni surexpression de ces gènes n'a pu être relié aux mécanismes de résistance. Nous avons ensuite comparé les protéomes des souches naturellement résistantes aux protéomes des souches sensibles RH (Type I) et ME-49 (Type II) par DIGE. Parmi les 31 protéines différentiellement exprimées entre souches sensibles et résistantes, quatre protéines, ROP2, MIC2, ENO2 et IMC1, nous ont semblé intéressantes. Afin de s'affranchir des variations liées aux différences de fond génétique des souches, les souches sensibles RH et ME-49 ont été rendues résistantes in vitro à la sulfadiazine par pression médicamenteuse croissante, résistance validée in vitro grâce à la mise au point d'un nouveau test de chimiosensibilité. Nous avons ensuite, par 2-DE, comparé les protéomes des souches de type II sensible (ME-49), et résistantes (ME-49-RSDZ et TgH 32006) sans identifier le ou les candidat(s) impliqué(s) dans la résistance médicamenteuse. Cependant, l'analyse des souches ME-49 sensible et ME-49-RSDZ résistante, par microarrays, nous a permis d'identifier une cible appartenant à la voie de synthèse des folates : la folylpolyglutamate synthase
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite responsible of a widespread infection, toxoplasmosis. Treatment options for toxoplasmosis are generally limited to combinations of sulfonamide and pyrimethamine which have a synergistic action on T. gondii folate synthesis by inhibiting two major enzymes: dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR). However treatment failures have been reported, and three naturally sulfadiazine resistant strains, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) and TgH 32045 (Type II variant), have been described. In this work, we studied resistance mechanisms to sulfadiazine on T. gondii. We are interested, in a first time, on the involvement of target genes, dhps and dhfr, and ABC transporters, TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 and TgABC.C2, in the sulfadiazine resistance on T. gondii. However, neither polymorphisms nor overexpression of these genes has been linked to resistance mechanisms. Then, we compared proteomes of naturally resistant strains to sensitive strains RH (Type I) and ME-49 (Type II) by DIGE. Among the 31 proteins differentially expressed between sensitive and resistant strains, four proteins, ROP2, MIC2, ENO2 and IMC1, seemed to be interesting. In order to avoid variations due to differences from genetic background, sensitive strains RH and ME-49 have been made resistant in vitro by gradual increase in sulfadiazine concentration. This resistance was checked in vitro by the development of a new chemosensitivity assay. We compared then, by 2-DE, proteomes of the type II strains, sensitive (ME-49) and resistant (ME-49-RSDZ and TgH 32006), without identifying candidates implicated in sulfadiazine resistance mechanisms. However, analysis of the sensitive strain ME-49 and the resistant strain ME-49-RSDZ, by microarrays, allowed us to identify a candidate belonging to folate synthesis pathways: folylpolyglutamate synthase

Grâce au séquençage des génomes et aux progrès de la spectrométrie de masse, l'analyse protéomique se révèle un outil puissant pour l'identification des protéines. Les techniques telles que l'électrophorèse bidimensionnelle, la spectrométrie de masse et la bioinformatique constituent les clés d'une approche nommée " méthodologie classique de la protéomique ". La recherche en protéomique évolue de plus en plus vers la caractérisation de protéines issues de mélanges complexes, avec pour but de mieux comprendre les systèmes biologiques, les interactions entre protéines, ainsi que leurs fonctions. Deux méthodes d'ionisation sont mises en oeuvre dans le cadre des études de biologie structurale : le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) et l'électronébulisation (ESI, Electrospray Ionization). Ces deux techniques possèdent l'avantage d'être suffisamment douces pour ioniser et amener à l'état gazeux des macromolécules biologiques (protéines et des acides amines). La technique protéomique a été mise au point lors de ce travail de thèse, au sein du Laboratoire de Spectrométrie de Masse de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN, CNRS, Gif-sur-Yvette). Ainsi, plusieurs collaborations ont été engagées, qui font intervenir des compétences pluridisciplinaires. Dans une première