Dissertations / Theses on the topic 'Realtids-PCR'

Fusobacterium necrophorum är en gramnegativ anaerob bakterie som grupperas i ss. necrophorum och ss. funduliforme. Fusobacterium necrophorum ss. funduliforme har på senare tid misstänkts kunna spela en roll vid vanligare svalginfektioner såsom halsfluss. Syftet med detta arbete var att sätta upp och bepröva en metod för realtids-PCR (Polymerase Chain Reaction) enligt Taqman för att detektera ss funduliforme. Vi undersökte även hur förvaringstiden i transportmedium (Amies kol, Copan) och odlingsmedium (Fastidious Agar Broth) påverkar överlevnaden för F. necrophorum ss. funduliforme och resultatet från realtids-PCR. Bakteriesuspension av varierande koncentration applicerades på provtagningspinnar som direkt inkuberades i medium, varefter en pinne av vardera koncentration utodlades och DNA extraherades för varje dag försöket pågick. En serie 10-spädningar av extraherat DNA från ss funduliforme ,med en lägsta koncentration av 10 DNA-molekyler per µL, användes som standard och positiv kontroll för PCR. Fusobacterium necrophorum ss funduliforme kunde detekteras med realtids-PCR från alla prov under alla dagar försöket pågick, medan odlingarna visade bäst resultat om provet såddes ut inom ett dygn från provtagningen. Realtids-PCR kan därför detektera förekomsten av ss funduliforme efter längre förvaring och bör användas för exempelvis transporterade prover, medan traditionell utodling med fördel kan användas för diagnostering av ss fundulforme då PCR inte ger information om antibiotikaresistens hos isolatet.
Fusobacterium necrophorum are Gram-stain negative, anaerobic, bacteria that are grouped into subspecies necrophorum and funduliforme. Fusobacterium necrophorum ss. funduliforme has recently been suspected to play a role in common throat infections such as tonsillitis. The purpose of this work was to set up and test a method for real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) according to Taqman with the purpose of detecting ss. funduliforme. We also examined how the storage time within transport medium (Amies charcoal, Copan) and culture medium (FAB-broth) affects the survival of the bacterium and the sensitivity of the culture and PCR methods. Bacterial suspensions of different concentrations were applied to pharyngeal sampling swabs and then directly incubated in transport medium. For each day the experiment lasted, a set of swabs of each concentration were cultured, DNA extracted, and real-time PCR performed. DNA extracted from ss. funduliforme was used as standards for the real-time PCR, with a minimum concentration of 10 DNA molecules per μL. Subspecies funduliforme could be detected from all days with real-time PCR while the cultures showed the best results if the sample was cultured within one day of collection. Real-time PCR can detect the presence of ss. funduliforme after prolonged storage and can therefore show accurate results for transported samples. Traditional culturing on growth medium is still a valuable and reliable method, provided that the samples are cultured within 24 hours. Culture may also be needed i.e. since PCR gives no information of the antibiotic resistance of the isolate.

Diatoms are photosynthetic protists that reside in aquatic environments. A unique feature of diatoms is their cell wall structure made of silica. Silicon is a limiting nutrient for diatoms. The bioavailable form of silicon in aquatic environments is silicic acid. Since the intracellular concentration of silicon is many times greater than the extracellular concentration in aquatic habitats, silicon transporters (SIT) are required that actively transports silicic acid into the cell. In the diatom Chaetoceros affinis two such transporters have been reported, SIT1 (CaSIT1) and SIT2 (CaSIT2). Gene expression of CaSIT1 is increased at low extracellular concentration of silicic acid (<30 µM), while at higher concentrations the transportation is dominated by diffusion. On the contrary, CaSIT2 does not seem to be affected by variations in environmental silicic acid concentrations, and its role in the transportation of silicic acid remains unclear. The aim of this study was to evaluate the relative gene expression of CaSIT1 and CaSIT2 in C. affinis, using realtime-PCR. The diatom was cultivated in two media: one with full nutrients (control) and one without added silicon (-Si). In addition, C. affinis was also cultivated with a second diatom, Cylindrotheca fusiformis, in respective media (mixed cultivation). Due to extensive primer-dimers, CaSIT2 was excluded from the proceeding analysis of the samples. Analysis showed that the relative gene expression of CaSIT1 was increased by silica limitation (ANOVA: p < 0,05), in accordance with previous studies. The effect of competition however resulted in a decrease of gene expression (ANOVA: p < 0,05). The combined effect, the interaction of competition and silica limitation, did not result in a significant change of the gene expression (ANOVA: p = 0,38). However, there was an increased variation among the mixed cultures, which could be a result of RNA degradation considering the poor RNA quality of the samples. The results from this study show that realtime-PCR is an effective method to measure gene expression of silica transporters, provided that the primers have been correctly evaluated.
