Dissertations / Theses on the topic 'Récepteurs β-adrénergiques'

La mucoviscidose (CF) est une maladie génétique due à des mutations dans le gène cftr (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). La mutation la plus fréquente est la délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del). Il est admis que CFTR est régulé par les récepteurs β-adrénergiques (β-AR). Seuls β1 et β2-AR ont été décrits dans les poumons humains avec une majorité de β2-AR. Dans les voies aériennes de patients CF, une diminution des β-AR a été rapportée sans distinction des sous-types. De plus, β2-AR interagit physiquement avec CFTR via la protéine NHERF1 (Na+/H+ exchanger regulatory factor 1). Le 1er objectif de ce travail a été de caractériser la présence des 3 sous-types de β-AR dans les bronches humaines : nous montrons pour la 1ère fois que β3-AR est exprimé en plus de β1 et β2-AR dans les bronches humaines. Le 2nd objectif a été de comparer l'expression des β-AR et de NHERF1 sur des bronches de patients non-CF et CF : chez les patients CF, il est observé une diminution de l'expression de β2-AR et NHERF1 alors que β3-AR est surexprimé. A partir de ces résultats, le 3ème objectif a été de comparer les effets de stimulations chroniques β2 ou β3-AR sur l'expression des 3 sous-types de β-AR et sur l'expression de l'activité de CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques humaines exprimant le CFTR sauvage (16HBE14o-) ou F508del (CFBE41o-) : les traitements augmentent l'activité basale du CFTR-F508del sans modifier l'expression des β-AR. La surexpression de NHERF1 restaure l'expression du CFTR-F508del in vitro. Le 4ème objectif a été d'étudier les effets de la surexpression de NHERF1 sur l'expression de CFTR chez la souris homozygote F508 del
Cystics fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations in the cftr (CF transmembrane conductance regulator) gene. The most frequent mutation is the delection of phenylalanine at the position 508 of the protein (F508del). It has been described that CFTR is regulated by β-adreno ceptors (β-ARs). Only β1 and β2-AR has been observed in human airway with β2-AR being the predominant subtype. In CF bronchi a decrease of global β-ARs expression has been reported without distinction of subtypes. Moreover, β2-AR physically interact with CFTR via NHERF1 (NA+/H+ exchanger regulatory factor 1), a chaperone protein. The 1st aim of this study is to characterize the expression of all β-ARs subtypes in human bronchi samples : we show for the first time that β3-AR is expressed in human lung as well as β1 and β2-ARs. The 2nd aim is to compare β-ARs and NHERF1 expression in non-CF and CF bronchi samples : in CF bronchi sample, we demonstrate an under-expression of β2-AR and NHERF1 but a β3-AR over-expression. From those results, the 3nd aim of this study is to compare the effects of chronic β2 or β3-AR stimulations on all β-ARs subtypes expression and on CFTR expression and activity in human bronchial epithelial cell lines expressing wild-type (16HBE14o) or F508del-CFTR (CFBE41o-) : both treatments increase F508del-CFTR basal activity but do not affect β-ARs expression. As our team has reported that NHERF1 over-expression restores F508del-CFTR expression in vitro, the 4th aim of this thesis is to assess the effects of NHERF1 over-expression on CFTR expression in a mouse model homozygous for F508del

Il est maintenant clairement etabli que la desipramine, en administration repetee chez le rat, induit une hyposensibilite des recepteurs beta-adrenergiques centraux. Cependant, une meilleure caracterisation de ces recepteurs s'avere necessaire pour tenter d'identifier le mode d'action de cet antidepresseur. Deux sous-types de recepteurs beta-adrenergiques, betal et beta2, coexistent dans le systeme nerveux central. Nos travaux sur neurones et astrocytes isoles a partir d'encephale de rat montrent que leur repartition est variable suivant les regions cerebrales mais egalement suivant le type cellulaire. Les recepteurs beta1-adrenergiques sont minoritaires dans le cervelet (10%), majoritaires dans le cerveau (85%) ou ils representent 81% des sites astrocytaires et 66% des sites neuronaux. Les recepteurs beta-adrenergiques peuvent presenter deux etats conformationnels de basse et haute affinites pour les agonistes beta-adrenergiques. La conformation de haute affinite du recepteur est regulee par le gtp, elle est donc sous la dependance des proteines g. Notre etude sur cellules isolees indique que seuls les recepteurs beta-adrenergiques neuronaux presentent ces deux etats de conformation ; les recepteurs beta-adrenergiques astrocytaires sont tous en etat de basse affinite. Ces resultats suggerent que les recepteurs beta-adrenergiques sont differemment couples a ces proteines dans les neurones et les astrocytes. La destruction selective de l'un ou l'autre type cellulaire montre que la stimulation de l'adenylate cyclase par les agonistes beta-adrenergiques est essentiellement gliale, elle serait donc induite par des sites de basse affinite. Les recepteurs beta-adrenergiques neuronaux qui interagissent avec les proteines g pourraient donc etre couples a un autre effecteur que l'adenylate cyclase dans ces cellules. Celui-ci serait implique dans le mecanisme d'action des antidepresseurs puisque les resultats obtenus demontrent que l'administration chronique de desipramine chez le rat affecte aussi bien les recepteurs beta-adrenergiques astrocytaires que neuronaux

