Dissertations / Theses on the topic 'Récepteurs mu-opioïdes'

L'administration chronique par voie intracérébroventriculaire de thiorphan, un inhibiteur de l'enképhalinase, induit une tolérance à son effet analgésique, évalué par la latence du saut sur le test de la plaque chaude et à son effet stimulant moteur. Le développement de cette tolérance s'accompagne d'une diminution du taux d'ARN messagers de la préproenképhaline A striatale, précurseur des enképhalines endogènes tandis qu'aucune modification de l'activité enképhalinasique n'a été notée. La tolérance à l'effet analgésique de l'acétorphan n'est pas croisée avec celle de la morphine. De façon similaire la tolérance à l'effet analgésique de la morphine ou la sensibilisation à son effet stimulant moteur, développées par administration chronique sous-cutanée de l'opiacé, laisse inchangé l'effet antinociceptif et stimulant moteur de l'acétorphan. On n'a pas observé de signes patents de dépendance physique lors de l'injection de naloxone à des rats traités chroniquement par le thiorphan. Ceci paraît corroboré par l'absence de sensibilisation à l'effet stimulant moteur de l'inhibiteur après son administration chronique. Les agonistes dopaminergiques D2, de façon indépendante de leur effet hypothermisant, induisent une analgésie. Cette analgésie implique une voie opioïdergique mais non enképhalinergique. Une tolérance croisée, sur le test de la plaque chaude a été observée entre le piribédil (agoniste D2) et la morphine après leur administration chronique. L'intensité de cette tolérance paraît plus importante après l'administration chronique de l'opiacé

Il est aujourd'hui bien connu qu'il existe des compartimentations latérales au sein même de la membrane, définissant des domaines. Une grande attention a été portée ces dernières années à des domaines membranaires particuliers, les " rafts ". Ces domaines enrichis en cholestérol et sphingolipides seraient impliqués dans certains processus de signalisation cellulaires qui nécessitent un transfert de l'information à la fois spécifique et efficace, comme c'est le cas notamment des RCPG. Dans cette étude, le rôle de l'environnement lipidique sur l'activité de deux RCPG, les récepteurs humains µ et d aux opioïdes (hMOR et hDOR) a été recherché. Des fractions enrichies en cholestérol (DRM) ont été analysées après extraction à froid en TX-100 de membranes cellulaires et la présence des récepteurs hMOR ou hDOR a été recherchée. Les données indiquent que peu de hDOR et hMOR sont retrouvés dans ces fractions à l'état basal, mais la redistribution d'une partie de ces récepteurs dans les DRM, dépendante de l'association des récepteurs aux protéines G, est observée après activation par leur ligand agoniste. Les données de pharmacologie obtenues après modulation de la teneur en cholestérol des membranes contenant ces récepteurs ont montré clairement un effet de la déplétion en cholestérol sur la fonctionnalité de hMOR et hDOR. Enfin, pour mieux cerner le rôle du cholestérol dans la distribution et l'activité des récepteurs, l'influence d'un autre stérol, l'ergostérol, a été étudié. Une modulation éventuelle de l'activité du récepteur hDOR par l'épaisseur de la membrane a été analysée en reconstituant le récepteur dans des liposomes ayant des lipides de longueur de chaînes variables
Numerous evidences show the existence of lateral heterogeneities within the plasma membranes defined as lipid domains. Among these, lipid rafts, have been extensively studied. They are characterised by an enrichment in cholesterol and sphingolipids, and are depicted as fluid plaforms that segregate membrane components involved in a particular signaling process, like signal transduction of GPCR, promoting the specificity and the efficiency of the response. Here we study the role of the lipidic environment on the activity of two GPCRs, namely human mu and delta opioid receptors (hMOR and hDOR). Cholesterol, which is a main component implicated in the formation of rafts, was here the subject of a particular interest. Membranes fractions that were enriched in cholesterol (DRM) were analysed after cold extraction by TX-100 of cellular membranes. The data we obtained show that hMOR and hDOR are found in DRM at a basal state. In contrast, when activated by an agonist, a relocalisation of a fraction of these receptors is observed in DRM and we show that this phenomenon is dependant of the association of these receptors with G-proteins. The analysis of pharmacological properties of hDOR and hMOR upon cholesterol depletion show clearly that some pool of receptors need cholesterol for function. To complete these data, we next examined whether this effect was due to direct interactions of the receptors with cholesterol or membrane thickness. To test this assumption, we have investigate the effect of ergosterol on hMOR and hDOR pharmacology and the acyl-chain length of the phospholipids on the function of the reconstituted hDOR

Au cours de ce travail, nous avons étudié le crosstalk fonctionnel entre récepteurs opioïdes mu et delta en conditions récompensantes induites par des stimuli naturels tels que la nourriture appétente et/ou l’exercice physique ou par des drogues telles que la morphine. En utilisant les souris doubles knock-in mu-mCherry /delta-eGFP, nous avons montré que l’hétéromérisation de mu et delta altère la signalisation et le trafic du récepteur mu en réponse au peptide opioïde met- enképhaline, mais pas β -endorphine, en culture primaire d’hippocampe et in vivo. Nous avons également montré qu’une administration chronique de morphine élargit la coexpression neuronale de mu et delta dans le cerveau. Ces changements persistent après 4 semaines d’abstinence indiquant leur caractère durable. Dans la seconde partie de la thèse, nous avons cartographié les connexions de la région subfornicale de l’hypothalamus latéral (LHsf) chez la souris et nous avons examiné l’activation des récepteurs mu et delta dans cette région après privation de nourriture et restauration de l’accès à des aliments riches en gras ou contrôle. Dans le LHsf, connecté de façon réciproque à de nombreuses régions de l’hypothalamus ou en lien avec le système de la récompense, la privation de nourriture induit l’internalisation des récepteurs delta quel que soit le régime alimentaire tandis que l’accès à la nourriture active les récepteurs mu et delta différemment selon le type de régime alimentaire. Enfin, l’expression des gènes opioïdes a été mesurée chez des rats nourris de façon chronique avec un accès libre au gras et au sucré et la possibilité de faire de l’exercice physique. Une interaction entre ces deux paramètres n’a été mise en évidence que sur l’expression du récepteur delta dans l’hypothalamus latéral
In the thesis, we studied the functional cross-talk between mu and delta opioid receptors in rewarding conditions elicited by natural stimuli such as palatable food and/or exercise or by drugs of abuse such as morphine. Using mu-mCherry/delta-eGFP double knock-in mice, we showed that mu-delta heteromerization alters mu opioid receptor signaling and trafficking in response to the endogenous opioid peptide met-enkephalin, but not β-endorphin, in primary hippocampal cultures and in vivo. We also showed that chronic morphine administration extended mu-delta neuronal co-expression throughout the brain which persisted after 4 weeks abstinence, pointing to morphine-induced long- lasting changes. In the second part of the thesis, neuroanatomical connections of the subfornical area of the lateral hypothalamus (LHsf) were mapped in mice and examined the activation of mu and delta receptors in this region following fasting and refeeding in HF diet and chow diet. Within the LHsf, which was reciprocally connected to many hypothalamic and reward related brain areas, fasting internalized delta receptors irrespective to the diet regimen whereas refeeding differentially activated mu and receptors in chow-fed and HFD-fed animals. Finally, opioid system related gene expression was measured in the long-term fc-HFHS fed and voluntary wheel running rats, which only revealed an interaction effect for delta opioid receptor expression in the LH

