Dissertations / Theses on the topic 'Récepteur couplé au protéine G'

Les récepteurs couplés de protéines G (RCPG) sont des capteurs biologiques polyvalents responsables de la majorité des réponses cellulaires aux hormones et neurotransmetteurs ainsi que des sens de la vue, de l'odorat et du goût. La transduction des signaux est associée à un ensemble de changements dans la structure tertiaire des récepteurs entraînant l'activation de partenaires intracellulaires dont les protéines G. La dimérisation est un élément central du mode de fonctionnement des RCPG ; cependant, son influence sur la façon dont le signal est transmis est encore mal définie.Nous avons utilisé ici le récepteur BLT1 du leucotriène B4 comme modèle afin d'analyser les changements de conformation au cours de l'activation. Pour cela, nous avons produit le récepteur suivant une approche qui consiste à l'exprimer dans les corps d'inclusion bactériens puis à le renaturer à l'aide de détergents et/ou surfactants originaux. L'accès au récepteur purifié nous a permis de montrer que la protéine G induit une asymétrie dans les changements de conformation au sein de l'homodimère de BLT1. De plus, nous avons pu établir que l'activation de la protéine G se fait essentiellement par le protomère ayant fixé l'agoniste (cis-activation). Enfin, nous avons montré que la forme monomérique du récepteur est parfaitement capable d'induire l'activation de la protéine G, même si le dimère apporte une modulation de la réponse. Ceci indique qu'un monomère de récepteur possède tous les déterminants moléculaires nécessaires à la transmission du signal. L'ensemble de ces résultats apporte un éclairage nouveau sur la façon dont les dimères de RCPG fonctionnent et peuvent moduler la réponse biologique
G-protein coupled receptors are versatile biological sensors that are responsible for the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters as well as for the sense of sight, smell and taste. Signal transduction is associated with a set of changes in the tertiary structure of the receptor that are recognized by the associated intracellular partners, in particular the G proteins. There is compelling evidence that GPCR can assemble as dimers but the way these assemblies function at the molecular level is still under investigation.We used here the leukotriene B4 receptor BLT1 as a model to analyze the conformational changes occurring during activation. To this end, we first produced the receptor in E. coli inclusion bodies and subsequently folded it back to its native state in vitro using original membrane mimetics. Using the purified dimeric receptor, we showed that (i) the G protein induces an asymmetric arrangement of the BLT1 homodimer where each of the protomers is in a distinct conformation, and (ii) the G protein is cis-activated, i.e. the protomer that binds the agonist also activates Gα. Finally, we brought evidence that, although the dimer fully activates its G protein partner, the monomer has per se all the molecular determinant for an efficient functioning. All these data are original evidence that sheds light into the way GPCR dimers are activated and in turn modulate G protein-mediated signaling

L'objectif général de ces travaux a été de contribuer à élucider les mécanismes moléculaire qui régissent les interactions protéine-ligand dans la membrane. La première protéine concernée est le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) le ligand d'intérêt, le cholestérol. PBR est impliquée dans la biosynthèse des stéroïdes, participant à la translocation du cholestérol de la membrane externe de la mitochondrie à membrane interne. Ne disposant d'aucune information structurale sur PBR, nous nous sommes d'abord intéressés à la structure de PBR en déterminant par RMN la conformation des fragments synthétiques recouvrant les domaines transmembranaires prédits puis en étudiant la protéine recombinante entière par RMN et dichroïsme circulaire. Différentes études couplant mutations modélisations ont ensuite été effectuées, qui ont permis de caractériser l'interaction PB cholestérol et le rôle de résidus clés dans cette interaction. La deuxième partie de la thèse concerne l'interaction du domaine extracellulaire de VPAC un récepteur couplé aux protéines G, avec le neuropeptide vasointestinal (VIP), qui joue un rôle important en physiopathologie humaine. Cette étude est basée sur la construction d'un mode structural par homologie du domaine de VPAC1. En utilisant la conformation du VIP obtenue par RMN et des données expérimentales de photoaffinité, nous avons pu proposer un mode d'interaction VIP-VPAC1 par docking, et caractériser cette interaction par simulation de dynamique moléculaire. Ce travail s'intègre dans la caractérisation des bases moléculaires de reconnaissance du VIP par son récepteur et plus généralement dans la compréhension d processus d'interaction ligand-récepteur dans la famille des RCPG de classe B
The main goal of this work has been to contribute to elucidate the molecular mechanism underlying protein-ligand interaction within the membrane. The first protein studied is the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) and its ligand interest, cholesterol. PBR is involved in steroid biosynthesis, through the cholesterol translocation from the outer to the inner membrane of mitochondria. In the absence of any available structural information on PBR, our first work has been to focus on the PBR structure, by determining from NMR data the conformation of synthetic fragments encompassing the predicted transmembrane domains and then by studying the entire recombinant protein by NMR and circular dichroism. In second step, several studies combining mutagenesis and molecular modeling have be performed which allow to characterize PBR-cholesterol interaction, and the role of key residues this interaction. The second part of our work is devoted to study the interaction of the extracellular domain VPAC1, a G-protein coupled receptor, with the vasointestinal neuropeptide (VIP), which plays important role in human physiopathology. From the VIP conformation obtained by NMR a photoaffinity data, we were able to propose a molecular model of the VIP-VPAC1 interaction using docking protocols and to characterize this interaction using molecular dynamics simulation. Our result contributes to elucidate the molecular basis of VIP recognition and more generally understand the ligand-receptor interaction process of the class B family of GPCRs

Le 26RFa est un neuropeptide de la famille des RFamides et le ligand du GPR103, un récepteur couplé à une protéine G. Ce système est impliqué dans de nombreux processus biologiques, tels que le contrôle de la prise alimentaire, la reproduction ou la formation des os. Bien que de nombreuses études d'activités aient été menées, seule l'analyse structurale du ligand dans le méthanol a été effectuée. L'objectif de ce travail de thèse a été de déterminer (i) les éléments structuraux du 26RFa nécessaires pour la liaison et l'activation du GPR103; (ii) de concevoir différents analogues du 26RFa et ainsi d'obtenir de nouvelles informations sur le pharmacophore de ce ligand. L'analyse structurale du 26RFa, de fragments et d'analogues a apporté de nouvelles informations concernant les éléments structuraux responsables de la liaison et de l'activation du GPR103, permettant de proposer un nouveau modèle de pharmacophore du ligand.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de protéines membranaires, et ils sont la cible de plus de 25% des médicaments. Ces récepteurs activent diverses voies de signalisation cellulaire via plusieurs familles de protéines G hétéro-trimériques (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Etant donné qu’un RCPG peut activer différentes protéines G, il est important de comprendre comment des ligands favorisent l’activation de certaines protéines G au détriment des autres (ligands biaisés). L’objectif de mon travail a été de développer de nouveaux tests pour l’étude des protéines G qui soient spécifiques d’une famille voire même de certains sous-types de protéines
G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the main family of membrane proteins, and they are the target of more than 25% of drugs in the market. These receptors activate various signaling pathways through different families of heterotrimeric G proteins (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Since a given GPCR can activate several G proteins, it is important to understand how ligands favor the activation of some of these G proteins (biased ligands). The objective of my thesis was to develop assays to study most G protein subtypes

Le but de cette thèse a été d’étudier, dans le neurone, l’internalisation et le trafic intracellulaire d’un GPCR modèle, le récepteur sst2a, suite à son activation. L’étude a été effectuée in vivo dans l’hippocampe de rat par immunofluorescence, autoradiographie et PCR quantitative et in vitro par microscopie confocale temps séquentiel sur neurone vivant. Ces expériences montrent que l’activation du récepteur sst2 induit, dans un premier temps, le recrutement à la membrane plasmique des -arrestines 1 et 2. La -arrestine 1 est également adressée dans le noyau, suggérant que cette protéine pourrait servir, dans le neurone, de messager nucléaire pour le récepteur sst2. Le récepteur sst2 s’internalise ensuite dans des puits de clathrine préexistants, puis, après passage par les endosomes précoces, est adressé dans le réseau trans golgien (TGN) avant de retourner à la membrane. L’ensemble de ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de recherche dans l’étude du trafic cellulaire des GPCR et montrent en particulier qu’un récepteur couplé aux protéines G peut recycler par le TGN à la suite de son internalisation.

Le récepteur de la cholécystokinine de type 1 (R-CCK1) est un récepteur à sept domaines trans-membranaires couplé aux protéines G dont la structure primaire varie légèrement entre les espèces. Nous avons pu montrer que les R-CCK1 murin et humain, contrairement au R-CCK1 de rat, induisent une inhibition de l'activation transcriptionnelle de c-Jun, en présence d'une sur-expression de MEKK1. A l'aide d'expériences complémentaires, il a pu être déterminé que cet effet serait indépendant de l'état de phosphorylation de la SAPK/JNK et de c-Jun, et de l'activité kinase de la SAPK/JNK, principale kinase connue jusqu'à présent comme activant c-Jun. Par ailleurs, les expériences menées sur des mutants du R-CCK1 murin tendent à prouver que la troisième boucle intracellulaire ne serait pas impliquée dans cette différence de signalisation intracellulaire, et que, par contre, le premier domaine trans-membranaires et l'extrémité C-terminale des R-CCK1 pourraient jouer un rôle dans ce phénomène.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la famille de récepteurs membranaires la plus étendue. Présentement, 30% des médicaments disponibles sur le marché agissent sur plus ou moins 4% des RCPG connus. Cela indique qu’il existe encore une multitude de RCPG à explorer, qui pourraient démontrer un potentiel thérapeutique intéressant pour des pathologies encore sans traitement disponible. La douleur chronique, qui affecte 1 canadien sur 5, fait partie de ces affections pour lesquelles les thérapies sont faiblement efficaces. Dans le but éventuel de pallier à ce problème, le projet de ce mémoire consistait à mieux comprendre les mécanismes régissant l’adressage membranaire du récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2), un RCPG dont l’activation induit des effets analgésiques puissants de type non opioïdergique. Des données du laboratoire ayant révélé une interaction entre la 3e boucle intracellulaire de NTS2 et la sécrétogranine III (SgIII), une protéine résidente de la voie de sécrétion régulée, notre objectif était de caractériser le rôle de SgIII dans la fonctionnalité du récepteur NTS2. Pour ce faire, l’interaction entre les deux protéines a d’abord été vérifiée par co-immunoprécipitation, GST pull down, essais de colocalisation subcellulaire et par FRET. Nous avons également utilisé un outil d’interférence à l’ARN (DsiRNA) pour invalider la protéine SgIII dans un modèle cellulaire neuronal et chez l’animal. Des essais de radioliaison sur le modèle cellulaire ont révélé une diminution de l’adressage de NTS2 à la membrane plasmique lorsque SgIII était supprimée. De la même façon, une invalidation de SgIII chez le rat inhibe les effets analgésiques d’un agoniste NTS2-sélectif (JMV-431), qui sont normalement observés dans le test de retrait de la queue (douleur aiguë). Nous avons cependant identifié que des stimulations au KCl, à la capsaïcine et à la neurotensine induisaient plutôt une insertion du récepteur à la membrane dans les cellules neuronales. Puisque l’interaction entre SgIII et la 3e boucle intracellulaire du récepteur NTS2 est peu probable selon un système de sécrétion classique, un modèle hypothétique de transition dans les corps multi-vésiculaires a été vérifié. Ainsi, la présence de NTS2 et de SgIII a été révélée dans des préparations exosomales de DRG F11, en plus d’une transférabilité du récepteur par le milieu extracellulaire. En somme, ces résultats démontrent la dépendance du récepteur NTS2 envers SgIII et la voie de sécrétion régulée, en plus d’identifier certains facteurs pouvant augmenter son expression à la surface cellulaire. Le projet contribue ainsi à ouvrir la voie vers des approches pour potentialiser les propriétés de NTS2 in vivo¸ en plus d’une piste d’explication concernant le trafic intracellulaire du récepteur.

