Dissertations / Theses on the topic 'Récepteurs au C3b du complément'

CR1 (CD35, récepteur pour le C3b/C4b) est une glycoprotéine transmembranaire présente sur de nombreux types cellulaires. Son rôle principal à la surface des érythrocytes (E) est le transport des complexes immuns vers le foie et la rate où ils sont éliminés. Nous avons montré que le Macaque rhésus (Macaca mulatta, MM) exprime un CR1 équivalent à celui de l’Homme en taille, en densité et réparti en bouquets. Ce CR1 présente des polymorphismes allotypiques. Il exprime aussi un CR1 plus court (CR1like, CR1L), plus abondant, plus diffus, à ancrage glycophosphatidylinositol. Nous avons décrit des polymorphismes de la région Sla de CR1 impliquée dans les phénomènes d'adhérence inter-érythrocytaire entre les E parasités par P. Falciparum et les E sains chez 12 espèces de primates. Ils ne protègent pas les E de MM contre la formation des rosettes avec des E humains parasités. Nous avons séquencé les promoteurs de CR1 et CR1L de MM (MCR1, MCR1L). AML1 activateur de CR1 humain est présent dans MCR1 mais absent de MCR1L. Ets et MZF1 sont conservés. Nous avons identifié un polymorphisme allèlique (délétion de 18 nucléotides) dans CR1L humain. Nous avons étudié le dépôt de C4d érythrocytaire (EC4d) de transplantés rénaux concomitamment à l'analyse de la biopsie du greffon. Il existe une relation entre le EC4d et le marquage diffus C4d des capillaires péritubulaires du greffon ; et entre le EC4d et les lésions histologiques retrouvées en situation de rejet aigu humoral. Le EC4d offre un intérêt pour le diagnostic et le suivi des rejets en transplantation rénale. Le mécanisme des dépôts de C4d reste à élucider. L’activation de la voie classique du complément ne semble pas impliqué
@CR1 (CD35, the C3b/C4b receptor) is a transmembrane glycoprotein found on few cell types. Erythrocyte CR1 (E-CR1) is involved in immune complex (IC) clearance in liver and spleen. The binding of IC on E is improved by cluster distribution of CR1 enabling a strong avidity multivalent binding. Rhesus macaque (Macaca mulatta) was shown to express a transmembrane E-CR1 as observed in Human (same length, density, cluster distribution). This “human-type” CR1 was characterized by allotypic polymorphisms. A shorter CR1 was also observed, called CR1like (CR1L) which was more abundant, more diffuse and glycophosphatidylinositol anchored. Polymorphisms of CR1 Sla region involved in rosetting between healthy E and P. Falciparum infected E were described in 12 primate species. E from rhesus macaque were not prevented from rosetting with human infected E by those polymorphisms. CR1 and CR1L promoters from rhesus macaque (MCR1, MCR1L) were sequenced. AML1 known as human CR1 activator was found in MCR1 but was missing in MCR1L. Ets and MZF1 were conserved. HES1 et LBP1 might downregulate MCR1 and human CR1L. An allelic polymorphism corresponding to a 18 nucleotide deletion was observed in human CR1L promoter. C4d deposition at E surface (EC4d) of patients suffering from kidney acute humoral rejection was compared with biopsy analysis and related to C4d tissue deposits. EC4d appears a promising non-invasive marker of acute humoral rejection. The mechanism of C4d deposition remains to be investigated. Complement classical pathway activation did not seem to be involved

La molécule CD46 humaine est à la fois un régulateur de l'activation du complément humain et un récepteur du virus de la rougeole. La régulation de l'activation du complément protège les cellules de l'organisme contre I' «auto»-agression du complément. Notre objectif a été de déterminer quelle est la conséquence d'une mise en jeu simultanée de ces deux fonctions. 1-Les interactions moléculaires, entre les partenaires viraux et cellulaires impliqués dans l'entrée du virus, ont été étudiées, à l'aide de formes recombinantes solubles des molécules CD46 et hémagglutinine. (i) L'interaction entre les domaines extracellulaires de l'hemagglutinine du virus de la rougeole et de son récepteur, la molécule CD46 humaine, est la première étape de l'entrée du virus. (ii) Le virus de la rougeole et la forme soluble de l'hémagglutinine du virus ont des sites communs de liaison sur les domaines SCR I et II de CD46, et les SCR III et IV renforcent la liaison du virus. Comme la fonction de régulation de l'activation du complément est localisée au niveau des SCR II, III, et IV, il y a chevauchement entre les deux fonctions de CD46. 2-Nous avons établi les paramètres cinétiques et quantitatifs du dépôt de l'élément C3b du complément humain, et sa régulation par la molécule CD46. (i) L'activation du complément sur des cellules xénogéniques, conduit successivement à un faible puis un fort dépôt de C3b. (ii) L'activation de la voie classique est plus rapide et plus efficace que la voie alterne, mais seulement dans l'induction du dépôt initial de C3b. (iii) La molécule CD46 retarde seulement le dépôt initial du C3b de la voie alterne, et bloque le second dépôt des deux voies d'activation. 3-Lors de la mise en jeu des deux fonctions de CD46: (i) la liaison du virus est insensible au C3b pré-déposé; (ii) le virus de la rougeole active la voie alterne du complément, (iii) l'infection ou du virus préfixé à la surface des cellules, augmente le dépôt de C3b. Nous proposons un modèle de l'entrée du virus de la rougeole dans une cellule cible via la molécule CD46, un modèle du dépôt de C3b et de sa régulation par la molécule CD46 lors de l'activation du complément, et un modèle des perturbations réciproques entre la fonction immunologique de la molécule CD46 et sa fonction récepteur pour le virus de la rougeole

