Academic literature on the topic 'Receptores acoplados a proteína G (GPCR)'

Los efectos de los factores de crecimiento y de ciertas hormonas se deben a la activación de receptores con actividad intrínseca de cinasa de tirosina (o RTK’s, por receptor tyrosine kinases), cuya estimulación inicia cascadas de señalización intracelular que regulan eventos transcripcionales esenciales para la proliferación y la diferenciación celulares. Entre los efectos debidos a la estimulación de los RTK’s, destaca la activación de la familia de cinasas de proteína activadas por mitógeno o MAPK’s (mitogen-activated protein kinases). Existen evidencias que indican que la estimulación de algunos receptores acoplados a proteínas G (o GPCR’s, por G protein-coupled receptors) resulta en la activación de RTK’s en ausencia de un ligando para estos últimos. Este proceso ha sido denominado transactivación, y depende de señales intracelulares inducidas por la estimulación de GPCR’s en las que participan tanto las subunidades a como los complejos bg de las proteínas G, así como fenómenos de fosforilación mediados por diferentes cinasas. En este artículo se revisan las características estructurales de ambos tipos de receptores (GPCR’s y RTK’s), los mecanismos responsables de su activación y los procesos involucrados en el fenómeno de transactivación de RTK’s por activación de GPCR’s.

A maioria dos hormônios polipeptídicos e mesmo o cálcio extracelular atuam em suas células-alvo através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Nos últimos anos, tem sido freqüente a identificação e associação causal de mutações em proteínas G e em GPCRs com diversas endocrinopatias, como diabetes insipidus nefrogênico, hipotiroidismo familiar, puberdade precoce familiar no sexo masculino e nódulos tiroidianos hiperfuncionantes. Nesta revisão, abordamos aspectos referentes ao mecanismo de transdução do sinal acoplado à proteína G, e descrevemos como mutações em GPCRs podem levar a algumas doenças endócrinas. Finalmente, comentamos a respeito das implicações diagnósticas e terapêuticas associadas com o maior conhecimento dos GPCRs.

As ações fundamentais das gonadotrofinas hipofisárias na vida sexual reprodutiva de ambos os sexos dependem da integridade estrutural e funcional dos seus respectivos receptores. Os receptores das gonadotrofinas localizados na membrana citoplasmática são membros da grande família dos receptores acoplados à proteína G e apresentam uma estrutura comum caracterizada por uma extensa porção extracelular e setes hélices transmembranas. A recente identificação de mutações inativadoras e ativadoras de ocorrência natural nos genes dos receptores do LH e do FSH contribuíram para a maior compreensão de estados patológicos gonadais. Neste trabalho, revisamos os aspectos moleculares dos defeitos dos genes dos receptores das gonadotrofinas e suas implicações fenotípicas no sexo feminino. Nas mulheres com mutações inativadoras em homozigose nestes genes, sintomas freqüentes como alterações menstruais (amenorréia secundária e oligoamenorréia) e infertilidade podem alertar o endocrinologista para o estabelecimento do diagnóstico definitivo da resistência ovariana ao LH ou ao FSH.

ResumenSe han implicado anomalías en el sistema serotonérgico en la patofisiología de los trastornos depresivos. Las plaquetas humanas poseen receptores de serotonina-2A (5-HT2A), e investigaciones anteriores que han utilizado LSD o ketanserina como ligandos han indicado que su número se incrementa en los pacientes deprimidos. Comparado con otros ligandos utilizados antes en los estudios de plaquetas, el DOI es muy selectivo para el receptor 5-HT2A y se fija a su estado de alta afinidad, marcando por tanto sólo los receptores que están asociados biológicamente a la proteína G. Determinamos la densidad (Bmax) y la afinidad (Kd) de receptores 5-HT2A marcados por [l25I]-DOI en las plaquetas de 21 pacientes no tratados con depresión mayor y 21 voluntarios sanos. Se encontró que la densidad de los sitios de fijación de 5-HT2A se incrementaba en las plaquetas de las pacientes deprimidas en comparación con los controles. No se observaron cambios en la Kd. No encontramos ninguna relación entre los parámetros de fijación y la gravedad del episodio depresivo o las tendencias suicidas de los pacientes. Nuestros resultados muestran que el número de receptores 5-HT2A acoplados de las plaquetas se incrementa en los pacientes deprimidos, lo que indica que la función del receptor 5-HT2A de las plaquetas aumenta en la depresión.

OBJETIVO: Este artigo revisa o sistema endocanabinoide e as respectivas estratégias de intervenções farmacológicas. MÉTODO: Realizou-se uma revisão da literatura sobre o sistema endocanabinoide e a sua farmacologia, considerando-se artigos originais ou de revisão escritos em inglês. DISCUSSÃO: Canabinoides são um grupo de compostos presentes na Cannabis Sativa (maconha), a exemplo do Δ9-tetraidrocanabinol e seus análogos sintéticos. Estudos sobre o seu perfil farmacológico levaram à descoberta do sistema endocanabinoide do cérebro de mamíferos. Este sistema é composto por pelo menos dois receptores acoplados a uma proteína G, CB1 e CB2, pelos seus ligantes endógenos (endocanabinoides; a exemplo da anandamida e do 2-araquidonoil glicerol) e pelas enzimas responsáveis por sintetizá-los e metabolizá-los. Os endocanabinoides representam uma classe de mensageiros neurais que são sintetizados sob demanda e liberados de neurônios pós-sinápticos para restringir a liberação de neurotransmissores clássicos de terminais pré-sinápticos. Esta sinalização retrógrada modula uma diversidade de funções cerebrais, incluindo ansiedade, medo e humor, em que a ativação de receptores CB1 pode exercer efeitos dos tipos ansiolítico e antidepressivo em estudos préclínicos. CONCLUSÃO: Experimentos com modelos animais sugerem que drogas que facilitam a ação dos endocanabinoides podem representar uma nova estratégia para o tratamento de transtornos de ansiedade e depressão.

