Dissertations / Theses on the topic 'Puces à ADN complémentaire'

Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape.
This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.

L'identification des organismes repose encore souvent sur des caractères phénotypiques. Cependant, ce type d'identification est imprécis et difficile pour des micro-organismes. Les puces à ADN semblent alors une solution d'avenir pour l'identification rapide et fiable d'un grand nombre d'espèces. Cependant, cette technique est récente et il est encore nécessaire de l'améliorer notamment au niveau conceptuel. Dans ce cadre, mon travail de thèse avait pour objectif de mettre en oeuvre de nouveaux moyens de conception de puces. Ces travaux ont été réalisés au travers de deux projets : Le projet " Aquachip " a eu pour objectif de concevoir une puce à ADN pour l'identification de pathogènes bactériens des eaux. Les importants flux d'information entre laboratoires sont souvent mal gérés et perturbent l'avancée des recherches. Nous avons alors développé une plateforme web dynamique, l'" E-dashboard " (MySQL, PHP), permettant à tous les partenaires de gérer les données relatives au projet. Cet outil a permis d'une part de suivre l'avancée du projet et d'autre part d'optimiser les échanges. Dans un second projet, " Mycochip ", l'objectif était de développer une puce à ADN pour identifier des champignons ectomycorhiziens. Les séquences ITS (Internal Transcribed Spacers) utilisées pour l'étude sont issues d'une région très divergente située entre les gènes de l'ARN ribosomique. Le projet a d'abord nécessité le développement d'un outil de rapatriement de séquences, EmblEx (Perl, MySQL), plus spécifique et performant que Entrez, SRS or ACNUC. Ensuite, la taxonomie imprécise des champignons nous a amené à concevoir une nouvelle méthode de classification par partitionnement sans alignement. Les expérimentations biologiques ont montré que des rapporteurs fiables peuvent être déterminés par cette approche
Identification of organisms are still often based on phenotypical characters. However, this type of identification is approximative and difficult for micro-organisms. DNA micro-arrays appear to be a solution for a fast and reliable identification of a large number of species. However, this technique is relatively recent and it is still necessary to improve it, in particular at the conceptual level. Within this framework, the objective of my thesis was to implement new means for chip design. This work was completed through two projects: The project "Aquachip" aimed in designing a DNA array for the identification of pathogenic bacteria present in bathing and drinking water. The project grouped several european laboratories that had to exchange a large amount of data. Such significant flow of information is often badly managed and slows down research. Consequently, we developed a dynamic numerical platform, the "E-dashboard" (MySQL, PHP), allowing all partners to manage data. This tool made it possible on the one hand to follow the progress of the various steps of the project and on the other hand to optimize exchanges between partners. In a second project, "Mycochip", the objective was to develop a DNA array to identify ectomychorizian fungi. ITS sequences (Internal Transcribed Spacers) from a very divergent area located between ribosomal RNA genes are used for this study. The project initially required the development of a tool to retrieve sequences, " EmblEx " (Perl, MySQL), which is more specific and powerful than Entrez, SRS or ACNUC. Then, the ambiguous taxonomy of fungi led us to conceive a new method of classification through partitioning without alignment. Biological experiments showed that reliable probes could be determined by this approach

Au cours de ce travail, nous avons clone et caracterise une adnc (tcac2) de trypanosoma cruzi qui code pour une proteine homologue aux proteines de stress de faible poids moleculaire et aux glutathion s-transferases. Cette homologie de sequence a ete renforcee par des analyses comparatives des profiles d'hydropathie et des structures secondaires (hca). De plus, la proteine native correspondante du stade epimastigote a ete purifiee sur une colonne d'affinite avec le s-hexylglutathion comme matrice et sequencee directement afin de prouver l'identite. Un serum dirige contre la proteine de fusion sj26gst/tcac2 (anti tcac2) reconnait dans les differents stades parasitaire de t. Cruzi, un seule antigene de 52 kda ayant un phi de 5,4. Cependant, aucun messager n'est detecte dans les formes trypomastigotes. La proteine tcac2, exprimee par le stade amastigote, semble persister apres la differenciation des formes amastigotes en formes trypomastigotes. Par ailleurs, l'expression de cette proteine augmente avec l'age et la densite de la culture epimastigote in vitro. La proteine tcac2 fait partie des composants d'excretion/secretion du parasite. Des antigenes portant une reactivite croisee ont ete detectes par le serum anti-tcac2, dans les differentes souches de t. Cruzi et les especes de t. Rangeli et t. Marinkelli. L'adnc obtenu par recouvrement (1648 pb), a partir de l'insert tcac2 et la region 5 obtenue par 5racepcr, revele un cadre de lecture ouvert codant pour une proteine d'environ 51 kda. Cependant, la taille du messager detecte en northern-blot est de 2500 bases pour t. Cruzi. D'une facon interessante, t. Marinkelli possede deux messagers de 1700 et de 2300 bases. Par ailleurs, l'immunisation de souris a l'aide de la proteine de fusion sj26gcst/tcac2 protege partiellement contre l'infection experimentale par t. Cruzi.

Cette thèse traite de questions statistiques soulevées par l'analyse de données génomiques de grande dimension, dans le cadre de la recherche contre le cancer. La première partie est consacrée à l'étude des propriétés asymptotiques de procédures de tests multiples visant à contrôler l'espérance (FDR) du taux de fausses découvertes (FDP) parmi les hypothèses rejetées. On introduit un formalisme flexible qui permet de calculer la loi asymptotique du FDP et les conditions de régularité associées pour une vaste famille de procédures de tests multiples, et de comparer la puissance de ces procédures. On s'intéresse ensuite aux liens en termes de contrôle du FDR entre les bornes intrinsèques à trois problèmes de tests multiples: la détection, l'estimation, et la sélection. On relie en particulier la vitesse de convergence dans le problème d'estimation à la régularité de la loi des probabilités critiques au voisinage de 1. La seconde partie est dédiée au développement de méthodes d'analyse des données de puces à ADN en cancérologie. On propose une méthode de pré-traitement des données de puces à ADN combinant une régression robuste et un modèle de mélange avec contrainte spatiale, qui permet d'éliminer les biais spatiaux en préservant le signal biologique. On développe ensuite une méthode d'inférence de régulations entre gènes à partir de données d'expression de gènes, qui repose sur des techniques d'apprentissage informatique et de tests multiples. Enfin, on construit un test génomique permettant de déterminer, pour une patiente traitée pour un cancer du sein, si un second cancer survenant sur le même sein est ou non une récidive du premier.

L'émergence des biotechnologies, telles que les puces ADN, a permis l'acquisition d'énormes quantités de données d'une cellule à un instant donné et sous certaines conditions. Elles sont devenues incontournables lorsqu'il s'agit de comprendre une maladie qui proviendrait d'une anomalie génomique perturbant le développement naturel entre la croissance, la division et la mort des cellules. En utilisant cette biotechnologie, l'objectif est d'identifier les gènes impliqués dans la maladie étudiée. Mais chaque puce donne l'information de plus de 19 000 gènes rendant difficile toute exploitation et analyse des résultats. La fouille de données a longtemps été étudiée pour mettre en évidence des corrélations non triviales à partir de grande base de données. Initialement proposées pour répondre aux interrogations des décideurs lorsqu'il s'agissait de mieux connaître le comportement des clients d'un supermarché, ces méthodes connaissent aujourd'hui un tel succès qu'elles ont été utilisées et adaptées dans divers domaines d'applications allant du marketing jusqu'à la santé. L'étude que nous proposons de mener est de proposer de nouvelles méthodes de fouille de données pour aider les biologistes à déduire de nouvelles connaissances à partir des données obtenues par l'analyse des puces ADN. Plus précisément, nous proposons de mettre en évidence des gènes fréquemment ordonnés selon leurs expressions et nous étudions l'apport de ce type d'information comme nouveau matériel d'étude pour les biologistes
The emergence of biotechnology, such as DNA chips, has acquired huge amounts of data in a cell at a given moment and under certain conditions. They are used in order to understand a disease whose origin is a genomic abnormality disrupting the natural development between growth, division and cell death. Using this biotechnology, the aim is to identify the genes involved in disease studied. But each chip gives information on more than 19,000 genes then it is difficult to use and to analyse the results. Methods of Data mining are used in order to find interesting correlations from large database. Initially proposed to address questions about the behavior of customers of a supermarket, these methods are now used and adapted in various fields of applications ranging marketing to health. In this study, we propose new methods in order to help biologists to deduce new knowledge from data obtained by DNA microarray analysis. Specifically, we propose to identify genes frequently ordered by their expressions and we study the contribution of such information as the new study material for biologists