L'apeline, ligand endogène du Récepteur Couplé aux Protéines G, APJ, joue un rôle majeur au niveau cardiovasculaire, notamment dans l'angiogenèse physiologique et la néovascularisation tumorale. Par une étude profiling array, notre équipe à mis en évidence que le gène de l'apeline est surexprimé dans un tiers des adénocarcinomes humains, et de manière intéressante, avec une fréquence très élevée (2/3) dans les cancers du pancréas. Ainsi, mon projet de thèse avait pour but de caractériser l'implication du système apelinergique dans le cancer du pancréas. L'adénocarcinome pancréatique canalaire (ADK) est la forme la plus commune des cancers du pancréas et la découverte de biomarqueurs et nouvelles cibles potentielles est particulièrement importante pour ce cancer dont le diagnostic est tardif et les traitements peu efficaces. Par une approche immunohistochimique sur des coupes d'ADK humains (49 patients), nous avons mis en évidence que l'apeline et APJ sont fortement exprimés par les cellules tumorales pancréatiques. Dans le but de caractériser l'expression spatio-temporelle de l'apeline et de son récepteur au cours de la carcinogenèse pancréatique, nous avons étudié par immunohistochimie leur expression dans des modèles murins d'ADK. Ainsi, dans les souris K-ras (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) récapitulant les stades précoces de la pathologie, et le modèle murin KPC (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) qui développe un ADK jusqu'au stade invasif, nos résultats mettent en évidence que l'apeline et son récepteur APJ sont exprimés par les cellules tumorales et ce, dès les premiers stades de la carcinogenèse. Afin d'étudier la fonction de la voie de signalisation apeline, nous avons caractérisé les cascades de transduction activées par l'apeline dans la lignée tumorale pancréatique humaine MiaPaCa qui exprime de façon endogène APJ et l'apeline comme retrouvé in vivo.Dans ces cellules, l'apeline induit la stimulation transitoire des ERKs et de la p70S6 Kinase, l'activation prolongée d'Akt et la phosphorylation inhibitrice de GSK3 stabilisant ainsi la Beta-caténine. De manière intéressante, mes travaux mettent en évidence que l'activation de la voie MAPK induite par l'apeline est dépendante de la protéine Gi. A l'inverse, la stimulation soutenue de la voie PI3K/Akt est indépendante de la voie G mais implique l'internalisation du récepteur. De plus, l'apeline régule positivement la quantité protéique de c-myc et cycline D1 tous deux impliqués dans la prolifération cellulaire, ainsi que de l'Hexokinase 2 permettant de maintenir un fort flux glycolytique, essentiel aux besoins énergétiques de la cellule tumorale. Ces résultats sont en accord avec les effets cellulaires que nous observons puisque l'apeline stimule la prolifération, la capture du glucose ainsi que la migration des cellules tumorales, des propriétés essentielles participant à la progression tumorale.Dans ce contexte, la surexpression de l'apeline et de son récepteur dans l'ADK et l'effet de cette de voie de signalisation sur la cellule tumorale fait de ce couple ligand/récepteur une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement du cancer du pancréas
Apelin, the endogenous ligand of the human G-protein coupled receptor, APJ, is a key regulator of cardiovascular system, notably during physiological and tumor angiogenesis. Using a cancer profiling array approach, our team clearly showed that apelin gene is overexpressed in one third of the human carcinomas, with the highest frequency (2/3) in pancreatic cancers. Thus, the aim of my PhD project was to characterize apelin signaling function during pancreatic carcinogenesis. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common form of pancreatic cancer and the discovery of biomarkers and new therapeutic targets is of crucial interest for this cancer since this cancer is diagnosed too late and there is no effective therapy. By an immunohistochemistry approach on human PDAC slides (49 patients), we show that apelin and APJ are strongly expressed by pancreatic tumor cells. In order to characterize apelin and APJ spatio-temporal expression during pancreatic carcinogenesis, we have studied their expression by immunohistochemistry in genetically engineered mouse models of PDAC. In the K-ras mouse model (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) which recapitulates early stages of the disease, and in the KPC mouse model (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) which develops PDAC until invasive stages, our results demonstrate that apelin and its receptor are expressed by tumor cells since the first steps of carcinogenesis. In order to study apelin signaling function, we have characterized signal transduction pathways activated by apelin in MiaPaCa human pancreatic cancer cell line endogenously expressing apelin and APJ as observed in vivo. In these cells, apelin induces transient activation of ERKs and p70S6 Kinase, a sustained Akt activation and an inhibitory phosphorylation of GSK3 thus allowing Beta-catenin stabilization. Interestingly, my results demonstrate that the MAPK pathway activation apelin induced is Gi protein dependent. Conversely, long term stimulation of PI3K/Akt pathway is G protein independent but instead involves receptor internalization. Moreover, apelin positively regulates on one hand c-myc and cyclin D1 protein levels, both of them being implicated in cell proliferation and on the other hand, intracellular protein content of Hexokinase 2 in order to ensure high glycolytic flux which is essential for tumor cells energy supply. These results are in agreement with cellular effects that we observed since apelin stimulates proliferation, glucose uptake and migration of tumor cells which are essentials properties for tumor progression. Accordingly, apelin and APJ overexpression in PDAC and the effects of this signaling pathway on tumor cells make of this ligand/receptor couple a new potential therapeutic target for pancreatic cancer treatment

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la classe de récepteurs la plus nombreuse et la plus étudiée. La compréhension du mode de fonctionnement de cette famille de récepteurs fait l'objet d'études intenses, tant au niveau de leur interaction avec le ligand qu'au niveau du processus d'activation suite à cette liaison. Le récepteur de l'U-II (UT) est un membre de la classe A des GPCRs et possède toutes les caractéristiques de cette famille. Notre hypothèse est que le récepteur UT possède des déterminants moléculaires identifiables qui sont impliqués lors de sa liaison à l'U-II et de son activation. Dans un premier temps, des études de marquage par photoaffinité du récepteur UT ont été effectuées en utilisant deux séries de ligands U-II qui contiennent le résidu photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) et qui possèdent un caractère agoniste ou agoniste partiel. Il a été montré pour les deux séries de ligands que les quatre premiers résidus de l'U-II sont à proximité du résidu Met288 dans la 3e boucle extracellulaire du récepteur UT. Cette approche a également été utilisée pour comparer le patron de photomarquage entre deux ligands contenant le Bpa à la position 6, soit de l'analogue agoniste complet avec celui de l'analogue agoniste partiel. Il a été montré que le peptide agoniste photomarque les résidus Met184/Met185 du TMD4 de l'UT, tandis que l'agoniste partiel photomarque plutôt une région délimitée au TMD5. Le deuxième objectif du projet a été l'identification, au moyen de l'approche SCAM (Substituted Cysteine Assessibility Method) de résidus qui bordent la pochette de liaison du récepteur. Chacun des résidus des domaines transmembranaires 6 et 7 ont été mutés, un à un, par une cystéine. Suite au traitement par des composés MTS, la liaison du ligand [indice supérieur 125]I-U-II aux mutants F268C[indice supérieur (6.44)], W278C[indice supérieur (6.54)] et A282C[indice supérieur (6.58)] du TMD6 ainsi qu'aux mutants L298C[indice supérieur (7.34)], Y300C[indice supérieur (7.36)], T302C[indice supérieur (7.38)] et T303C[indice supérieur (7.39)] du TMD7 a été inhibée, démontrant que ces positions du récepteur font face à la pochette de liaison. L'ensemble de ces études mène à une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison et de l'activation du récepteur UT et nous a permis de proposer un modèle moléculaire du récepteur UT ligandé. Ce modèle pourra ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du processus de liaison et d'activation des GPCRs peptidergiques de la classe A.

GPR88 est un récepteur couplé aux protéines G orphelin exprimé principalement au niveau du striatum spécifiquement dans les neurones moyens épineux de la voie striato-nigrale et de la voie striato-pallidale.Premièrement nous avons étudié les souris Gpr88 KO et montré des altérations biochimiques, structurales et comportementales. Aussi les résultats montrent que l’hyperactivité des souris Gpr88 KO est diminuée par l’administration de méthylphénidate. Deuxièmement nous avons montré que la diminution des comportements liés à l’anxiété dépend de GPR88 dans la voie striato-pallidale et que la coordination motrice est régulée par GPR88 dans le striatum adulte (injection AAV-Cre) et dans la voie striato-pallidale. Dernièrement, nous avons confirmé un déficit d’inhibition du prépulse chez les souris Gpr88 KO, mais aussi montré que celui-ci s’étend à la modalité visuelle et n’est pas lié à un déficit général d’inhibition ou à la délétion de Gpr88 dans les neurones striato-pallidaux
Among brain orphan G protein-coupled receptors, GPR88 shows high expression mainly in the striatum specifically in medium spiny neurons of both the striatonigral and striatopallidal pathwaysFirst, we examine full Gpr88 KO mice and show biochemical, structural and behavioral alterations. Results also show that the hyperactivity phenotype of Gpr88 KO mice is reversed by methylphenidate.Second, we show that Gpr88 in striatopallidal neurons (cKO approach) exerts anxiogénic activity and that motor coordination is regulated by GPR88 in the adult brain (AAV-Cre approach) and in the striatopallidal pathway.Finally, we confirmed previous data showing impaired acoustic prepulse inhibition in Gpr88 KO mice and further show that this deficit is not the result of a general inhibition deficit or of the lack of GPR88 in striatopallidal neurons

Résumé : L’expression de surface des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) est un processus hautement régulé et très important dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. En effet, un déséquilibre dans leur niveau d’expression est souvent relié à différentes pathologies comme le cancer, le diabète, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives. C’est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires influençant ce phénomène est si importante et nous permettra d’élaborer et/ou d’améliorer les médicaments ciblant la régulation de ce processus. Il est bien connu qu’un des acteurs importants dans le trafic vésiculaire des GPCRs est représenté par la famille des Rab GTPases. Effectivement plusieurs de ces dernières, soit les Rabs 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 et 11 pour ne nommer que les plus connues, modulent l’expression de surface des GPCRs. De plus, certaines études soulèvent la possibilité qu’un GPCR soit lui-même capable de réguler son propre trafic intracellulaire, et ce grâce à son interaction avec les Rab GTPases. Toutefois, le mécanisme emprunté par le GPCR pour atteindre cette fin reste à élucider. Dans le présent travail, je démontre que le GPCR, β2AR, module non seulement la maturation de la petite protéine G Rab11a grâce à son interaction avec la Rab GéranylGéranylTransférase (RGGT), mais influence également son activation en modulant son ubiquitination via son association avec la E3-ubiquitine ligase, HACE1. De plus, je révèle que la sous-unité alpha de la RGGT (RGGTA) accroît significativement la maturation et le transport antérograde du récepteur β2AR, ce qui souligne ainsi un nouveau rôle cellulaire pour cette protéine. L’ensemble des résultats générés appuie l’hypothèse qu’un GPCR puisse contrôler son propre routage intracellulaire, et éclaircit les mécanismes utilisés pour réguler l’activé de la Rab GTPase avec laquelle il interagit. // Abstract : Cell surface expression of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) is a highly regulated and very important phenomenon for keeping cellular homeostasis. In fact, dysregulation of their cell expression is related to many diseases like cancer, neurological disorders, obesity, diabetes and cardiovascular diseases. These facts illustrate how important understanding the molecular mechanisms involved in cell surface transport of those receptors is, which will help us in designing or improving drugs which actually target this pathway. Rab GTPases are proteins known for being essential regulators of GPCR vesicular trafficking. Indeed, an increasing number of studies report the implication of Rab1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 and 11 (to cite the most frequently studied) cell surface transport of GPCRs. Moreover, some studies also put forward the possibility that a GPCR might be able to regulate its own cellular trafficking by interacting and controlling activation of Rab GTPases. However, the mechanism involved in this process remains to be clarified. In the present study, I demonstrate that the prototypic GPCR, β2AR, not only modulates prenylation/maturation of the small G protein Rab11a by interacting with Rab GeranylGeranylTransferase (RGGT), but also influences Rab11a activation by modulating its ubiquitination via its association with the E3-ubiquitin ligase, HACE1. Furthermore, I reveal that the α subunit of the RGGT (RGGTA) also promotes the maturation and anterograde transport of the receptor, which highlight a new cellular role for this protein. Altogether, those results support the hypothesis that GPCRs control their own trafficking, and shed light on some of the mechanisms that might be employed by those receptors in activation of Rab GTPases.

L'activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) induit la phosphorylation de résidus Serine (S) et Thréonine (T) de leurs domaines intracellulaires. Ces phosphorylations sont impliquées dans la désensibilisation du récepteur, son internalisation mais aussi dans le choix de la voie de signalisation activée. Le neuropeptide FF appartient à une famille de neuropeptides impliqués dans la modulation de l'activité analgésique des opioïdes en activant le récepteur NPFF2, un récepteur couplé aux protéines Gi. Afin d'étudier le rôle des phosphorylations induites par l'agoniste dans la régulation de l'activité du récepteur, nous avons déterminé par spectrométrie de masse le profil de phosphorylation des récepteurs humain et de rat exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Les phosphorylations ont été identifiées dans l'extrémité C-terminale (T372/S373, S382, S386, S395, T412 et S414/T415) puis remplacés par des alanines et les récepteurs de rat mutés transfectés dans des cellules SH-SY5Y. La caractérisation fonctionnelle après mutagenèse des sites de phosphorylation nous a permis de montrer le rôle majeur des résidus TS372, 412TNST415 dans la désensibilisation du récepteur, et des résidus S395, 412TNST415 dans son internalisation. Pourtant, ces récepteurs restent capables de recruter la Béta-arrestine-GFP. Nous avons de plus montré le rôle de Gi et de la GRK2 dans la phosphorylation du récepteur. Ces résultats apportent une nouvelle preuve du rôle spécifique de la phosphorylation de résidus particuliers dans la régulation de l'activité des RCPG et permettent d'envisager la production d'anticorps phosphospécifiques destinés à l'étude in vivo de l'activation du récepteur NPFF2
GPCR activation induces the phosphorylation of Serine and Threonine residues in their intracellular domains. These phosphorylations are involved in receptor desensitization and internalization but can also determine the involved signaling pathway. Neuropeptide FF belongs to a neuropeptide family which modulates opioid analgesia by interacting with a Gi protein coupled receptor: the NPFF2 Receptor. In order to investigate the role of phosphorylation in the regulation of NPFF2R function, a mass spectrometry analysis was performed to characterize the agonist-induced phosphorylation pattern of the human and rat receptor expressed in SH-SY5Y cells. All phosphorylation sites were found in the carboxyl-terminus tail on T372/S373, S382, S386, S395, T412 and S414/T415. All the identified residues were mutated to Alanine and mutant rat receptors were expressed in SH-SY5Y cells. Functional characterization allowed us to identify the major, likely GRK-dependent, phosphorylation cluster responsible for acute desensitization, 412TNST415 at the end of the C-terminus of the receptor, as well as additional sites involved in desensitization (372TS373) and internalization (S395). The rat-specific residues seemed to be involved in G-protein coupling efficacy. These results bring new evidences of the specific role of the phosphorylation of particular residues in the regulation of GPCR activity. Furthermore, these results will enable us to generate phosphospecific antibodies that could be used in in vivo studies of NPFF2 receptor activation

