Academic literature on the topic 'Recombinaison génétique – Dissertations universitaires comme sujet'

Mycobacîerium abscessus est un pathogène émergent responsable d'infections respiratoires sévères chez les patients atteints de la mucoviscidose. Cette espèce est également responsable d'infections extra-pulmonaires, notamment en cas de transplantation, et se caractérise par une faible susceptibilité aux antibiotiques. Le génome de cette mycobactérie a été séquence et des puces à ADN ont été développées. Des études effectuées sur des variants naturels lisses et rugueux montrent que les isolats rugueux sont hypervirulents. Ces isolats ne produisent pas de glycopeptidolipides (GPL), un métabolite lipidique de surface. On peut donc se demander si l'absence de ce lipide est responsable de cette hypervirulence. La première partie de ma thèse a été de développer des outils génétiques adaptés à M. Abscessus. En utilisant le système dit de « recombineering », nous avons construit une souche mutante caractérisée par sa faible production des GPL (AmmpL4b). Afin de prouver le rôle de ce gène dans un phénotype donné, nous avons aussi adapté un système de complémentation à M. Abscessus en testant des plasmides réplicatifs et intégratifs ayant démontré leur efficacité chez d'autres espèces. Dans ce travail, nous avons montré que la production des GPL engendre des modifications de surface de la cellule comme la mobilité par glissement. La virulence des souches (sauvage, mutante et complémentée) a été évaluée in vitro dans des modèles cellulaires et in vivo dans des modèles murins. Ces tests de virulence montrent que ce n'est pas que l'absence des GPL qui est impliquée dans la virulence de M abscessus. Nous privilégions à l'heure actuelle l'hypothèse qu'un autre facteur intervient directement ou indirectement dans cette virulence. Dans le futur, la caractérisation de la virulence de cet organisme ouvra la voie au développement de nouvelles drogues ou vaccins contre ce pathogène émergent
Mycobacterium abscessus is a rapidly growing mycobacterial species that can be involved in pulmonary and disseminated infections in immunosuppressed or young cystic fibrosis patients. It is an emerging pathogen and has attracted recent attention due to the numerous cases of infection; furthermore, genomic tools have been developed for this species. Nevertheless, the study of this species has until now been limited to spontaneous variants. We have compared three different mutagenesis Systems : the ts-sacB, the phage, and the recombineering Systems, and show that there are important differences in their efficiency for the construction of allelic-exchange mutants. We show, using the mmpL4b gene of the glycopeptidolipid pathway as a target, that allelic-exchange mutants can be constructed with a reasonable efficiency ( 7%) using the recombineering System. Studies on this species were limited so far to natural spontaneous variants. These studies have nevertheless showed that the Rough variants of M abscessus which are characterized by a low production of glycopeptidolipids are hypervirulent in human and also in in vivo models. Interestingly, these highly virulent isolates strongly induce TNF-α secretion by macrophages. However, the mechanism of the higher virulence process is currently unknown. The mutant constructed in this study, which is low glycopeptidolipids producer, is unable to slide and it loss the ability to form biofilms. These confirm the role of glycopeptidolipids in the modification of cell surface. Using in vivo model the virulence of this mutant has been tested. This study shows that other factor is involved with the lack glycopeptidolipids in the virulence of M abscessus. The study of the mechanism of the virulence of M abscessus is a pre-requisite to develop new drugs or vaccine candidates against this emerging pathogen

Au cours de mon travail de thèse, nous avons développé une méthode originale d'étude de la diversité génétique du VIH. Cette méthode est fondée sur l'isolement de virus clonaux issus d'événements d'infection uniques à partir du plasma de patients infectés. L'analyse des séquences génomiques issues des virus clonaux nous a permis de quantifier in vivo un taux de recombinaison élevé chez les six patients étudiés, de démontrer le rôle de la recombinaison dans l'échappement du VIH aux traitements antirétroviraux, via un rôle dans la génération et la préservation de la diversité génétique du VIH. Nous avons aussi étudié les propriétés fonctionnelles des protéines Env provenant de virus clonaux isolés chez cinq patients. L'étude d'Env distinctes issues d'un même patient a révélée une extraordinaire diversité fonctionnelle, même parmi les virus utilisant le même co-récepteur. Cette diversité fonctionnelle se traduit par un large spectre d'infectivités sur un type cellulaire donné, des différences dans leur capacité relative à infecter différentes cellules cibles et des différences de sensibilités à certains inhibiteurs d'entrée. Aucune corrélation entre l'infectivité de ces virus clonaux et la sensibilité aux inhibiteurs d'entrée n'est observée, ce qui indique que ces propriétés fonctionnelles peuvent être, dans une certaine mesure, dissociées