Parmi les modifications myocardiques induites par l'entraînement d'endurance, la bradycardie, l'amélioration de la fonction diastolique et le développement d'une hypertrophie cardiaque sont les plus connues. Nous avons démontré dans nos différentes études que des modifications de l'expression des β AR semblent être impliquées dans les adaptations cardio-vasculaires observées lors de l'hypertrophie cardiaque liée à l'entraînement. D'autres facteurs interviennent également pour expliquer ces adaptations cardiaques fonctionnelles et morphologiques. Parmi ceux-ci, il faut notamment citer des adaptations tissulaires impliquant l'amélioration de la vascularisation artérielle sans changement dans la densité du collagène. Ces différents éléments soulignent le caractère physiologique et bénéfique des modifications induites par l'entraînement en endurance. Les études expérimentales réalisées au niveau cardiaque, et présentées dans ce mémoire ont essayé autant que faire se peut d'étudier les différents niveaux d'organisation de l'organisme (cellule-tissu-organe), susceptibles de subir certaines modifications liées à l'entraînement
Among myocardial modifications induced by aerobic physical training: a bradycardia, an improvement of diastolic function and a developed cardiac hypertrophy are the well known. We demonstrated in our different studies that expression modifications of β AR seem to be involved in the cardiovascular adaptations observed during cardiac hypertrophy linked to training. Others factors also take place to explain morphological and functional cardiac adaptations. Among them, we can note tissular adaptations involving increased arteries number, without change in collagen density. These different elements emphasize the physiological and beneficial pattern of modifications induced by endurance training. The experimental studies realised on heart, and presented in this thesis, tried to elucidate the different organisation levels of organism (cell-tissu-organ), liable to be subject to some modifications linked to training

La voie β-adrénergique (β-AR)/AMPc est cruciale pour l’adaptation de la fonction cardiaque. Dans l’insuffisance cardiaque (IC), cette signalisation est perturbée et une part importante des patients meurt de troubles du rythme. Classiquement, les effets inotrope et lusitrope positifs de l’AMPc sont attribués à la phosphorylation par la protéine kinase AMPc dépendante (PKA) des protéines clés du couplage excitation–contraction (CEC). L’AMPc active aussi le facteur d’échange Epac, impliqué dans l’hypertrophie cardiaque et le contrôle de l’homéostasie calcique. Une cible d’Epac est la CaMKII, une kinase modulée par le Ca2+ et la calmoduline qui phosphoryle aussi les protéines clés du CEC, et dont l’activation est pro-arythmique.Les phosphodiestérases (PDEs) de type 3 et 4 sont majeures pour dégrader l’AMPc et contrôler l’homéostasie calcique et le CEC. Les inhibiteurs de PDE3 sont de puissants cardiotoniques mais leur utilisation est limitée par leurs effets pro-arythmiques. De plus, l’invalidation de gènes codant pour PDE4 conduit à des arythmies ventriculaires. Mon travail a permis d’identifier les perturbations de l’homéostasie calcique responsables de la survenue d’arythmies lorsque l’activité des PDE3 et des PDE4 est diminuée. Mes résultats montrent que les inhibiteurs de PDEs exercent des effets inotropes via PKA, mais suscitent des vagues de Ca2+ pro-arythmiques impliquant la PKA et la CaMKII activée en partie via Epac. Ceci suggère l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de CaMKII comme compléments aux inhibiteurs de PDEs pour limiter leurs effets délétères, une hypothèse que j’ai pu vérifier dans un modèle porcin plus proche du patient
The β-adrenergic pathway (β-AR)/cAMP is crucial for the adaptation of the cardiac function upon stress. In heart failure (HF), this signaling pathway is disrupted and a significant proportion of patients dies of cardiac arrhythmias. Classically, the inotropic and lusitropic effects of cAMP are attributed to the phosphorylation by the cAMP-dependent protein kinase (PKA) of the key proteins of the excitation-contraction coupling (ECC). cAMP also activates the exchange factor Epac, which is involved in cardiac hypertrophy and controls intracellular Ca2+ homeostasis. Epac activates CaMKII, another kinase modulated by Ca2+ and calmodulin which phosphorylates the same key proteins of the ECC, and is involved in arrhythmogenesis.Phosphodiesterases (PDEs) type 3 and 4 are crucial enzyme to degrade cAMP and to control Ca2+ homeostasis, thus ECC. PDE3 inhibitors are potent cardiotonic drugs but their use is limited by their pro-arrhythmic effects. Furthermore, the invalidation of genes encoding PDE4 results in ventricular arrhythmias. My work allowed characterizing the perturbations of Ca2+ homeostasis which lead to arrhythmias when PDE3 and PDE4 activities are decreased. My results show that PDE inhibitors exert inotropic effects via PKA, but evoke pro-arrhythmic Ca2+ waves via both PKA and CaMKII, the latter being activated in part via Epac. Altogether, these results suggest the potential use of CaMKII inhibitors as adjuncts to PDEs inhibitors to limit their deleterious effects, a hypothesis I also tested in a porcine model closer to the patient

L’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique (HTAPi) se caractérise par une une augmentation des résistances vasculaire, une augmentation de la PAPm et à long terme une insuffisance ventriculaire droite. La dysfonction endothéliale est l’événement initial de la maladie. Elle résulte d’un déséquilibre de synthèse des molécules vasoactives, d’un défaut de production de facteurs de croissance. Ces perturbations affectent directement le muscle lisse adjacent qui en réponse produit une vasoconstriction et une prolifération excessive. Le muscle lisse possède également ses propres anomalies intrinsèques contribuant à amplifier son phénotype vasoconstrictif et prolifératif. Actuellement, les thérapeutiques de l’HTAP ne permettent pas de corriger le remodelage vasculaire et les données cliniques soulignent leur manque d’efficacité en ce qui concerne la survie des patients. Ces travaux de doctorat ont visé à proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette optique, nous nous sommes intéressés à l’implication de la kinase Src dans la pathogenèse de l’HTAP. Nous avons montré que l’augmentation du niveau de Src dans les CML-AP été associée au développement de l’HTAPi. Aussi, nous avons montré que l’inhibition de Src, avec des molécules spécifiques, prévient la prolifération des CML-AP in vitro et réverse l’HTAP dans un modèle expérimental induit par la monocrotaline. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’inhibition des récepteurs adrénergiques dans l’HTAP. Nous avons comparé les effets du nébivolol, un β-bloquant de troisième génération qui possède des propriétés vasodilatatrices, aux effets du métoprolol, un β-bloquant de deuxième génération. Nous avons montré que le nébivolol, contrairement au métoprolol, a des effets positifs sur la dysfonction endothéliale, la relaxation des artères pulmonaires et sur le modèle expérimental de l’HP induite par la monocrotaline. Ainsi au cours de ce doctorat, nous avons caractérisé deux stratégies thérapeutiques différentes qui ont montré toutes deux un potentiel intéressant pour le traitement de l’HTAP
Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension (iPAH) is characterized by an increased vascular resistance, increase pulmonary artery pressure, and at long term, a right ventricular failure. Endothelial dysfunction is the initial event of this pathology. It is a result of altered vasoactive molecules synthesis, altered growth factors production. These alterations directly affect the neighboring smooth muscle which produces an important vasoconstriction and a significant proliferation. Also, the smooth muscle has its own intrinsic abnormalities that participate in its vasoconstriction and proliferation phenotypes.It is to note that to date, PAH treatment strategies do not improve the vascular remodeling. Moreover, clinical results show no efficiency of these treatments on patient survival. Accordingly, this thesis studies have targeted new and better therapeutic approaches. To this aim, we have fist oriented our research toward the involvement of Src kinase in PAH pathology. We found that increased Src level in the Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells (PA-SMC) was associated with PAH development. Also, we have showed that, in vitro, Src inhibition, with specific molecules, prevent PA-SMC proliferation and revert PAH in a monocrotaline-induced experimental model. The second aim of this thesis work was oriented toward beta-adrenergic receptor inhibition in PAH. We have compared the effect of both the nebivolol, which is a third generation of b-blockers that has a vasodilation proterties, and metoprolol, which is a second generation of -blockers. Our results show that, as opposite to metoprolol, nebivolol has positive effects on endothelial dysfunctions, pulmonary artery relaxation, and on monocrotaline-induced PH in rats.Therefore, during this thesis, we have characterized two different therapeutic strategies that both show interesting potential in PAH treatment