Cette thèse traite de questions statistiques soulevées par l'analyse de données génomiques de grande dimension, dans le cadre de la recherche contre le cancer. La première partie est consacrée à l'étude des propriétés asymptotiques de procédures de tests multiples visant à contrôler l'espérance (FDR) du taux de fausses découvertes (FDP) parmi les hypothèses rejetées. On introduit un formalisme flexible qui permet de calculer la loi asymptotique du FDP et les conditions de régularité associées pour une vaste famille de procédures de tests multiples, et de comparer la puissance de ces procédures. On s'intéresse ensuite aux liens en termes de contrôle du FDR entre les bornes intrinsèques à trois problèmes de tests multiples: la détection, l'estimation, et la sélection. On relie en particulier la vitesse de convergence dans le problème d'estimation à la régularité de la loi des probabilités critiques au voisinage de 1. La seconde partie est dédiée au développement de méthodes d'analyse des données de puces à ADN en cancérologie. On propose une méthode de prétraitement des données de puces à ADN combinant une régression robuste et un modèle de mélange avec contrainte spatiale, qui permet d'éliminer les biais spatiaux en préservant le signal biologique. On développe ensuite une méthode d'inférence de régulations entre gènes à partir de données d'expression de gènes, qui repose sur des techniques d'apprentissage informatique et de tests multiples. Enfin, on construit un test génomique permettant de déterminer, pour une patiente traitée pour un cancer du sein, si un second cancer survenant sur le même sein est ou non une récidive du premier
This thesis deals with statistical questions raised by the analysis of high-dimensional genomic data for cancer research. In the first part, we study asymptotic properties of multiple testing procedures that aim at controlling the False Discovery Rate (FDR), that is, the expected False Discovery Proportion (FDP) among rejected hypotheses. We develop a versatile formalism to calculate the asymptotic distribution of the FDP an the associated regularity conditions, for a wide range of multiple testing procedures, and compare their asymptotic power. We then study in terms of FDR control connections between intrinsic bounds between three multiple testing problems: detection, estimation and selection. In particular, we connect convergence rates in the estimation problem to the regularity of the p-value distribution near 1. In the second part, we develop statistical methods to study DNA microarrays for cancer research. We propose a microarray normalization method that removes spatial biases while preserving the true biological signal; it combines robust regression with a mixture model with spatial constraints. Then we develop a method to infer gene regulations from gene expression data, which is based on learning and multiple testing theories. Finally, we build a genomic score to predict, for a patient treated for a breast tumor, whether or not a second cancer is a true recurrence of the first cancer

Les puces à ADN permettent d'étudier simultanément le niveau d'expression de plusieurs milliers de gènes. Ce travail est consacré à l'étude et au développement de méthodes statistiques pour l'analyse de données de puces à ADN. Une fois les données normalisées, on distingue deux problématiques : la recherche de gènes différentiellement exprimés entre deux conditions expérimentales et l'étude de profils d'expression. En raison de la variabilité expérimentale importante, des méthodes statistiques appropriées doivent être mises en place. Concernant l'identification de gènes différentiellement exprimés, nous montrons la nécessité de disposer de répétitions pour une analyse robuste. L'analyse de variance apparaît dans un premier temps une approche naturelle permettant de prendre en compte différents facteurs de variabilité. Une méthode plus complexe consisterait à introduire différentes composantes de la variance, en représentant les niveaux d'expression des gènes par des modèles linéaires mixtes. La classification de profils d'expression est abordée avec pour objectif de prendre en compte les problèmes de variabilité. La classification de données répétées permet de séparer pour chaque classe la variabilité due aux erreurs de mesure des effets aléatoires liés à des covariables. Notre approche est basée sur des modèles de mélange de modèles linéaires mixtes. Les unités statistiques d'une classe peuvent être caractérisées par différents modèles mixtes et plusieurs modèles de mélange sont envisagés. Choisissant un cadre probabiliste pour le problème de classification, la question du choix de modèle et du nombre de classes est résolue à l'aide de critères d'information
CDNA microarrays are a method for measuring simultaneously the expression levels of thousands of genes. In this work, we consider statistical methods for gene expression data analysis. After the normalization step, two problems can be considered: first the determination of a statistically significant change in gene expression between two experimental conditions and second the analysis of gene expression profiles. Data variability is one of the main difficulties that led us to develop specific methods. To detect differentially expressed genes, we describe the need for experimental replication to robustify the analysis. First, analysis of variance is investigated to determine which factors of variability are relevant. An ongoing work considers more complex approach that introduces different variance components. In this model, gene expression levels are represented by linear mixed models. In a next step, in order to account for data variability in gene expression profiles clustering, we propose to properly exploit the data repetitions. Repeated data clustering is an approach to isolate error measurements from covariable random effects. Our approach is based on mixed model mixture. For each class, statistic units can be characterized by different mixed models and several mixture models are considered. Within a probabilistic framework, the problem of selecting a particular mixed model mixture is solved minimizing information criteria

Dans le cadre de ce travail, différents procédés d'élaboration et de lecture de puces à ADN ont été mis au point. La méthode retenue pour l'élaboration des puces consiste à fonctionnaliser par silanisation des structures de type Si/SiO2 avec le chlorodiméthylsilylundécanoate de méthyle (CDSUM), puis après hydrolyse et activation des esters de méhtyle au n-hydroxysuccinimide (NHS), un aminopolyoxyde d'éthylène, lui-même greffé sur les esters activés, joue le rôle d'espaceur et assure une couverture de la surface par des terminaisons alcools primaires. Les substrats ainsi préparés permettent la synthèse d'oligonucléotides par la chimie des phosphoramidites. Des systèmes d'adressages, tels que la projection par jets et la fluidique, ont été réalisés pour localiser les réactions de synthèse à la surface des puces. Parallèlement aux systèmes d'adressage mécanique, une méthode de multifonctionnalisation par micro tamponnage a été développée, permettant d'optimiser la surface des substrats. Des travaux sur la lecture des puces ont été conduits selon différents procédés, tels que l'optoélectrochimie sur structure EDS ou la cartographie de fluorescence. Puis ces techniques ont été validées par radio-imagerie et XPS. Des puces réutilisables 20 fois, sans altération de réponse, hybridables par des oligonucléotides complémentaires et des fragments PCR doubles brins de 1. 5 kb, ayant une limite de détection de 10aM pour des hybridations oligonucléotides contre oligonucléotides, soit 5. 3 10-4 brins / ưm2 ont été obtenues, la sélectivité étant réalisée au mismatch près.

