Academic literature on the topic 'Puces à ADN complémentaire'

Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape.
This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.

L'identification des organismes repose encore souvent sur des caractères phénotypiques. Cependant, ce type d'identification est imprécis et difficile pour des micro-organismes. Les puces à ADN semblent alors une solution d'avenir pour l'identification rapide et fiable d'un grand nombre d'espèces. Cependant, cette technique est récente et il est encore nécessaire de l'améliorer notamment au niveau conceptuel. Dans ce cadre, mon travail de thèse avait pour objectif de mettre en oeuvre de nouveaux moyens de conception de puces. Ces travaux ont été réalisés au travers de deux projets : Le projet " Aquachip " a eu pour objectif de concevoir une puce à ADN pour l'identification de pathogènes bactériens des eaux. Les importants flux d'information entre laboratoires sont souvent mal gérés et perturbent l'avancée des recherches. Nous avons alors développé une plateforme web dynamique, l'" E-dashboard " (MySQL, PHP), permettant à tous les partenaires de gérer les données relatives au projet. Cet outil a permis d'une part de suivre l'avancée du projet et d'autre part d'optimiser les échanges. Dans un second projet, " Mycochip ", l'objectif était de développer une puce à ADN pour identifier des champignons ectomycorhiziens. Les séquences ITS (Internal Transcribed Spacers) utilisées pour l'étude sont issues d'une région très divergente située entre les gènes de l'ARN ribosomique. Le projet a d'abord nécessité le développement d'un outil de rapatriement de séquences, EmblEx (Perl, MySQL), plus spécifique et performant que Entrez, SRS or ACNUC. Ensuite, la taxonomie imprécise des champignons nous a amené à concevoir une nouvelle méthode de classification par partitionnement sans alignement. Les expérimentations biologiques ont montré que des rapporteurs fiables peuvent être déterminés par cette approche
Identification of organisms are still often based on phenotypical characters. However, this type of identification is approximative and difficult for micro-organisms. DNA micro-arrays appear to be a solution for a fast and reliable identification of a large number of species. However, this technique is relatively recent and it is still necessary to improve it, in particular at the conceptual level. Within this framework, the objective of my thesis was to implement new means for chip design. This work was completed through two projects: The project "Aquachip" aimed in designing a DNA array for the identification of pathogenic bacteria present in bathing and drinking water. The project grouped several european laboratories that had to exchange a large amount of data. Such significant flow of information is often badly managed and slows down research. Consequently, we developed a dynamic numerical platform, the "E-dashboard" (MySQL, PHP), allowing all partners to manage data. This tool made it possible on the one hand to follow the progress of the various steps of the project and on the other hand to optimize exchanges between partners. In a second project, "Mycochip", the objective was to develop a DNA array to identify ectomychorizian fungi. ITS sequences (Internal Transcribed Spacers) from a very divergent area located between ribosomal RNA genes are used for this study. The project initially required the development of a tool to retrieve sequences, " EmblEx " (Perl, MySQL), which is more specific and powerful than Entrez, SRS or ACNUC. Then, the ambiguous taxonomy of fungi led us to conceive a new method of classification through partitioning without alignment. Biological experiments showed that reliable probes could be determined by this approach

Au cours de ce travail, nous avons clone et caracterise une adnc (tcac2) de trypanosoma cruzi qui code pour une proteine homologue aux proteines de stress de faible poids moleculaire et aux glutathion s-transferases. Cette homologie de sequence a ete renforcee par des analyses comparatives des profiles d'hydropathie et des structures secondaires (hca). De plus, la proteine native correspondante du stade epimastigote a ete purifiee sur une colonne d'affinite avec le s-hexylglutathion comme matrice et sequencee directement afin de prouver l'identite. Un serum dirige contre la proteine de fusion sj26gst/tcac2 (anti tcac2) reconnait dans les differents stades parasitaire de t. Cruzi, un seule antigene de 52 kda ayant un phi de 5,4. Cependant, aucun messager n'est detecte dans les formes trypomastigotes. La proteine tcac2, exprimee par le stade amastigote, semble persister apres la differenciation des formes amastigotes en formes trypomastigotes. Par ailleurs, l'expression de cette proteine augmente avec l'age et la densite de la culture epimastigote in vitro. La proteine tcac2 fait partie des composants d'excretion/secretion du parasite. Des antigenes portant une reactivite croisee ont ete detectes par le serum anti-tcac2, dans les differentes souches de t. Cruzi et les especes de t. Rangeli et t. Marinkelli. L'adnc obtenu par recouvrement (1648 pb), a partir de l'insert tcac2 et la region 5 obtenue par 5racepcr, revele un cadre de lecture ouvert codant pour une proteine d'environ 51 kda. Cependant, la taille du messager detecte en northern-blot est de 2500 bases pour t. Cruzi. D'une facon interessante, t. Marinkelli possede deux messagers de 1700 et de 2300 bases. Par ailleurs, l'immunisation de souris a l'aide de la proteine de fusion sj26gcst/tcac2 protege partiellement contre l'infection experimentale par t. Cruzi.