During my thesis, we developed a new technique for study the genetic diversity of HIV. This method is based on the isolation of infectious clonal viruses directly resulting from single plasma-derived infections events. A comparison of the genomic sequences of clonal viruses from six patients demonstrated strong evidence for extensive recombinaison in vivo, showed that recombination could increase the diversity of drug resistant genotypes and reveals that recombination contributes to the generation and preservation of the HIV-1 diversity. The isolation of clonal viral populations from five different patients permits to evaluate the phenotypic properties of Env proteins exprimed by clonal viruses. Even when comparaisons were restricted to viruses from a same patient with similar tropism, genetically diverses Env proteins exhibited a remarkable fonctionnal diversity, included a wide range of infectivities for a given target cell, differences in their relative ability to infect different target cells and differences in sensibility to inhibition by some entry inhibitors. No correlation was observed between viral infectivity and inhibition by entry inhibitors, indicating that theses properties can be dissociated

Dans le but d'évaluer le risque de transmission de l'EMCV de l'animal, en particulier le porc, à l'homme, notamment lors de xénotransplantations, nous nous sommes intéressés aux facteurs susceptibles de favoriser ou de limiter cette transmission par l'étude de l'interaction du virus avec des cellules humaines. Des outils permettant la mise en évidence de la multiplication du virus aux différentes étapes de l'infection ont été développés. Notamment, pour le suivi de la synthèse des protéines, un virus recombinant exprimant l'EGFP a été créé. Celui-ci, était pathogène pour la souris, à l'instar du virus parental. L'EGFP a pu être détectée par autofluorescence in vitro dans les cellules infectées et in vivo sur des empreintes de cerveaux de souris. Le pouvoir infectieux de différentes souches virales sur des lignées et des cellules primaires humaines, reflétant le tropisme du virus chez l'animal, a été analysé. Les résultats montrent que l'infection des cellules dépend du type cellulaire et de la souche virale et que l'adsorption varie essentiellement en fonction des souches. Par comparaison des séquences de capside, des acides aminés jouant un rôle probable dans cette adsorption ont été mis en évidence. L'analyse des partenaires cellulaires impliqués dans l'attachement a permis de montrer que l'adsorption de la souche 1086C est dépendante des acides sialiques et que la lysine 231 de VP1 jouerait un rôle important dans cette liaison. Par ailleurs, l'adsorption de la souche B279/95 est indépendante des acides sialiques mais dépend des héparanes sulfates. Ceci suggère l'utilisation probable de co-récepteurs portant des héparanes sulfates ou des acides sialiques
In order to evaluate the transmission risk of EMCV, from animal, mainly pig, to human, especially during xenotransplantations, we were interested in factors likely to support or limit this transmission by studying the interaction of EMCV with human cells. Tools allowing the detection of the virus multiplication at the various stages of the infection were developed. In particular, for the follow-up of the proteins synthesis, a recombinant EMCV expressing EGFP was created. The recombinant virus was pathogenic for mouse like the parental virus. EGFP could be detected by autofluorescence in vitro in infected cells and in vivo on prints of mouse brains. The infectious power of various viral strains on human cell lines and primary cells, reflecting the tropism of the virus in animal, was analysed. The results indicated that the infection of the cells depends on the cellular type and the viral strain and that adsorption varies primarily according to the strains. By comparison of the sequences of capsid, amino acids playing a probable part in this adsorption were highlighted. The analysis of the cellular partners implied in the attachment made it possible to show that the adsorption of the strain 1086C is dependent on sialic acid and that lysine 231 of VP1 would play an important part in this connection. In addition, the adsorption of the B279/95 strain is independent of sialic acid but depends on heparanes sulfates. This suggests the probable use of co-receptors carrying heparane sulfates or sialic acids