De l’ADN libre circulant (ADNc) dérivant de la tumeur peut être isolé dans le plasma des patients présentant un cancer. Cet ADNc tumoral (ADNct) permet un accès indirect à la tumeur puisqu’il porte les même caractéristiques génétiques et épigénétiques et représente une biopsie liquide. Nous avons évalué l’intérêt du séquençage ciblé de l’ADNct comme biomarqueur de réponse à des thérapies ciblées développées en phase précoce en oncologie. Dans la première partie de ce travail, nous avons évalué les mutations identifiables par séquençage de l’ADNct d’une cohorte de 39 patients recevant un traitement anti-cancéreux dans le cadre d’un essai thérapeutique de phase I. Un total de 157 échantillons de plasma a été séquencé avec une couverture moyenne de 1685x. A l’initiation du traitement, 23 des 39 patients (59%) avaient au moins une mutation identifiable dans l’ADNct. Parmi les 44 mutations identifiées, TP53, PIK3CA et KRAS étaient les gènes les plus fréquemment mutés avec des fréquences de 41%, 20% et 18% respectivement. Dans un second temps, l’ADNc des patients ayant des mutations identifiées a été collecté et séquencés tous les mois au cours du traitement jusqu’à progression. Parmi les 23 patients, 13 ont reçu une thérapie ciblant directement l’anomalie moléculaire identifiée. Le suivi longitudinal des mutations identifiées dans l’ADNct et la dynamique des fréquences alléliques pendant le traitement a mis en évidence des variations associées à la réponse thérapeutique. Par ailleurs, pour les patients présentant plusieurs mutations identifiées dans un même échantillon d’ADNct, le suivi de ces mutations a mis en évidence la présence de clones évoluant de manière discordante au cours du traitement. Les variations quantitatives des fréquences alléliques des mutations dans l’ADNct étaient associées au temps jusqu’à progression sous traitement. L’ADNct est un biomarqueur d’intérêt pour le développement des thérapies ciblées en oncologie fait l’objet de nombreux développement en oncologie qui seront discutés dans ce travail
Circulating cell free DNA (ccDNA) deriving from tumor can be isolated in plasma of cancer patients. This circulating tumor DNA (ctDNA) shared the same genetics and epigenetics characteristics with the tumor and represents virtually a liquid biopsy. We evaluated whether targeted next-generation sequencing (NGS) of circulating tumor DNA (ctDNA) could be used for patient selection and as a tumor clone response biomarker in 39 patients with advanced cancers participating in early-phase clinical trials of targeted drugs. Overall, 159 plasma samples were sequenced with a mean sequencing coverage achieved of 1,685X across experiments. At trial initiation (C1D1), 23 of 39 (59%) patients had at least one mutation identified in cfDNA. Out of the 44 mutations identified at C1D1, TP53, PIK3CA and KRAS were the top three mutated genes identified, with 18 (41%), nine (20%), eight (18%) different mutations, respectively. In the second part of this work, we performed sequential NGS of ctDNA for the 23 patients with cfDNA mutation identified at C1D1. The monitoring of mutation allele frequency (AF) in consecutive plasma samples during treatment with targeted drugs demonstrated potential treatment associated clonal responses. Longitudinal monitoring of cfDNA samples with multiple mutations indicated the presence of separate clones behaving discordantly. Molecular changes at cfDNA mutation level were associated with time to disease progression. Targeted NGS of ctDNA has potential clinical utility to monitor the delivery of targeted therapies and future directions are discussed

Les glioblastomes multiformes sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus agressifs. La médiane de survie des patients n’excède pas 12 à 15 mois. Des anomalies du métabolisme glucidique ont été décrites dans les glioblastomes, tel un taux anormalement élevé de glycogène. Au cours de ce travail, nous avons modulé, par une stratégie ADNc antisens, le taux de glycogène d’une lignée cellulaire humaine de glioblastome. Nous avons montré que des ADNc dirigés contre des enzymes impliquées directement ou indirectement dans la synthèse du glycogène induisent une diminution, in vitro, de l’invasion et de la prolifération cellulaire. De même, in vivo, la taille des tumeurs induites chez la souris immuno-déprimée est diminuée. Ceci est associé à une modification du taux des protéines impliquées dans l'apoptose et dans le cytosquelette. Le métabolisme glucidique est donc déterminant dans la tumorigenèse cérébrale et peut représenter de nouvelles cibles thérapeutiques et diagnostiques.

Après le clonage d'un ADNc nitrate réductase nous avons isolé et séquencé le gène structural nitrate réductase (nia) de la chicorée de Bruxelles (Cichorium intybus L. ) par PCR. L'analyse par hybridation génomique laisse supposer la présence d'un seul gène nia par génome haploïde. Le gène de 5222 bp possède trois introns situés dans la partie molybdique et code pour une protéine de 920 acides aminés. La séquence en acides aminés de la protéine nitrate réductase (NR) de chicorée avec les NR d'autres espèces présente un taux d'homologie jusqu'à 78%. Dans les jeunes plantules l'activité nitrate réductase est 10 fois plus importante dans les racines que dans les feuilles. Nous avons pu mettre en évidence une régulation spatiale du gène nia selon la concentration en nitrate de la solution nutritive. Les hybridations in situ montrent que pour une concentration de 200 mM de nitrate le gène s'exprime d'une façon homogène dans le parenchyme de la racine ainsi que dans l'apex, tandis qu'à une concentration de 5 mM l'expression se situe principalement dans la stèle et également dans l'apex racinaire. Dans des cultures de suspensions cellulaires de chicorée, l'activité NR est maximale au 3ème jour, puis elle diminue lorsque le saccharose du milieu est épuisé. Les activités enzymatiques impliquées dans le métabolisme du saccharose (invertase [INV], saccharose synthase [SS], et saccharose phosphate synthase [SPS]) présentent le même profil que l'ANR. L'acide abscissique à 10-4 m provoque une inhibition de la croissance cellulaire, inhibe les activités INV, SS et SPS mais augmente paradoxalement l'ANR. Cet accroissement de l'ANR n'est pas lie à une modification de l'activité transcriptionnelle, mais peut éventuellement s'expliquer par un apport plus important de pouvoirs réducteurs. Une régulation post-traductionnel de la NR et de la SPS s'exerce apparemment par des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation.

La détection de séquences génétiques par la technologie des puces à ADN se heurte à des problèmes de fiabilité et de reproductibilité, dus en grande partie à des problèmes de mélange. Dans toute cette thèse, nous montrons à quel point le mélange par advection chaotique améliore les performances de ces puces. Pour cela nous comparons, par une étude principalement numérique, l'efficacité de deux protocoles de mélange basés sur le principe d'injection alternée et périodique de fluide (modèle puits/sources) : l'un utilise des seringues réversibles, l'autre des pompes recyclant le fluide extrait, conduisant globalement à un mélange bien plus efficace et rapide. En outre, nous mettons en évidence le rôle important de la géométrie de la chambre. Dans un second temps, nous introduisons un modèle de capture chimique entre les monobrins d'ADN libres en volume (cibles) et ceux fixés sur la puce (sondes). Nous montrons alors numériquement que la réaction est généralement grandement limitée par la diffusion, mais que l'advection chaotique améliore les choses de manière très significative grâce au mélange. Ceci nous permet d'estimer les constantes de vitesses dans le cas statique (où la diffusion agit seule) et le cas dynamique (avec mélangeur). Enfin, profitant de l'opportunité d'un stage à l'Université de Sherbrooke, j'ai effectué un premier suivi en temps réel par SPR d'une cinétique de type "cibles en solution/sondes sur support" pour tenter de comparer les vitesses d'hybridation statique et dynamique.

L'analyse chromosomique sur puce ADN (ACPA) tend à devenir le principal examen diagnostique dans la déficience intellectuelle (DI). Parmi les techniques d'ACPA, les puces SNP ont l'intérêt de pouvoir détecter les pertes d'hétérozygotie, et par conséquent d'identifier les isodisomies uniparentales (iUPD) et les zones d'identité liées à la consanguinité. Nous avons étudié une cohorte de 1 187 patients atteints de DI, dans un cadre diagnostique, sur puces SNP. Nous avons réalisé, par cette étude, 145 diagnostics (12%) dont 2 iUPD et 6 délétions n'incluant qu'un seul gène. De plus, nous avons détecté 639 CNV rares non décrits chez des sujets contrôles et incluant des séquences codantes, ce qui nous a permis d'identifier 11 gènes candidats dans la DI : CAMTA1, SP3, CNTNAP4, NUDT12, STXBP6, DOCK8, DOCK10, SMARCA2, NYAP2, ATAD3A et ATAD3B. Nous avons tenté de valider l'implication de ces gènes par séquençage, mais n'avons trouvé de seconde mutation pour aucun d'entre eux. Toutefois, des réarrangements de CAMTA1 ont été retrouvés dans 2 autres familles avec un phénotype homogène (DI et ataxie congénitale) ce qui nous a permis d'affirmer qu'il s'agit d'un gène de DI. Par ailleurs, l'homozygosity mapping, réalisé avec puces SNP, a identifié, par séquençage whole exome, une mutation non-sens homozygote du gène BUD13 dans une famille de DI syndromique. Enfin, de façon fortuite, nous avons caractérisé en ACPA une translocation familiale entraînant une disruption d'un gène d'ataxie spino-cérébelleuse, ATXN10, ce qui a permis de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie. Au total, notre étude démontre l'intérêt des puces SNP dans la DI, d'une part en diagnostic et d'autre part pour l'identification de nouveaux gènes responsables de DI.