Les récepteurs mu aux opioïdes (MORs) jouent un rôle central dans l’addiction et ce majoritairement via le contrôle qu’ils exercent sur les phénomènes de récompense. Les effets des MORs sur le système de récompense sont généralement attribués à leur expression dans le circuit mésocorticolimbique. Les MORs sont toutefois exprimés dans d’autres régions du cerveau, notamment dans une petite structure cérébrale épithalamique qui exprime la plus forte densité de MORs : l’habénula médiane (MHb). Le rôle de cette population spécifique de récepteurs n’a jamais été exploré, malgré l’implication fortement suggérée dans la littérature de l’habénula dans l’addiction et les processus de récompense/aversion sous-jacents. Nous avons donc généré un modèle de souris knockout conditionnel chez lesquelles nous supprimons les MORs uniquement dans l’habénula et nous les avons soumis à des tests comportementaux dans le but d’évaluer les fonctions de ces récepteurs et leur impact sur le comportement avec un focus sur les processus aversifs, cognitifs et récompensant. Nos résultats révèlent que les récepteurs mu que nous supprimons dans l’habénula limitent l’aversion somatique et affective mais ne modulent ni les réponses locomotrices, analgésiques et de récompense à la morphine, ni les fonctions cognitives que nous avons testées. Nous identifions donc pour la première fois une population de MORs dans l’habénula qui freinent l’aversion et nous suggérons par là-même que les récepteurs mu de l’habénula pourraient être cruciaux dans le stage «sevrage aversif» des cycles d’addiction
Mu opioid receptors (MORs) have been extensively studied for their addictive properties that are thought to operate through the control of reward processes. While the importance of MORs in reward is generally attributed to their presence in the mesocorticolimbic circuitry, their role in the medial habenula (MHb), the structure in which MORs are most densely expressed, remains unexplored to date. This is quite surprising given the increasing literature on the habenula’s role in addiction as well as reward/aversion processes. Here we generated a conditional knockout mouse model that lacks MORs solely in the MH band we investigated the contribution of habenular MORs in brain functions and behavioural out comes with emphasis on reward, aversion and cognition. While the performance of our mutant model did not differ in locomotor, analgesic and reward responses to morphine norincognitive tasks compared to control mice, we uncovered a novel role for MORs in aversive states.This is the first report demonstrating that MORs control both somatic and affective aversion specifically at the level of the MHb. Habenular MORs could thus be crucial to the aversive with drawal stage of addiction cycles that is thought to increase craving and prevent success in quitting

Le by-pass gastrique Roux-en-Y (BPG) est une chirurgie de l'obésité qui induit des améliorations spectaculaires de l'homéostasie glucidique indépendamment de la perte de poids. Un mécanisme proposé pour expliquer ces améliorations est une augmentation de la production intestinale de glucose (PIG) qui induit des effets bénéfiques sur l'organisme (satiété, amélioration de la sensibilité hépatique à l'insuline). Cette augmentation de la PIG, retrouvée chez la souris ayant subi un BPG simplifié, est également responsable des effets bénéfiques des régimes enrichis en protéines via l'inhibition des récepteurs mu-opioïdes (RMO) par les peptides. Nous avons donc testé l'hypothèse selon laquelle les effets bénéfiques du BPG dépendraient d'une inhibition des RMO par les protéines alimentaires et nous avons également testé le rôle causal de la PIG dans ces améliorations métaboliques. Pour cela, nous avons réalisé un by-pass duodéno-jéjunal (BDJ), ie un BPG sans restriction gastrique, chez des souris sauvages (WT), des souris invalidées pour le gène du RMO (MOR-/-) et des souris dépourvues de PIG (I-G6pc-/-). Chez les souris obèses, Le BDJ induit une forte perte de poids (–30%), en partie expliquée par une malabsorption lipidique, ainsi qu'une amélioration des paramètres glucidiques dépendante de cette perte de poids. Au contraire, chez la souris de poids normal, le BDJ n'induit ni perte de poids ni malabsorption mais améliore la tolérance au glucose. Les effets sont les mêmes chez les souris WT, MOR-/- et I-G6pc-/- ce qui montre que les récepteurs mu-opioïdes et la PIG ne semblent pas avoir de rôle causal dans les améliorations du métabolisme énergétique et glucidique après BDJ
Roux-en-Y gastric bypass procedure (GBP) is an obesity surgery that induces dramatic glucose homeostasis improvements independently of weight loss. A proposed mechanism to explain these glucose homeostasis improvements is an increase in intestinal glucose production (IGP) that induces beneficial effects on metabolism (satiety, improved liver insulin sensitivity). This increase in IGP is found in mice that have undergone a simplified GBP and is also responsible for the beneficial effects of protein-enriched diets through the inhibition of mu-opioid receptors (MOR) by alimentary peptides. We therefore hypothesized that the beneficial effects of GBP could depend on MOR inhibition by dietary proteins and we also tested the causal role of IGP in these metabolic improvements. For this purpose, we performed a duodenal-jejunal bypass surgery (DJB), ie GBP without gastric restriction, in wild-type mice (WT), in mice lacking MOR gene (MOR-/-) and in mice lacking IGP (IG6pc-/-). In obese mice, DJB induced a rapid and substantial weight loss (-30%), partly explained by fat malabsorption, and weight loss-dependent improvements of glucose homeostasis. In contrast, in the non-obese mice, DJB did not induce weight loss nor malabsorption but improved glucose tolerance. Effects were similar in WT, MOR-/- and I-G6pc-/- mice showing that mu-opioid receptors and IGP did not appear to have a causal role in glucose and energy metabolism improvements after DJB