partie sera décrite l'étude de complexes purifiés selon le protocole TAP. Cette méthodologie a permis la description de nouvelles sous-unités du snRNP U2, ainsi que l'identification d'un nouveau complexe, RES, impliqué dans le processus d'épissage alternatif. La caractérisation d'un complexe ultime (Dcs1 et Dcs2) de dégradation des ARNm a été réalisée. Dans un deuxième temps, la protéomique différentielle a été mise à profil dans le but de mieux appréhender la pathogenèse de la Mucoviscidose. Un élément fondamental a ainsi été révélé : la sous expression de l'Annexine 1, protéine critique du processus anti-inflammatoire/protecteur, et cruciale pour maintenir l'homéostasie et la réparation des tissus après un épisode inflammatoire. Un autre objectif d'étude a consisté en l'identification d'une nitro-réductase issue d'une souche de Bacillus sp. Cette enzyme s'avère capable de réaliser une double réduction du groupement nitro du 3,5-DNBTF. En fin, le dernier chapitre concerne le traitement par plasma froid à pression atmosphérique d'une protéine modèle : le lysosyme. Cette étude a permis d'identifier une modification chimique spécifique des résidus aminés tryptophane. L'ensemble de ces résultats illustre l'importance, dans des domaines très variés, de la protéomique ciblée.

Il a été montré que le diabète augmentait l'expression des CYP 2E1 et 2B1 de rat au niveau ARN et protéines. Cette élévation a été attribuée à une stabilisation des ARNm et peut être inversé par un traitement quotidien à l'insuline. En utilisant une lignée d'hépatome de rat, il a été précédemment montré au laboratoire que cette hormone agissait par un mécanisme post-transcriptionnel en diminuant la durée de vie des messagers des CYP2E1 et 2B1 de rat. Nous avons entrepris d'identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans cette régulation. En utilisant des protéines cytoplasmiques provenant de cellules d'hépatome de rat traitées ou non avec l'insuline (10-7 M) et l'ARNm entier des CYP2E1 ou 2B1 marqué au 32P comme sonde, nous avons, par des expériences de protection à la RNase T1, mis en évidence un complexe majoritaire ARN/protéines. Grâce aà des fragments de ces ARNm puis des expériences de compétition avec des oligonucléotides antisens complémentaires, le site de liaison des protéines a été localisé pour chacun des CYP sur une séquence de 16 nucléotides, présentant entre-elles une homologie de 80%. . . .

L'invasion de l'hôte par un pathogène induit une réponse immunitaire innée qui aboutit à l'activation cellulaire, à une réaction inflammatoire et parfois à l'initiation d'une immunité acquise. Des différences fondamentales existent dans l'organisation de la réponse immune innée à un pathogène, d'une cellule , d'un organe, ou d'un individu à l'autre. L'organisation de la réponse immune innée en réponse à l'invasion bactérienne, parasitaire ou fongique nécessitent la coopération du récepteur de type Toll 2 (TLR2) avec TLR1 ou TLR6 et la formation de complexes d'activation dans les radeaux lipidiques, qui déterminent une réponse spécifique et adaptée au pathogène. Cependant, les mécanismes de rapprochement moléculaire et la régulation des voies de signalisation impliqués dans la réponse inflammatoire sont encore mal compris. L'objectif de ce travail était d'investiguer les mécanismes impliqués dans la reconnaissance et la signalisation via TLR2, ainsi que dans la variabilité du phénotype inflammatoire. Par une méthode d'analyse protéomique différentielle, nous avons étudié la composition moléculaire du complexe d'activation et les modifications post-traductionnelles en fonction du dimère de TLR2 engagé. Cette approche a permis d'identifier et caractériser le rôle de la tyrosine kinase Lyn et d'IMPDHII dans la régulation de la signalisation de TLR2. Enfin, dans une approche translationnelle nous avons étudié le rôle d'un polymorphisme du gène IRAK1, dont la protéine est en aval de la majorité des TLRs, dans la variabilité du phénotype chez des patients septiques. Ce travail introduit des perspectives nouvelles sur l'organisation, la régulation et la variabilité de la réponse immunitaire innée