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont la cible de plus de 25% des médicaments. La compréhension des mécanismes moléculaires de l'activation de ces complexes oligomériques est cruciale pour le développement de drogues plus efficaces. Notre modèle d'étude, le récepteur métabotrope de l'acide γ-amino-butyrique (GABA-B), le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central, module la transmission synaptique et constitue une cible pharmacologique pour le traitement de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques incluant l'anxiété, l'épilepsie ou l'addiction aux drogues. Le récepteur GABA-B est un hétérodimère obligatoire formé de deux sous-unités GB1 et GB2, composées chacune d'un domaine extracellulaire appelé Vénus flytrap (VFT) et d'un domaine à sept helices transmembranaires (7TM) commun à tous les RCPG. Le VFT de GB1 lie le GABA, tandis que le domaine 7TM de GB2 contient le site de liaison de modulateurs allostériques positifs et est responsable du couplage à la protéine G. Mon travail de thèse a eu deux objectifs : (i) au niveau fondamental, il a consisté à mieux comprendre le mécanisme moléculaire d'activation du récepteur GABA-B. Nous avons démontré l'importance du mouvement relatif des VFT de GB1 et GB2 pour l'activation du récepteur, en développant l'approche « glycan wedge scanning ». D'autre part, nous avons démontré que la transactivation directe entre les deux domaines 7TM de l'hétérodimère représente une étape clé dans l'activation du récepteur ; (ii) au niveau technologique, j'ai mis en place un système senseur de l'état d'activation du récepteur GABA-B exprimé à la surface de cellules vivantes en utilisant de nouvelles techniques de marquage en fluorescence, compatibles avec des mesures de FRET en temps résolu. Pour cela, j'ai développé une méthode de marquage orthogonal entre un ACP-tag inséré dans une sous-unité et un Snap-tag fusionné à l'autre sous-unité. La mise en place de ce senseur devrait conduire à un nouveau test de criblage de molécules spécifiques du GABA-B, à moyen ou haut débit
G-protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors, and the target of more than 25% of drugs on the market. Understanding the molecular mechanisms of the activation of such oligomeric complexes is crucial to develop more potent drugs. The metabotropic γ-aminobutyric acid receptor (GABA-B) is activated by the main inhibitory neurotransmitter of the central nervous system (GABA). It plays an important role in brain functions and as such, it is a potential therapeutic target for the treatment of various neurologic and psychiatric disorders (anxiety, epilepsy or drug addiction). The GABA-B receptor is an obligatory heterodimer composed of two subunits, GB1 and GB2, each of them possessing an extracellular domain called Venus flytrap (VFT) and a seven transmembrane domain (7TM) common to all GPCRs. The VFT of GB1 contains the GABA binding site whereas 7TM domain of GB2, where the positive allosteric modulators bind, is responsible for G-protein activation. My doctoral research project had two main objectives. The first one was to better understand the molecular mechanism underlying the activation of GABA-B receptor. We first demonstrated the importance of the relative movement of GB1 and GB2 VFT domains in the activation, using a « glycan wedge scanning » approach. In addition, we showed a direct transactivation between the two 7TM that is a key step in GABA-B activation. The second objective was the development of a sensor to monitor the GABA-B receptor activation at the cell surface of living cells. This sensor, based on GABA-B receptor conformational changes during activation used new fluorescent tools compatible with time-resolved FRET experiments. To this aim, we set up an orthogonal labelling between an ACP-tag inserted in a loop of one subunit and a Snap-tag fused to the other. This sensor of GABA-B activation should lead to the development of a medium or high throughput screening of specific GABA-B molecules

Depuis quelques années, le récepteur opioïdergique delta (DOPR) apparaît comme une alternative intéressante dans le traitement de la douleur puisque son utilisation est accompagnée de moins d'effets secondaires qu'avec les traitements opioïdergiques actuels, ciblant principalement le récepteur opioïdergique mu (MOPR). Par contre, les agonistes sélectifs pour DOPR n'ont que très peu d'effets chez les animaux sains en raison d'une faible expression membranaire du récepteur. Depuis quelques années, un nombre croissant d'études se sont intéressées à l'adressage de DOPR et les résultats montrent que différentes situations peuvent moduler son expression à la membrane plasmique. Mes travaux de Thèse se sont donc intéressés à la régulation de DOPR dans un contexte de traitement de la douleur. En premier lieu, nous avons montré que les agonistes sélectifs pour DOPR soulagent l'hyperalgésie thermique induite par l'inflammation et que cet effet est conservé lors d'un traitement prolongé. À l'opposé, les effets antinociceptifs et moteurs de la deltorphine sont rapidement soumis à la tolérance. La dichotomie observée quant au développement de la tolérance pour les effets des agonistes DOPR suggère que des mécanismes de régulation différents s'opèrent lors de l'activation soutenue de DOPR. Dans un deuxième temps, nous avons montré que des agonistes sélectifs pour DOPR et MOPR, inhibent les comportements douloureux ainsi que l'activation neuronale (c'est-à-dire l'expression de c-fos) induits par la formaline ou la capasïcine. De plus, les agonistes DOPR et MOPR empêchent la relâche de substance P via l'inhibition des fibres afférentes primaires, ce qui confirme leur localisation sur les fibres peptidergiques. Par ailleurs, puisque les agonistes DOPR et MOPR ont des actions similaires sur la relâche de substance P, nos résultats proposent une colocalisation de DOPR et MOPR. L'ensemble de ces résultats contribuent à élargir nos connaissances sur les rôles et la régulation de DOPR dans le but d'en faire une cible thérapeutique pour le traitement de la douleur chronique.

Notre équipe a caractérisé un nouveau récepteur, msr/apj, qui est exprimé par les cellules endothéliales durant la formation des vaisseaux et du cœur. En 1998, le ligand endogène (baptisé apeline) du récepteur a été isolé par une équipe japonaise. Dans le but de comprendre la fonction endothéliale de cette nouvelle voie de signalisation, nous avons analysé les différentes cascades de transduction activées par l'apeline dans des CHO exprimant de manière stable msr/apj. Dans ces cellules, l'apeline engendre une inhibition de l'adénylylcyclase, et induit une activation des ERKs et de la p70S6 kinase. Grâce à l'expression stable de sous-unités a de protéines G insensibles à la toxine pertussique, nous avons montré que la stimulation des ERK est dépendante de ai2 et indépendante de Ras. La stimulation de la p70S6 kinase implique préférentiellement ai1, une PI3 Kinase, Akt, et mTOR. De manière intéressante, nous avons observé que les HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) expriment naturellement le récepteur de l'apeline. L'apeline engendre aussi une activation de la p70S6K dans ces cellules et induit leur prolifération. Cependant, ces cellules expriment naturellement l'apeline qui peut engendrer une désensibilisation autocrine. Cette désensibilisation peut être obtenue en aigu après un prétraitement des CHO par l'apeline ou en chronique avec des CHO coexprimant le récepteur et l'apeline. La délétion du domaine C-terminal du récepteur bloque la désensibilisation associée au couplage avec la sous-unité ai2 et l'activation des ERK. Ce récepteur représente donc une nouvelle cible pharmacologique pour les pathologies associées à une néovascularisation telles que le développement des tumeurs solides et les rétinopathies ischémiques
Our team have characterized a new receptor, msr/apj, which is expressed in the endothelium of newly forming heart and blood vessels. In 1998, the endogenous ligand (named apeline) of this receptor was isolated by a Japanese laboratory. In order to understand the endothelial function of this new signaling pathway, we analyzed the various signal transduction pathways activated by apelin in CHO cells which stably express msr/apj. In these cells, apelin induces inhibition of adenylylcyclase, and activation of ERKs and p70S6 kinase. The stable expression of pertussis toxin insensitive a subunits of G proteins led us to demonstrate that ERK stimulation is ai2 dependent and Ras independent. The p70S6 kinase stimulation preferentially involves ai1, a PI3 Kinase, Akt, and mTOR. Interestingly, we observed that HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) endogenously express the apelin receptor. In these cells, apelin induces the activation of p70S6K and leads to their proliferation. However, these cells also express apelin which can induce an autocrine desensitization of the receptor. This desensitization can be obtained after acute pretreatment of the CHO by apelin or observed with CHO cells co-expressing the receptor and apelin. The deletion of the receptor C-terminal domain abolishes the desensitization associated with the coupling with the ai2 subunit and the ERK activation. Thus, this receptor represents a new pharmacological target for pathologies associated with a neovascularization such as the solid tumors development and ischemic retinopathy

Compte tenu de la grande distribution des gènes des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) dans le génome humain et du vaste potentiel thérapeutique de ces récepteurs, beaucoup d'efforts ont été déployés au cours des trois dernières décennies afin de comprendre les bases structurales de leurs mécanismes d'actions. Les travaux de recherches présentés dans le cadre de cette thèse rapportent le développement et l'utilisation d'approches biochimiques afin de caractériser la structure moléculaire d'un modèle de GPCR peptidergique, soit le récepteur de l'angiotensine II de type 1 (AT[indice inférieur 1]). Dans une première étude (J.Med.Chem.2006,49(7):2200-9), nous décrivons la synthèse stéréospécifique d'une sonde photoréactive, le p-[3-(trifluorométhyl)-3H-diazirin-3-yl]-L-phénylalanine (Tdf), ainsi que sa caractérisation en marquage par photoaffinité (MPA). Nous démontrons par l'utilisation du récepteur de l'angiotensine II de type 2 (AT[indice inférieur 2]) comme modèle de GPCR que le Tdf est plus réactif que le p-benzoyl-L-phénylalanine (Bpa, la sonde photoréactive la plus couramment utilisée), en plus de ne présenter aucune chimiosélectivité envers les méthionines. Ces propriétés font que le Tdf est non seulement complémentaire au Bpa, mais représente également un outil moléculaire permettant de déterminer avec précision les sites de contacts ligand/récepteur par MPA. Dans une deuxième étude (J.Med.Chem.2010; 53(5):2063-75), nous cherchons à identifier l'ensemble des domaines du site de liaison du récepteur AT[indice inférieur 1] qui contacte chacune des huit positions de l'angiotensine II (AngII) par MPA. À l'aide de deux séries de huit radio-analogues photoréactifs incorporant le Bpa ou le Tdf, nous démontrons qu'un mutant constitutivement actif (MCA) du récepteur AT[indice inférieur 1], AT[indice inférieur 1]-[N111G] (AT[indice inférieur 1],-MCA), possède une relation structure-activité (SAR) plus tolérante que le récepteur de type sauvage (TS). Nos résultats suggèrent que la portion N-terminale (NT) de l'AngII réside dans un environnement hydrophile et interagit avec différentes régions du récepteur MCA-AT[indice inférieur 1], dont plusieurs domaines extracellulaires (DEC). Dans une troisième étude (Manuscrit soumit [i.e. soumis]), nous utilisons l'essai de proximité aux méthionines (EPM) afin d'identifier précisement les résidus des DEC du récepteur AT[indice inférieur 1] qui forment le site de liaison pour l'AngII. Les données recueillies sont utilisées afin de générer in silico une structure tridimensionnelle du récepteur AT[indice inférieur 1] lié à l'AngII. Cette structure met en évidence le rôle central de plusieurs DEC, mais aussi des deux ponts disulfures, dans l'organisation de la topologie extracellulaire du site de liaison du récepteur AT[indice inférieur 1]. L'AngII y interagit alors simultanément avec l'ensemble des DEC, mais aussi profondément au sein des domaines transmembranaires (DTM). Nous émettons l'hypothèse que ce mode de liaison puisse être commun à d'autres GPCR peptidergiques.

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT
We address the question of the existence of a specific membrane organization which could favor the interactions between the G protein coupled receptor (GPCR), the G protein and the effector. Here we examine the lateral diffusion of the human mu opioid receptor (hMOR) in regard to its activation by ligands and to membrane environment modifications. The T7-EGFP-hMOR stably expressed in SH-SY5Y is found to be fully functional. Its mobility analysis was achieved using two complementary biophysical approaches which are vrFRAP (variable radii fluorescence recovery after photobleaching) and SPT (single particle tracking). At 22°C these analyses reveal a double compartimentation of the receptors in permeable domains (about 1 µm radius) and in smaller domains (200 nm radius). Moreover receptors exhibiting a directed diffusion are observed. The temperature was modulated, the actin cytoskeleton was partially destroyed, and the G protein/receptor interaction was impeded to determine the sources of the receptor organisation. It appears that many parameters are playing a part in the complex receptor organisation. Our results show that the interactions of hMOR with G proteins or with the cortical cytoskeleton influence its membrane organisation. Antagonists binding don't modify the receptor organisation in permeable sub-micrometer size domains. On the contrary agonists binding induce a decrease of both the domain size and the diffusion coefficient. Our results highlight the influence of numerous parameters on the hMOR dynamic organisation. They demonstrate the interest of a conjoint use of vrFRAP and SPT approaches to obtain a global vision of a protein plasma membrane organisation

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.