Cette thèse traite de questions statistiques soulevées par l'analyse de données génomiques de grande dimension, dans le cadre de la recherche contre le cancer. La première partie est consacrée à l'étude des propriétés asymptotiques de procédures de tests multiples visant à contrôler l'espérance (FDR) du taux de fausses découvertes (FDP) parmi les hypothèses rejetées. On introduit un formalisme flexible qui permet de calculer la loi asymptotique du FDP et les conditions de régularité associées pour une vaste famille de procédures de tests multiples, et de comparer la puissance de ces procédures. On s'intéresse ensuite aux liens en termes de contrôle du FDR entre les bornes intrinsèques à trois problèmes de tests multiples: la détection, l'estimation, et la sélection. On relie en particulier la vitesse de convergence dans le problème d'estimation à la régularité de la loi des probabilités critiques au voisinage de 1. La seconde partie est dédiée au développement de méthodes d'analyse des données de puces à ADN en cancérologie. On propose une méthode de pré-traitement des données de puces à ADN combinant une régression robuste et un modèle de mélange avec contrainte spatiale, qui permet d'éliminer les biais spatiaux en préservant le signal biologique. On développe ensuite une méthode d'inférence de régulations entre gènes à partir de données d'expression de gènes, qui repose sur des techniques d'apprentissage informatique et de tests multiples. Enfin, on construit un test génomique permettant de déterminer, pour une patiente traitée pour un cancer du sein, si un second cancer survenant sur le même sein est ou non une récidive du premier.

L'émergence des biotechnologies, telles que les puces ADN, a permis l'acquisition d'énormes quantités de données d'une cellule à un instant donné et sous certaines conditions. Elles sont devenues incontournables lorsqu'il s'agit de comprendre une maladie qui proviendrait d'une anomalie génomique perturbant le développement naturel entre la croissance, la division et la mort des cellules. En utilisant cette biotechnologie, l'objectif est d'identifier les gènes impliqués dans la maladie étudiée. Mais chaque puce donne l'information de plus de 19 000 gènes rendant difficile toute exploitation et analyse des résultats. La fouille de données a longtemps été étudiée pour mettre en évidence des corrélations non triviales à partir de grande base de données. Initialement proposées pour répondre aux interrogations des décideurs lorsqu'il s'agissait de mieux connaître le comportement des clients d'un supermarché, ces méthodes connaissent aujourd'hui un tel succès qu'elles ont été utilisées et adaptées dans divers domaines d'applications allant du marketing jusqu'à la santé. L'étude que nous proposons de mener est de proposer de nouvelles méthodes de fouille de données pour aider les biologistes à déduire de nouvelles connaissances à partir des données obtenues par l'analyse des puces ADN. Plus précisément, nous proposons de mettre en évidence des gènes fréquemment ordonnés selon leurs expressions et nous étudions l'apport de ce type d'information comme nouveau matériel d'étude pour les biologistes
The emergence of biotechnology, such as DNA chips, has acquired huge amounts of data in a cell at a given moment and under certain conditions. They are used in order to understand a disease whose origin is a genomic abnormality disrupting the natural development between growth, division and cell death. Using this biotechnology, the aim is to identify the genes involved in disease studied. But each chip gives information on more than 19,000 genes then it is difficult to use and to analyse the results. Methods of Data mining are used in order to find interesting correlations from large database. Initially proposed to address questions about the behavior of customers of a supermarket, these methods are now used and adapted in various fields of applications ranging marketing to health. In this study, we propose new methods in order to help biologists to deduce new knowledge from data obtained by DNA microarray analysis. Specifically, we propose to identify genes frequently ordered by their expressions and we study the contribution of such information as the new study material for biologists

Cette thèse traite de questions statistiques soulevées par l'analyse de données génomiques de grande dimension, dans le cadre de la recherche contre le cancer. La première partie est consacrée à l'étude des propriétés asymptotiques de procédures de tests multiples visant à contrôler l'espérance (FDR) du taux de fausses découvertes (FDP) parmi les hypothèses rejetées. On introduit un formalisme flexible qui permet de calculer la loi asymptotique du FDP et les conditions de régularité associées pour une vaste famille de procédures de tests multiples, et de comparer la puissance de ces procédures. On s'intéresse ensuite aux liens en termes de contrôle du FDR entre les bornes intrinsèques à trois problèmes de tests multiples: la détection, l'estimation, et la sélection. On relie en particulier la vitesse de convergence dans le problème d'estimation à la régularité de la loi des probabilités critiques au voisinage de 1. La seconde partie est dédiée au développement de méthodes d'analyse des données de puces à ADN en cancérologie. On propose une méthode de prétraitement des données de puces à ADN combinant une régression robuste et un modèle de mélange avec contrainte spatiale, qui permet d'éliminer les biais spatiaux en préservant le signal biologique. On développe ensuite une méthode d'inférence de régulations entre gènes à partir de données d'expression de gènes, qui repose sur des techniques d'apprentissage informatique et de tests multiples. Enfin, on construit un test génomique permettant de déterminer, pour une patiente traitée pour un cancer du sein, si un second cancer survenant sur le même sein est ou non une récidive du premier
This thesis deals with statistical questions raised by the analysis of high-dimensional genomic data for cancer research. In the first part, we study asymptotic properties of multiple testing procedures that aim at controlling the False Discovery Rate (FDR), that is, the expected False Discovery Proportion (FDP) among rejected hypotheses. We develop a versatile formalism to calculate the asymptotic distribution of the FDP an the associated regularity conditions, for a wide range of multiple testing procedures, and compare their asymptotic power. We then study in terms of FDR control connections between intrinsic bounds between three multiple testing problems: detection, estimation and selection. In particular, we connect convergence rates in the estimation problem to the regularity of the p-value distribution near 1. In the second part, we develop statistical methods to study DNA microarrays for cancer research. We propose a microarray normalization method that removes spatial biases while preserving the true biological signal; it combines robust regression with a mixture model with spatial constraints. Then we develop a method to infer gene regulations from gene expression data, which is based on learning and multiple testing theories. Finally, we build a genomic score to predict, for a patient treated for a breast tumor, whether or not a second cancer is a true recurrence of the first cancer