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT
We address the question of the existence of a specific membrane organization which could favor the interactions between the G protein coupled receptor (GPCR), the G protein and the effector. Here we examine the lateral diffusion of the human mu opioid receptor (hMOR) in regard to its activation by ligands and to membrane environment modifications. The T7-EGFP-hMOR stably expressed in SH-SY5Y is found to be fully functional. Its mobility analysis was achieved using two complementary biophysical approaches which are vrFRAP (variable radii fluorescence recovery after photobleaching) and SPT (single particle tracking). At 22°C these analyses reveal a double compartimentation of the receptors in permeable domains (about 1 µm radius) and in smaller domains (200 nm radius). Moreover receptors exhibiting a directed diffusion are observed. The temperature was modulated, the actin cytoskeleton was partially destroyed, and the G protein/receptor interaction was impeded to determine the sources of the receptor organisation. It appears that many parameters are playing a part in the complex receptor organisation. Our results show that the interactions of hMOR with G proteins or with the cortical cytoskeleton influence its membrane organisation. Antagonists binding don't modify the receptor organisation in permeable sub-micrometer size domains. On the contrary agonists binding induce a decrease of both the domain size and the diffusion coefficient. Our results highlight the influence of numerous parameters on the hMOR dynamic organisation. They demonstrate the interest of a conjoint use of vrFRAP and SPT approaches to obtain a global vision of a protein plasma membrane organisation

Le Neuropeptide FF (FLFQPQRFa, NPFF) est un neurotransmetteur peptidique, caractérisé par son activité pharmacologique anti-opioïde. Ce peptide active deux récepteurs couplés aux protéines G, NPFF1 et NPFF2. De nombreuses données suggèrent que le NPFF module l'activité opioïde par un effet direct sur les récepteurs opioïdes situés sur les mêmes neurones plutôt que via un effet indirect dû à une modification d'un circuit neuronal. Néanmoins, les mécanismes moléculaires sous-jacents de ce cross-talk entre les récepteurs sont encore mal compris. Ce travail est composé de deux parties principales : 1) les mécanismes anti-opioïdes médiés par les récepteurs du Neuropeptide FF. Nous avons testé les activités directes et anti-opioïdes des récepteurs NPFF sur les canaux calciques voltage-dépendants activés par dépolarisation sur des neurones du noyau raphé dorsal (DRN) de souris. Le récepteurs NPFF dans ces neurones sont préférentiellement couplés aux protéines G de type Gi/o. Les effets directs et anti-opioïdes induits par les récepteurs NPFF interviennent dans des gammes de concentration différentes indiquant que l'activité anti-opioïde spécifique n'est pas une conséquence directe de leur activité sur les canaux calciques. De plus, nous avons comparé ces interactions entre récepteurs NPFF et NOP (nociception, N/OFQ) observés sur des neurones dissociés de souris avec celles observés sur une lignée cellulaire de neuroblastome humain, SH-SY5Y. Les données obtenues en imagerie calcique et dans le test de stimulation de liaison du [35S]GTPyS aux protéines G, montrent un rôle potentiel important des radeaux membrane/lipides (rafts), qui agirait comme une plateforme de signalisation dans les effets du NPFF. 2) le rôle du Neuropeptide FF dans la dépression. Afin de tester le rôle potentiel pharmacologique du NPFF dans la dépression, des injections locales du 1DMe, un analogue du NPFF, ont été réalisées dans le DRN de souris. Nous avons observé une forte activité de cet analogue dans le test de suspension de la queue test et dans le "splash test", comme respectivement une diminution des temps d'immobilité et une augmentation du temps de toilettage. Du fait de l'existence d'un fort effet antidépressif des antagonistes des récepteurs NOP après injection dans le DRN et de l'effet cellulaire anti-N/OFQ du NPFF que nous avons démontré, il est plausible d'envisager que le NPFF possède un effet antidépressif via son action anti-opioïde sur les récepteurs nociceptine
Neuropeptide FF (FLFQPQRFa, NPFF) is considered as a potent opioid-modulating peptide. It exhibits the opioid-modulation effect by activating two G protein-coupled receptors, NPFF1 and NPFF2. Several observations suggest that the anti-opioid effect of NPFF is more likely mediated by a cross-talk between NPFF and opioid receptors in the same neuron rather than an indirect effect due to a neuronal circuitry. Nevertheless, the precise molecular mechanisms underlying the cross-talk between both receptors remain need to be investigated. This work is composed of two main parts : 1) Neuropeptide FF receptors and the molecular mechanisms of their anti-opioid effect. We tested both direct and anti-opioid activities of NPFF receptors on Ca2+ transient induced by depolarization in mouse dorsal raphe nucleus (DRN) neurons. The NPFF receptor preferentially coupled with Gi/o proteins, which induced the direct activity. Different threshold to observe the direct and anti-opioid effect of NPFF suggested that the specific anti-opioid activity of NPFF receptors was not a direct consequence of their activity on Ca2+ transients. Furthermore, we studied the molecular mechanisms underlying the cross-talk between NPFF and NOP (Nociceptin/Orphanin FQ, N/OFQ) receptors in mouse DRN neurons and SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Data from Ca2+ imaging, [35S]GTPyS binding assay and western blot indicated that cholesterol-rich lipid rafts, which acted as a "platform", were involved in NPFF anti-N/OFQ effect, and the siRNA interference data showed that GRK2 protein mediated this process. 2) The potential role of Neuropeptide FF in anti-depressant response. In order to test the potential role of Neuropeptide FF in anti-depression, the NPFF analogue 1DMe was locally injected into mouse DRN. We observed a decrease of immobility time and an increase of grooming time, in tail suspension test and splash test, respectively, after 1DMe treatment. RF9, the specific antagonist of NPFF receptors, reversed the anti-depression effect of 1DMe. Referencing the strong anti-depression effect of NOP receptor antagonists after DRN injection and the cellular anti-N/OFQ activity of NPFF receptors in this nucleus, the hypothesis that the anti-depression effect of NPFF may due to its cellular anti-N/OFQ activity is interesting to be further verified