De nombreuses méthodes variées permettent d'analyser les puces à ADN. L'utilisation préférentielle de l'une ou l'autre des méthodes dépend en grande partie de l'objectif attendu. Ce travail décrit dans un premier temps deux études illustrant des cas où les puces à ADN sont un outil exploratoire performant ayant permis, par des analyses basiques mais adaptées, de découvrir des pistes validées au cours d'expériences complémentaires. Ensuite, ce travail décrit la mise au point d'une nouvelle méthode d'analyse ne permettant pas de mettre en évidence les gènes d'intérêt mais les fonctions d'intérêt dans un modèle étudié par puces à ADN, SBIME (Searching for a Biological Interprétation from Microarray Experiments). En utilisant SBIME, nous avons mis en évidence l'importance des voies d'oxydo-réduction dans la résistance au docetaxel de certains cancers du sein. Par ailleurs, cet outil a contribué à souligner le rôle majeur du cytosquelette d'actine dans les mécanismes de résistance des cellules tumorales aux lymphocytes T. Notre nouvelle méthode a également été utile pour la compréhension des différences entre trois classes de neuroblastome. Enfin, SBIME a permis de mettre en évidence l'importance des mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN dans la rechute métastatique du mélanome. Pour finir, nous présentons deux études approfondies pour lesquelles l'utilisation de notre outil n'était pas adaptée. La première étude a établi les liens entre la polyploïdisation et la différenciation des mégacaryocytes. La deuxième étude a permis de mettre en exergue des liens remarquables entre la sélection thymique et l'apoptose neuronale
There are numerous methods available for the analysis of microarray experimente and the choice of method primarily depends on the awaited objective. Firstly, this work describes two studies illustrating cases where DNA chips are a powerful exploratory tool allowing, by basic but adapted analysis, to discover tracks validated during complementary experiments. Secondly, this work describes the development of a new method of analysis, SBIME (Searching for a Biological Interpretation from Microarray Experiments), that highlight functions of interest instead of genes of interest in a model studied by DNA microarrays. By using SBIME, we have highlighted the importance of the oxydoreduction pathway in docetaxel resistance of certain breast cancers. In addition, this tool contributed to outlining the major role of the actin cytoskeleton during the resistance of tumoral cells to T lymphocytes. Our new method has also been useful for the comprehension of the differences between three classes of neuroblastoma. Lastly, SBIME has emphasized the importance of DNA repair and replication mechanisms in the metastatic relapse of melanoma. In conclusion of this work, we present two in-depth studies for which the use of our tool was not adapted. The first study has established the relationships between the polyploidization and the differentiation of the megakaryocytes. The second study has put forward remarkable links between thymic selection and neuronal apoptosis

Une identification multiparamétrique et non biaisée des bactéries et virus d'un prélèvement peut influencer les décisions des autorités sanitaires. L'objectif de ce travail était d'établir l'utilité de la technologie des puces ; ADN pour une identification rapide de pathogènes d'un échantillon clinique. Une puce à ADN basée sur Ia technologie de reséquençage a été conçue pour l'identification de 50 bactéries, de 42 virus et de 619 gène qui codent pour la résistance aux antibiotiques ou pour des toxines. Ce travail a consisté en le choix de gènes et des sondes pour l'identification des pathogènes ainsi que le développement d'un protocole d'extraction et d'amplification des acides nucléiques d'origine bactérienne et virale. Un grand nombre de pathogènes ont été testés avec réussite permettant ainsi la validation de la première version de la puce. Des expériences ont permis d'évaluer les capacités à identifier des pathogènes en mélange afin de mimer ui contexte clinique. En effet, trois syndromes majeurs ont été reproduits comprenant plusieurs pathogènes L'identification de ces derniers et de leurs éléments génétiques ont été réalisés avec succès. La capacité à identifier un mélange a été confirmée par l'identification du virus MonkeyPox et d'un Staphylococcus aureus multirésistant provenant d'un échantillon de croûte. Enfin, ce travail a montré une corrélation étroite entre le résultats de l'antibiogramme et le profil de résistance aux antibiotiques prédit par la puce. En conclusion, cette technologie montre des avantages pour une détection multipathogène même si un excès d'ADN eucaryote limite encore quelque peu la sensibilité
Unbiased and multiparametric identification of bacteria and viruses present in clinical samples can influence the therapeutic decisions taken by health authorities. The objective of this work was to establish a DNA microarray technology for the rapid identification of pathogens in clinical specimens. A microarray based on resequencing technology was designed for the identification of 50 bacteria, 42 viruses and 619 genes encoding antibiotic resistance and toxins. Elaboration of the first generation microarray involved chosing the genes and probes for the identification of pathogens as well as developing extraction and amplification protocols of nucleic acids from bacterial and viral genomes. A large number of pathogens were successfully tested allowing us to validate this first generation microarray. Some experiments were carried out to evaluate the capacity of the array to identify several pathogens in a mixture mimicking the clinical context. Three major syndromes were reproduced comprising several different pathogens and these were ail identified successfully The ability to identify individual pathogens in complex mixtures was also successfully demonstrated by the detection of MonkeyPox virus and multiresistant Staphylococcus aureus in a human scab. Finally, there was excellent correlation between the antibiotic resistance profile detected on the antibiogram and the resistance profile predicted by the chip. In conclusion, resequencing array technology presents many advantages for multipathogen identification even though an excess of eukaryotic DNA still limits slightly the sensitivity of the detection

L'analyse anatomo-pathologique des tumeurs cérébrales ne semble pas être en mesure d'assurer dans tous les cas un diagnostic et un pronostic fiables, et par conséquent une stratégie thérapeutique adaptée. Dans le but de proposer de nouvelles classifications neuropathologiques ainsi que de nouveaux marqueurs moléculaires des gliomes, des profils d'expressions caractéristiques des différents types de tumeurs sont définis en utilisant la technologie "microarray". Une nouvelle méthode de puce à ADN, contenant des oligonucléotides longs sur support de nylon avec détection radioactive a été développée. Par ailleurs, d'importantes adaptations ont été réalisées, dictées par les contraintes liées aux prélèvements cliniques. L'étude du transcriptome des tumeurs cérébrales révèle 55 gènes différentiellement exprimés entre les gliomes malins de haut grade et les gliomes non évolutifs de bas grade; et l'analyse par "clustering hiérarchique" de 27 échantillons montre des profils d'expression génétique permettant une meilleure caractérisation des différents types tumoraux. De même, la forte vascularisation décrite comme étant un des critères histologiques caractéristiques des glioblastomes, corrèlant avec un mauvais pronostic, nous a conduit à étudier l'effet de deux inhibiteurs de l'angiogénèse, l'endostatine et le Neovastat. L'analyse de l'expression des gènes des cellules endothéliales traitées par ces inhibiteurs, a mis en évidence un certain nombre d'acteurs moléculaires impliqués dans le processus anti-angiogénique, et ouvre de nouvelles perspectives expérimentales et thérapeutiques.

Un procédé d'immobilisation d'ADN de manière covalente, robuste et reproductible a été développé dans le cadre de ce travail. La méthode sélectionnée pour l'immobilisation des brins d'ADN consiste à faire réagir des oligonucléotides porteurs d'une amine primaire terminale sur les surfaces. La réaction sur des acides activés crée des liaisons covalentes de type amide très stables chimiquement. La fonctionnalisation du support est obtenue par greffage chimique du[diméthyl(diméthylamino)silyl] undécanoate de tertiobutyle, déprotection des fonctions ester et activation au N-hydroxysuccinimide (NHS) des fonctions acide formées. Le choix d'un silane monofonctionnel permet d'obtenir des greffages plus reproductibles qu'avec les silanes trifonctionnels habituellement utilisés. Les densités de greffage dépendent du nombre de silanols présents en surface de l'échantillon. Ainsi des densités de greffage de 1,4 micron mol/m2 ont été mesurées par FTIR-ATR sur de la silice thermique qui possède une faible densité de silanols. Les fonctions acide sont obtenues en conditions douces par formation d'ester de silyle facilement hydrolysable dans l'eau. La réaction des oligonucléotides modifiés par un aminolinker sur les acides activés au NHS se fait à partir de solutions diluées grâce à un séchage in situ des gouttes déposées. Cette méthode donne des densités d'immobilisation, après lavage, de 4xlO puiss. 11 brins/cm2. Ces supports permettent d'hybrider des oligonucléotides complémentaires et des fragments PCR doubles brins de 1,5 kb. Le greffage covalent permet d'utiliser ces dispositifs dans des cycles d'hybridation / dénaturation successifs
A process of covalently, reliability and reusability of DNA immobilization has been developed in this work. The selected method for the immobilization of DNA strand consists to make reaction between oligonucleotides carrying terminals primaries amines with the surfaces. The reaction on activated acids creates covalent bounds of very chemically stable amide type. The substrate functionalization is performed by chemical grafting of the t-butyl [dimethyl (diméthylamino) sily] undecanoate following with a deprotection step of the ester and activation of the leading acids with the N-hydroxysuccinimide (NHS). The choice of a monofunctional silane allows to obtain more reproducible grafting than with the usually trifunctionals used. The grafting densities depend of the number of silanols presents on the surface sample. Thus grafting densities of 1. 4 micron mol/m2 have been measured by FTIR-ATR on thermal silica that possess a low density of silanols. The acid function are generated under mild conditions by formation of silyl ester easily hydrolysable with water. The reaction of amino-modified oligonucleotides on NHS ester activated is carried out from diluted solutions thanks an in-situ drying of the deposited drops. This process gives immobilisation densities of 4x10 puis. 11 strands/cm2. These substrates allow to hybrid complementary oligonucleotides and large double strands PCR fragments (1. 5 kb). The covalent grafting allows to use these devices in successive hybridization-denaturation cycles