Host invasion by micro-organisms induces an innate immune response that leads to cell activation, inflammation and potentially to the initiation of an adaptative response. Major differences are found within the organisation of innate immune responses depending on the pathogen, the invaded cell-type and the host itself. Initiation and organisation of innate immune responses facing bacteria, parasites, or fungi need the cooperation of Toll-like receptor 2 (TLR2) with TLR1 or TLR6, and multimolecular complexes in lipid rafts that determine a specific response. However, our understanding of molecular interactions within lipid rafts remains cryptic. Specifically, little is known regarding the composition of signaling complexes induced by distinct pathogens and the activation mechanisms involved in the initiation and regulation of a potent inflammatory response. The aim of this research project was to investigate the mechanisms involved in recognition and signaling downstream TLR2, and factors that account for variability of the inflammatory phenotype. For this purpose, we established a differential proteomic strategy to identiy the composition of TLR2 activation cluster and post-translationnal modifications of proteins after the recruitment of TLR2 dimers to lipid rafts. This approach enabled us to identify tyrosine-kinase Lyn and IMPDHII as essential regulators of TLR2 signaling. In a translational approach, we studied the effect of an haplotype of IRAKI gene, which codes for a key signaling protein downstream TLRs, on clinical variability in patients with septic shock. Our results provide new insights in ogranisation, regulation and variability of innate imune response

Des anticorps anti-CE (AECA) ont été identifiés dans un large éventail de maladies auto-immunes et/ou inflammatoires systémiques, en particulier dans la sclérodermie systémique (ScS), dans l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (HTAPi) et dans les vascularites systémiques, notamment dans l’artérite à cellules géantes (maladie de Horton). Ces anticorps peuvent jouer un rôle pathogène en activant les CE et en entrainant leur apoptose en particulier au cours de la ScS. Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux cibles des AECA. A l’aide d’une technique d’immunoblot en 2 dimensions utilisant des extraits protéiques totaux de CE de veine ombilicale humaine normale (HUVEC) suivie d’une analyse en spectrométrie de masse, nous avons étudié et identifié les cibles des AECA naturels contenus dans des préparations d’IgG humaines normales, les immunoglobulines intraveineuses (IVIg). De façon intéressante, très peu de ces antigènes avaient été précédemment rapportés comme étant des cibles des IgG auto-réactives naturelles et/ou contenues dans les IVIg. Dans un second temps, nous avons étudié les profils de réactivité des IgG sériques de patients ayant une ScS avec ou sans HTAP, une HTAPi ou une maladie de Horton et nous avons pu identifier des cibles antigéniques des AECA spécifiques de chacune de ces maladies. Parmi les cibles antigéniques les plus pertinentes identifiées dans chaque pathologie on trouve: la phosphoglycérate mutase 1 et la vimentine dans la ScS, les peroxyredoxines 1 et 2 dans la ScS avec HTAP, la profiline-1 dans l’HTAPi et la lamine A/C et la vinculine dans la maladie de Horton. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons étudié les protéomes de différents types de CE afin de déterminer si l’origine des CE influence leur reconnaissance par les AECA. Nous avons utilisé la technique «2-Dimensional Differential In Gel Electrophoresis» (2D-DIGE) pour comparer les protéomes de 4 donneurs caucasiens différents d’HUVEC et de cellules de microcirculation de peau (HMVEC-D) et de poumon (HMVEC-P) et nous avons trouvé des différences importantes d’expression des protéines entre les HUVEC et les CE de microcirculation. Dix-sept et 114 protéines avaient une expression différente d’un rapport d’au moins 1,5 entre les HUVEC et les HMVEC-P et entre les HUVEC et les HMVEC-D, respectivement. Un grand nombre de ces protéines était impliqué dans la prolifération et la survie des CE. En se servant du logiciel «Ingenuity» et des réseaux d’interaction de protéines qu’il a générés à partir des protéines différemment exprimées entre les HUVEC et les HMVEC-D, nous avons trouvé que 57% de ces protéines ont la capacité d’interagir avec l’acide rétinoïque et/ou avec le Transforming growth factor-beta, ce qui suggère une réponse différente de ces 2 types de CE en présence de chacune de ces molécules. Puis, en utilisant une technique d’immunoblot quantitatif en une dimension nous avons trouvé que les profils de réactivité des IgG sériques de patients atteints de ScS diffèrent selon le type de CE utilisé, HUVEC ou HMVEC-D. Au total, nous avons identifié des nouvelles cibles antigéniques des AECA dans la ScS, l’HTAPi et la maladie de Horton, la plupart d’entre elles étant impliquée dans le cycle et la survie cellulaires. Nous avons de plus démontré que les protéomes des CE de macrocirculation et de microcirculation diffèrent significativement et influencent la fonction et la reconnaissance immune des CE