Le VIH-1 est divisé en 4 groupes : M (major), O (outlier), N (non-M non-O) et P. Au sein de ces groupes, la recombinaison est un phénomène extrêmement fréquent qui joue un rôle majeur dans la diversification de l’épidémie du VIH. La recombinaison résulte de phénomènes de sauts de matrice entre les 2 molécules d’ARN du virus pendant l’étape de reverse transcription. Ainsi les infections multiples, en générant des virions hétérodiploïdes, sont le pré-requis indispensable à la recombinaison. En Afrique Centrale et au Cameroun en particulier, tous les groupes du VIH-1 circulent et des cas de doubles infections VIH-1 M+O ont été rapportés. Malgré la grande divergence génétique entre les deux groupes, 3 cas de recombinaison M/O ont été mis en évidence chez des patients camerounais sans lien épidémiologique. Pour deux d’entre eux, la recombinaison impliquait le gène vpr, qui pourrait représenter une région privilégiée pour la recombinaison inter-groupe M/O. La capacité de transmission et de circulation de telles formes, qui apparaissent extrêmement rares, n’est pas connue. L’objectif de ce travail était de mettre au point et de valider des outils sérologiques et moléculaires pour la détection des recombinants M/O dans le gène vpr chez les patients doublement infectés par un VIH-1 de groupe M (VIH-M) et de groupe O (VIH-O) au Cameroun. Le dépistage des doubles infections reposait sur une stratégie de sérotypage utilisant deux antigènes gp120/V3 représentatifs des groupes M et O. Pour les échantillons doublement réactifs, un test de compétition (GSEIA) a été mis au point afin d’éliminer les réactivités croisées non spécifiques. La présence des génomes VIH-M et VIH-O a été confirmée à l’aide de PCR spécifiques de groupe ciblant les régions pol et env. Enfin, une PCR spécifique de groupe encadrant le gène vpr a été développée pour la recherche des recombinants. Cet algorithme mis en place au Centre Pasteur du Cameroun nous a permis d’identifier 5 recombinants M/O, avec un point de recombinaison dans vpr pour 4 d’entre eux. Trois recombinants vpr étaient associés à une double infection VIH-M+O ou à une infection par un VIH-M. Des recombinants M/O ont été détectés sans double infection associée, dont un chez une patiente Camerounaise vivant en France, suggérant des cas de recombinants transmis. Ce travail souligne la complexité du dépistage des formes recombinantes M/O qui nécessite la combinaison d’outils sérologiques et moléculaires ciblant différentes régions du génome, notamment dans le cas des recombinants transmis. Les résultats confirment l’importance du gène vpr dans les phénomènes de recombinaison M/O. La grande variabilité génétique des souches du groupe O pourrait avoir des conséquences en termes de prise en charge thérapeutique des patients infectés par un recombinant M/O. Enfin, le risque d’émergence de formes recombinantes circulantes M/O doit être évalué à travers une surveillance épidémiologique au Cameroun mais également dans les pays ayant un lien avec cette région
HIV-1 is divided into 4 groups: M (major), O (outlier), N (non-M non-O) and P. Among these groups, recombination is an extremely frequent phenomenon, playing a major role in the diversification of the HIV epidemic. Recombination results from strand switching between the two viral RNA molecules during the reverse transcription step. Thus, multiple infections, by generating heterodiploïd virions, are the prerequisite to recombination. In Central Africa and in Cameroon in particular, all HIV-1 groups circulate and M+O dual infections have been reported. Despite the great genetic divergence between the two groups, three cases of M/O recombinants were described in Cameroonian patients with no epidemiological link. For two of them, recombination involved the vpr gene that could represent a preferential site for M/O intergroup recombination. The transmission and circulation capacities of such forms, that appear to be extremely rare, are unknown. The objective of this work was to develop and validate serological and molecular tools for the detection of M/O recombinants in the vpr gene in