L'estimation de la biodiversité bactérienne est généralement effectuée par PCR, clonage et séquençage d'un grand nombre de séquences d'ADN ribosomique 16S (ADNr 16S). L'abondance de ces séquences dans les bases de données publiques permet désormais d'envisager la réalisation d'une puce à ADN qui rendrait de telles études beaucoup plus rapide. De plus, l'ADNr 16S étant constitué d'une succession de domaines dont les vitesses d'évolution sont très variables, de relativement élevée à presque nulle, il constitue un candidat idéal pour déterminer des rapporteurs permettant l'identification des bactéries à différents niveaux taxonomiques. De telles séquences constitueraient d'excellents rapporteurs, capables de détecter des bactéries jusqu'ici inconnues. Couplés à des rapporteurs spécifiques de chaque espèce connue, ceux-ci permettraient de réaliser une puce à ADN capable d'identifier une bactérie isolée mais aussi d'estimer la diversité bactérienne à des échelles supérieures à celle de l'espèce. Mon projet de thèse a consisté à vérifier la faisabilité d'une telle puce à ADN. Ce projet a nécessité la création d'EmblEx (Perl / HTML), un outil de collecte de séquences à partir des bases de données publiques, plus spécifique et plus précis que les outils disponibles jusqu'ici. Les séquences rapatriées ont alors été réparties en classes, sans alignement préalable. En effet, l'analyse des résultats de BLAST permet de créer une matrice de distances directement utilisable par un algorithme de partitionnement. Chaque classe a ensuite été mise en relation avec la taxonomie existante pour vérification. Des rapporteurs spécifiques à chaque classe peuvent alors être identifiés. Ainsi, un rapporteur permettra d'identifier un ordre donné alors qu'un autre identifiera une classe
Estimating bacterial biodiversity is often carried out after PCR, cloning and sequencing of a large number of 16S ribosomal RNA gene sequences (16S rDNA). The large number of such sequences in the public databases makes it now possible to consider a DNA chip to study bacterial diversity. 16S rDNA which is composed of a succession of domains of relatively high to very low rates of divergence is an ideal candidate to design probes allowing bacterial identification at various taxonomic levels. Having species-specific and high level probes on a chip would make it possible to identify known species or to characterize an environment at the genus, family or phylum level. The work of this thesis consisted in checking the feasibility of such a DNA chip. This project required the creation of EmblEx (Perl/HTML), a tool for the retrieval of every sequence of interest from the public databases, in a more specific and more precise manner than using current tools. Sequences are then classified without alignment, a new method of analysing the results of a BLAST search makes it possible to directly compute a distance matrix then used by a partitioning algorithm. Each class is then compared to existing taxonomy. Probes specific to each class could be identified, providing genus- or class-specific probes

Chez l'Annélide polychète Nereis diversicolor, une métalloprotéine (MPII) ayant la propriété de fixer des métaux lourds tels que le cadmium a été précédemment caracterisée et purifiée dans notre laboratoire. Nous avons abordé l'étude de cette protéine en adoptant une nouvelle stratégie. Nous avons extrait et purifie les ARNm de coelomocytes (cellules libres dans le coelome des animaux). Ces ARNm ont été traduits in vitro (lysat de réticulocytes de lapin) ou in vivo (injection des ARNm dans les ovocytes de xenopus laevis. Les techniques du « Western-blot » et celles du test ELISA, mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux anti MPII, indiquent que les coelomocytes sont un site de synthèse des ARNm de la MPII. Les traductions obtenues a partir de ces ARNm et la disponibilité d'anticorps poly- ou monoclonaux nous ont incité à élaborer une banque d'expression par un clonage de cDNa dans le vecteur lambda gt11. La sélection des clones de phages recombinés a été pratiquée par la révélation d'une immunoréaction des anticorps poly- ou monoclonaux confrontés aux protéines exprimées au niveau des plages de lyse. Les modalités de l'expression en abondance des protéines de fusion par des bactéries hôtes de phages recombinés et les conditions de détection de ces protéines par des anticorps anti-MPII nous ont conduit à invoquer une dégradation systématique de ces dernières par les bactéries. Les protéines de fusion, dans leur intégrité, seraient considérées comme toxiques par les cellules hôtes des phages recombinés

L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.

L'analyse des gènes est un sujet au cœur de l'actualité. Les grandes avancées de la biologie moléculaire de ces dernières années étaient limitées par le décryptage des séquences d'ADN. Les biopuces basées sur le principe de la reconnaissance de la molécule d'ADN permettent d'accéder à ce type d'informations et sont développées depuis quelques années. Le travail effectué au cours de cette thèse s'inscrit dans le cadre du projet ROSA dont le but est de mettre au point un outil d'analyse performant. La principale technique de détection utilisée pour la lecture des puces à ADN est la spectroscopie de fluorescence. Une présentation des différents types de puces à ADN ainsi que du principe de la fluorescence nous conduit à dégager les différents problèmes posés. Dans un premier temps, la validation des différentes étapes de fabrication, par synthèse directe, ou par accrochage d'oligonucléotides présynthétisés, ainsi que la comparaison de différents types de fonctionnalisation du support, permettent de choisir les conditions les mieux adaptées à l'obtention d'une puce fonctionnelle. Dans un deuxième temps, l'utilisation d'un substrat en silicium avec une épaisseur d'oxyde "accordée" à la longueur d'onde d'excitation entraîne la diminution de la limite de détection de la lecture des puces à ADN par fluorescence, facteur limitant cette technique. Enfin, la reproductibilité et la capacité de réutilisation des différents types de support montrent la fiabilité de la fabrication et les performances de la technique de lecture. Nous avons également tenté de poser les bases d'une analyse quantitative.

L’objectif de cette thèse est l’étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l’essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligo-nucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil. Univ-lyon1. Fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l’utilisation d’une puce dédiée à Buchnera ont permis d’étudier le transcriptome de la bacté-rie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son ex-pression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte
The aim of this thesis is the study of the transcriptome of the bacterium Buchnera aphidicola, the primary endosymbiont of the pea aphid, Acyrthosiphon pi-sum, by microarray technology. The high interdependance between Buchnera and the aphid caused modifications of the bacterial genome, including loss of most regulatory genes. However, Buchnera retained the biosynthesis pathways, for the production of essential amino acids to its host. The first part of this the-sis relates to the development of ROSO, a software to design optimized oligonucleotide probes for microarrays. An interface was conceived to allow its use on line (http://pbil. Univ-lyon1. Fr/roso). In the second part, the design and the use of a chip dedicated to Buchnera allowed to study the bacterial transcrip-tome, under nutritionnal and osmotic stress in the diet of the aphid. This analysis shows that Buchnera is able to modify its gene expression and to adapt its metabolism to answer to changing demand of its host