Interacción entre un fragmento peptídico del receptor tipo 1 de angiotensina humano y sistemas miméticos de membrana biológica Interaction between a peptide fragment of the human receptor type 1 of angiotensin and model membranes Nélida Marín Huachaca1, Clóvis R. Nakaie2 y Shirley Schreier1 1 Departamento de Bioquímica de la Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes 748, CEP: 05513-970 São Paulo, Brasil 2 Departmento de Biofísica de la Universidade Federal de São Paulo, Rua 3 de Maio 100, CEP: 04044-020, São Brasil. DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2015.0019/ Resumen El receptor tipo 1 de angiotensina (AT1) humano pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a Proteínas G (GPCR). Estudios conformacionales de fragmentos peptídicos de GPCR requiere el uso de sistemas que mimeticen el ambiente del receptor. El presente estudio propone investigar la interacción del fragmento peptídico Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), que corresponde a los residuos de aminoácidos 92 100 del primer bucle extracelular del receptor AT1 humano, con sistemas miméticos de membrana biológica micelas y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las micelas fueron preparadas a partir de los lisofosfolípidos: 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilcolina (LPC) y 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilglicerol (LPG), mientras que, las LUV fueron preparadas a partir de 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) y 1-palmitoil-2oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). El péptido fEC1 fue sintetizado por el método de síntesis en fase sólida. Se realizaron medidas de fluorescencia utilizando, como sonda fluorescente intrínseca, el residuo de triptófano (W94), presente en la secuencia de aminoácidos de fEC1. La longitud de onda de excitación (exc) fue de 195 nm. Los espectros de fluorescencia de fEC1 (10 M) fueron obtenidos en concentraciones crecientes de lisofosfolípidos o de fosfolípidos. La intensidad de fluorescencia del péptido aumentó en la presencia de micelas tanto zwitteriónica (LPC) como aniónica (LPC: LPG, mol:mol) y, en la presencia de LUV aniónica (POPC:POPG, mol:mol). Asimismo, se observaron desplazamientos de las longitudes de onda de emisión máxima (max) hacia el azul. Las alteraciones espectrales observadas son debido a la sensibilidad del triptófano a la polaridad del medio en que se encuentra. A partir de las isotermas de interacción fueron determinadas las constantes de asociación (Ka). De acuerdo a estos valores, la interacción del péptido con los sistemas aniónicos fue mayor que con los zwitteriónicos debido a la contribución de fuerzas electrostáticas. Para los estudios de supresión de fluorescencia se utilizó acrilamida como supresor colisional y se determinaron las constantes de Stern-Volmer. Conforme a estos valores, el fluoróforo está más expuesto a la acrilamida cuando fEC1 está en solución que cuando está en la presencia de sistemas biomiméticos, lo cual es debido a la interacción del péptido con estos sistemas. Asimismo, se calcularon los valores de anisotropía de fluorescencia (r) los cuales están relacionados al movimiento de difusión rotacional de un fluoróforo. De acuerdo a estos datos, el péptido presenta mayor movimiento de difusión rotacional en medio acuoso que cuando interactúa con los sistemas modelo. Los resultados obtenidos, a través de la fluorescencia de estado estacionario, muestran la interacción del fragmento peptídico fEC1 con micelas de lisofosfolípido, LUV de POPC: POPG y, en menor extensión, con LUV de POPC. Descriptores: Receptor AT1 humano, dicroísmo circular, fluorescencia, sistema mimético de membrana biológica. Abstract The type 1 angiotensin (AT1) receptor belongs to G protein coupled receptors (GPCR) superfamily. Conformational studies of GPCR peptide fragments require the use of systems that mimic the receptor environment. The current study aims to investigate the interaction of the peptide fragment Ac-YRWPFGNYLCONH2 (fEC1), corresponding to amino acid residues 92 -100 of the first extracellular loop of the human AT1 receptor, with model membranes –micelles and large unilamellar vesicles (LUV). The micelles were prepared from lysophospholipids: 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (LPC) and 1-palmitoyl-2-hydroxysn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (LPG) and, LUVs were prepared from 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG). The peptide fEC1 was synthesized by solid-phase synthesis. Fluorescence measurements were performed using the tryptophan residue (W94), present in the amino acid sequence of fEC1, as an intrinsec fluorescent probe. The excitation wavelength (exc) was 195 nm. The fluorescence spectra of fEC1 (10 µM) were obtained at increasing concentrations of lysophospholipids or phospholipids. The fluorescence intensity of peptide in the presence of zwitterionic (LPC) and anionic (LPC: LPG, mol:mol) micelles and in the presence of anionic LUV (POPC:POPG, mol:mol) increased. Besides, upon addition of these model systems, a blue-shift of the maximum emission peak of the peptide was observed. The spectral changes observed are due to the sensitivity of tryptophan to the polarity of the medium. From the binding isotherms, binding constants (Kb) were determined. According to these values, the binding of the peptide with the anionic systems was higher than with the zwitterionic ones, this is due to the contribution of electrostatic forces. For fluorescence quenching studies, acrylamide was used as a collisional quencher, thus, SternVolmer constants were determined. According to these data, the fluorophore is more exposed to acrylamide when fEC1 is in solution than in the presence of the biomimetic membrane. Moreover, the values of fluorescence anisotropy (r) which are related to the rotational diffusion of a fluorophore were calculated. According to these data, the peptide showed higher rotational diffusion in aqueous medium than in presence of model systems. The results obtained by steady-state fluorescence show the binding of the peptide fragment fEC1 with lysophospholipid micelles, POPC: POPG LUV and, in lesser extent, with POPC LUV. Keywords: Human AT1 receptor, circular dichroism, fluorescence, model membrane.

