Dissertations / Theses on the topic 'Quimerism'

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luciana_aquini_fernandes_gil.pdf: 1257217 bytes, checksum: 0c4055569b5af0eb817b075544551d2f (MD5) Previous issue date: 2012-08-08<br>Bovine Botulism is a lethal intoxication caused by the ingestion of the neurotoxins produced by Clostridium botulinum types C and D that inhibit the release of acetylcholine at the neuromuscular junction leading to death by flaccid paralysis. It produces important economic losses, being a major cause of casualties in cattle in several regions of Brazil. The control of the disease depends on the presence of neutralizing antibodies against botulinum neurotoxins (BONTs) in immunized cattle. Immunization is obtained inoculating toxoids produced from cultures of selected strains of C. botulinum types C and D, whose industrial production has limitations concerning efficiency and productivity. An alternative to the use of these toxoids is the production of recombinant antigens with high levels of purity and antigenicity. The C-terminal fraction of the heavy chain of botulinum neurotoxins has been the main target in the development of recombinant vaccines with promising results. In this work, two recombinant bivalent chimeras for the control of bovine botulism consisting of the neuronal receptor binding domains (NRBDs) of botulinum C and D toxins were efficiently produced in Escherichia coli. They were characterized and evaluated in mice, with promising results. Both the recombinant chimeras rLTB-C-D and rC-D were produced by cloning and expressing a synthetic gene encoding the C-terminal portion of both BONTs. The former also included the preferred codons of the E. coli heat labile enterotoxin B subunit (LTB), a potent humoral immune adjuvant. The levels of expression of the recombinant antigens were satisfactory, yielding approximately 100 mg of each recombinant antigen per liter of culture. An ELISA performed to assess the antigenicity of the molecules showed that both were recognized by sera of immunized mice suggesting the preservation of epitopes with the properties of native BONTs. Both chimeras induced high levels of neutralizing antibodies without undesirable effects. The level of neutralizing antibodies of the groups inoculated with equimolar concentrations of rLTB-C-D and rC-D containing Aluminum Hydroxide as adjuvant were similar, confirming the adjuvant properties of LTB. These results demonstrated that the recombinant chimeras were immunogenic. Sera from mice inoculated with commercial vaccines were also analyzed by ELISA using as antigens rC and rD, corroborating the neutralization.<br>O botulismo bovino é uma intoxicação letal causada pela ingestão da neurotoxina produzida pelo Clostridium botulinum principalmente dos tipos C e D que atua inibindo a liberação de acetilcolina na junção neuromuscular levando à morte por paralisia flácida, com grande importância econômica e sanitária, sendo uma das principais causas de morte em bovinos adultos no Brasil. O controle imunológico do botulismo bovino depende da presença de anticorpos neutralizantes contra as neurotoxinas botulínicas (NBOTs) no momento da ingestão da toxina pré-formada, por meio de imunização dos animais. Atualmente, a imunização é realizada com toxóides obtidos da detoxificação do extrato de cultivos de cepas selecionadas de C. botulinum dos tipos C e D que apresentam limitações quanto à eficiência e produção. Uma alternativa ao uso dos toxóides clássicos é a produção de vacinas recombinantes usando antígenos específicos de alta pureza e imunogenicidade. A fração C-terminal da cadeia pesada da neurotoxina botulínica tem sido o alvo principal no desenvolvimento de alternativas recombinantes a serem utilizadas como vacinas. Neste trabalho, duas quimeras recombinantes bivalentes compostas pelos domínios de ligação ao receptor neuronal (DLRNs) foram produzidas em Escherichia coli, caracterizadas e avaliadas em camundongos. As quimeras recombinantes rLTB-C-D e rC-D foram produzidas a partir da clonagem e expressão de um gene sintético que codifica a porção C-terminal das NBOTs construído com os códons preferenciais de E. coli e a subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), um potente adjuvante da resposta imune humoral. O nível de expressão dos antígenos foi de aproximadamente 100mg de cada antígeno recombinante por litro de cultura. Um ELISA realizado para avaliar a antigenicidade das moléculas mostrou que ambas foram reconhecidas pelos soros padrões, sugerindo conservação de epitopos semelhantes aos dos DLRNs nativos. Ambas as quimeras foram inócuas para os camundongos, os quais não apresentaram lesões no local da inoculação bem como alteração de comportamento. Nos soros dos camundongos inoculados com as quimeras recombinantes foi possível detectar níveis de anticorpos neutralizantes. O grupo inoculado com a rLTB-C-D apresentou nível de anticorpos neutralizantes semelhante ao do grupo rC-D + hidróxido de alumínio confirmando o potencial adjuvante da LTB. As quantidades de antígenos utilizados foram equimolares. Esses resultados demonstram que as quimeras recombinantes foram imunogênicas. Os soros dos camundongos inoculados com as diferentes vacinas também foram analisados por ELISA indireto utilizando rC e rD como antígenos. Os dados obtidos neste ELISA corroboram os dados da soroneutralização.

El propósito de este trabajo es estudiar una serie de pacientes afectos de enfermedades hematológicas, en edad pediátrica, sometidos a un trasplante de progenitores hemopoyéticos (TPH). Para ello se ha realizado el seguimiento del trasplante en pacientes que han recibido un trasplante alogénico de<br/>un donante de diferente sexo mediante el estudio del QUIMERISMO y se ha relacionado con diferentes parámetros clínico-biológicos; el seguimiento en pacientes que presentaban una alteración cromosómica al diagnóstico, tanto si recibían un TPH autólogo o un TPH alogénico, mediante el estudio de la ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR); y se ha evaluado la Influencia del cariotipo observado y del pronóstico de las alteraciones cromosómicas detectadas en el diagnóstico de la enfermedad, en la recaída y en la supervivencia post-trasplante.<br/><br/>Se han obtenido los siguientes resultados:<br/><br/>En el estudio del quimerismo se ha establecido un valor umbral del 1%, para considerar detección de células del paciente. Se han detectado células del paciente en el 42% de los casos mediante la técnica de FISH y en el 16% mediante citogenética. 10 de ellos, han presentado un QM estable, de los cuales seis mostraron un aumento de células del paciente que provocó la recaída clínica en tres; en uno de ellos se detectó el aumento de las células residuales antes de la recaída clínica. Se ha observado una relación estadísticamente significativa entre la presencia de QM y el seso del paciente (el 80% con QM eran niñas, y el 69% con QC eran niños) y el régimen de acondicionamiento (el 60% con QM habían recibido únicamente quimioterapia mientras que el 80% con QC habían recibido quimioterapia e ICT). La SG ha sido la misma para los pacientes con QM o con QC (65%) y la SLE ha sido menor para el grupo con QM (51% vs 75%).<br/><br/>En el estudio de la EMR se ha establecido un valor umbral del 6% de núcleos con la fusión para considerar presencia de la reorganización BCR/ABL mediante FISH. Se ha detectado el cariotipo observado al diagnóstico en el 26% (10/38) de los pacientes. De los 10 pacientes que han presentado la EMR, en ocho la detección coincidió con la recaída clínica y en dos la detección se realizó antes de la recaída.<br/><br/>EN EL estudio del CARIOTIPO Y su Influencia en la EVOLUCION POSTTRASPLANTE se ha observado que las alteraciones cromosómicas detectadas al diagnóstico de la enfermedad, han mantenido su valor pronóstico después del TPH. Se ha observado la evidencia de una peor evolución de las alteraciones en 11q23 en las LLA (han fallecido 2/4), y una evolución no tan desfavorable en las LMA (no ha fallecido ninguno de 4). En la presente serie, la presencia de un cariotipo alterado ha constituido un factor de mal pronóstico, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo alterado. El valor pronóstico del cariotipo se ha mantenido post-TPH, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo de pronóstico desfavorable. En la presente serie, la indicación de un TPH autólogo en le grupo de pacientes con cariotipo de mal pronóstico, no ha resultado en una mejora en la supervivencia de estos, que quizás podrían beneficiarse de un TPH alogénico no emparentado; ya que la SG y la PR ha sido del 51,8% y del 31%, respectivamente para los pacientes que recibieron un TPH alogénico y del 33% y del 75% respectivamente, para los pacientes que recibieron un TPH autólogo, siendo estas diferencias estadísticamente significativas.<br>In this work we have performed the follow-up of children with haematological diseases who received a progenitor cells transplantation (PCT). We have studied of chimerism in a sex-mismatched allogeneic PCT, the minimal residual disease (MRD) when the patient showed a chromosome aberration at diagnosis of the malignant disease, and we have analyzed the correlation between the karyotype at diagnosis and the outcome after of the PCT.<br/><br/>- In the chimerism analysis we have observed a mixed chimerism (MC) we have detected more than 1% of host cells. The 42% patients showed host cells by FISH, and only the 16% by cytogenetics. Ten of them showed MC, and six of them showed a increase of the host cells, in one patient before of the clinical relapse a progressive increase of host cells was detected. The results indicate that female patients and a less intensive conditioning regimen are significantly associated with the MC status. The overall survival (OS) was similar for the patients with MC or donor chimerism (DC), and leukaemia-free survival was higher in DC than in the MC groups.<br/><br/>- In the follow-up of MRD, BCR/ABL reorganization has been considered to exist when more than 6% of fusion nuclei was observed. The karyotype observed at diagnosis was detected 26% of patients. In two of them the karyotype showed at diagnosis was observed before of the clinical relapse.<br/><br/>- The prognosis of the karyotype observed at diagnosis has been similar as prognostic factor in the outcome after PCT. The prognosis of 11~23 chromosome aberration in LLA was worse in LMA. To detect an abnormal karyotype at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. To detect a karyotype of the worst prognosis at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. The outcome of patient who showed a karyotype of worst prognosis at diagnosis of the disease and received an autologous PCT was worse the group of patients with karyotype of worst prognosis and who received an allogenic PCT.