Diatomer är vattenlevande, fotosyntetiska protister som kännetecknas av att dess cellväggsstruktur är uppbyggd av kiseldioxid. Kisel är ett begränsande näringsämne för diatomer. Den biotillgängliga formen av kisel i akvatisk miljö är kiselsyra. Eftersom den intracellulära koncentration av kisel är mångfaldigt högre än den extracellulära i de flesta akvatiska habitat, krävs kiseltransportörer (SIT) som aktivt pumpar in kiselsyran. Hos diatomen Chaetoceros affinis har två kiseltransportörer rapporterats, SIT1 (CaSIT1) och SIT2 (CaSIT2). Genuttrycket av CaSIT1 ökar vid låg koncentration av extracellulär kiselsyra (<30 µM), medan vid högre koncentrationer domineras transporten av diffusion. I motsats tycks CaSIT2 inte påverkas av variationer i tillgänglig kiselsyra, och dess roll vid transport av kiselsyra är oklar. Syftet med föreliggande arbete var att med realtids-PCR undersöka det relativa genuttrycket av CaSIT1 och CaSIT2 hos C. affinis. Diatomen odlades i två medium: en med komplett näringsinnehåll (kontroll) och en med samma näringsinnehåll förutom kisel (-Si). Därutöver odlades även C. affinis tillsammans med Cylindrotheca fusiformis, i respektive medium (mixad kultur). På grund av omfattande primer-dimers uteslöts CaSIT2 primers från analys av proverna. Det relativa genuttrycket av CaSIT1 ökade vid kiselbegränsning (ANOVA: p < 0,05), i enlighet med tidigare studier. Effekten av konkurrens resulterade däremot i en minskning av genuttryck (ANOVA: p < 0,05). Den kombinerade effekten (konkurrens och kiselbegränsning) resulterade inte i en signifikant förändring av genuttrycket (ANOVA: p = 0,38). Det var en ökad variation bland de mixade kulturerna, vilket eventuellt förklaras av degraderat RNA då RNA-kvalitén över lag var väldigt låg för de flesta prover. Resultaten i denna studie visar att realtids-PCR är en effektiv metod för att undersöka genuttryck av kiseltransportörgener, under förutsättning av primers utvärderats korrekt.

Human T-lymfotropt virus (HTLV) är ett C-typ onkovirus som tillhör familjen Retroviridae som huvudsakligen angriper T-lymfocyter och orsakar leukemi och andra autoimmuna sjukdomar. I den nuvarande kliniska diagnostiken används Enzyme-linked immunosorbent assay och ibland vid screeningsmetoden uppträder ospecifika reaktioner. På senare tid har flera metoder baserade på real-tids PCR utvecklats för att bestämma halten av virala genom i patienter. Syftet med denna studie var att sätta upp och optimera en realtids-PCR för detektion av humant T-lymfotropt virus typ-1 och 2. Inför optimering av realtids-PCR extraherades DNA från MT-4 och MO-T cellinjer.  Under optimering av realtids-PCR användes SYBR Green och smältpunktsanalys där flera komponenter bl.a. templat-, primer-, magnesium- koncentrationer samt annealing/elongeringstemperaturen modifierades. Efter avslutad optimering utfördes probetitrering för att specifikt skilja ut HTLV-1 och HTLV-2. Amplifieringsprodukten verifierades med Sangersekvensering. För att hitta den lämpligaste metoden för extrahering av DNA från helblod testades olika extraheringsmetoder för DNA-preparering. Efter färdig optimering såg PCR-programmet ut enligt följande: 95ºC i 3 min följt av 45 cykler med 95ºC i 3s och 60ºC i 10s. De optimala koncentrationerna av de olika reagenserna var 0,5µM HTV-F5, 0,7µM HTV-R4, 0,2µM HTLV-P1 och 0,1µM HTLV-P2.  Den optimala extraktionsmetoden från helblod visades vara med MagNA Pure Compact med 500µL helblod. Den färdig optimerade PCR-metoden är en semi-kvanitativ metod som fungerar väl för detektion av HTLV 1 och 2, men vidareutveckling av metoden krävs innan den kan tas i bruk för klinisk diagnostik.