Nous abordons le problème de la conception de sondes oligonucléotidiques pour puces à ADN en proposant des solutions sur le plan informatique, mais aussi sur le plan biologique, avec la validation expérimentale de nos méthodes. Nous présentons une nouvelle approche qui combine une forte spécificité des sondes avec une bonne sensibilité. Sur le plan du Génie Logiciel, nous menons une réflexion sur la réutisabilité des composants logiciels dans le domaine des puces à ADN, qui nous amène à proposer une " Platform Independant Model" pour la conception de sondes, conformément à la démarche de développement " Model Driven Architecture" proposé par l'Object Management Group. Deux logiciels ont été développés : le premier implémente notre nouvelle approche, le second permet la détermination de sondes spécifiques de micro-organismes pour des puces ciblant l'ARNr 16S. Ce dernier a été parallélisé et déployé sur une architecture de type cluster de calcul

Ce travail est consacré à la conception, la synthèse et l'étude de sondes électrochimiques pour l'élaboration d'une nouvelle génération de puces à ADN. Le premier chapitre rappelle les différentes méthodes de fabrication et principes de détection utilisés actuellement pour le développement de puces à ADN. Au cours du second chapitre, une nouvelle voie de synthèse d'oligonucléotides (ODN) intégrant des sondes électrochimiques de type ferrocényle est détaillée. La caractérisation de ces nouveaux ODN marqués et leur étude électrochimique font l'objet de la troisième partie. Les quatrième et cinquième parties sont consacrées au greffage de ces ODN marqués respectivement sur un copolymère dérivé de l'EDOT et sur or. Dans les deux cas, les systèmes obtenus ont été caractérisés et permettent la détection de la réaction d'hybridation
This work deals with the development of a new generation of DNA biosensors based on electrochemical detection. The first part points out the various strategies currently used to fabricate DNA chip. In a second part, a new approach of DNA synthesis including ferrocenyl electrochemical probes is described. The characterization of these DNA and their electrochemical properties in solution are described in a third part. The fourth and fifth part expose the grafting of these DNA on an EDOT copolymer and on gold respectively. In the both cases, the systems are fully characterized and are shown to allow the monitoring of the hybridization reaction

Les outils bio-informatiques sont devenus indispensables aux traitements et à l'analyse des données de puces à ADN. De l'extraction des données primaires par les logiciels d'analyse d'images à la recherche des réseaux moléculaires en passant par la normalisation et la validation des données, les méthodes mathématiques et statistiques sont incontournables. Ce travail s'intéresse aux méthodes d'analyse d'images des puces à ADN, à la métrologie et à la transformation des données primaires en données "consolidées ". Au cours de cette étude, un service Web nommé MADSCAN (MicroArray Data Suite of Computed Analysis) a été développé pour traiter les données primaires d'expression. Cet outil permet de filtrer, normaliser et valider statistiquement les données primaires. Les enjeux suivants sont l'analyse (mise en évidence des gènes d'intérêts, méthodes de classifications) et l'intégration des données d'expression avec les méta-données (ontologies, littérature. . . ) pour une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement des gènes
Bioinformatic tools have become essential for microarray processing. From raw data extraction by image analysis software to the research of molecular networks via data normalization and validation, mathematical and statistical methods are crucial. This work deals with the performance of microarray image analysis software, with metrology and the transformation of raw microarray data to consolidated gene expression data matrices. A Web service, MADSCAN (MicroArray Data Suite of Computed Analysis) has been developed to process raw expression data. This tool filters, normalizes, and statistically validates raw data. The next challenges are the analysis (molecular marker identification, classification approaches) and the integration of expression data with metadata (ontology, literature. . . ) for a better understanding of gene mechanisms

Afin de synthétiser in situ des oligonucléotides sur des supports plans solides (wafers Si/SiO₂, lames de verre), de nouveaux agents de couplage organosiliciés ont été préparés. Ces composés ont ensuite été greffés, par la technique des SAM's, sur les supports et des films robustes, résistant aux traitements acides et basiques ont été obtenus. Les films greffés ont été caractérisés en spectroscopie infrarouge, Raman ainsi qu'en Microscopie à Force Atomique. Sur ces surfaces chimiquement modifiées, des oligonucléotides ont ensuite été synthétisés et l'application « puces à ADN » a été démontrée.

L’objectif du cette thèse a été d’enrichir nos connaissances sur des bactéries difficilement cultivables ou intracellulaires strictes en utilisant la technologie des puces à ADN. Deux modèles expérimentaux ont fait l’objet de nos recherches, Tropheryma whipplei, agent de la maladie Whipple, et Rickettsia conorii, agent de la fièvre boutonneuse méditerranéenne. L’analyse génomique comparative de 16 isolats cliniques de T. Whipplei provenant de diverses sources géographiques et biologiques, nous a permis de mettre en évidence une très forte conservation entre les différents génomes. Les modifications de la régulation des gènes de la souche Twist en réponse à une exposition à la doxycycline ont également été étudiées. Les résultats obtenus ont été cohérents avec le mode d’action attendu d’un inhibiteur de la traduction. En outre, ce travail nous a servi de support pour développer une technique d’amplification de l’ARN procaryote permettant l’analyse du transcriptome par puces à ADN à partir d’une quantité réduite d’ARN bactérien. En ce qui concerne R. Conorii, et compte tenu de résultats préliminaires très intéressants et prometteurs obtenus par RT-PCR, nous avons tenté d’analyser, de manière globale, le transcriptome de cette bactérie intracellulaire stricte soumise à un stress nutritif. Nous avons utilisé une puce à ADN comportant un nombre limité de cibles, ce qui ne permet pas d’avoir une vision complète des modifications transcriptionnelles mais certains points, tels que l’augmentation de gènes codant pour l’appareil de sécrétion de type IV ont été mis en évidence. Il faut toutefois souligner que cette approche, qui n’avait jamais été décrite au préalable pour les rickettsies, et qui a été rendue possible grâce à une étape d’élimination des ARN eucaryotes par hybridation soustractive, ouvre de larges perspectives de recherche. Globalement, les données que nous avons obtenues confirment le fait que les puces à ADN sont un outil très prometteur pour l’étude des bactéries difficilement cultivables ou intracellulaires strictes malgré un certain nombre de limitations expérimentales que nous avons en partie surmontées
This thesis was aimed to enrich the knowledge about fastidious and obligate intracellular bacteria using the DNA microarray technology. Two experimental models were used in this work, namely Tropheryma whipplei, the agent of the Whipple’s disease, and Rickettsia conorii, the agent of the Mediterranean Spotted Fever. The comparative analysis of 16 clinical isolates of T. Whipplei originating from various geographical and biological sources revealed a strong rate of conservation through their genomes. The regulation of T. Whipplei Twist strain in response to doxycycline was also investigated. The results obtained were consistent with the mode of action of this translation inhibitor. Moreover, this work has been used as a support to develop a technique of amplification of the prokaryotic RNA thus allowing the transcriptome analysis by microarrays starting from a small amount of RNA. Concerning R. Conorii, preliminary and highly interesting results obtained by RT-PCR assays, led us to analyze the whole transcriptome of this bacteria exposed to a nutrient stress. To assess both the feasibility and the accuracy of such an approach, a specific DNA microarray composed with a limited number of targets was developed. Despite the lack of a global view of the transcriptional changes, some conclusions have been evidenced from our results, including the up-regulation of several genes encoding for the type IV secretion system proteins. This is the first analysis of rickettsial transcriptome by microarrays. Such an approach, which was made possible by using an experimental strategy based on the substractive hybridization of eukaryotic RNA has a great prospect for the future investigations. In summary, our data confirmed that, despite some limitations in part circumvented in this work, DNA microarrays are powerful tools for the study of fastidious and obligate intracellular bacteria

Depuis la fin des annees 1990, la technologie des puces a adn est en plein essor. Cette technologie permet d'analyser le transcriptome de facon global. Elle donne en effet l'opportunite d'etudier les variations transcriptionnelles a l'echelle du genome (plusieurs milliers de genes etudies simultanement). L'analyse et l'interpretation de ce grand nombre de donnees necessitent une approche bioinformatique performante. En effet, pour exploiter pleinement ce type de technologie, il faut faire appel a un grand nombre de disciplines : analyse d'image, technique de normalisation, analyse statistique des donnees, stockage et gestion des donnees, representation des donnees, regroupement / classification. . . La societe clinigenetics au sein de laquelle j'ai effectue ma these, utilise parmi d'autres, la technologie des puces a adn pour la decouverte de nouvelles cibles therapeutiques et de nouveaux traitements pour lutter contre les maladies cardiovasculaires. Mon role durant ma these a ete de selectionner des methodes d'analyses et les outils de visualisations intuitifs permettant de repondre aux objectif des etudes de transcriptomique de la societe. J'ai egalement participe a l'elaboration de la methodologie d'analyse et a l'interpretation des donnees generees par ces experiences.