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es analizar cual es la frecuencia y la relevancia clínica de la persistencia de células linfoides T y de células mieloides originarias del receptor (quimerismo mixto) tras un trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos. La hipótesis de trabajo es comprobar si el estudio secuencial y cuantitativo del patrón de quimerismo mixto en linfocitos T y en neutrófilos permite predecir el rechazo del injerto alogénico o la recidiva leucémica, respectivamente.<br/><br/>Para ello se ha estudiado el quimerismo hemopoyético en dos grupos de pacientes:<br/><br/>1. Pacientes tratados con un trasplante alogénico en el que se eliminan de forma parcial los linfocitos T del inóculo (alo-TSP/ELT) mediante selección positiva de las células CD34+.<br/><br/>2. Pacientes que recibieron un trasplante alogénico con acondicionamiento de intensidad reducida de tipo "no mieloablativo" (alo-TIR "no mieloablativo").<br/><br/>En nuestros estudios hemos aplicado una técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis automatizado de fragmentos de ADN repetitivos en tandem o microsatélites (PCR/STR multiplex), la cual permite analizar cuál es el componente del donante y del receptor en diferentes líneas celulares, así como un estudio cuantitativo de cada una de ellas. Las muestras analizadas fueron obtenidas de forma secuencial a partir de la sangre periférica. Para el análisis del quimerismo mediante PCR/STR utilizamos un preparado comercial (AmpFlSTR Profiler Plus PCR; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) que analiza nueve STR: D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, y un segmento del gen de la amelogenina para distinguir el cromosoma X o Y. La separación y detección de los productos amplificados por PCR se llevó a cabo mediante un secuenciador automático de ADN (ABI Prism 310 automated DNA sequencer; Applied Biosystems). El tamaño de los fragmentos se detecta automáticamente mediante dos métodos informáticos (ABI Prism GeneScan 2.0 y GenoTyper; Applied Biosystems). La tinción con diferentes colores permite identificar alelos de tamaño muy similar. Por último, la cuantificación del quimerismo mixto se efectúa calculando el porcentaje de componente del donante y del receptor utilizando unas fórmulas matemáticas específicas. Se considera quimerismo mixto cuando el porcentaje de linfocitos T o de neutrófilos del receptor es superior al 5%. La sensibilidad de la PCR/STR se sitúa entre el 1-5%.<br/><br/>Las conclusiones de los dos estudios incluidos en esta Tesis Doctoral fueron:<br/><br/>1. La técnica de la PCR/STR permite realizar un análisis secuencial y cuantitativo del quimerismo hemopoyético tras el trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos con un nivel de sensibilidad suficiente. <br/><br/>2. La eliminación de linfocitos T del producto de leucaféresis mediante selección positiva de las células CD34+ se asocia a un aumento significativo de la frecuencia de quimerismo mixto en linfocitos T, el cual puede ser predictivo de fallo de implante. En este mismo contexto, el quimerismo mixto mieloide se asocia a recidiva leucémica en pacientes con hemopatías malignas que afectan a esta línea celular (ej. leucemia mieloide crónica).<br/><br/>3. El régimen de acondicionamiento "no mieloablativo" con fludarabina e irradiación corporal total 2 Gy permite alcanzar un implante hemopoyético completo y mantenido, pero con un retraso significativo del injerto en el compartimiento linfoide T, por lo que puede ser útil en pacientes con enfermedades malignas con índice proliferativo bajo o en remisión, pero ineficaz para el control de enfermedades hematológicas malignas en progresión.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pasquini<br>Co-orientadora: Drª. Noemi Farah Pereira<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 01/08/2014<br>Inclui referências<br>Resumo: O resultado do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) é avaliado por meio da recuperação hematológica e da análise do quimerismo. Este estudo tem como objetivo avaliar os níveis de quimerismo em pacientes com Anemia Aplástica Severa (AAS) Adquirida com mais de 18 meses de acompanhamento pós-TCTH, que apresentaram recuperação hematológica parcial ou completa no sangue periférico. Foram analisados 104 pacientes com AAS transplantados no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná e monitorados no período de 1987 a 2012. Os pacientes foram divididos em dois grupos, conforme o regime de condicionamento. Os pacientes do grupo I (n=55) receberam ciclofosfamida (CFA) isolada, 200 mg/Kg de peso corpóreo e os do grupo II (n=49) CFA, 120 mg/Kg de peso corpóreo, associada ao bussulfano (BUS), 12 mg/Kg de peso corpóreo. Cada grupo foi subdividido de acordo com os seguintes níveis de quimerismo em relação às células do doador: ?50%, entre 51 e 90% e >90%. A análise de quimerismo foi realizada pela amplificação de locos VNTRs/STRs com detecção dos fragmentos em gel de poliacrilamida e coloração com sais de prata (84 pacientes) até julho de 2009 e após esse período por eletroforese capilar em Analisador Genético de DNA (20 pacientes). Os níveis de quimerismo foram correlacionados com as variáveis pré-transplante (idade e sexo do paciente e intervalo entre o diagnóstico e o TCTH), variáveis do transplante (idade e sexo do doador e número de células infundidas) e variáveis pós-transplante (número de neutrófilos, plaquetas e dosagem de hemoglobina após 18 meses do transplante). A análise dos resultados mostrou associação entre os níveis de quimerismo e os tipos de condicionamento empregados (p<0,001). A recuperação autóloga (quimerismo ?50%) foi encontrada em 36,4% dos pacientes do grupo I e em nenhum dos pacientes do grupo II. Quimerismo entre 51 e 90% foi identificado em 11 pacientes (20,0%) do grupo I e em 5 pacientes (10,2%) do grupo II. Quimerismo >90% foi mais frequente no grupo II (89,8%) quando comparado ao grupo I (43,6%). As características pré-transplante (idade e sexo do paciente e intervalo entre o diagnóstico e o TCTH) e do transplante (idade e sexo do doador) não mostraram associação ao quimerismo em nenhum dos grupos. O maior número de células infundidas mostrou associação com níveis de quimerismo mais elevados nos pacientes do grupo I (p=0,013) e não apresentou associação nos do grupo II. A análise multivariada mostrou que o nível de quimerismo >90% está associado ao condicionamento com CFA+BUS (p<0,001) e ao maior número de células infundidas (p=0,009). A recuperação hematológica, avaliada com base no último hemograma disponível, mostrou associação entre o número mais elevado de neutrófilos (p=0,003) e de plaquetas (p<0,001) e maior grau de quimerismo nos pacientes do grupo I. A dosagem de hemoglobina não mostrou associação com o quimerismo nos dois regimes de condicionamento. Este estudo sugere que o condicionamento com CFA associada ao BUS e o maior número de células infundidas são fatores preditivos da evolução do enxerto alogênico de células-tronco hematopoéticas. Os resultados deste estudo reforçam que a recuperação autóloga da hematopoese depende da intensidade da imunossupressão exigida para cada caso e que a função imunossupressora da CFA isolada pode induzir a regeneração hematológica autóloga. Palavras-chave: Anemia Aplástica Severa. Transplante de células-tronco hematopoéticas. Condicionamento. Quimerismo.<br>Abstract: The outcome of hematopoietic stem cell transplantation is evaluated (HSCT) by hematologic recovery and chimerism analysis. The aim of this study is to assess the levels of chimerism in Acquired Severe Aplastic Anemia (SAA) patients with post-transplant follow up of 18 months or more, and that have showed partial or complete hematologic recovery in peripheral blood. A total of 104 SAA patients transplanted at the Hospital de Clínicas of the Universidade Federal do Paraná and monitored from 1987 to 2012 were analyzed. Patients were divided into two groups on the basis of the conditioning regimen. Group I (n=55) received only cyclophosphamide (CY) at 200mg/kg of body weight, while those of group II (n=49) received CY at 120mg/kg of body weight associated with busulfan (BUS) at 12mg/kg of body weight. Each group was then subdivided according to the following levels of chimerism in relation to the donor's cells: ?50%, from 51 to 90%, and >90%. Chimerism analysis was performed by amplification of VNTR/STR loci followed by detection of fragments in polyacrylamide silver stained gels (84 patients) until July of 2009 and, from then on, by capillary electrophoresis in DNA Genetic Analyser (20 patients). Levels of chimerism were correlated to pre-transplant (patient's age, sex, and time elapsed from diagnosis to HSCT), transplant (donor's age, sex, and number of infused cells) and post-transplant (number of neutrophils and platelets, and hemoglobin levels from18 months on after transplant) variables. Data analysis showed an association between the levels of chimerism and the different conditioning regimens (p<0.001). Autologous recovery (chimerism ?50%) was achieved by 36.4% of patients from group I and by none of those from group II. Chimerism ranging from 51 to 90% was identified in 11 patients (20.0%) from group I and in 5 patients (10.2%) from group II. Levels of chimerism >90% were more frequent in group II (89.8%) than in group I (43.6%). Pre-transplant (patient's age, sex, and time elapsed from diagnosis to HSCT) and transplant (donor's age and sex) characteristics did not show association with chimerism in either one of the groups. The largest number of infused cells showed association with higher levels of chimerism in patients from group I (p=0.013), but not with those in group II. Multivariate analysis indicated that the chimerism level >90% is associated with the conditioning regimen CY+BUS (p<0.001) and with the highest number of infused cells (p=0.009). Hematologic recovery evaluated on the basis of the last available blood count indicated an association of the largest number of neutrophils (p=0.003) and platelets (p<0.001) with the highest level of chimerism in patients from group I. Hemoglobin levels did not show any association with chimerism in either one of the groups. This study suggests that the conditioning regimen with CY and BUS as well as the highest number of infused cells are predictive factors of the establishment of hematopoietic stem cell allogeneic graft. The results of this study corroborate that hematopoietic autologous recovery relies on the intensity of immunosuppression needed for each case, and that the immunosuppressive function of CY alone can induce autologous hematologic recovery. Keywords: Severe Aplastic Anemia. Hematopoietic stem cell transplantation. Conditioning regimen. Chimerism.