Les anaphylatoxines du complément et leurs récepteurs, RC3a et RC5a, jouent un rôle lors de la régénération et l’ontogénèse tissulaires. Les hépatocytes n’expriment le RC5a qu’après un stress inflammatoire ; l’administration de C5a augmente la prolifération hépatocytaire in vitro et in vivo, au cours de la régénération hépatique. Les RC3a et RC5a sont exprimés dans les neurones en grain du cervelet de rat en cours de développement. In vitro, le RC5a protège les neurones en grain de l’apoptose induite par appauvrissement du milieu ; in vivo, l’injection sous durale de C5a induit une prolifération accrue des neuroblastes par une action directe sur le RC5a neuronal. L’injection de C3a provoque une diminution de la couche externe du cervelet et une augmentation concomitante de celle de la couche interne pouvant s’expliquer par une accélération de la migration des neurones en grain comme mesurée in vitro par une augmentation de la motilité des neuroblastes
Complement anaphylatoxines and their receptors, C3Ar and C5aR, play a role in regeneration and ontogenesis. Hepatocytes express C5aR only after inflammatory stress. C5a administration increase the hepatocyte proliferation in vitro and in vivo, during liver generation. C3aR and C5aR are expressed in granular neurons of rat cerebellum during development. In vitro, C5aR protects granular neurons against apoptosis induced by lack of substract in medium ; in vivo, sub-dural injection of C5a induces an increase of neuroblast proliferation by a direct action of this peptide on C5aR. C3a injection provokes a decrease of cerebellar external layer and a concomitant increase of internal layer that could be explained by an acceleration of granular neuron migration as measured in vitro by an increase of neuroblast motility

Le système nerveux central (SNC) peut être le siège de réactions inflammatoires au cours de diverses pathologies. De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires participent à l'initiation et à l'amplification de l'inflammation cérébrale. Ainsi, les cellules gliales du SNC et les cellules immunes infiltrantes sont responsables de la production de cytokines et de protéines du complément (C) observée dans le cerveau pathologique. Plusieurs études ont montré l'implication du C dans les pathologies du SNC. Les anaphylatoxines C3a et C5a sont deux peptides pro-inflammatoires libérés lors de l'activation du C. Elles agissent par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques respectivement nommes C3aR et C5aR. Nous avons émis l'hypothèse que C3a et C5a libérées dans le cerveau pourraient exercer leurs effets inflammatoires via leur liaison au C3aR et au C5aR sur les cellules nerveuses. L'astrocyte, cellule gliale du SNC, a constitué notre modèle d'étude car cette cellule possède un étonnant potentiel immunologique et est fortement impliquée dans l'inflammation cérébrale. Notre étude a été menée en parallèle sur des lignées astrocytaires humaines et sur des astrocytes de rat en culture primaire. Nous avons montré l'expression constitutive des récepteurs C3aR et C5aR à la surface des astrocytes. Les deux récepteurs sont fonctionnels puisque leur stimulation par C3a et C5a induit d'une part l'activation de voies de transduction et, d'autre part, une augmentation de l'expression des ARNm des cytokines IL-6 et IL-8, et une sécrétion d'IL-8 par les astrocytes. L'ensemble de ces données nous permet d'attribuer de nouveaux rôles à C3a et C5a au sein du cerveau et renforce l'implication des anaphylatoxines dans les processus inflammatoires cérébraux et la pathogénèse du SNC.

Dans le but d'approfondir le rôle des anaphylatoxines dans le système nerveux central, nous avons stimulé des cellules T98G par le C3a ce qui a conduit à la découverte de deux molécules. Le CR2 est présent sur les astrocytes mais sa fonction est inconnue. Nous avons produit un anticorps monoclonal capable d'activer le CR2 astrocytaire qui s'associe à TAPA-1 et à la caldesmone qui sont connus pour arrêter la prolifération cellulaire. Ensuite, nous avons étudié le GPR176 dont le ligand est inconnu. Des animaux ont été immunisés selon quatre protocoles mais nous n'avons pas pu obtenir d'anticorps. Le GPR176 est principalement exprimé au niveau du système nerveux. Nous avons produit une lignée stable qui permettra de découvrir son ligand. L'ensemble de ces résultats ne nous a pas permis de corréler le complexe CR2/TAPA-1 et le GPR176 avec la réaction inflammatoire gliale mais les résultats obtenus sur le CR2 supposent une action de ce récepteur dans la formation de la cicatrice gliale
In order to decipher the function of anaphylatoxins in the central nervous system, we stimulated glioblastomas cells with C3a which leads us to the discovery of two molecules induced by C3a. CR2 is expressed on astrocytes but its function is unknown. We produced a monoclonal antibody which can activate astrocytic CR2 which translocates with TAPA-1 and with the non-muscle caldesmon. These proteins are known to arrest cell migration. In a second part, we study the GPR176 whose ligand is unknown. We immunized rabbits and mice with four protocols but we failed to obtain an antibody. We localized GPR176 in the central nervous system and particularly in the lombar spinal cord and in locus coeruleus. We produced a stable cell line which will be used in ligand finding. These results don't show an interaction between the complex TAPA-1/CR2 and GPR176 with glial inflammation but findings obtained with CR2 suppose a role of this receptor in promoting glial scar formation

