Dissertations / Theses on the topic 'Regulació de les comunicacions'

La Societat de la Informació és una realitat cada vegada més important en les societats desenvolupades i, juntament amb la Globalització, estan transformant de manera radical les nostres societats. En aquest context, els mitjans de comunicació i les xarxes de comunicacions electròniques estan vivint un procés de convergència que implica una transformació sense precedents en el món de la comunicació. L'objecte de la Tesi és l'anàlisi detallat de l'evolució i la situació actual de les xarxes de comunicacions electròniques i dels mitjans de comunicació, que he anomenat xarxes de comunicació multimèdia i, l'objectiu, analitzar els sistemes regulatoris i fer una proposta dels principis bàsics que hauria de contemplar un model regulatori de les xarxes de comunicació multimèdia assentat en els valors essencials del liberalisme social perquè pugui respondre de manera satisfactòria a l'interès públic.
La Sociedad de la Información es una realidad cada vez más importante en las sociedades desarrolladas y, junto la Globalización, están transformando de manera radical nuestras sociedades. En este contexto, los medios de comunicación y las redes de comunicaciones electrónicas están viviendo un proceso de convergencia que implica una transformación sin precedentes del mundo de la comunicación. El objeto de la Tesis es el análisis detallado de la evolución y la situación actual de las redes de comunicaciones electrónicas y los medios de comunicación, que he llamado redes de comunicación multimedia y, el objetivo, analizar los sistemas regulatorios y hacer una propuesta de los principios básicos que debería contemplar un modelo regulatorio de las redes de comunicación multimedia asentado en los valores esenciales del liberalismo social para que pueda responder de manera satisfactoria al interés público.
The Information Society is an increasingly important reality in developed societies and, along with globalization, is radically transforming our societies. In this context, the media and electronic communications networks are experiencing a convergence process that involves an unprecedented transformation in the world of communication. The purpose of this thesis is the detailed analysis of the evolution and of the current status of electronic communications networks and media, which I have labeled multimedia and communication networks, and, further, to analyze the current regulatory systems in order to develop a set of basic principles to be considered in the setting up of a regulatory model of multimedia communication networks, rooted in core values of social liberalism, and able to effectively defend the public interest.

La tesi estudia aspectes relacionats amb el telecontrol digital de centrals hidràuliques de generació d'energia elèctrica, aportant una estratègia de regulació lineal òptima (RLO) que permet incloure en la formulació -i, per tant, compensar) els retards en el càlcul de l'acció de control.

A més, la aportació d'una llei de control multinivell (multirate) permet millorar l'estabilitat quan es produeixen asincronismes entre la recepció de les telemesures i l'enviament de les ordres a les unitats generadores. Per a la validació de resultats, s'ha elaborat un model realista del sistema de generació de la zona catalana, acoblat a la resta peninsular i al francès. També s'aporta un exhaustiu estudi bibliogràfic sobre estratègies de regulació potència-freqüència (RPF) .

El la llei de control multinivell, s'ha considerat la possibilitat de reduir l'esforç de generació ponderant les realimentacions dels reguladors de velocitat de diferents unitats generadores. A més de tècniques de control Digital i de RLO; la tesi empra metodologies derivades de la Teoria de Sistemes de Gran Escala (LSS), dissenyant-ne els reguladors d'àrea autònoma (model de dues àrees d'Elgerd y Fosha) sobre una base de suboptimalitat, per posteriorment enfocar en el bloc coordinador tant efectes beneficiosos (Siljak) com perjudicials (Sundareshan) de les interconnexions entre subsistemes de la xarxa elèctrica
Esta tesis estudia aspectos relacionados con el telecontrol digital de las centrales hidráulicas de generación de energía eléctrica, aportando una estrategia de regulación lineal óptima (RLO) que permite incluir en la formulación - y, por tanto, compensar- los retardos de cálculo de la acción de control.

Además, la aportación de una ley de control multinivel (multirate) permite mejorar la estabilidad cuando se producen asincronismos entre la recepción de las telemedidas y el envío de órdenes a las unidades generadoras. Para la validación de resultados, se ha elaborado un modelo realista del sistema de generación de la zona catalana, acoplado al resto peninsular y al francés. Además, se aporta un exhaustivo estudio bibliográfico sobre estrategias de regulación potencia-frecuencia (RPF).

En la ley de control multinivel, se ha considerado la posibilidad de reducir el esfuerzo de generación ponderando las realimentaciones de los reguladores de velocidad de diferentes unidades generadoras. Además de técnicas de control digital y de RLO; la Tesis usa metodologías derivadas de la teoría de Sistemas de Gran Escala (LSS), diseñándose los reguladores de área autónoma (modelo de dos áreas de Elgerd y Fosha) sobre bases de suboptimalidad, para luego abordar en el bloque coordinador los efectos beneficiosos (Siljak) o perjudiciales (Sundareshan) de las interconexiones entre subsistemas de la red eléctrica.
This thesis assesses some aspects related with the digital telecontrol of hydraulic power plants, contributing with a control strategy based on the optimal linear regulator (OLR) which allows including -and, therefore, to compensate- the delays due to the control action computation in the problem formulation.

Besides, the new control law (multilevel & multirate) permits to improve the stability degree when it exists some asynchronism between the telemeasurements reception and the emission to the power units of the control commands. For checking theoretical results (in computer simulation), a realistic model of the Catalan power system (power generation &transportation levels) linked to the rest of the Iberian peninsular system, as well as to the French one, has been made. Additionally, a huge bibliographical study on power-frequency regulation strategies is documented in the thesis.

In the design of the multirate control law, the possibility to reduce generation efforts by weighting the feedback signals from different velocity (frequency) regulators has been considered. In addition to the Digital Control and OLR techniques, other methodologies from the Large Scale Systems (LSS) theory have been used. In particular, on a two-area model (Elgerd & Fosha model), the OLR design is made in a sub-optimality basis, being latter enlarged with a coordinator in order to take into account both beneficial (Sundareshan) or damaging (Siljak) aspects due to the electric interconnections with the whole power grid.

Aquesta tesi presenta un estudi sobre la gestió i regulació de l’ensenyament i aprenentatge matemàtic amb alumnat immigrant nouvingut de l’aula acollida d’educació Secundària. La revisió de la bibliografia ens ha mostrat que són molts pocs els estudis realitzats amb alumnes de procedència asiàtica, ja que són moltes les dificultats que presenten aquests alumnes, sobre les diferències culturals, de llengua, etc., respecte dels alumnes autòctons. L’estudi s’ha realitzat en diferents fases. En primer lloc es va fer un estudi pilot per tal de valorar els instruments de la mateixa. Els resultats del mateix ens van portar a fer un segon estudi amb una població d’alumnat d’origen asiàtic. La metodologia emprada ha estat descriptiva, ja que tenien com objectiu descriure els processos de gestió i regulació que es produeixen en una aula d’acollida. Es va començar l’estudi passant unes proves inicials, tant de continguts matemàtics com de resolució de problemes, les quals ens van donar informació valuosa dels coneixements que tenien els nostres alumnes en el moment de l’escolarització en el nostre país; i per tant ens orientaven en la gestió i regulació que s’havia de fer. Per veure l’evolució i l’adaptació de l’alumnat immigrant nouvingut es van dissenyar uns tallers d’àlgebra i de geometria que formaven part del currículum oficial. A partir d’aquests tallers hem estudiat les interaccions comunicatives (tant verbals, com gestuals) i les reaccions que es produïen durant la resolució dels problemes, els resultats de les quals ens han ajudat a entendre com els alumnes, plantejaven, argumentaven, i en definitiva feien els problemes. I també, evidentment, ens aportaven noves formes de seguir la regulació de l’aula d’acollida.
This thesis presents a study on the management and regulation of teaching and learning mathematics with immigrant students arrived from the host classroom of secondary education. The literature review shows very few studies with students of Asian origin because there are many difficulties with these students regarding cultural and language differences, among other factors and this is not the case with native students. The study was conducted in several phases. First of all, we carried out conducted a pilot study to evaluate the tools. The results also took us to a second study with a population of students of Asian origin. The methodology used was descriptive because its objective was to describe the management procedures and regulation that occur in a reception class. We began carrying out some initial tests, (both mathematical) content and problem solving, which gave us valuable knowledge about the level our students had at the time of enrollment in our country. This helped us adjusting and regulating classroom activities placement of students and so on. Furthermore, we designed algebra and geometry workshops as part of the official curriculum in order to see the evolution and adaptation of newly arrived immigrant students. Since these workshops studied communicative interaction (both verbal and gestural) and reactions that occurred during the resolution of the tasks, the results helped us to understand how students answered, argued, and ultimately worked out the exercises. These findings offer us new ways to continue regulating the reception class.
Esta tesis presenta un estudio sobre la gestión y regulación de la enseñanza y aprendizaje matemático con alumnado inmigrante recién llegado al aula de acogida en la educación Secundaria. La revisión de la bibliografía nos ha mostrado que son muy pocos los estudios realizados con alumnos de procedencia asiática, porque son muchas las dificultades que presentan estos alumnos, sobre las diferencias culturales, de lengua, etc., respecto de los alumnos autóctonos. El estudio se ha realizado en diferentes fases. En primer lugar se realizó un estudio piloto para valorar los instrumentos del mismo. Los resultados de este nos llevaron a hacer un segundo estudio con una población de alumnado de origen asiático. La metodología utilizada ha sido descriptiva, ya que tenían como objetivo describir los procesos de gestión y regulación que se producen en un aula de acogida. Se comenzó el estudio pasando unas pruebas iniciales, tanto de contenidos matemáticos como de resolución de problemas, las que nos dieron información valiosa de los conocimientos que tenían nuestros alumnos en el momento de la escolarización en nuestro país y, por lo tanto nos orientaban en la gestión y regulación que se tenía que hacer. Para ver la evolución y la adaptación del alumnado inmigrante recién llegado se diseñaron unos talleres de álgebra y de geometría que formaban parte del currículo oficial. A partir de estos talleres hemos estudiado las interacciones comunicativas (tanto verbales como gestuales) y las reacciones que se producían durante la resolución de los problemas. Los resultados nos han ayudado a entender cómo los alumnos, planteaban, argumentaban, y en definitiva hacían los problemas. Y también, evidentemente, nos aportaban nuevas formas de seguir la regulación del aula de acogida.

L'objecte d'estudi d'aquesta tesi es centra en la política europea de l'espectre radioelèctric i presta especial atenció a l'harmonització del dividend digital al Regne Unit i Espanya. La metodologia es basa en una revisió bibliogràfica i hemerogràfica completada amb un conjunt d'entrevistes amb representants de diferents organismes de regulació del Regne Unit i Espanya, i de la mateixa Comissió Europea. En la primera part de la tesi es realitza una aproximació conceptual, des d'una vessant tècnica i jurídica, a la xarxa radioelèctrica i al dividend digital, espai alliberat una vegada completada la transició a la TDT. Seguidament, s'aborda la naturalesa, àmbits de regulació de la xarxa radioelèctrica, actors, models i evolució de les formes de gestió. El tercer capítol es centra en la Unió Europea com actor de la política de l'espectre radioelèctric des de mitjans de la dècada dels 80 fins a l'actualitat. En la darrera part de la tesi es descriuen i analitzen les actuacions de la UE destinades a harmonitzar el dividend digital fent especial referència a les conseqüències d'aquesta harmonització sobre les estructures nacionals i la planificació de la TDT en els dos països estudiats, el Regne Unit i Espanya.
El objeto de estudio de esta tesis se centra en la política europea del espectro radioeléctrico y presta una especial atención a la armonización del dividendo digital en el Reino Unido y España. La metodología está basada en una revisión bibliográfica y hemerográfica completada con un conjunto de entrevistas con representantes de diferentes organismos de regulación del Reino Unido y España, y de la misma Comisión Europea. En la primera parte de la tesis se realiza una aproximación conceptual, desde una vertiente técnica y jurídica, a la red radioeléctrica y al dividendo digital, espacio liberado una vez se ha completado la transición a la TDT. Seguidamente, se aborda la naturaleza y ámbitos de la regulación de la red radioeléctrica, sus actores, modelos y evolución de sus formas de gestión. El tercer capítulo se centra en la Unión Europea como actor de la política del espectro radioeléctrico desde mediados de la década de los 80 hasta la actualidad. En la última parte de la tesis se describen y analizan las actuaciones de la UE destinadas a armonizar el dividendo digital y se atiende especialmente a las consecuencias que esta armonización tiene sobre las estructuras nacionales y la planificación de la TDT en los dos países estudiados, el Reino Unido y España.
The object of study of this thesis focuses on the European radio spectrum policy in particular the harmonization of the digital dividend in the United Kingdom and Spain. The methodology is based on a multidisciplinary bibliographic review completed with an in-depth interviews with policy-makers from the national regulatory authorities and the European Commission. The first chapter of the dissertation consists of a conceptual approach of radio spectrum network and the digital dividend, the amount space released once the switch-over is completed. Afterwards, it deals with the nature of spectrum regulation, its actors, models and evolution of spectrum management. Its third chapter focuses on the European Union as a spectrum policy actor from the 80's onwards. Finally, this thesis analyses the EU actions oriented to the harmonisation of the digital dividend, and pays special attention to its consequences on national structures and DTT plans of the United Kingdom and Spain.

La Ley 28278: Ley de Radio y Televisión (LRTV) de julio del 2004, impone al Estado la tarea de promover la radiodifusión digital y traduce este deber promocional, en dos acciones que corresponden ser cumplidas por el Ministerio de Transportes y Comunicaciones (MTC). Estas tareas son: a) Tomar las medidas necesarias relativas al espectro radioeléctrico; b) Adoptar los estándares técnicos correspondientes. A continuación reseñaremos las normas legales que tienen directa vinculación con la radiodifusión digital y que han sido aprobadas en el Perú desde el año 2004 a la fecha (ver anexo), las que tienen efecto desde ya o a corto o mediano plazo, sobre las -de acuerdo a las estadísticas oficiales- 1,083 estaciones de televisión, que son operadas por 355 empresas. Otro dato a tener presente es que el 61% de las estaciones de televisión son de tipo comercial, mientras que el restante 39% tienen propósitos educativos.

Sp1 i Sp3 pertanyen a la família de factors de transcripció Sp que controla la transcripció de gens implicats en gairebé tots els processos cel.lulars. Estudis previs al nostre grup van estudiar la regulació del promotor del gen Sp1 i van demostrar que la transcripció de Sp1 estava regulada principalment de forma positiva per Sp1 i NF-Y, i que Sp3 era capaç de contrarrestar l'activació produïda per Sp1 sobre el seu propi promotor. Donat que la relació Sp1/Sp3 a la cèl·lula és important per a la regulació dels gens diana, en aquest treball ens vam proposar estudiar la regulació del promotor de Sp3.
Vam clonar una regió de 546 bp que corresponia al promotor de Sp3 i vam procedir a la seva caracterització. Sp3 presenta múltiples inicis de transcripció localitzats entre les posicions -132 i -70 respecte de l'inici de traducció i la seva màxima activitat promotora es localitza a la regió fins a -281bp respecte de l'inici de traducció. Mitjançant les tècniques de retardament de la movilitat electroforètica (EMSA) i Immunoprecipitació de la Cromatina (ChIP) hem demostrat la unió dels factors Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb i c-Jun al promotor de Sp3. D'altra banda hem estudiat l'efecte de la sobreexpressió i la inhibició d'aquestes proteïnes sobre l'activitat d'aquest promotor utilitzant assajos d'activitat luciferasa, i sobre els nivells endògens de mRNA utilitzant RT-Real Time-PCR. Sp3 activa la transcripció del seu propi promotor. El promotor de Sp3 també és activat de forma més potent per Sp1, Sp3 i NF-Y; tot i que NF-1, c-Myb, B-Myb, c-Jun i c-Fos també poden activar aquest promotor. Un altre fet remarcable és que E2F1 es comporta com a repressor del promotor de Sp3. Tots els resultats observats a nivell de l'activitat del promotor es van confirmar amb la mesura dels nivells endogens de mRNA per Sp3.
Addicionalment, s'ha estudiat la interacció de Sp1 amb diferents proteïnes implicades en la regulació del cicle cel·lular i s'ha caracteritzat l'efecte de la seva sobreexpressió sobre l'activitat del promotor de Sp1, ja que està regulat per Sp1. Utilitzant un array d'anticossos, es va fer un cribatge de proteïnes que poguessin interaccionar amb Sp1, i algunes d'elles es van confirmar per co-immunoprecipitació. Això ens va permetre demostrar que Sp1 és capaç d'interaccionar amb CDK4, p21, SKP2 i BRCA2. Posteriorment, vam analitzar l'efecte d'aquestes i altres proteïnes que interaccionen amb Sp1 sobre el promotor de Sp1, i vam observar que el promotor de Sp1 és regulat de forma positiva per la sobreexpressió de CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 i Stat3; mentre que és reprimit per la sobreexpressió de p53 i NFB. Per tal d'analitzar si hi havia una correlació entre els efectes sobre el promotor de Sp1 i una alteració dels nivells endogens de Sp1, vam confirmar tots els efectes observats a nivell de l'activitat del promotor tot emprant la tècnica de RT-Real Time-PCR. A més, els efectes sobre el promotor de Sp1 es produeixen mentre aquestes proteïnes estan unides, directa o indirectament, al promotor tal com van demostrar els assajos de ChIP. També vam estudiar l'efecte de la sobreexpressió d'aquestes proteïnes sobre un promotor que només contenia caixes Sp1 i, en general, vam observar efectes equivalents als observats per al promotor de Sp1. La interacció entre Sp1-p21 va ser objecte d'estudi en més detall i vam determinar que l'expressió de p21 en cèl·lules de fibrosarcoma indueix el promotor de Sp1 així com els nivells de mRNA, però, al mateix temps, indueix la degradació de Sp1.