Beställningsfrekvensen för detektion av Trichomonas vaginalis samt Mycoplasma genitalium i Jönköpings län är låg jämfört med den för Chlamydia trachomatis och Neisseria gonorrhoeae.  Både T. vaginalis och M. genitalium har associerats med infektion av humant papillomvirus (HPV) samt kan bland annat orsaka salpingit med infertilitet som potentiell komplikation. Patogenerna har även beskrivits öka risken för transmission av HIV. Syftet med studien var att detektera T. vaginalis samt M. genitalium med realtids-Polymerase Chain Reaction (PCR) för uppskattning av prevalens hos individer provtagna för C. trachomatis, N. gonorrhoeae samt HPV i Jönköpings län. Hos individer över 25 år, provtagna för C. trachomatis och N. gonorrhoeae, uppskattades prevalensen till 5,5 % för M. genitalium samt 0,13 % för T. vaginalis. Hos samma individer var prevalensen av C. trachomatis och N. gonorrhoeae 4,5 % respektive 0,13 %. Prevalensen hos individer provtagna för HPV uppskattades till 2,3 % för M. genitalium samt 0,26 % för T. vaginalis. De slutsatser som dras är att relevans finns för en mer frekvent beställning av M. genitalium samt att analys för detektion av endast en patogen ej är optimal. Multiplex analys för detektion av sexuellt överförbara patogener föreslås.
The request for detection of Trichomonas vaginalis and Mycoplasma genitalium in Jönköping County is low compared to Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Both T. vaginalis and M. genitalium have been associated with Human Papilloma Virus (HPV) infection and can cause infections such as salpingitis, potentially resulting in infertility. The pathogens have also been described to increase the risk of HIV transmission. The aim of this study was to detect T. vaginalis and M. genitalium by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) to estimate the prevalence among individuals tested for C. trachomatis, N. gonorrhoeae and HPV in Jönköping County. In individuals above the age of 25 years, tested for C. trachomatis and N. gonorrhoeae, the prevalence was estimated to 5,5 % for M. genitalium and 0,13 % for T. vaginalis. In the same group the prevalence of C. trachomatis and N. gonorrhoeae was 4,5 % and 0,13 % respectively. The prevalence in individuals tested for HPV was estimated to 2,3 % for M. genitalium and 0,26 % for T. vaginalis. Relevance of a more frequent request for detection of M. genitalium was concluded and single pathogen detection was not deemed to be optimal. Multiplex analysis for detection of sexually transmitted pathogens is encouraged.

The antibiotic class β-lactams include drugs such as penicillins, cephalosporines, carbapenems and monobactams which mechanism of action is to inhibit cell-wall synthesis. Bacteria have developed several mechanisms to counter β-lactams. Bacteria can defend themselves from antibiotics by releasing enzymes that attack the antibiotic compound itself by hydrolysis, target alteration or redox reactions. Presence of antibiotics can also trigger a downregulation of genes coding for antibiotic binding proteins, as well as upregulation of proteins that serves as channel and pump proteins that ensure no accumulation of antibiotics occurs in the cytosol. The aim with the study was to investigate the presence of three plasmid-mediated genes (blaFOX, blaCIT(CMY-2) and blaMOX) coding for ampicillin resistance (pAmpC) in water isolates sampled from Helge River, Kristianstad. The detection of genes was done according to a previous optimized protocol for Real-Time PCR with SYBR™Green chemistry (duplex blaCIT(CMY-2)/blaMOX and singleplex blaFOX). The method proved not to be robust for multiplex PCR, only the singelplex for the gene blaFOX could produce valid results. 30 of 96 isolates were deemed as positive for the gene, whereas 27 of 79 were considered clinical relevant. Among the 27 isolates, 16 also harbored other genes for resistance (13 blaCTX-M, 2 blaOXA, 1 blaTEM and 1 blaSHV). One isolate carried on three resistancegenes (blaFOX, blaCTX-M och blaTEM). A majority of the positive isolates, 20 out of 27, were sampled near the pumpstation. The findings indicate that Helge river might be a reservoir for dissemination of antibiotic resistance genes.