Cette étude a conduit à l'identification des séquences nucléotidiques uniques de deux souches non séquencées de Campylobacter jejuni, bactérie à l'origine d'affections entériques chez l'homme par comparaison avec la souche séquencée NCTC 11168. Nous avons étudié les souches C. Jejuni TGH 9011 et 81-176, toutes deux présentant des phénotypes de virulence plus accentués que la souche séquencée. Nous avons mis au point une puce à ADN de type " shotgun ", générée par dépôt de plasmides représentatifs d'une banque génomique totale de chacune de ces deux souches. L'étude a permis l'identification de 130 ORFs spécifiques par rapport à la souche-type pour TGH 9011 et 86 ORFs ainsi que la séquence du plasmide pTet pour 81-176. Les gènes identifiés chez ces souches sont impliqués principalement dans des mécanismes démontrés comme étant liés à la pathogenèse de C. Jejuni. La puce à ADN de TGH 9011 a également été utilisée de façon préliminaire à l'identification des gènes régulés par la proteine Fur (Ferric Uptake Regulator). Ces travaux démontrent l'efficacité de l'utilisation de puce à ADN de type " shotgun " pour l'identification de la diversité génétique bactérienne
This study represents the identification of unique sequences of two non-sequenced, human-enteropathogenic Campylobacter jejuni strains, by comparison with the sequenced strain NCTC 11168. We choose to study TGH 9011 and 81-176 strains for their pathogenicity characters. We constructed a shotgun microarray made by the printing of plasmids issued from a whole representative genomic library of the two studied strains. After analysis, we were able to identify 130 ORFs specific to TGH 9011 compare to NCTC 11168 and 86 ORFs plus the sequence of the plasmid pTet of 81-176. Identified genes are mostly involved in demonstrated pathogenesis mechanisms of C. Jejuni. The microarray of TGH 9011 has been also used for the study of genes regulated by the Ferric Uptake regulator. In summary, these studies demonstrate the power of the use of shotgun microarray for bacterial genomic comparisons

Notre projet etait de mettre au point une methode de marquage rapide et selective d'acides nucleiques, l'objectif etant de pouvoir utiliser ceux-ci pour le resequencage sur puces a adn. Notre approche a consiste en la synthese de ribonucleotides triphosphates porteurs d'une fonction reactive. Ces triphosphates modifies ont ete incorpores par voie enzymatique dans des sequences d'arn afin de generer des acides nucleiques fonctionnalises. Les arn ainsi actives ont ensuite ete marques en utilisant un fluorochrome. Nous avons synthetise des nucleotides triphosphates en serie uridine, adenosine et cytidine porteurs de fonctions reactives de type oxyamine (onh 2) ou methylcetone (coch 3). Les fluorophores correspondants, modifies avec une fonction aldehyde ou oxyamine, ont ete prepares. Nous avons ensuite mis au point les conditions de post-marquage des acides nucleiques fonctionnalises. Les arn marques ont ete utilises pour le resequencage sur puces a adn. Les acides nucleiques detectes ont ete soit un fragment de l'arn 16s de mycobacterium tuberculosis soit un fragment du gene codant pour la transcriptase inverse de hiv-1. Apres hybridation sur puces, nous avons obtenu des pourcentages d'homologie voisins de 100%, montrant la selectivite et l'efficacite de notre methode de marquage.

La technologie des puces à ADN fait appel à des techniques de marquages d'acides nucléiques qui doivent être sensibles en étant le plus efficace possible. Notre travail a consisté à développer une méthode de marquage directe et efficace basée sur l'alkylation des groupements phosphates des acides nucléiques. Nous avons ainsi synthétisé une série de dérivés d'aryldiazométhanes conjugués à un marqueur. Les premières molécules décrites sont des marqueurs biotinylés pour lesquels on a fait varier la position de la biotine sur le groupement phényle comportant la fonction réactive diazométhane. L'introduction de groupements électroattracteurs a également été réalisée. D'autres molécules biotinylées comportant des chaînes polyéthylène glycol ont été synthétisées ainsi que des composés polybiotinylés. Enfin des marqueurs Cy5 ont été synthétisés dans le but de s'affranchir de l'étape de révélation de la biotine. Finalement, les résultats obtenus sur puce à ADN sont présentés
Parallel to CUITent progress in DNA chip technology, requirements for efficient nucleic acid labeling technologies are growing. We describe an alternative, efficient and direct labeling method based on alkylation of nucleic acid phosphates by aryldiazomethane derivatives. We synthesized series of atyldiazomethane derivatives tethered to reporter groups. The fIfst molecules described are biotinylated labeling molecules with variation of the position of biotin moiety on the phenyl ring bearing the reactive diazomethane fonction. The introduction of electro-withdrawing groups on the aromatic ring was also realized. Other biotinylated molecules containing polyethylene glycol chains have been synthesized to improve the aqueous solubility. These established procedures were further applied for the synthesis of polybiotinylated compounds and Cy5 molecules. We also describe the general procedures used for the study of the new molecules on DNA chips and the results obtained with two molecules

Les benzodiazépines sont sédatives, anxiolytiques et anti-convulsantes. Leurs s'exercent par l'intermédiaire de récepteurs dans le système nerveux central. Cependant, certaines benzodiazépines se fixent aussi sur un récepteur pharmacologiquement distinct (BPBS), dans les organes périphériques. Celui-ci semble être impliqué dans l'immuno-modulation : nous avons observé un effet des benzodiazépines périphériques sur la prolifération lymphocytaire in vitro. Afin de caractériser le récepteur de ces ligands, nous l'avons purifié à partir de la l ignée cellulaire CHO (hamster), puis clivé, pour en déterminer partiellement la séquence. Un antisérum, obtenu par immunisation avec des peptides synthétiques ana) logues, a été utilisé pour étudier l'homologie entre le BPBS de CHO et celui de la lignée monocytaire humaine U937. A partir des séquences peptidiques du BPBS de CHO quatre sondes d'oligo-nucléotides ont été synthétisés pour isoler l'ADNc d'une banque U937. La région codante séquencée correspond à une protéine de 169 acides présentant plusieurs domaines trans-membranaires potentiels. Enfin, en utilisant l'ADNc isolé comme sonde, nous avons localisé le gène BPBS dans la bande 22q 13. 3 du génome humain
[Benzodiazepines are sedative, anxiolytic and anticonvulsant. They exert their effects through receptors in the central nervous system. However, some benzodiazepines also bind to a pharmacologically different receptor (BPBS) in peripheral organs. This one could be involved in immuno-modulation: we observed an effect of peripheral benzodiazepines on lymphocyte proliferation in vitro. To further characterize the receptor of these ligands, we purified it from the CHO cell line (hamster) and we cleaved it to determine a partial sequence. An antiserum directed against synthetic analogous peptides was used to study the homology cell line U937. Using the CHO BPBS peptide sequence, four oligonucleotide probes were synthesised to isolate the BPBS cDNA from a U937 library. The sequenced coding region corresponds to a 169 amino-acid protein with several potential trans-membrane domains. Finally, using the cDNA of the human BPBS as a probe, the BPBS gene was localized in the 22q 13. 3 band of the human genome. ]