Com a conclusió final, hem vist que el procés de transcripció és un mecanisme molt complex que involucra un gran número de factors de transcripció, així com d'altres proteïnes que puguin interaccionar amb aquests factors.
Sp1 and Sp3 belong to the Sp family of transcription factors that controls transcription of genes involved in almost all processes in the cell. We performed a detailed analysis of the promoter region of the Sp3 transcription factor, including the identification of its transcriptional start sites and the putative binding sites for transcription factors. Multiple transcriptional starts sites were located at position sranging from -70 to -132 relative to the translational start of the gene. We defined the minimal promoter region cooresponding to 281 bp relative to the translational start. Along the promoter sequence we demonstrated the binding of Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb and c-Jun. Moreover, we studied the effect of the overexpression or knocking down of these factors on the Sp3 promoter activity and the endogenous mRNA levels. Sp3 is positively autoregulated and it is also activated by Sp1, NF-Y, Myb, AP-1 and NF-1. On the contrary, Sp3 transcription is repressed by E2F/DP1 overexpression.
Additionally, we studied the interaction of Sp1 with other proteins involved in the cell cycle regulation and we characterized the effect the overexpression of these proteins on the Sp1promoter activity, given that this promoter is regulated by Sp1. Sp1 is able to interact with CDK4, p21, SKP2 and BRCA2. The Sp1 promoter is positively regulated by the overexpression of CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 and Stat3 whereas the overepression of p53 and NFB represses the promoter. The effects of all these proteins were also analyzed at the Sp1 mRNA level and by using an artificial promoter containing only Sp1 binding sites. The interaction between Sp1 and p21 was further analyzed and we demonstrated that, in fibrosarcoma cells, p21 induces the Sp1 promoter and its mRNA expression but, at the same time, it induces the degradation of Sp1 protein.
The process of transcription is a very complex mechanism that involves a great number of transcription factors and other proteins interacting with these factors.

Doctor en Bioquímica
El retículo endoplásmico (RE) y la mitocondria son organelos celulares que entablan una continua y dinámica conversación que permite a la célula responder coordinadamente a diversas situaciones fisiopatológicas. Datos previos de nuestro Laboratorio mostraron que ambos organelos incrementan los puntos de contacto físico durante la fase temprana del estrés de RE, permitiendo una mayor transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria y estimulando así el metabolismo de este último organelo y favoreciendo la sobrevida celular. El presente proyecto estudió la participación de proteína quinasa A (PKA) y caveolina-1 (Cav1) como agentes reguladores de esta interacción física y funcional entre el RE y la mitocondria. Como modelo de estudio se utilizaron células HeLa tratadas con tunicamicina como agente inductor de estrés de RE por 4 h. Primero, se investigó la participación de PKA en la fase temprana del estrés de RE. Esta quinasa se activó ante condiciones de estrés, medido por la fosforilación de DRP1 en Ser637 por Western blot y concomitante elongación mitocondrial (microscopía confocal). El inhibidor específico de PKA H89 previno estos cambios, comprobando que ambos son dependientes de PKA. Posteriormente, se estudió la participación de PKA en el acoplamiento RE-mitocondria a través de la medición de proximidad (microscopía confocal), contactos físicos (microscopía electrónica), transferencia de Ca2+ (microscopía de fluorescencia) y bioenergética mitocondrial (tasa de consumo de oxígeno). El papel de PKA en estos procesos se evaluó por modulación farmacológica con H89. Los resultados mostraron que la activación de PKA es necesaria para inducir la formación de contactos RE-mitocondria, y de esta forma, gatillar la respuesta adaptativa frente a estrés de RE. Luego se investigó el papel de Cav1 sobre la interface RE-mitocondria. La expresión de Cav1 abolió completamente la respuesta adaptativa frente a estrés de RE temprano, evidenciado mediante proximidad entre organelos, transferencia de Ca2+ y respiración mitocondrial. Además de alterar esta plasticidad organelar frente a condiciones de estrés, la expresión de Cav1 disminuyó significativamente la bioenergética mitocondrial basal, junto con inducir un remodelado basal de la interface RE-mitocondria medido por purificación de las membranas del RE asociadas a mitocondria (MAM). Finalmente, se determinó que la expresión de Cav1 antagonizó la señalización de PKA, impidiendo que ella fosforile a DRP1 y promueva la elongación mitocondrial en respuesta a estrés de RE. Más aún, mediante fraccionamiento subcelular, se estableció que Cav1 afectó la localización subcelular de PKA, evitando que se relocalice a las membranas microsomales en respuesta al estrés de RE. De este modo, Cav1 actúa como un regulador negativo de PKA, previniendo su activación frente a estrés de RE, evitando así la respuesta adaptativa celular
The endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria are two organelles that continuously communicate between one another. This organelle crosstalk allows mitochondria and ER to coordinate responses to a variety of physiological and pathophysiological situations. Data from a previous work show that during the early phase of ER stress, both organelles increase their contact sites, augmenting thereby calcium transfer from ER to mitochondria. This response boosts mitochondrial bioenergetics and ultimately promotes cell survival. Here, we sought to study the role of Protein Kinase A (PKA) and Caveolin-1 (Cav1) as regulators of such organelle crosstalk. As an experimental model, HeLa cells were treated with tunicamycin to induce ER stress. First, we observed that PKA was activated during early stages of ER stress, as assessed by increased phosphorylation of DRP1 at the inhibitory site Ser637 (Western blot), and that this event was followed by mitochondrial elongation (confocal microscopy). The specific PKA inhibitor H89 prevented these changes, thus confirming that they were due to PKA and not another kinase. Subsequently, we studied ER-mitochondria coupling by evaluating organelle proximity (confocal microscopy), physical contact sites (electron microscopy), Ca2+ transfer (fluorescence microscopy) and mitochondrial bioenergetics (oxygen consumption rate). PKA was again involved in these processes by pharmacological modulation using the inhibitor H89. Our results show that PKA activation is necessary to induce the formation of ERmitochondria contacts and to trigger the adaptive metabolic responses to ER stress. Next, we investigated the role of Cav1 as a modulator of the ER-mitochondria interface. Cav1 overexpression completely abolished the early adaptive response to ER stress, as assessed by evaluating the proximity between organelles, calcium transfer and mitochondrial respiration. In addition to altering organelle plasticity in response to stress conditions, Cav1 overexpression severely decreased baseline mitochondrial bioenergetics and induced basal remodelling of the ER-mitochondria interface, as determined by purification and analysis of mitochondria-associated ER membranes. Finally, we determined that Cav1 overexpression antagonizes PKA signalling, preventing PKA-dependent DRP1 phosphorylation and mitochondrial elongation in response to ER stress. Moreover, subcellular fractionation revealed that Cav1 affected PKA localization, prevented redistribution to microsomal membranes in response to ER stress, and altered the pattern of DRP1 phosphorylation. Thus, Cav1 functions as a negative regulator of PKA that precludes PKA activation during early ER stress and thereby prevents the adaptive cellular response
Fondecyt; Fondap;

El presente trabajo consiste en el estudio del uso del espectro radioeléctrico en las comunicaciones globales, impulsados por el desarrollo de la banda ancha, en naves y aeronaves, que está tomando mayor relevancia a consecuencia del desarrollo del comercio internacional que genera la necesidad de estar permanentemente conectados. Esta situación suscita un gran impacto en la regulación de los países, dado que el uso del espectro puede involucrar varios territorios, la temporalidad y comunicaciones en espacios libres. No obstante, se aprecia que los países no están aún preparados para este nuevo escenario, pues se requiere una revisión de la actual regulación de las telecomunicaciones. Por ello, se evalúa la necesidad o no de la regulación del espectro y las comunicaciones globales, considerando los convenios y la legislación sobre derechos del mar y el espacio aéreo; y, en caso de requerirse la regulación, si esta debe ser general, es decir, si se debe aplicar el marco normativo común a los demás servicios, o, definir una regulación especial, evaluando las ventajas y desventajas en cada caso. Para tal efecto, se ha revisado las recomendaciones de la UIT y la legislación comparada de Europa, España, EE.UU., México, Colombia y Chile. Por otro lado, para brindar el marco general de una posible de la posible regulación, pese a su estado incipiente, se ha seguido la metodología de análisis de impacto regulatorio que propone la OECD.
Tesis

Snail és un factor de transcripció del tipus dit de zinc essencial en la transició epiteli mesènquima (EMT), on la seva funció més ben caracteritzada és com a repressor de l'expressió de l'E-Cadherina. Aquesta tesi doctoral es centrà en l'estudi funcional d'Snail en aquelles línies cel·lulars on hi havia una coexpressió de totes dues proteïnes.
En aquest treball es descriu com l'activitat transcripcional d'Snail és regulada per la fosforilació d'un domini ric en serines adjacent a una seqüència d'export nuclear. Aquesta fosforilació, regulada per les unions a la matriu extracel·lular, permet un canvi conformacional d'Snail que afavoreix el seu export nuclear i en conseqüència la pèrdua de la seva capacitat transcripcional. A més a més es mostra com Snail pot ser fosforilat in vitro per les quinases CK2 i GSK3?, on la fosforilació de la primera afavoreix la de la segona.
D'altra banda es descriu com Snail pot ser degradat al nucli pel sistema del proteasoma, la regió responsable d'aquesta i com Akt és capaç de promoure-la.
A més a més es mostra com Snail pot ser fosforilat in vitro per les quinases CK2 i GSK3?, on la fosforilació de la primera afavoreix la de la segona.
D'altra banda es descriu com Snail pot ser degradat al nucli pel sistema del proteasoma, la regió responsable d'aquesta i com Akt és capaç de promoure-la.
Snail is a zinc finger transcription factor essential during the epithelyal-mesenchymal transition (EMT), where it acts as an E-Cadherin repressor, its best characterized function. This doctoral thesis is focused on the functional study of Snail on those cell lines co-expressing Snail and E-cadherin.
In this work we describe how the transcriptional activity of Snail is regulated by phosphorylation on a serine rich domain adjacent to a nuclear export sequence (NES). This phosphorylation, regulated by the extracellular matrix unions, causes a conformational change of Snail, that allows its nuclear export and, in consequence, inhibits its transcriptional activity. Snail is phosphorylated in vitro by two kinases, CK2 and GSK3?.
It is also shown how Snail can be degraded in the nucleus by the proteasome system, which region is implicated and how Akt can stimulate it.

Els resultats que es presenten en aquesta memòria aporten informació que ens permet donar un pas més en el coneixement de la regulació transcripcional del gen pfkfb3 i conseqüentment de la via glucolítica.

En primer lloc, hem localitzat els elements de resposta de HIF-1 al promotor del gen i hem observat que aquests eren essencials per a la resposta a la hipòxia en cèl·lules de glioblastoma humà (T98G) i en fibroblasts embrionaris de ratolí (mEF). Seguidament, hem corroborat la implicació de la progesterona en la regulació del gen pfkfb3, que inicialment havien descrit Hamilton i col·laboradors {Hamilton, 1997 #93}. Hem posat de manifest l'augment d'expressió d'uPFK-2 i del seu mRNA en cèl·lules de càncer de mama (T47D) incubades amb la hormona. A més a més, hem determinat que aquest increment era degut a l'acció dels receptors de progesterona (PR, progesterone receptors). Hem localitzat una possible seqüència consens per aquests receptors (PRE, progesterone response element) al promotor del gen pfkfb3, però encara no hem pogut demostrar si el paper que exerceix la progesterona en la regulació d'aquest gen és a nivell transcripcional o a nivell d'estabilització del seu mRNA.

Per comprovar els resultats obtinguts en cèl·lules aïllades, hem estudiat la regulació del gen pfkfb3 in vivo, utilitzant com a model d'experimentació animal la soca de ratolins C57/BL6. Els hem tractat amb STZ i hem observat l'increment d'expressió del mRNA del gen pfkfb3, d'uPFK-2, i de la concentració de Fru-2,6-P2 en el fetge d'animals diabètics. Paral·lelament, hem realitzat l'estudi de la regulació transcripcional del promotor del gen pfkfb3, in vivo, utilitzant la tècnica de transferència gènica per hidrodinàmia. Els resultats obtinguts demostren l'augment de la transcripció del gen en el fetge dels ratolins diabètics en condicions de dejuni. A més, hem realitzat estudis immunohistoquímics dels fetges diabètics i controls, demostrant que l'expressió del gen pfkfb3 es produeix principalment en els hepatòcits proliferants de la zona perivenosa del fetge dels ratolins diabètics. També hem estudiat les vies de senyalització que porten a l'augment d'expressió del gen pfkfb3, demostrant que la via PI3K/Akt/mTOR (activa en aquestes cèl·lules altament proliferants) hi té un paper essencial.

Aquests resultats obtinguts sobre la regulació del gen pfkfb3, juntament amb els que ja s'havien descrit {Hamilton, 1997 #93}; {Chesney, 1999 #96}; {Atsumi, 2002 #110}; {Riera, 2002 #113}; {Minchenko, 2002 #144}; {Riera, 2003 #114}; {Bando, 2005 #102}; {Telang, 2006 #106}, ens confirmen la importància que té el fenotip glucolític en les cèl·lules proliferants o tumorals. El gen pfkfb3 controla la síntesi de la Fru-2,6-P2 que, com s'ha explicat a la introducció, és l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1. Per tant, podem considerar que el gen pfkfb3 és clau per a la regulació de la via glucolítica, de manera que el seu augment d'expressió en diferents tipus de cèl·lules proliferants i tumorals condueix a l'activació d'aquesta via i, conseqüentment, afavoreix el canvi cap a un fenotip glucolític.

Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.
Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine.

Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.
Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine.

En els darrers anys hi ha hagut un gran desenvolupament de la recerca en l'àrea de les xarxes informàtiques. En aquest context, la utilització dels grafs com a models per a les xarxes, on els nodes són ordinadors o processadors interconnectats, que s'han de comunicar entre ells de la manera més eficaç possible, ha donat lloc a gran quantitat de treballs. Quan es tracta de xarxes d'interconnexió, en què el nivell d'integració és elevat, es solen considerar models amb bones propietats de simetria, que permeten definir i analitzar els algorismes amb més facilitat. Per exemple, els grafs de Cayley són grafs definits a partir de l'operació d'un grup. Això permet utilitzar l'estructura algèbrica subjacent per a la resolució dels problemes.
Aquesta tesi tracta de les propietats d'una família de grafs, els anells cordals de grau 3, que són grafs de Cayley sobre el grup de simetries d'un polígon regular o grup dièdric. Aquest grup no és commutatiu, però els seus elements satisfan bones relacions. A més, està molt relacionat amb el grup cíclic, i això fa que els anells cordals tinguin molt a veure amb els grafs circulants.
Una part important del treball és l'estudi de les propietats estructurals dels anells cordals, mentre que en una segona part es donen algorismes de comunicació punt a punt, o encaminaments, amb bones propietats, i d'intercanvi d'informació entre tots els nodes, o gossiping. Aquestes dues parts del treball estan interrelacionades, ja que les propietats estructurals dels grafs s'utilitzen en les definicions i en l'anàlisi dels algorismes que es proposen en la segona part i, a la vegada, l'estudi de problemes de comunicacions ha motivat el plantejament de problemes de caire més teòric, com la classificació per isomorfisme dels anells cordals, la caracterització del seu grup d'automorfismes o el càlcul de l'aresta bisecció.
Part de l'interès d'aquest treball és l'ús de les tessel.lacions per a la representació dels grafs. Aquesta eina s'ha revelat molt útil en l'estudi de propietats mètriques i de problemes en què s'han d'establir camins entre els nodes, ja que en facilita la visualització. Les altres famílies de grafs que han estat estudiades per diversos autors mitjançant tessel.lacions del pla són, sobretot, els grafs circulants de grau 4, en què s'utilitzen quadrats per representar els vèrtexs, i de grau 6, en què s'utilitzen hexàgons. Per als anells cordals de grau 3 s'han utilitzat triangles. En particular es veu com la tessel.lació determina totalment el graf, i les propietats del graf es tradueixen en propietats de la tessel.lació.
Es poden citar com a problemes oberts la generalització dels resultats a altres famílies de grafs, i l'estudi d'altres problemes de comunicacions. En particular, per al problema del càlcul de l'índex òptic, es tenen alguns resultats en el cas d'anells cordals aresta transitius, que utilitzen la caracterització del grup d'automorfismes i la definició d'encaminaments amb bones propietats presentats en aquesta tesi.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1). En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1). Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli.
It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