Interacción entre un fragmento peptídico del receptor tipo 1 de angiotensina humano y sistemas miméticos de membrana biológica Interaction between a peptide fragment of the human receptor type 1 of angiotensin and model membranes Nélida Marín Huachaca1, Clóvis R. Nakaie2 y Shirley Schreier1 1Departamento de Bioquímica de la Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes 748, CEP: 05513-970 São Paulo, Brasil 2Departmento de Biofísica de la Universidade Federal de São Paulo, Rua 3 de Maio 100, CEP: 04044-020, São Brasil. DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2016.0003/ Resumen El receptor tipo 1 de angiotensina (AT1) humano pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a Proteínas G (GPCR). Estudios conformacionales de fragmentos peptídicos de GPCR requiere el uso de sistemas que mimeticen el ambiente del receptor. El presente estudio propone investigar la interacción del fragmento peptídico Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), que corresponde a los residuos de aminoácidos 92 -100 del primer bucle extracelular del receptor AT1 humano, con sistemas miméticos de membrana biológica -micelas y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las micelas fueron preparadas a partir de los lisofosfolípidos: 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilcolina (LPC) y 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilglicerol (LPG), mientras que, las LUV fueron preparadas a partir de 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) y 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). El péptido fEC1 fue sintetizado por el método de síntesis en fase sólida. Se realizaron medidas de fluorescencia utilizando, como sonda fluorescente intrínseca, el residuo de triptófano (W94), presente en la secuencia de aminoácidos de fEC1. La longitud de onda de excitación (lexc) fue de 195 nm. Los espectros de fluorescencia de fEC1 (10 mM) fueron obtenidos en concentraciones crecientes de lisofosfolípidos o de fosfolípidos. La intensidad de fluorescencia del péptido aumentó en la presencia de micelas tanto zwitteriónica (LPC) como aniónica (LPC: LPG, mol:mol) y, en la presencia de LUV aniónica (POPC:POPG, mol:mol). Asimismo, se observaron desplazamientos de las longitudes de onda de emisión máxima (lmax) hacia el azul. Las alteraciones espectrales observadas son debido a la sensibilidad del triptófano a la polaridad del medio en que se encuentra. A partir de las isotermas de interacción fueron determinadas las constantes de asociación (Ka). De acuerdo a estos valores, la interacción del péptido con los sistemas aniónicos fue mayor que con los zwitteriónicos debido a la contribución de fuerzas electrostáticas. Para los estudios de supresión de fluorescencia se utilizó acrilamida como supresor colisional y se determinaron las constantes de Stern-Volmer. Conforme a estos valores, el fluoróforo está más expuesto a la acrilamida cuando fEC1 está en solución que cuando está en la presencia de sistemas biomiméticos, lo cual es debido a la interacción del péptido con estos sistemas. Asimismo, se calcularon los valores de anisotropía de fluorescencia (r) los cuales están relacionados al movimiento de difusión rotacional de un fluoróforo. De acuerdo a estos datos, el péptido presenta mayor movimiento de difusión rotacional en medio acuoso que cuando interactúa con los sistemas modelo. Los resultados obtenidos, a través de la fluorescencia de estado estacionario, muestran la interacción del fragmento peptídico fEC1 con micelas de lisofosfolípido, LUV de POPC: POPG y, en menor extensión, con LUV de POPC. Descriptores: Receptor AT1 humano, dicroísmo circular, fluorescencia, sistema mimético de membrana biológica. Abstract The type 1 angiotensin (AT1) receptor belongs to G protein coupled receptors (GPCR) superfamily. Conformational studies of GPCR peptide fragments require the use of systems that mimic the receptor environment. The current study aims to investigate the interaction of the peptide fragment Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), corresponding to amino acid residues 92 -100 of the first extracellular loop of the human AT1 receptor, with model membranes –micelles and large unilamellar vesicles (LUV). The micelles were prepared from lysophospholipids: 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (LPC) and 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (LPG) and, LUVs were prepared from 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG). The peptide fEC1 was synthesized by solid-phase synthesis. Fluorescence measurements were performed using the tryptophan residue (W94), present in the amino acid sequence of fEC1, as an intrinsec fluorescent probe. The excitation wavelength (lexc) was 195 nm. The fluorescence spectra of fEC1 (10 µM) were obtained at increasing concentrations of lysophospholipids or phospholipids. The fluorescence intensity of peptide in the presence of zwitterionic (LPC) and anionic (LPC: LPG, mol:mol) micelles and in the presence of anionic LUV (POPC:POPG, mol:mol) increased. Besides, upon addition of these model systems, a blue-shift of the maximum emission peak of the peptide was observed. The spectral changes observed are due to the sensitivity of tryptophan to the polarity of the medium. From the binding isotherms, binding constants (Kb) were determined. According to these values, the binding of the peptide with the anionic systems was higher than with the zwitterionic ones, this is due to the contribution of electrostatic forces. For fluorescence quenching studies, acrylamide was used as a collisional quencher, thus, Stern-Volmer constants were determined. According to these data, the fluorophore is more exposed to acrylamide when fEC1 is in solution than in the presence of the biomimetic membrane. Moreover, the values ​​of fluorescence anisotropy (r) which are related to the rotational diffusion of a fluorophore were calculated. According to these data, the peptide showed higher rotational diffusion in aqueous medium than in presence of model systems. The results obtained by steady-state fluorescence show the binding of the peptide fragment fEC1 with lysophospholipid micelles, POPC: POPG LUV and, in lesser extent, with POPC LUV. Keywords: Human AT1 receptor, circular dichroism, fluorescence, model membrane

O estudo fitoquímico do extrato etanólico de caules adultos de Araucaria angustifólia resultou no isolamento e identificação da vanilina, p-hidroxibenzaldeído, coniferaldeído, dois isoflavonóides (cabreuvina e irisolidona), quatro lignanas (pinoresinol, eudesmina, lariciresinol e 9\'-O-acetato de lariciresinol) e &#946;-sitosterol. Foi desenvolvido um protocolo para a obtenção de calos, a partir de caules de plântulas estioladas, dos quais foram isolados e caracterizados mistura de isômeros E e Z do p-cumarato de octadecila e do ferulato de octadecila.<br>Phytochemical investigations carried out on ethanolic extract from woods of Araucaria angustifolia resulted on the isolation and identification of vanillin, p-hydroxybenzaldehyde, coniferaldehyde; two isoflavones (cabreuvine and irisolidone); four lignans (pinoresinol, eudesmine, lariciresinol and 9\'-O-lariciresinolacetate), and &#946;-sitosterol. Its callus culture was showed to accumulate mixtures of isomers E and Z of octadecyl p-cumarate and of octadecyl ferulate.