La buprénorphine (BPN), un traitement de substitution pour les héroïnomanes, fait souvent l’objet d'abus et de mésusages notamment en association avec les benzodiazépines (BZDs). Notre but était d'étudier l'effet d'une BZD (clorazépate dipotassique : CRZ) sur la régulation des récepteurs opioïdes µ, δ et κ, seule ou en association avec la BPN. Des rats Wistars ont été injectés en aigu ou en chronique (21 jours) avec du CRZ (i. P. ; 20 mg/kg) seul ou associé de la BPN (s. C. ; 0,15 mg/kg). Un β-imager nous a permis de quantifier la liaison de ligands spécifiques de chacun des sous types de récepteurs et de calculer le Bmax (nombre maximum de liaisons du ligand) ainsi que le Kd (constante de dissociation) sur les coupes de cerveaux de rats. Nos résultats ont montré a) que le CRZ seul avait modifié la densité des récepteurs opioïdes et/ou l'affinité des différents ligands vis-à-vis de leurs récepteurs spécifiques b) que la régulation de ces récepteurs induite par la BPN pouvait être modifiée par l'addition de CRZ. Ces effets dépendant de la localisation cérébrale des différents sous types, pourraient avoir des conséquences comportementales au niveau de l'addiction, en fonction des structures cérébrales impliquées, et expliquer l’appétence des toxicomanes pour ces associations
Buprenorphine (BPN), a substitution therapy for heroin addicts, is largely abused and misused specially in association with benzodiazépines (BZDs). With the aim to explain this craving, we investigated the regulation of opioid receptors subtypes µ, δ and κ induced by dipotassium clorazepate (CRZ) alone or in combination with BPN. Wistars rats were injected acutely (once a day) or chronically (21 days) with CRZ (i. P. ; 20 mg/kg) alone or in combination with BPN (s. C. ; 0,15 mg/kg). Using a β-imager, we investigated the binding parameters (Bmax and Kd) of three specific tritiated radioligands on rat brain sections. Our results showed that a) CRZ acts on density of opioid receptors and/or affinity of specific ligands b) the down- and/or up-regulation induced by BPN and the opioid ligands affinity were quantitatively modified when CRZ was added to BPN c) effects on opioid receptors were region dependent. Opioid receptors structures are implicated in different hedonic behaviors and their regulation modified by a BZD could explain the abuse of BPN-BZD association

Les étapes membranaires de la transduction du signal médiée par les récepteurs couplés aux protéines G ne sont pas complètement compris. Grâce à une approche de suivi de particule unique nous avons étudié la diffusion latérale du récepteur æ au opioi͏̈des à la surface de fibroblastes transfectés de façon stable par un récepteur " taggé ". Nos travaux ont permis de distinguer deux types de comportements diffusionnels : 10 % des récepteurs présentent une diffusion dirigée ou lente et 90 % une diffusion " confinée avec marche " combinant une diffusion confinée aux temps courts et une marche aléatoire aux temps longs. Une analyse statistique montre que le confinement observé est dû à des interactions attractives inter-protéines à longue distance en l'absence de barrières extra ou intra-membranaires. Nous proposons un modèle théorique simple qui explique les comportements diffusionnels aux temps courts et aux temps longs ainsi que les variations des coefficients de diffusion avec la taille des domaines. .
G protein coupled receptors are involved with other partners in a signal transduction pathway whose mechanism is still not completely understood. We used single particle tracking to study the real time lateral movements of the æ opioid receptor on the surface of fibroblast cells stably transfected by a T7-tagged æ opioid receptor. Two populations could be distinguished : 10% of the receptors exhibit a directed diffusion mode and 90% have a "walking confined diffusion" mode combining a short term confined diffusion with a long term random walk. .

L’utilisation des opioïdes est à l’origine de phénomènes de tolérance et d’hyperalgésie induite (HIO) aussi bien chez l’animal qu’en utilisation clinique. Ces phénomènes surviennent avec tous les opioïdes de manière dose-dépendante. Les mécanismes qui les sous-tendent sont complexes et imparfaitement connus. Le rémifentanil et le sufentanil sont les opioïdes les plus utilisés en France en anesthésie-réanimation. Leur utilisation s’accompagne d’une HIO qui majore la douleur postopératoire et peut être responsable de la persistance de la douleur à long terme. La perception des stimuli nociceptifs chez un patient sous anesthésie générale n’est pas aisée et repose encore sur des signes cliniques indirects d’activation du système sympathique. Ces signes peu sensibles et peu spécifiques conduisent à sous doser ou sur-doser les patients en opioïdes. Récemment, un nouvel outil de monitorage de la nociception est apparu, l’analgesia nociception index (ANI). L’ANI reflète le tonus parasympathique et de ce fait permettrait aux anesthésistes de mieux adapter le dosage des opioïdes. Dans cette thèse, nous avons d’abord évalué la sensibilité et la spécificité de l’ANI à détecter les stimuli nociceptifs, puis montré qu’elles étaient supérieures à celles des signes cliniques, et supérieures à d’autres indices de monitorage proposés. Ensuite nous avons validé la capacité de l’ANI à guider l’analgésie peropératoire du rémifentanil dans différentes situations.Sur le plan expérimental, nous avons exploré, après une exposition courte ou prolongée à différentes doses de rémifentanil et de sufentanil, les mécanismes associés à l’hyperalgésie thermique in vivo, chez la souris, et ex vivo, sur la voie des MAP kinases ERK1/2 et sur le trafic membranaire des récepteurs opioïdes de type µ (MOR) dans différentes cultures cellulaires. Chez la souris, nous avons mis en évidence une hyperalgésie précoce au saut sur plaque chaude, après exposition aux doses les plus élevées de rémifentanil, mais pas avec le sufentanil. De plus, nous n’avons pas observé d’HIO sur le léchage des pattes.Sur les cultures cellulaires, le rémifentanil comme le sufentanil activent la voie des MAPK ERK1/2 lors d’une exposition courte, avec apparition d’une désensibilisation lorsque l’exposition se prolonge. Le rémifentanil comme le sufentanil induisent une internalisation précoce et progressive des récepteurs MOR
The use of opioids is associated with tolerance and induced hyperalgesia (OIH). Tolerance and OIH occur with all opioids and have been demonstrated both, in animals and in humans and are likely to be dose-dependent. The underlying mechanisms are complex and partially known. Remifentanil and sufentanil are the most used opioids in France in anesthesia and intensive care. Their use is associated with OIH that increases postoperative pain and may be responsible for persistent pain. In anesthetized patients, nociceptive stimuli are still detected according to clinical signs of sympathetic activation. These signs lack sensitivity and specificity and lead to underdosing or overdosing opioids. Recently, the analgesia nociception index (ANI), has been proposed as surrogate marker of nociception. The ANI reflects the parasympathetic tone and thus may allow anesthetists to better adapt the opioid dosage. In this thesis, we first evaluated the sensitivity and specificity of ANI to detect nociceptive stimuli, and showed that it better detects them than do clinical signs or than other currently available monitoring tools. Subsequently, we validated the ability of the ANI to adequately guide the intraoperative dosing of remifentanil in different clinical setting.After acute and sustained exposure to different doses of remifentanil and sufentanil we investigated, in vivo, the mechanisms associated with thermal hyperalgesia in mice, and ex vivo, the effect on the MAP kinase ERK1/2 pathway and the μ-type opioid receptor (MOR) membrane trafficking in human neuroblastoma and embryonic kidney cell cultures. In mice, high-dose remifentanil induced early hyperalgesia assessed by the jumping latency in a hot-plate test, but not the sufentanil. We did not observe OIH for the hind paw licking test. On cell cultures, after short exposure, both remifentanil and sufentanil produced activation of the MAP kinase ERK1/2 pathway, and rapid desensitization and internalization of the MOR