patients dually infected by HIV-1 group M (HIV-M) and HIV-1 group O (HIV-O) in Cameroon. Dual infections were screened using a serotyping strategy bases on two gp120/V3 antigens representative of groups M and O. For dually reactive samples, a competitive assay (GSEIA) was developed to eliminate non specific cross-reactivities. Presence of HIV-M and O genomes was confirmed with group specific PCRs targeting the pol and env regions. Finally, a group specific PCR flanking the vpr gene was developed to detect recombinants. This algorithm implemented at Centre Pasteur du Cameroun allowed us to identify 5 M/O recombinants, with a vpr breakpoint for 4 of them. Three vpr recombinants were associated with a HIV-M+O dual infection or a HIV-M infection. Some M/O recombinants were detected in the absence of associated dual infections, of which one in a Cameroonian patient living in France, suggesting transmitted cases. This work underlines the complexity of the detection of M/O recombinants that requires the combination of serological and molecular tools targeting different regions of the genome, in particular for transmitted recombinants. Our results confirm the importance of the vpr gene in M/O recombination phenomena. The great genetic variability of HIV-O strains could have consequences on therapeutic management of patients infected with a M/O recombinant. The risk for emergence of M/O circulating recombinant forms has to be evaluated through an epidemiological surveillance in Cameroon but also in countries having a link with this region

Les camélidés ont la particularité de produire, outre des IgG conventionnelles, des IgG formées de chaînes lourdes dépourvues de chaînes légères appelées IgG homodimériques. Ces dernières sont caractérisées par des régions variables et constantes VHH et CnH qui diffèrent des régions conventionnelles VH et CH. Bien que l'étude des propriétés structurales des IgG homodimériques ait été bien documentée, les bases génétiques impliquées dans leur émergence, lors du processus de maturation des lymphocytes B, sont restées insaisissables. Nous avons montré que tous les segments géniques nécessaires à la génération des chaînes lourdes des Igs homodimériques et tétramériques d'alpaga sont présents dans la même région génomique, constituant ainsi un seul locus IgH. La structure en « translocon », Vn-Dn-Jn-Cn, retrouvée tout au long de l'évolution des loci IgH des tétrapodes, est maintenue au locus IgH chez l'alpaga et très certainement chez tous les camélidés. Malgré la conservation globale de cette structure, l'organisation en mosaïque des segments variables, VHH et VH, et des gènes constants, CnH et CH, révèle un nouveau type de locus IgH en « translocon ». Celui-ci rend compte de son unicité et des Igs qui en résultent. Les données transcriptionnelles suggèrent que lors de leur développement, les lymphocytes B exprimant des IgG homodimériques passent par une étape préalable d'expression d'IgM, tout comme les lymphocytes exprimant des IgG tétramériques. Néanmoins, l'organisation particulière du locus IgH chez les camélidés impliquerait une régulation des étapes de réarrangement VDJ qui déterminent l'expression de l'une ou l'autre des Igs, tétramérique ou homodimérique
In addition to producing conventional tetrameric IgGs, camelids have the particularity of producing ; functional homodimeric IgG type that lacks light chains, and is therefore made up of two identice heavy chains. This non-conventional IgG type is characterized by variable and constant regions referred to as VHH and CHH respectively, and which differ from conventional VH and CH counterpart Although structural properties of homodimeric IgGs have been well investigated, the genetic basis involved in their generation are still largely unknown. We showed that a single IgH locus in alpaca (Lama pacos) chromosome 4 contains ail genetic elements required for the generation of the two types of Igs. The alpaca IgH locus is composed of a V-region that contains both VHH and VH gem segments, followed by a unique DH-JH cluster and C-region genes, which include both CHH and C genes. Although this general gene organization greatly resembles that of other typical mammalian Vn-Dn-Jn-Cn translocon IgH loci, the intermixed gene organization within the alpaca V and C region reveals a new type of translocon IgH locus. Transcript analyses of expressed homodimeric and tetrameric IgGs showed similar levels of mutation and that of IgMs revealed the existence of VHH Cm transcripts, strongly suggesting that cells bearing homodimeric IgGs develop from lgM+ cells The gene organization of the camelid IgH locus implies a striking regulation of stepwise gene arrangements to enable expression of either tetrameric or homodimeric Ig in B lymphocytes