L'expression fonctionnelle du récepteur β3-adrénergique dans le myocarde humain a récemment été décrite. La stimulation de ce récepteur provoque une diminution de la force de contraction, réponse opposée à celle de la stimulation β1- et β2-adrénergique. Cet effet inotrope négatif implique une protéine Guo sensible à la toxine pertussique (PTX). Nous avons montré que cet effet contractile résulte de l'activation d'une NO synthase (NOS) et de l'augmentation du taux de GMPc intracellulaire. Dans un système d'expression recombinant, nous avons identifié le premier effecteur canal ionique du récepteur β3-adrénergique, le canal chlore CFfR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). La régulation de CFfR par le récepteur β3-adrénergique est indépendante de la voie AMPc/PKA, mais implique une protéine Giio sensible à la PTX. Nos résultats suggèrent que cette régulation ne nécessite pas l'activation d'une NOS, ni la présence d'une protéine cytosolique, le NHE-RF (Na+IH+ Exchanger Regulator Factor). L'activation du courant chlore CFfR pourrait expliquer, au moins en partie, la diminution de la durée du potentiel d'action induite par la stimulation B3-adrénergique. Par une approche pharmacologique, nous avons également mis en évidence l'expression fonctionnelle du récepteur β3-adrénergique dans l'aorte de rat. Sa stimulation induit une vasorelaxation dépendante de l'endothélium, de l'activation d'une NOS endothéliale et d'une augmentation du taux de GMPc intracellulaire. La caractérisation du récepteur β3-adrénergique dans le système cardio-vasculaire nous a permis de mettre en évidence de nouvelles voies de signalisation de ce récepteur
A functional β3-adrenoceptor has been recently described in the human heart. The β3- adrenoceptor stimulation, in contrast to that of β1- and β2-adrenoceptors, decreases cardiac contractility through a pertussis toxin (PTX) sensitive Guo protein. We have shown that this negative inotropic effect involves a NO Synthase (NOS) activation and an increase in intracellular cGMP level. For the first time, a channel, CFfR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), is described as a β3-adrenoceptor effector. Furthermore, we have shown, in a heterologous mammalian expression system, that the regulation of CFfR chloride conductance by the β3-adenoceptor is independent of the cAMP/PKA pathway, but involves a PTX sensitive Giio protein. We also suggest that this regulation is not mediated by NOS and does not imply the cytosolic protein NHE-RF (Na+IH+ Exchanger Regulator Factor). Activation of CFfR could explain in part the decrease in action potential duration induced by the β3-adrenoceptor stimulation. Pharmacological tools allowed us to demonstrate that the β3-adrenoceptor is expressed in the rat aorta. The β3-adrenoceptor stimulation induces a vasorelaxation which depends on the endothelium and is mediated through the activation of a NOS pathway and an increase in intracellular cGMP level. The β3-adrenoceptor characterization in the cardiovascular system provides new cellular coupling pathways for this receptor

L'amphétamine induit chez le rat une sensibilisation comportementale qui se traduit par une augmentation de la réponse motrice à ce psychostimulant. Les neuroadaptations sous-tendant ce phénomène, qui seraient aussi impliquées dans le comportement compulsif de recherche de drogue, ont surtout été associées au système dopaminergique issu de l'aire tegmentale ventrale (ATV). Cependant, d'autres systèmes de neurotransmetteurs contribueraient également à la sensibilisation. Dans ce travail, nous avons montré que la transmission -adrénergique centrale, en particulier dans le noyau du lit de la strie terminale, est nécessaire à l'activation neuronale précoce et l'initiation de la sensibilisation comportementale induites par l'amphétamine. Nous avons de plus identifié les neurones projetant à l'ATV et activés par cette drogue. Ce travail a ainsi permis de mettre en évidence de nouveaux circuits et substrats neuronaux potentiellement engagés dans les effets à long terme des psychostimulants