Le système opioïde contrôle la douleur et la récompense, et le récepteur opioïde mu est la cible moléculaire de l’analgésie et de la dépendance aux opiacés. Dans la première partie de la thèse, nous avons montré que ce récepteur est également nécessaire au développement de l’hyperalgie se développant lors d’une administration chronique de morphine. Dans la seconde partie de thèse, nous avons étudié l’impact des interactions entre systèmes opioïde et cannabinoïde sur les effets associés à l’administration chronique de morphine. Nous avons exploré les effets d’un prétraitement avec un agoniste sélectif du récepteur cannabinoïde CB1, l’arachidonyl-2-chloroethylamide (ACEA) sur le développement de réponses nociceptives morphiniques, le sevrage, la récompense et des comportements naturels. L’étude comportementale a été complétée par des analyses transcriptionnelles et fonctionnelles afin d’identifier les processus neuroadaptatifs mis en jeu. Nos travaux montrent que l’activation des récepteurs CB1 et Mu présentent des effets bénéfiques sur les paramètres comportementaux associés à l’addiction, suggérant un intérêt thérapeutique potentiel à associer ces composés en clinique
The opioid system controls pain and reward, and the Mu opioid receptor plays a central role in these effects. In the first part of the thesis, we showed that Mu receptor is also involved in the development of hyperalgesia induced by chronic opiate exposure. In the second part of the thesis, we studied the impact of opioid and cannabinoid interactions on effects associated to chronic morphine administration. We explored the effects of a pretreatment with a CB1 cannabinoid receptor selective agonist, arachidonyl-2-chloroethylamide (ACEA), on morphine-associated nociceptive, withdrawal, reward and naturalistic behaviors. To complete this behavioral study, we performed transcriptional and functional analyses to identify the neuroadaptative processes involved. Our study demonstrates that dual activation of CB1 and Mu receptors has a beneficial effect on behavioral parameters related to addiction, pointing to potential usefulness of combining both medications for therapeutic interventions

Les antidépresseurs présentent un délai d'efficacité de deux à trois semaines, qui correspondrait à la mise en place d'un ensemble de mécanismes adaptatifs neuronaux. Un traitement chronique par la paroxétine, inhibiteur sélectif de la recapture de la sérotonine, ne modifie pas la densité du transporteur vésiculaire des monoamines (VMAT2) et de son ARN messager dans le cerveau de rat. L'immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase diminue transitoirement dans le locus coeruleus au 14 ème jour de traitement par la paroxétine et revient au niveau des témoins après 21 jours. Cette régulation est commune à plusieurs antidépresseurs et révèlerait les interactions entre les systèmes à sérotonine et à noradrénaline (NA). Après des traitements de courte durée par la paroxétine (4 et 7 jours), la densité de liaison de la 3H-naloxone (déplaçable par le DAGO) aux récepteurs est augmentée dans des régions limbiques et corticales. Après 21 jours, cette densité est diminuée dans le thalamus. La réboxétine, inhibiteur sélectif de la recapture de la NA et le moclobémide, inhibiteur réversible de la monoamine oxydase de type A modifient la densité de sites de liaison de la 3H-naloxone (sensible au DAGO) dans des régions cérébrales différentes. Bien qu'il n'existe pas de trait commun aux trois antidépresseurs, ces régulations apparaissent dans des régions impliquées dans la physiopathologie dépressive. Une étude parallèle concernant les récepteurs montre des profils de réponse différents selon l'antidépresseur étudié. La liaison de la 3H-nociceptine augmente dans le raphé dorsal au cours d'un traitement chronique par la paroxétine. Au 4ème jour, l'augmentation de cette densité s'accompagne de l'augmentation du couplage du récepteur

La protection des enképhalines contre leur dégradation enzymatique conduit, chez le rat comme chez la souris, à une augmentation de la locomotion tant dans ses composantes horizontale que verticale. Les résultats de notre étude suggèrent que les enképhalines endogènes stimulent la locomotion en activant les récepteurs opioïdes delta. Cette modulation semble correspondre à une mobilisation de la dopamine stockée dans les vésicules synaptiques. Ce contrôle exercé par les enképhalines se traduit, en outre, par une augmentation du métabolisme de la dopamine et par une diminution de la liaison in vivo de la [3H]-N-propyl-norapomorphine dans les structures limbiques de rat et le striatum de souris. La libération de dopamine a également été évaluée, in vivo, par la technique de microdialyse cérébrale. L'administration intrastriatale de peptides opioïdes mu et delta conduit localement à une libération accrue de dopamine. L'étude de l'influence de la lésion de neurones striataux par l'acide kaïnique sur les effets stimulants exercés par les agonistes opioïdes mu indiquent que les récepteurs opioïdes mu (impliqués dans le contrôle de la libération striatale de dopamine) sont probablement localisés sur des neurones prenant naissance dans le striatum alors que les récepteurs delta sont plutôt situés sur des terminaisons striatales de neurones extrinsèques, chez le rat

L'addiction ou dépendance aux substances psychoactives est une affection chronique, fréquente et grave, émaillée de rechutes et de périodes d'abstinence. Les études épidémiologiques montrent que l'abstinence aux opiacés est fortement associée à une prévalence accrue de la dépression. Nous résumons ici les principaux aspects cliniques de la dépendance aux opiacés et de la dépression, en détaillant leurs mécanismes physiopathologiques. Puis, nous présentons notre modèle d'abstinence aux opiacés chez la souris. Suite à un traitement morphinique chronique et au cours de l'abstinence apparaissent progressivement des comportements apparentés à la dépression. Ce traitement morphinique modifie profondément le fonctionnement du système sérotoninergique, notamment dans le noyau du raphé dorsal. De plus, les déficits comportementaux observés peuvent être prévenus par un traitement chronique par la fluoxétine, un antidépresseur ciblant ce système. Nous avons généralisé ce modèle à l'héroïne, un autre opiacé illicite. Nous avons révélé par des approches génétiques de délétion constitutive et conditionnelle les rôles distincts des 3 récepteurs opioïdes (mu, delta et kappa) lors de l'abstinence à l'héroïne. Enfin, nous avons initié une étude de caractérisation, à l'échelle de l'ensemble du génome, des adaptations transcriptomiques (ARN messagers et micro-ARN) dans le noyau du raphé dorsal au cours de l'abstinence à l'héroïne et du traitement antidépresseur. Ce travail devrait permettre d'améliorer notre compréhension des mécanismes neurobiologiques à l'œuvre dans la comorbidité entre dépendance aux opiacés et dépression et pourrait suggérer de nouvelles pistes thérapeutiques.