Les influences de la lumière, de l'obscurité et de l'ANA sur les peroxydases apoplastiques et sur le développement d'explants racinaires de chicoree (Cichorium intybus L. ) ont été analysées. Les activités auxine-oxydasiques dûes aux peroxydases sont toujours plus fortes à l'obscurité qu'à la lumière. L'utilisation de syringaldazine, co-substrat spécifique des peroxydases impliquées dans le processus de lignification, a montré une corrélation positive entre synthèse de lignine et activité syringaldazine-oxidase. La prolifération cellulaire des explants (callogenèse) est d'autant plus importante que la lumière ou l'acide l-naphtanlène acétique (ANA) diminuent l'activité auxine-oxydasique. La baisse sensible d'activité syringaldazine-oxydase provoquée par l'ANA conduit à la non édification de la couche cellulaire périphérique lignifiée. Cette dernière est bien représentée chez les explants cultivés à la lumière et sans ANA. Ce régulateur de croissance perturbe aussi fortement le développement des explants, avec perte de leur potentialité organogène. L'hypothèse d'une relation entre phénomène de cicatrisation précoce, lié à la couche lignifiée, et capacité organogène des explants a été formulée. L'ANA induit l'expression d'une isoperoxydase basique, la Cicpx (Cichorium intybus cationic peroxydase). Celle-ci, également rencontrée dans les milieux de culture des suspensions cellulaire de chicorée cultivées en présence d'ANA, a été purifiée. Le taux de purification important (RZ = 3,5) a permis de déterminer son point isoélectrique de 8,9, son poids moléculaire de 34 KDa et son absence de réactivité envers la syringaldazine. Son séquençage partiel a abouti à quatre séquences de polypeptides dont deux présentent une certaine homologie avec d'autres peroxydases végétales. Ces dernières ont servi à l'élaboration de deux amorces pour essayer d'amplifier par PCR un fragment du gène de la Cicpx. Le but étant de se servir de ce fragment comme sonde nucléotidique, afin de déterminer si la Cicpx est une isoforme ou une isoenzyme. Mais, la présence de certains acides aminés ont conduit à des amorces dites dégénérées qui ne nous ont pas permis d'aboutir à nos fins. Cependant, un ADNc de peroxydase a été obtenu par RT-PCR, dont la correspondance avec la Cicpx reste à démontrer.

Dans cette thèse, nous proposons trois nouvelles méthodes d’analyse de puces à ADN qui intègrent notre connaissance à priori de corrélations sous-jacentes au problème. La première méthodologie utilise les données de réseau métabolique pour l’analyse de profils d’expression de gènes. Elle est basée sur la décomposition spectrale du réseau à l’aide de la matrice laplacienne liée au graphe associé. La deuxième approche est une nouvelle méthode de classification supervisée pour les données de puces arrayCGH. Elle est basée sur le problème L1-SVM usuel modifié pour intégrer une seconde contrainte de régularisation qui traduit la forte chance pour deux relevés successifs d’appartenir à la même région d’altération. La dernière méthode est une autre manière d’introduire l’information contenue dans un réseau dans la classification supervisée de profils d’expression. Pour cela, nous avons rajouté au problème L1-SVM un terme de régularisation qui traduit notre volonté d’attribuer dans la fonction de décision des poids semblables à deux gènes connectés.

Les résultats d’expériences de microarray furent décriés par le manque de concordance inter-expériences. Les listes immenses de gènes résultant de filtrages statistiques sont difficiles à exploiter. La Food and Drug Administration a montré que le choix d’indicateurs de filtrage de gènes était la source d’une grande disparité entre expériences de microarray issus de laboratoires indépendants. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode de sélection basée sur la modélisation de l’allure de la courbe d’expression avec le Log2 du « fold-change » entre les points de cinétique. En effet, des gènes co-régulés au cours d’une cinétique temporelle présentent des courbes d’expression d’allure similaire alors que leur niveau d’expression peut être différent. Nous avons validé la méthode grâce à 2 expériences indépendantes de microar-ray étudiant la différenciation des ovaires d’embryons de souris. Ainsi, nous avons obtenu une liste réduite et pertinente de gènes exprimés. Puis, une analyse de ces résultats dans le cas de la différenciation ovarienne nous a permis d’identifier 9 nouveaux gènes candidats validés in silico et restant à être testés biologiquement
Microarray results were blamed because of their lack of concordance. Moreover, the huge candidate gene lists from statistical filterings are not useful for biologists. FDA proved that the lack of reliability between microarray experiments came from the choice of gene filtering indicators. In this context, a filtering method was developed based on expression curve shape modelling with the use of Log 2 of fold-change between kinetic points. Actually, the co-regulated genes display similar expression shape but with heterogeneous expression level.Our method was developed and validated thanks to two independent microarray experiments (Affymetric®) from mouse embryonic ovaries. Therefore, a short and relevant list of genes was obtained. Thus, a study of results linked to ovarian differentiation permitted to identify nine new candidate genes that were in silico validated. These genes might be biologically tested (i.e. RT PCR) by the scientific community

Le venin du serpent Bungarus Multicinctus contient des -,- et -neurotoxines. Ces neurotoxines bloquent la transmission nerveuse ou neuromusculaire soit par fixation sur certains récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine au niveau postsynaptique (- et -neurotoxine), soit en inhibant la libération de l'acétylcholine au niveau presynaptique (-neurotoxines). Les -bungarotoxines sont des phospholipases a#2 qui présentent une activité toxique en plus de leur activité enzymatique. Deux approches complémentaires ont été utilisées dans cette étude. Elles font appel d'une part aux techniques immunologiques et d'autre part a la biologie moléculaire. Elles offrent des perspectives intéressantes pour l'étude des mécanismes moléculaires mis en jeu par l'action de neurotoxines: 1) deux banques d'hybridomes exprimant des anticorps monoclonaux diriges certains contre l'-bungarotoxine et d'autres contre la -bungarotoxine ont été préparées. L'analyse des anticorps montre que certains ont un effet neutralisant sur l'activite toxique et/ou enzymatique des toxines. Les mécanismes possibles de la neutralisation sont discutes; 2) une banque d'ADNc de glande a venin du serpent bungarus multicinctus a été préparée. Le clonage et le séquençage de sept ADNc ont été réalisés. Ces ADNc codent pour les précurseurs de deux nouvelles -neurotoxines (2- et 3-bungarotoxines), deux analogues inconnus des -neurotoxines (CE et CP) et trois phospholipases a#2, la phospholipase a#2 non toxique déjà connue et deux isoformes inconnues des chaines a des -bungarotoxines. Les séquences primaires déduites de ces ADNc sont analysées et comparées a celles de molécules homologues. Sur ces bases nous proposons que les phospholipases a#2 appartenant au groupe structural I possèdent un propeptide. Nous avons réalise une analyse statistique de l'usage des codons dans les séquences nucléiques connues chez les serpents et nous proposons enfin une strategie de criblage des banques d'adnc ou génomique de serpent

Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.
Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.
This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.
This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.

Parmi 48 espèces de légionelles, L. Pneumophila est responsable de 90% des cas de légionellose. Parmi les 15 sérogroupes (sg) de cette espèce, le sg1 est associé à 84% des cas. Pour comprendre s’il existe une relation entre ces différences de virulence et des différences du contenu génétique, nous avons caractérisé le contenu génétique de différentes souches. Le séquençage des génomes des souches L. Pneumophila Paris et Lens a montré la plasticité du génome et la présence de multiples protéines de type eucaryote qui pourraient moduler les fonctions de l’hôte à l’avantage du pathogène. Le contenu génétique de 216 souches L. Pneumophila humaines ou environnementales a été caractérisé par hybridation ADN/ADN sur puce à ADN. Les résultats suggèrent que le LPS lui-même pourrait rendre compte des différences de virulence. Nous montrons aussi que la souche Paris est distribuée dans le monde entier et contient des gènes spécifiques contribuant probablement à son adaptation.

Le travail de cette thèse est axé autour de l'observation de la stabilité du duplexe de l'ADN. Exploitant un système de détection en temps réel basé sur le principe de l'imagerie par la résonance des plasmons de surface, nous utilisons des rampes de température pour mettre en évidence les interactions d'ADN sur une biopuce fonctionnalisée. Un premier travail porte ainsi sur une comparaison de chimies de greffages et l'influence du tampon sur la stabilité du duplex d'ADN. Notamment, la salinité du milieu et l'influence d'un dénaturant de l'ADN sont étudiés. Dans un deuxième temps, la méthode des rampes de température est appliquée à la détection des mutations ponctuelles sur des cibles d'ADN et ARN longues, issus de la polymerase chain reaction (PCR) ou la nucleic acid sequence based amplification (NASBA), respectivement. L'effet de compétition entre cibles mutées et l'hybridation à la surface est abordé. De plus, les structures secondaires en solutions peuvent changer la capture des cibles sur les sondes. La possibilité d'intégrer l'amplification dans un système de détection sur puce est démontrée pour la NASBA. Enfin, en collaboration avec le laboratoire des lésions d'acides nucléiques (LAN) au CEA Grenoble, une étude des interactions et de l'activité de protéines réparatrices sur l'ADN endommagé est présentée, profitant, de nouveau du choix flexible de la température.