El Objetivo General de esta Tesis ha sido investigar la formación y función de heterómeros entre receptores de dopamina y otros receptores que puedan estar implicados en la regulación de la transmisión dopaminérgica, como receptores de galanina, histamina, adrenérgicos o receptores sigma-1. Basándonos en que tanto la galanina como la dopamina modulan la liberación de acetilcolina en el hipocampo, se ha demostrado que los receptores de dopamina de la familia D1 (receptores D1 y D5) pueden formar heterómeros con los receptores de galanina Gal1 y Gal2 y se ha estudiado la función de estos heterómeros en la liberación de acetilcolina en el hipocampo. En el estriado, los receptores de dopamina D1 se localizan en las neuronas GABAérgicas dinorfinérgicas donde también se localizan receptores de histamina H3. Este hecho permite formular la hipótesis de que estos receptores de histamina modulen la transmisión dopaminérgica mediante la formación de heterómeros y que esto pueda explicar algunos de los resultados contradictorios sobre las interacciones funcionales entre receptores H3 y receptores de dopamina. Teniendo en cuenta todo ello, se ha demostrado que los receptores de dopamina D1 pueden formar heterómeros con los receptores de histamina H3 y se han estudiado las implicaciones funcionales de estos heterómeros en cultivos celulares y en el estriado. Las vías dopaminérgicas y especialmente la señalización mediada por los receptores D1 y D2 de dopamina, están profundamente implicadas en la adicción a cocaína. Una gran parte de los efectos mediados por la cocaína se atribuyen a una sobre-estimulación de la señalización de los receptores de dopamina debida al incremento de dopamina ocasionado por la inhibición por cocaína del transportador de dopamina (DAT). Sin embargo, la cocaína, además de interaccionar con DAT, puede unirse a otras proteínas como los receptores sigma-1. En este contexto, es interesante conocer si los receptores sigma 1 pueden modular la funcionalidad de los receptores de dopamina D1 y D2 mediante un proceso de heteromerización. Por ello, se ha demostrado que los receptores D1 y D2 de dopamina pueden formar heterómeros con los receptores sigma-1 e investigado el efecto que ejerce la cocaína, mediado por estos heterómeros, en la transmisión dopaminérgica. El receptor de dopamina D4 pertenece a la familia de receptores de dopamina D2 y, en humanos, es el único que presenta formas polimórficas, las más comunes D4.4, D4.2 y D4.7. Existe una clara relación entre la forma polimórfica D4.7 del receptor D4 humano con el trastorno de hiperactividad y déficit de atención. No existen muchas diferencias funcionales entre las formas polimórficas por lo que no se conoce cuales son las repercusiones bioquímicas de expresar una u otra forma. Nuestra hipótesis de trabajo es que podían existir diferencias en la capacidad de formar heterómeros con otros receptores de dopamina como el D2 y que estos heterómeros podrían modular la liberación de glutamato en el estriado, lo que podría ser relevante en el trastorno de hiperactividad y déficit de atención. Por ello, se ha demostrado que los receptores D2 y D4 de dopamina pueden formar heterómeros en células vivas y en el tejido estriatal y se ha estudiado su papel en la liberación de glutamato en el estriado. Otra particularidad del receptor de dopamina D4 es que es el único receptor dopaminérgico en la glándula pineal de rata sin que se conozca cual es su función a pesar de que se expresa de manera circadiana. Dado que la glándula pineal está bajo el control de los receptores alfa-1B y beta-1 adrenérgicos, cuya activación está altamente relacionada con la regulación del ritmo circadiano y la síntesis y liberación de serotonina y melatonina, una posibilidad es que los receptores de dopamina D4 puedan modular la función de los receptores adrenérgicos de la glándula pineal mediante un proceso de heteromerización. Para estudiar esta posibilidad se ha demostrado que los receptores D4 de dopamina pueden formar heterómeros con los receptores alfa-1B y beta-1 adrenérgicos y se ha investigado su presencia y función en la glándula pineal de rata.<br>DOPAMINE RECEPTOR´S HETEROMERS. NEW MECHANISMS FOR THE REGULATION OF DOPAMINERGIC TRANSMISSION The main objective of this Thesis has been to investigate the formation and function of heteromers between dopamine and other receptors that might be implicated in the regulation of dopaminergic transmission, such as galanin, histamine, adrenergic or sigma-1 receptors. Firstly, it has been demonstrated that dopamine D1-like family receptors (D1 and D5) can form heteromers with galanin Gal1 and Gal2 receptors. The functional association of these heteromers has been studied within the context of the liberation of acetylcholine in the hippocampus. Secondly, it has been shown that dopamine D1 receptors can form heteromers with histamine H3 receptors. The functional implications of these heteromers have been studied using cellular cultures and native striatum tissue. Thirdly, it has been demonstrated that dopamine D1 and D2 receptors can form heteromers with sigma-1 receptors. The effect of cocaine on the dopaminergic transmission mediated by these heteromers has been investigated. Fourthly, it has been shown that dopamine D2 and D4 receptors can form heteromers both in living cells and striatal tissue and their role on the release of glutamate in the striatum has been studied. Finally, it has been shown that dopamine D4 receptors can form heteromers with adrenergic α1B and β1 receptors, their presence and function has been investigated in rat pineal gland.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10866.pdf: 1428796 bytes, checksum: 3e8b3b83a47e7f481fd590e1f74949b4 (MD5)<br>A degradacao de proteinas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma grande quantidade de oligopeptideos dentro das celulas. Para investigar possiveis efeitos desses oligopeptideos, alguns deles foram isolados do cerebro de rato, sintetizados acoplados a sequencia peptidica TAT atraves de pontes dissulfeto, sendo entao analisados nas vias de transducao de sinal de receptores acoplados a proteina G. A mistura contendo os quatro peptideos analisados (20-80 ƒÊM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificacao do meio extracelular induzido pela angiotensina II em celulas CHO-S que expressam o receptor AT1 (CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptideos aumentaram a transcricao do gene reporter da luciferase induzida pela angiotensina II em celulas CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo isoproterenol em celulas HEK293. Os peptideos sem TAT, incapazes de atravessar a membrana das celulas, nao alteraram as respostas a estimulacao dos receptores, sugerindo um efeito intracelular dos peptideos nas cascatas de transducao de sinal. Alem disso, todos os peptideos estudados inibiram competitivamente a degradacao de um substrato sintetico da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressao da EP24.15 em celulas CHO-S e HEK293 foi suficiente para reduzir a atividade do gene reporter luciferase induzida pela angiotensina II ou pelo isoproterenol. Finalmente, a utilizacao dos peptideos como gisca h em colunas de afinidade revelou que diversas proteinas envolvidas na sinalizacao de receptores acoplados a proteina G interagem com os peptideos, incluindo a adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular, delineando-se como novas moléculas bioativas dentro das células.<br>TEDE