Els macròfags desenvolupen un paper clau en la formació de la lesió d'ateroma. Les LDL oxidades (LDLox) indueixen l'expressió de la adipocyte fatty acid-binding protein (FABP4) en els macròfags, fet que constitueix un dels desencadenants de l'evolució d'aquestes cèl·lules al fenotip de cèl·lula escumosa. Les LDLox són una font d'aldehids, que són els productes finals de l'oxidació dels àcids grassos poliinsaturats. El treball realitzat ha estat dissenyat per provar la hipòtesi de la participació dels aldehids en la inducció de l'expressió de FABP4 en macròfags. A causa del caràcter prooxidant d'aquestes espècies, s'ha avaluat si aquesta inducció podria relacionar-se amb el sistema antioxidant cel·lular dirigit pel factor de transcripció Nrf2. El treball experimental es va dur a terme amb monòcits de la línia cel·lular THP-1 que es van diferenciar a macròfags mitjançant èsters de forbol. Els aldehids apolars estudiats van ser el 2,4-decadienal (DDE) i l'hexanal. La valoració dels efectes sobre les expressions gènica i proteica de FABP4 es va realitzar per RT-PCR a temps real i western blot, respectivament. Ambdós aldehids van produir augments en l'expressió gènica i proteica de la FABP4 en els macròfags. L'estudi in silico del promotor de la FABP4 humana va revelar la presència d'un possible lloc antioxidant response element (ARE) per la unió de Nrf2 amb un elevat grau d'homologia amb la seqüència consens. L'assaig d'immunoprecipitació de la cromatina va confirmar al unió in vivo de Nrf2 a aquest lloc ARE. L'estudi de l'efecte dels aldehids sobre l'activació del factor de transcripció Nrf2 va evidenciar un comportament diferencial entre els dos compostos. El DDE augmentava la forma fosforilada i activa de Nrf2, mentre que l'hexanal no produïa cap efecte. Es va provar que en l'activació de Nrf2 produïda pel DDE estaven implicades dues de les principals vies de senyalització intracel·lular: PI-3k/Akt i ERK-MAPK. Considerant els resultats obtinguts, podem suggerir un nou paper de la via Nrf2-ARE com a desencadenant de la formació de cèl·lules escumoses a través de la inducció de FABP4 en resposta a l'oxidació. Aquests resultats proposa la via de Nrf2 com a nova diana per la intervenció terapèutica dirigida a la prevenció i el control del desenvolupament de l'aterosclerosi.
Macrophages play a crucial role in the development of atherosclerosis. It has been shown that oxidized LDL (oxLDL) induces adipocyte fatty acid-binding protein (FABP4) in human macrophages, which constitutes one of the major contributors to foam cell formation. oxLDL is a source of apolar aldehydes formed as end-products of polyunsaturated fatty acid oxidation in LDL. This thesis has been designed to study the hypothesis that apolar aldehydes participate in the induction of FABP4 expression in human macrophages. According to the prooxidant nature of these species, we have assessed whether FABP4 expression could be related to the cellular antioxidant system leadered by the transcription factor Nrf2. The experimental procedure was mainly performed by using human monocytic leukemia THP-1 cells which were differentiated to macrophages through a 72-hour phorbol ester treatment. 2,4-decadienal (DDE) and hexanal were the two apolar aldehydes studied. Reverse transcription and real time-PCR (RT-rtPCR) and Western blotting were used to assess FABP4 mRNA and protein expression, respectively. Both aldehydes produced a markedly increase in FABP4 expression at mRNA and protein levels. In silico analysis of human FABP4 promoter revealed the presence of a putative antioxidant response element (ARE) where Nrf2 could bind. This putative binding site had a high matrix similarity score with the consensus sequence. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay using an Nrf2-specific antibody confirmed the in vivo binding of Nrf2 to this ARE found in human FABP4 promoter. The assessment of the effect of the two aldehydes on Nrf2 activation evidenced a differential behaviour between DDE and hexanal. Whereas DDE increased nuclear phosphorylated Nrf2 levels, hexanal showed no effect. We observed that two of the major intracellular signal transduction pathways, PI-3k/Akt and ERK-MAPK, are implicated in DDE-induced Nrf2 activation. According to our results, we propose a novel role of Nrf2-ARE pathways as a triggering step on foam cell formation mediated by FABP4 induction in response to oxidation. These results open new therapeutic targets addressed to control arteriosclerosis development.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.

En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1).

En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1).

Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.

En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli.
It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.

On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.

On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.

All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

CD69 és una lectina tipus C amb orientació tipus II, que participa en la migració de limfòcits i la secreció de citocines. CD69 s'expressa a la gran majoria de leucòcits durant processos infecciosos, autoimmunitaris i neoplàsics, i s'utilitza àmpliament com a marcador de l'activació del sistema immunitari. El seu targeting amb anticossos monoclonals ha resultat útil en el tractament de malalties en diferents models animals i, per tant, per esbrinar quins són els mecanismes que controlen la seva expressió a la superfície cel•lular és molt important. L’expressió de CD69 és induïble i està fortament controlada a nivell transcripcional. Després de processos d’activació, els transcrits de CD69 es detecten als 30-60 minuts i la proteïna a les 4-6 hores. La present tesi ha estudiat quins són els elements genètics necessaris per a una correcta expressió temporal i espaial de CD69 in vivo. L’anàlisi de la seqüència de l’ADN en una regió 45Kb per sobre del gen va rebel•lar una conservació evolutiva del promotor i de quatre seqüències no codificants que van ser anomenats CNS1, CNS2, CNS3 i CNS4 (CNS, Conserved Non coding Sequence). Mitjançant experiments de digestió amb DNasa i d’immunoprecipitació de la cromatina, es va veure que aquests CNS eren regions obertes de cromatina amb modificacions epigenètiques específiques. A més, en assajos de luciferasa en cèl•lules T, es va veure que els elements CNS2 i CNS4 mostraven una activitat enhancer constitutiva i induïble. La generació de ratolins transgènics amb el reporter hCD2 va permetre analitzar la seva funció in vivo. El promotor conferia una expressió regulada durant la selecció positiva dels timòcits, però no podia donar suport a una expressió regulada en limfòcits madurs. La inclusió de CNS1 i CNS2 va causar la supressió de l'expressió del reporter i l'addició de CNS3 i CNS4 va donar lloc a una expressió regulada a les cèl•lules T, però no a les cèl•lules B. Vam concloure que CNS1-4 són elements reguladors importants que interactuen tant positivament com negativament amb el promotor de CD69 i que contribueixen de manera diferent a l'expressió CD69 a les cèl•lules T i B. D’altra banda, l’anàlisi in silico de regions intragèniques del gen de CD69 va revel.lar una estructura de la cromatina específica entre les seqüències codificants I i II (Intró I) que estava associada a nucleosomes posicionats. A més, en aquesta regió del locus CD69 humà es va identificar un lloc nou d’hipersensibilitat que era induïble per estimulació. Una anàlisi en el locus murí va rebel•lar una regió similar d’hipersensibilitat que sembla implicar almenys les primeres 2Kb de l'Intró I. Pel que fa a l’estructura de la cromatina, en timòcits negatius per CD69, aquesta regió intrònica mostrava nivells baixos i intermedis de l'acetilació i dimetilació de la lisina 4 i de la histona H3 respectivament. L’expressió de CD69 en aquest mateix tipus cel•lular durant la selecció positiva es va associar amb una inducció clara de l'acetilació de la histona H3 a l’Intró I. Curiosament, els limfòcits T perifèrics presentaven alts nivells d'aquestes marques de forma independent a l’expressió CD69. Per tant, l'Intró I pot jugar un paper crucial en el control de l'expressió del gen de CD69. Amb aquesta tesi hem observat que l'epigenètica i els elements distals d’ADN són importants la regulació de l’expressió de CD69, s'han ampliat considerablement els coneixements sobre els possibles mecanismes, que fins ara s'havia focalitzat només en el promotor, i proposa una nova base per a futurs estudis.
Thesis: "Transcriptional regulation of CD69 gene" Summary CD69 is a type II C-type lectin involved in lymphocyte migration and cytokine secretion.CD69 expression represents one of the earliest available indicators of leukocyte activation and its rapid induction occurs through transcriptional activation. In this thesis we examined the molecular mechanism underlying mouse CD69 gene transcription in vivo in T and B cells. Analysis of the 45kb region upstream of the CD69 gene revealed evolutionary conservation at the promoter and at four non-coding sequences (CNS) that were called CNS1, CNS2, CNS3 and CNS4. These regions were found to be hypersensitive sites in DNase I digestion experiments and chromatin immunoprecipitation assays showed specific epigenetic modifications. CNS2 and CNS4 displayed constitutive and inducible enhancer activity in transient transfection assays in T cells. Using a transgenic approach to test CNS function, we found that the CD69 promoter conferred developmentally regulated expression during positive selection of thymocytes but could not support regulated expression in mature lymphocytes. Inclusion of CNS1 and CNS2 caused suppression of reporter expression whereas further addition of CNS3 and CNS4 supported developmental-stage and lineage-specific regulation in T cells but not in B cells. We concluded CNS1-4 are important cis-regulatory elements that interact both positively and negatively with theCD69 promoter and that differentially contribute to CD69 expression in T and B cells. In silico analysis of intragenic regions of CD69 gene also revealed a specific chromatin structure between coding sequence I and II (intron I) associated with positioned nucleosomes. Intron I contained a novel hypersensitive site region that was inducible upon stimulation and, interestingly, its chromatin structure appears to be developmentally regulated. Thus, Intron I may also contain an important DNA regulatory element important for the correct expression of CD69.

Els receptors d'adenosina són receptors acoblats a proteïna G classificats en A1, A2A, A2B i A3 en funció del grau d'afinitat pel seu agonista endogen, l'adenosina. Els receptors A1 i A3 interaccionen amb l'adenilat ciclasa (AC) inhibint la seva activitat i els receptors A2A I A2B activant-la. El receptor d'adenosina A1 (A1R) té un paper clàssicament neuroprotector mentre que el receptor A2A (A2AR) està associat a neurotoxicitat, dany neuronal i mort cel·lular. Les malalties neurodegeneratives són un conjunt de patologies que presenten dèficit cognitiu o alteracions motores en funció del tipus neuronal que degenera i que, bioquímicament s'anomenen proteïnopaties, perquè acumulen agregats proteics.

L'objectiu d'aquest estudi ha estat l'anàlisi dels nivells d'expressió dels receptors d'adenosina en la malaltia de grans argiròfils (AGD), la malaltia d'Alzheimer (AD) i la malaltia de Parkinson (PD). En aquest punt, hem descrit un increment dels receptors A1R en l'hipocamp de pacients amb AGD i un increment dels receptors A1R i A2AR en el còrtex frontal de pacients amb AD des de estadiatges preclínics. Paral·lelament s'ha detectat un augment dels receptors A2AR en el nucli estriat de pacients amb PD que encara no han rebut tractament farmacològic. Altres autors havien descrit increments del receptor tot i que sempre associat a tractaments de llarga durada amb Levodopa (L-Dopa). A partir d'aquest resultat i per tal de conèixer el mecanisme molecular implicat en l'increment patològic del receptor vam afrontar el segon objectiu del treball: l'estudi de la regulació transcripcional del gen ADORA2A, gen que codifica pel receptor A2AR.Es va estudiar el percentatge de metilació de l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A, tant en línies cel·lulars com en l'estriat de pacients amb PD i el paper de dos factors de transcripció, ZBP-89 i Yin-yang 1(YY1), en l'increment patològic del receptor. La metilació de l'ADN és un dels principals mecanismes de repressió de l'expressió gènica. Hem demostrat que el percentatge de metilació en l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A controla els nivells d'ARNm del receptor en línies cel·lulars tot i que no hem observat canvis en el percentatge de metilació en el nucli estriat de pacients amb PD respecte els pacients controls. A més, hem demostrat, per primera vegada, que els factors de transcripció ZBP-89 i YY1 actuen com activador i repressor, respectivament, del receptor A2AR en les cèl·lules SHSY-5Y. En els pacients de PD no s'han observat canvis en l'expressió del ZBP-89 però sí, un increment tant a nivell d' ARNm com de proteïna del YY1. Conjuntament, per microscopia confocal, hem observat que YY1 està localitzat tant als nuclis de les cèl·lules positives com negatives pel receptor A2AR. En conclusió, el percentatge de metilació no varia en les regions analitzades entre controls i patològics. Tot i així, hem demostrat un increment patològic de YY1 en pacients amb PD i, com que està descrit que els nivells d'AMPc controlen l'expressió del factor de transcripció, ens permet proposar la hipótesis per la qual un increment de YY1 pot representar un mecanisme de regulació retrògrada del A2AR per tal de reduir-ne els nivells a PD.
Adenosine is a nucleoside distributed throughout the entire organism as an intermediary metabolite. At the extracellular level, adenosine plays multiple physiologic roles, interacting with specific receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine receptors A1 and A2B have been related in neuroprotective role and adenosine activity through A2 receptors (A2ARs) can give rise to neurotoxicity, neuronal damage and cellular death. In this work we have devolve two main points. First of all we characterized the adenosine receptor expression levels in neurodegenerative disease: Argirofilic grains disease (AGD), Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD). We described an increase of A1R in hippocampus of patients with AGD, increased levels of A1 and A2A in frontal cortex of patients with AD in early stages. We observed an increase of de A2A levels in striatum in PD patients with any treatment at all. Trying to know the molecular reason of the pathological expression levels of A2A R we studied the percent of methylation of 5'UTR of ADORA2A which codifies by A2aR in cell lines and in post-mortem tissue of patients of PD. We conclude that DNA methylation plays a role in a constitutive A2AR cell surface level, but no changes were observed comparing PD patients and controls. By the other hand, we studied the role of two transcription factors ZBP-89 and Yin-yang 1 (YY1) in the A2AR expression level. We conclude ZBP-89 active and YY1 repress the expression of the receptor in SHSY-5Y lines.

El malbaratament dels productes frescos suposa la pèrdua de fins a un 45% dels fruits i vegetals. El canvi global i el previst increment de la freqüència de fenòmens meteorològics extrems representaran una major pressió a la producció i la cadena logística des del camp fins al consumidor, especialment als països en desenvolupament on la cadena del fred no sempre es pot mantenir i les pèrdues poden representar una fracció encara major de la collita. La senescència post-collita i els estressos associats limiten la longevitat comercial, però també la qualitat organolèptica i valor nutricional dels vegetals i productes frescos. Una millor comprensió d'aquests processos crea oportunitats per a una millor gestió i per dirigir programes de millora. Després de la collita, l’exposició controlada a estressos abiòtics i/o aplicacions exògenes de fitohormones i reguladors del creixement pot millorar característiques nutricèutiques, organolèptiques i de longevitat comercial. En aquesta tesi s’han desenvolupat noves metodologies per combinar trets fisiològics, perfils hormonals i bioquímics, i eines transcriptòmiques per caracteritzar millor els processos de senescència d'òrgans. Permetent així el disseny d’estratègies biotecnològiques per millorar la qualitat i/o longevitat de productes frescos, tot descrivint els efectes subjacents d'aquesta manipulació en la fisiologia de la post-collita i la maduració de fruits. Els resultats suggereixen el potencial per manipular la senyalització per àcid abscísic (ABA) amb aplicacions d’ABA i/o pirabactina (pyrabactin) per millorar la qualitat post-collita de les verdures de fulla verda (Brassica oleracea var capitata) emmagatzemades a temperatura ambient (Capítol 3) i per millorar el contingut de vitamina C i E de fruits de gerdera (Rubus idaeus; Capítols 1 i 2); i l’estudi i caracterització de la senescència floral post-collita de flors insensibles a l’etilè (Lilium, Iris) i el potencial d’aplicacions de melatonina per millorar la longevitat post-collita de Lilium (Capítol 1, Apèndix 1). S’observà com els processos de senescència de fulles i flors, i de maduració de fruits, comparteixen característiques fisiològiques i de la seva regulació hormonal i redox, resultant l’ABA un important regulador d’aquests processos.
Food waste and loss represents 45% of fruits and vegetables production. Global change and the forecasted increase in the frequency of extreme weather events will further strain the production and the logistic chain from the field to the consumer, especially in the developing world where the cold chain cannot always be properly maintained. Post-harvest senescence and associated stresses limit longevity, but also the organoleptic quality and nutritional value of fresh products. Improved understanding of these processes creates options for better management and to inform breeding programs. After harvest, controlled exposure to abiotic stresses and/or exogenous phytohormones can enhance nutraceutical, organoleptic and commercial longevity traits. In this Thesis new methodologies to combine physiological features, hormonal and biochemical profiles, and transcriptomic tools have been developed to better characterise organ senescence processes. Thus, allowing the design of biotechnological strategies to improve the quality and/or longevity of fresh products, describing the underlying effects of this manipulation on post-harvest physiology and fruit maturation. The results suggest the potential to manipulate ABA signalling through ABA and/or pyrabactin applications to improve the post-harvest quality of green leafy vegetables (Brassica oleracea var capitata) stored at room temperature (Chapter 3) and to improve vitamin C and E content of raspberry fruits (Rubus idaeus; Chapters 1 and 2); and the characterization of the post-harvest senescence of ethylene-insensitive flowers (Lilium, Iris) and the potential of melatonin applications to improve Lilium post-harvest longevity (Chapter 1, Appendix 1). It was observed how the processes of leaf and flower senescence, and of fruit ripening, share physiological characteristics and its hormonal and redox regulation, resulting in ABA being an important regulator of these processes.