Les études d'association pangénomiques ont permis d'identifier de nouveaux loci, dont le gène CR1 comme associé au risque de maladie d'Alzheimer (MA). Le récepteur du complément de type 1 (CR1) est une glycoprotéine transmembranaire, présente notamment à la surface des érythrocytes (CR1E), mais également dans le plasma sous forme soluble (CR1s). Le CR1 peut prendre des formes fonctionnelles différentes, qui pourraient conférer des niveaux de risque différents, voire suggérer des mécanismes physiopathologiques de la MA. Si la relation entre CR1 et MA est aujourd'hui connue, son mécanisme reste énigmatique.L'objectif principal de cette thèse était de corréler aux données génétiques (single nucleotide polymorphisms, polymorphismes de longueur, polymorphismes de densité), des éléments phénotypiques acquis comme la densité du CR1E ou le CR1S. D'une part, notre étude a montré grâce à deux méthodes différentes, que la MA était associée à une densité basse de l'isoforme long de CR1 (CR1*2) et suggérait l'existence d'allèle silencieux de CR1. D'autre part, nous avons montré que même si les critères génétiques étaient respectés, certains phénotypes pourraient être acquis au cours de la maladie. Nos résultats suggèrent que la MA résulterait plus d'une insuffisance d'épuration des dépôts amyloïdes, que d'une réponse excessive dont la réaction inflammatoire serait délétère. Bien que cette recherche génotypique et phénotypique, à potentiel physiopathologique, nécessite des investigations à plus grande échelle, elle pourra ouvrir la voie à des nouvelles pistes thérapeutiques qui ne peuvent être envisagées aujourd'hui faute de vue claire du ou des mécanismes en cause
Genome-wide association studies have identified new loci, including the CR1 gene, as being associated with Alzheimer's disease (AD) risk. The complement receptor type 1 (CR1) is a transmembrane glycoprotein found on the surface of erythrocytes (CR1E), and also in the plasma in soluble form (CR1s). CR1 can have different functional forms that may confer different risk levels, or even suggest pathophysiological mechanisms of AD. Indeed, the relation between CR1 and AD is now well established, the mechanism of this association remains to be elucidated.The main objective of this thesis was to correlate acquired phenotype elements, such as density of CR1E (number of CR1 antigenic sites per erythrocyte) or CR1s with genetic data (single nucleotide polymorphisms, length and density polymorphisms). Firstly, our study showed using two different methods that AD is associated with low density of the long CR1 isoform (CR1*2) and suggested the possible existence of silent CR1 alleles. Secondly, we showed that although genetic criteria were met, some phenotypes could be acquired during the course of the disease. Our findings suggest that AD stems more from insufficient clearance of amyloid deposits than from excessive response whose inflammatory reaction might be deleterious. Although this genetic and phenotypic study with pathophysiological potential still require further investigation on a larger scale, she could pave the way towards new therapeutic avenues that currently remain elusive in the absence of a clear overview of the mechanisms involved

La proteolyse limitee de c3 est induite, soit lors de l'activation du complement par les c3 convertases, soit par d'autres proteases (trypsine). Cette proteolyse conduit a la formation d'un fragment c3b doue du pouvoir de former une liaison covalente de type ester ou amide avec des proteines solubles ou membranaires. C3b peut egalement interagir de facon non covalente avec des recepteurs specifiques. C3b, proteine bivalente, peut donc jouer un role preponderant au cours de la reponse immune. C3b est notamment implique dans les etapes conduisant a la presentation d'un antigene aux lymphocytes t. Afin d'etudier l'influence de c3b sur ces differentes etapes, nous avons elabore un systeme modele constitue de c3b lie a une particule de superose par liaison ester. Nous utilisons comme cpa la lignee monocytaire humaine u937. En presence de fractions purifiees enrichies en endosomes/lysosomes la liaison ester est stable. C3b est partiellement proteolyse en c3c et en un fragment de 32 kda c3d-like qui reste lie au superose par liaison ester. Ceci suggere que c3b peut evoluer lors du trafic intracellulaire en restant lie a l'ag. L'utilisation d'inhibiteurs de proteases nous a permis d'observer que des enzymes appartenant a la famille des proteases acides, a serine, et a cysteine dont la cathepsine b, cooperent aux activites esterolytiques et proteolytiques exercees par la fraction enrichie en endosomes/lysosomes, sur le c3b-superose. Pour poursuivre l'etude in situ, nous avons incube les cellules u937 en presence de complexes formes de c3b lie a la toxine tetanique (tt) par liaison ester, et adopte une technique permettant de separer les lysosomes des endosomes. Cette etude a montre que c3b influence la prise en charge, le routage intracellulaire et la proteolyse de la tt. Ceci se traduit sur un plan fonctionnel: l'ag, plus tardivement disponible a partir des complexes tt-c3b, est presente avec plus d'efficacite que l'ag libre aux lymphocytes t specifiques de la tt. L'influence de c3b sur ces etapes est due a la stabilite de la liaison ester au cours du trafic intracellulaire. Par ailleurs, nous avons mis en evidence un effet modulateur direct de c3 sur la proteolyse de la tt dans les lysosomes. C3, proteolyse dans ces fractions, parait agir directement sur les proteases des lysosomes, sans intervenir comme competiteur de la tt