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) conforman la familia de receptores de membrana más grande. El numeroso y variado tipo de señales que detectan han otorgado a estos receptores un alto interés farmacológico. Además, las interacciones entre diferentes tipos de GPCR formando complejos oligoméricos dan lugar a complejos con características bioquímicas diferenciadas de los protómeros que los forman. En esta Tesis Doctoral se han estudiado diferentes aspectos derivados este tipo de interacciones, centrando estos experimentos alrededor del receptor A2A de adenosina (A2AR), un importante neuromodulador del Sistema Nervioso Central. Por una parte, mediante la combinación de las técnicas de transferencia de energía resonante bioluminiscente (BRET) y de complementación bimolecular fluorescente (BiFC) se ha podido detectar in vivo que A2AR forma oligómeros con más de dos protómeros, tanto de tipo homomérico (Gandía et al., 2008) como heteromérico. En este último caso, se ha estudiado en concreto el oligómero de A2AR con el receptor D2 de dopamina y el receptor metabotrópico 5 de glutamato (Cabello et al., 2009). A continuación, se ha aplicado una variante de la técnica de doble híbrido específica para proteínas de membrana (MYTH), con la intención de detectar proteínas interaccionantes con A2AR. Gracias a esta aproximación, se han encontrado nuevas proteínas candidatas a interaccionar con nuestro receptor, destacando entre ellas un GPCR huérfano, GPR37. Mediante técnicas físicas y funcionales en modelos de cultivo celular y animales se ha podido validar la interacción A2AR/GPR37 y se ha comprobado que la presencia de GPR37 modifica la funcionalidad del receptor A2A de adenosina. Finalmente, para profundizar en las características estructurales de GPR37, poco conocidas hasta el momento, se ha estudiado la cola C-terminal del receptor. Así, se ha visto que existe una región rica en residuos de cisteína que regula el tráfico del receptor hacia la membrana plasmática. Además, este dominio rico en cisteínas modula el estrés de retículo endoplasmático generado al sobreexpresar GPR37 en cultivo celular y también la inducción de vías apoptóticas (actividad de caspasa-3) en estas mismas condiciones (Gandía et al., 2013).<br>G protein-coupled receptors (GPCR) consitute the biggest family of membrane receptors. Since they detect a large and diverse number of signals, they have a growing pharmacological interest. Furthermore, the interactions between different types of GPCR form oligomeric complexes that show different biochemical properties than the protomers they are made of. Different aspects of these interactions have been studied in this Doctoral Thesis, focusing the experiments around the adenosine A2A receptor, being adenosine an important modulator of the Central Nervous System. Firstly, by means of the combination of the bioluminescent ressonant energy transfer (BRET) and bimolecular fluorescent combination (BiFC) techniques we have detected in vivo that A2AR is able to form oligomers made up of more than two protomers, leading to homomeric complexes (Gandía et al., 2008) as well as others of heteromeric nature. In this latter case, we have studied the oligomer of A2AR with the dopamine D2 and glutamate metabotropic 5 receptors (Cabello et al., 2009). Following these experiments, we have applied a modified version of the yeast two-hybrid technique set up for membrane proteins (MYTH) in order to detect A2AR-interacting proteins. Thanks to this approach, we have found new potential interactors, and among them an orphan GPCR has stood out: GPR37. By means of physical and functional techniques in cell culture and animal models we have validated the A2AR/GPR37 interaction and we have demonstrated that the presence of GPR37 modifies the functionality of A2AR. Finally, in order to better understand the rather less studied structural characteristics of GPR37, we have studied its C-terminal tail. Thus, we have observed the presence of a cysteine-rich region that regulates the trafficking of the receptor to the plasma membrane. Furthermore, this cystein-rich domain modulates the GPR37-dependent endoplasmic reticulum stress, as well as the induction of apoptotic pathways (capase-3 activity) (Gandía et al., 2013).

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G protein-coupled receptors (GPCRs) are the main acceptors of neurotransmitters, and thus play an important role in communication between neurons. Because of this they are an attractive drug target for multiple neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. The primary function of GPCRs is to initiate diverse intracellular signaling cascades in response to extracellular events, like neurotransmitter binding. Despite the wealth of available biochemical data, the structural foundations of GPCR activity remain poorly understood. Such insights would not only expand our knowledge of those receptors, but also facilitate the design of safer and more efficient drugs. Here, using several computational approaches, we propose structural mechanisms that explain GPCR in vitro data. We unravel features GPCR functionality at multiple levels of action including ligandreceptor interactions, allosteric signal transmission as well as posttranslational modifications. Our results identify phenomena potentially conserved among GPCRs that advance our understanding of this relevant receptor family.<br>Los receptores acoplados a proteína G (en inglés GPCRs) son los principales receptores de neurotransmisores, teniendo un papel importante en la comunicación neuronal. Por esto, se los considera una atractiva diana farmacológica en múltiples trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. El rol primario de los GPCRs es iniciar múltiples cascadas de señalización intracelular en respuesta a eventos extracelulares. A pesar de la vasta información bioquímica disponible, los fundamentos estructurales de la actividad de GPCRs no se comprenden totalmente. Estos fundamentos, no sólo podrían expandir nuestro conocimiento de los receptores, sino que podrían facilitar el diseño de farmacos más seguros y eficaces. Utilizando varios enfoques computacionales, proponemos mecanismos estructurales que explican los resultados in vitro de los GPCRs. Desciframos elementos de la funcionalidad de GPCRs en múltiples niveles, incluyendo interacciones ligando-receptor, transmisión de señales alostérica y modificaciones post-traduccionales. Nuestros resultados identifican fenómenos potencialmente conservados entre los GPCRs, ampliando nuestro conocimiento de esta relevante familia de receptores.