título de Biólogo con mención en Medio Ambiente<br>El quimerismo ocurre cuando dos individuos genéticamente distintos y conspecíficos se fusionan o coalescen generando una única entidad genéticamente heterogénea conocida como quimera. Este aumento en la variabilidad genética intraorganismo supondría un aumento en la variabilidad fenotípica del mismo, lo que conferiría a estas entidades una mayor tolerancia ante cambios ambientales en comparación a individuos genéticamente homogéneos o no quiméricos, posiblemente debido a efectos sinérgicos entre las distintas líneas celulares. El beneficio de ser quimera ha sido estudiado en distintos grupos de algas, particularmente en especies de algas rojas (Gracilaria y Mazzaella), las cuales muestran una correlación positiva entre coalescencia y tolerancia al estrés. A pesar de ello, en macroalgas pardas los estudios han sido mayoritariamente descriptivos, evidenciado los procesos de formación de entidades quiméricas, así como la frecuencia del quimerismo en poblaciones naturales de Lessonia spicata. Sin embargo, se desconoce aún si en esta especie los organismos con quimerismo muestran mayor tolerancia al estrés que aquellos genéticamente homogéneos y si existe un efecto en la adecuación biológica de la quimera de acuerdo al número de individuos fusionados así como el nivel de parentesco de los individuos que se fusionan para formar la quimera (e.g. fusión entre hermanos, medios hermanos, vecinos, poblaciones distintas). Basado en lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la tolerancia a estrés por temperatura de plántulas quiméricas y unitarias de L. spicata cultivadas en condiciones contrastantes de temperatura, distinto número de individuos fusionados y nivel de parentesco. Para ello, primero se desarrolló un protocolo para la generación masiva de plántulas con variabilidad genética intraorganismo de L. spicata en laboratorio. Segundo, se evaluó la tolerancia al estrés en términos de la tasa de crecimiento en condiciones contrastantes de temperatura (12±2°C vs 18±2°C) de plántulas quiméricas con distinto número de individuos fusionados versus unitarias. Tercero, se evaluó el efecto del parentesco sobre la quimera y el estrés térmico, comparando crecimiento entre unitarias, quimeras conformadas por cepas locales y quimeras conformadas por cepas de distintas poblaciones. Los resultados indicaron que plántulas quiméricas provenientes de la fusión de 5 esporofitos poseen una mayor tasa de crecimiento que las plántulas unitarias en condiciones normales de temperatura (12°C). Mientras que a estrés 10 térmico (18ªC) plántulas quiméricas también poseen una mayor tasa de crecimiento, pero la significancia de la respuesta depende de la densidad y parentesco de las entidades que forman la quimera. En términos de parentesco, los resultados sugieren que las quimeras provenientes de la fusión de esporofitos de plantas no emparentadas poseen una tasa de crecimiento mayor que quimeras formadas con medios hermanos. A la luz de estos resultados es posible concluir que el quimerismo en la macroalga parda Lessonia spicata le conferiría una ventaja a dichos organismos frente a los continuos cambios ambientales. Este hecho adquiere relevancia si se sabe que la especie está constantemente expuesta a cambios de la temperatura producto del Niño, así como el aumento de la temperatura del océano causado por cambio climático.<br>Chimerism occurs when two genetically distinct and conspecific individuals fuse or coalesce, generating a single entity genetically heterogeneous known as chimera. This condition increase the intraorganismal genetic variability, that could increase in the phenotypic variability and provide higher tolerance to environmental changes compared to genetically homogeneous or non-chimeric individuals. These can be produced due to synergistic effects between the genetically different cell lines that coexist into the chimera. The benefit of chimeric condition has been studied in different groups of macroalgae, particularly in the red species (Gracilaria and Mazzaella). They show a positive correlation between coalescence and stress tolerance. Despite of this, in the brown macroalgae the studies have been poorly described, most of them are descriptive, evidencing the formation processes of chimeric entities, as well as the frequency of chimerism in natural Lessonia spicata populations. However, it is still unknown whether the chimerism in Lessonia species shows greater stress tolerance than those genetically homogeneous. As well as whether there the fitness is affected by to the number of individuals fused, and/or the level of kinship among the individuals that composed the chimera (e.g. fusion between siblings, half siblings, neighbors, different populations). In this context, the main objective of this study was evaluate the thermal stress tolerance of chimeric and unitary organism in the brown macroalgae L. spicata, which were cultivated under contrasting temperature conditions, different number of fused individuals and level of kinship. To this, firstly in this study generated a protocol for massive generation of plantlets with intraorganismal genetic variability of L. spicata in laboratory. Secondly, the stress tolerance was evaluated in terms of specific growth rate under contrasting temperature conditions (12 ± 2 °C vs 18 ± 2 °C) of chimeric plantlets with different numbers of individuals fused versus unitary ones. Thirdly, the effect of kinship on the chimera and thermal stress was evaluated by comparing growth rate between unitary individuals versus chimeras formed by local strains, and from different populations. The results indicate that chimeric plantlets resulting from the fusion of 5 sporophytes have a higher growth rate than the unitary plantlets under normal conditions (12°C). While under thermal stress (18°C) the chimeras have the higher growth rate. However, the significant differences depended on the density and kinship of the entities that made up the chimera and the culture temperature. In terms of 12 kinship, the results suggest that chimeras resulting from the fusion of sporophytes of unrelated plants have a higher growth rate than chimeras formed by half-sib brothers. Follow these results, it is possible to conclude that chimerism in the brown macroalga Lessonia spicata would confer an advantage to these organisms in face to continuous environmental changes. This fact acquires relevance if it is known that this species is constantly exposed to temperature changes produced by ENSO events, as well as the increase in the ocean temperature caused by climate change.