EN CATALÀ :

Les proteïnes morfogenètiques òssies (BMPs) són membres de la superfamília del TGF-beta i s'ha demostrat que participen en la determinació i especificació de varis teixits i òrgans durant el desenvolupament dels vertebrats i que regulen la proliferació, l'apoptosi i la diferenciació de múltiples tipus cel·lulars. Les BMPs van ser originàriament identificades per a la seva habilitat d'induir la formació ectòpica d'os i entre ells, BMP-2, -4 and -7 resulten essencials perquè tingui lloc un adequat desenvolupament ossi. Les BMPs també s'ha descrit que participen en el control de la migració cel·lular durant la morfogènesis embrionària. Malgrat s'han publicat alguns treballs en relació a la participació de BMPs en la regulació de la migració de progenitors mesenquimals i osteoblasts, els mecanismes moleculars mitjançant els quals les BMPs regulen aquests processos són poc coneguts. Tenint en compte aquests precedents, ens varem proposar estudiar la participació de BMP-2 en la regulació de la migració de les cèl·lules mioblàstiques C2C12.
Els resultats presentats en aquest treball demostren que BMP-2 indueix la migració cel·lular quimiotàctica en cèl·lules C2C12. Les evidències experimentals que ens permeten arribar a aquesta conclusió són: i) l'anàlisi de la migració cel·lular mitjançant l'assaig de ferida indica que en presència de BMP-2 la ferida és repoblada més eficientment i que aquest efecte és independent de la síntesis proteica de novo i de la proliferació cel·lular; ii) els resultats obtinguts en l'aproximació experimental basada en l'ús de la Càmera de Boyden mostren que la migració induïda per BMP-2 té caràcter quimiotàctic a favor de gradient de concentració. Tenint en compte que la resposta inicial de la cèl·lula a un agent quimiotàctic consisteix en la polarització i extensió de protrusions en la direcció de la migració, es va analitzar posteriorment l'efecte de BMP-2 en la organització del citoesquelet d'actina. El resultats mostraven que BMP-2 induïa la formació d'acumulacions d'actina cortical, i que es tractava d'un efecte ràpid, transitori i que tenia lloc en diferents tipus cel·lulars, independentment de la distribució basal dels seus filaments d'actina. En relació a l'estudi dels mecanismes moleculars implicats en els efectes de BMP-2 en la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular, els resultats obtinguts demostren que BMP-2 regula aquests efectes a través de l'activació de vies de senyalització que involucren Cdc42, PI3K i p38MAPK, que estan implicades en la regulació de proteïnes que tenen un impacte directe sobre la polimerització d'actina. Concretament, BMP-2 indueix l'activació de Cdc42 i la isoforma α de PI3K de manera paral·lela i independent, i ambdues rutes estan implicades en la regulació de l'activitat de varis membres de la família de proteïnes PAK, que alhora regulen la LIMK1, proteïna implicada en el control de la polimerització dels filaments d'actina a través de la fosforilació de la cofilina. Per altra banda, l'activitat de la MAPK p38α també resulta imprescindible en la regulació de la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular dependent de BMP-2, a través d'una via de senyalització que involucra la quinasa MK2 i hsp27, proteïna que té la capacitat de regular directament la polimerització dels filaments d'actina. En conjunt, les dades presentades suggereixen noves vies de senyalització activades en resposta BMP-2 que relacionen els receptors de membrana amb la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular.
The main focus of the research is to study in depth the effects of Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) in the actin cytoskeleton reorganization and cell migration, as well as the study of the signalling pathways implicated in these effects.
BMPs have been shown to participate in the patterning and specification of several tissues and organs during vertebrate development and to regulate cell growth, apoptosis and differentiation in different cell types. We have reported that exposure of C2C12 cells to BMP-2 leads to an increase in cell migration and a rapid rearrangement of the actin filaments into cortical protrusions. These effects required independent and parallel activation of the Cdc42 small GTPase, the α-isoform of the PI3K and the p38α MAPK. Furthermore, we demonstrate that BMP-2 activates different group I and II PAK isoforms as well as LIMK1, and that these activations measured by either kinase activity or with antibodies against phosphorylations at their activation loops, were abolished by blocking PI3K and Cdc42 signalling pathways. Moreover, we have described that BMP-2 induces MK2 and hsp27 activation in a p38-dependent manner and that both proteins are implicated in the effects of BMP-2 on cell migration. Altogether, these findings suggest that Cdc42, PI3K and p38 signals emanated from BMP receptors are involved into specific regulation of actin assembly and cell migration. We are at the moment studying the possible relationship between Cdc42/PI3K-PAK-LIMK1 and p38-MK2-hsp27 pathways. Preliminary results suggest that these pathways are independent; however we are still working on it.

Els complexes ciclina-CDK són elements clau perquè el cicle cel·lular es doni de manera ordenada. Estan regulats a diferents nivells ja que les seves funcions són essencials per a la correcta progressió del cicle. El primer nivell de regulació és la interacció entre la ciclina i la CDK. En segon lloc, aquestes proteïnes poden experimentar fosforilacions i defosforilacions activadores i inhibidores. En tercer lloc, aquests complexes poden ser inhibits per la interacció amb CKIs (CDK Inhibitors). Finalment, la localització subcel·lular també és una manera de regular l'activitat d'aquests complexes, ja que només són actius al nucli de la cèl·lula.

En aquest treball presentem un nou mecanisme de regulació dels complexes ciclina-CDK. Concretament hem observat que els membres del complex ciclina A-CDK2 interaccionen amb l'acetilasa PCAF. Aquesta proteïna ha estat generalment considerada com a un co-activador transcripcional gràcies a la seva capacitat d'acetilar histones i activar la transcripció gènica. Tanmateix, també s'ha vist que és capaç d'acetilar proteïnes no-histones com ara p53 o MyoD, i com a conseqüència està implicada en altres funcions cel·lulars com la diferenciació o la resposta a dany al DNA. L'acetilasa PCAF s'uneix al complex ciclina A-CDK2 tot inhibint la seva activitat quinasa. A més, acetila la ciclina A, cosa que comporta la seva degradació pel sistema ubiquitina-proteasoma. PCAF també acetila CDK2 a la lisina 33, la qual es troba molt conservada a la família de les CDKs, ja que és un aminoàcid crucial per a la interacció amb l'ATP. L'acetilació de CDK2 a la lisina 33 comporta la inhibició de la seva activitat quinasa i la seva separació de la ciclina A.

En conclusió, els resultats d'aquesta tesi aporten un nou nivell de regulació dels complexes ciclina-CDK desconegut fins ara, i que cal tenir en compte com a possible mecanisme d'acció dels fàrmacs basats en compostos inhibidors de deacetilases els quals, d'altra banda, estan donant bons resultats en el tractament de malalties hematològiques i tumors sòlids.
"REGULATION OF CYCLIN A-CDK2 COMPLEX BY ACETYLATION"

TEXT:

Cell cycle proteins are regulated in different ways, being phosphorylation one of the most important and more studied mechanisms of regulation. On the other hand, acetylation is another kind of post-translational modification that was discovered in histones and initially it was associated with transcriptionally active chromatin. However, different studies indicate that acetylation can also play a role in the regulation of non-histone proteins and it has been linked to oncogenesis and cardiovascular and neurodegenerative diseases.

In this work we report that cyclin A/cdk2 complex, which is crucial for cell cycle progression during S phase, is acetylated by the acetyltransferase P/CAF. Cyclin A directly interacts with P/CAF and is acetylated at lysines 54, 68, 95 and 112. Maximal acetylation occurs simultaneously to ubiquitylation at mitosis, indicating a role of acetylation on cyclin A stability. A non-acetylatable mutant in which these lysines were substituted by arginines (cycA 4R) cannot be ubiquitylated, is more stable than cycA wild-type and arrests cell cycle at mitosis.

Increased expression of cyclin A has been detected in many types of cancers and it has a prognostic value to predict survival or early relapse. Our results indicate that acetylation is able to cause a decrease in the levels of cyclin A, suggesting that treatment with HDAC inhibitors (which potentiate acetylation in the cell) could be considered to treat this kind of tumors.

La presente investigación se circunscribe en el ámbito de las telecomunicaciones, buscando analizar retos regulatorios actuales en ese sector. Se trata de un mercado dinámico que, en las últimas décadas, ha buscado evolucionar a la par de las mejoras tecnológicas y dar políticas que permitan mayor competencia, en favor del usuario. El objetivo fue analizar dos tipos de abordaje que se le puede dar a un nuevo reto, detallando el contexto en el que surgieron, cómo se diseñó la estrategia y cuáles fueron los resultados observables. El primero, sobre Operadores Móviles Virtuales, parte de una política pública nacional, por lo que puede evaluarse los objetivos planificados y cuál es el estado actual. El segundo ejemplo parte de la experiencia comparada para constatar la diferencia de tratamiento de un mismo caso entre Europa y Perú, reflexionando sobre qué modelo sería más adecuado. Respecto al reto de los "Operadores Móviles Virtuales", encuentro que se trató de una propuesta interesante de política pública para incrementar la competencia en el sector sorteando la dificultad de la instalación de grandes infraestructuras. Su formulación tuvo varios elementos adecuados, como la accesibilidad, las provisiones orientadas a una sana competencia y la determinación del mandato de interconexión. Sin embargo, a día de hoy no ha producido los efectos deseados y considero que sería importante modificar algunos aspectos para darle un nuevo impulso. Respecto a los servicios de telecomunicación que he denominado "híbridos", por utilizar redes de internet y de telecomunicaciones, encontré que nuestra regulación no los ha contemplado, a pesar de que funcionan en nuestro país. Al determinar que tienen importantes similitudes con los OMV y que sí implican la prestación de servicios que ya se encuentran regulados, mi propuesta es que se amplíe la primera categoría jurídica para incluirlos, determinando las obligaciones que le son aplicables.
Trabajo académico

El objetivo de la tesis es el estudio de diversosaspectos de redes de interconexión que pueden sermodeladas mediante la teoría de grafos, y masconcretamente, mediante dígrafos línea iterados enparticular se presentan, para estos grafos, protocolos dediseminación de la información (broadcasting) que mejorantodos los resultados anteriores en cuanto a lavulnerabilidad, esta se estudia bajo dos aspectos: encuanto a la vulnerabilidad del encaminamiento, sepresentan nuevas cotas superiores para el diámetro deldígrafo de supervivencia para dígrafos línea iterados;por lo que respecta a la vulnerabilidad del diámetro, sedefinen nuevas familias de dígrafos que resultan seroptimas de forma asintótica respecto al grado, para elproblema (delta,d',s).

Una de les principals fites en aqüicultura és aconseguir una reducció de les proteïnes que se subministren amb la dieta, procedents majoritàriament de farines de peix, i incrementar la presència de nutrients més rendibles, com ara els carbohidrats. En tractar-se principalment d'espècies carnívores, la substitució de proteïnes per carbohidrats està limitada per les característiques metabòliques dels peixos en cultiu. L'activitat alanina aminotransferasa (ALT) hepàtica juga un paper central com a connexió entre el metabolisme d'aminoàcids i el de carbohidrats, i s'ha mostrat com l'aminotransferasa hepàtica més sensible a canvis en l'estat nutricional i la utilització de proteïna en moltes espècies de peixos. L'ALT pot estar implicada en múltiples processos cel.lulars i la seva activitat podria estar sotmesa a un sistema complex de regulació. El nostre grup va clonar tres isoenzims d'ALT a partir de fetge de Sparus aurata, indicant l'existència de dues isoformes citosòliques, cALT1 i cALT2, i una isoforma mitocondrial mALT, de diferent distribució tissular i regulació nutricional. Donat que les modificacions posttraduccionals a què pot estar sotmesa l'ALT són poc conegudes, es va voler estudiar si existeixen proteïnes capaces d'interaccionar i modular l'activitat de les isoformes citosòliques d'ALT. Mitjançant un assaig de doble híbrid en llevat s'ha identificat els fragments de quatre proteïnes amb potencialitat d'interacció amb cALT2, que corresponen a l'F-lectina, RPS20, RBP2 i HABP2. F-lectina és una proteïna d'unió a carbohidrats present en peixos i amfibis, que presenta un pèptid senyal de secreció. Estudis de localització subcel•lular indiquen que, tot i que cALT1 i cALT2 són preferentment citosòliques, quan s'expressen conjuntament amb l'F-lectina, les proteïnes passen a formar vesícules perinuclears de gran mida que colocalitzen amb marcadors de cis-Golgi, trans-Golgi i vesícules de secreció. Aquest fet suggereix que les proteïnes cALT1 i cALT2 són incorporades a la via de secreció a través de la interacció amb F-lectina. Els anàlisis de FRET validen la interacció entre cALT1 o cALT2 i F-lectina. En cèl.lules transfectades amb plasmidis d'expressió de cALT1, cALT2 i F-lectina, la presència d'F-lectina augmenta l'activitat ALT en els extractes on s'expressa cALT1 o cALT2, suggerint que l'F-lectina és capaç de modular l'activitat d'ALT. F-lectina s'expressa majoritàriament en fetge, ronyó i teixit adipo& teixits on també s'expressen cALT1 i cALT2. En orades injectades intraperitonealment amb lipopolisacàrid (LPS) 1mg/kg de peix, 24 hores després del tractaments'observa un increment en l'expressió d'F-lectina, i un augment en l'activitat ALT en extractes hepàtics, sense observar canvis en els nivells d'mRNA de cap de les isoformes ALT. L'augment de l'activitat ALT és degut, hipotèticament, a un augment en l'expressió d'F-lectina, que a la seva vegada provoca un augment en l'activitat de l'enzim ALT a través de la interacció de l'F-lectina amb cALT1 i cALT2. Addicionalment, s'ha observat que la incubació de cultius bacterians E. coli amb extractes cel.lulars on se sobreexpressen les proteïnes cALT2, F-lectina i cALT2 conjuntament amb F-lectina, produeix una inhibició del creixement bacterià. Aquesta efecte antibacterià es podria donar pel fet que cALT2 conté una regió homòloga a la regió d'unió a endotoxines de la proteïna LBP, responsable de la unió i presentació de I'LPS a altres proteïnes del sistema immunitari. Els nostres estudis suggereixen que a més del seu paper metabòlic, les isoformes citosòliques d’ALT poden estar implicades en processos del sistema immunitari en orada.
One of the main goals in aquaculture is to reduce proteins and to increase the presence of more sustainable nutrients in diets. The substitution of proteins for carbohydrates is limited by the metabolic characteristics of carnivorous fish. The activity of alanine aminotransferase (ALT) in liver plays a central role as a link between amino acids and carbohydrate metabolism, and is sensitive to changes in nutritional status and utilization of protein in many species of fish. Our group cloned three isoenzymes of ALT in the liver of Sparus aurata (two cytosolic isoforms and a mitochondrial one), with different tissue distribution and nutritional regulation. ALT post-translational modifications are unknown, and we studied the existence of proteins which may interact and modulate ALT activity. We identified four fragments of proteins with potential interaction with cALT2, corresponding to F-lectin, RPS20, RBP2 and HABP2. Although cALT1 and cALT2 are preferably cytosolic, when coexpressed with F-lectin, a secretion protein, the proteins became part of large perinuclear vesicles that colocalize with cis-Golgi, trans-Golgi and secretion vesicles markers. This suggests that cALT1 and cALT2 are included in the secretory pathway through the interaction with F-lectin. The interaction between cALT1 or cALT2 and F-lectin was validated with an alternative method. The expression of F-lectin increased ALT activity in cells expressing cALT1 or cALT2, suggesting that F-lectin is able to modulate the activity of ALT. F-lectin is expressed mainly in liver, kidney and adipose tissue, tissues where cALT1 or cALT2 are also expressed. In fish treated intraperitoneally with lipopolysaccharide (LPS) we observed an increase in F-lectin expression, and an increase of ALT activity in liver extracts, without changes in mRNA levels of any ALT isoform. Hypothetically, the increased ALT activity is due to an increase in the expression of F-lectin, which in turn causes an increase in the activity of ALT enzymes. The incubation of bacterial E. coli cultures with cell extracts in which cALT2, F-lectin and cALT2 together with F-lectin are overexpressed, produces an inhibition of bacterial growth. This antibacterial effect could occur because cALT2 seems to contain a region homologous to endotoxin binding region in LBP protein. Our studies suggest that, in addition to their metabolic role, ALT cytosolic isoforms may be involved in immune processes in sea bream.