The aims of this thesis are: Aim 1. The involvement of A(1)R-A(2A)R heteromer in glial cells and its study at a molecular level. Aim 2. To find evidence for allosteric interactions between partner receptors in the A(2A)RD(2)R receptor heteromer which confer specific pharmacological characteristics to the heteromer. Aim 3. Search for selective antagonists of A(2A)R for presynaptic A(1)R-A(2A)R heteromers versus postsynaptic A(2A)R-D(2)R heteromers that can be useful for treatment of neurological disorder’s treatment, particularly Huntington’s disease. Aim 4. Investigate the pharmacological and functional properties of A(2A)R in the A(2A)CB1 heteromer. Aim 5. Compound screening of different A(2A)R antagonists in stable CHO cell lines expressing A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R or A(2A)R-CB(1)R heteromers. The conclusions of the objectives are: Conclusions derived from the first aim: The involvement of A(1)R-A(2A)R heteromer in glial cells and its study at a molecular level. - Upon GABA uptake, adenosine has a biphasic effect, which is mediated by A(1)RA(2A)R heteromers coupled to both Gi/0 and Gs proteins. Extracellular adenosine acting on these A(1)R-A(2A)R functional units operates in a concerted way to balance a PKA-dependent action on GABA uptake. The neural output would thus be inhibitory at low firing rates and facilitatory at high firing rates. - Adenosine by acting on adenosine receptors in astrocytes may significantly contribute to neurotransmission in a dual manner, which depends on the concentration of the nucleoside that is in turn dependent on neuronal firing activity. - BRET and single molecule tracking with TIRF microscope show that the minimal GPCR heteromer unit may consist of four protomers and two G proteins. The strong similarity between GPCRs suggests that the molecular model proposed could apply to other receptors. - These heteromers can be formed in the plasma membrane and are stable on the order of minutes. Such stability suggests that designing ways to target these heteromers may indeed be a viable strategy. - The orientation of the alpha-subunits of the G proteins is on the distal receptors, suggesting that G proteins cross-talk could occur via receptors across the heteromer complex. - The heteromeric unit described, with its dynamic and structural limitations, provides the molecular framework to understand why heteromers are functionally distinct units and not merely the aggregation of two entities with independent functions. Conclusions derived from the second aim: To find an evidence for allosteric interactions between partner receptors in the A(2A)R-D(2)R receptor heteromer which confer specific pharmacological characteristics to the heteromer. In cell culture, the agonist and antagonist binding to the adenosine A(2A)R diminish the affinity of dopamine D(2)R agonists and antagonists. - Those negative interactions between ligands are consequence of allosteric interactions between both receptors conforming the A(2A)R-D(2)R heteromer and constitute a unique biochemical property of this heteromer. - In ex vivo tissue, using these allosteric interactions as a heteromer fingerprint, it has been demonstrated the expression of A(2A)R-D(2)R heteromer in human striatum. - The fact that the A(2A)R antagonists are able to modulate dopamine D(2)R pharmacology has to be taken into account to understand pathologies such as Parkinson’s disease or for human PET neuroimaging. Conclusions derived from the third aim: Search for selective antagonists of A(2A)R for presynaptic A(1)R-A(2A)R heteromers versus postsynaptic A(2A)R-D(2)R heteromers that can be useful for neurological disorder’s treatment, particularly Huntington’s disease. - The physical presence of dopamine D(2)R in the A(2A)R-D(2)R heteromer induced a strong negative cooperativity in the A(2A)R that was detected by SCH-442416. This cooperativity indicates that A(2A)R-A(2A)R homodimers are present in the A(2A)R-D(2)R heteromer. - Based on in vitro and in vivo approaches, the compound SCH-442416 was classified as a preferential presynaptic A(2A)R antagonist, and the compound KW- 6002 was classified as a preferential postsynaptic A(2A)R antagonist. Considering this, SCH-442416 can be used as a lead compound in the development of antidyskinetic drugs in Huntington’s disease; meanwhile KW-6002 can be beneficial in Parkinson’s disease. Conclusions derived from the fourth aim: Investigate the pharmacological and functional properties of A(2A)R in the A(2A)R-CB1R heteromer. - Adenosine A(2A)R changes its G-protein coupling from stimulatory Gs to inhibitory Gi when it forms heteromer with CB1R and a synergistic cross-talk in G-protein activation is observed when both receptors are coactivated. - CB1R mainly controls the ERK1/2 signaling under the A(2A)R-CB1R heteromer. - The A(2A)R-CB1R heteromer does not show allosteric effects at the ligand binding level. Conclusions derived from the fifth aim: Compound screening of different A(2A)R antagonists in stable CHO cell lines expressing A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R or A(2A)R-CB1R heteromers. - Compound number 9 could be a good candidate to treat Parkinson’s disease due to its preferential binding to A(2A)R forming A(2A)R-D(2)R heteromer.<br>Els objectius de la tesi doctoral són: - Objectiu 1. Implicacions de l’heteròmer A(1)R-A(2A)R a les cèl•lules glials i el seu estudi a nivell molecular. - Objectiu 2. Trobar evidències de modulacions al•lostèriques entre receptors a l’heteròmer A(2A)DD(2)R que confereixen característiques farmacològiques específiques a l’heteròmer. - Objectiu 3. Recerca d’antagonistes selectius de A(2A)R per a heteròmers presinàptics A(1)R-A(2A)R versus heteròmers postsinàptics A(2A)R-D(2)R que poden ser útils en el tractament de malalties neurològiques, particularment en la malaltia de Huntington. - Objectiu 4. Investigar les propietats funcionals i farmacològiques de A(2A)R en l’heteròmer A(2A)RCB(1)R. - Objectiu 5. Anàlisi de diferents compostos antagonistes de A(2A)R en línies cel•lulars estables CHO expressant A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R o A(2A)R-CB(1)R. Les conclusions de la tesi són les següents. Primer objectiu: - En la recaptació de GABA, l’adenosina te un efecte bifàsic, el qual està mediat pels heteròmers A(1)R-A(2A)R que es troben acoblats a proteïnes Gi/o i Gs. L’adenosina extracel•lular actuant sobre aquests heteròmers opera en el balanç de recaptació de GABA depenent de l’activitat PKA. La senyalització neural serà inhibitòria a baixa activació neuronal i facilitadora a alta activitat neuronal. - BRET i experiments de “single molecule tracking” amb microscopi TIRF demostren que l’expressió mínima d’aquest heteròmer consta de quatre protomers i dues proteïnes G. La gran similitud entre GPCR suggereix que aquest model molecular podria ser aplicable a altres receptors. - Aquests heteròmers poden formar-se a la membrana plasmàtica i són estables durant minuts. Aquesta estabilitat suggereix que el disseny de fàrmacs dirigits contra aquests heteròmers és una estratègia viable. Segon objectiu: - En cultius cel•lulars, la unió d’agonistes i antagonistes a A(2A)R fa disminuir l’afinitat d’agonistes i antagonistes per al D(2)R. - Aquestes interaccions negatives entre lligands són conseqüència d’interaccions al•lostèriques entre ambdós receptors que conformen l’heteròmer A(2A)R-D(2)R i constitueixen una unitat bioquímica. - El fet de que els antagonistes de A(2A)R són capaços de modular la farmacologia de D(2)R ha de ser tingut en compte per poder entendre patologies com la malaltia de Parkinson i per a la neuroimatge per PET. Tercer objectiu: - La presència física de D(2)R en l’heteròmer A(2A)R-D(2)R indueix una forta cooperativitat negativa a A(2A)R la qual va ser detectada per SCH 442416. Aquesta cooperativitat indica que el homodimers A(2A)R-A(2A)R es troben presents a l’heteròmer A(2A)R-D(2)R. - Basant-nos en experiments in vitro i in vivo, el compost SCH 442416 va ser classificat com a preferentment antagonista de receptor A(2A) presinàptic, i el compost KW 6002 va ser classificat com a antagonista preferentment postsinàptic. Considerant això, SCH 442416 pot ser utilitzat pel desenvolupament de fàrmacs antidiscinètics pel tractament de la malaltia de Huntington, mentre que KW 6002 pot ser beneficiós per a tractar la malaltia de Parkinson. Quart objectiu: - A(2A)R canvia el seu acoblament a proteïna Gs per Gi quan passa a formar heteròmers amb CB(1)R i un “cross-talk” sinergístic en activació de proteïna G s’observa quan tots dos receptors es troben co-activats. Cinquè objectiu: - El compost número nou podria ser un bon candidat per tractar la malaltia de Parkinson degut a la seva unió preferencial al receptor A(2A) present a l’heteròmer A(2A)R-D(2)R.