O objetivo central desta dissertação de mestrado foi analisar se, pela sua resposta ao interferon-g (IFNg), as células não leucocitárias contribuem ao controle dos protozoários Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS e Plasmodium berghei ANKA. O IFNg é uma citocina que promove a ativação de diversos tipos de leucócitos, a sua ação sobre as células mononucleares fagóciticas merece um destaque especial. Apesar de conhecermos os pormenores do papel desta citocina na ativação dos leucócitos, desconhecemos se o IFNg exerce ação ativadora sobre as células estruturais (não leucocitárias), ou seja, sobre as células não profissionais da resposta imune. A nossa hipótese de trabalho é que, no caso dos parasitas intracelulares, o IFNg poderia reforçar a ação sinalizadora e efetora das células estruturais infectadas. Por outro lado, em ambas as situações de parasitas intracelulares e extracelulares, o IFNg, ao agir sobre diversas células estruturais, poderia induzir a produção de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, etc) que contribuiriam direta ou indiretamente à remoção/controle do parasita. A nossa abordagem tem sido o estudo da infecção por estes protozoários em quimeras de medula óssea B6/IFNgRKO, nas quais as células não leucocitárias são deficientes em receptores para IFNg e as células leucocitárias são normais. A análise por imunofluorescência de cortes histológicos mostrou uma alta expressão de IFNgR pelas células estruturais do coração dos animais B6 e quimeras controle B6/B6, mas nenhuma expressão deste receptor nos cortes histológicos correspondentes de animais IFNgRKO e quimeras experimentais B6/IFNgRKO, apesar de grande parte dos leucócitos dos animais deste último grupo ter se tornado IFNgR+. Após infecção pelo T. cruzi, o coração e músculo esquelético dos animais quiméricos B6/IFNgRKO mostraram maior carga parasitária e menor intensidade dos infiltrados 8 inflamatórios do que aqueles dos animais quiméricos B6/B6, resultados que sugerem o envolvimento das células estruturais no controle do parasita e promoção do recrutamento leucocitário. Na infecção pelo Plasmodium chabaudi AS a análise comparativa dos grupos IFNgRKO e quimera B6/IFNgRKO mostrou que no início da infecção as curvas de parasitemia destes grupos são idênticas sugerindo que nesta fase da infecção a presença do IFNgR nos leucócitos em pouco contribui na evolução da parasitemia. Por outro lado, a análise comparativa dos grupos quimera B6/IFNgRKO e quimera B6/B6 mostrou níveis mais elevados de parasitemia e maior índice de mortalidade nos animais B6/IFNgRKO, sugerindo que as células estruturais participam no controle do parasita através da sua resposta ao IFNg. Entretanto, em uma experiência preliminar de infecção pelo Plasmodium berghei ANKA não observamos grandes diferenças entre os animais dos grupos B6/IFNgRKO e B6/B6, não somente no que se refere à curva de parasitemias, como também na indução de morte precoce decorrente de malária cerebral.<br>The main purpose of our work was to analyze if by their response to Interferon-g (IFN-g), the non-leucocyte cells are able to control Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS and Plasmodium berghei ANKA protozoans. IFNg was described as a cytokine that promote activation on different types of leucocytes, its action on mononuclear phagocytic cells is important. Despite the fact that this cytokine activate leucocytes, it is unknown whether IFNg activates the structural cells (non-leucocytes), that is, the non-professional cells of the immune response. Our hypotheses suggest that in the case of intracellular parasites, IFNg could help the infected structural cells by increasing their signaling and effect actions. In addition, during the response against intracellular and extracellular parasites, IFNg could induce the production of inflammatory mediators by these cells guaranteeing direct or indirectly the parasite clearance. In the present study, we analyzed the infection of diferente protozoans on bone marrow B6/IFNgRKO chimeras, in which the non-leukocyte cells are deficient in IFNg receptor and the leukocyte cells are normal. Immunofluorescence analyses of histological sections revealed a high expression of IFNgR on the structural cells from the heart of B6 and control chimeras B6/B6 animals, but non-expression of this receptor on histological sections from IFNgRKO and experimental chimeras B6/IFNgRKO, despite the fact that a great part of leucocytes from the last group of animals express the receptor. After T. cruzi infection, the cardiac and skeletal muscle from B6/IFNgRKO chimera animals showed a huge amount of parasite and less infiltration inflammatory than B6/B6 animals, suggesting that the structural cells are involved in the parasite control and leukocyte recruitment. During Plasmodium chabaudi AS infection, comparative analyses from IFNgRKO and 10 B6/IFNgRKO groups showed that parasitemia curves at the early phase are similar, suggesting that during this phase IFNgR expression on leukocytes are not important. On the other hand, parasitemia and mortality levels on B6/IFNgRKO and B6/B6 groups were higher than those on B6/IFNgRKO animals, determining that structural cells participate during the course of infection through their response to IFNg. However, when B6/IFNgRKO and B6/B6 animals were infected with Plasmodium berghei ANKA no significantly difference was observed between these groups related to the course of parasitemia and cerebral malaria.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-19T19:37:39Z No. of bitstreams: 1 FabiodeBarrosAmaralDissertacao2014.pdf: 2938215 bytes, checksum: 3d899bf568eeae36d21979ba7aafab3c (MD5)<br>Made available in DSpace on 2016-12-19T19:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabiodeBarrosAmaralDissertacao2014.pdf: 2938215 bytes, checksum: 3d899bf568eeae36d21979ba7aafab3c (MD5) Previous issue date: 2014-03-31<br>The equine chorionic gonadotropin (eCG) has been used as an important resource in the processes of reproduction in animals of economic interest, especially horses and cattle. The eCG molecule consists of a glycoprotein composed of two subunits called alpha and beta which together perform the function of both LH (luteinizing hormone) and FSH (follicle stimulating hormone) and due to this characteristic has great potential to induce ovulation in household species. Based on the aforementioned characteristics, the present work was was aimed at the study and characterization of the structure of eCG using molecular modeling techniques as well as testing its production in cells of the microorganism Pichia pastoris. Furthermore, chimeric models have been proposed linking the eCG and immunoglobulin G (IgG) molecule based on studies that reveal the great potential of it in raising the half-life of other molecules circulating in the organism. Four chimeric models were prepared so that the eCG alpha and beta chains are connected by a hinge, short and flexible regions, while the terminal region of the alpha chain was connected to the N-terminal portion of the CH2 domain of the IgG by another hinge region, thus resulting in a model in which two different molecules are linked.<br>A gonadotrofina cori??nica equina (eCG) tem sido um importante recurso usado nos processos de reprodu????o em animais de interesse econ??mico, principalmente equinos e bovinos. A mol??cula de eCG consiste em uma glicoprote??na composta de duas subunidades denominadas alfa e beta que juntas desempenham a fun????o tanto de LH (horm??nio luteinizante) como FSH (horm??nio fol??culo estimulante) e devido a essa caracter??stica possui um grande potencial para induzir a ovula????o em esp??cies dom??sticas. Baseando-se nas caracter??sticas citadas, o presente trabalho teve como objetivo estudar e caracterizar a estrutura do eCG utilizando-se t??cnicas de modelagem molecular assim como testar a sua produ????o em c??lulas do microrganismo Pichia pastoris. Al??m disso, foram propostos modelos quim??ricos ligando eCG ?? mol??cula de imunoglobulina G (IgG) tendo como base estudos que revelam o grande potencial da mesma em elevar a meia vida de outras mol??culas em circula????o no organismo. Quatro modelos quim??ricos foram apresentados de forma que as cadeias beta e alfa do eCG s??o conectadas por regi??es hinge que s??o sequ??ncias curtas e flex??veis da mol??cula enquanto que a regi??o terminal da cadeia alfa foi conectada por meio de outra regi??o hinge, ?? por????o N-terminal do dom??nio CH2 da IgG, portanto, resultando em um modelo em que est??o ligadas duas mol??culas diferentes.

Orientador: Leandro Karnal<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Filosofia e Ciências Humanas<br>Made available in DSpace on 2018-08-26T05:59:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RenatoDenadaida_M.pdf: 4703282 bytes, checksum: eab63757290d8a4163b209306fb8279b (MD5) Previous issue date: 2014<br>Resumo: Esta dissertação analisa a maneira como a Historia de las Indias de Nueva España foi produzida pelo dominicano frei Diego Durán em finais do século XVI. O trabalho versa sobre a obra, as fontes de informação, as leituras e andaimes de construção que presidiram sua composição. Em especial, procurou-se analisar como Durán teceu sua narrativa ao se utilizar de diferentes registros e tradições históricas e o peso que esses elementos tiveram no resultado final da obra. Ao contextualizar as camadas de leitura e feitura do documento, percebeu-se que apesar do olhar do dominicano sobre a história indígena ter sido guiado por uma perspectiva bíblica, as tradições europeias e americanas foram ressignificadas ao entrarem em contato na Historia de las Indias<br>Abstract: This dissertation examines how the Historia de las Indias de Nueva España was produced by Dominican friar Diego Durán in the late sixteenth century. The text discusses the work, the sources of information and the readings which governed its composition. In particular, we sought to analyze how Durán wove his narrative while using different records and historical traditions and the weight these have had on the final outcome of the work. By contextualizing the layers of reading and making of the document, the analysis noticed that despite the biblical perspective guided the Dominican on indigenous history, European and American traditions were resignified when put together in the Historia de las Indias<br>Mestrado<br>Historia Cultural<br>Mestre em História