La protéine de stress Gp96, est une protéine du réticulum endoplasmique (RE) de la famille des HSP90, exprimée dans toutes les cellules. En situation de stress du RE, elle est induite et peut alors être exprimée au niveau membranaire et extracellulaire. Gp96 est connue pour moduler de manière ambivalente les réponses immunitaires, ayant des effets à la fois pro- et anti-inflammatoires. Bien qu’elle ait été montrée nécessaire pour la tolérance au microbiote des macrophages intestinaux, son rôle n’a pas été pas élucidé au niveau moléculaire. De plus, ses effets dans les macrophages en situation de stress du RE n’est pas connu, malgré leur implication dans de nombreuses pathologies. Dans ces travaux, nous montrons dans un premier temps que Gp96 est exprimée à la membrane des macrophages M2 et non des macrophages M1 dérivés de monocytes du sang périphérique de volontaires sains. Nous mettons en évidence que le stress du RE, généré par la perturbation de l’homéostasie calcique induite par la thapsigargine (Tg), a pour conséquence un switch du phénotype M2 vers un profil pro-inflammatoire dépendant de Gp96 fonctionnelle. Ce switch est associé à la diminution de l’expression membranaire de Gp96 et à sa sécrétion. Dans un second temps, nous démontrons que Gp96 interagit avec le complément C3 intracellulaire dans les macrophages M1 et M2. Cette interaction est plus importante dans les macrophages M2 stressés comparé aux M2 non stressés et, C3b, le fragment issu du clivage de C3, est présent uniquement dans le surnageant de culture des M2 stressés, et a pu de plus être co-immunoprécipité avec Gp96. Enfin, comme Gp96, le fragment inactivé de C3b, iC3b, est détecté uniquement à la membrane des M2 non stressés et sa présence dépend de Gp96 fonctionnelle. Ces résultats suggèrent que Gp96 membranaire et iC3b pourraient être des marqueurs des macrophages M2 anti-inflammatoires. Ils montrent que Gp96 est impliquée dans la modulation du phénotype M2 vers un profil pro-inflammatoire induite par une perturbation de l’homéostasie du calcium. Cet effet pourrait être lié à sa capacité à interagir avec le complément C3 dont les fragments de clivage C3a et C3b ont des effets pro-inflammatoires
The stress protein Gp96, is an endoplasmic reticulum (ER) protein of the HSP90 family, expressed in all cells. Under ER stress, it is induced and can then be expressed at the membrane and extracellular levels. Gp96 is known to have a dual role in immune responses, having both pro- and anti-inflammatory effects. Although it has been shown to be necessary for the tolerance of intestinal macrophages to the microbiota, its role has not been elucidated at the molecular level. Moreover, its effects in macrophages under ER stress are not known, despite their involvement in many pathologies. In this work, we first show that Gp96 is expressed at the membrane of M2 and not M1 macrophages derived from blood monocytes of healthy volunteers. We show that ER stress, generated by the disruption of calcium homeostasis induced by thapsigargine (Tg), results in a switch from the M2 phenotype to a functional Gp96-dependent pro-inflammatory profile. This switch is associated with the decrease in membrane expression of Gp96 and its secretion. In a second step, we demonstrate that Gp96 interacts with intracellular complement C3 in macrophages M1 and M2. This interaction is more important in stressed M2 macrophages than in untreated M2 and, C3b, the fragment resulting from the cleavage of C3, is present only in the culture supernatant of the stressed M2, and could moreover be co-immunoprecipitated with Gp96. Finally, like Gp96, the inactivated fragment of C3b, iC3b, is detected only at the membrane of unstressed M2 and its presence is dependent on functional Gp96. These results suggest that membrane Gp96 and iC3b could be markers of anti-inflammatory M2 macrophages. They show that Gp96 is involved in the modulation of the M2 phenotype towards a pro-inflammatory profile induced by a disruption of calcium homeostasis. This effect could be related to its ability to interact with the C3 complement whose C3a and C3b cleavage fragments have pro-inflammatory effects