Le récepteur β-adrénergique des érythrocites de dinde a été identifié et caractérisé par deux approches, l'une biochimique et l'autre immunochimique et des nouveaux outils ont été développés pour l'étude des relations structure-fonction du récepteur. Le récepteur β-adrénergique des membranes d'érythrocites de dinde a été identifié par le ligand photoactivable iodocyanopindolol-diazirine marqué à l'iode 125. Deux polypeptides de masse moléculaire apparente 50kDa et 42kDa ont été marqués de manière spécifique. Le polypeptide de 42kDa provient du polypeptide de 50kDa par une protéolyse qui s'accompagne de la perte de la chaine glycosylée située sur l'extrémité N-terminale de la forme 50 kDa. Après solubilisation par la digitonine, le polypeptide de 42kDa a été purifié à homogénéité en deux étapes : par chromatographie d'affinité sur un gel où a été immobilisé l'antagoniste alprénolol, puis par électroélution d'un gel de polyacrylamide. Le site de fixation du ligand photoactivable iodocyanopindolol-diazirine a pu être localisé dans la région contenant les domaines transmembranaires VI et VII et serait un résidu acide aspartique. Des anticorps ont été produits contre les récepteurs β-adrénergiques. Après immunisation avec du récepteur β₁-adrénergique partiellement purifié à partir des érythrocites de dinde, un anticorps monoclonal a été sélectionné; celui-ci immunoprécipite le récepteur marqué par affinité et reconnait le récepteur en immunoempreinte. Il semble dirigé contre un épitote intramembranaire ou cytoplasmique. Après la détermination des séquences des récepteurs β₁-adrénergiques de dinde et des récepteurs β₁ et β₂-adrénergiques humains, des anticorps ont été produits contre des peptides synthétiques dérivés de ces séquences. Ces peptides sont situés sur des boucles intra-ou extracellulaires d'après le modèle de repliement transmembranaire des récepteurs β-adrénergiques qui a été proposé d'après le profil d'hydropathicité de ces protéines. Ces anticorps reconnaissent les récepteurs entiers dénaturés. Les anticorps dirigés contre la deuxième boucle extra-cellulaire du récepteur β₁-adrénergique humain interfèrent avec la liaison du ligand agoniste isoprotérénol sur le récepteur. Ces anticorps anti-peptides, ainsi que le marquage par affinité, ont été utilisés pour caractériser les récepteurs β-adrénergiques exprimés dans la bactérie Escherichia coli après fusion des génes codant pour les récepteurs β-adrénergiques avec le gène lamB codant pour la protéine de la membrane externe de la bactérie LamB. Ainsi ont également pu être localisés la protéine de fusion et le récepteur actif dans les différents compartiments cellulaires de la bactérie.

Le système nerveux sympathique (SNS) a été identifié à être progressivement activé dans de nombreuses maladies cardio-vasculaires, du processus chroniques différents, y compris l'hypertension et de cardiomyopathie, à l'insuffisance cardiaque congestive[82,156,412-414]. L'hyperactivité du système nerveux sympathique peut modifier le nombre, la fonction et la voie de signalisation en aval des récepteurs β-adrénergiques. Bien qu'il n'yait pas de mécanisme unifié pour interpréter ces découvertes divergentes, des anomalies de calcium ont été reconnu comme une cause fondamental de la fonction systolique défectueuse du ventricule gauche [82]. Le niveau de calcium intracellulaire est directement impliqué dans l'interaction entre l'actine et la myosine, qui controle la contractilité du muscle. Les stimulations des récepteurs β-adrénergiques peuvent induire des réponses inotropes / lusitropes positifs par la production d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et l'activation de la protéine kinase A (PKA). Le calcium de type transitoire est augmenté suite à la phosphorylation des protéines ciblées (cannaux calciques, récepteurs de la ryanodine, SERCA2a et troponine). Dans les conditions physiologique, la dysfonctionnement des récepteurs β-adrénergiques peut être un mécanisme commun de la réduction de la fonction cardiaque. Dans ce contexte, nous avons effectué des expériences au sujet de la voie de stimulation β-récepteurs adrénergiques en deux états physiopathologiques différents, cardiomyopathie du syndrome métabolique et de personnes âgées.La première expérience est menée au sein de rats sénescents. Au coeur sénescent, un dysfonctionnement diastolique et une réponse réduite à la stimulation β-adrénergiques ont été identifiés, qui sont associés à une sous-expression des récepteurs β1- et β2-adrénergiques, ainsi qu’à une sur-expression des récepteurs β3-adrénergiques.[73,415,416] Ces changements permettent de réduire la production d'AMPc ou facilitent l'hydrolyse de l'AMPc. Ainsi, un mécanisme complémentaire de la régulation de l'AMPc a été impliqué dans le cœur. La protéine de multirésistance 4 (MRP4) joue un rôle important dans la régulation de l'AMPc intracellulaire et les réponses cardiaques stimulées par les récepteurs β-adrénergiques. Mais le rôle de MRP4 au coeur sénescent n'a jamais été étudié. Dans ce fait, nous avons mené de l'expérience pour étudier l'expression de MRP4 et son influence sur le dysfonctionnement β-adrénergique dans le cœur sénescent. L’expression de MRP4 a été quantifiée dans ventriculaires gauches par Western Blotting. Les réponses des récepteurs β-adrénergiques à l'isoprotérénol ont été étudiés in vivo (échocardiographie de stress) et in vitro (raccourcissement des sarcomères et de calcium de type transitoire dans les cardiomyocytes isolés par Ionoptix®) chez les rats jeunes (âgés de 3 mois) et les rats sénescents (âgés de 24 mois) prétraités ou non avec MK571, un inhibiteur spécifique de MRP4
The sympathetic nervous system (SNS) has been identified to be progressively activated in many cardiovascular diseases, from different chronic process including hypertension and cardiomyopathy, to congestive heart failure [82,156,412-414]. The hyperactivity of sympathetic nervous system may change the number, function and downstream mechanisms of β-adrenoceptors. Although there is no unified mechanism to interpret those divergent findings, calcium abnormalities has been recognized to be fundamental in the defective systolic function in left ventricle [82]. The intracellular calcium level is directly involved in the interaction of actin and myosin, thus reflects the contractility of muscle. β-adrenergic stimulation can induce the positive inotropic / lusitropic responses via the production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and the activation of protein kinase A (PKA). Thus calcium transient is increased after phosphorylation of serials targeted proteins (calcium channel, ryanodine receptor, SERCA2a, and troponin). Under the pathophysiological condition, β-adrenergic dysfunction may be a common mechanism of decreased cardiac function. So, we performed experiments about β-adrenoceptor stimulation pathway in two different pathophysiological status, cardiomyopathy of the elderly and metabolic syndrome. The first experiment is conducted within senescent rat. In the senescent heart, diastolic dysfunction and reduced response to β-adrenergic stimulation have been identified, which are associated with the down-regulation of 1- and 2-adrenoceptors, along with the up-regulation of 3-adrenoceptor. [73,415,416] These changes either reduce the cAMP production or facilitate the hydrolysis of cAMP. Meanwhile, a complementary mechanism of the regulation of cAMP has been involved in heart. The multidrug resistance protein 4 (MRP4) plays an important role in the regulation of intracellular cAMP and β-adrenergic stimulated cardiac responses. But the role of MRP4 in the senescent heart has never been studied. Thus, we conducted the experiment to study the MRP4 expression and its influence on β-adrenergic dysfunction in the senescent rat heart. MRP4 was quantified in left ventricular homogenates by Western blotting. The β-adrenergic responses to isoproterenol were investigated in vivo (stress echocardiography) and in vitro (sarcomere shortening and calcium transient of isolated cardiomyocyte by Ionoptix®) in young (3-month age) and senescent (24-month age) rats pretreated or not with MK571, a specific MRP4 inhibitor. As a result, we confirmed that the MRP4 overexpression contributes to the decrease of positive inotropic response to β-adrenoceptor stimulation in the senescent heart