Orientador: Carmino Antonio de Souza<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas<br>Made available in DSpace on 2018-08-07T12:06:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Beltrame_LuizPaulo_D.pdf: 1273755 bytes, checksum: a809e73238738768c971673f3daef900 (MD5) Previous issue date: 2006<br>Resumo: As elevadas taxas de mortalidade após transplante alogênico de medula óssea (TMO) com regime de condicionamento pré-transplante mieloablativo, levou-nos a iniciar a realização destes procedimentos utilizando-se regime de condicionamento pré-transplante não-mieloablativo, para pacientes considerados de maior risco. Esta modadlidade de tratamento passou a ser oferecida para pacientes com neoplasias hematológicas que devido à idade mais avançada, e/ou presença de comorbidades, eram inelegíveis para serem submetidos a um TMO convencional, e também para aqueles que estavam sendo submetidos a um segundo TMO. Entre julho de 2001 e outubro de 2005, 26 pacientes (leucemia mielóide aguda, n=1; leucemia mielóide crônica, n=1; Linfoma de Hodgkin, n=4; Linfoma não-Hodgkin agressivo, n=6; mieloma múltiplo, n=14) receberam TMO de um doador relacionado HLA-idêntico com células progenitoras periféricas (CPP), após um condicionamento pré-TMO não-mieloablativo. O regime de condicionamento consistia de fludarabina, 30 mg/m2/dia por 3 dias, e 2 Gy de irradiação corporal total. A profilaxia da doença do enxerto-contra-hospedeiro foi feita com ciclosporina-A por 56 dias, e micofenolato mofetil por 28 dias. Dos 26 pacientes, 23 (88%) encontravam-se em progressão de doença, e 24 (92%) estavam sendo submetidos ao segundo TMO. O seguimento mediano global foi de 436 dias (3-1397 dias), e o seguimento mediano dos pacientes vivos ao término deste estudo foi de 640 dias (135-1397 dias). São apresentados também, sem qualquer finalidade comparativa, os resultados de 47 pacientes que no mesmo período e na mesma unidade, foram submetidos ao TMO com CPP após um regime de condicionamento mieloablativo. Nos pacientes que receberam TMO com regime de condicionamento não-mieloablativo, a toxicidade não-hematológica foi branda e a recuperação rápida. Infecção bacteriana foi observada em 11 pacientes (44%). O tempo mediano com contagem de neutrófilos menor que 500 células por ml de sangue foi de 6 dias, e apenas 3 pacientes (12%) atingiram contagem plaquetária abaixo de 20.000. Quimerismo hematopoiético completo foi atingido em 25 pacientes (95%), e infusão de linfócitos do doador foi necessária em 6 indivíduos, sendo em 3 devido ao estado de quimerismo misto, e em 3 devido à progressão de doença. A doença do enxerto-contra-hospedeiro (DECH) aguda graus II ou maior ocorreu em 9 pacientes (37%) e a DECH crônica extensa ocorreu em 15 (60%). Houve 12 óbitos (46%), 7 relacionados a complicações do procedimento e 5 devido a progressão de doença. A sobrevida global, sobrevida livre de progressão e tempo para progressão nestes pacientes foram respectivamente 39% (95% IC, 15-63%), 33% (95% IC, 11-55%) e 64% (95% IC, 32-96%), considerando-se um tempo de seguimento mediano de 436 dias, com variação de 3 a 1397. O TMO com regime de condicionamento pré-transplante não-mieloablativo mostrou-se factível e seguro, com redução da toxicidade e mortalidade relacionadas ao procedimento, mesmo para pacientes com neoplasias hematológicas de alto risco<br>Abstract: Background and Objectives. High mortality rate after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) with myeloablative conditioning prompted us to offer HSCT with non-myeloablative conditioning (NST). Design and Methods. Between July, 2001 and October, 2005, 26 patients [acute myeloid leukemia, n=1; chronic myeloid leukemia, n=1; Hodgkin¿s lymphoma, n=4; aggressive non-Hodgkin¿s lymphoma n=6; multiple myeloma (MM), n=14], received peripheral NST from HLA-identical siblings. Conditioning regimen consisted of fludarabine plus 2 Gy of TBI, and GVHD prophylaxis with cyclosporine-A plus micofenolate mofetil. Eighty-eight percent were in progression of disease (PD) and 92% were undergoing their second HSCT. Results. Non-hematologic toxicities were mild and transient. Bacterial infection occurred in 44%. Median time to granulocyte recovery was six days and only 12% achieved platelets count lower than 20 x 109/L. Full donor chimerism was established in 95%. Donor lymphocyte infusion was required in 6 patients, 3 because of mixed chimerism and 3 because of PD. A-GVHD grade II or higher was observed in 37%, and extensive c-GVHD in 60%. There were 12 deaths (46%), 7 transplant related mortality and 5 related to PD. OS, PFS and time to progression (TTP) were respectively 39% (95% CI, 15-63%), 33% (95% CI, 11-55%) and 64% (95% CI, 32-96%) for the whole group. MM patients had OS, PFS and TTP of 27% (CI 95%, 0-67%), 42% (95% CI, 8-76%) and 86% (95% CI, 60-100%), respectively. Interpretation and Conclusion. This approach showed feasible and safe with reduction in transplant related toxicities, even for these high risk hematopoietic malignancies<br>Doutorado<br>Clinica Medica<br>Doutor em Clínica Médica

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:37Z : No. of bitstreams: 1 000844259.pdf: 4595767 bytes, checksum: 71dce578d9bb8bd46aa509b0383e1407 (MD5)<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)<br>Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)<br>O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada de e<br>Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species piracanjuba Brycon orbignyanus into lambaris Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba's testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into lambaris testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration ofbusulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species piracanjuba (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process.

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira<br>Banca: George Shigueki Yasui<br>Banca: Maria Angélica Spadella<br>Banca: Rafael Henrique Nóbrega<br>Banca: Carlos Alberto Vicentini<br>Resumo: O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada...<br>Abstract: Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species "piracanjuba" Brycon orbignyanus into "lambaris" Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba's testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into "lambaris" testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration ofbusulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species "piracanjuba" (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process<br>Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-14Bitstream added on 2014-06-13T19:32:31Z : No. of bitstreams: 1 razza_em_me_botib.pdf: 299239 bytes, checksum: 0bf1a328b00c57f4ec60137687ffb77c (MD5)<br>Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)<br>Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)<br>No quimerismo por agregação, células de embriões oriundos de fertilizações distintas se distribuem, aleatoriamente, para formar um único indivíduo. Entretanto, a formação de embriões tetraploides (4n), por eletrofusão, e o posterior quimerismo com um embrião diploide (2n) deve resultar em um embrião quimérico, porém com massa celular interna (MCI) não aleatória, isto é, exclusivamente 2n. Desta forma, a agregação de um embrião zebuíno (4n, genótipo termorresistente) com um taurino (2n, genótipo termossensível) resultaria em uma MCI exclusivamente ―taurina‖, porém com o trofectoderma (futuro elemento extraembrionário, isto é, o córion) de maior composição zebuína, podendo constituir um modelo para estudos de adaptação - durante a gestação - deste embrião/feto em clima tropical. O objetivo do presente trabalho foi padronizar a produção de embriões 4n da raça Nelore (Bos indicus) bem como o quimerismo por agregação com embriões mestiço Bos taurus (2n) com Bos indicus (4n). Oócitos de vacas Nelore provenientes de abatedouro foram maturados, fertilizados com sêmen de touros Nelore ou Holandês Preto e Branco e cultivados em meio SOF. Embriões da raça Nelore, em estágio de 2 células (30 h pós-inseminação, hpi) e com o eixo interblastômeros bem definido, foram selecionados para o procedimento de eletrofusão (equipamento ECM 830-BTX, Harvard Apparatus) com o intuito de produzir embriões tetraploides. Para este procedimento, foram testados alguns parâmetros, de acordo com o número de pulsos (1 ou 2), voltagem (0,40; 0,50; 0,75; 1,0; 1,4; 5,0 kV/cm) e duração do eletrochoque (20; 25; 50; 60 μs). Embriões zebuínos 4n, formados após a eletrofusão, e embriões mestiços taurinos 2n, ambos em estágio de 8 a 16 células (72 hpi), foram submetidos a tratamentos com protease...<br>The embryonic chimeras production by aggregation allows embryonic cells from two distinct fertilizations to be randomly distributed to compose a single individual. However, the formation of tetraploid embryo (4n) by electrofusion and its subsequent chimerism with a diploid embryo (2n) should result in a chimeric conceptus, whose inner cell mass (ICM) would be entirely 2n. Hence, the aggregation of a zebu embryo (4n, thermotolerant) with a European breed embryo (2n, thermosensitive or ―taurine‖) would result in an exclusively taurine ICM, but the trophectoderm (future extraembryonic components, i.e. chorion) would be mostly from zebu embryo, which could support taurine embryo/fetus in a different way - during pregnancy - under tropical environment. The aim of this study was to standardize the production of 4n Nelore embryos (Bos indicus) and the production of embryonic chimeras by aggregation of crossbred Bos taurus (2n) with Bos indicus (4n) embryos. Nelore cows ovaries were collected from abattoir and oocytes were obtained, matured, fertilized with semen from Nelore or Holstein bulls, and cultured in SOF (synthetic oviduct fluid). Two-cell stage Nelore embryos (30 hours post insemination or hpi), with a clearly visible interblastomeric axis, were selected for electrofusion procedure (ECM 830-BTX, Harvard Apparatus) to produce tetraploid embryos. For this purpose, some parameters were tested according to the number of pulses (1 or 2), voltage (40, 50, 75, 100, 140, 500 V) and time length of electroshock (20, 25, 50, 60 μs). Nelore tetraploid embryos produced after electrofusion and diploid crossbred taurine embryos, both on 8 to 16-cells stage (72 hpi) were subjected to protease treatment to remove the zona pellucida, and subsequently treated with the agglutinant agent... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira<br>Banca: Fernanda C. L. Alvarenga<br>Banca: José Buratini Junior<br>Resumo: No quimerismo por agregação, células de embriões oriundos de fertilizações distintas se distribuem, aleatoriamente, para formar um único indivíduo. Entretanto, a formação de embriões tetraploides (4n), por eletrofusão, e o posterior quimerismo com um embrião diploide (2n) deve resultar em um embrião quimérico, porém com massa celular interna (MCI) não aleatória, isto é, exclusivamente 2n. Desta forma, a agregação de um embrião zebuíno (4n, genótipo termorresistente) com um taurino (2n, genótipo termossensível) resultaria em uma MCI exclusivamente ―taurina‖, porém com o trofectoderma (futuro elemento extraembrionário, isto é, o córion) de maior composição zebuína, podendo constituir um modelo para estudos de adaptação - durante a gestação - deste embrião/feto em clima tropical. O objetivo do presente trabalho foi padronizar a produção de embriões 4n da raça Nelore (Bos indicus) bem como o quimerismo por agregação com embriões mestiço Bos taurus (2n) com Bos indicus (4n). Oócitos de vacas Nelore provenientes de abatedouro foram maturados, fertilizados com sêmen de touros Nelore ou Holandês Preto e Branco e cultivados em meio SOF. Embriões da raça Nelore, em estágio de 2 células (30 h pós-inseminação, hpi) e com o eixo interblastômeros bem definido, foram selecionados para o procedimento de eletrofusão (equipamento ECM 830-BTX, Harvard Apparatus) com o intuito de produzir embriões tetraploides. Para este procedimento, foram testados alguns parâmetros, de acordo com o número de pulsos (1 ou 2), voltagem (0,40; 0,50; 0,75; 1,0; 1,4; 5,0 kV/cm) e duração do eletrochoque (20; 25; 50; 60 μs). Embriões zebuínos 4n, formados após a eletrofusão, e embriões mestiços taurinos 2n, ambos em estágio de 8 a 16 células (72 hpi), foram submetidos a tratamentos com protease... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: The embryonic chimeras production by aggregation allows embryonic cells from two distinct fertilizations to be randomly distributed to compose a single individual. However, the formation of tetraploid embryo (4n) by electrofusion and its subsequent chimerism with a diploid embryo (2n) should result in a chimeric conceptus, whose inner cell mass (ICM) would be entirely 2n. Hence, the aggregation of a zebu embryo (4n, thermotolerant) with a European breed embryo (2n, thermosensitive or ―taurine‖) would result in an exclusively taurine ICM, but the trophectoderm (future extraembryonic components, i.e. chorion) would be mostly from zebu embryo, which could support taurine embryo/fetus in a different way - during pregnancy - under tropical environment. The aim of this study was to standardize the production of 4n Nelore embryos (Bos indicus) and the production of embryonic chimeras by aggregation of crossbred Bos taurus (2n) with Bos indicus (4n) embryos. Nelore cows ovaries were collected from abattoir and oocytes were obtained, matured, fertilized with semen from Nelore or Holstein bulls, and cultured in SOF (synthetic oviduct fluid). Two-cell stage Nelore embryos (30 hours post insemination or hpi), with a clearly visible interblastomeric axis, were selected for electrofusion procedure (ECM 830-BTX, Harvard Apparatus) to produce tetraploid embryos. For this purpose, some parameters were tested according to the number of pulses (1 or 2), voltage (40, 50, 75, 100, 140, 500 V) and time length of electroshock (20, 25, 50, 60 μs). Nelore tetraploid embryos produced after electrofusion and diploid crossbred taurine embryos, both on 8 to 16-cells stage (72 hpi) were subjected to protease treatment to remove the zona pellucida, and subsequently treated with the agglutinant agent... (Complete abstract click electronic access below)<br>Mestre

Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales)<br>No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo<br>La presente memoria que hemos denominado “La Fábrica de Quimeras” intenta analizar el populismo desplegado en la candidatura presidencial de Carlos Ibáñez del Campo en 1952. El trabajo busca indagar los fenómenos involucrados en esta elección, que ocasionaron un cambio en el sistema político chileno de mediados de siglo, debido a que se hacía necesario dar nuevas respuestas a un nuevo grupo de electores que había surgido en ciudades tales como Santiago, nos estamos refiriendo a los habitantes de las llamadas “poblaciones callampas”. La candidatura de Ibáñez se articuló como un fenómeno populista, que estaba asociado a otras experiencias en nuestro continente, como las de Juan Domingo Perón en Argentina o de Getulio Vargas en Brasil. No obstante, debemos señalar que Chile había sido reticente a la formación de dichos movimientos, por ello nos interesó mucho analizar cómo se forma esta candidatura, utilizando un método historiográfico que da cuenta de la estructura de la campaña, sus adherentes y, principalmente, del discurso utilizado para encantar a las masas. La candidatura de Ibáñez la hemos denominado populista, pero como señalaremos más adelante, el uso que se ha dado a dicho término ha resultado muy ambiguo, por lo que pondremos en perspectiva la candidatura de Ibáñez con las teorías más conocidas que explican al populismo. Finalmente debemos destacar que nosotros hemos formulado la hipótesis de que la candidatura de Ibáñez en 1952 sirvió de puente entre dos épocas del desarrollo político en Chile. La primera, cercana a los gobiernos radicales, que se fueron desarrollando como cupulares, ya que se habían acercado a los tradicionales grupos aristocráticos, llegando a sintonizar plenamente con su sentir. El otro extremo del puente fueron los gobiernos de las planificaciones globales de Frei Montalva y Allende, los que tenían aspiraciones democratizantes, ya que mediante su acercamiento a las masas, lograron canalizar el potencial de dichas masas, dotándoles de un papel central en la política chilena de mediados del siglo XX. Ibáñez es el puente entre estos dos períodos, ya que a través del populismo, las masas marginales logran iniciar el proceso de entrada al espectro político utilizando algunos métodos populistas.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0<br>Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06041.pdf: 4212913 bytes, checksum: fd1c8026a141fe44d8a936d7cfcd904d (MD5)<br>Tese (Doutoramento)<br>IPEN/T<br>Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Introdução e Objetivos. Fosfatases são enzimas promissoras para aplicação na degradação de organofosforados. Por exemplo, a enzima paraoxonase 1 (PON1), associada à lipoproteína de alta densidade (HDL), hidrolisa lactonas, ésteres aromáticos e compostos organofosforados (OP) neurotóxicos. \"Módulos de ligação a carboidrato\" (CBM) têm diversas aplicações biotecnológicas. Nosso objetivo é a obtenção de proteínas quiméricas contendo fosfatases ligadas a um módulo de ligação de celulose, o que possibilitaria a imobilização dessas enzimas em suportes de celulose. Resultados. Como prova de conceito, uma proteína quimérica contendo uma \"fosfatase ácida\" (appA) de E.coli e CBM familia 2 (CBM2) de uma celulase de Xanthomonas axonopodis pv citri foi montada e produzida em E. coli como uma proteína recombinante solúvel. appA-CBM2 purificada demonstrou ser totalmente funcional exibindo atividade de ligação à celulose microcristalina (Avicel PH101) e atividade de fosfatase sobre p-nitrofenil fosfato. A ligação à Avicel evidenciou um comportamento de saturação descrito por uma \"constante de ligação\" (Kb) de 26 mg e um \"máximo de ligação\" (Bmax) de 4,45 U/&#181;g. Além disso, a ligação de appA-CBM2 em Avicel foi maior em pH 2,5 e diminuiu acima de pH 6,5, como observado anteriormente para CBM2. Finalmente, o efeito de concentração de p-nitrofenil fosfato na atividade catalítica de appA-CBM2 e appA foi idêntico, exibindo um Km de 2,8 mM. Portanto, esses dados mostram que o conceito de uma proteína que combina as propriedades da fosfatase e do domínio de ligação à celulose é possível e funcional. De forma similar, os segmentos de DNA que codificam para o CBM2 e para a PON1 de Homo sapiens, foram fusionados resultando em um segmento que codifica para uma proteína quimérica (PON1-CBM2). PON1 nativa e PON1-CBM2 foram produzidas na forma solúvel e ativa em E.coli cepa Arctic. Embora não tenha sido viável sua purificação, estas enzimas foram caracterizadas. PON1-CBM2 liga-se em Avicel PH101 com um comportamento de saturação, descrito por uma constante de ligação (Kb) de 27 mg, valor idêntico àquele observado para appA-CBM2, o que sugere que o domínio CBM2 é igualmente funcional nestas duas enzimas quiméricas. PON1-CBM2 também exibe atividade paraoxonásica com Km similar àquele observado para PON1 nativa (1,3 mM), sugerindo que o \"domínio\" PON1 encontra-se totalmente funcional na enzima quimérica. Conclusão. Uma estratégia para a construção e expressão heteróloga em E. coli de PON1 e das enzimas quiméricas appA-CBM2 e PON1-CBM2 foi desenvolvida. As enzimas quiméricas mostraram-se totalmente funcionais e conservaram as propriedades de seus \"domínios\" constituintes.<br>Introduction and Aims. Phosphatases are promising enzymes for application in the degradation of organophosphates, whereas carbohydrate binding module has significant and demonstrated biotechnological applications. The high-density lipoprotein-associated enzyme paraoxonase 1 (PON1) hydrolyzes lactones, aromatic esters, and neurotoxic organophosphorus (OP) compounds. Our aim is to obtain chimeric proteins containing a phosphatase domain linked to a carbohydrate binding module (CBM), which could be immobilized on a cellulose supports. Results. As a proof of concept, a chimeric protein combining an acid phosphatase (appA) from E.coli and a CBM family 2 (CBM2) from Xanthomonas axonopodis pv. citri was assembled and produced in E.coli as a recombinant soluble protein. Purified appA-CBM2 was fully functional, was bound to microcrystalline cellulose and exhibited phosphatase activity upon p-nitrophenyl phosphate. The binding to microcrystalline cellulose Avicel PH101 exhibited saturation with a binding constant (Kb) of 26 and a maximum binding (Bmax) of 4,45 U/&#181;g. In addition, the binding was higher at pH 2.5 and decreased above pH 6.5, as previously observed for CBM2. Finally, effect of p-nitrophenyl phosphate concentration on appA-CBM2 and native appA activities were identical, exhibiting a Km of 2.8 mM. Taken together, these data show that the conceptual design of a protein combining the properties and biotechnological advantages of phosphatases and cellulose binding domains is possible and functional. Similarly, DNA segments coding for CBM2 and for PON1 from Homo sapiens combined resulting in a segment coding for a chimeric protein (PON1-CBM2). Native PON1 and PON1-CBM2 were produced as recombinant protein in E. coli Arctic. Although purification was not accomplished, these enzymes were characterized. PON1-CBM2 binds to microcrystalline cellulose, exhibiting a saturation behavior described by a Kb of 27 mg. PON1 and PON1- CBM2 have the same Km for paraoxon (1.3 mM), indicating that the phosphatase domain was fully functional. Conclusion. An effective strategy for heterologous expression of the native PON1 and chimeric appA-CBM2 and PON1-CBM2 in E. coli was attained. The chimeric enzymes were fully functional and maintained the properties of their original domains