Hos vuxna individer förekommer två fenotyper gällande produktionen av laktas, vilka kallas laktostolerans och laktosintolerans. Vid laktosintolerans produceras otillräckliga mängder laktas vilket framkallar symptom som magsmärtor och flatulens vid intagandet av mjölkprodukter. En enbaspolymorfism (LCT-13910C>T) har kopplats till laktostolerans hos nordvästeuropéer och kan genotypas med smältkurveanalys i realtids-PCR. På Laboratoriemedicin vid Länssjukhuset Ryhov används idag en metod vid genotypning av LCT-13910C>T där extraktion av DNA från blod krävs innan analys. Anledningen till detta är att DNA-polymeraset som ingår enzymmixen LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe endast fungerar med rent DNA-templat. Med en annan enzymmix, Kapa Probe Force, ska analys kunna göras direkt på blod. För att utvärdera enzymmixen jämfördes resultat från befintlig metod och resultat från metod med Kapa Probe Force, gällande förmågan att identifiera genotyperna LCT-13910C/C, C/T och T/T samt med avseende på imprecision. Vid jämförelse mellan metoderna samstämde resultatet i avseende på genotyp till 100 % utifrån specificerade smälttemperaturer (Tm) för respektive genotyp angivna i kitet för primer/prober. Däremot syntes lägre fluorescensnivå på smältopparna i metod med Kapa Probe Force, men påverkade inte tolkning av smältkurvorna. En lägre prov-till-prov-variation sågs även i resultatet från metod med Kapa Probe Force gentemot befintlig metod.
Among adults two phenotypes are found with regards to production of lactase, these are termed lactase persistence and lactose intolerance. Lactose intolerance is characterized by a low production of lactase, which leads to symptoms such as stomach ache and flatulence after the consumption of dairy products. A single nucleotide polymorphism (LCT-13910C>T) has been correlated with the occurrence of lactase persistence in northwestern Europeans. Genotyping of LCT-13910C>T is possible with melting curve analysis in real time PCR. The currently used method for genotyping of LCT-13910C>T at Ryhov County Hospital requires the extraction of DNA template from blood, due to the fact that the DNA-polymerase in the kit LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe requires pure DNA template for analysis. With another DNA-polymerase, included in the kit Kapa Probe Force, analysis on crude samples such as pure blood should be possible. Evaluation of Kapa Probe Force included comparison of the results from both methods with regards to identification of genotypes LCT-13910C/C, C/T and T/T and with regard to imprecision. The results from Kapa Probe Force were 100 % consistent with the results from existing method and acquired melting temperatures (Tm) were all within the accepted ranges specified in the kit of primers and probes. The fluorescence of melting curves acquired with Kapa Probe Force was significantly lower, however this had no effect when it came to interpreting the results. A lower variation could also be seen between samples with Kapa Probe Force compared to existing method.

Herpes simplexvirus 1 och 2 orsakar godartade sjukdomar, men kan även orsaka mortalitet. Diagnostik av herpes simplexvirus 1 och 2 utförs numera framför allt med realtids- Polymerase chain reaction (PCR). I metoden amplifieras specifika deoxiribonukleinsyra(DNA)-sekvenser till miljontals kopior vilka sedan detekteras med fluorescein. I realtids-PCR sätts positiva och negativa kontroller. De positiva kontrollerna kan vara InHouse eller kommersiella. Tolkningen av resultatet inkluderar inspektion av kontrollerna. DNA utsätts för nedbrytningsprocesser av olika slag, och kan förvaras på olika sätt för att upprätthålla stabilitet. Syftet med studien var att jämföra laboratoriets InHouse-kontroller med två kommersiella kontroller, för att utvärdera vilken av dessa som var mest stabila över tid. Utvärderingen utfördes genom att analysera tre kontroller med realtids-PCR, efter att de hade förvarats i -20° C, i 5° C och i 20° C, och var spädda i TE-buffert eller i PCR-vatten. De kommersiella och InHouse-kontrollerna visade sig vara jämbördiga. Vidare studier som görs under längre tid, i större omfattning och där koncentrationerna är samma för varje kontroll, föreslås.
Herpes simplex viruses 1 and 2 which usually cause benign diseases but can even cause mortality. The diagnostics of herpes simplex virus 1 and 2 are performed with real-time Polymerase chain reaction (PCR). In the real-time PCR method, specific deoxyribonucleic acid (DNA) sequences are amplified into millions of copies which are then detected with fluorescein. Positive and negative controls are used in real-time PCR. The positive controls can be InHouse or commercial. The interpretation of the results includes inspection of the controls. DNA is subject to degradation processes of different kinds and can be stored in different ways to maintain stability. The purpose of the study was to compare the laboratory's InHouse controls with two commercial controls, to evaluate which of these were more stable over time. The evaluation was performed by analyzing the three controls with real-time PCR after they were stored in temperatures at -20° C, at 5° C and at 20° C, and were diluted in TE-buffer or in water. The commercial and InHouse controls proved to be equitable. Further studies carried out for a longer period of time, to a greater extent and where concentrations are the same for each control are suggested.