The endothelium is composed of a thin layer of cells that lines the interior surface of blood vessels, thus forming an interface between circulating blood in the lumen and the rest of the vessel wall. These cells, named endothelial cells (EC), line the entire circulatory system, from the heart to the smallest capillaries. EC differ, depending on the vessel type where they are located. Anti-EC antibodies (AECA) were identified in a large panel of systemic auto-immune and/or inflammatory diseases, particularly in systemic lupus erythematosus, anti-phospholipid syndrome, systemic sclerosis (SSc), idiopathic pulmonary arterial hypertension (iPAH) and systemic vasculitis. These antibodies are able to activate EC and induce apoptosis, particularly in SSc. In the first part of this work, we were interested in the identification of target antigens of AECA in vascular inflammatory or autoimmune diseases. Using a 2-dimensional immunoblotting technique on total protein extracts of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) followed by mass spectrometry, we identified target antigens of AECA in normal human polyclonal IgG preparations, intravenous immunoglobulins (IVIg). Interestingly, very few of these antigens had previously been reported as targets of normal human self-reactive IgG and or detected in IVIg preparations. In addition, we investigated the reactivity profiles of serum IgG of patients with SSc with or without PAH, with iPAH or with giant cell arteritis (GCA) and we were able to identify specific target antigens of AECA in each of these conditions. Thus, we identified phosphoglycerate mutase 1 and vimentin in patients with SSc, peroxyredoxins 1 and 2 in SSc patients with PAH, profilin-1 in patients with iPAH and lamin A/C and vinculin in patients with GCA. In the second part of this work, we studied the proteomes of different types of EC to determine if the EC type can influence the recognition of these cells by AECA. We used the “2 Dimensional-Differential In Gel Electrophoresis” (2D-DIGE) to compare proteomes of 4 different caucasian donors HUVEC, pulmonary human microvascular EC (HMVEC-P) and dermal human microvascular EC (HMVEC-D) and found important differences between HUVEC and microvascular EC. Seventeen and 114 proteins showed at least a 1. 5 fold change expression between HUVEC and HMVEC-P and between HUVEC and HMVEC-D, respectively. A number of these proteins were involved in the proliferation and survival of EC. “Ingenuity” analysis showed that 57% of the 114 proteins differentially expressed between HUVEC and HMVEC-D were involved in susceptibility to retinoic acid and/or transforming growth factor-beta, which suggests that these 2 types of EC respond in a different manner in the presence of each of these molecules. Then, using a one-dimensional immunoblotting technique on HUVEC and HMVEC-D protein extracts, we found that reactivity profiles of serum IgG of patients with SSc differ between HUVEC and HMVEC-D. Overall, we were able to identify new target antigens of AECA in patients with SSc, iPAH or GCA. Most of these target antigens are involved in cell cycle and survival. However, the pathogenic role of these AECA needs further investigations. In addition, we have observed important differences between proteomes of macrovascular and microvascular EC and provided evidence that these differences influence EC function and immune recognition