Cette thèse présente une nouvelle méthode de synthèse du phosgène marqué au carbone-11, précurseur important pour marquer des molécules radiopharmaceutiques d’intérêt médical à haute radioactivité spécifique. Cette synthèse est réalisée, en 10 minutes à partir du méthane marqué au carbone-11, qui est chloré en tétrachlorure de carbone par catalyse sur de la pierre ponce imprégnée de chlorure cuivrique. Un procédé photochimique a été étudié, mais la réaction se trouve fortement inhibée. Puis le tétrachlorure de carbone est oxydé en phosgène au contact d’une surface en acier. Cette nouvelle méthode de synthèse du phosgène a été appliquée au marquage du CGP-12177, destiné à étudier les sites récepteurs cardiaques β-adrénergiques. Pour ce genre d’études, il est essentiel de marquer les molécules avec une haute radioactivité spécifique
This thesis describes a new synthesis of high specific radioactivity carbon-11 labelled phosgene. The latter is an important precursor for the labelling of radiopharmaceuticals used in Positron Emission Tomography. The synthesis is carried out in 10 minutes. First, the carbon-11 labelled methane (¹¹CH₄) is chlorinated into carbon tetrachloride on pumice impregnated with copper (II) chloride? A photochemical process had previously been studied but this reaction was strongly inhibited. Then the ¹¹C-carbon tetrachloride is oxidized into 11C-phosgene on hot stainless. The ¹¹C-CGP 12177 has been labelled from this new 11C-phosgene synthesis for receptor studies which require high specific radioactivity

Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques du canal calcique de myocytes ventriculaires de rats adultes. Sur cette préparation nous avons rencontré que le canal calcique à haut seuil d'activation par le voltage, sensible aux dihydropyrines (DHPS) et à la phosphorylation AMPc-dépendante. Outre le voltage et le calcium intracellulaire la nature de l'ion perméant (Ca2+, Ba2+, Na+) contrôle l'inactivation du canal. Lorsque le canal transporte exclusivement l'ion Ca2+ sa cinétique d'inactivation biexponentielle reflète l'activité de deux composantes de courant, interdépendants, d'un même et unique canal. Ces deux composantes de courant sont régulées par le potentiel de membrane (HP), et la fréquence de stimulation. Les agents béta-adrénergique et les DHPS agonistes favorisent l'activité préférentielle d'une des deux composantes. Immédiatement après l'obtention de la configuration whole-cell patch-clamp, l'influx calcique est nul puis il se développe et atteint une amplitude maximum au bout d'environ deux minutes. Le développement du courant Ica se traduit par une modification importante de la cinétique d'inactivation du canal en présence de Ca2+ qui passe de monoexponentielle lente à biexponentielle. Ce comportement du canal est conforme à l'activité de deux composantes de courant du même canal. Des fréquences de stimulation élevées (au-dessus de 1 hz), facilite l'influx calcique par un mécanisme de régulation des deux composantes de courant. La stimulation béta-adrénergique et les DHPS agonistes déplacent les propriétés voltage-dépendantes d'activation et d'inactivation du canal vers des potentiels plus négatifs. Ils ont cependant un mode d'action différent. Les agonistes béta-adrénergiques ralentissent la cinétique d'inactivation du courant Iba tandis que les DHPS agonistes accélèrent cette inactivation. En outre l'effet des DHPS agonistes dépend de l'état de phosphorylation AMPc-dépendante du canal.

Le traitement à l'insuline n'empêchant pas à long terme le développement de la cardiomyopathie, l'activité physique régulière est aujourd’hui proposée comme complément à la prise en charge médicamenteuse du diabète. Notre objectif premier était de déterminer sur une durée conséquente les effets respectifs de l'entraînement physique et du traitement à l'insuline sur la fonction cardiaque en portant une attention particulière sur le système β-adrénergique et/ou sur le système de régulation du calcium intracellulaire. A long terme le traitement à l'insuline comme l'entraînement physique ne parviennent ni l'un, ni l'autre à atténuer les désordres occasionnés par le diabète au niveau de la fonction myocardique. Si notre entraînement en endurance n’a pas permis d'améliorer les performances myocardiques dans notre modèle de rat diabétique non traité à l'insuline, il a même accentué la bradycardie et la désensibilisation β-adrénergique induites par le diabète. Ensuite, nous avons cherché à déterminer si à long terme, le traitement à l'insuline et l’entraînement physique pouvaient agir de manière synergique et ce faisant améliorer les performances myocardiques. Associés le traitement à l’insuline et l’entraînement en endurance parviennent à normaliser la fonction contractile. Cet effet additif est très certainement médié par des adaptations dans la voie de signalisation impliquant les protéines régulatrices du Ca2+. Nos travaux révèlent l’intérêt majeur d’un traitement bi-dimensionnel – traitement à l’insuline, activité physique – dans la prise en charge thérapeutique quotidienne des patients diabétiques. Néanmoins, nous soulignons l'importance d'une activité physique adaptée pour induire les effets bénéfiques escomptés
The insulin treatment does not avoid long-term development of cardiomyopathy, regular physical activity is now offered as a complement to drug therapy of diabetes. Our primary aim was to determine long term respective effects of exercise training and insulin treatment on cardiac function with a focus on the β-adrenergic system and/or on the calcium intracellular regulatory system. In the long-term insulin treatment and exercise training were not able to decrease the troubles caused by diabetes on myocardial function. Our endurance training did not improve myocardial performance in our model of diabetic rats, furthermore bradycardia and the β-adrenergic desensitization induced by diabetes has been increase. Afterwards, we considered the effects of a possible synergy between long-term insulin treatment and exercise training on myocardial performance. Associated insulin treatment and exercise training are able to normalize contractile function. This additive effect is likely mediated by changes in the signaling pathway involving Ca2+ cycling proteins. Our works show the interest of a major bi-dimensional treatment - insulin treatment, physical activity - in the therapeutic management of patients with diabetes everyday. However, we highlighted importance of adequate physical activity to induce the expected benefits