Fästingburna infektioner är ett ökande problem, och därmed även infektioner orsakade av Rickettsia spp. Syftet med studien var att undersöka risken att drabbas av en infektion efter bett av rickettsiainfekterad fästing. Specificitet och sensitivitet av Fluidigm-PCR jämfördes mot real time polymerase chain reaction (realtids-PCR) vid detektion av Rickettsia spp. i fästingar som bitit människor. Vidare undersöktes om det finns någon korrelation mellan fästingens blodsugningstid och serokonversion mot Rickettsia spp. 753 fästingar lämnades in av 104 deltagare i Sverige och på Åland. Fästingarna analyserades med realtids-PCR för att detektera gltA-genen som är specifik för Rickettsia spp. 3,5 % av fästingarna var positiva för Rickettsia spp. med realtids-PCR. Vid analysering med Fluidigm-PCR av samma material blev 1,3 % av proverna positiva. Beräkningar som gjordes med realtids-PCR som referens visade att Fluidigm-PCR har sämre specificitet och sensitivitet jämfört med realtids-PCR. Deltagare som serokonverterade (n=5) lämnade endast in rickettsianegativa fästingar som därför inte kunde kopplas till infektionen. Därmed kunde inga slutsatser dras om risken att drabbas av en infektion efter bett av rickettsiainfekterad fästing eller om det föreligger någon korrelation mellan fästingens blodsugningstid och serokonversion.
Tick-borne infections are increasing, including infections caused by Rickettsia spp. The aim of this study was to examine the risk of developing an infection after being bitten by a tick infected with Rickettsia spp. Specificity and sensitivity of a Fluidigm-PCR assay were compared to real time polymerase chain reaction (real-time PCR) assay when detecting Rickettsia spp. in ticks that had bitten humans. Possible correlation between the tick's feeding time and seroconversion against Rickettsia spp. was also investigated. A total of 753 ticks from 104 participants in Sweden and the Åland Islands (Finland) were analyzed with real-time PCR to detect the gltA gene specific for Rickettsia spp. 3.5 % of the samples were positive for Rickettsia spp. with real-time PCR, while only 1.3 % of the samples were positive with Fluidigm-PCR. Calculations showed that Fluidigm-PCR assay has lower specificity and sensitivity than the real-time PCR assay. Unfortunately, no conclusions could be drawn considering correlation between the tick's feeding time and seroconversion of the bitten humans since no participants who had seroconverted had also submitted ticks containing Rickettsia spp. Therefore, no conclusions could be drawn considering the risk of developing an infection after being bitten by a tick infected with Rickettsia spp.
STING-studien

Tuberkulos orsakad av Mycobacterium tuberculosis, är en av de ledande dödsorsakerna globalt sett enligt världshälsoorganisationen (WHO). M. tuberculosis ingår i Mycobacterium tuberculosis komplex (MTBC) där bland annat Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) och Mycobacterium africanum också ingår. Förutom MTBC ingår även icke-tuberkulösa mykobakterier (NTM) i genuset Mycobacterium. Fall av M. tuberculosis-infektioner rapporteras vanligtvis i utvecklingsländer medan NTM-infektioner är vanligare i västvärlden. Idag använder man sig av sputumprover för att diagnostisera vid misstanke om tuberkulos men bakterierna detekteras också från vätskor, sekret, exkret och vävnader. Odling är den vanligaste diagnostikmetoden men även mikroskopi används och molekylärbiologiska tekniker som realtids-PCR (polymerase chain reaction) vilken kan amplifiera och detektera M. tuberculosis för en snabb och säker analys. Syftet med denna studie var att utveckla en realtids-PCR-metod för att detektera NTM och särskilja dem från MTBC i formalin-fixerade paraffininbäddade vävnadsprover (FFPE). Fyra tidigare publicerade primerpar, senX3, MTC, IS6110 och IS1081, specifika för MTBC utvärderades med realtids-PCR parallellt med det kommersiella kittet AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection med dual priming oligonukleotider (DPO). Resultaten visade att de fyra primerparen inte var specifika nog för att kunna särskilja MTBC- och NTM-stammar utan PCR-produkter av olika storlek erhölls även från NTM-stammar. Anyplex-kittet visade däremot hög specificitet och kunde gruppera samtliga testade stammar korrekt som MTBC eller NTM. Samma goda resultat erhölls vid analys av DNA-extrakt från 21 FFPE-prover. Sammanfattningsvis visar denna studie att AnyplexTM MTB/NTMe-kittet uppfyller kraven för att särskilja MTBC från NTM från FFPE-material vilket inte realtids-PCR med primers senX3, MTC, IS6110 och IS1081 gör.