L’obésité est maintenant reconnue comme présentant une inflammation chronique et est caractérisée par une augmentation de l’infiltration de macrophages dans le tissu adipeux. Cette infiltration est réflètée par l’activation du système du complément qui agit comme élément déclencheur et précurseur aux autres fonctions immunitaires. Le C5L2 (C5aR-like receptor 2) a récemment été identifié comme récepteur pour la protéine stimulant l’acylation (ASP) ainsi que pour le facteur inflammatoire C5a (capable quant à lui d’aussi se lier au C5aR). Cette thèse porte sur: (i) l’interaction entre C5L2 et C5aR suite à l’activation de ceux-ci par leurs ligands respectifs dans des lignées cellulaires adipocytaires (3T3-L1) et de macrophages (J774), (ii) la contribution du C5aR au métabolisme et à la réponse immunitaire d’adipocytes provenant de modèles murins et (iii) l’association entre C5L2 et C5aR avec des facteurs reliés à l’obésité chez l’humain. Les récepteurs C5L2 et C5aR s’associent entre-eux de façon constitutive en homo- et hétérodimères et l’ajout de ligand à des cultures d’adipocytes 3T3-L1 ou de macrophages J774 augmente cette colocalisation. Autant l’ASP que le C5a ont réussi à induire une réponse fonctionnelle chez des adipocytes primaires. Lorsque des adipocytes primaires provenaient de souris invalidées pour le C5aR, les effets d’un traitement avec C5a étaient perturbés tandis que les effets médiés par un traitement à l’ASP étaient maintenus. De plus, l’addition de C5a bloquait la signalisation et la réponse fonctionnelle causées par un traitement à l’ASP chez les adipocytes primaires provenant de souris C5aRKO et de type sauvage. Finalement, l’expression des gènes C5L2 et C5aR dans le tissu adipeux de femmes obèses morbides était associée avec une adiposité croissante. De façon interessante, les ratios ASP/C5L2 et C5L2/C5aR augmentaient de façon significative avec l’obésité abdominale. Lorsque pris ensemble, l’interaction fonctionelle, physiologique et la proximité physique des récepteurs C5L2 et C5aR chez les adipocytes suggèrent un rôle potentiel de ceux-ci sur l’immunométabolisme du tissu adipeux. De surcroit, cette interaction met en valeur les liens qui existent entre le tissu adipeux et les protéines et récepteurs du complément tout en démontrant comment une réponse excessive au niveau immuno-métabolique pourrait exacerber le développement du niveau d’adiposité chez l’individu.
From the convergence of metabolism and immune research has emerged a new research field, termed “Immunometabolism”. Obesity, an immunometabolic disease, is associated with a state of low-grade inflammation and is characterized by increased infiltration of macrophages into adipose tissue. Complement activation can act as an early trigger and precursor of other immune functions. C5aR-like receptor 2 (C5L2) has been identified as a receptor for Acylation Stimulating Protein (ASP) and the inflammatory factor C5a (which can also bind C5aR). This thesis sequentially evaluates (i) ligand-induced C5L2 and C5aR interaction in cultured 3T3-L1 adipocytes and J774 macrophages, (ii) the C5aR contribution in adipocyte metabolic and immune responses in mouse models, (iii) as well as C5L2 and C5aR association with obesity-related factors in humans. The immunometabolic receptors, C5L2 and C5aR, constitutively self-associate into homo-/heterodimers and ligand treatment of 3T3-L1 adipocytes and J774 macrophages increased their colocalization. Both C5a and ASP directly induced primary adipocyte signaling and function. However, in C5aRKO primary adipocytes, C5a effects were disrupted, while stimulatory effects of ASP were mostly maintained. Moreover, addition of C5a completely blocked ASP signaling and activity in both C5aRKO and WT primary adipocytes. Finally, C5L2 and C5aR expression in adipose tissue from morbidly obese women was associated with increased adiposity. Interestingly, ASP/C5L2 and C5L2/C5aR ratio markedly increased with abdominal obesity. Taken together, the closely linked physical, functional and physiological interaction between C5L2 and C5aR in adipocytes suggests a potential role in adipose tissue immunometabolism. This further highlights the important new links between adipose tissue and complement proteins/receptors and demonstrates how excessive immunometabolic responses may exacerbate adiposity.

Deux maladies rénales sont liées à une dérégulation du complément : le SHUa et la GNMP. La forme auto-immune du SHUa est liée à la présence d'auto-anticorps dirigés contre le Facteur H, également retrouvés dans des GNMP. La forme de SHUa-AI est caractérisée par la présence de complexes immuns circulants, une perturbation de la protection membranaire par le FH et de son interaction avec ses ligands protéiques, non retrouvées chez les patients atteints de GNMP. Les sites de liaison au FH sont différents, les anticorps associés au SHUa reconnaissent les régions N- et C-terminales tandis que les anticorps associés à une GNMP que la région N-terminale. Le déficit complet d'une protéine structurellement proche du FH (CFHR1) n'est associé qu'à la forme de SHUa-AI et pourrait jouer un rôle dans la génération et la pathogénicité des anticorps anti-FH. L'étude in silico des épitopes potentiellement présentés par HLA-A24 a révélé une possible cross-réactivité avec des protéines parasitaire, compatible avec l'étude clinico-biologique des patients atteints de SHUa-AI. Nos données suggèrent l'existence de mécanismes d'auto-immunisation liés à une perte de tolérance par deletion d'un gène et d'une réaction croisée avec une réponse anti-parasitaire chez ces patients atteints de SHUa. Dans la GNMP, les anticorps anti-FH sont fréquemment associés à un anticorps anti-C3 convertase ou à une immunoglobuline monoclonale révélant des mécanismes d'immunisation plus hétérogènes. Ces résultats permettent de mieux comprendre les différences physiopathologiques entre le SHUa et la GNMP, et pourraient révéler de nouveaux concepts généraux d'immunisation dans le cadre de maladies auto-immunes
Dysregulation of the complement System is linked to two different renal diseases: aHUS and MPGN The autoimmune form of aHUS is due to generation of autoantibodies directed Factor H. Moreover, we have characterized anti-FH IgG in patients presenting with MPGN. AI-aHUS patients had increased levels of FH-containing immune complexes and perturbation of FH-dependent cell-protection, in contrast to MPGN patients. AI-aHUS associated antibodies bound both N-and C-terminal domains of FH, while in case of AI-MPGN they bound the FH N-terminal domain only. The homozygous deletion of Factor H related protein CFHR1 is strongly associated with AI-aHUS and may play a role in the underlying mechanisms of anti-FH autoantibodies generation and in their pathological role. An in silico prediction of the epitopes potentially presented by the HLA-A24 was conducted and revealed a high sequence similarity between FH-derived peptides and peptides of a parasitic origin, correlated with the analysis of the clinical and biological symptoms of the AI-aHUS. Taken together, these results suggested that the mechanisms underlying the auto-immunization are related to a loss of tolerance due to a deletion of a FH homologous gene and a cross-reactivity towards a parasite antigen in AI-aHUS. In MPGN, anti-FH antibodies are frequently associated to monoclonal gammopathy or with other autoantibodies, directed against and stabilizing the C3 convertase, therefore revealing more heterogeneous mechanisms of immunization. These results led to a better understanding of the pathophysiological differencies between aHUS and MPGN. They could also reveal new auto-immunization scenario in autoimmune diseases