El propòsit d'aquest treball és explorar els aspectes morals i polítics de la gestió dels riscos tecnològics, en especial els riscos de la producció i ús dels productes químics industrials, des del punt de vista del republicanisme democràtic. La tesi que es defensa és que els riscos tecnològics s'han de regular com a resultat d'una deliberació democràtica. Deliberació significa que les raons compten, que la decisió no consisteix només en l'agregació dels interessos o de les preferències, com fa l'anàlisi cost-benefici. I aquest debat col•lectiu s'ha de basar en una ciència independent o desinteressada – desvinculada dels interessos particulars. La recerca intenta prosseguir les línies iniciades principalment per Nicholas Rescher, Kristin Shrader-Frechette, Carl Cranor i Sven Ove Hansson. Des de diferents perspectives aquests autors han mostrat la necessitat de refinar el criteri tècnic de decisió (la maximització de la utilitat esperada) amb la consideració dels possibles resultats catastròfics i de les probabilitats negligibles, i de les conseqüències d'un fals positiu i les d'un fals negatiu en la regulació del risc; i d'ampliar-lo amb la incorporació de criteris explícitament morals, com la justícia en la distribució de beneficis i riscos, o el dret a la salut. Cass Sunstein ha estat molt bel•ligerant contra el que ell considera que són irracionalitats que es produeixen en la regulació dels riscos quan es fa massa cas de les pressions populars i es promulguen lleis “dictades per la por” seguint alguna variant del principi de precaució. I ha propugnat, almenys en part, que l'anàlisi cost-benefici pot ser la solució per restaurar la racionalitat. L'anàlisi que se'n fa en aquest text vol argumentar que l'anàlisi cost-benefici no està justificat moralment i que el principi de precaució no s'ha d'entendre com un criteri de decisió alternatiu al de maximització de la utilitat esperada sinó com una regla heurística. La proposta de gestió democràtica dels riscos que es vol justificar es basa en la concepció de la democràcia d'Amy Gutmann i Dennis Thompson, i de Henry Richardson, entre d'altres; i en la caracterització de les funcions dels comitès d'assessorament científic independents que han fet Wiebe Bijker, Roland Bal i Ruud Hendriks. La implantació dels objectius de la química verda –reforma de la indústria química per tal de fer-la més benigne per a la salut– podria ser la concreció en el cap dels riscos dels productes químics dels principis de gestió democràtica. En aquest context, s'analitza l'avenç que pot representar la nova regulació europea del 2006 (reglament REACH) que traspassa la càrrega de la prova de no toxicitat al fabricant.
The aim of this dissertation is to explore the moral and political aspects of the management of technological risks, particularly the risks of production and use of industrial chemicals, from the point of view of democratic republicanism. The thesis of the author is that technological risks should be regulated as a result of democratic deliberation. Deliberation means that reasons matter: the decision is not only the aggregation of interests or preferences, as is the case with cost-benefit analysis. And this collective discussion should be based on independent science. The research attempts to continue the lines primarily initiated by Nicholas Rescher, Kristin Shrader-Frechette, Carl Cranor and Sven Ove Hansson. From different perspectives these authors have shown the need to refine technical decision criteria (maximizing expected utility) with the consideration of possible catastrophic results and negligible probabilities, and the consequences of a false positive and a false negative in risk regulation; and extend them by explicitly incorporating moral criteria, such as justice in the distribution of benefits and risks, and the right to health. Cass Sunstein has been very belligerent against what he considered “laws of fear” enacted under irrational popular pressures. He advocated that, at least in part, costbenefit analysis may be the solution to restore rationality. The analysis in this text argues that cost-benefit analysis is not morally justified and that the precautionary principle may be a rational heuristic rule. The proposed democratic management of risks to be justified is based on the concept of democracy that Amy Gutmann and Dennis Thompson, and Henry Richardson, among others, have developed. And on the type of independent scientific advisory committees characterised by Wiebe Bijker, Roland Bal and Ruud Hendriks. The implementation of the goals of green chemistry –the reform of the chemical industry to make it more benign to health– could be a good opportunity for democratic risk management.

No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo
Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales)
1.- El espectro radioeléctrico (al que nos referiremos también simplemente como “el espectro”) es un recurso natural, de carácter ilimitado, consagrado en algunos ordenamientos jurídicos como un bien nacional de uso público, sobre el cual el Estado ejerce su soberanía. Es asimismo, un medio intangible que se utiliza como medio para la prestación de servicios de telecomunicaciones. Al encontrarse materialmente en la atmósfera, el espectro radioeléctrico es materialmente ilimitado. Sin embargo, su uso (la habilitación para servicios de telecomunicaciones) se encuentra de alguna forma determinado por el avance de la tecnología, toda vez que, a medida que ésta avanza y evoluciona, se van descubriendo mayores posibilidades de uso para este elemento. En el ordenamiento jurídico nacional, el espectro radioeléctrico se encuentra bajo la regulación y administración de la SUBTEL. Sin perjuicio de ello, ejercen además potestad sobre el espectro la Dirección General de Aeronáutica Civil en lo que respecta a la navegación aérea, el Tribunal de Defensa de la Libre Competencia y la Corte Suprema, estos dos últimos, en las causas sometidas a su conocimiento. Dentro del amplio abanico de servicios de telecomunicaciones que se valen del espectro radioeléctrico destaca, tanto por el volumen de clientes como por su complejidad tecnológica, el de la telefonía móvil, el que hoy más bien se encuentra identificado con los servicios de Banda Ancha Móvil. En efecto, gracias al avance tecnológico de los últimos 10 años, el servicio de telefonía propiamente tal (es decir, el envío y recepción de señales de voz) ha sido complementado por el servicio de Banda Ancha Móvil, es decir, el envío y recepción de paquetes de información a través del espectro radioeléctrico

Els objectius d'aquesta tesi van ser plantejats per tal d'aprofundir en l'estudi de la implicació de la proteïna p27(kip1) en processos de tumorogènesi i metàstasi, donat que els nivells baixos de p27(kip1) son cosiderats un factor de mal pronòstic en els càncers humans.

Així doncs, els objectius proposats pel desenvolupament d'aquest treball són els següents:

· Identificació de noves proteïnes d'unió a p27(kip1)
· Caracterització funcional de les noves interaccions amb p27(kip1)
· Implicació d'aquestes noves funcions de p27(kip1) amb el cicle cel·lular i càncer.

L'iduronat-2-sulfatasa (IDS) (EC. 3.1.6.13) és un enzim lisosomal involucrat en el catabolisme dels proteoglicans. La seva activitat és basa en tallar el grup sulfat de la posició 2 de l'àcid idurònic del dermatan i heparan sulfat. D'altra banda, el proteoglicà heparan sulfat, anomenat perlecan, ha estat identificat als illots pancreàtics i forma part dels dipòsits d'amiloid observats en la majoria de pacients amb diabetis tipus 2. S'ha demostrat que el perlecan interaccions amb l'amilina i actua afavorint la formació de les fibretes d'amilina. El fet que s'hagi detectat l'expressió de l'IDS de forma preferencial als illots pancreàtics en relació al teixit exocrí, ha portat a considerar que l'IDS podria tenir un paper funcional a l'illot pancreàtic.
La hipòtesi de treball de la tesi, proposa que un dèficit en l'expressió de l'IDS podria donar com a conseqüència una alteració del metabolisme dels proteoglicans, en concret del perlecan als illots pancreàtics, i aquest fet podria afectar a la funció secretora de la cèl·lula  pancreàtica. L'objectiu general d'aquest treball ha estat el d'estudiar l'enzim IDS als illots pancreàtics humans i de ratolí, tant la seva localització, la seva regulació, com el seu efecte sobre la resposta secretora d'insulina i a l'estructura morfològica de l'illot.
L'estudi de la localització de l'IDS al teixit pancreàtic humà i de ratolí, ens demostrà que aquest enzim s'expressa específicament als illots pancreàtics en relació al teixit exocrí. L'expressió de l'IDS es detecta tant a cèl·lules  com a cèl·lules  de l'illot pancreàtic. També s'ha demostrat que l'IDS es localitza als lisosomes de les cèl·lules  pancreàtiques.
L'expressió del mRNA d'IDS als illlots pancreàtics de ratolí està regulada per la via glicolítica, mentre que en illots humans, l'IDS no s'estimula vers la glucosa. L'expressió del perlecan, tant en illots humans com de ratolí, tampoc està regulada per la glucosa.
El bloqueig de l'expressió de l'IDS provoca una disminució significativa del contingut d'insulina dels illots de ratolí i provoca que la morfologia dels illots humans estigui totalment afectada, amb un increment tant en numero com en mida dels lisosomes, així com un augment de la crinofagia.
Com a conclusió final de la tesi, l'iduronat-2-sulfatasa es localitza als lisosomes dels illots pancreàtics, el seu patró d'expressió als illots de ratolí no coincideix amb el dels illots humans i la reducció de l'expressió de l'IDS als illots pancreàtics, provoca una alteració de la funció secretora d'insulina, a través d'un increment de la crinofàgia.

En el nostre grup s’ha demostrat la interacció directa entre l’inhibidor de ciclines-CDKs p27 i l’acetiltransferasa PCAF. Aquesta interacció es produeix entre el domini HAT de PCAF i la regió que compren els aminoàcids 91-120 de p27. Aquesta regió conté un PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa), un domini característic d’interacció entre proteïnes. En aquest treball hem comprobat que PCAF acetila la lisina en posició 100 de p27 in vivo. L’acetilació de p27 afecta la seva estabilitat, afavorint-ne la seva trasnlocació del nucli al citoplasma, al inici de la fase G1, on serà degradada (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF és un co-activador transcripcional que actúa acetilant histones, factors de trasncripció i altres proteïnes. Per altra banda, recentment s’ha descrit que p27 actúa com a regulador transcripcional, bàsicament com a repressor transcripcional de la transcripció de determinats gens diana. Així doncs, com PCAF acetila p27, en aquest treball ens hem centrat en confirmar la col·laboració de p27 i PCAF en la regulació transcripcional dels seus gens diana. Per aconseguir aquest objectiu hem identificat els programes transcripcionals regulats per p27 i PCAF en cèl·lules humanes de càncer de còlon (HCT116), mitjançant experiments de ChIP-seq. Determinem que p27 i PCAF s’uneixen a regions diferents de la cromatina en els seus gens diana. Un cop identificats els gens diana comuns de p27 i PCAF, s’ha analitzat l’expressió de 14 d’aquests gens i hem pogut concloure que p27 i PCAF en regulen la seva transcripció de forma antagònica. p27 reprimeix i PCAF activa l’expressió de la majoria dels gens diana analitzats. Aquest efecte és degut a la unió de p27 i PCAF a elements reguladors de la transcripció en la cromatina. Hem descrit que p27 s’uneix a elements amb efecte activador de la transcripció en la cromatina dels seus gens diana, inhibint-los. Per contra, PCAF s’uneix a elements amb efecte silenciador sobre la transcripció del seus gens diana. Finalment hem demostrat la interacció de p27 i PCAF amb els factors de transcripció PAX en cèl·lules HCT116.
Our group has demonstrated the direct interaction between the cyclin-CDK inhibitor p27 and the acetyltransferase PCAF. This interaction occurs between the HAT domain of PCAF and the region comprising aa 91-120 of p27. This region of p27 contains a PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa) a characteristic protein interacting domain. In this study we found that PCAF acetylates the lysine at position 100 of p27 in vivo. The acetylation of p27 affects its stability, promoting its translocation from the nucleus to the cytoplasm early in the G1 phase, where it will be degraded (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF acts as a transcriptional coactivator by acetylating histones, transcription factors and other proteins. On the other hand, it has been reported that p27 acts as a transcriptional regulator, basically by repressing transcription of certain target genes. Therefore, since PCAF acetylates p27, in this thesis we focus on confirming the collaboration of p27 and PCAF in the transcriptional regulation of their target genes. To pursue this goal we have identified the transcriptional programs regulated by p27 and PCAF in HCT116 cells by ChIP -seq experiments. We found that p27 and PCAF binds to different regions of the chromatin of their target genes. Once the common target genes of p27 and PCAF were identified, their expression was analyzed. We concluded that p27 and PCAF regulate the transcription of their target genes antagonistically. p27 represses and PCAF activates the expression of most of their target genes, due to its binding to transcription regulatory elements in the chromatin. p27 binds to transcription activating elements, thus inhibiting the transcription of the target gene. On the contrary, PCAF binds to transcription silencing elements, thus activating the transcription of the target gene. Finally we demonstrated the interaction of p27 and PCAF with transcription factors PAX in HCT116 cells.

Els transportadors de nucleòsids pertanyen a les famílies gèniques SLC28 i SLC29 que codifiquen pels transportadors de nucleòsids concentratius (hCNTs) i transportadors de nucleòsids equilibratius (hENTs), respectivament. La família dels hENTs inclou quatre membres: hENT1, hENT2, hENT3 i hENT4. Aquests realitzen el transport de nucleòsids o dels anàlegs derivats de nucleòsids a favor de gradient de concentració, són independents de sodi i poden transportar bidireccionalment. Les proteïnes hENT1 i hENT2 transporten purines i pirimidines amb baixa afinitat. La família dels hCNTs està formada per tres membres: hCNT1, 2 i 3. hCNT1 transloca pirimidines i hCNT2 purines i uridina mitjançant un mecanisme unidireccional amb una estequiometria d’un catió de sodi per cada nucleòsid transportat. hCNT3 presenta una àmplia selectivitat de substrat transportant tant nucleòsids purínics com pirimidínics, així com els seus anàlegs, inclosos alguns derivats de nucleobases com les tiopurines amb una estequiometria de 2 sodis per cada nucleòsid. A més, sabem que les proteïnes CNTs d’eucariotes han incorporat evolutivament un domini N-terminal que no està present als procariotes, encara que aquests ortòlegs més primitius són totalment funcionals. D’això es dedueix que aquesta zona N-terminal no és essencial per a l’activitat transportadora però sí que sembla que conté zones reguladores, tal i com s’ha començat a comprovar. Per aquest motiu es pot hipotetitzar que el domini N-terminal d’hCNT3 pot ser rellevant per tal de comprendre totes aquelles funcions associades a aquesta proteïna transportadora, no necessàriament vinculades estrictament a la seva activitat com a transportador. Aquesta tesi s’ha estructurat en dos grans blocs, un que fa referència a l’estudi de les possibles proteïnes d’unió amb el transportador, conferint-li així aquestes noves funcions reguladores que es postulen gràcies aquest nou domini. I l’altre bloc referent a l’estudi de la pròpia funció transportadora de la proteïna, específicament del transport d’acadesina (AICAR). Una aproximació proteòmica amb el domini N-terminal d’hCNT3 ha permès identificar proteïnes com Galectina-4 (Gal-4), l’Adenosina Quinasa (ADK) com a possibles proteïnes d’interacció amb hCNT3, utilitzant com a font de proteïnes un homogenat de còlon, per Gal-4 i un extracte proteic de mostres de pacients amb Leucèmia Limfàtica Crònica (LLC) per l’ADK. S’ha pogut veure com el transportador hCNT3 interacciona amb la proteïna Gal-4 promovent el seu tràfic cap a la membrana plasmàtica en la línia cel·lular HT-29. Paral·lelament també s’ha comprovat que hCNT3 interacciona amb ADK, aquesta interacció provoca un canvi en l’eficiència per transportar adenosina, per tant, el transportador podria regular els nivells d’adenosina extracel·lulars. A més, s’ha estudiat el paper dels hCNT en la captació d’acadesina (AICAR), un anàleg de nucleòsid que s’ha descrit que pot inhibir la proliferació cel·lular i induir apoptosi a diferents tipus de tumors i leucèmies, entre elles la LLC, model el qual es va identificar la interacció amb ADK. En la present tesi, s’ha descrit que els transportadors responsables de la internalització d’AICAR són hCNT3 i hENT1. Posteriorment es va analitzar si el fet que aquest fàrmac tingués dues vies d’entrada tenia algun efecte fisiològic per la cèl·lula. Ja que una de les vies esdevenia més eficient al interaccionar amb ADK, enzim que fosforila AICAR a AICA ribotide (ZMP) per ser actiu. Per tant, s’esperava era que el transport d’AICAR per hCNT3 es traduís en més activació d’AMPK ja que hCNT3 estaria interaccionant amb l’ADK. No obstant, es va observar que l’efecte inductor de l’AMPK l’exerceix majoritàriament l’AICAR que s’interioritza per hENT1. S’ha de tenir en compte que l’aportació d’hCNT3 al model utilitzat és molt minoritària, amb la qual cosa es necessitarien més estudis per comprendre el mecanisme d’acció d’AICAR. Podríem dir que en aquest treball s’han generat les primeres evidències que demostrarien que el transportador hCNT3 pot interaccionar amb altres proteïnes, adquirint noves funcions per la cèl·lula o per acabar de madurar i poder realitzar la seva funció.
Two gene families are implicated in the uptake of nucleosides and nucleoside analogs into cells, SCL28 and SLC29. The former encodes hCNT1, hCNT2, and hCNT3 proteins. They translocate nucleosides in a Na(+) coupled manner with high affinity and some substrate selectivity, being hCNT1 and hCNT2 pyrimidine- and purine-preferring, respectively, and hCNT3 a broad selectivity transporter. SLC29 genes encode four members, being hENT1 and hENT2 the only two which are unequivocally implicated in the translocation of nucleosides and nucleobases (the latter mostly via hENT2) at the cell plasma membrane. The hCNT3 transporter and the other members of the SLC28 gene family have a prominent N-terminal domain that is absent in prokaryotic CNTs this domain fulfils the biochemical requirements for being a hub for protein–protein interactions. Moreover, this fragment of the protein is responsible for hCNT3 polarized insertion into the plasma membrane and contains amino acid residues implicated in the kinetics of hCNT3 trafficking. In a recent GST-pull down approach using the N-terminus tail of the hCNT3 transporter as a bait and protein extracts from healthy human colon pool lysate or Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL) primary cells as prey, we have been able to selectively precipitate Gal-4 and ADK, respectively. We validated biochemically the interaction Gal-4-hCNT3 and the biological significance was that this protein is a regulator of hCNT3 trafficking and retention at the plasma membrane. Regarding ADK, we also found the first evidence that hCNT3 decrease its KM value for adenosine when the transporter is interacting with ADK. Suggesting that the transporter could be, at least in part, implicated in the regulation of extracellular adenosine levels. Finally, we identified hCNT3 and hENT1 as the responsibles for AICAR uptake, an analog of adenosine monophosphate, which induce apoptosis in B-CLL cells. Because we identified ADK to increase hCNT3 efficiency in adenosine uptake, we suspected that this would be the main entrance for AICAR. However, we found that the AMPK phosphorylation produced by AICAR was mainly through hENT1 transport. We should keep in mind that the cellular model used for these experiments showed a low hCNT3 activity. So, further studies are needed to understand the mechanisms of AICAR.