Le cancer germinal testiculaire (CGT), cancer le plus fréquent de l’homme jeune, a vu son incidence tripler en cinquante ans. Sa physiopathologie demeure inconnue mais des données épidémiologiques suggèrent le rôle d’une exposition foetale ou périnatale à des perturbateurs endocriniens environnementaux (PEE) à activité estrogénique, associés à des facteurs de prédisposition génétique. Grâce à la lignée séminomateuse humaine (JKT-1), l’estrogéno-dépendance du CGT a été mise en évidence par l’équipe d’accueil en décrivant sur la prolifération des cellules germinales malignes : une voie génomique et mitochondriale via le récepteur classique ER béta exerçant un rôle suppresseur tumoral; et une voie non génomique, via un récepteur membranaire couplé aux protéines G, exerçant un rôle promoteur tumoral. Nous avons pu identifier (antagoniste, siRNA) que ce récepteur membranaire était GPR30/GPER. Localisé à la membrane plasmique dans notre modèle, il est capable de lier, avec une forte affinité, le bisphénol A, un PEE à activité estrogénique, et d’induire la prolifération des cellules séminomateuses humaines. Nous avons pu mettre en évidence que GPR30/GPER est exprimé par les cellules germinales humaines adultes normales et qu’il était surexprimé dans les cellules séminomateuses JKT-1. Cette surexpression a été confirmée dans une collection tumorale multicentrique de séminomes et reliée à deux polymorphismes spécifiques situés dans la région promotrice de GPR30/GPER, qui pourraient constituer un facteur de susceptibilité génétique de CGT, à rechercher chez des patients à haut risque de développer de telles tumeurs. Ces résultats nous amènent à formuler l’hypothèse qu’une surexpression de GPR30/GPER par polymorphismes (et/ou modification épigénétique), associée à l’extinction d’ER béta par modification épigénétique, pourrait être impliquée dans l’action des PEE sur le contrôle de la prolifération germinale maligne et/ou la carcinogenèse testiculaire
Testicular germ cell tumours (TGCT) are the most frequent cancer of young men with an increasing incidence all over the world since fifty years. Pathogenesis remains unknown but fetal or perinatal exposure to environmental endocrine disruptor compounds (EDC) with estrogenic affinity, together with genetic susceptibility, have been suggested. Using the JKT-1 cell line, which is derived from a human testicular seminoma, the lab has previously shown that estrogens are involved in human seminoma cell proliferation in vitro through two signalling pathways: the one through nuclear and mitochondrial ER beta, which acts as a tumoural suppressor; the other one through a membrane G protein coupled receptor (GPCR), with a proliferative effect. Using selective antagonist and siRNA, we identified this GPCR as GPR30/GPER, a widely conserved orphan GPCR, which is located at the cell membrane in JKT-1 cells. Bisphenol A, an estrogenic EDC, induces JKT-1 cells proliferation in vitro through GPR30/GPER. GPR30/GPER is expressed both in normal adult and tumoural human germ cells, and selectively overexpressed in seminoma tumours. We demonstrated that this overexpression is associated with two polymorphisms, which are located in the 5’ regulatory region of GPR30/GPER gene. Thus, overexpression of GPR30/GPER due to genetic polymorphisms is involved in testicular carcinogenesis and could be a genetic susceptibility factor of TGCT, which might be screened in high-risk TGCT patients. Both overexpression of GPR30/GPER by genetic polymorphisms (and/or epigenetic modifications) and silencing of ER beta by hypermethylation could also participate in the effects of EDC during the control of malignant germ cell proliferation and/or testicular carcinogenesis

La ghréline, ligand endogène du Growth Hormone Secretagogue Receptor (GHSR), constitue la seule hormone orexigène connue à ce jour et stimule fortement la sécrétion d’hormone de croissance (GH). Ces propriétés font du GHSR une cible potentielle dans le traitement des maladies de la croissance et de la balance énergétique. Le séquençage du gène GHSR chez 290 patients présentant un déficit isolé en GH ou une petite taille idiopathique a permis d’identifier 2 mutations tronquantes (W2X, c. 370delG) et 6 variations faux-sens (L42V, A204E, V216A, R237W, L311F, A358T) au sein de 8 familles indépendantes. L’analyse fonctionnelle comparative de ces variants in vitro a évalué leur affinité pour la ghréline, leur localisation cellulaire et leur activité transcriptionnelle sur des gènes cibles. L’étude des variations W2X, R237W, A204E et c. 370delG a permis de mettre en évidence une perte de fonction des mutations tronquantes et un mécanisme original de perte totale (A204E) ou partielle (R237W) de l’activité constitutive des récepteurs avec conservation de leur capacité à répondre à la ghréline. Ces mutations sont responsables d’une petite taille, avec ou sans altération des tests de sécrétion de GH, se transmettant selon un mode récessif ou dominant à pénétrance incomplète. Ce travail nous a donc permis de caractériser une nouvelle étiologie de retard de croissance chez l’homme et de confirmer l’importance du GHSR et de son activité constitutive dans la croissance. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques des anomalies du GHSR chez l’homme devrait fournir des connaissances importantes pour le développement de molécules ciblant l’axe ghréline/GHSR.

Les récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B de la sérotonine ont une localisation subcellulaire différente dans les neurones. Le récepteur 5-HT1A est situé à la membrane somatodendritique alors que le récepteur 5-HT1B est axonal et présente une localisation intracellulaire dans le soma. Des études antérieures ont montré que les régions impliquées dans leur adressage sont la troisième boucle intracellulaire et l’extrémité C-terminale. J’ai analysé les messages d’adressage contenus dans ces régions par mutagenèse dirigée, et démontré qu'un motif di-leucine de la région C-terminale joue un rôle crucial dans le repliement et l'export des deux récepteurs du RE vers la membrane plasmique. De plus, par criblage double-hybride, j’ai identifié une protéine partenaire du récepteur 5-HT1A, appelée Yif1B, et homologue d'une protéine de levure située dans le RE et l'appareil de Golgi. J'ai montré que Yif1B interagit avec le motif di-leucine C-terminal du récepteur 5 HT1A et qu'elle régule son export du RE.

Le récepteur TSH est un récepteur couplé aux protéines G présentant des spécificités par rapport aux récepteurs homologues de la lutropine (LH) et folliculostimuline (FSH): (i) son volumineux domaine extracellulaire clivé en deux sous-unités (ii) son activité constitutive (iii) l'existence d'auto-anticorps stimulants dirigés contre le récepteur et impliqués dans l'hyperthyroïdisme. Le trafic intracellulaire du TSHR n'était pas documenté. Des lignées permanentes de cellules L exprimant ce récepteur ainsi que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur permettent d'étudier sa distribution et son endocytose en microscopie confocale et électronique. Le TSHR est initialement présent sur la membrane plasmique au sens strict et les puits recouverts de clathrine, au niveau desquels il est internalisé. L'internalisation constitutive représente 10% des récepteurs présents à la surface. L'hormone n'augmente que d'un facteur 3 cette endocytose. La majorité du récepteur internalisé est recyclé via des vésicules lisses alors que l'hormone est dégradée dans les lysosomes. Le recyclage est inhibé par la monensine et emprunte une voie indépendante de la cavéoline-1. Les études de microscopie conduites sur les thyrocytes humains en culture primaire montrent une polarisation baso-latérale du récepteur et une voie d'endocytose similaire. Le récepteur LH est lui internalisé massivement puis dégradé dans les lysosomes. Les essais de colocalisation avec le récepteur transferrine démontrent que les récepteurs homologues LH et TSH suivent un trafic intracellulaire différent dans le même système d'expression cellulaire. L'utilisation de récepteurs chimères des TSHR et LHR prouvent que les domaines transmembranaires et intracellulaires contiennent les informations responsables de l'orientation vers la voie de recyclage versus celle de dégradation. Le domaine extracellulaire semble conditionner le taux d'internalisation. La détermination des séquences impliquées est en cours
The TSH receptor is a G protein coupled receptor, with specific characteristics from the two high homologous lutropin (LH) and folliculostimulin (FSH) receptors (i) its large extracellular domain which is cleaved in two subunits (ii) its constitutive activity towards the cAMP transduction pathway and (iii) the existence of stimulating anti-receptor autoantibody implicated in hyperthyroïdism. Seant information is available on the intracellular trafficking of this receptor. Stahly transfected L cells expressing TSH receptor and anti-receptor antibodies were used to study by confocal and electron microscopies its cellular distribution and endocytosis. The TSH receptor was initially localized on the plasmalemma proper and in clathrin-coated pits. Lt was internalized through clathrin-coated vesicles. Constitutive endocytosis represented 10% of cell surface receptor molecules. Endocytosis was increased only 3 fold by the hormone. The majority of internalized receptor recycled to cell surface via smooth vesicles whereas hormone was degraded in lysosomes. This recycling was inhibited by administration of monensin and occurred via a caveolin-1 independent pathway. Microscopic studies repeated in primary cultures of human thyroid cells showed a baso-lateral distribution and a very similar endocytosis pathway. The LH receptor is endocytosed in high proportion and degraded in lysosomes. Colocalization studies with transferrin receptor confirmed that highly homologous LH and TSH receptors exhibit, when expressed in the same cells, very different cellular trafficking properties. The use of LHITSH receptor chimeras showed that transmembrane and intracellular domains contain information orienting the protein toward recycling or degradative pathways. The extracellular domain seems to play a role in the extent of internalization. These observations should now allow the determination of the molecular signals involved in these processes

La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien
Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle

Le WEB2086 figure parmi les molécules ayant une activité inverse élevée pour le récepteur du PAF. Cette molécule a déjà été utilisée comme traitement pour l'asthme et représente une avenue intéressante pour une potentielle thérapie anti-cancéreuse. Nos résultats suggèrent que le WEB2086 permet la diminution de l'expression de son récepteur, le PAFR.Le même phénomène est observé avec l'agoniste PAF. Ces deux ligands n'ont cependant pas toutes les mêmes caractéristiques pharmacologiques. Nous avons donc décidé d'étudier les différentes voies de signalisation et de circulation intracellulaires activées suite à une stimulation au PAF ou au WEB2086.Le PAFR, qui peut être désensibilisé par les PKC, est phosphorylé suite à une stimulation au PAF ou au WEB2086 par des PKC d'isoformes différentes. Il semble que les PKC [bêta], [thêta] et [zêta] soit préférablement utilisées par le WEB2086, alors que les PKC [delta], [alpha], [epsilon] et [zêta] sont stimulées lorsque les récepteurs sont en mis présence de PAF. Les mécanismes régissant la signalisation et la circulation intracellulaire du PAFR ne sont pas connus. Nos travaux tentent d'élucider ces mécanismes, en comparant les voies de signalisation induites par le PAF et le WEB2086.Le mécanisme de circulation intracellulaire permettant la dégradation du PAFR utilise la voie des endosomes précoces et tardifs lors de la stimulation au PAF. Cependant, le mécanisme est différent suite à une stimulation au WEB2086. Les récepteurs sont ciblés à la dégradation indépendamment du type de ligand utilisé, soit un agoniste ou un agoniste inverse. L'utilisation d'inhibiteurs du protéasome et des lysosomes a permis d'établir que ces deux systèmes sont utilisés pour diminuer l'expression du récepteur du PAF. La compréhension des mécanismes de la régulation négative du PAFR et de la signalisation induite par les agonistes inverses donneront des outils pour la mise en place de modèles généraux de la régulation du récepteur et faciliteront le développement de thérapies ciblant efficacement la signalisation du récepteur.--Résumé abrégé par UMI.

La stimulation de la clairance pulmonaire des fluides dépendante des agonistes β adrénergiques est un mécanisme important qui protège le poumon de l’oedème alvéolaire. L’hypothèse de notre étude est un effet antagoniste direct des médiateurs tels que l Interleukine-8 (IL-8) et le Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), sur la réponse de l’épithélium alvéolaire à la stimulation par les agonistes β adrénergiques. Les expériences, étudiant le courant transépithélial, montrent que l’IL-8 inhibe le transport Chlore CFTR-spécifique stimulé par les agonistes β adrénergiques, à travers la membrane apicale de cellules primaires épithéliales alvéolaires de type II (CEAII) de rat et humaines. De plus l’IL-8 diminue la production d’AMPc stimulée, induisant une inhibition de l’activité du promoteur et de l’expression du gène de CFTR des CEAII. Nous démontrons que l’inhibition par TGF-β1 nécessite l’IL-8 et est médiée par la désensibilisation des récepteurs β adrénergiques par le biais de la translocation à la membrane plasmatique du complexe PI-3K/GRK2. En accord avec les résultats in vitro, nous montrons que TGF-β1 nécessite IL-8 pour inhiber le transport des fluides à travers l’épithélium alvéolaire distal stimulé par les agonistes β adrénergiques in vivo (rat). Enfin l’activation de la PI3K par IL-8 et TGF-β1 se fait sur deux isoformes différentes. Ainsi, nos résultats démontrent l’importance de la voie de signalisation de la PI3K dans l’amplification de l’inhibition IL-8-dépendante du transport de fluides alvéolaires, médié par l’AMPc. La mise en évidence de ce mécanisme a des implications sur l’utilisation des agonistes des récepteurs β adrénergiques dans le traitement du SDRA
β-adrenergic agonist-dependent stimulation of the lung fluid clearance is an important mechanism that protects the lung from alveolar flooding. In this study we hypothesized that critical mediators of acute lung injury (ALI), such as interleukin-8 (IL-8) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1), could directly antagonize the epithelial response to β adrenergic agonists. Short circuit current experiments revealed that IL-8 inhibits CFTR-specific β adrenergic agonist-stimulated vectorial Cl- transport across the apical membrane of primary rat and human alveolar epithelial type II (ATII). IL-8 also significantly decreased β adrenergic agonist-stimulated cAMP production resulting in the inhibition of the CFTR promoter activity and gene expression in ATII cells. We found that the TGF-β1-dependent inhibition required IL-8 and was mediated by desensitization the β adrenergic receptor through both TGF-β1 and IL-8 signaling pathways, implicating PI-3 kinase-GRK2 complex translocation to the plasma membrane. Consistent with the in vitro results, we showed that TGF-β1 requires IL-8 to inhibit the β adrenergic agonist-stimulated fluid transport across the distal airspace epithelium in vivo in rats. In summary, the results demonstrate for the first time the importance of the PI3K signaling pathway in amplifying the IL-8-dependent inhibition of the cAMP-mediated alveolar fluid transport. This mechanism has an important clinical relevance since it may modify the way the β adrenergic agonists could be used for the treatment of ARDS