L’hypertrophie cardiaque est un mécanisme adaptatif qui se développe en réponse à une surcharge de travail hémodynamique. Lors d’un stress chronique, elle peut mener à l’insuffisance cardiaque (IC), l’une des principales causes de mortalité dans les pays industrialisés. Les voies de signalisation hypertrophiques induites par les récepteurs α et β-adrénergiques font intervenir la petite protéine G Ras et des protéines calcium-dépendantes telles que la calcineurine (CaN) et la Ca2+/calmoduline-dépendante kinase de type II (CaMKII), ainsi que leurs facteurs de transcription respectifs NFAT et MEF2. Dans les cellules immunitaires, la protéine Carabine a été mise en évidence comme inhibant la CaN et de Ras. L’objectif de cette thèse et de caractériser son rôle dans le cardiomyocyte.In vitro, nous montrons que Carabine est exprimée dans le cardiomyocyte de rat nouveau-né et adulte et inhibe par l’intermédiaire de ses domaines fonctionnels les voies de signalisation de Ras/ERK, CaN/NFAT et CaMKII/MEF2. Sous stimulation chronique adrénergique, la surexpression de Carabine prévient le remodelage cardiaque en bloquant le développement des marqueurs de l’hypertrophie : la croissance cellulaire, la réexpression des gènes foetaux etla réorganisation des protéines contractiles. Enfin, dans un modèle d’hypertrophie cardiaque induite par surcharge de pression chez le rat, l’injection intramyocardiaque d’un adénovirus codant pour Carabine inhibe l’hypertrophie des cardiomyocytes. Ce travail ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de l’IC
Cardiac hypertrophy is an adaptative mechanism developed in response to hemodynamic overload. During chronic stress, it can lead to heart failure (HF), one of the most important causes of mortality in industrialized countries. Hypertrophic signaling pathway induced under α and β-adrenergic receptor involve small G protein Ras and calcium dependent proteins suchas the calcineurine (CaN) and the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II (CaMKII), as well as their respective transcription factors NFAT and MEF2. In immune cells Carabin protein has been shown to inhibit CaN and Ras. The purpose of my thesis was to determine the role of Carabin in the cardiomyocyte.In vitro, we showed that Carabin is expressed in neonatal and adult rat cardiomyocyte and inhibits via its functional domains the Ras/ERK, CaN/NFAT and CaMKII/MEF2 signaling pathways. Under adrenergic chronic stimulation, Carabin overexpression blocks the development of hypertrophic markers (cell size increase, re-expression of embryonic genesand contractile protein reorganisation) preventing thus cardiac remodeling. Finally, in a rat model pressure overload cardiac hypertrophy, intra-cardiac injection of Carabin adenovirus inhibits cardiomyocyte growth. This study opens new insights into the treatment of HF

Les travaux présentés dans ce mémoire ont pour objectif d’approfondir la compréhension de l’altération de la réponse à la stimulation des récepteurs β-adrénergiques dans plusieurs contextes physiopathologiques. La première étude confirme l’existence d’une dysfonction β-adrénergique à l’échelle du cardiomyocyte au cours de la sénescence. Elle met en lumière le rôle de la protéine MRP4 (multidrug resistance associated protein 4) dans cette diminution de réponse inotrope positive à l’isoprotérénol. La deuxième étude évalue la réponse à la stimulation des récepteurs β-adrénergiques dans le syndrome métabolique et montre que la dysfonction est modérée dans ce contexte même en cas de diabète associé à l’obésité. Ces résultats fonctionnels sont expliqués par la diminution d’expression des récepteurs β1- et β2-adrénergiques mais l’absence de surexpression du récepteur β3-adrénergique comme observée dans le diabète de type 1. La troisième étude analyse le rôle de l’atorvastatine sur la réponse β-adrénergique chez les diabétiques et les mécanismes de modulation de cette réponse par une étude du transcriptome cardiaque. Elle montre également que l’inhibition de la production d’oxyde nitrite améliore la réponse β-adrénergique. La quatrième étude a expliqué une part de la dysfonction β-adrénergique chez les diabétiques par la surexpression de MRP4. L’inhibition de MRP4 a permis de restaurer la réponse à l’isoprotérénol au cours de la cardiopathie diabétique. Au total, l’ensemble de nos travaux poursuit la description des mécanismes de la dysfonction β-adrénergique dans la sénescence et le diabète et souligne le rôle de MRP4
The studies presented in this report looked for a better understanding of the altered response to stimulation of the β-adrenergic receptors in several physiopathological contexts. The first study confirms the alteration of the β-adrenergic response at the cardiomyocyte level in the senescent cardiomyopathy. The role of MRP4 (multidrug resistance associated protein 4) in the reduced inotropic response to isoproterenol is emphasized. The second study evaluates the response to β-adrenoceptors stimulation in the metabolic syndrome and shows mild dysfunction in this context even in obesity associate with diabetes. These functional results are explained by a reduced expression of β1- and β2-adrenergic receptors but no overexpression of β3-adrenoceptor as observed in type 1 diabetes. The third study analyzes the role of atorvastatin on the β-adrenergic response in the diabetic cardiomyopathy and the mechanisms involved by study of the cardiac transcriptome. The inhibition of nitrite oxide production improves the response to β-adrenoceptors stimulation in diabetic heart. The fourth study explained part of the β-adrenergic dysfunction in the diabetic cardiomyopathy by the overexpression of MRP4. The inhibition of this protein restored the response to isoproterenol during diabetic cardiomyopathy. All together the present results carry on with description of the mechanisms involved in the β-adrenergic dysfunction in aging and diabetes and underline the role of MRP4