L'activation du récepteur µ pour les opioïdes (MOR) dans l'intestin diminue la motricité tout en exerçant un puissant effet analgésique. Plusieurs études réalisées in vitro suggèrent que ce récepteur serait également impliqué dans la régulation de l'inflammation. Le but de notre travail était d'étudier le rôle et la régulation de MOR au niveau du côlon au cours de processus inflammatoires. Notre étude a montré que (1) l'administration préventive ou curative d'agonistes de MOR entraînait une diminution significative par rapport au placebo des scores macroscopiques, des scores histologiques et des concentrations de MPO, d'ARNm du TNFa et de l'IL-1b, (2) Les souris MOR-/- développaient une colite nécrosante sévère et diffuse, rapidement fatale. (3) L'injection curative des agonistes permettait de limiter les lésions du côlon par une action anti-proliférative sur les lymphocytes CD45RBHigh. La rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont deux maladies inflammatoires intestinales (MICI) dont l'étiologie est inconnue. Nous avons observé que la principale source de MOR dans l'intestin de témoins sains et de patients atteints de MICI étaient les macrophages, les lymphocytes T CD4 et CD8+ ainsi que le système nerveux entérique. Au cours de l'inflammation, les MOR étaient surexprimés par les cellules mononuclées du sang périphérique et de la lamina propria intestinale de patients atteints de MICI par rapport à des patients témoins. Cette augmentation de l'expression de MOR était corrélée aux taux d'ARNm du TNFa chez les patients atteints de MICI et dépendante de la voie de transduction du signal NF-kB. Enfin un effet anti-inflammatoire du à l'activation de MOR a été mis en évidence à partir de biopsies humaines de patients atteints de MICI impliquant une action sur les lymphocytes CD4+, cellules clefs dans la physiopathologie des MICI. L'activation des MOR exerce un puissant effet anti-inflammatoire in vivo chez la souris et ex vivo chez l'homme. L'effet combiné des agonistes sélectifs sur la motricité, la douleur abdominale et l'inflammation pourrait rendre attrayant leur utilisation thérapeutique dans les MICI
The principal roles of µ opioid receptor (MOR) agonists are analgesia, inhibition of intestinal motility and secretions. More recently, immunoregulation and anti-inflammatory functions have been described in vitro. In a first study, we evaluated the involvement of MOR in intestinal inflammation. These experiments revealed a reduction of colitis by the administration of both MOR agonists (DALDA and DAMGO), reflected by increased survival rates, an improvement of the different biological parameters and an inhibition of T cells proliferation. Moreover, MOR-/- mice displayed an increased susceptibility to TNBS-induced colitis compared to WT mice. Ulcerative colitis and Crohn's disease are the main human inflammatory bowel diseases (IBD), characterized by unknown etiology and no curative treatment is available to date. We observed that the principal source of MOR in healthy controls and IBD patients intestine were macrophages, CD4+ and CD8+ T lymphocytes, as well as enteric nervous system. During inflammatory process, MOR were overexpressed by the peripheral blood and intestinal lamina propria mononuclear cells of IBD patients compared to control patients. This MOR overexpression was correlated with the TNFa mRNA levels in IBD patients and dependent of the NF-kB transduction pathway. Moreover, anti-inflammatory properties of MOR agonists were highlighted by using human biopsies of IBD patients, implying an involvement on the CD4+ T cells as major key cells in the IBD physiopathology. To conclude, we have shown that MOR activation exerts a powerful anti-inflammatory effect in vivo in mice and ex vivo in human. Combined properties of the selective agonists on motility, abdominal pain and inflammation could offer new strategies in the treatment of IBD

La prise en charge et le soulagement de la douleur représentent une nécessité médicale majeure. La morphine demeure l'antalgique le plus puissant utilisé en clinique mais elle comporte des effets indésirables. Elle agit principalement sur le récepteur des opioi͏̈des de type mu, un récepteur appartenant à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G. Comprendre les interactions ligand-récepteur et les modifications conformationnelles qui en résultent constitue une étape indispensable à l'interprétation de l'action des opioi͏̈des au niveau moléculaire. De plus, la conception de molécules à effet thérapeutique basée sur la structure des récepteurs apparaît de plus en plus comme un outil précieux en chimie médicinale. Dans le cas des opioi͏̈des, cette stratégie n'est pas appplicable puisque aucune structure cristallographique de ces récepteurs n'est disponible. Or, ces récepteurs sont naturellement très faiblement exprimés. Des systèmes de surexpression appropriés sont donc requis pour obtenir d'importantes quantités de protéine pure et active. Ce travail a débuté par les essais de solubilisation et purification du récepteur humain des opioi͏̈des de type mu (hMOR) surexprimé dans les cellules Sf9 infectées par un baculovirus recombinant. Face aux difficultés rencontrées, un nouveau système d'expression inductible basé sur l'obtention de lignées stables dans des cellules Schneider S2 de Drosophila melanogaster a été mis en place. De manière innovante, le récepteur hMOR a été couplé à l'EGFP afin de permettre le suivi, la localisation, la quantification de manière directe et le développement d'un protocole de purification. Le récepteur produit a été caractérisé d'un point de vue biochimique et pharmacologique et sa purification a été entreprise. En parallèle, nous avons souhaité adapter la technique de mesure de la capacité de liaison du récepteur EGFPhMOR par transfert d'énergie de résonance de fluorescence avec différents ligands opioi͏̈des rendus fluorescents
Pain management and treatment represent a major unmet medical challenge. Morphine remains the most potent painkiller used clinically, despite secondary side effects. It principally acts on the mu opioid receptor that belongs to the superfamily of the G-Protein-Coupled receptors. Interpretation of the opioid mode of action at the molecular level needs that we understand how the receptor and ligands interact with each other and what are the associated conformational changes. Moreover, the integration of structure-based methods, virtual screening, and combinatorial chemistry can provide the basis for more efficient drug design. In the case of opioids, this strategy is not applicable because these receptors are not yet amenable to structure based drug design due to the lack of three-dimensional structures. These receptors are endogenously poorly expressed so appropriate overexpression systems are required to obtain the large amounts needed for crystallization. This work began with solubilization and purification trials of the human mu opioid receptor (hMOR) overexpressed in baculovirus-infected Sf9 cells. Because difficulties we encountered, a new system of expression based on stable cell lines and on an inducible expression in Drosophila melanogaster Schneider S2 cells was developed. In an innovating way, the receptor was fused to the EGFP to follow, localize, directly quantify and develop a purification protocol. The produced receptor EGFPhMOR was biochemically and pharmacologically characterized and we began the purification process. In parallel, we wished to adapt the measurement of the binding capacity of the receptor based on the fluorescence resonance energy transfer between the EGFP fused to the receptor and opioid ligands wa made fluorescent