Conhecemos o papel dos leucócitos no controle do Trypanosoma cruzi, mas ignoramos qual a contribuição das populações estruturais (miócitos, hepatócitos, etc). Estas populações poderiam sinalizar a presença do parasita e/ou ter ação efetora que poderia aumentar em resposta a citocinas como o IFN-g. Para verificar se as células estruturais respondem ao IFN-g contribuindo à destruição do T. cruzi, analisamos a infecção em quimeras WT/IFNgR-KO (WT/KO) geradas em camundongos IFNgR-KO reconstituídos com medula óssea de camundongos selvagens (WT), nas quais parte dos leucócitos é IFNgR+, mas as células não leucocitárias são deficientes. Quimeras WT/KO e quimeras controle WT/WT foram estudadas em relação à carga parasitária e inflamação. O parasitismo sistêmico e tissular é maior nas quimeras WT/KO do que nas quimeras WT/WT, mas inferior à dos controles IFNgR-KO. Nos animais WT/KO o aumento de ninhos no coração e músculo não se acompanha de aumento no infiltrado leucocitário. Os resultados sugerem que as células não leucocitárias contribuem à defesa frente ao T. cruzi.<br>Although we know the role played by leukocytes in Trypanosoma cruzi control, we ignore the contribution of structural cells (myocytes, hepatocytes, etc). These cells could signal the presence of the parasite and/or mediate an effector activity which could increase in response to cytokines, as IFN-g. To evaluate if non-leukocytes respond to IFNg, contributing to T. cruzi destruction, we analysed the infection in WT/IFNgR-KO (WT/KO) chimaeras, generated in IFNgR-KO mice reconstituted with bone marrow of wild-type mice (WT) so that most leukocytes are IFNgR+ but structural cells are deficient. WT/KO chimaeras and control WT/WT chimaeras were infected by T. cruzi and the parasite load and inflammation analyzed in various organs. Systemic and tissue parasite loads were higher in WT/KO chimeras than in WT/WT chimeras, but lower than in control IFNgR-KO mice. In WT/KO chimaeras the increased parasite load at the heart and skeletal muscle was not followed by an increase of inflammatory infiltrates. Our results suggest that structural cells contribute to T. cruzi control.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:56:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco_Chagas_Oliveira_Atanasio.pdf: 3146370 bytes, checksum: 8e51a686688868abfaa92fdf8f4ed453 (MD5) Previous issue date: 2011-03-03<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior<br>Talking about the trajectory of legendary leads us to believe in narratives that references his achievements and reaffirm the traits that help shape them in that aspect. . The figure of myth, the hero, the villain is nothing but a reflection of the historical embodiment of an image cemented in time. However, what occurs when we face indicating lead us to revise the figure legendary and causing a certain issues? And what would be released by the looks perceptions alternatives that reconstruct the the narratives of the legendary? These were questions which I encountered when analyzing the memories that established certain way about The Rebellious. The very word "Rebellious" since it carries a certain range of meanings, by itself eventually indict the reinterpretation process that would have been driven over those who were well defined from the standpoint of society. These individuals have emerged from obscurity to establish themselves in the story about the name of the Coluna Prestes (Prestes Column). This was a group historically known for being a rebel up coming from the military, insurgents in the 1920s, which opposed the oligarchic power politics of the governors, the present political regime in the first two decades of Republican Brazil.Headed by Luiz Carlos Prestes, this movement has taken an surprising course, itinere between the years 1925-1927, about 25,000 km of national territory, urging local communities to fight against the yoke of elitist political season, at the time the opposing force that fought the government.In the middle the various stories extolled his forays into the course of this movement. Among the routes of its passage are several northeastern towns, among them Timon-Maranhão and Teresina-Piauí. These the narratives were other points of the passage of the rebels. But as they were found in the inherited memories and lived in the memories they carry the memory of this period? Using this plan is that we see other directions printed of the image of the rebels. And what would they? It is the from these issues as establishing the development of this study, having as objective to analyze the ways in which the figures of the revolutionary the Prestes Column were appropriate in social memory. Through a case study on its passage in both cities, we found that other images were made on his figures. These images lead us to explore the properties of memory and pluralized field of the social imaginary and chimerical<br>Falar sobre as trajetórias de lendários leva-nos a pensar em narrativas que referencie seus feitos e reitere os traços que ajudam a moldá-los nesse aspecto. A figura do mito, do herói, do vilão nada mais é que o reflexo da incorporação histórica de uma imagem solidificada no tempo. No entanto, o que acontece quando nos deparamos com indicativos que nos levam a rever e figura da lenda gerando certa problemática? E quais seriam os olhares lançados pelas percepções alternativas que reelaboram as narrativas sobre a lenda? Essas foram questões as quais me deparei ao analisar as memórias que estabeleciam determinados sentidos sobre os Revoltosos. O próprio termo Revoltoso , uma vez que carrega certa gama de significados, por si mesmo acaba por indiciar o processo de ressignificação que teria sido impelido sobre aqueles que assim foram definidos a partir do olhar social. Tais sujeitos emergiram do anonimato para se firmarem na história sobre o nome de Coluna Prestes. Esse fora uma grupo historicamente conhecido por ser um levante rebelde advindo das forças armadas, insurgente na década de 1920, que se opôs ao poder oligárquico da política dos governadores, regime político presente nas duas primeiras décadas do Brasil republicano. Liderado por Luiz Carlos Prestes, esse movimento empreendeu uma surpreendente trajetória, itinerando, entre os anos de 1925-1927, por cerca de 25.000 quilômetros do território nacional, exortando às comunidades locais para luta contra o julgo político-elitista da época, ao tempo em que combatia as forças inimigas do governo. Em meio às suas incursões diversas histórias exaltaram a trajetória desse movimento. Entre os percursos de sua passagem se encontram várias cidades do nordeste, dentre elas Timon-Maranhão e Teresina-Piauí. Esses seriam outros pontos de narrativas sobre a passagem dos rebeldes. Mas como eles se encontram presentes nas memórias herdadas e nas memórias vividas que carregam a lembrança de tal época? Por meio desse plano é que visualizamos outros sentidos impressos sobre a imagem dos rebeldes. E quais seriam eles? É a partir de tais problemáticas que se estabelece o desdobramento desse estudo, tendo como objetivo analisar as formas pelas quais as figuras dos revolucionários da Coluna Prestes foram apropriadas na memória social. Através de um estudo de caso sobre sua passagem nas duas cidades, observamos que outras imagens foram fabricadas sobre suas figuras. Essas imagens nos levam a explorar as propriedades da memória e o campo pluralizador e quimérico do imaginário social

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011<br>O complexo GimC/Prefoldina é um complexo hetero-oligomérico envolvido na biogénese do citoesqueleto. Este complexo é constituído por seis subunidades distintas que se classificam em classe α (Gim2/Pfd3 e Gim5/Pfd5) e β (Gim1/Pfd6, Gim3/Pfd4, Gim4/Pfd2 e Gim6/Pfd1). GimC/Prefoldina interage com polipéptidos nascentes de actina e tubulina ainda ligados ao ribossoma e entrega-os à chaperonina CCT/TriC. Sabe-se que as diferentes subunidades Gim não são redundantes. A ausência de cada uma das subunidades leva a fenótipos distintos, nomeadamente, em condições de stresse oxidativo e osmótico em Saccharomyces cerevisiae. De acordo com o trabalho desenvolvido anteriormente no laboratório não foi possível correlacionar os fenótipos de stresse com defeitos a nível do citoesqueleto tendo-se equacionado se as diferenças fenotípicas poderiam estar relacionadas com a expressão genética de diferentes genes que actuam conforme as condições do meio. Atendendo ainda a dados da literatura, perspectiva-se o envolvimento das Gim, por exemplo, na regulação da transcrição. Tendo como finalidade a identificação de alvos moleculares de interacção directa com as Gim e subjacentes aos fenótipos de stresse, pretendeu-se com o presente trabalho a validação funcional das proteínas Gim em Saccharomyces cerevisiae, para utilização em sistemas two-hybrid. Para tal, foram realizados ensaios one-hybrid com quimeras LexADBDGim (Lexgim) e diferentes repórteres. Paralelamente foi averiguado o potencial de cada Gim na regulação da transcrição mediada pela RNA polimerase II. Os resultados obtidos conduziram à identificação de promotores específicos nos quais as quimeras Lexgim não desempenham funções como activadores nem como repressores transcricionais, por si só, em condições de crescimento óptimas. Deste modo, as Lexgim poderão ser utilizadas para identificação de novos alvos de interacção, em ensaios two-hybrid nas condições testadas, ou seja na ausência de stresse. Porém, dado que a interacção Gim/alvo poderá existir apenas em condições de stresse, a capacidade das Lexgim afectarem a transcrição deverá ser estudada em condições de stresse oxidativo e osmótico, através de ensaios one-hybrid.<br>GimC/Prefoldin is a hetero-oligomeric complex involved in cytoskeleton biogenesis. It is composed by six different subunits belonging to α (Gim2/Pfd3 and Gim5/Pfd5) and β (Gim1/Pfd6, Gim3/Pfd4, Gim4/Pfd2 and Gim6/Pfd1) classes. This complex interacts with actin and tubulin nascent polypeptides while associated with ribossome and deliver them to chaperonin CCT/TriC. The Gim subunits are not redundant. In Saccharomyces cerevisiae, the absence of each subunit leads to different phenotypes, for instance, in the presence of osmotic and oxidative stress agents. Taking into account previous work developed in our laboratory, it was not possible to correlate the stress phenotypes with cytoskeleton defects so, it was hypothesized that the phenotypic differences could be due to differential expression of specific stress genes. In addition, literature data does not exclude the involvement of the Gim, for example, in transcriptional regulation. In order to identify targets that directly interact with Gim and support the stress phenotypes, this work aimed the functional validation of Gim in Saccharomyces cerevisiae, in the context of two-hybrid systems. In this way, one-hybrid assays with each LexADBDGim (Lexgim) chimeras and different reporters were performed. At the same time it was determined the potential of each Gim to regulate transcription mediated by RNA polymerase II. The obtained results led to the identification of specific promoters in which Lexgim chimeras do not operate as transcriptional activators neither repressors per se under optimal growth conditions. In this way Lexgim can be used for two-hybrid assays within the tested conditions. Since the Gim/target interactions may occur only in stress conditions, the Lexgim capacity to affect transcription should be evaluated in osmotic and oxidative stress conditions through one-hybrid assays.