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires. Ils sont impliqués dans une large variété de processus physiologiques et par conséquent ils représentent une cible thérapeutique d'intérêt pour le développement de médicaments. Plusieurs études ont démontré que les RCPGs sont capables d'interagir entre eux pour former des complexes oligomériques. Cependant, leur existence in vivo et leur rôle fonctionnel reste sujet à débats. Afin de mieux appréhender ce phénomène, nous avons utilisé un RCPG de classe C comme modèle d'étude, le récepteur de l'acide γ-aminobutyrique (GABAB), qui est impliqué dans une grande variété de désordres neurologiques et psychiatriques. Son originalité réside dans le fait qu'il est un hétérodimère obligatoire composé de deux sous-unités : GABAB1 et GABAB2 (GB1 et GB2). La liaison de l'agoniste sur GB1 conduit à l'activation de GB2. Au cours de ma thèse, nous avons montré en utilisant une nouvelle approche biophysique basée sur un marquage fluorescent enzymatique appelé Snap-tag que, contrairement aux récepteurs métabotropiques du glutamate, le récepteur GABAB forme des dimères de dimères (tétramères). Cette organisation hétéro-oligomérique est assurée par des contacts stables entre les domaines extracellulaires des sous-unités GB1. De plus, nous avons apporté des données en faveur de l'existence physiologique de cet assemblage en utilisant des membranes de cerveau de rat et de souris. Dans une seconde partie, nous avons souhaité déterminer les conséquences fonctionnelles de cette organisation. Nos résultats suggèrent une efficacité de couplage à la protéine G réduite du récepteur GABAB lorsqu'il est associé en dimères de dimères. Collectivement, nos données rapportent pour la première fois, l'existence de larges complexes allostériques de RCPGs dans le cerveau
The G-protein coupled receptors (GPCR) constitute the main family of transmembrane receptors. They are involved in many physiological processes and, as a consequence, they represent a therapeutic target of interest for the development of new drugs. Few studies have demonstrated that GPCRs are able to interact with each other to form oligomeric complexes. However, the existence in vivo and the functional interest of these oligomers remain a subject of intense debates. To address this issue, we have used a class C GPCR as a model, the γ-aminobutyrate B receptor (GABAB), which is involved in a wide variety of neurological and psychiatric disorders. This receptor has the particularity to be an obligatory heterodimer composed of two subunits GABAB1 and GABAB2 (GB1 and GB2). Agonist binding on GB1 leads to G-protein activation by GB2. During my thesis, we developed a new biophysical approach based on an enzyme-mediated fluorescent labeling calle d Snap-Tag and showed that, unlike metabotropic glutamate receptors, GABAB forms dimers of dimers (tetramers). This oligo-heterodimers organization is mediated via stable contacts between extracellular domains of GB1 subunits. Furthermore, we brought evidence of the physiological reality of this assembly using rat and mouse brain membranes. Then, we aimed at assessing what would be the functional rational of the GABAB dimer of heterodimers. Our results suggest that the GABAB receptor has a lower G protein-coupling efficacy when associated into dimers of dimers. Altogether, our data report for the first time, the existence of large allosteric GPCR complexes in the brain

La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) est une association bénéfique établie entre les membres d'un ancien sous-phylum de champignons, les Gloméromycètes, et les racines de la majorité des plantes terrestres. Les champignons MA procurent de l'eau et des minéraux (azote et phosphore principalement) à leur plante hôte et obtiennent de cette dernière des molécules carbonées sous forme d'hexoses et de lipides. Des études récentes ont montré que certaines protéines sécrétées par les champignons MA peuvent être des régulateurs importants de l'association (Kloppholz et al., 2011 ; Tsuzuki et al., 2016). Notre objectif était d'identifier de nouvelles protéines fongiques contribuant à la mise en place de la symbiose. Des protéines prédites pour être préférentiellement sécrétées par le champignon MA Rhizophagus irregularis dans les racines ont été identifiées au début de ma thèse (Kamel et al., 2017). Certaines d'entre-elles présentaient une structure ressemblant aux précurseurs de phéromones sexuelles d'Ascomycètes. Ces protéines sont connues pour être maturées dans les voies de sécrétion en petits peptides qui sont ensuite sécrétés. Leur reconnaissance par un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) aboutit à la fusion cellulaire de deux types sexuels opposés. Dans le cas de R. irregularis, seule la reproduction clonale a été décrite, mais des données génomiques récentes remettent en question son statut d'organisme asexué (Ropars et al., 2016). Une grande partie de ma thèse a été dédiée à la caractérisation fonctionnelle de ce type de peptides chez R. irregularis. Nous avons montré que deux peptides étaient effectivement produits et sécrétés par R. irregularis. L'utilisation de peptides synthétiques nous a permis de mettre en évidence que l'un d'eux stimulait la colonisation de M. truncatula mais était également perçu par le champignon lui-même, induisant la transcription de son propre gène précurseur et d'un GPCR. Ce peptide stimulateur de la symbiose est composé de seulement trois acides aminés et il peut être produit à partir de trois précurseurs protéiques. Par des approches de génétique inverse (HIGS et VIGS), nous avons confirmé l'importance de ces précurseurs dans l'établissement de la symbiose.[...]
Arbuscular Mycorrhizal (AM) symbiosis is a beneficial association established between members of an ancient subphylum of fungi, the Glomeromycotina, and the roots of the majority of terrestrial plants. AM fungi provide water and minerals (mainly nitrogen and phosphorus) to their host plant in exchange for organic carbon in the form of hexoses and lipids. Recent studies have shown that certain proteins secreted by AM fungi are important symbiosis regulators (Kloppholz et al., 2011, Tsuzuki et al., 2016). Our aim was to identify new fungal proteins involved in the establishment of symbiosis. Proteins predicted to be preferentially secreted by the AM fungus Rhizophagus irregularis in the roots were identified at the beginning of my thesis (Kamel et al., 2017). We noticed that some of them had a structure resembling the sex pheromone precursors of Ascomycota. These proteins are known to be processed in the secretory pathway into small peptides which are then secreted. Their recognition by a G protein-coupled receptor (GPCR) leads to cell fusion of two opposite sex types. In the case of R. irregularis, only clonal reproduction has been described. However, recent genomic data question its status as an asexual organism (Ropars et al., 2016). A large part of my thesis was dedicated to the functional characterization of this type of processed peptides in R. irregularis. We show that two of them are actually produced and secreted by R. irregularis. Treatments with synthetic forms of these peptides revealed that one of them stimulated the colonization of M. truncatula but was also perceived by the fungus itself, inducing the transcription of its own precursor gene and of a GPCR gene. This symbiosis-stimulating peptide is composed of only three amino acids and can be produced from three different protein precursors. Using reverse genetics (HIGS and VIGS), we confirmed the importance of these precursors in the symbiosis establishment. [...]

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent une vaste famille de protéines située à la surface de la cellule et assurent la communication entre les cellules de notre organisme. Ce sont des cibles thérapeutiques privilégiées, mais leur stimulation prolongée conduit à des adaptations, en particulier le développement de la tolérance. La tolérance, qui peut se définir comme une baisse de l’efficacité d’un composé au cours du temps, est bien connue des cliniciens dans le cas de traitements prolongés de nombreuses pathologies avec des médicaments ayant pour cibles les RCPG. La compréhension des mécanismes impliqués dans ces phénomènes adaptatifs constitue ainsi un défi majeur qui pourrait conduire au développement de nouveau traitement visant à limiter la tolérance. C’est dans ce contexte que nous avons récemment identifié une nouvelle famille de protéines interagissant avec les RCPG. Cette famille, appelée GASP, aurait une fonction importante dans la dégradation des RCPG, phénomène considéré comme un élément clé du développement de la tolérance in vivo. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux régions des GASP et des RCPG cruciales pour l’interaction de ces deux types de protéines, identifiant ainsi un nouveau motif d’interaction protéine-protéine et développant un petit peptide capable d’inhiber cette interaction. Je me suis également intéressé à l’interaction de GASP-1 et -2 avec le récepteur muscarinique M1 à l’acétylcholine, et ses conséquences sur la dégradation de ce récepteur, montrant ainsi pour la première fois l’implication des GASP dans la régulation du trafic intracellulaire des RCPG à recyclage rapide. Finalement, j’ai exploré le rôle physiologique de GASP-1 à l’aide d’un modèle animal déficient en cette protéine. Dans un premier temps, les mécanismes adaptatifs, comportementaux et biochimiques, liés à la consommation de cocaïne ont été étudiés, montrant une diminution de l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne chez les animaux mutants. Ces animaux présentent également une difficulté à acquérir un comportement d’autoadministration de la cocaïne qui s’accompagne d’une baisse de la densité en récepteurs dopaminergiques et muscariniques dans le striatum. Dans un deuxième temps, la régulation des rythmes circadiens a été étudiée et bien qu’aucune différence en terme de régulation du rythme de veille-éveil n’ait été décelée entre les animaux sauvages et mutants, une interaction entre les GASP et les protéines horloges Period conduisant à la modification de leur profil de localisation subcellulaire a pu être mise en évidence
G protein-coupled receptors (GPCRs), one of the most important family of proteins, are distributed at the plasma membrane and are implicated in cell communication. They represent major targets for pharmaceutical drugs and their function is tightly regulated. Recently, we identified a novel family of proteins interacting with GPCRs. This family, called GASP, could have an important function in the proteolysis of the GPCRs, which is considered as a key feature of the regulation of GPCR activity. My PhD work focused on the domains of GASPs and GPCRs that are critical for the interaction between these two kinds of proteins, identifying a novel protein-protein interaction motif and designing and developing a small peptide capable of preventing this interaction. I also focused on the interaction between GASP-1 and -2 and the acetylcholine muscarinic M1 receptor, and the consequences of this interaction on the proteolysis of this receptor, showing for the first time the implication of GASPs in the intracellular trafficking of fast recycling GPCR. Finally, I studied the physiological role of GASP-1 using transgenic animals deficient in this protein. These mice showed notably alteration in behavioral and biochemical adaptive mechanisms related to acute and prolonged administration of cocaine. The regulation of the circadian rhythms was also assessed. Despite the lack of difference in terms of sleep-activity rhythm between wild-type and mutant mice, an interaction between the GASPs and the PER clock proteins, that leads to the modification of their subcellular distribution, was observed

Mes travaux de thèse ont porté sur la désorphanisation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sur la caractérisation d’un nouveau site de liaison à la mélatonine (MLT), nommé MTx. Les RCPG représentent la plus grande famille de protéines transmembranaires et sont des cibles privilégiées de traitements pharmaceutiques car ces récepteurs sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Au sein de cette famille, il existe de nombreuxrécepteurs pour lesquels le ligand n’a pas encore été identifié et sont, de ce fait, appelés RCPG orphelins. Nous nous sommes intéressés à deux d’entre eux ayant un intérêt thérapeutique, le GPR88, impliqué dans la schizophrénie et le GPR21, impliqué dans le diabète de type 2. Au cours de cette thèse, nous avons tenté d’identifier les ligands endogènes de ces deux récepteurs.Au cours de notre campagne de désorphanisation du GPR88 nous avons testé l’activité de plusieurs fluides biologiques au cours de tests fonctionnels par mesure de la concentration d’AMPc dans une lignée cellulaire exprimant de façon stable le récepteur et par une technologie ≪ label-free ≫, l’EPIC. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence une activité agoniste spécifique du liquide céphalo-spinal (LCS). Les lots de LCS actifs ont ensuite été fractionnés selon des gradients de poids moléculaire (PM), mettant en évidence une activité agoniste spécifique dans la fraction de plus petite taille, inférieure à 3 kDa. Le fractionnement successif en HPLC phase inverse de cette ≪ fraction < 3 kDa ≫, a mis en évidence de nouvelles fractions actives spécifiques dans les premières eluees, suggérant une molécule plutôt polaire. La dernière fraction active a ensuite été analysée par spectrométrie de masse (MS) à haute résolution afin d’identifier les molécules contenues. La MSnous a permis d’identifier clairement deux entités chimiques, la créatine et l’hypoxanthine, et une troisième pour laquelle nous n’avons pas de formule chimique précise, mais un PM d’environ 175 Da. Une étude approfondie des bases de données des métabolites présents dans le LCS nous a permis d’identifier 10 composés candidats d’environ 175 Da à considérer en plus de la créatine et de l’hypoxanthine. Ces douze composés ont été testés individuellement ou combinés dans le test de mesure d’AMPc sans qu’aucune activité agoniste n’ait pu être identifiée. Ces études nous permettent de conclure que le ligand du récepteur GPR88 est contenu dans le LCS, a un PM inférieur à 3 kDa, est très polaire, ce qui nous permet de rejeter les lipides et les acides gras. Nous pouvons également exclure les petites molécules testées de la liste de ligands potentiels, sans pour autant rejeter leurs énantiomères non commercialement disponibles. D’autres techniques de séparation/fractionnement(par exemple une chromatographie HILIC) et une réduction des délais entre les fractionnements et les tests fonctionnels garantissant une meilleure stabilité de la molécule, nous permettront certainement d’identifier le ligand du GPR88
G-protein coupled receptors (GPCR) are the largest transmembrane protein family of the genome.Although, they are involved in numerous physiological processes, there are still some receptors among this family for which no ligand has been identified yet. These are called orphan receptors. We focused on two of these orphan receptors: GPR88 and GPR21, showing therapeutic potential in schizophrenia and diabetes mellitus, respectively. During this PhD thesis, we aimed to identify the ligands of these receptors using functional assays and by screening endogenous compounds libraries. Our approaches allowed us to identify the cerebro-spinal fluid (CSF) as a source for the GPR88 receptor ligand. This molecule appears to be very polar with a molecular weight below 3kDa . We also ruled out some compounds contained in the CSF, that we identified in active fractions by mass spectrometry. Concerning GPR21, the assays developped in our laboratory did not permit to detect any specific activity in the libraries nor in the tested biological fluids. In a second part of this PhD program, we pharmacologically characterized a new melatonin (MLT) binding site, named MTx. This site was discovered through autoradiography experiments, with high radiolabelled doses of MLT. MLT is a hormone, mainly synthesized at night by the pineal gland. It is involved in numerous physiological processes and in regulating circadian and circannual rhythms. The identification of this new site, as well as deciphering its roles, might allow us to enrich our knowledge on MLT, and to understand the mode of action of some treatments involving melatoninergic compounds. This site has a pharmacological profile unprecedently described. It can bind both MLT and serotonin, which is not the case with classical melatoninergic nor serotoninergic receptors. Our objectives for the work on MTx, was to identify the gene/protein responsible for the MLT binding and subsequently perform functional studies to further characterize this protein