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.
En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers.
Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.
Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.

El desarrollo y transformación del mercado de telefonía móvil, y las recientes tendencias de políticas regulatorias para enfrentar los problemas de colusión y exclusión de éste mercado, como la utilización de cargos de acceso en equilibrios asimétricos y regulación a precios minoristas, entre otros, son la fuente de motivación principal de esta tesis. El objetivo principal es lograr reflejar los comportamientos estratégicos de los agentes del mercado, a través de un modelo de optimización no lineal con restricciones de equilibrio, que integre a consumidores heterogéneos, a un regulador y a dos firmas en competencia oligopólica que brindan múltiples servicios a los consumidores, que perciben utilidad por recibir y realizar llamadas. Donde se asegurare la convergencia del problema a equilibrios únicos perfectos en el subjuego en mercado compartido, e incluya, funciones de costo basadas en firmas reales, a través de modelos de costo detallados de desempeño de elementos, como los utilizados por los entes reguladores en la actualidad. Dentro de los resultados, el bienestar social se ve aumentado por la aplicación de cargos de acceso asimétricos, esto bajo la condición de que el regulador sea capaz de reconocer si las asimetrías tienen fuente en la demanda o en la oferta. Por otra parte, no se recomienda la aplicación de cargos de acceso nulos, por sus efectos negativos en los segmentos de menor tráfico. En el ámbito de la regulación a precios a público, se plantea la conveniencia de una política regulatoria que prohíbe la diferenciación de precios entre los servicios dentro y fuera de la red, la cual entrega mayores utilidades a las firmas pequeñas y disminuye el poder de mercado de las firmas grandes, mejorando la competencia en la mayoría de los casos analizados, a pesar de esto, la imposición de la política conlleva a un sacrificio de una parte del excedente de los consumidores en el mediano plazo. Por último, se muestran las bondades del modelo en una simulación exitosa del mercado colombiano, donde se evalúa la conveniencia de una rebaja de los cargos de acceso o la imposición de la no diferenciación de precios, en vista de esto el modelo se puede transformar en una potente herramienta análisis de mercado de mediano plazo.

L'interès de l'estudi de la regulació dels gens de proteïnes de reserva de cereals prové del fet que són gens específics de llavor, amb una expressió lligada al desenvolupament del gra, i molts d'ells mostren una gran eficiència transcripcional. Els patrons d'expressió d'aquests gens suggereixen l'existència de complexes reguladors constituïts per diferents activadors transcripcionals que reconeixen els elements en cis- implicats en la seva expressió. Tot i els nombrosos estudis fets, els mecanismes moleculars implicats es coneixen poc.
A blat de moro, el nostre model d'estudi, les proteïnes de reserva s'acumulen majoritàriament a l'endosperma i, en menor mesura, a l'embrió. A endosperma s'acumulen les zeïnes (les prolamines de blat de moro), mentre que a embrió trobem globulines i oleosines. Tant les zeïnes com les globulines s'acumulen en orgànuls derivats del reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics, mentre que les oleosines s'acumulen en cossos lipídics.
L'interès del nostre grup se centra en el gen gamma-Z, que codifica per una proteïna de reserva d'endosperma, la gamma-zeïna. El gen gamma-Z està present en una o dues còpies per genoma haploide i, en canvi, el seu producte representa fins al 15% del contingut proteic del gra, suggerint una fina regulació gènica.
L'objectiu general d'aquest treball era caracteritzar nous factors de transcripció implicats en la regulació de l'expressió del gen gamma-Z i altres factors reguladors de l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específics d'endosperma però també lligats al desenvolupament de la llavor.
Els objectius concrets així com els resultats obtinguts es descriuen breument a continuació:
1) Caracterització funcional del factor proteic PBF com a regulador positiu del gen gamma-Z. Identificació del domini activador de PBF. PBF és un activador transcripcional del promotor del gen gamma-Z i volíem caracteritzar el domini responsable d'aquesta funció mitjançant estudis d'activació per expressió transitòria en endospermes joves de blat de moro. Aquests estudis van revelar que el domini activador de PBF es localitza en el seu domini C-terminal, però que l'activitat d'aquest factor proteic depèn de la seva capacitat d'unió al DNA.
2) Recerca de nous factors de transcripció responsables de l'expressió del gen gamma-Z i implicats en el reconeixement de seqüències presents a la regió proximal del seu promotor: clonatge del gen GAMYB de blat de moro i estudis d'immunolocalització. Caracterització d'aquest factor com a regulador transcripcional del gen gamma-Z.
El gen ZmGAMYB codifica per un factor de transcripció de tipus Myb R2R3, que s'uneix de forma específica a la caixa AACA del promotor del gen gamma-Z i que és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. ZmGAMYB s'expressa específicament a endosperma de blat de moro en desenvolupament, coincidint amb el patró d'expressió de PBF i concordant amb la possibilitat de que reguli l'expressió del gen de la gamma-zeïna. El factor mGAMYB s'acumula a les capes més superficials d'aquest teixit (aleurona i subaleurona).
3) Recerca de nous factors de transcripció implicats en l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específiques d'endosperma: clonatge del gen FUSCA3 de blat de moro, estudis d'immunolocalització a gra de blat de moro i posterior caracterització d'aquest factor.
El gen ZmFUSCA3 codifica per un factor de transcripció de tipus B3 i s'expressa majoritàriament a embrió de blat de moro en desenvolupament. El factor mFUSCA3 s'acumula massivament a l'aleurona i a l'embrió, suggerint que sigui un regulador de l'acumulació de productes de reserva en aquests teixits. FUSCA3 és capaç d'unir-se a la caixa RY-like present a la regió proximal del promotor del gen gamma-Z, tot i que de forma poc específica, però no és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor.
In cereals, major seed storage proteins are called prolamins and accumulate primarily in the endosperm. Prolamin genes are tissue specific and show high efficiency levels, suggesting tight genetic regulation.
In maize, our model specie, prolamins are accumulated in ER derived structures called protein bodies, whereas other storage proteins such as globulins or oleosins accumulate in the aleurone layer and in the embryo.
The interest of our group resides in the gamma-zein, an endosperm specific storage protein, which constitutes the 15% of the proteic content of the grain, whereas its gen is present in only one or two copies per haploid genome.
The object of the present work was to characterize new transcription factors implicated in seed storage gene expression linked to grain development, especially those involved in gamma-Z gene expression. Specific objectives as well as results achieved are briefly described bellow.
1) Functional characterization of PBF as a positive regulator of gamma-Z gen. PBF is a transcriptional activator of gamma-Z gene and its activation domain is located in the C-terminal region of the protein, but its activity depends on its binding to DNA.
2) New transcription factors involved in gamma-Z gene expression: cloning of GAMYB gene in maize and immunolocazation assays. Characterization of this factor as a transcriptional regulator of gamma-Z gene.
ZmGAMYB encodes a Myb R2R3 transcription factor that specifically binds to the AACA box of the gamma-Z gene promoter and activates gamma-zein expression from this promoter. ZmGAMYB is specifically expressed in maize developing endosperm, as other gamma-Z regulators do. The proteic factor accumulates in the more superficial layers of this tissue (aleurone and subaleurone).
3) New transcription factors related to seed storage gene expression: cloning of FUSCA3 gene in maize, immunolocazation assays and characterization of this factor.
ZmFUSCA3 encodes a B3 transcription factor highly expressed in maize developing embryo. The proteic factor accumulates massively in the aleurone layer as well as in the embryo, suggesting a regulatory role in seed storage products accumulation in these tissues. FUSCA3 binds RY-like motives of the gamma-Z gene promoter, with weak specificity, but does not activate expression from this promoter.

Nombroses malalties presenten alteracions en el procés de traducció de proteïnes; això ha fet que en els darrers anys incrementi la recerca sobre els mecanismes que regulen l’expressió gènica dels organismes a nivell traduccional. Donat que el procés de traducció és elevadament costós des del punt de vista energètic, les cèl·lules mantenen molt regulat el pas d’iniciació de la síntesi de proteïnes. 4E-BP1 és una proteïna que juga una paper important en la regulació de la síntesi proteïca. Mitjançant la unió al factor d’iniciació eIF4E, impedeix la formació del complex eIF4F inhibint així la síntesi de proteïnes. La unió de 4E-BP1 a l’eIF4E es regula per fosforilació, quan 4E-BP1 és hiperfosforilat allibera el factor d’iniciació eIF4E i es pot donar la traducció de proteïnes. Són molts els estudis fets sobre 4E-BP1 i en els darrers anys se l’ha relacionat amb diversos tipus de càncer, on s’ha vist que es troba sobreexpressat, sobretot en la seva forma fosforilada. En aquest estudi es va estudiar una sèrie de 96 tumors de mama on es va veure que nivells elevats de proteïna total de 4E-BP1 i la seva forma fosforilada, p-4E-BP1, es troben associats amb el grau de malignitat del tumor en càncer de mama. A més a més, la ràtio de p-4E-BP1:4E-BP1 total correlacionava significativament amb la presència de metàstasi en els nòduls limfàtics. També es va estudiar in vitro, els efectes bioquímics, moleculars i biològics de la sobreexpressió de 4E-BP1, així com d’una forma mutant de 4E-BP1 que no es pot fosforilar. Amb aquests resultats es va constatar que la sobreexpressió d’aquesta proteïna provocava una parada del creixement cel·lular, almenys en alguns tipus cel·lulars. Aquests resultats també es van confirmar en experiments in vivo on es va veure que la sobreexpressió de 4E-BP1 suprimia la tumorogènesi. Finalment, per mitjà de l’estudi de noves quinases candidates a fosforilar 4E-BP1 es va veure que 4E-BP1 es pot regular a través de diverses vies de senyalització cel·lular. Amb aquests resultats proposem que p4E-BP1 podria ser un factor clau candidat per establir el pronòstic en càncer de mama. A més a més, la regulació de la síntesi proteica, a través de la inhibició de la fosforilació de 4E-BP1, podria evitar la proliferació de les cèl·lules tumorals, almenys en alguns tipus cel·lulars. Proposem 4E-BP1 com a factor clau on convergeixen les principals vies de senyalització que es troben alterades en càncer i podria ser considerada com a possible proteïna diana en futures teràpies contra el càncer.
Many diseases have some alterations in the process of protein translation; related to this, there is presently a notable interest in the mechanisms that regulate gene expression at translational level. Because protein synthesis consumes a high proportion of cellular energy, it is clear that overall protein synthesis must be subject to a tight control to match the requirements of the cell. 4E-BP1 is a protein that plays an important role in regulating protein synthesis. By binding to the initiation factor eIF4E, prevents the formation of the eIF4F complex inhibiting protein synthesis. The binding of 4E-BP1 to eIF4E is regulated by phosphorylation, when 4E-BP1 is hyperphosphorylated releases the initiation factor eIF4E and the initiation complex formation is possible allowing the translation of the proteins. There are a lot of studies on 4E-BP1 and it has been linked to several types of cancer, where 4E-BP1 was overexpressed, mainly in its phosphorylated form. In this study, we studied a series of 96 breast tumors and we found that elevated levels of total 4E-BP1 protein and its phosphorylated form, p-4E-BP1, were associated with the grade of tumor malignancy in breast cancer. In addition, the ratio of p-4E-BP1: total 4E-BP1 correlated significantly with the presence of metastasis in lymph nodes. We also studied in vitro the biochemical, molecular and biological effects of the overexpression of 4E-BP1, as well as the overexpression of a mutant of 4E-BP1 unable to phosphorylate. These results showed that overexpression of this protein caused a cell growth decrease, at least in some cell types. These results were also confirmed in in vivo experiments, where it was found that the overexpression of 4E-BP1 suppressed the tumorigenicity. Finally, 48 kinases were examined to see whether they are involved in 4E-BP1 phosphorylation and stability. The screening study was based on analysis of 4E-BP1 status after inhibition of these kinases in a breast carcinoma cell line. These findings provide evidence that 4E-BP1 can be regulated and stabilized by multiple kinases implicated in several cell signaling pathways: PDK1, SRC, PRKCB1, PAK2, p38β, PRKCA and CaMKKB (affecting 4E-BP1 phosphorylation) and LRRK2, RAF-1, p38γ, GSK3β, AMPKα, PRKACA and PRKACB (affecting total 4E-BP1 stability). Overall, the results suggest that p-4E-BP1 may be a candidate for establishing the prognosis in breast cancer. In addition, regulation of protein synthesis through inhibition of phosphorylation of 4E-BP1, could prevent the proliferation of tumor cells, at least in some cell types. We propose that 4E-BP1 could be a key factor where converge different cell signaling pathways that are altered in cancer and could be considered as a potential protein target for future therapies against cancer.

El gen UCP3 s'expressa majoritàriament al múscul esquelètic i al TAM en rosegadors, i pràcticament de manera exclusiva al múscul esquelètic en humans. El gen s'activa en resposta a diferents estímuls, entre els quals trobem l'àcid retinoic, els àcids grassos no esterificats i les hormones tiroïdals. L'estudi de la regulació de la transcripció del gen UCP3 en cèl·lules musculars ens ha permès obtenir informació sobre els mecanismes moleculars responsables de l'expressió d'UCP3 al múscul esquelètic i de la modulació d'aquesta expressió deguda als estímuls esmentats. L'estudi de la regulació de l'expressió d'UCP3in vivo ens ha permès establir la importància d'alguns d'aquests mecanismes en un context fisiològic.

D'acord amb l'expressió específica d'UCP3 al múscul, el factor de transcripció miogènic MyoD és necessari per l'activitat basal del promotor del gen UCP3. MyoD regula l'expressió del gen humà UCP3 a través d'unes seqüències semblants a Ebox properes al lloc d'inici de la transcripció (-29/-9). A més a més, l'activació del promotor del gen humà UCP3 per MyoD és necessària per tal que l'àcid retinoic, els àcids grassos o les hormones tiroïdals en modulin l'activitat.

L'àcid retinoic, un conegut activador transcripcional de l'expressió dels gens UCP1 i UCP2, activa l'expressió del gen UCP3 en cèl·lules musculars diferenciades. La resposta del gen UCP3 humà a l'àcid retinoic està mitjançada pels receptors d'àcid retinoic (RAR-RXR) i l'element de resposta a hormones DR1 (AGGTTTCAGGTCA) situat a la regió proximal (-71/-59) del promotor d'UCP3.

Per altra banda, l'activació del gen UCP3 pels àcids grassos es dóna a través de PPARalfa o PPARdelta (receptors activats per proliferadors peroxisomals) i de l'element DR1, in vitro i in vivo. En ratolins PPAR-alfa-KO s'ha observat una necessitat diferencial de PPAR-alfa per regular l'expressió del gen UCP3, en funció del teixit (cor o múscul esquelètic) i de l'estadi del desenvolupament (nounats i adults).
A nivell molecular, els processos d'acetilació són importants per l'activació del promotor del gen UCP3. El coactivador p300 és capaç de coactivar la resposta dependent de lligand de PPAR-alfa en el promotor, i l'activitat acetiltransferasa de p300 és necessària per aquesta coactivació. Tant l'estat d'acetilació de les histones com de MyoD són importants per l'activació del promotor del gen UCP3.