Bien que les opioïdes représentent la classe d’analgésique la plus efficace, les traitements de la douleur par les opioïdes présentent différents effets indésirables limitant leur efficacité. Le récepteur opioïde  (MOR) exprimé par les neurones des ganglions dorso-rachidiens (DRG) est impliqué dans une partie de l’analgésie induite par la morphine ainsi que dans la tolérance (MIT) et l’hyperalgésie (MIH) induites par la morphine. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la MIT et la MIH sont sans cesse redéfinis. Les facteurs moléculaires essentiels impliqués dans la transduction du signal du MOR sont encore méconnus, empêchant le développement de thérapies permettant d’améliorer l’efficacité analgésique des opioïdes en évitant leurs effets secondaires. Récemment, notre équipe a démontré le rôle de FLT3 dans le développement et la maintenance des douleurs neuropathiques (NP) après lésion nerveuse. Au vu des mécanismes moléculaires communs entre NP et MIH, nous supposons que FLT3 exprimé par les neurones du DRG module l’analgésie morphinique en interagissant avec MOR. Nous avons découvert que MOR et FLT3 sont colocalisés au niveau du DRG et l’activation de FLT3 induit une MIT et une MIH au travers d’une interaction physique avec le MOR. Des approches in vitro ont révélé l’implication de voies signalétiques FLT3-dépendantes dans la régulation de l’effet inhibiteur de la morphine sur des cellules HEK293T co-exprimant MOR et FLT3. La délétion de FLT3 empêche l’apparition de MIT, de MIH et de potentiation à long terme au niveau spinal chez les murins sans altérer l’effet antinociceptif de la morphine. Le blocage extracellulaire de FLT3 par le BDT001 a permis de mettre en évidence une potentiation de l’effet analgésique morphinique tandis que le test du CPP a révélé un blocage des effets récompensants de la morphine. Sur un modèle de douleur chronique inflammatoire (CFA), le BDT001 peut prévenir la MIT et la MIH induits par le traitement chronique morphinique et est en mesure d’améliorer l’efficacité analgésique morphinique. Ensemble, ces résultats suggèrent une fonction essentielle de l’activité de FLT3 dans la modulation de l’activation du MOR et de ses fonctions
Despite opioids are the most effective class of analgesics, opioid pain medications have detrimental side effects limiting their analgesic efficacy. Morphine Opioid Receptors (MOR) expressed in Dorsal Root Ganglion (DRG) sensory neurons drive part of morphine analgesia and are involved in morphine-induced tolerance (MIT) and hyperalgesia (MIH). Although knowledge of the neural mechanisms underlying MIT and MIH has gradually advanced, the essential molecular factors involved in opioid receptor signal transduction are still unknown, which has prevented the development of efficient therapies to maximize and sustain opioid analgesic efficacy. Our team has previously shown that the Fms-Like Tyrosine kinase 3 receptor (FLT3) in DRG sensory neurons is critical for the development and the maintenance of neuronal hyperexcitability after nerve injury-induced Neuropathic Pain (NP). Since NP shares common mechanisms with MIH, we hypothesize that peripheral neuronal FLT3 modulates morphine analgesia by interacting with peripheral MOR. We found that MOR and FLT3 are colocalized and FLT3 activation induces MIT and MIH through a physical interaction with MOR in DRG neurons. Therefore, in vitro approaches revealed an involvement of FLT3-dependent signaling pathways in the regulation of morphine analgesia in HEK293T cells co-expressing MOR and FLT3. Deletion of FLT3 reduced MIT, MIH and long-term potentiation without altering morphine antinociception. In fact, extracellular blockade of FLT3 with BDT001 potentiated morphine analgesia while CPP paradigm revealed a blockade of morphine reward effects. On a pain model of chronic inflammatory pain (CFA), BDT001 prevented MIT and MIH development with chronic morphine administration and improved morphine efficacy during treatment. Altogether, these data suggest a trigger function of FLT3 activity on MOR peripheral activation and functions

Les opiacés demeurent des molécules incontournables dans le traitement des douleurs moyennes à sévères. Si leur efficacité dans le traitement de la douleur aiguë est incontestable, leur utilisation chronique est responsable de nombreux effets indésirables comprenant une hypersensibilité à la douleur et une tolérance à leurs effets analgésiques. Une partie de ces effets secondaires résulteraient de l’activation de systèmes anti-opioïdes endogènes, comme les neuropeptides RF-amide, dont des études précédentes suggèrent une complémentarité de fonctionnement dans la modulation de la douleur. Le premier axe de travail de cette thèse fut de développer les outils moléculaires afin d’étudier la possibilité d’interactions fonctionnelles et d’hétérodimérisation de ces récepteurs, en particulier GPR103 et NPFF1R. Nous avons ainsi pu générer et caractériser des lignées cellulaires exprimant les différents récepteurs à peptide RF-amide avec un fluorophore fusionné à leur extrémité amino-terminale. En parallèle, nous avons pu développer au cours d’une collaboration fructueuse avec deux équipes de chimistes un ligand à dualité d’action, agoniste opioïdergique et antagoniste des récepteurs NPFF1R et NPFF2R. Chez la souris, nous avons montré que l’administration sous-cutanée de ce composé produit une analgésie longue durée, qui n’est pas atténuée par le développement de tolérance analgésique ou d’hyperalgésie après une semaine d’administration quotidienne. Le syndrome de sevrage, précipité par la naltrexone est plus faible après l’administration chronique de ce composé qu’avec l’agoniste opioïdergique de référence. De plus, grâce à ses caractéristiques d’agoniste biaisé sur le récepteur MOR, cette molécule induit une plus faible dépression respiratoire chez la souris
Opioid analgesics continue to be the cornerstones for treating moderate to severe pain. However, upon chronic administration, their efficiency is limited because of prominent side effects, such as tolerance and dependence. One hypothesis for the occurrence of these side effects is that the chronic stimulation of the opioid system may trigger its endogenous counterparts, anti-opioid systems, producing hyperalgesia and analgesic tolerance. Previous data from our lab and others suggest that RF-amide peptide receptors can modulate pain signalling through cross-interactions. We developed cell lines expressing fluorescent RF-amide receptors for the study of functional crosstalk and heterodimerization between RF-amide peptide receptors, i.e. GPR103 and NPFF1R. Through a productive collaboration with two teams of chemists, we identified and characterized multitarget peptidomimetic compounds that combined G protein-biased agonism and NPFFR antagonism. In accordance with in vitro results, we observed that acute subcutaneous administration of this compound produced long-lasting antinociceptive effects with less respiratory depression in mice. No hypersensitivity nor analgesic tolerance developed after chronic administration. Altogether, this molecule showed potent antinociceptive effect with limited side effects upon acute and chronic administration