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica<br>Nos doentes submetidos a transplante hematopoiético alogénico, a monitorização do quimerismo é importante na avaliação do sucesso do transplante. A análise de quimerismo nas diferentes sub-populações linfocitárias possibilita a monitorização em linhagens específicas, podendo estar dependente da pureza das células isoladas. A pureza das sub-populações celulares pode ser avaliada por técnicas moleculares ou por citometria de fluxo. Recentemente foram desenvolvidos kits baseados em técnicas de biologia molecular, tal como o Non-T Genomic Detection Kit e o Non-B Genomic Detection Kit da Accumol, que detetam a presença de ácido desoxirribonucleico (ADN) de células contaminantes em amostras de ácido desoxirribonucleico genómico de linfócitos T ou B isolados. Este estudo teve como objetivo avaliar a pureza das sub-populações linfocitárias, T e B, importantes na monitorização do quimerismo. As amostras de linfócitos T e B foram isoladas por meios imunomagnéticos, separação direta e separação sequencial, procedendo-se de seguida à extração de ácido desoxirribonucleico. A amplificação dos Short Tandem Repeats foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase multiplex e os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese capilar. Na avaliação da pureza por citometria de fluxo os anticorpos utilizados na marcação foram CD45+, CD3+ e CD19+, os resultados foram analisados com o software Navios. A avaliação da pureza com o kit Accumol realizou-se nas amostras extraídas anteriormente para o estudo do quimerismo, de seguida amplificaram-se os fragmentos por reação em cadeia da polimerase e respetiva separação por eletroforese capilar, a análise foi efetuada no software GeneMapper. No presente estudo, foram analisadas 31 amostras provenientes de doentes alo-transplantados. No isolamento de linfócitos T por separação direta, 53% das amostras apresentaram contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90%. Após o isolamento direto de linfócitos B, não foram obtidas amostras com contagens absolutas de células ≥400 células/μL e purezas >90%. No isolamento por separação sequencial, verificou-se contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90% em 77% das amostras de linfócitos T e em 8% amostras de linfócitos B. A maioria das amostras de linfócitos T com quimerismo completo e misto, apresentaram pureza >90%. Nos linfócitos B, com quimerismo completo e quimerismo misto, a percentagem da pureza foi variável. Com este estudo, pode-se concluir que com contagens linfocitárias ≥0,5x103/μL no sangue periférico é possível obter uma contagem absoluta de células ≥400 células/μL, assim como valores de pureza >90%, principalmente no isolamento de sub-populações de linfócitos T. O mesmo não se verificou nas amostras de linfócitos B, pois a maioria não atingiu valores de contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%. Para o isolamento de linfócitos T e B numa amostra de sangue, a separação sequencial apresentou melhores resultados na obtenção de amostras com contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%.<br>In patients submitted to allogeneic stem cell transplantation, the monitoring of chimerism is important for determining the success of the transplant. The chimerism analysis on different lymphocyte subpopulations enables the monitoring of specific lines and may be dependent on the purity of the isolated cells. The purity of the cellular subpopulations can be evaluated by molecular techniques or by flow cytometry. It has been recently been developed kits based on molecular biology techniques, such as Accumol’s Non-T Genomic Detection Kit and Non-B Genomic Detection Kit, which detect the presence of deoxyribonucleic acid from contaminating cells in samples of genomic deoxyribonucleic acid from isolated T and B lymphocytes. The aim of this study was to evaluate the purity of the lymphocyte subpopulations, T and B, used in the monitoring of chimerism. Before evaluation of purity, samples of T and B lymphocytes were isolated by immunomagnetic means, direct separation and sequential separation, then proceeding to the extraction of deoxyribonucleic acid. Amplification of short tandem repeats following multiplex polymerase chain reaction technique, the amplified fragments were separated by capillary electrophoresis. The assessment of purity by flow cytometry, the antibodies used in labeling were CD45+, CD3+ and CD19+, the results were analyzed with software Navios. Assessment of purity with Accumol kit was performed after amplification of the polymerase chain reaction fragments and respective separation by capillary electrophoresis, analysis was performed on the GeneMapper software. In this study we analyzed samples from 31 allotransplant patients. In the isolation of T lymphocytes by direct separation, 53% of the samples had an absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90%. In direct separation of B cells it was not obtained any sample with absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90%. In isolation by sequential separation, there was an absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90% in 77% of T lymphocytes samples, and 8% of B lymphocytes samples. The majority of T-cell samples showing complete or mixed chimerism had purity >90%. The B lymphocytes samples with complete and mixed chimerism, the percentage of purity was variable. With this study it can be concluded that with lymphocyte counts ≥0,5x103/μL in peripheral blood it is possible to obtain an absolute cell count ≥400 cells/μL, as well as purity values >90%, especially in the isolation of sub-population of T lymphocyte. The same was not observed in B lymphocyte samples, the majority did not reach the target values of cells ≥400 cells/μL and purity >90%. Even for isolation in the same sample of T and B lymphocytes, sequential separation showed better results in obtaining samples with absolute cell count ≥400 cells/μL and of >90% purity.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica<br>A análise de quimerismo, nos doentes pós transplante alogénico de progenitores hematopoiéticos, tornou-se um procedimento de rotina para avaliar o sucesso do transplante e na deteção de falência do enxerto. Após alotransplante o doente apresenta quimerismo completo, quando apenas têm células do dador ou quimerismo misto, quando têm células próprias e do dador. Para a análise de quimerismo, as células do dador e do doente são distinguidas por marcadores genéticos designados como short tandem repeats informativos, que são utilizados para efetuar o seguimento dos doentes no período pós transplante. Este trabalho teve como objetivos monitorizar o estado de quimerismo em doentes pós alotransplante, e comparar duas técnicas moleculares para avaliação do estado de quimerismo: amplificação de short tandem repeats, e amplificação do gene da amelogenina em pares dador/doente de sexos diferentes, pela técnica de reacção em cadeia da polimerase seguida de electroforese capilar. Os short tandem repeats utilizados foram: D11s, F131, THO, VWA, FES, FGA, HPRT. A análise foi realizada através de ADN extraído do sangue, nas subpopulações de leucócitos - células mononucleares e granulócitos. No presente estudo, foi analisado o quimerismo de 24 doentes alotransplantados, o seguimento médio destes doentes foi de 6 meses. O quimerismo foi analisado pela amplificação de short tandem repeats (n=24) e do gene da amelogenina (n=14). Os resultados obtidos para a análise de quimerismo foram: 20 doentes apresentaram sempre quimerismo completo e 4 doentes quimerismo misto. Dos doentes com quimerismo misto, 2 evoluíram para quimerismo completo e 2 mantiveram o mesmo estado. Foi possível concluir que, para a avaliação do quimerismo dos doentes, ambas as técnicas, short tandem repeats e gene da amelogenina, são informativas e podem ser realizadas separadamente ou de uma forma complementar.<br>Chimerism analysis after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation has become a routine procedure, for monitoring the engraftment of donor cells, thus allowing early detection of graft failure. After allogeneic stem cell transplantation the patient has complete chimerism when only has donor cells, or mixed chimerism when he has his own and the donor’s cells. To the chimerism analysis, donor cells and patient’s cells are distinguished by genetic markers, named informative STR. They are used to perform the following of patients in the post-transplant period. The aim of this study were to monitor chimerism status in patients following allogeneic stem cell transplantation, and to compare two molecular techniques to assess the state of chimerism: amplification of short tandem repeats and amplification of amelogenin gene in pairs donor/patient of different gender by polymerase chain reaction technique. The analysis was performed using DNA extracted from blood leukocyte subpopulations - mononuclear cells and granulocytes. The short tandem repeats used were: D11s, F131, THO, VWA, FES, FGA, HPRT and the amelogenin gene, were amplified by the polymerase chain reaction, followed by capillary electrophoresis analysis. In this study, we performed follow up evaluation of 24 patients submitted to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The median follow up of these patients was 6 months. The chimerism was analyzed by amplification of short tandem repeats (n=24) and amelogenin gene (n=14). Majority of patients (n=20) consistently showed complete chimerism and 4 patients showed mixed chimerism. From the patients with mixed chimerism, 2 progressed to complete chimerism and 2 remained in the same condition. In summary, both techniques, short tandem repeats and amelogenin gene, are informative and can be performed individually or in a complementary way to evaluate the chimerism status of allotransplanted patients.