Notre équipe vient de découvrir une méthode originale d’obtention d’extraits de Bacteroides thetaiotaomicron (E) qui préserve sa viabilité. Après culture anaérobie de ce commensal intestinal en milieu gélosé pauvre en facteurs de croissance, puis exposition à l’air, la bactérie semble posséder et générer dans E tout l’équipement de détoxication des espèces réactives de l’oxygène in vitro. Il laisse alors augurer d’un pouvoir thérapeutique à visée anti-inflammatoire.Objectifs et méthodes : Le but est d’abord de caractériser E, aux plans glucidique, lipidique et protéique. Dans ce dernier cas, il s’agit de séparer les protéines produites par la bactérie vivante et contenues dans E par électrophorèse bidimensionnelle et de les identifier par la technique des cartes peptidiques massiques. Les gels (n≥6) sont traités statistiquement (PDQuest®, Bio-Rad). Pour mieux localiser ces protéines dans la bactérie, elles sont comparées avec celles obtenues par destruction de B. thetaiotaomicron et identifiées dans la fraction cellulaire relative à la membrane bactérienne externe. Un travail de microscopie électronique est aussi entrepris pour visualiser les éventuels évènements intervenant pendant l’extraction.Le but est alors de vérifier, in vitro, l’effet antioxydant de l’extrait bactérien standardisé et d’en contrôler l’innocuité en modèles cellulaires utilisant le granulocyte neutrophile. L’effet thérapeutique anti-inflammatoire est ensuite recherché chez l’animal. L’action de E est d’abord évaluée en modèle murin d’inflammation cutanée auriculaire induite par dépôt de chlorure de benzalkonium, sous anesthésie générale. Des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas d’irritation sont testés en parallèle. L’épaisseur des oreilles est mesurée toutes les heures pendant 5 h et des coupes histologiques d’oreilles, effectuées au bout de 2 h chez certains animaux. Deux colorations différentes permettent alors d’évaluer la quantité de mastocytes dégranulant localement.L’action de E, administré par voie intra-rectale (IR), est ensuite testée chez des souris subissant les premières phases d’un processus inflammatoire, en modèle de colite aiguë. Celle-ci est induite per os par du dextran sulfate sodium (DSS) ; elle évolue sur 8 jours. Sont considérés en parallèle des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas de colite. Des scores cliniques et des scores histologiques de sévérité sont établis tous les jours de l’expérience. Des marqueurs de l’inflammation sont suivis dans les tissus murins après autopsie des animaux. [...]
Our team had discovered a new method to obtain extracts of Bacteroides thetaiotaomicron (E) which preserved its viability. This intestinal symbiont was anaerobically grown on an agar medium poorly supplemented in growth factors. After exposure to air, the bacterium seemed to possess and generate in E all the equipment able in vitro to detoxify reactive oxygen species. It let us expect a therapeutic power referred to anti-inflammatory properties.Objectives and methods: The aim was first to characterize E, in terms of carbohydrates, lipids and proteins. To achieve this last-mentioned goal, proteins contained in E coming from living bacteria were separated by two-dimensional electrophoresis and identified by the peptide mass fingerprinting technique. The gels (n ≥ 6) were statistically analyzed (PDQuest®, Bio-Rad). To find the origin of these proteins in bacteria, they were compared with those obtained by destruction of B. thetaiotaomicron (BT) and identified in the cell fraction containing the bacterial outer membrane proteins. Electron microscopy work was also undertaken to visualize any event occurring during extraction.The antioxidative effect of standardized E extracts was checked in vitro. E safety was also controlled in cell models using polymorphonuclear neutrophils. An E anti-inflammatory effect was then searched in animal models. E was first evaluated using a skin irritation mouse model. Inflammation was induced by benzalkonium chloride on ears of anesthetized mice. Positive and negative controls were treated in parallel. The ear thickness was measured every hour for 5 h and histological ear sections were performed after 2h for some animals. Two different staining methods enabled the enumeration of degranulating mast cells in ear sections.The effect of the bacterial extract was next tested locally by intrarectal (IR) instillations in mice undergoing the early stages of inflammation in a dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. This acute model evolved over 8 days. In parallel, positive and negative animal controls underwent or not the colitis and were treated or not. Clinical and colonic histological severity scores were daily determined. Inflammation markers were measured in mouse colonic tissues after animal autopsy. [...]