Les récepteurs couplés aux protéines G de classe A (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires du génome humain et sont impliqués dans la régulation de nombreux mécanismes physiologiques. Comprendre les mécanismes évolutifs qui ont conduit à la diversité de cette famille de récepteurs pourrait permettre une meilleure connaissance des relations séquence-structure-fonction des différentes sous-familles. Pour obtenir des informations sur l'évolution des RCPG, nous avons exploré leur espace de séquences par multidimensional scaling métrique (MDS). Nous avons appliqué une nouvelle technique MDS qui projette des séquences supplémentaires sur un espace de référence et permet ainsi la comparaison des séquences de différentes espèces. Les résultats montrent que les récepteurs se répartissent en quatre groupes et suggèrent que les récepteurs actuels ont évolué à partir d'ancêtres des récepteurs de peptides suivant trois directions évolutives principales. Les prolines des hélices transmembranaires 2 et/ou 5 sont impliquées dans deux de ces directions. Pour comprendre le mécanisme fin ayant abouti à la formation des différentes sous-familles, nous avons analysé les covariations des résidus à différents niveaux hiérarchiques (classe/groupe/sous-famille). Nous avons testé différentes méthodes pour analyser les mutations corrélées afin de sélectionner une méthode robuste pour les différents jeux de séquences. L'application de cette méthode met en évidence des résidus spécifiques qui sont cruciaux pour l'évolution de sous-familles particulières
Class A G-protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors in the human genome and are involved in the regulation of many physiological functions. Understanding the mechanisms that drove the evolution of this receptor family should allow a better knowledge of sequence-structure-function relationships of the different sub-families. To gain evolutionary information on GPCRs, we explored their sequence space by metric multidimensional scaling (MDS). We applied a new MDS technique which projects supplementary sequences onto a sequence space of reference and allows comparison of sequences from different species. Results show that receptors cluster in four groups and suggest that modern receptors evolved from ancestors of the peptide receptors along three main evolutionary pathways. Proline residues of transmembrane helices 2 and/or 5 are involved in two of these pathways. To further detail the mechanisms that led to the different sub-families, we analyzed covariations of residues at different hierarchical levels (class/group/sub-family). We tested different methods of covariation analysis in order to select a method robust at the different hierarchical levels. This method highlights sequence determinants that are crucial for the evolution of specific sub-families

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de protéines membranaires avec plus de 800 membres identifiés. Ils sont exprimés de manière ubiquitaire dans les cellules eucaryotes et impliqués dans la plupart des fonctions physiologiques. Ainsi, ils sont la cible de 50% des médicaments sur le marché. Malgré leur intérêt fondamental et thérapeutique, une seule structure tridimensionnelle est disponible ce qui limite la compréhension des relations structure-fonction pour les autres RCPG. Ce manque d'informations structurales est dû à leur faible niveau d'expression. Nous avons développé une stratégie de production de RCPG fonctionnels en quantité compatible avec des études structurales, basée sur l'accumulation des récepteurs sous forme de corps d'inclusion dans le cytoplasme d'Escherichia coli grâce à l'utilisation d'un nouveau partenaire de fusion, un fragment de l'intégrine alpha 5 humaine. Ce partenaire, le plus efficace jamais utilisé, prévient le ciblage des RCPG dans la membrane des bactéries et permet leur accumulation en grande quantité. Nous avons ainsi pu purifier plusieurs milligrammes de RCPG de différentes familles. La fonctionnalité des RCPG humains V2 de la vasopressine et BLT2 du leucotriène B4 renaturés a été démontrée au niveau de la liaison de leurs ligands respectifs et de l'activation de leurs protéines G spécifiques. Cette stratégie devrait faciliter les études structurales de résonance magnétique nucléaire et de cristallographie aux rayons X, et ouvrir la voie au développement rationnel de ligands sélectifs et de composés thérapeutiques.

Les mécanismes de sécrétion de noradrénaline (NA) via les récepteurs de l'angiotensine (AT1) et alpha2-adrénergiques (alpha2A/C-AR) restant méconnus, nous avons émis l'hypothèse de l'implication d'un dimère AT1/alpha2C. Nos résultats montrent que ces deux récepteurs interagissent directement et que la liaison l'angiotensine II (AngII) et de NA stabilisent des conformations différentes du dimère. De plus, dans des conditions mimant l'hypertension artérielle (HTA ; costimulation NA+AngII), le dimère adopte une nouvelle conformation. En utilisant une technique originale permettant de mesurer spécifiquement l'activation des voies de signalisation intracellulaires induite uniquement par le dimère AT1/alpha2C, nous avons mis en évidence que la costimulation induit l'activation par le dimère d'une nouvelle voie de signalisation faisant intervenir la voie Galphas/PKA. Enfin, nous avons étudié la relevance physiologique de cette nouvelle entité in vivo en explorant l'activité du SNA chez la souris par microneurographie. De façon étonnante, la co-injection AngII+NA engendre une augmentation de l'activité du SNS, par rapport à l'injection d'AngII seule suggérant potentiellement un rôle du dimère AT1/alpha2C dans le contrôle de l'activité du SNA. En conclusion, l'ensemble de ces travaux montrent pour la première fois l'existence du dimère AT1/alpha2C et surtout la création d'une nouvelle entité pharmacologique via un dimère. A plus long terme, le dimère AT1/alpha2C pourrait représenter une nouvelle entité pharmacologique qui modulerait de façon originale le tonus sympathique et pourrait constituer une nouvelle cible de médicaments notamment dans le cadre du traitement de l'HTA
Mechanisms of norepinephrine (NE) secretion via angiotensin (AT1) and alpha2-adrenergic (alpha2A/C-AR) receptors remains unknown. So we hypothesized the involvement of a AT1/alpha2C dimer. Our results show that these two receptors are able to interact directly and binding of angiotensin II (Ang II) or NA stabilize different conformations of the dimer. In addition, under conditions mimicking arterial hypertension (HTN; costimulation NA+AngII), AT1/alpha2C dimer adopts a new conformation. Using a new technique allowing a specific measure of intracellular signaling pathways activation only induced by AT1/alpha2C dimer, we demonstrated that costimulation induces a new signaling pathway involving the Galphas / PKA pathway. Finally, we studied the physiological relevance of this new entity in vivo by exploring the SNS activity in mice by microneurography. Surprisingly, co-injection AngII + NA causes an increased SNS activity, compared to the injection of AngII alone, suggesting a role of AT1/alpha2C dimer in the control of controlling SNS activity. In conclusion, all this work show for the first time the existence of the AT1/alpha2C dimer and especially the creation of a new pharmacological entity in HTN condition. In the longer term, AT1/alpha2C dimer may represent a new pharmacological entity that originally modulate the sympathetic tone and may be a new drug target in particular the treatment of HTN

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines membranaires impliquées dans la communication entre cellules via des messagers circulants (hormones, neurotransmetteurs) ainsi que dans la perception de notre environnement (vision, odorat, goût). Ils sont essentiels à de nombreuses fonctions physiologiques vitales (cardiaques,respiratoires...) et comportementales (relations sociales et affectives) et sont donc une cible thérapeutique de choix pour la découverte de nouveaux médicaments.Au sein de l'équipe Canaux, de l’Institut de Biologie Structurale, un biocapteur original a été créé se basant sur la fusion de ces RCPG avec un canal ionique (Kir6.2) appelé Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Les changements conformationnels du récepteur induit par son activité (fixation de ligand, activation des protéines G) sonttraduits par le canal ionique en courant électrique aisément détectable par des techniques électrophysiologiques. Cette nouvelle génération de biocapteurs permet d'étudier en temps réel l’activité des RCPG par des techniques électrophysiologiques très sensibles.Le travail de thèse s’est principalement focalisé sur l’étude du récepteur de l’ocytocine (OXTR) impliqué dans l’accouchement, l’allaitement et le lien social. La technologie ICCR a été utilisée pour trois des projets de cette thèse. Le premier avait pour but l’étude des mécanismes moléculaires de la dépendance au cholestérol du récepteur del’ocytocine, et a ainsi permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation allostérique entre le cholestérol et la fixation des ligands. Un second projet a porté sur l’utilisation de ce biocapteur pour identifier de nouveaux types de ligands, plus spécifiques de certaines voies intracellulaires, appelés ligands biaisés. Enfin, un troisième projet a mis en relief l’effet de certains composés environnementaux sur les RCPG et a permis de mettre en avant de nouveaux récepteurs ciblés par ce type de composés.Pour terminer, un projet parallèle s’est porté sur l'étude de la formation de pores par des protéines bactériennes dépendantes des RCPG. Il s’agit des « pore-forming toxins » (PFTs) de la famille des hémolysines gamma, produitespar un des pathogènes humains les plus virulents, Staphylococcus aureus. Certaines de ces toxines sont capables de sefixer sur des RCPG très spécifiques, les récepteurs aux chimiokines, et ont donc un rôle important dans les infections virales et dans certaines pathologies cancéreuses. Les travaux ont notamment permis d’obtenir des informations nouvelles sur le mécanisme d’insertion de ces pores dans la membrane
G protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins involved in communication between cells via circulatingmessengers (hormones, neurotransmitters) as well as in the perception of the environment (vision, smell, taste). Theyare essential for many physiological functions (cardiac, respiratory...) and behavioral (social and emotional responses)and therefore represent interesting therapeutic targets.Within the Channels team, at the Institute of Structural Biology, an original biosensor was created, based onthe fusion of a GPCR to an ion channel (Kir6.2), called an Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Conformationalchanges of the receptor induced by its activity (ligand binding, activation of G proteins) are directly transmitted to theion channel and allow the generation of an electrical signal easily detectable by electrophysiological techniques. Thesenew biosensors are powerful tools to study GPCR activity in real time.The main focus of the thesis was the study of the oxytocin receptor (OXTR), involved in childbirth,breastfeeding and social bonding. ICCR technology has been used for three projects during the thesis. The first aimedat studying the molecular mechanisms of cholesterol dependency of the oxytocin receptor and allowed theidentification of a new allosteric regulation mechanism between cholesterol and the ligand binding. A second projectfocused on the use of this biosensor to identify new types of ligands, selective to certain intracellular pathways, calledbiased ligands. Finally, a third project highlighted the effect of certain compounds, known as endocrine disruptors, onGPCRs. Endocrine disruptors are environmental pollutants which have potentially harmful effects on human health.Finally, a parallel project was dedicated to the study of pore formation by GPCR-dependent bacterial toxins.These proteins are called pore-forming toxins (PFTs), from the gamma hemolysin family and are produced by one ofthe most virulent human pathogens Staphylococcus aureus. Some of these toxins are able to bind very specifically tocertain GPCRs, members of the chemokine receptor family. They therefore play a vital role in numerous viralinfections and in some cancerous pathologies. New information concerning the mechanism of membrane insertion ofthese toxins during pore formation was discovered during this work

Les protéines-G hétérotrimériques, constituées des sous-unités α, β et γ, sont les premières actrices de la transduction du signal en interagissant directement avec les Récepteurs Couplés aux protéines-G (RCPG). Les protéines-G ont la capacité de lier soit une molécule de GDP lorsqu'elles sont inactives, soit une molécule de GTP quand elles sont activées par un RCPG. Cet échange de nucléotide va conduire à la dissociation de l'hétérotrimère avec d'une part la sous-unité α seule, et d'autre part le complexe βγ. Chacune de ces entités va ensuite propager le signal dans le compartiment intracellulaire. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont pour but de mieux comprendre la dynamique des protéines-G hétérotrimériques et de leurs récepteurs par des techniques de mécanique moléculaire incluant la Dynamique Moléculaire (DM) et l'Analyse de Modes Normaux (AMN). Dans un premier temps une AMN nous a permis de décrire les possibles mouvements de larges amplitudes des protéine-G. Nous avons à l'occasion de cette étude mis au point une méthode de sélection de Modes Normaux (MN) pertinents que nous avons appelés modes représentatifs. Nous avons également développé une méthode d'extraction de ligand (ici le GDP) le long de ces MN. Ceci nous a permis de montrer qu'un mouvement concerté de toute la sous-unité α pouvait permettre l'ouverture de la poche et la sortie du GDP. Dans un deuxième temps, nous avons affiné nos résultats en reconstruisant des profils d'énergie libre le long de plusieurs chemins de sortie possibles pour le GDP. Ainsi nous avons pu proposer un mécanisme fin de sortie du ligand et plusieurs résidus clés impliqués dans cette sortie. Nous avons également étudié le processus de dissociation de l'hétérotrimère par la technique de la Dynamique Moléculaire Dirigée. Il a été possible, à l'issue de cette étude, de proposer un mécanisme à l'échelle moléculaire de la séparation des sous-unités α et βγ. Pour finir, nous avons également étudié le macro-complexe RCPG : protéine-G. Deux études traitent des mécanismes d'activation et de couplage des protéines-G à son récepteur. Nous avons notamment montré que l'hétérotrimère de protéine-G contraint très fortement les mouvements du récepteur. Un mouvement très largement retrouvé dans le complexe ainsi que dans plusieurs autres RCPGs dont les structures sont connues a été proposé comme étant le mouvement d'activation des RCPG une fois complexés à leurs protéines partenaires
Heterotrimeric G-proteins, constituted of α, β and γ subunits are the first actresses of the intra-cellular signal transduction and interact directly with G-protein Coupled Receptors (GPCR). The heterotrimer is able to bind either a GDP molecule (inactive state) or a GTP molecule (active state). The nucleotide exchange is triggered by the interaction with an activated GPCR and leads to the dissociation of the whole heterotrimer into two independant entities : α and tightly bound βγ subunits. Both subunits further propagate the signal into the intracellular compartment. Goals of the present work were to better understand the mechanics of G-proteins and GPCR by combining several molecular mechanics techniques such as Molecular Dynamics (MD) and Normal Mode Analysis (NMA).Firstly, we described large amplitude motions of the whole G-protein heterotrimer. In this study we developped a method to select relevant Normal Modes (NM), we called representative NM. We also developped a method which consists to extract a ligand (in our case the GDP) out of its binding pocket along computed NM. With these two new methods, we showed that a concerted motion of the α subunit would promote the opening of the pocket and the release of the GDP.Secondly, to refine our results, we performed free energy profiles reconstructions along several putative exit pathways of the GDP. Thus, we proposed for the first time a fine-tuned mechanism of GDP exit at the molecular scale and putative key-residues. We proposed also a molecular scale mechanism for the dissociation of the heterotrimeric G-protein through the use of the Targeted Molecular Dynamics (TMD). Finally we were interested in the study of the GPCR:G-protein complex. We performed two studies related to the activation and to the coupling of the macro-complex. We showed that G-protein constrain drastically the GPCR motions. One over-represented motion in the complex that was also retrieved in other crystallized structures of several different GPCRs thus suggested that this motion could be the putative activation motion of a GPCR when complexed to its favorite protein partners

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont les cibles de 50% des médicaments actuellement sur le marché pharmaceutique. La compréhension de leur mode de fonctionnement est donc essentielle au développement de nouvelles molécules capables de cibler spécifiquement ces récepteurs. Ces dix dernières années, les technologies de transfert d'énergie ont permis de révéler la capacité des RCPG, longtemps considérés comme monomériques, à s'organiser en dimères voire en structures oligomériques plus grandes. Toutefois, la caractérisation précise de cette stœchiométrie d'assemblage implique la mise au point de méthodes adaptées.
Au cours de ce travail de thèse nous avons développé une approche de FRET en temps résolu permettant de mettre en évidence, à l'aide d'anticorps marqués, des interactions de sous-unités de RCPG à la surface de cellules vivantes. En choisissant le récepteur GABAB comme modèle d'étude, cette approche a permis de révéler l'homo- et l'hétérodimérisation de ce récepteur à la surface cellulaire. De plus, en condition de perméabilisation des cellules, l'oligomérisation de la sous-unité GABAB1 retenue dans les compartiments intracellulaires a pu être caractérisée par cette même approche.
Afin d'analyser plus précisément l'organisation du récepteur GABAB, nous avons mis au point une deuxième méthode permettant de marquer irréversiblement à l'aide de fluorophores les sous-unités GABAB1 et GABAB2 présentes à la surface cellulaire. La combinaison de cette méthode de marquage (SNAP-tag) avec une analyse de FRET en temps résolu a permis de caractériser l'organisation oligomérique de ce récepteur. Ainsi, le récepteur GABAB, connu pour être un hétérodimère obligatoire, semble capable de former des oligomères via la sous-unité GABAB1 qui représente un point de contact entre deux hétérodimères. Le rôle d'une telle organisation sur la fonction de ce récepteur reste toutefois indéterminé.