Finalment, s'ha observat que les hormones tiroïdals activen l'expressió del gen UCP3 humà i de ratolí al múscul esquelètic in vivo i en cèl·lules musculars en cultiu. Les hormones tiroïdals activen el promotor d'UCP3 a través dels receptors d'hormones tiroïdals (TR) i la regió del DNA que conté l'element DR1.

Per tant, l'element DR1 present en la regió proximal del promotor del gen UCP3 és un element multihormonal que mitjança l'activació del gen UCP3 per l'àcid retinoic, les hormones tiroïdals i els àcids grassos. En el futur, seria interessant estudiar la relació que s'estableix entre aquestes vies de senyalització in vivo.
UCP3 gene is mainly expressed in skeletal muscle and brown adipose tissue in rodents, and almost exclusively in skeletal muscle in humans. The gene is activated in response to different stimulus, such as retinoic acid, fatty acids and thyroid hormones. In the present study we investigate the molecular mechanisms responsible for UCP3 gene expression in skeletal muscle and for the retinoic acid, fatty acids and thyroid hormones-dependent activation. Studying UCP3 gene regulation in vivo has allowed to establish the importance of some of these mechanisms in a physiological context.

In agreement with the specific expression of human UCP3 in muscle, the myogenic transcription factor MyoD is needed for UCP3 promoter basal activity. MyoD regulates the expression of the human UCP3 gene through Ebox-like sequences near the initiation transcription site (-29/-9). Moreover, MyoD is necessary for retinoic acid, fatty acid or thyroid hormone-dependent activation of the UCP3 promoter.

Retinoic acid, a transcriptional activator of UCP1 and UCP2 gene expression, activates UCP3 gene expression in differentiated skeletal muscle cells. Human UCP3 gene response to retinoic acid is mediated by retinoic acid receptors (RAR-RXR) through a hormone response element DR1 (AGGTTTcAGGTCA) located in the proximal region of the promoter (-71/-59).

In addition, UCP3 gene activation by fatty acids is achieved by PPAR-alpha or PPAR-delta (peroxisome proliferator activated receptor) through the previously described DR1, in vitro and in vivo. Studies in PPAR-alpha-KO mice has revealed that PPAR-alpha is differentially required for UCP3 gene expression, depending on tissues (heart or skeletal muscle) and development stages (newborns and adults).

Finally, thyroid hormones activate human and mouse UCP3 gene expression in vivo and in vitro. This activation is mediated by thyroid hormone receptor (TR) through the DNA region that contains the DR1 element, in both human and mouse UCP3 promoter.

In conclusion, the DR1 element located in the proximal region of UCP3 gene promoter is a multihormonal response element able to mediate retinoic acid, thyroid hormone and fatty acid-dependent activation of UCP3 gene. In the future, it should be interesting to study the relationship between these signalling pathways in vivo.

L’epigenètica fa referència als canvis heretables en l'expressió gènica que no són causats per alteracions en la seqüència d'ADN. La metilació de la citosina en el dinucleòtid CpG és una de les modificacions epigenètiques més importants en els éssers humans, i les alteracions en els patrons de metilació de l’ADN són una característica comuna de tots els càncers. La metilació de l'ADN té un paper crucial en la regulació de l'arquitectura de la cromatina, i per tant en el control de l'expressió gènica i l'estructura cromosòmica. Tot i que la metilació de l'ADN es troba principalment en regions riques en CpGs dins d'elements repetitius i la hipometilació global va ser la primera alteració de la metilació de l'ADN detectada en els tumors, hi ha un fort biaix en tots els estudis de metilació, que es limiten en bona part a l'estudi de la hipermetilació d’illes CpG. El concepte desfasat que considerava el elements repetitius com seqüències parasitàries fa anys que s’ha abandonat, no obstant la majoria dels estudis a escala genòmica els ha ignorat. Per aquesta raó, els avenços en la comprensió dels mecanismes epigenètics que regulen elements repetitius poden contribuir a dilucidar la seva participació específica en els processos biològics. La desmetilació d'elements repetitius es produeix en l'envelliment i en processos patològics com el càncer, i s'ha associat amb la reactivació gènica i la inestabilitat genòmica. Elements Alu (membres de la família SINE - short interspersed elements - ) són els retrotransposons més abundants del genoma humà amb més d'1 milió de còpies per genoma haploide, el 10% de tot el genoma. Curiosament els elements Alu no estan distribuïts a l'atzar dins del genoma humà i tendeixen a acumular-se en les regions riques en gens. Els elements Alu contenen fins a un 33% del nombre total de CpGs del genoma i estan altament metilats en la majoria dels teixits somàtics. No obstant, una fracció d’Alus és manté desmetilada en cèl•lules normals i aquesta proporció s'incrementa en cèl•lules canceroses. Els elements Alu desmetilats solen trobar-se en dominis de cromatina activa i juguen un paper en la regulació i l'estabilitat genòmica. La nostra hipòtesi és que els elements Alu integrats en la cromatina activa poden participar en múltiples processos cel•lulars, incloent funcions crucials del desenvolupament i d’identitat cel•lular. El principal objectiu d'aquesta tesi ha estat identificar elements Alu desmetilats associats a un estat de la cromatina activa i determinar el seu paper en la regulació de l'expressió gènica. Hem identificat un subgrup d'elements Alu amb perfils epigenètics distintius i propis d'estats funcionals actius. A més hem observat que alguns elements Alu poden presentar perfils epigenètics específics d'estats patològics (com el càncer) o fisiològics (segons el tipus de cel•lular), així com que els elements Alu desmetilats en el teixit normal tenen un alt grau de conservació epigenètica. D'altra banda, hem identificat i caracteritzat dues regions promotores corresponents als gens GLDC i DIEXF que contenen elements Alu (ZALU3 i Aj2c1, respectivament) i que presenten un patró epigenètic dinàmic durant el desenvolupament i el càncer. Aquests elements Alu presenten canvis epigenètics que delimiten la regió reguladora d'aquests gens, la qual cosa es tradueix en perfils transcripcionals i proteics associats a l'estat epigenètic de l'Alu.
Epigenetics refers to heritable changes in gene expression that occur without alteration in DNA sequence. DNA methylation plays a crucial role in the regulation of chromatin architecture and in the control of gene expression. Even though DNA methylation is found mostly in repetitive elements and widespread hypomethylation was the first DNA methylation abnormality detected in tumors, there is a strong bias in methylation studies as most of them are restricted to CpG islands hypermethylation. For that reason, advances in understanding the epigenetic mechanisms that regulate repetitive elements may contribute to elucidate their specific participation in biological processes. Demethylation of repeat elements occurs in aging and pathological processes, as cancer, and has been associated with gene reactivation and genomic instability. Alu elements are the most abundant retrotransposon in the human genome, with more than 1 million copies. Interestingly, Alu elements tend to accumulate in gene rich regions. Alu elements contain up to 33% of the total number of CpG sites in the genome and are highly methylated in most somatic tissues. Strikingly, a small fraction of Alus remains unmethylated in normal cells and this proportion is increased in cancer cells. We hypothesize that Alu elements embedded in active chromatin are likely to participate in multiple cell processes, including crucial functions in development and cell identity. The main objective of this thesis has been to identify Alu elements with an active chromatin state and to determine their role in gene expression regulation. We have identified a subset of Alu elements with different epigenetic patterns characteristic of active functional states. We have observed that Alu elements have specific epigenetic profiles associated with pathological (cancer) or physiological (cell type) states and that the epigenetic particularity of Alus unmethylated in normal tissue is conserved at evolutional level. Moreover, we have identified and characterized two promoter regions corresponding to GLDC and DIEXF genes that include Alu elements (ZALU3 and Aj2c1, respectively) with a dynamic epigenetic pattern during development and cancer. These Alus show epigenetic changes that are consistent with the transcriptional and proteomic profiles of these genes and define the boundaries of the regulatory region.

L'ACG és una malaltia inflamatòria crònica de caràcter granulomatós, que afecta a les arteries grans i mitjanes en pacients d’edat avançada. El tractament majoritàriament establert per l'ACG són els glucocorticoides, que malgrat produir generalment una remissió ràpida dels símptomes, no eviten rebrots, i presenten una sèrie important d’efectes secundaris que fan necessària la investigació de teràpies alternatives. La investigació de nous tractaments requereix un coneixement més acurat sobre la patogènesi de la malaltia. La fisiopatologia de la malaltia es fonamenta en hipòtesis i deduccions fetes a partir de l’observació de l’expressió de molècules que tenen funcions conegudes en altres patologies. Així doncs s’ha acceptat que l'ACG s'inicia amb la presentació d'un antigen desconegut per part de les cèl·lules dendrítiques. Això provocarà una onada inflamatòria amb activació de leucòcits, i la progressió d'un infiltrat inflamatori a través de la paret arterial desestructurant les diferents làmines, que conclou amb la hiperplàsia de la làmina íntima i la obturació de la llum del vas. L'IFN-g per la seva banda, és una citoquina implicada en multitud de fenòmens relacionats amb la inflamació, com són l'activació de macròfags, la producció de molècules d’adhesió per part de les cèl·lules endotelials, o el reforçament de la via de diferenciació limfocitària Th1. Tots aquests fenòmens semblen rellevants durant la fisiopatologia de l'ACG, però malgrat això el rol de l'IFN-g en aquesta malaltia és encara desconegut. Una de les limitacions que té la investigació en ACG, és l'absència d'un model animal que permeti la realització d'estudis funcionals. En aquest sentit, els objectius del nostre treball són la posada a punt d'un model de cultiu d'artèria que permeti avaluar els efectes de molècules bloquejants i/o fàrmacs amb finalitat terapèutica. I en segon lloc aprofundir en el paper de l'IFN-g en l'ACG, definint les funcions que pugui tenir en la fisiopatologia de la malaltia però també en el manteniment de d’infiltrat inflamatori a la paret arterial. Així doncs, hem posat a punt el model de cultiu d'artèria temporal de pacients amb ACG, comprovant que l’estructura de la paret arterial es preserva durant temps perllongats en cultiu i mantenint la viabilitat de l'infiltrat inflamatori. Aquest model ens ha permès valorar les diferències en l'expressió de molècules pro-inflamatòries i molècules involucrades en el remodelatge vascular, entre biòpsies positives i negatives, i quins efectes té el tractament amb glucocorticoides sobre l'expressió d’aquestes. Així doncs, les biòpsies de pacients amb ACG presenten nivells d'expressió més elevats de IFN-g, IL-1b, CCL3, 4 i 5, i MMP9. El tractament amb glucocorticoides disminueix l'expressió d’aquestes mateixes molècules i de IL-6, TNF-a i CXCL8, així com la presencia de macròfags (identificats mitjançant immunotinció amb CD68) a la paret arterial. En canvi els corticoides no afecten substancialment l’expressió de molècules involucrades en el remodelatge vascular com el PDGF, TGFb o col·làgens. En el segon treball hem bloquejat l'IFN-g amb un anticòs monoclonal humà, que inhibeix en les artèries l’expressió i fosforilació de Stat-1, el factor de transcripció de la via canònica de l'IFN-g. Hem vist que aquest bloqueig té un impacte significatiu sobre l’expressió de quimiocines directament induïdes per IFN-g, com CXCL9, 10 i 11, tan a nivell de mRNA com de proteïnes, i també té efectes inhibitoris sobre molècules com IL-1b o TNF-a, tot i que aquestes tendències no han arribat a ser estadísticament significatives. L’estimulació de les artèries amb IFN-g recombinant ha resultat en un augment de l’expressió d’aquestes mateixes quimiocines i també dels receptors CCR2 i CXCR3. L'IFN-g també té un efecte estimulador de l’expressió de quimiocines sobre el component cel·lular majoritari de la paret arterial, les cèl·lules musculars llises (VSMC). L'IFN-g estimula en aquest tipus cel·lular les quimiocines CXCL9, 10 i 11, i CCL2, i també les molècules d’adhesió ICAM-1 i VCAM-1, i els factors de transcripció Stat-1 i Stat-3. Aquests augments de la síntesi de quimiocines i molècules d'adhesió es tradueixen en un augment de la migració (a través de CXCR3) i de l'adhesió de limfòcits i monòcits cap a les VSMC. El contacte entre aquests tipus cel·lulars ja provoca per si mateix un increment de l'expressió de quimiocines, i aquesta estimulació desapareix a l'inhibir l'IFN-g. Així doncs, l'IFN-g sembla tenir un paper significatiu en la progressió de l'infiltrat inflamatori a través de la paret arterial. El seu alliberament per part de les cèl·lules inflamatòries provoca en les VSMCs un increment de la síntesi de molècules que provoquen la migració i l'adhesió de les pròpies cèl·lules inflamatòries. Aquests resultats proporcionen les primeres evidencies sobre el paper funcional del l’IFNg en l’arteritis de cèl·lules gegants i constitueixen un primer pas per explorar el seu potencial com a possible diana terapèutica en l'ACG.
GCA is a granulomatous vasculitis of the elderly, affecting large and medium-sized arteries. Glucocorticoids are the cornerstone of GCA treatment, but unfortunately the majority of patients experience undesirable side effects and relapse when glucocorticoids are tapered. This observation underlines the need for searching alternative therapies in GCA. Investigating new treatments requires a better understanding of GCA pathogenesis and the development of functional models for pre-clinical testing, since there are no animal models for GCA. IFN-g, highly expressed in GCA patients compared to controls, is a cytokine implicated in multiple inflammatory-related pathways, and it may contribute to GCA pathogenesis by participating in lymphocyte Th1 differentiation and by activating macrophages promoting granuloma formation. However, this is extrapolated from its known biologic functions and the functional role of IFN-g in GCA has not been explored. Our main objectives were: to develop a human temporal artery culture model for functional studies, and to explore IFN-g roles by using a neutralizing, fully human monoclonal antibody against IFN-g. In our first study we developed a temporal artery culture model in tri-dimensional matrix where viability and morphology is preserved for up to 2 weeks. In this model we have confirmed differences in expression of pro-inflammatory molecules between GCA and control arteries. We have also observed that glucocorticoids inhibit mRNA expression of pro-inflammatory cytokines such as IFN-g and IL-1b or chemokines CCL3, 4 and 5, as well as a reduction in macrophage infiltration assessed by CD68 immunostaining. Interestingly, glucocorticoids did not have a significant effect on the expression of molecules involved in vascular remodelling such as PDGF, TGFb or collagens. In the second study, we used a fully human neutralizing antibody against IFN-g in order to inhibit IFN-g effects. Treatment of cultured arteries with this antibody reduced the expression and phosphorylation of Stat-1, a pivotal transcription factor in IFN-g-driven canonical signalling pathways. IFN-g blockade led to significant decrease in mRNA and protein expression of CXCL9, 10 and 11 in cultured arteries and a decrease in infiltrating CD68 macrophages. Stimulating GCA arteries with recombinant IFN-g elicited the opposite effects. We demonstrated that IFN-g had significant effects on the main cellular component of the arterial wall, vascular smooth muscle cells (VSMC) by inducing chemokine (CXCL9, 10 and 11, and CCL2) and adhesion molecule (ICAM-1 and VCAM-1) expression. This resulted in increased PBMCs migration and adhesion to cultured VSMC and to normal arteries exposed to IFN-g. In summary, IFN-g synthetized by inflammatory cells, acts on VSMCs via Stat1, to enhance the production and secretion of chemokines and adhesion molecules that regulate trafficking of these leukocytes, perpetuating a loop that contributes to the maintenance and progression of the inflammatory infiltrates in the arterial wall. Our work provides first evidences supporting a functional role of IFNg in GCA, a necessary first step to explore its potential as therapeutic target.