La formation du complexe C3b-H est essentielle au bon fonctionnement de la voie alterne du système du complément puisqu’elle permet d’inhiber la formation du complexe d’attaque membranaire à la surface de nos cellules, préservant l’organisme de toute destruction auto-immune. L’interaction de H avec C3b permet notamment de favoriser l’inactivation protéolytique de C3b par le facteur I, bloquant de ce fait l’activation de la voie alterne. Malgré l’importance du complexe C3b-H, l’interaction entre ces deux protéines à l’échelle moléculaire reste méconnue. En effet, à l’heure actuelle, aucune structure tridimensionnelle de ce complexe n’a pu être obtenue, que ce soit par cristallographie ou par résonance magnétique nucléaire, en raison de sa taille (335 kg.mol-1) et de la flexibilité de H. Cependant, la connaissance de l’organisation de ce complexe est nécessaire à la compréhension de la régulation de la voie alterne et pourrait de plus, se révéler utile quant au développement de thérapies vis-à-vis des maladies auto-immunes tel que le syndrome hémolytique et urémique atypique. Au cours de ces travaux, nous nous sommes donc intéressés à l’étude du complexe C3b-H à l’échelle de l’édifice entier par marquage oxydatif et pontage chimique couplés à la spectrométrie de masse. Ces approches expérimentales nous ont ainsi permis de proposer, à l’échelle de la molécule entière, un modèle tridimensionnel de ce complexe de haut poids moléculaire
The C3b-H complex plays an essential role in regulation of the complement alternative pathway (AP) because it blocks the attack membrane complex (MAC) formation on our self-surface, thus preserving host from autoimmune disease. The C3b-H interaction leads to the proteolytic inactivation of C3b induced by factor I, thus blocking the MAC formation and consequently AP activation. Despite this importance of C3b-H complex for the innate immunity, the mechanism of interaction between these two molecules at the molecular level remains to be established. Indeed, up to date, no three-dimensional structure of this complex is available, either by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance, due to its large size (335 kg.mol-1) and flexibility of H. Yet, these data are required for a better understanding of AP regulation and, might moreover, be useful for the implementation of therapy against autoimmune disorders. In this study, we investigate the C3b-H complex by using oxidative footprinting and cross-linking coupled with mass spectrometry. Our experimental approaches have been successfully applied, allowing us to propose a three-dimensional model of this high molecular complex

La proteine c3 du complement influence l'elaboration de la reponse immune specifique dirigee contre un antigene defini. L'etude presentee dans cette these contribue a demontrer que le fragment c3b du complement, en se fixant de facon covalente a un antigene d'origine exogene, module l'appretement de l'antigene par une cellule presentatrice de l'antigene. Des donnees bibliographiques recentes concernant l'appretement d'antigenes, le fragment c3b et son implication dans la reponse immune specifique sont presentees dans un chapitre d'introduction. L'etude experimentale decrite a ete realisee en utilisant des anticorps monoclonaux murins comme antigenes et des cellules monocytaires ou lymphocytaires b humaines comme cellules presentatrices ; des complexes covalents anticorps monoclonaux-c3b ont ete produits et caracterises. Les resultats obtenus sont exposes dans trois chapitres. Dans un premier chapitre, des experiences montrent que la presentation d'anticorps monoclonaux murins a des cellules t humaines specifiques de ces anticorps est modulee lorsqu'ils sont complexes au fragment c3b. Puis certaines des principales etapes de l'appretement des anticorps utilises sont caracterisees dans des cellules monocytaires u937 ou lymphocytaires b humaines non specifiques de l'antigene (fixation a des recepteurs membranaires, internalisation, transit intracellulaire, modifications biochimiques) ; enfin, l'influence de la liaison covalente entre anticorps et c3b sur ces differentes etapes est mise en evidence. Des hypotheses sont proposees concernant un role chaperon de c3b

C1q initie la voie classique du complement grace a sa region globulaire (gr). C3de correspond a la partie de c3b qui se fixe sur les cellules cibles. Nous avons cristallise ces proteines et enregistre un jeu de donnees a 3,2 a pour la gr, a 3,7 a pour c3de. Des problemes de reproductibilite et de taille des cristaux nous ont empeche de poursuivre l'etude. La subtilisine de bacillus lentus (savinase#t#m) est utilisee comme additif dans les detergents des lessives. Des inhibiteurs competitifs et reversibles (acides boroniques) sont ajoutes dans ces solutions pour eviter que la savinase#t#m ne degrade les autres enzymes presentes. Nous avons resolu la structure de 4 complexes a 2 a puis 1,7 a par remplacement moleculaire a partir d'une nouvelle forme cristalline. Les acides boroniques interagissent avec la proteine par une liaison covalente entre leur atome de bore et l'oxygene gamma de la serine active, et par des contacts hydrophobes entre leur groupement r et la poche de specificite s1. L'acide benzo furane 2 boronique (bf2ba) est l'inhibiteur le plus efficace parmi les 4 etudies. La reactivite entre le bore et la serine active depend de la nature du groupement r, du ph, de la concentration en inhibiteur. A partir du modele savinase#t#m/bf2ba, nous proposons des inhibiteurs potentiellement plus efficaces