L'objectif principal de ma thèse était de développer de nouvelles technologies et des outils pour l’étude de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR).À la surface de la cellule se trouve une multitude de récepteurs qui jouent un rôle critique dans la communication cellule-cellule, dont les GPCR, une famille de récepteur utilisant les protéines G intracellulaires pour transmettre leurs signaux. Le ciblage de ces récepteurs à des fins thérapeutique est innovant et très prometteur. Mais à ce jour seuls quelques médicaments ciblant les GPCR ont été mis sur le marché, en partie en raison d'un manque d'outils permettant le suivi de leur action sur les cellules natives.L’objectif de cette thèse est donc de développer des tests simples pour suivre l’activation de n’importe quel GPCR. Pour développer ce type de test, nous avons décidé d'utiliser des fragments d'anticorps appelés nanobodies. Les anticorps sont des protéines du sang produites en réponse à un antigène spécifique qui sont capable de le neutraliser. Les nanobodies correspondent au domaine variable de certains anticorps de camélidés. En raison de leur faible taille (13 kDa) et de leur site de liaison à l'antigène réduit, les nanobodies se lient souvent à des cavités et présentent une grande sensibilité aux changements de conformation de l'antigène
The main objective of my thesis was to develop technologies and tools to study activation of G protein-coupled receptors (GPCRs).The cell surface is displaying a multitude of receptors, who play critical roles in cell-cell communication. Among them, GPCRs represent a large family relying on the use of intracellular G proteins for their signaling. Targeting these receptors for therapies is very promising and innovative. So far, only few new drugs have been put on the market, partly due to a lack of tools enabling the follow-up of their action on native cells.The aim of this thesis is thus to develop simple assays to study activation of any GPCRs. To develop this kind of test, we used antibody fragments called nanobodies. Antibodies are blood protein produced in response to and counteracting a specific antigen. Nanobodies correspond to antibody fragments derived from the variable domain of a special class of camelid antibodies. Because of their small size (13 kDa) and reduced antigen binding site, nanobodies often bind cavities and show a high sensitivity to antigen conformational changes

Les récepteurs couplés aux protéines G sont une classe extrêmement importante de cibles thérapeutiques. L'un des défi important pour comprendre leur rôle physiologique et éventuellement physiopathologique est notamment de disposer de ligands puissants, sélectifs et éventuellement traçables. Au court de ces travaux de thèse ont ainsi été synthétisés des ligands pour le sous-type dopaminergique D3, impliqué dans des pathologies comme l'addiction, la schizophrénie ou la maladie de Parkinson. Nous avons développé une nouvelle famille originale de molécules dérivées d'un ligand de référence, le BP 897, dans le but d'augmenter la sélectivité vis-à-vis du sous-type D2. Des voies de synthèse rapides et efficaces pour accéder à des dérivés traçables du BP 897 ont également été mises au point. Ainsi, la synthèse de deux précurseurs radio-marquables devrait permettre d'étudier par tomographie d'émission de positons la distribution et l'occupation cérébrale du récepteur D3. Par ailleurs nous avons tenté de mettre au point un nouveau test de criblage basé sur le transfert par résonance d'énergie de fluorescence afin de tester facilement, rapidement, à moindre coût et sans danger, des chimiothèques sur le récepteur D3. Ceci devrait permettre la découverte de nouvelles molécules d'affinité, de sélectivité, d'efficacité et de structure chimique variées. Ainsi, cinq dérivés ou analogues fluorescents du BP 897 ont été synthétisés dont l'un pourrait servir de ligand marqué de référence pour le criblage. Enfin, nous avons développé une stratégie de découverte du premier ligand de nouvelles cibles issus du décryptage du génome, les récepteurs orphelins, dont l'implication physiopathologique reste à explorer. Dans l'optique de générer une chimiothèque ciblée pour le criblage, a été mise au point une voie de synthèse sur support solide autour d'un motif très courant dans de nombreux ligands : arylpipérazine
The G protein-coupled receptors are an extremely significant class of therapeutic targets. One challenge is to design potent, selective and possibly labelled ligands to understand the physiological and physiopathological role of these receptors. In the present study, ligands were thus synthesized for the dopaminergic D3 subtype, involved in pathologies such as addiction, schizophrenia or Parkinson's disease. We designed a new original family of molecules derived from BP 897, with the aim of increasing the D3 versus D2 selectivity. Fast and effective synthesis routes were also developed to provide labelled derivatives of BP 897. Thus, the synthesis of two precursors for positrons emission tomography should allow the study of the cerebral distribution and occupancy of the D3 receptor. In addition, we tried to develop a new screening test based on fluorescence resonance energy transfer in order to screen libraries on the D3 receptor in a simple, fast, cheap and safe way. This should allow the discovery of new molecules with varied affinity, selectivity, efficacy and chemical structure. Thus, five fluorescent derivatives or analogues of BP 897 were synthesized, among which one could be used as the labelled ligand for screening. Lastly, we developed a strategy for the discovery of the first ligand of new targets resulting from decoding of the genome, the orphan receptors, whose physiopathological implication remains to be explored. In an attempt to generate a targeted library for screening, a route was developed for the solid-phase synthesis of molecules containing arylpiperazine, a current scaffold in many ligands

Le récepteur du Glucagon Like Peptide-1 (GLP-1R) appartient aux Récepteurs Couplés aux Protéines G et constitue une cible très prometteuse pour le traitement du diabète et des maladies neurodégénératives chroniques. Afin de découvrir des modulateurs allostériques de GLP-1R, un essai de criblage basé sur le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a été développé. L’identification de tels ligands a été privilégiée en établissant l’essai FRET sur le récepteur orphanisé, c'est-à-dire délété du site de liaison du peptide endogène par suppression de l’extrémité N-terminale. Le criblage a conduit à la sélection de plusieurs composés allostériques se fixant dans le corps central de GLP-1R. Leur caractérisation fonctionnelle a montré qu’ils potentialisaient la réponse du peptide endogène et qu’ils induisaient in vitro une augmentation de la sécrétion d’insuline dans les cellules . Ces nouveaux ligands ouvrent ainsi des perspectives intéressantes pour le traitement du diabète de type 2
The Glucagon-Like-Peptide-1 Receptor (GLP-1R) belongs to the G protein coupled receptor family and represents a promising target for the treatment of chronic neurodegenerative disorders and diabetes. A screening assay based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) technology was developed to identify a new class of ligands. To look specifically for allosteric modulators, FRET assay was established on the orphanised GLP-1R: the receptor was deleted from its endogenous agonist binding site by truncation of the N-terminal domain. The screening campaign led to the discovery of several allosteric compounds binding the GLP-1R transmembrane region. The functional characterization revealed that some of them act as positive allosteric modulators by enhancing agonist-stimulated responses. These allosteric compounds of GLP-1R also potentiate the insulin release of pancreatic -cells in vitro and therefore offer new perspectives for the treatment of type 2 diabetes