Les catécholamines induisent la synthèse d’AMPc par une stimulation des récepteurs β-adrénergiques et contrôlent ainsi la fonction cardiaque en activant une pléiade de voies de signalisation intracellulaires. Les protéines Epac sont des facteurs d’échange pour les petites protéines G et sont directement activés par l’AMPc. Devant l’importance de la voie β-adrénergique dans la physiopathologie cardiaque et dans le but de mieux comprendre la régulation des processus cellulaires dépendants de l’AMPc dans le cœur, il apparaît essentiel de caractériser le rôle des facteurs d’échange Epac dans le myocarde. Dans une première partie, cette étude démontre que les effets de Epac sur l’hypertrophie des cardiomyocytes ventriculaires de rats nouveaux nés requièrent les GTPases H-Ras et Rap2B. Epac active la voie PLC/IP3/Ca2+ qui est nécessaire pour l’activation de H-Ras. Au niveau transcriptionnel, Epac induit l’export nucléaire de HDAC4 permettant l’activation d’un programme génique d’hypertrophie. Dans une deuxième partie, cette étude révèle l’implication de Epac1 dans l’hypertrophie des cardiomyocytes in vivo, chez la souris. La délétion de Epac1 protège du remodelage cardiaque induit par l’activation prolongée des récepteurs β-adrénergiques et améliore la fonction cardiaque. La surexpression de Epac1 spécifiquement dans le myocarde entraîne une hypertrophie des cardiomyocytes. Par ailleurs, la voie β-AR/Epac1 induit l’accumulation de protéines ubiquitinylées et provoque l’activation du processus d’autophagie in vitro et in vivo. L’autophagie protège des effets délétères de la voie β-adrénergique/Epac en participant à l’élimination des agrégats protéiques et en contrant les effets hypertrophiques de Epac1. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement de l’hypertrophie et de l’insuffisance cardiaque
Catecholamines regulate cardiac function by stimulating β-adrenergic receptors (β-AR), leading to cAMP production and activation of a multiplicity of signaling pathways. Epac proteins are exchange factors for small G proteins which are directly activated by cAMP. Given the importance of the β-adrenergic pathway in cardiac physiopathology, it becomes essential to characterize functions of Epac protein in myocardium. In a first part, this study shows that H-Ras and Rap2B GTPases are involved in Epac-induced neonatal rat cardiac myocytes hypertrophy. Epac induces activation of the PLC/IP3/Ca2+ pathway which is necessary for H-Ras activation. At the transcriptional level, Epac causes HDAC4 nuclear export leading to activation of a hypertrophic gene program. In a second part, this study reveals implication of Epac1 in cardiac hypertrophy in vivo. Deletion of Epac1 in mice protects from cardiac remodeling induced by chronic isoproterenol infusion and enhances cardiac function. Cardiac specific overexpression of Epac1 in mice induces cardiac myocytes hypertrophy. Interestingly, β-AR/Epac1 pathway triggers ubiquitinated proteins accumulation and activation of autophagy both in vitro and in vivo. By eliminating aggregates and by counteracting hypertrophic effects of Epac, autophagy protects from deleterious effects of the β-AR/Epac pathway. These results open news insights into the treatment of cardiac hypertrophy and heart failure