Les puces à ADN permettent d'étudier simultanément le niveau d'expression de plusieurs milliers de gènes. Ce travail est consacré à l'étude et au développement de méthodes statistiques pour l'analyse de données de puces à ADN. Une fois les données normalisées, on distingue deux problématiques : la recherche de gènes différentiellement exprimés entre deux conditions expérimentales et l'étude de profils d'expression. En raison de la variabilité expérimentale importante, des méthodes statistiques appropriées doivent être mises en place. Concernant l'identification de gènes différentiellement exprimés, nous montrons la nécessité de disposer de répétitions pour une analyse robuste. L'analyse de variance apparaît dans un premier temps une approche naturelle permettant de prendre en compte différents facteurs de variabilité. Une méthode plus complexe consisterait à introduire différentes composantes de la variance, en représentant les niveaux d'expression des gènes par des modèles linéaires mixtes. La classification de profils d'expression est abordée avec pour objectif de prendre en compte les problèmes de variabilité. La classification de données répétées permet de séparer pour chaque classe la variabilité due aux erreurs de mesure des effets aléatoires liés à des covariables. Notre approche est basée sur des modèles de mélange de modèles linéaires mixtes. Les unités statistiques d'une classe peuvent être caractérisées par différents modèles mixtes et plusieurs modèles de mélange sont envisagés. Choisissant un cadre probabiliste pour le problème de classification, la question du choix de modèle et du nombre de classes est résolue à l'aide de critères d'information
CDNA microarrays are a method for measuring simultaneously the expression levels of thousands of genes. In this work, we consider statistical methods for gene expression data analysis. After the normalization step, two problems can be considered: first the determination of a statistically significant change in gene expression between two experimental conditions and second the analysis of gene expression profiles. Data variability is one of the main difficulties that led us to develop specific methods. To detect differentially expressed genes, we describe the need for experimental replication to robustify the analysis. First, analysis of variance is investigated to determine which factors of variability are relevant. An ongoing work considers more complex approach that introduces different variance components. In this model, gene expression levels are represented by linear mixed models. In a next step, in order to account for data variability in gene expression profiles clustering, we propose to properly exploit the data repetitions. Repeated data clustering is an approach to isolate error measurements from covariable random effects. Our approach is based on mixed model mixture. For each class, statistic units can be characterized by different mixed models and several mixture models are considered. Within a probabilistic framework, the problem of selecting a particular mixed model mixture is solved minimizing information criteria

Dans le cadre de ce travail, différents procédés d'élaboration et de lecture de puces à ADN ont été mis au point. La méthode retenue pour l'élaboration des puces consiste à fonctionnaliser par silanisation des structures de type Si/SiO2 avec le chlorodiméthylsilylundécanoate de méthyle (CDSUM), puis après hydrolyse et activation des esters de méhtyle au n-hydroxysuccinimide (NHS), un aminopolyoxyde d'éthylène, lui-même greffé sur les esters activés, joue le rôle d'espaceur et assure une couverture de la surface par des terminaisons alcools primaires. Les substrats ainsi préparés permettent la synthèse d'oligonucléotides par la chimie des phosphoramidites. Des systèmes d'adressages, tels que la projection par jets et la fluidique, ont été réalisés pour localiser les réactions de synthèse à la surface des puces. Parallèlement aux systèmes d'adressage mécanique, une méthode de multifonctionnalisation par micro tamponnage a été développée, permettant d'optimiser la surface des substrats. Des travaux sur la lecture des puces ont été conduits selon différents procédés, tels que l'optoélectrochimie sur structure EDS ou la cartographie de fluorescence. Puis ces techniques ont été validées par radio-imagerie et XPS. Des puces réutilisables 20 fois, sans altération de réponse, hybridables par des oligonucléotides complémentaires et des fragments PCR doubles brins de 1. 5 kb, ayant une limite de détection de 10aM pour des hybridations oligonucléotides contre oligonucléotides, soit 5. 3 10-4 brins / ưm2 ont été obtenues, la sélectivité étant réalisée au mismatch près.