La physiologie neuronale dépend étroitement de la polarisation de distribution des composants entre axones et dendrites. Comprendre les mécanismes qui dirigent le trafic et l'adressage de molécules vitales comme celle de la famille des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) est primordial. Cependant, bien que les mécanismes régissant le trafic des RCPG neuronaux après activation par un agoniste soient bien décrits, leur adressage à la membrane reste mal connu. Or, leur état conformationnel basal semble jouer rôle crucial dans leur adressage. Grâce au développement de nouveaux outils et à l'établissement d'une modélisation mathématique de la relation entre état d'activation et trafic intracellulaire, nous avons pu valider le rôle de l'activité constitutive du récepteur modèle cannabinoïque CB1 dans l'apparition d'un cycle spontané d'endocytose et de recyclage au sein des cellules HEK-293 et dans l'adressage et la plasticité des phénotypes de distribution des récepteurs neuronaux.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines membranaires responsables de la transduction de signaux de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Localisés partout dans l'organisme, ils sont impliqués dans de très nombreuses fonc tions physiologiques comme la vision, l'olfaction, la croissance et l'adhésion cellulaire, la régulation hormonale, etc. Ils sont cibles d'une grande diversité de ligands : des photons, des ions, des amines biogènes, des hormones, des glycoprotéines, des molécules odorantes et gustatives, etc. Un RCPG est formé de 7 hélices α transmembranaires reliées par des boucles intra- et extra-cellulaires. Ces 7 hélices α délimitent une cavité. Les ligands se fixent soit dans cette cavité soit au niveau des boucles extra-cellulaires, activant le récepteur qui va se lier à une protéine G à l'intérieur de la cellule, initiant une cascade de réactions chimiques. Un seul RCPG a été cristallisé jusqu'µa présent, la rhodopsine bovine, apportant une information structurale précieuse. Les RCPG présentent un grand intérêt pharmacologique. Leur diversité et les nom- breuses fonctions qu'ils contrôlent les font intervenir dans de nombreuses pathologies. Plus de 30% des nouveaux médicaments mis sur le marché ciblent des RCPG. De plus, beaucoup de RCPG sont encore orphelins, c'est-à-dire sans ligand connu, et possèdent donc un fort potentiel pharmacologique. Les RCPG forment une super-famille de plus d'un millier de membres, dont la grande majorité sont responsables de la perception des molécules olfactives. Le site de liaison de la plupart des RCPG est situé dans la cavité transmembranaire ; mais pour certains, le site est externe à la membrane et le ligand se fixe aux boucles extra- cellulaires. Mais même dans ces cas, les récepteurs possèdent une cavité transmembranaire et c'est sur elle que nous focalisons notre travail. Plusieurs classifications des RCPG ont déjà été proposées : phylogénétiques, basées sur des automates statistiques, sur des empreintes physico-chimiques ou sur la compo- sition en acides aminés. Mais aucune ne prend en compte précisément le point de vue pharmacologique, axé sur le ligand (le médicament). C'est pourquoi nous proposons une nouvelle classification des RCPG orientée phar- macologie. Elle est basée sur l'étude de résidus supposés critiques de la cavité trans- membranaire, qu'on pense interagir avec des ligands. Nous partons d'un jeu de données de 369 séquences de RCPG humains non-olfactifs, aussi (( propre )) que possible. Puis nous alignons les parties transmembranaires de fa»con automatique mais avec une étape de vérification et de raffinement manuels. Ensuite nous extrayons 30 résidus critiques en étudiant la cavité de la rhodopsine bovine, dont les parties transmembranaires ont une très forte identité avec celles de la rhodopsine humaine (94%). Nous supposons que ces 30 résidus sont critiques pour tous les RCPG, c'est-à-dire que la forme des cavités de tous les récepteurs est globalement conservée. Cette supposition est étayée par diverses publications. Enfin nous classifions ces séquences discontinues par une méthode de clustering hiérarchique agglomératif (la méthode UPGMA). Les distances entre séquences sont simplement les scores d'identité entre elles. Une procédure de bootstrapping vient apporter un poids statistique à la classification qui aboutit à 22 clusters bien distincts. Notre classification est en accord avec la classification GRAFS publiée récemment (analyse phylogénétique exhaustive de 342 RCPG humains non-olfactifs), c'est-à-dire que les clusters obtenus correspondent aux familles et sous-familles déjà identifiees, à quelques différences près. On peut appliquer cette classification à la recherche de nouvelles cibles pour des ligands partageant des sous-structures communes (on parle de structures privilégiées). Partant de ligands dont on connait des récepteurs, on recherche parmi les 30 résidus critiques de ces récepteurs ceux qui interviennent dans la liaison. Ensuite on recherche d'autres récepteurs qui partagent les mêmes résidus. On peut proposer ces nouveaux récepteurs comme cibles potentielles pour les ligands de départ. Une deuxième application immédiate de notre classification est la désorphanisation de récepteurs, c'est-à-dire la découverte d'un premier ligand pour un récepteur orphelin. Nous proposons comme point de départ pour un récepteur orphelin les ligands connus des récepteurs de la même classe. La pertinence d'une classification basée sur les cavités transmembranaires pour des récepteurs dont le site de liaison n'est pas la cavité est discutable. Pourtant nous constatons que les familles pour lesquelles le ligand se fixe à l'extérieur de la membrane (famille de classe secrétine et glutamate) sont très bien identifiées et séparées les unes des autres. Dans un deuxième temps, nous avons construit une autre classification des RCPG en utilisant, non plus les séquences, mais des modèles 3D des récepteurs, construits par homologie. Pour schématiser, nous recherchons le point de vue qu'aurait un ligand placé dans la cavité. Nous plaçons donc une sphère conceptuelle, qui représente le ligand, au centre de gravité de la cavité. Cette sphère est découpée en 80 éléments triangulaires, de même taille et disposés uniformément sur la sphère. Ensuite nous projetons, à partir du carbone β des résidus, des informations physico-chimiques et géométriques de la cavité dans les triangles qui intersectent la demi-droite partant du centre de la sphère et allant vers le carbone β du résidu considéré. Enfin nous comparons les sphères deux à deux, chaque comparaison donnant un score utilisé pour générer une matrice de distances et finalement une classification par la même méthode que précédemment. La méthode est assez floue (discrétisation peu poussée, projection à partir des carbones β et non à partir de tous les atomes) pour masquer les erreurs dues à la modélisation. Les modèles utilisés sont préalignés sur la structure qui a servi de point de départ, la structure cristallographique de la rhodopsine bovine. Malheureusement ces alignements ne sont pas suffisamment précis pour la génération d'une matrice de distances. Nous avons donc construit un outil d'alignement structural pour les raffiner. Cet outil est guidé par le score décrit ci-dessus pour trouver l'alignement entre deux cavités. Le meilleur score donnera le résultat de l'alignement. La classification est homogène avec la précédente, mais le nombre de récepteurs non classés (singletons) est plus grand. Intéressant est le fait que le récepteur DUFFY, non classé par notre précédente classification, est classé ici avec les récepteurs des chimiokines, en accord avec la classification de la base Swiss-Prot. Notre classification a en outre donné naissance à un outil d'alignement structural de cavité adapté au travail sur des modèles, mais qui peut aussi aligner des structures cristallographiques
G-protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins responsible for the transduction of signals from outside into the cell. Distributed in the whole body, they are implied in various physiological functions, like vision, olfaction, cellular growth and adhesion, etc. They are targeted by a tremendous diversity of possible ligands: photons, ions, biogenic amines, hormones, glycoproteins, olfactive and gustative molecules, etc. A GPCR is composed of 7 transmembrane α-helices linked together by intra- and extracellular loops. These 7 α-helices delineate a cavity. Ligands bind either in this cavity, or on the extracellular loops, activating the receptor that will link to a G-protein inside the cell, initiating a cascade of secondary messengers. Up to now, the bovine rhodopsin is the only known crystallographic structure, bringing a valuable structural information. GPCRs present a big pharmacological interest. Their diversity and the numerous functions they control get them involved in numerous pathologies. More than 30% of new commercialized drugs target GPCRs. Furthermore, many GPCRs are still orphan, without known ligand, and hence constitute potential pharmacological targets. GPCRs form a superfamily of more than one thousand members. Three out of four are involved in the perception of olfactive molecules. The binding site of most GPCRs is located in the transmembrane cavity; but for some of them, it is located outside the membrane and the ligand binds an extracellular loop. But even for these cases, all receptors show a transmembrane cavity on which we will concentrate during this work. Several classifications of GPCRs have been proposed: phylogenetic classifications, or based on statistical automata, or on physicochemical fingerprints, or based on their amino-acid composition. But none of them takes into account precisely the pharmacolo- gical point of view of the ligand (the drug). That's why we propose a new classification of GPCRs which is pharmacologically- oriented. It is based on the study of some residues of the transmembrane cavity supposed to be critical and to interact with the ligand. We start from a dataset of 369 sequences of human nonolfactory GPCRs, as \clean" as possible. Then we align automatically the transmembrane parts, but with a manual check following. Then we extract 30 critical residues by studying the cavity of bovine rhodopsin, which transmembrane parts share a high identity score with the human rhodopsin (94%). We suppose that these 30 residues are critical for all GPCRs, i. E. The fold of all GPCRs is overall conserved. This hypothesis is supported by several publications. Eventually, we classify these sequences by an agglo merative hierarchical clustering algorithm (UPGMA). The distances between sequences are simply the identity scores between them. A bootstrap procedure brings a statistical support to the classification, that leads to 22 well-defined clusters. Our classification agrees the recently published GRAFS classification (a phylogenetic analysis of 342 human non-olfactory GPCRs): resulting clusters correspond to already identified families and subfamilies, with slight differences. This classi¯cation can be applied to ¯nd new targets to ligands that share some common substructures (called priviledged structures). We start from ligands with known receptors, we seek among the 30 critical residues of these receptors those that participate to the binding. Then we seek for other receptors that share the same residues. We can eventually propose these new receptors as putative targets for the ligands we started with. A second straightforward application of the classification is the deorphanization of receptors, i. E. The discovery of a fisrt ligand for an orphan receptor. We propose, as a starting point for an orphan receptor, the known ligands of the receptors of the same cluster. The relevence of a classification based on the transmembrane cavities for receptors which binding site is not the this cavity is questionable. However we find that even the families for which the ligand bind outside the membrane (secretin and glutamate families) are well identified and well separated. In a second time, we built another classification of GPCRs, based on 3D homology models rather than on sequences. To simplify, we try to take the point of view of a ligand inside a cavity. We put a conceptual sphere, that stands for the ligand, at the center of gravity of the cavity. This sphere is tessellated into 80 triangles, with same size, homogenously dispatched. Then we project from the β carbon of the residues some phy sicochemical and geometrical information into the triangles. Eventually we compare the spheres, each comparison gives a score used to build a distance matrix and a classification with the same method as for the previous one. This method is quite fuzzy (low resolution discretization, projection from the β carbons and not from all atoms) to hide the errors due to modelling. The models are prealigned on the cristal structure of bovine rhodopsin. But unfortu- nately these alignments were not precise enough to build a distance matrix. So we coded a structural alignment tool to refine the alignments. This tool is guided by the previsouly- described score to find an alignment between two cavities. The best score gives the output alignment. The resulting clustering is homogenous with the previous one, but the number of non-classified receptors (singletons) is higher. Interestingly, the receptor DUFFY, not classified by our previous clustering, is classified here in the Chemokine cluster, in agree- ment with the Swiss-Prot database classification. Our classification leads to a structural alignment tool adapted to work on models, but that can also work on crystal structures

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) correspond à la plus grande famille de protéines membranaires chez l'homme et sont impliqués dans un nombre important de processus physiologiques. Ils ont la capacité de fixer une large gamme d'activateurs, parmi eux on retrouve les hormones, les neurotransmetteurs, les sucres, les protéines, les peptides, mais aussi l'énergie lumineuse. L'ICCR (anglais : « ion channel-coupled receptor ») est un récepteur ionotrope artificiel créé par la fusion d'un RCPG et d'un canal ionique Ktsub{ir}6.2. Lorsque le RCPG est activé par son ligand, celui-ci va subir des changements conformationnels, directement transmis au canal. Cela va donc entrainer une modification de son flux d'ions, pouvant facilement être mesurer par la technique TEVC (anglais : « two-electrode voltage-clamp »).Grâce au vaste répertoire de RCPG naturels, cette famille convient parfaitement pour des applications de biocapteurs. Dans l'équipe, plusieurs ICCR ont déjà été créés à partir de différents récepteurs, par exemple les récepteurs muscarinique M2 et dopaminergique D2. Le but de cette thèse a été d'élargir cette gamme d'ICCR à la famille des récepteurs olfactifs.Malgré le fait que la famille des récepteurs olfactifs représente presque la moitié de tous les RCPG chez l'homme, ces derniers sont également les récepteurs les moins connus et étudiés. Étant capables de détecter, souvent en très faibles concentrations, la présence dans l'air de composés organiques volatils, ils sont aussi idéaux dans le cadre du développement de biocapteurs. En effet, cette capacité à détecter des composés en phase gazeuse, offre de grandes possibilités afin de créer des outils de diagnostique non invasifs, ou encore de créer des biocapteurs dans le cadre d'analyses environnementales.Durant ce travail, des difficultés se sont présentées pour l'expression hétérologue des ICCR dans les ovocytes de Xénopes. De ce fait, des efforts poussés ont été réalisés afin optimiser l'expression. En premier lieu, l'expression des ICCR dans des cellules d'insecte a été testée permettant une expression bien plus importante que précédemment testé dans les ovocytes. Dans un second temps, la caractérisation d'un RCPG chimérique, créé de la fusion de deux RCPG différents a été testé, donnant lieu à un RCPG fonctionnel. Ce travail offre une porte d'entrée intéressante pour le développement de nouveaux ICCR ou bien des RCPG
G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of human membrane proteins, and are responsible for controlling many physiological functions. The range of activators and ligands is unparalleled, these include, hormones, neurotransmitters, sugars, proteins, peptides, and light energy. The ion channel-coupled receptor (ICCR) is an artificial ligand-gated ion channel, based on the fusion of a GPCR and the Ktsub{ir}6.2 ion channel. When the GPCR component is activated by its ligand, conformational changes are passed from the receptor to the channel, altering its flow. This effect can be easily measured by two-electrod voltage-clamp.Due to the huge repertoire of naturally-occurring GPCRs, these molecular sensors are ideal for use in biosensors. Many ICCRs have already been created from different GPCRs, such as for the Muscarinic M2 and Dopamine D2 receptors. The aim of this work is to expand the ICCR technology into the realm of olfactory receptors.Olfactory receptors are some of the least well-studied GPCRs, despite the fact they represent about half of the entire GPCR family in humans. Olfactory receptors are also some of the most interesting, when considering biosensing applications. They are able to detect, sometimes at extremely low concentrations, volatile organic compounds present in the air. This ability to detect compounds within a gaseous phase presents opportunities for the fields of non-invasive diagnostic, and environmental analysis.Difficulties with the heterologous expression of olfactory receptors were encountered, and so efforts were made to develop the technique in new directions. First attempts were made at expressing ICCRs in insect cells were carried out, and the proteins seemed to express very well. Furthermore, the characterisation of a chimeric receptor, based on the fusion of two GPCRs was attempted, and this chimeric receptor was shown to be functional. This work could provide a way to easily create new ICCRs

L’apoptose est un processus dont l’importance physiologique et pathophysiologique est de mieux en mieux appréciée. Si plusieurs mécanismes expliquant son initiation et son exécution ont été décrits, les détails de sa régulation fine restent à être précisés. Par ces travaux, nous démontrons une interaction directe entre la protéine pro-apoptotique Siva1 et la queue C-terminale de plusieurs récepteurs couplés aux protéines G, incluant TP, IP, PAF, AT?R et CHRM3. Pour TP, nous prouvons que la stimulation du récepteur par le U46619 entraîne une translocation et une accumulation cytoplasmique de Sival, ainsi qu’une modulation de ses interactions avec Mdm2, XIAP et TRAF2, résultant en une induction de l’apoptose. Nous rapportons également que l’expression de Siva1 potentialise l’ubiquitinylation de TP en réponse à une stimulation et que cette ubiquitinylation n’affecte ni la dégradation, ni l’internalisation du récepteur. Nous démontrons par ailleurs que la stimulation de TP diminue l’expression totale d’i?B?, l’inhibiteur principal de la voie NF?B et que cet effet corrèle avec le niveau d’expression de Siva1. En démontrant l’existence d’un complexe entre TP et TRAF2 suite à une stimulation réceptorielle, nous proposons que la modulation NF?B par TP pourrait résulter d’une signalisation dépendant de l’ubiquitine et analogue à celle des TNFR. D’autre part, nous présentons une interaction entre Siva1 et l’arrestine et apportons des données suggérant que l’expression de Siva1 pourrait moduler l’activation des MAPK. Nous proposons finalement un modèle réconciliant les fonctions anti- et pro-apoptotiques de TP et dans lequel le phénotype final d’une stimulation dépendrait de l’expression relative de Siva1. Les corolaires de ce modèle pourraient possiblement bonifier la prise en charge d’incidents ischémiques comme l’infarctus du myocarde ou l’accident vasculaire cérébral, et améliorer le traitement du cancer par une diminution de la toxicité d’agents chimiothérapeutiques et l’amélioration de la sensibilité tumorale.[symboles non conformes]

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) contrôlent l'activité physiologique de la majorité des cellules. Ils constituent la cible privilégiée de la plupart des drogues et de plus de 50 % des médicaments connus. Nous décrivons dans cette thèse les progrès réalisés dans l’expression et la purification d’un certain nombre de ces récepteurs membranaires. Nos RCPG, issues de la collection MePNet, ont été exprimés dans le système Pichia pastoris avec un epitope FLAG et un tag 10xHis en N-ter, et une extrémité C-ter biotinylée. De nombreux essais de purification, combinant plusieurs types de résines, n’ont malheureusement permis de ne récupérer qu’une très faible fraction des récepteurs exprimés. Dans un deuxième temps, l’utilisation en « batch » de billes couplées à la streptavidine nous a cependant mené vers des essais de cristallogenèse. Nous avons enfin cherché à stabiliser certains de ces récepteurs en les fusionnant en C-ter avec une sous-unité Gα ou bien en N-ter avec OmpA
G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters. Consequently, they constitute the largest family of pharmaceutical targets. Here, we report progress made in expressing and purifying mammalian GPCRs from the MePNet collection in the methylotrophic Pichia pastoris yeast expression system. Beginning initially with flask cultures and subsequently with medium cell density fermentor cultures, GPCRs, expressed with N-ter FLAG epitope and decahistidine, and C-ter biotinylation fusion tags, were subjected to various purification methods. The use of home made streptavidine-coated beads in batch gave the most success in purifying these GPCRs. After having checked their oligomerization state, three dimensional crystallization trials were conducted by using the sitting-drop technique. Other approaches included generating fusion proteins to enhance expression and stability, and to increase the amount of hydrophilic surface area