Classically it was assumed that the compounds with therapeutic effect exert their action interacting with a single receptor. Nowadays it is widely recognized that the pharmacological effect of most drugs is more complex and involves a set of receptors, some associated to their positive effects and some others to the side effects and toxicity. Antipsychotic drugs are an example of effective compounds characterized by a complex pharmacological profile binding to several receptors (mainly G protein-coupled-receptors, GPCR). In this work we will present a detailed study of known antipsychotic drugs and the receptors potentially involved in their binding profile, in order to understand the molecular mechanisms of the antipsychotic pharmacologic effects.<br/><br/>The study started with obtaining homology models for all the receptors putatively involved in the antipsychotic drugs receptorome, suitable for building consistent drug-receptor complexes. These complexes were structurally analyzed and compared using multivariate statistical methods, which in turn allowed the identification of the relationship between the pharmacological properties of the antipsychotic drugs and the structural differences in the receptor targets. The results can be exploited for the design of safer and more effective antipsychotic drugs with an optimum binding profile.<br>Tradicionalmente se asumía que los fármacos terapéuticamente efectivos actuaban interaccionando con un único receptor. Actualmente está ampliamente reconocido que el efecto farmacológico de la mayoría de los fármacos es más complejo y abarca a un conjunto de receptores, algunos asociados a los efectos terapéuticos y otros a los secundarios y toxicidad. Los fármacos antipsicóticos son un ejemplo de compuestos eficaces que se caracterizan por unirse a varios receptores simultáneamente (principalmente a receptores unidos a proteína G, GPCR). El trabajo de la presente tesis se ha centrado en el estudio de los mecanismos moleculares que determinan el perfil de afinidad de unión por múltiples receptores de los fármacos antipsicóticos.<br/><br/>En primer lugar se construyeron modelos de homología para todos los receptores potencialmente implicados en la actividad farmacológica de dichos fármacos, usando una metodología adecuada para construir complejos fármaco-receptor consistentes. La estructura de estos complejos fue analizada y se llevó a cabo una comparación mediante métodos estadísticos multivariantes, que permitió la identificación de asociaciones entre la actividad farmacológica de los fármacos antipsicóticos y diferencias estructurales de los receptores diana. Los resultados obtenidos tienen interés para ser explotados en el diseño de fármacos antipsicóticos con un perfil farmacológico óptimo, más seguros y eficaces.