Tuberculosis mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the leading causes of death globally according to the World Health Organization (WHO). M. tuberculosis is included in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) which contains also Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) and Mycobacterium africanum. In addition to MTBC, non-tuberculous mycobacteria (NTM) are also included in the genus Mycobacterium. Cases of M. tuberculosis infections are usually reported in developing countries while NTM infections are more common in the western world. Today, sputum samples are used to diagnose tuberculosis but the bacteria can also be detected from analysis of fluids, secretions, excreta and tissues. Cultivation is a common diagnostic method but also use of microscopy and molecular biology techniques such as real-time PCR (polymerase chain reaction) which can amplify and detect M. tuberculosis for a rapid and specific analysis. The purpose of this study was to develop a real-time PCR method for detecting MTBC and distinguishing them from NTM in formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples (FFPE). AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection kit was compared with previously published primers senX3, MTC, IS6110 and IS1081. 21 FFPE samples were processed by DNA extraction for further analysis with real-time PCR for amplification and detection and fragment analysis for size determination. The results show that the kit meets the requirements for distinguishing MTBC from NTM both with purified strains and samples from FFPE material while the different primer combinations senX3, MTC, IS6110 and IS1081 don't. To conclude, the AnyplexTM MTB/NTMe kit can be used for diagnostics of MTBC and NTM from FFPE samples.

Typning av hla-b*27:En jämförelsestudie mellan två analysmetoder för att påvisa HLA-B*27 molekylen i ankyloserande spondylitCarolina BermudezBermudez, C. Typning av HLA-B*27. En jämförelsestudie mellan två analysmetoder för att påvisa HLA-B*27 molekylen i Ankyloserande spondylit. Examensarbete i Biomedicinsk vetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2018.Human leukocyt antigen (HLA) är vävnadsantigener, belägna på våra vita blodkroppar. HLA-B*27 allelen är starkt kopplat till Ankyloserande spondylit (AS). Det är en kronisk inflammatorisk ledsjukdom, som främst attackerar ryggraden, bäckenet och bröstkorgen. Det finns idag ingen enskild laborativ metod som med full säkerhet kan fastställa diagnos av denna sjukdom, innan de kliniska symtomen uppträder. Typning av HLA-B*27 ger endast information om närvaro eller frånvaro av antigenet, vid utredning av AS. Vidare är HLA-B*27 en polymorf och de olika alleltyperna varierar kraftigt, bland skilda etniska grupper samt mellan geografiska områden. Genetiska- och miljöfaktorer påverkar också. Sjukdomsutveckling i samband med närvaro av HLA-B*27 allelen, varierar därför från individ till individ. Därmed fungerar metoden endast som ett komplement-verktyg, för att ytterligare bekräfta diagnos. Syftet med denna studie var att med realtids-polymerase chain reaction (PCR), utföra typning av HLA-B*27 med Linkseq kit samt jämföra analysresultaten med uthämtade resultat från intern sjukhusdatabas, där typning av HLA-B*27 hade utförts med PCR-SSP (sekvens-specifika primers). Samtliga resultat stämde överens till 100%, vilket indikerar att metoden fungerar bra. Det finns studier som visat att HLA-B*27 molekylens fria tunga kedjor (HLA-B*272) har en starkare benägenhet än andra HLA-molekyler att binda in till killer immunoglobine-like receptorer (KIRs). Inbindning till KIRs med efterföljande ökad stimulering av interleukiner (IL) främst IL-17 och IL-23 bidrar till sjukdomsutvecklingen av AS. Dock finns ingen HLA-B*272 specifik antikropp som kan bevisa detta och det behövs därför ytterligare undersökning för att hitta en sådan. Därefter skulle en ny laborativ metod kunna utvecklas för att fastställa diagnos av AS i ett tidigt skede, innan de kliniska symtomen uppvisas. Nyckelord: Allelvarianter, Ankyloserande spondylit, HLA-B*27, KIR, PCR-SSP, Realtids-PCR.