Le systeme du complement a un role critique dans le developpement de la reponse immune specifique : la deficience acquise ou genetique de la proteine c3 affecte la production des anticorps contre des antigenes (ag) t-dependant. Cette proteine se lie covalemment aux ag lors de l'activation du systeme du complement et est progressivement proteolysee donnant des differents fragments : ic3b, c3dg, c3d qui restent lies a l'ag. Cr1 et cr2 sont deux recepteurs exprimes sur les lymphocytes b, t et les cellules dendritiques folliculaires. Cr1 fixe le fragment c3b et ic3b tandis que cr2 lie ic3b, c3dg et c3d. L'importance de cr1 et cr2 est soulignee par le fait que la production des ac specifiques des ag t-dependant peut etre inhibee par le blocage fonctionnel de ces recepteurs. Il semblerait que c'est au niveau des lymphocytes b que leur expression est essentielle, pour le controle de la reponse immune. Le role respectif de ces recepteurs dans l'internalisation est difficile a determiner du fait qu'ils sont toujours exprimes ensemble sur les lymphocytes b. Pour mieux definir leur role nous avons developpe un modele d'etude base sur la transfection des fibroblastes murins permettant l'expression de cr1, cr2 ou cr1 plus cr2. Nous avons etudie la capacite de ces recepteurs a fixer leurs ligands et a les internaliser. Nous montrons que cr1 et cr2 cooperent dans l'endocytose de c3b, c3b-c3b ou ic3b mais non dans l'endocytose de c3de ou j3d3, un anticorps specifiques de cr1. Pour expliquer cette cooperation, deux hypotheses ont ete emises : 1) apres fixation a cr1, le ligand pourrait etre endocyte ou proteolyse en ic3b ou c3dg, capte par cr2 et endocyte ; 2) un pontage de cr1 et cr2 induit par le ligand declencherait d'une maniere plus efficace les phenomenes d'internalisation, tels que la formation des puits a clathrine. Cette hypothese est particulierement favorisee par notre modele. Par ailleurs, nous avons etudie le role de cr1 dans la localisation intracellulaire des ag lies a c3b. Nous montrons que cet ag localise dans la peripherie cellulaire, en contraste avec l'ag libre qui se distribue dans toute la cellule. Cela pourrait impliquer un transit intracellulaire de l'ag different pouvant affecter sa proteolyse et/ou sa presentation aux lymphocytes t.

La biosynthèse du complément C3 par des cellules épithéliales de foie de rat est stimulée par des cytokines produites dans du milieu conditionné par des lymphomonocytes humains actives par un mitogène. Parmi elles, quatre interleukines définies, impliquées dans la réaction inflammatoire, l’IL-1α, l’'IL-1β, le TNFα et l'IL-6, ont été incubées avec les cellules hépatiques. L'IL-1α, l'IL-1β et le TNFα produits par recombinaison génétique ou d'origine naturelle stimulent individuellement la production de C3 de manière dose-dépendante. La réponse des cellules est abolie par l'immunosoustraction de l'interleukine du milieu d'incubation, démontrant sa participation directe à l'activité stimulante. L'incubation simultanée d'IL-1 et de TNFα stimule la production du C3 de manière additive. Par contre, l 'IL-6 naturelle possède une activité stimulante alors que sa forme recombinante en est dépourvue. Pourtant, des expériences de fixation spécifique de L'IL-6 radiomarquée sur les cellules révèlent que les formes naturelles et recombinantes possèdent la même affinité pour leur récepteur. L'activité stimulante de la préparation naturelle est partiellement diminuée par l'immunosoustraction de l’IL-6, et totalement restaurée par la substitution de la molécule naturelle par sa forme recombinante. L’IL-6 ne stimule donc pas directement la production du C3 mais amplifie l'activité stimulante de composants co-purifies. Cet effet synergique de l'IL-6 est confirmé par l'incubation simultanée de l’IL-6 et de l’IL-1 d'une part et du TNFα d'autre part. La contribution de l’IL-6 à l'activité stimulante de l'IL-1 et du TNFα peut donc résulter d'une régulation de l'expression des récepteurs spécifiques de chacune de ces deux cytokines. La mesure de la fixation spécifique d'IL-1 et de TNFα radiomarqués sur les membranes cellulaires permet d'identifier et de dénombrer les récepteurs respectifs et enfin de mesurer leur affinité pour le ligand. L'incubation des cellules avec l'IL-6 réprime rapidement et durablement l'expression des récepteurs de l'IL-1 et ne permet certainement pas d'expliquer la synergie entre ces deux molécules. Par contre, la régulation du nombre de récepteurs du TNFα, dont l'expression est multipliée par 9 en présence d’IL-6, peut parfaitement rendre compte de l'effet amplificateur de cette IL-6 sur la stimulation de la production hépatique du C3 par le TNFα.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune inflammatoire. La PR touche les articulations jusqu'à les détruire. Elle est caractérisée par la présence d’anticorps anti protéines citrullinées (ACPA) mais l’auto-antigène n’est toujours pas connu. Dans cette maladie, l’implication de l’immunité adaptative ne fait donc aucun doute mais le rôle de l’immunité innée reste encore flou. Le système du complément joue un rôle important dans l’immunité innée tout comme les récepteurs de type Toll (TLR) qui sont des récepteurs de celle-ci. C1q, par la reconnaissance des ses ligands, active une des voies du complément, la voie classique. Chez les patients atteints de PR, le complément est activé et un dépôt de C1q est retrouvé dans l’articulation. Le TLR9 reconnaît des ADN dérivés de bactéries ou de virus mais une expression à la surface des cellules pourrait conduire à la reconnaissance d’autres motifs comme les signaux de danger (DAMP). D’ailleurs, nous avons montré récemment qu’il existait un TLR9 exprimé à la surface des polynucléaires neutrophiles (PNN). Enfin, il a été mis en évidence récemment un nouveau mécanisme bactéricide effectué par les PNN : la formation de NET (neutrophil extracellular traps). Mais en dehors de leur rôle bactéricide, les NET ont été montrés comme pathogènes dans certaines maladies comme le lupus. Dans ce travail de thèse, je me suis intéressé à l’implication de ces acteurs, NET, C1q et TLR9 dans la PR. Nous avons montré que C1q est indispensable au développement de l’arthrite dans un modèle animal. De plus, l’expression des récepteurs au C1q par les PNN et les monocytes est corrélée à l’activité de la maladie et à l’inflammation. Nous avons montré que les NET représentent une cible pour les ACPA (ce qui en fait des auto-antigènes potentiels dans la PR) et que ces NET sont immunogènes. L’immunogénicité des NET est modulée par C1q. Enfin, il semblerait que le TLR9 ait moins d’importance dans l’arthrite. Par ce travail, nous avons montré l’importance du rôle joué par l’immunité innée dans la PR et ses modèles
Rheumatoid artthritis (RA) is the most frequent rheumatic disease. This auto-immune disease causes pain and joint destruction. RA has been characterized by adaptative immunity involvement and anti-citrullinated protein antibodies (ACPA) production. Involvement of innate immunity is less investigated. Complement system, part of innate immunity, is activated in RA. C1q activates classical complement pathway by binding its ligands. C1q is found in joint of RA patients. On the other hand Toll-like-receptor (TLR), innate receptors could play a role in RA upon recognition of pathogen-derived DNA (TLR9). Cell surface expression of TLR9 has been reported as potentially pathological, and we describe that polymorphonuclear neutrophils (PMN) express a cell surface TLR9 wich could recognize damage associated molecular pattern (DAMP). Finally, neutrophil extracellular traps (NET) wich are expelled chromatin fiber and represent a physiological response to bacteria, have been reported as pathological in certain circumstances. We investigated the role of those three innate actors in RA. We have shown that C1q is mandatory to develop experimental arthritis and expression of their receptors on RA patient PMN and monocytes is correlated with disease activity and inflammation. We have also shown that NET are immunogenic and this immunogenicity is partly modulated and mediated by C1q. NET might trigger ACPA production in RA. Finally, it seems that involvement of TLR9 is less important in RA. With those experiments we have shown that the involvement of innate immunity in RA is more important than that has been reported so far