El objetivo de la presente tesis es el de aportar conocimiento sobre la bioquímica y la farmacología de los receptores de adenosina, así como entender las relaciones entre estructura química y actividad farmacológica de los ligandos existentes para estos receptores. Con este objetivo se han empleado distintas técnicas y metodologías del diseño de fármacos asistido por ordenador. Los resultados presentados en este trabajo incluyen:<br/><br/>· El desarrollo de una estrategia original para la selección de una muestra que cubra adecuadamente la diversidad molecular existente en una base de datos de compuestos químicos<br/>· La construcción de un modelo de la región transmembrana del receptor A1 humano de adenosina, en el que se ha localizado y caracterizado un sitio de unión de agonistas compatible con los datos experimentales.<br/>· Predicciones teóricas de las energías de unión de ligandos, realizadas a partir de los complejos agonista-receptor predichos sobre el modelo mencionado, obteniendo un grado de acuerdo con los datos experimentales que resulta esperanzador<br>The goal of the present thesis is to gain knowledge about the biochemistry and pharmacology of adenosine receptors, as well as to understand structure-activity relationships for the existing ligands for this receptors. In order to achieve this goal, we have used several techniques and methodologies from the computer-aided drug design field. Results presented in this work include:<br/><br/>· The development of an original strategy of selection of a maximum diversity sample that adequately covers the original molecular diversity contained in a compound database<br/>· The building of the transmembrane region of a human A1 adenosine receptor model. In such a model, an agonists binding site has been located and characterized, showing agreement with experimental data.<br/>· The resulting ligand-receptor complexes have been studied with computational approaches for the prediction of ligand-binding free energies. A nice correlation with experimental results was observed

Os receptores medeiam a maioria das respostas fisiológicas em resposta a diversidade de estímulos. A ativação da sinalização mediada pelo receptor de angiotensina II tipo 1 é o principal responsável pelos efeitos do hormônio angiotensina II (Ang II) nos tecidos alvo. No rim concentrações fisiológicas de Ang II aumentam a atividade no túbulo proximal da isoforma 3 do trocador de Na+/H+ (NHE3). Este efeito é crucial para a manutenção do volume extracelular e pressão arterial. Evidências recentes mostraram que a ativação seletiva da sinalização enviesada da beta-arrestina/ receptor AT1 induz diurese e natriurese independentemente da sinalização via proteína G. Neste estudo testamos a hipótese de que a sinalização enviesada do receptor AT1/ beta-arrestina inibe a atividade do NHE3 no túbulo proximal, bem como investigar os possíveis mecanismos moleculares que medeio este efeito. Para tal, nós determinamos os efeitos do composto TRV120023, que se liga ao receptor AT1, bloqueando o acoplamento da proteína G e estimulando a sinalização da beta-arrestina, na função do NHE3 in vivo e in vitro. A atividade do NHE3 foi medida quer em túbulo proximal nativo, por meio de microperfusão estacionária, bem como em uma linha celular de túbulo proximal de gamba (OKP), por meio de recuperação de pH intracelular dependente de Na+. Os nossos resultados mostram que o TRV120023 na concentração de 10-7 M inibe marcadamente a atividade do NHE3 em túbulo proximal quer in vivo quer in vitro, sendo que este efeito é completamente abolido nas células silenciadas para a beta-arrestina 1 e 2 através de RNA de interferência. Adicionalmente, a estimulação do NHE3 pela Ang II é completamente suprimida pelo TRV120023 quer in vivo quer in vitro. A inibição do NHE3 pelo TRV120023 foi associada com a diminuição do NHE3 expresso na superfície da membrana plasmática em células OKP e com a redistribuição entre o corpo e a base das microvilosidades em túbulo proximal de rato. A diminuição do NHE3 na superfície da membrana plasmática em células OKP estava associado com um aumento na internalização do NHE via endocitose mediada por clatrina. A inibição do NHE3 mediada pela beta-arrestina não envolve a sinalização do receptor AT2, cAMP/ PKA, Akt e ERK1/2. Estes achados indicam que a sinalização enviesada do receptor AT1/beta-arretina inibe a atividade do NHE3 em túbulo proximal, pelo menos em parte, devido a alterações na localização subcelular do NHE3<br>Cell surface receptors mediate most of our physiological responses to an array of stimulus. The triggering of the angiotensin II type I (AT1) receptor signaling is the major control point in the regulation of the ultimate effects of the peptide hormone angiotensin II (Ang II) on its target tissue. In the kidney physiological concentrations of Ang II upregulate the activity of proximal tubule Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3). This effect is crucial for maintenance of extracellular fluid volume homeostasis and blood pressure. Recent findings have shown that selective activation of the betaarrestin-biased AT1 receptor signalingpathway induces diuresis and natriuresis independent of G-protein mediated signaling. This study tested the hypothesis that activation of this AT1 receptor/beta-arrestin signaling inhibits NHE3 activity in proximal tubule as well as investigate the underlying molecular mechanisms mediating this effect. To this end, we determined the effects of the compound TRV120023, which binds to the AT1R, blocks G protein coupling, and stimulates beta-arrestin signaling, on NHE3 function in vivo and in vitro. NHE3 activity was measured in both native proximal tubules, by stationary microperfusion, and in opossum proximal tubule (OKP) cells, by Na+-dependent intracellular pH recovery. Our results showed that 10-7 MTRV120023 remarkably inhibited proximal tubule NHE3 activity both in vivo and in vitro, and the effect was completely abolished in OKP cells silenced for beta-arrestin 1 and 2 by small interference RNA. Additionally, stimulation of NHE3 by Ang II was completely suppressed by TRV120023 both in vivo as well as in vitro. Inhibition of NHE3 activity by TRV120023 was associated with a decrease in NHE3 surface expression in OKP cells and with a redistribution from the body to the base of the microvilli in the rat proximal tubule. The decreased surface NHE3 in OKP cells was associated with an increase in NHE3 internalization via clathrin mediated endocytic. Beta-arrestin mediated NHE3 inhibition did not involve AT2 receptor, cAMP/ PKA, Akt and ERK1/2 signaling. These findings indicate that biased signaling of the AT1 receptor/beta-arrestin pathway inhibits NHE3 activity in the proximal tubule at least in part due to changes in NHE3 subcellular localization