Dans le cœur, l’activation aiguë de la voie AMPc/PKA via la stimulation des récepteurs β-adrénergiques (β-ARs) permet de réguler la contraction cardiaque alors que l’activation chronique de cette voie est délétère, car elle est source de survenue d’arythmies cardiaques et de remodelage hypertrophique du cœur. Au niveau des cardiomyocytes, Il existe principalement deux sous-types de récepteurs β-ARs ; β1- et β2-ARs, qui exercent des effets différents sur la fonction cardiaque.Dans une première partie de ma thèse, je me suis intéressé à l’étude du rôle des récepteurs β1- et β2-ARs dans la régulation différentielle de l’activité PKA cytoplasmique et nucléaire. J’ai ainsi pu montrer que contrairement aux récepteurs β1-ARs qui ont la capacité d’activer la PKA au niveau du cytoplasme et aux noyaux, les récepteurs β2-ARs activent la PKA uniquement au niveau du cytoplasme, et ce indépendamment de la capacité des récepteurs β2-ARs à induire une augmentation des niveaux d’AMPc dans les noyaux. En accord avec ces résultats, les récepteurs β1- mais pas β2-ARs activent le facteur pro-apoptotique régulé par la PKA, ICER.Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis intéressé aux différents mécanismes responsables de l’incapacité des récepteurs β2-ARs à activer la PKA au niveau des noyaux. Mes résultats soulignent le rôle de la localisation des récepteurs β2-ARs au niveau des cavéoles, leurs couplage aux protéines Gi, leurs désensibilisation par la GRK2 ainsi que la dégradation de l’AMPc généré par ces récepteurs par la PDE3 et 4 dans la régulation de la signalisation PKA cytoplasmique et pointent vers la PDE4 comme un régulateur central permettant de limiter l’activation de la PKA holoenzyme responsable des réponses PKA nucléaires. Mes résultats montrent également que la mAKAP est un élément clé dans la transduction de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β2-ARs et à un moindre degré, les récepteurs β1-ARs. Dans la dernière partie de ma thèse, j’ai étudié le remodelage de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β1- et β2-ARs au cours de l’insuffisance cardiaque. J’ai ainsi pu montrer qu’en plus de la diminution de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β1-ARs, il existe une signalisation PKA nucléaire de novo induite par les récepteurs β2-ARs dans les cardiomyocytes de rat adulte insuffisants.En conclusion, ce travail a mis à jour une nouvelle différence entre les récepteurs β1- et β2-ARs dans la signalisation PKA au niveau des noyaux des cardiomyocytes de rat adultes, et souligne le rôle important de la PDE4 et de la mAKAP dans la régulation de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β2-ARs
In the heart, acute activation of the cAMP/PKA pathway upon stimulation of β-adrenoceptors (β-ARs), plays a fundamental role in the regulation of cardiac function, whereas chronic activation of this pathway is deleterious, as it is responsible for cardiac arrhythmias and hypertrophic remodeling of the heart. In cardiac myocytes, there are mainly two subtypes of β-ARs: β1- and β2-ARs, which exert different effects on cardiac function.In the first part of my thesis, my work was focused on understanding the role of β1- and β2-ARs in the differential regulation of cytoplasmic and nuclear PKA activity. Hence, I have showed that unlike β1-ARs which have the capacity to induce the activation of PKA in the cytoplasm and the nucleus, β2-ARs induce the activation of PKA only in the cytoplasmic compartment, regardless of their ability to induce an increase in cAMP in the nuclei. Consistently, β1- but not β2-ARs were able to induce the activation of the pro-apoptotic factor regulated by PKA, ICER.The second aim of my thesis was to decipher the different mechanisms involved in the inability of β2-ARs to activate PKA in the nucleus. I concentrated my efforts on investigating the role of the localization of β2-ARs in caveolae, their coupling to Gi proteins, their desensitization by GRK2 as well as the hydrolysis of cAMP by PDE3 and 4 in the regulation of β2-AR-induced cytoplasmic PKA activity. My results point to PDE4 as a central regulator which limits the activation of the PKA holoenzyme pool involved in the nuclear PKA responses. My results also show that mAKAP is a key component of nuclear PKA signaling induced by β2-ARs and to a lesser extent by β1-ARs. In the last part of my thesis, I have studied the remodeling of nuclear PKA signaling induced by β1- and β2-ARs that occurs during heart failure. I showed that, besides a decrease in β1-AR-induced nuclear PKA signaling, there is a de novo β2-AR-induced nuclear PKA signaling in cardiomyocytes from rat with heart failure.In conclusion, this work uncovers a new difference in PKA signaling between β1- and β2-ARs at the nuclear compartment of adult rat cardiomyocytes and underlines the importance of PDE4 and mAKAP in the regulation of β2-AR-induced nuclear PKA signaling

Différents modèles de souris transgéniques surexprimant une des protéines du système -adrénergique (récepteur -ar, protéine gs ou -ark) dans le cur, ont été établis dans le cadre d'études des cardiomyopathies. Notre modèle de souris transgéniques (f28) porte le gène du 2-ar humain sous le contrôle de son promoteur naturel. Il a été produit dans le but d'avoir un modèle d'étude in vivo chez lequel on retrouve une distribution des 2-ars qui ressemble le plus possible a celle decrite chez l'homme. Dans une première partie de notre étude nous avons caractérisé chez les souris f28 l'expression du transgène dans plusieurs tissus cibles des catécholamines, en les comparants aux souris contrôles. Nous avons montré que le transgène est transcrit en messagers h2-ars spécifiques, dans le cur, le muscle, le poumon, le cerveau et le foie de souris f28, mais pas dans le rein et la rate. Leur profil de distribution tissulaire diffère de celui des arnm 2-ars de souris (m2-ars), et leur taille est supérieure à celle des messagers décrits chez l'homme et la souris. Ces messagers sont traduits en protéines, et les récepteurs transgéniques sont exprimés dans tous les organes de souris f28 exprimant les arnm transgéniques. L'expression la plus élevée est celle observée dans le foie ou les 2-ars représentent près de 95% des -ars totaux. Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons montré dans le foie, que les récepteurs transgéniques sont capables d'interagir normalement avec les protéines gs de souris, et d'induire l'activation de l'adenylyl cyclase suite à la stimulation par l'agoniste -ar isoproterenol. Chez le rat, l'expression des 2-ars dans le foie varie en fonction de l'ontogenèse : elle est élevée chez le nouveau-né et faible chez l'adulte. Comme les 2-ars jouent un rôle physiologique très important dans cet organe, nous avons effectué une étude ontogénique du système -ar (-ars, protéine g, adenylyl cyclase). Nous avons montré que chez la souris contrôle on retrouve le même profil ontogénique d'expression des 2-ars et d'activité de l'adenylyl cyclase que ceux décrits chez le rat. En revanche, chez la souris f28, les 2-ars hépatiques sont fortement exprimes à tous les âges, tant chez le nouveau-né que chez l'adulte, et les réponses de l'adenylyl cyclase induites par l'agoniste, sont aussi fortement augmentées. Les souris f28 semblent présenter non seulement des altérations métaboliques mais aussi des altérations phénotypiques : une mortalité élevée des nouveau-nés, un déficit pondéral et un problème de coordination des mouvements des pattes arrière. Nous avons pu montrer que le phénotype de déficit pondéral est dû à l'expression du transgène, en particulier à la surexpression des 2-ars dans le foie. Finalement, nous avons utilise ce modèle de souris transgéniques pour mettre en évidence le rôle des 2-ars dans la régulation des phénomènes d'apoptose dans le foie. Il a été décrit que l'augmentation des taux d'ampc pouvait contrôler l'apoptose dans certains types cellulaires. Nous avons montre que les souris f28 qui surexpriment des 2-ars dans le foie, sont protégées contre l'apoptose induite par un anticorps anti-fas. Quant aux souris contrôles qui, normalement meurent suite à l'injection de cet anticorps, elles acquièrent une protection suite à l'administration de l'agoniste 2-ar clenbuterol. Le modèle de souris f28 est un outil de choix pour étudier l'impact physiopathologique de la modification de l'expression des 2-ars dans le foie, mais également dans d'autres tissus.