Les premières étapes de développement du cerveau dépendent fortement de programmes génétiques. Après la naissance, les connexions neuronales deviennent susceptibles d’être remodelées en réponse à des changements de l’environnement. Cette plasticité culmine au cours de fenêtres temporelles appelées périodes critiques. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus. Dans le cadre de ma thèse, j’ai étudié les mécanismes qui sous-tendent la plasticité des réseaux au cours de deux périodes critiques chez la souris : la période critique de plasticité de dominance oculaire dans le cortex visuel et la période critique de l’élagage synaptique dans le cortex préfrontal. Dans une première étude, je me suis intéressée aux synapses excitatrices dans les interneurones PV du cortex visuel au cours du développement postnatal. Mes résultats suggèrent que la régulation développementale de l’expression de la protéine GRIP1 dans les interneurones PV gouverne la composition des récepteurs AMPA et la plasticité homéostatique des synapses, et pourrait jouer un rôle dans l’ouverture de la période critique du cortex visuel. Dans une deuxième étude, j’ai étudié les conséquences d’une expression élevée du gène du complément C4, qui chez l’homme prédispose à la schizophrénie, sur la maturation corticale. J’ai montré que la surexpression de C4 dans le cortex préfrontal cause plusieurs phénotypes qui, chez l’homme, ont été associés à la schizophrénie : perte d’épines dendritiques, modifications de la transmission portée par les récepteurs NMDA, altérations de la transmission GABAergique et déficits de la mémoire de travail
The early stages of brain development are largely determined by genetic programs. After birth, neuronal connections become susceptible to remodeling in response to changes in the environment. This plasticity culminates during specific time windows termed critical periods. The underlying mechanisms are still poorly understood. In my thesis, I studied the mechanisms underlying network plasticity during two critical periods in mice: the critical period of ocular dominance plasticity in the visual cortex and the critical period of synaptic pruning in the prefrontal cortex. In a first study, I studied the properties of excitatory synapses in PV interneurons of the visual cortex during postnatal development. My results suggest that the developmental regulation of GRIP1 protein expression in PV interneurons governs the composition of AMPA receptors and homeostatic synaptic plasticity, and may play a role in the opening of the critical period in the visual cortex. In a second study, I investigated the consequences of high expression of the C4 complement gene, which in humans predisposes to schizophrenia, on cortical maturation. I showed that overexpression of C4 in the prefrontal cortex causes several phenotypes that in humans have been associated with schizophrenia: loss of dendritic spines, changes in transmission carried by NMDA receptors, alterations in GABAergic transmission and deficits in working memory