typing of hla-b*27:a comparison study between two analysing methods for the detection of the HLA-B*27 molecule in ankylosing spondylitisCarolina BermudezBermudez, C. Typing of HLA-B*27. A comparison study between two analysing methods for the detection of the HLA-B*27 molecule in Ankylosing spondylitis. Degree project in Biomedical Laboratory Science, 15 credit points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical science, 2018.Human leukocyte antigen (HLA) are tissue antigens located on our white blood cells. The HLA-B*27 allele is strongly related to Ankylosing spondylitis (AS). It is a chronical inflammatory rheumatic disease that primarily affects the spine, the pelvis and the chest. At present, there is no single laboratory method that with all certainty may determine diagnosis of this disease, before the clinical symptoms appear. Typing of HLA-B*27 only gives information about the presence or absence of the antigen, upon the investigation of AS. Furthermore, HLA-B*27 is a polymorph and the different types of alleles, strongly vary among different ethnic groups and also between geographic regions. Genetic- and environmental factors also affect. Development of disease in conjunction with the presence of the HLA-B*27 allele, therefore varies from one individual to another. So, the method only functions as a complementary tool, to further confirm diagnosis. The aim of this study was to perform HLA-B*27 typing with realtime-polymerase chain reaction (PCR) using Linkseq kit and compare the analysed results with those results that were retrieved from the internal database of the hospital, where typing of HLA-B*27 had been performed with PCR-SSP (sequence specific primers). All results agreed with 100%, which indicates that the method functions well. There are studies that show that the heavy chains (HLA-B*272) of the HLA-B*27 molecule have a stronger affinity than other HLA-molecules of binding in to killer immunoglobulin-like receptors (KIRs). Increased stimulation of interleukins (IL) primarily IL17 and IL23, following binding to KIRs, contributes to the pathogenesis of ankylosing spondylitis. However, there is no HLA-B*272 specific antibody that may prove this and therefore more investigation is needed, in order to find one. A new laboratory method could then be developed to determine diagnosis of AS at an early stage, before the clinical symptoms emerge. Keyword: Allelvariants, Ankylosing spondylitis, HLA-B*27, KIR, PCR-SSP, Realtime-PCR.

Toxoplasma gondii är en encellig parasit som kan skapa svåra skador hos immunsupprimerade individer samt hos foster då mamman infekteras under graviditet. Genom framtagande av en realtids-PCR-metod för detektion av T. gondii ska denna diagnostik flyttas från Klinisk Patologi (KP) samt Karolinska Universitetslaboratoriet till Klinisk Mikrobiologi i Lund. Två regioner: REP-529 samt genen B1, som båda förekommer i ett flertal kopior i T. gondii-genomet, utgjorde mål för primerutprovning. Analyser utfördes både med realtids-PCR och konventionell PCR. De primerpar som gav lägst Ct-värde samt högst amplitud valdes ut för REP-529 respektive B1 för vidare analyser. Hybridiseringsprober användes för att öka specificiteten och metoden utvärderades på upprenat T. gondii DNA från olika stammar samt Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) -prover erhållna från KP. I alla provmaterial amplifierades REP-529 mer effektivt (lägre Ct-värde) än B1 vilket var förväntat då fler kopior finns av REP-529 än av B1. Nedre kvantifikationsgränsen för REP-529 och B1 visade sig dock vara samma på ca 1,8 genomkopior/µl.
Toxoplasma gondii is a unicellular organism that can cause severe damage in immunocompromised patients or in fetuses when the mother is infected during pregnancy. Through development of a real time-PCR based method for detection of T. gondii-DNA, the diagnostics is planned to be relocated from the department of Clinical Pathology in Lund and the Karolinska University Laboratory in Huddinge to the department of Clinical Microbiology in Lund. The method was built on amplification of REP-529 and the B1-gene of the T. gondii genome, both present in multiple copies. Primers were tested on purified T. gondii DNA with conventional PCR as well as real time PCR with EvaGreen dye. Primers with high amplitude and low Ct-value were selected for both REP-529 and B1. Hybridizing probes were applied to increase specificity and the method was evaluated on T. gondii-DNA extracted from Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded (FFPE) tissue as well as purified DNA from ten different strains of T. gondii. The amplification of REP-529 yielded a higher amplitude and lower Ct-value compared to that of B1 but the lower limit of quantification seemed to correlate between the two, with 1,8 genome-copies/µl.