La caractérisation par DNA-array du sous-groupe hautement virulent de E. Coli responsable de pathologies invasives, défini par le ribotype B2i et le « Séquence-Type » 29 (EcMLST), nous a permis de mettre au point une PCR de détection spécifique. En combinant le sérotypage au MLST nous avons pu distinguer, au sein de ce sous-groupe, trois « séquence-O-types » associés, chez les enfants de moins de 3 mois, aux urosepsis (STc29°2), aux méningites (STc29018) ou à ces deux syndromes (STc29°45). La souche S88, représentative du clone STc29 émergeant en France, a été séquencée dans le cadre du projet Coliscope. Nous avons montré que deux attributs de cette souche, un nouvel antigène O et un plasmide ColV proche de ceux des souches pathogènes aviaires, sont indispensables pour sa virulence dans un modèle animal de méningite. La compréhension de l'origine de ce clone sera facilitée grâce aux outils moléculaires que nous avons développés
Using DNA-array method, we developed a PCR able to detect the highly virulent E. Coli subgroup characterized by ribotype B2i and Sequence-Type 29 (EcMLST). Combining MLST and serotyping, we were able to distinguish among E. Coli strains belonging to this subgroup and causing invasive diseases in infants, three «sequence-O-types» associated with urosepsis (STc2902), meningitis (STc29018) or both syndromes (STc29O4S). Strain S88, representative of the STC29045 emerging clone in France has been sequenced in the Coliscope project. We found that two different traits of this strain, a new O antigen and a ColV plasmid close to those of avian pathogenic strains, are essential for its virulence in a neonatal meningitis rat model. Unraveling the origin of this clone will be aided by the molecular tools we have developed

Des facteurs génétiques et d’environnement sont impliqués dans l’étiopathogénie de la schizophrénie avec un modèle d’interaction. Le substratum biologique de cette interaction est inconnu mais pourrait être expliqué par un modèle épigénétique. Dans la première partie de ce travail, nous avons choisi d’examiner en détail, à travers une revue critique des données de la littérature, le facteur environnemental qu’est l’exposition prénatale au diethylstilbestrol, un oestrogène de synthèse considéré comme perturbateur endocrinien mais aussi perturbateur de la régulation épigénétique particulièrement la méthylation de l’ADN. Bien que les données épidémiologiques ne permettent pas d’incriminer ou d’exclure l’exposition prénatale au diethylstilbestrol comme facteur augmentant le risque des troubles psychiatriques, plusieurs arguments sont en faveur de cette hypothèse. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons testé l’hypothèse des polymorphismes génétiques des enzymes de la machinerie de régulation épigénétique comme facteur de vulnérabilité génétique pour la schizophrénie. Une étude d’association familiale (325 trios) a été réalisée intéressant 10 gènes codant pour les HDACs. Les marqueurs de type SNP (n = 551) ont été extraits par la méthode de tagSNP. Les analyses statistiques ont identifié 10 SNPs associés avec la schizophrénie avec un seuil de signification inférieur à 0. 01. Ils sont situés sur HDAC3, HDAC9, HDAC10 et HDAC11. Une interaction épistatique a été identifiée entre HDAC3, HDAC9 et HDAC10. Bien que cette étude est exploratoire et sans correction pour les tests multiples, nos résultats confortent des données en faveur de l’implication de ces gènes avec des troubles neurodéveloppementaux
Genetic factors and environment are involved in the etiopathogeny of schizophrenia with an interaction model. The biological substratum of this interaction is unknown but could be explained by an epigenetic model. In the first part of this work, we chose to examine in detail, through a critical review of the literature data, the environmental factor of prenatal exposure to diethylstilbestrol, a synthetic estrogen considered as endocrine disruptor which also perturbs epigenetic regulation particularly DNA methylation. Although epidemiological data do not incriminate or exclude prenatal exposure to diethylstilbestrol as a factor increasing the risk of psychiatric disorders, there are several arguments in favor of this hypothesis. In the second part of this work, we tested the hypothesis of genetic polymorphisms of enzymes of the machinery of epigenetic regulation as a genetic vulnerability factor for schizophrenia. A family-based association study (325 trios) was conducted involving 10 genes encoding HDACs. SNP markers (n = 551) were extracted by the method of tagSNP. Statistical analysis identified 10 SNPs associated with schizophrenia with a threshold significance less than 0. 01. They are located on HDAC3, HDAC9, HDAC10, and HDAC11. An epistatic interaction was identified between HDAC3, HDAC9 and HDAC10. Although this study is exploratory and without correction for multiple testing, our results support data for the involvement of these genes with neurodevelopmental disorders