La buprénorphine (BPN), un traitement de substitution pour les héroïnomanes, fait souvent l’objet d’abus et de mésusages en association, en particulier, aux benzodiazépines (BZD). Après avoir montré qu’une BZD (clorazépate dipotassique) induisait des modifications de densité des récepteurs aux opioïdes et d’affinité de trois ligands spécifiques, notre objectif était de vérifier si cet effet était constant pour la classe des BZD, s’il était fonction de la dose efficace, de la pharmacocinétique ou du potentiel de mésusage de chaque BZD. L’effet sur la régulation des récepteurs µ-opioïdes de cinq BZD ou apparentées (alprazolam, clonazépam, flunitrazépam, loprazolam, zolpidem), en association avec la BPN, a été étudié. Toutes ces BZD modifient la régulation des récepteurs µ induite par la BPN en majorant leur densité. Afin de permettre d’étudier, chez l’homme, la contribution relative de chacun des trois types de récepteurs aux opioïdes dans l’addiction, l’analgésie et l’anesthésie, des traceurs spécifiques à forte affinité utilisables en Tomographie par Emission de Positons ou en Tomographie d’Emission MonoPhotonique ont été caractérisés in vitro en évaluant affinité, sélectivité ou activité intrinsèque. Une nouvelle approche méthodologique de déplacement compétitif de liaison de ligands marqués utilisant des coupes de tissus et un radio-imager temps réel de haute sensibilité a été parallèlement développée et validée. L’évaluation ex vivo (métabolisme, biodistribution cérébrale et périphérique et liaison spécifique) chez le petit animal des molécules les plus prometteuses, radiomarquées, a permis de proposer deux nouveaux radioligands spécifiques mu et kappa
Buprenorphine (BPN), a substitution therapy for heroin addicts, is largely abused and misused especially in association with benzodiazepines (BZD). First, we have shown that a BZD (dipotassium clorazepate) acts on density of opioid receptor subtypes and affinity of three specific ligands. Consequently, our aim was to investigate if this effect was constant for the BZD class, if it was function of the effective dose, the pharmacokinetic or the abuse potential of each BZD. Five BZD or related (alprazolam, clonazepam, flunitrazepam, loprazolam, zolpidem) in combination with BPN were tested to measure their effect on the regulation of µ-opioid receptors. All the studied BZD modify the regulation of µ-opioid receptors induced by BPN by increasing their density. In order to study, in human, the contribution of each opioid receptor subtypes in drug-addiction, pain or anaesthesia, specific tracers with good affinity usable in Positron Emission Tomography or Single Photon Emission Tomography were characterized in vitro by evaluating affinity, selectivity or intrinsic activity. A new methodological approach of competitive displacement binding on tissue sections and using a high-resolution radio-imager was developed and validated. Ex vivo evaluation of the most promising compounds (metabolism, cerebral and peripheral biodistribution and specific binding) in small animals, once radiolabeled, allowed to put forward two new radioligands for in vivo imaging of mu and kappa opioid receptors

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.
Opium (opioids) and cannabis (cannabinoids) derivatives present many interesting properties. Following the identification of their respective receptors, various pharmacological strategies have tried to exploit their analgesic properties. The cloning of cannabinoid CB1 and CB2 receptors has promoted the discovery of endogenous agonists of these receptors named endocannabinoids. The two mostly studied endocannabinoids are anandamide and 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). This has also led to the identification of enzymes that catalyze the inactivation of these endogenous cannabinoids: a fatty acid amide hydrolase or FAAH and a monoacylglycerol lipase or MAGL. It is known that the endogenous cannabinoid system is upregulated in a variety of pathological processes, such as inflammatory and neuropathic pain. This increase is usually interpreted as a physiological response to restore homeostasis and it was particularly observed in the periphery. Endocannabinoids seem to act specifically at key moments in targeted tissues to minimize the consequences related to the onset of pain. This observation is very interesting from a therapeutic perspective because it suggests the possibility of targeting the endocannabinoid degrading enzymes in order to increase their local concentrations and thus prolong their neuromodulatory action. At the peripheral level, the activation of cannabinoid receptors induces beneficial antinociceptive effects while minimizing side effects often associated with their central activation. We focused our work on the peripheral modulation of this endogenous system using inhibitors of endocannabinoid degrading enzymes to assess their therapeutic potential and to elucidate the mechanisms of action underlying their effects in animal models of inflammatory and neuropathic pain. We have demonstrated that this approach can relieve the symptoms associated with these two types of pain, through the activation of CB1 and CB2 receptors. The opioid and cannabinoid systems have similarities, including comparable locations along the pain pathways, mechanisms of action relayed by G protein-coupled receptors and common pharmacological properties such as analgesia. The opioid system is involved in the antinociceptive effects induced by cannabinoids. In contrast, the participation of the cannabinoid system in those induced by morphine remains uncertain. We have demonstrated that peripheral and spinal antinociceptive effects induced by morphine are reduced in genetically modified mice in which the expression of CB1 and CB2 receptors was eliminated, suggesting a role for these receptors in the effects of morphine. We have further demonstrated that the decrease in morphine-induced analgesia in these mice is not caused by a malfunction of the mu opioid receptors (MOP) or by a down-regulation of these receptors. Our results confirm the existence of functional interactions between cannabinoid and opioid systems at the peripheral and spinal levels. These findings are promising from a therapeutic perspective since a targeted modulation of the levels of endocannabinoids and endogenous opioids would induce potentially synergistic beneficial analgesic effects while minimizing side effects associated with the central activation of these systems.