Methicillin-resistenta Staphylococcus aureus (MRSA) har blivit en allt vanligare patogen inom sjukvården och i samhället. MRSA orsakar infektioner som inte kan behandlas med β-laktamantibiotika. För att förhindra spridning genomgår patienter och sjukvårdspersonal screening-tester. I dessa screening-tester ingår PCR-analys av mecA, nuc och/eller Sa442. MecA är lokaliserad på Staphylococcal Cromosomal Cassette mec (SCCmec) och används som en markör för MRSA medan nuc och Sa442 anger S. aureus. PCR-positiva isolat odlas ut på agarplattor efter anrikning i en selektiv buljong. Kolonier av S. aureus resistensbestäms mot cefoxitin som MRSA är resistent mot. Idag används dock PCR-analys av mecA som en referensmetod för diagnostisering av MRSA. Under det senaste årtiondet har även rapporterats fynd av stammar som enligt resistensmönster är MRSA men som har utfallit negativt för mecA i PCR. Under 2011 rapporterades en ny variant av SCCmec och en ny variant av mecA, mecALGA251. I denna studie har en realtids-PCR tagits fram för att identifiera den nya varianten, mecALGA251. Denna PCR användes för att undersöka 43 kliniska isolat, fyra cefoxitin-känsliga S. aureus från rutinen och tre referensstammar. De kliniska isolaten hade samlats in under perioden 2004 – 2011 och hade uppvisat cefoxitin-resistens men gett negativt resultat i mecA-PCR. Totalt 40 av de 43 cefoxitin-resistenta kliniska isolaten visades bära mecALGA251. Resistensbestämningar med diskdiffusion och E-test mot cefoxitin, oxacillin, cefuroxim och cefotaxim visade att denna typ av MRSA inte kan skiljas från klassisk MRSA. Resultaten visar att cefoxitin-resistenta S. aureus isolat som bär mecALGA251 finns bland skånska patienter. De visar också att det finns cefoxitin-resistent S. aureus som saknar både klassiska mecA och mecALGA251. Dessa stammar har inte studerats vidare i denna studie.
Methicillin-resistant Staphylococcus aure s (MRSA) has become a more frequent pathogen within health care facilities and the community. MRSA causes infections that can’t be treated with β-lactamantibiotics. To prevent the spread of MRSA, patients and medical personnel undergo screening-tests. In the screening-tests PCR-analysis of mecA, nuc and/or Sa442 is included. MecA is located at Staphylococcal Chromosomal Cassette mec (SCCmec) and is a marker for MRSA, whereas nuc and Sa442 state regular S. Aureus infections. PCR-positive isolates are grown on agar plates after enrichment in selective broth. Colonies of S. aureus are tested for cefoxitin susceptibility to which MRSA is resistant. PCR-analysis of mecA is the reference method that is being used today when MRSA is being diagnosed. During the last decade cefoxitin-resistant strains that lack mecA in the PCR has been reported. In 2011 a new variant of SCCmec and a new variant of mecA, mecALGA251 was reported. In this study a new real-time-PCR has been developed in order to identify mecALGA251. The new PCR protocol was being used to examine 43 clinical isolates, four cefoxitin-susceptible S. aureus from the routine and three reference strains were examined. The clinical isolates had been collected during the period 2004-2011 and were cefoxitin-resistant but lacked mecA. In total of 40 of the 43 cefoxitin-resistant was PCR positive for mecALGA251. Susceptibility testing with disk diffusion and E-test for cefoxitin, oxacillin, cefuroxime and cefotaxime showed that this type of MRSA can’t be distinguished from regular MRSA. The results showed that cefoxitin-resistantS. aureus isolates carrying mecALGA251 exist among patients in Skåne County. One cefoxitin-resistant S. aureus isolate lacked both classic mecA and mecALGA251, which indicates that other mechanisms may exist, however these results has not been further analysed in this study.

Underdiagnosis of intestinal parasites in patients with diarrhea A compilation from the Swedish public health authority indicates that infections caused by Cryptosporidium spp. increased in Sweden from 47 cases in 2004 to 594 cases in 2016 and Giardia intestinalis causes around 1300 infections per year. The primary aim of this study was to investigate the prevalence of parasites in patients with diarrhea. Furthermore, the study investigated whether samples taken with E-swab could be analyzed with real-time polymerase chain reaction (PCR) for detection of Cryptosporidium spp., Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica/dispar and G. intestinalis rather than Sodium acetate-acetic acid-formaline fixative (SAF-fixative). Prevalence of parasites in fecal samples was collected from 200 samples from patients with bacterial issue ordered. For evaluation of E-swab, 22 frozen, unfixed samples that were positive for intestinal parasites was used. Twelve positive E-swab samples was used as comparative positive controls. This was analyzed using real-time PCR. Bacteria was counted for 9.5% of the infections whilst parasites counted for 14% of the infections. The conclusion was that E-swab could replace SAF-fixative in the diagnosis of intestinal parasites and that there is that an underdiagnosis of intestinal parasites. Keywords: Cryptosporidium spp, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Giardia intestinalis, real-time PCR, E-swab, prevalence.