Les Thalassémies constituent un ensemble exceptionnel de modèles permettant d'étudier la régulation de la synthèse de l'hémoglobine. Cette maladie autosomique récessive se caractérise en Sicile par une haute fréquence et une grande variabilité génétique. La détermination des haplotypes de restriction du complexe (3 a été utilisée comme première étape de criblage. Une approche plus sophistiquée par P. C. R. A confirmé les deux propriétés susdites. Une étude moléculaire approfondie a été faite sur deux formes de p thalassémie associées à une surexpression d'hémglobine foetale. La séquence des régions régulatrices des gènes Gy et Ay, promoteurs et enhancer, n'a jusqu'à présent révélé aucune anomalie expliquant ce phénotype particulier. Chez un sujet homozygote pour une (3° thalassémie et porteur du phénotype PHHF, trois variations de séquence ont été retrouvées dans la région enhancer en 3' du gène Ay L'exploration de ces trois mutations chez de nombreux sujets d'ethnies et de génotypes variés a démontré qu'elles ne sont pas responsables du phénotype PHHF, mais sont polymorphes dans les différentes populations, et se trouvent en liaison avec un polymorphisme Pvu II, situé à 1,5 kb plus en 3', déterminant ainsi deux configurations, et deux seulement, lesquelles divisent les haplotypes du complexe p en deux groupes fondamentaux. La configuration. . . T. . . C. . . A. . . Pvu II- semble plus régulièrement liée à une expression basse d'Hb F de type adulte (Ay), alors que la configuration. . . C. . . A. . . G. . . Pvu II+ se retrouve aussi bien avec une expression basse qu'avec une expression élevée d'Hb F de type foetal (Gy).

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire et multifactorielle de l'intima des artères de gros et moyen calibre, caractérisée par une accumulation de cholestérol provenant des lipoprotéines de faible densité ou LDL (Low - Density Lipoprotein). La facteur de risque majeur que représente l'élévation du taux plasmatique des LDL est parfois transmis selon un mode autosomique dominant définissant l'hypercholestérolémie familiale dominante (HCFD). Deux gènes dont les mutations sont associées à l'HCFD ont été caractérisés : le gène LDLR qui code pour le récepteur LDL et le gène APOB qui code pour son ligand, l'apolipoprotéine B-100. Notre objectif était le dénombrement et l'étude des différents gènes impliqués dans l'HCFD par une approche combinant des outils moléculaires, génétiques et informatiques. Par cartographie génétique dans deux familles présentant une HCFD non liée aux gènes LDLR et APOB, nous avons localisé un troisième locus (FH3 pour Familial Hypercholesterolemia 3) à l'origine de l'hypercholestérolémie dans l'une de ces familles. Nous avons aussi détecté l'existence d'un gène FH4 dans la deuxième famille. L'ensemble de ces travaux montre un niveau d'hétérogénéité génétique plus important que celui reconnu jusqu'alors pour l'HCFD. Pour la maladie du gène LDLR, nous avons créé une base de données réunissant l'ensemble des informations cliniques et biologiques associées aux 350 mutations ponctuelles et petites insertions / délétions (< 100 paires de base) décrites à ce jour dans sa séquence codante. L'analyse des données moléculaires de la base révèle 64% de mutations faux - sens et 19% de mutations non-sens, dont seulement 20% affectent un dinucléotide CpG. De plus, même si ces remaniements sont répartis sur toute la longueur de la séquence codante, ils touchent préférentiellement les exons 4 et 9. Pour le gène APOB, nous avons mesuré l'impact clinique des mutations R3500Q et R3531C dans la population française. Leur prévalence s'est avérée relativement faible (0,4%) chez les sujets souffrant d'athérosclérose coronarienne et leur contribution à l'HCFD bien inférieure à celle des mutations du gène LDLR. Les mutations R3531C sont moins fréquentes que les mutations R3500Q et associées à une hypercholestérolémie moins sévère en moyenne. Une grande variabilité phénotypique caractérise ces deux mutations.