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR.
Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

Resum Mutacions en els gens de les presenilines (PS: PS1 i PS2), el component catalític del complex γ-secretasa, són la principal causa d'Alzheimer familiar hereditari (FAD). Evidències recents demostren que mutacions associades a FAD produeixen una reducció del processament per PS/γ-secretasa de diversos substrats, suggerint un mecanisme de pèrdua de funció d´aquestes mutacions. De fet, la inactivació genètica d'ambdues PS en el cervell adult causa dèficits en la plasticitat sinàptica i memòria, i neurodegeneració. Durant el desenvolupament embrionari, la inactivació de PS1 indueix canvis en la neurogènesi i la mort prematura probablement degut, almenys en part, a alteracions en la via de senyalització de Notch. Malgrat això, el paper de la PS1 i/o l´activitat γ-secretasa i els mecanismes moleculars regulats per aquests durant els processos de diferenciació neuronal, tals com el creixement axonal i dendritic i la formació de sinapsis, en gran part es desconeixen. Un dels principals esdeveniments durant la maduració neuronal és el creixement de l´axò, un procés necessari per establir connexions sinàptiques adequades pel funcionament dels circuits neuronals. La família de proteïnes Rho GTPases regulen la polarització neuronal i el creixement de l'axó. Per altra banda, els receptors tirosina quinasa d´efrina (Eph) regulen el creixement i la guia axonal durant la maduració neuronal. L'activació dels receptors Eph indueix el col·lapse del con de creixement i la retracció axonal a través de l'activitat RhoA. L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha sigut investigar el paper de PS1/γ-secretasa durant el creixement axonal, així com els mecanismes moleculars implicats en aquesta regulació. Els resultats obtinguts demostren que la inactivació genètica de PS1 en ratolins indueix una reducció del creixement axonal en la regió ventricular i en l'hipocamp. En el mateix sentit, la inactivació genètica o farmacològica de l'activitat PS1/γ-secretasa indueix una reducció significativa del creixement axonal en neurones hipocampals en cultiu. De fet, la inactivació de PS/γ-secretasa incrementa l'activitat de RhoA GTPasa causant defectes en l'elongació de l'axó, un efecte que és revertit a l´inhibir RhoA o la seva proteïna efectora ROCK. A més, en aquest treball descrivim per primera vegada que PS1 col·localitza amb el receptor EphA3 en els axons de neurones hipocampals, i que PS1/γ-secretasa regula el processament d´EphA3 de forma constitutiva i independent de lligand, essent aquest processament necessari per al creixement axonal. A més, demostrem que la generació del fragment intracel·lular EphA3 ICD per PS/γ-secretasa, és clau per al creixement axonal, de manera que un mutant de EphA3 que perd la capacitat de ser proteolitzat no reverteix els defectes del creixement axonal causats per la inactivació de PS1. Per contra, l'expressió d'EphA3 ICD rescata el creixement axonal en neurones hipocampals deficients en PS/γ-secretasa o EphA3. A més, l'expressió d'EphA3 ICD disminueix l'activitat RhoA GTPasa, a la vegada que interacciona amb les miosines Ib i IIa, proteïnes que són clau en la regulació de l´organització del citoesquelet axonal en el con de creixement. Per tant, els nostres resultats demostren que la PS1/γ-secretasa juga un paper essencial durant creixement axonal en neurones hipocampals a través de la regulació de les vies de senyalització d´EphA3 i RhoA.
Mutations in the Presenilin genes (PS: PS1 and PS2), the catalytic component of the γ-secretase complex, are the main cause of familial Alzheimer’s disease (FAD). Recent evidences show that FAD-linked mutations induce a reduction of PS/γ-secretase processing of several substrates, suggesting a loss-of-function mechanism in this mutations. In fact, the genetic inactivation of both PS in adult brain induces synaptic plasticity and memory deficits, and neurodegeneration. In developmental stages, inactivation of PS1 induces alterations in neurogenesis and premature death of the embryos, partially, due to alterations in the Notch signaling pathway. However, the role of PS1 or the γ-secretase activity and the molecular mechanisms regulated during the neuronal differentiation, such as axonal and dendritic elongation and synapse formation, are widely unknown. Axon elongation, a process necessary for the establishment of functional synaptic connections in the neural circuitry, is one of the main events during neuronal differentiation. Rho GTPase family proteins regulate neuronal polarization and axon elongation. On the other hand, ephrin tyrosine kinase receptors (Eph) regulate the elongation and axon growth during neuronal differentiation. Activation of Eph receptors induces the growth cone collapse and axonal retraction through the RhoA activity. The objective in this doctoral thesis has been to investigate the role of PS1/γ-secretase during the axonal elongation, and the molecular mechanisms involved in this pathway. Our results show that genetic inactivation of PS1 in mice induces a significant reductions of the axon growth in primary hippocampal neurons. In fact, the inhibition of PS/γ-secretase induces an increase in RhoA GTPase activity, which in turn causes elongation defects in the axon, an effect reverted by RhoA or ROCK effector protein inhibition. Moreover, in this thesis we describe for the first time the colocalization of PS1 and EphA3 receptor in the axons of hippocampal neurons, where PS1/γ-secretase regulates the constitutive and ligand-independent processing of EphA3, a mechanism necessary for axonal growth. Furthermore, we demonstrate that generation of the intracellular fragment of EphA3 (EphA3 ICD) is a key event for axonal growth, where processing-defective EphA3 mutants are not able to rescue axonal growth defects caused by PS1 inactivation. Otherwise, expression of EphA3 ICD induces a decrease of RhoA GTPase activity, which in turn interacts with myosin-IB and myosin-IIA key proteins for the reorganization of the axon cytoskeleton in the growth cone. Therefore, our results indicate that PS1/γ-secretase has an essential role during axonal growth in hippocampal neurons by regulating EphA3 and RhoA signaling pathways.

En la presente tesis doctoral se ha realizado una serie de aportaciones para contribuir al desarrollo de los sistemas de comunicaciones móviles de tercera generación. Esta nueva generación de sistemas utilizará una técnica de acceso del tipo CDMA y pretende poder garantizar una cierta calidad de transmisión en las comunicaciones. En este sentido, esta tesis presenta nuevas propuestas tanto para el protocolo de acceso al medio (MAC) como para los algoritmos de gestión de los recursos radio (RRM).
Las propuestas han sido presentadas, estudiadas y analizadas en diferentes entornos representativos de trabajo y se ha demostrado su validez para su utilización en un sistema real de comunicaciones. Además, por su sencillez de implementación y alta eficiencia en la utilización de los recursos, se ha comprobado que todas ellas son candidatas muy adecuadas para poder formar parte de los estándares en formación para los citados sistemas.
Glosando los aspectos desarrollados en la presente tesis doctoral, cabe destacar los siguientes puntos:
? Se han estudiado en profundidad las necesidades y requerimientos del interfaz radio en los sistemas de comunicaciones móviles de tercera generación, centrando el estudio en las transmisiones en modo paquete para entornos con acceso CDMA.
? Se ha propuesto un nuevo protocolo MAC para trabajar en este entorno de operación. Asimismo, se ha realizado un modelo teórico del protocolo para el análisis de su rendimiento en sistemas genéricos con tráfico homogéneo. Se ha analizado con detalle el modelo para demostrar las propiedades cuasi-óptimas del protocolo, tanto en retardo como en throughput y estabilidad. El protocolo además introduce un concepto nuevo de control distribuido que minimiza la información de control necesaria, mejorando con ello las prestaciones del sistema.
? Se han realizado simulaciones por ordenador de un sistema de comunicaciones cuyo MAC es el nuevo protocolo propuesto para verificar la validez del modelo teórico. Se ha comprobado que se minimiza el retardo de propagación, se alcanza la máxima eficiencia en la utilización del canal radio y se mantiene la estabilidad para cualquier carga de tráfico.
? Se ha propuesto una estructura de receptor físico para la detección de las secuencias de peticiones de acceso. Se ha analizado el rendimiento del receptor y se han derivado las probabilidades de error en la detección de las secuencias para entornos reales móviles. En esta situación, se ha realizado el estudio de estabilidad del protocolo y se han introducido las modificaciones necesarias para mantener la robustez del mismo, alcanzando el objetivo buscado.
? Se ha realizado un trabajo de optimización del protocolo de acceso para mantener sus propiedades para cualquier entorno de tráfico de entrada, haciendo especial hincapié en el peor escenario posible. Este escenario es aquel en el que los usuarios generan mensajes muy racheados de longitud mínima. Se han introducido nuevas mejoras en el protocolo para mantener su rendimiento cuasi-óptimo en este escenario límite.
? Se han realizado nuevas simulaciones de sistema por ordenador de cara a demostrar la capacidad inherente del protocolo para manejar situaciones de tráfico heterogéneo donde es posible adaptar las velocidades de transmisión de forma dinámica para mejorar el rendimiento del sistema. Para este cometido se han definido unos modelos de tráfico basados en las aplicaciones más usuales.
? Se ha estudiado el comportamiento de un sistema celular de comunicaciones móviles donde el protocolo MAC es el nuevo protocolo propuesto. Se han realizado simulaciones en las que se demuestra que es posible mejorar el rendimiento general del sistema gracias al uso de la información de control que ofrece el propio protocolo en los criterios para la gestión de los handovers y el control de potencia.
? Se han propuesto y analizado nuevas estrategias de gestión de los recursos radio, tanto para el subsistema de transmisión como para el subsistema de resolución de colisiones, de cara a dotar al sistema de la capacidad de garantizar una cierta calidad de servicio en las comunicaciones. Estas estrategias mantienen la idea de la gestión distribuida, lo que minimiza la información de señalización necesaria en el sistema. Se han definido unas clases de servicio de comprobación, con sus correspondientes parámetros de calidad y se ha demostrado el correcto funcionamiento del sistema en presencia de tráfico heterogéneo proveniente de todas estas clases. Se ha verificado que se cumplen los requisitos exigidos al sistema, cumpliéndose los criterios de prioridad y garantizando la calidad de las transmisiones.
Por tanto, podemos concluir que la presente tesis doctoral se enmarca dentro de los estudios de investigación orientados a ofrecer nuevas aportaciones para ser incluidas en el nivel 2 del modelo OSI de los futuros sistemas de comunicaciones móviles de tercera generación.
This thesis provides some new contributions for the development of the future third generation mobile communication systems. This new generation will use a CDMA multiple access technique and pretends to guarantee a certain quality of service in the transmissions. In this sense, this thesis presents new proposals of Medium Access Control Protocols (MAC) and radio resource management algorithms (RRM).
These proposals have been presented, studied and analysed in different representative scenarios and it has been proved their suitability for a real communication system. They are also simple to implement and they have a very high efficiency in the use of the transmission resources. Therefore, all of them are promising in order to became part of the future standards.
Summarising the main aspects of the thesis, they are:
? The requirements of the radio interface of the future third generation mobile communication systems have been studied in detail, focusing in packet switched mode and CDMA access.
? A new MAC protocol has been proposed to work in this scenario. A theoretical model has been developed in order to obtain its performance in a generic traffic situation. The near-optimum properties of the protocol have been demonstrated. These properties affect delay, throughput and stability. The protocol also introduces a new concept of distributed control, which minimises control information, improving the overall performance.
? Some computer simulations have been carried out to verify the analytic model. It has been proved that the packet delay is minimised and the channel efficiency is almost the maximum theoretical one. Also, the stability is kept for any traffic load.
? A receiver structure for the detection of the access requests has been proposed. This scheme has been studied and analysed, and all the misdetection probabilities have been derived in the presence of a real radio channel with fast fading. The required modifications in the MAC protocol needed to maintain the stability have been introduced and analysed.
? The MAC protocol parameters have been optimised in order to keep the same performance properties whichever the traffic load pattern could be. In particular, the worst case scenario of very frequent short messages has been studied in detail. Some modifications have been proposed and introduced in order to reach this objective.
? Some computer simulations have been carried out to demonstrate the inherent capacity of the MAC protocol to operate in heterogeneous traffic situations. Also, a dynamic rate adaptation algorithm has been proposed and analysed to improve the overall performance.
? A cellular mobile communications system based on the MAC protocol has been designed and simulated. It has been proved that the control information of the protocol can be used to improve the mobility mechanisms of the system: power control and handover decisions.
? New Radio Resource Management strategies have been proposed and analysed, in order to provide the system the capacity to guarantee a certain quality of service in the transmissions.

La sirtuïna 1 (SirT1), una desacetilasa depenent de NAD, promou la formació de l’heterocromatina facultativa (HF) desacetilant H4K16Ac, H3K9Ac i H1K26Ac i establint marcadors d’heterocromatina via interacció amb la histona metiltransferasa Suv39h1, un factor clau en l’organització de la cromatina. Però SirT1 també regula l’heterocromatina constitutiva (HC) depenent de Suv39h1 a través d’un mecanisme desconegut. Considerant la importància de l’HC en l’organització i estabilitat de la cromatina global, i les seves implicacions funcionals en l’envelliment i la durada de la vida, definir si i com SirT1 ajuda a mantenir l'estructura de l’HC podria ser per a determinar les conseqüències durant la resposta a l'estrès en l'estabilitat del genoma. Per aquest motiu, en aquesta primera part de la tesi, ens vam centrar en entendre la connexió entre SirT1 i l’estructura de l’HC a través de l’estudi de la relació entre SirT1 i Suv39h1, ja que com s’ha comentat anteriorment, aquesta relació és crucial per la formació d’HC. En el mecanisme que proposem entre SirT1 i Suv39h1 per entendre la relació funcional entre aquestes dues proteïnes a l’HC, SirT1 preserva l’estructura de l’HC a través de l’estabilització de Suv39h1 sota condicions d’estrès inhibint la poliubiquitinització, mediada per la ubiquitina lligasa E3 MDM2 (un factor molt important en el control de la resposta a estrès relacionat amb p53), a la lisina 87 del domini chromo de Suv39h1. Els nostres estudis suggereixen que l’augment dels nivells de Suv39h1 promou un augment de l’intercanvi d’aquest a l’HC. L’increment de la taxa de renovació de Suv39h1, observat al mutant K87 d’aquest, promou la integritat genòmica en condicions d’estrès genotòxic. Aquest mecanisme pot ser també molt important per l’HF en el contexte del programa d’expressió en resposta a estrès regulat per SirT1. Una altra proteïna molt important en l’HC, en el manteniment i formació d’aquesta, és la proteïna estructural HP1, de la qual s’han descrit tres isoformes en mamífers: HP1α, HP1β i HP1γ. Curiosament comparada amb SirT1, HP1 també s’uneix a la regió N-terminal de Suv39h1, però contràriament, té una forta localització a HC. Aquesta observació ens va portar a desenvolupar la segona part del projecte centrada en entendre si el mecanisme observat entre SirT1 i Suv39h1 estava conservat dins del cor estructural de l’HC a través de la relació entre Suv39h1 i les isoformes d’HP1. Conseqüentment, aquest estudi ens va dirigir cap a la caracterització del paper de cadascuna de les isoformes d’HP1 en el manteniment de l’estructura de l’HC. Les qual s’han considerat, excepte en aspectes molt concrets, força similars. Sorprenentment, tot i la similitut entre les tres isoformes d’HP1, vam aportar una regulació diferencial sobre Suv39h1. De les isoformes d’HP1 existents a mamífers, dues d’elles HP1α i HP1γ, augmenten els nivells de Suv39h1 a través de la seva unió i regulació a la regió N-terminal d’aquest, com hem vist amb SirT1, inhibint la degradació per ubiquitinització i conseqüentment augmentant l’intercanvi de Suv39h1. El mecanisme a través del qual no està clar. HP1β sembla tenir un paper com a reservori respecte la regulació de Suv39h1 en condicions normals. Les isoformes d’HP1α i HP1γ també semblen incrementar la renovació de Suv39h1 per tal de mantener una adequada estructura de l’HC. Específicament, l’HP1β sería necessària en aquest augment sota l’efecte de l’estrès per garantitzar la integritat del genoma. Tenint en compte el coneixement de l’HC, que és mínim, els nostres estudis s’han centrat en entendre l’estructura, a través de la caracterització del paper de les isoformes d’HP1, en condicions normals i d’estrès. Proposem un model en el qual situaríem predominantment HP1α, però també HP1γ, formant homo i heterodímers, en diferents regions del foci d’HC limitant l’expansió de la marca d’H4K20me3. En aquesta regió, Suv39h1 uniría a HP1α i a HP1γ i aquestes l’estabilitzarien. I en el centre d’aquestes regions localitzaríem HP1β que tindria més afinitat amb Suv420h2 formant homo i heterodímers amb HP1γ. En absència d’HP1α, la modificació H4K20me3 s’expandiria provocant una compactació a la cromatina.
Sirtuin1 (SirT1) is a NAD dependent deacetylase that promotes the formation of facultative heterochromatin via interaction with histone methyltransferase Suv39h1, a key factor in the organization of chromatin. But SirT1 also regulates the constitutive heterochromatin (HC) depending Suv39h1 through an unknown mechanism. Considering the importance of the HC in the organization and stability of the global chromatin and its functional implications in aging and lifespan, define whether and how SirT1 helps keep the structure HC could be to determine the implications for the stress response in genome stability. In the proposed mechanism between SirT1 and Suv39h1 to understand the functional relationship between these two proteins in the HC, SirT1 preserves the structure of the HC through the stabilization of Suv39h1 under stress conditions inhibiting polyubiquitination mediated by MDM2 at lysine 87 of the chromo domain of Suv39h1. The increase in available Suv39h1 is associated with a faster renewal of the HC and increased protection of genomic integrity in these conditions. Another important protein in the HC, maintenance and training for this, which also binds to the N-terminal region of Suv39h1 is heterochromatin protein1 (HP1) which has a strong localization in HC. Therefore, we focused on studying the relationship between Suv39h1 and three HP1 isoforms found in mammals: HP1α, HP1β and HP1γ. Surprisingly, despite the similarity, we observed a differential regulation of Suv39h1. HP1α and HP1γ, increase the levels of Suv39h1 through its binding and regulation by the N-terminal region that inhibits degradation by polyubiquitination and consequently increasing the exchange of Suv39h1 to maintain an adequate structure of the HC. The mechanism through which is unclear. HP1β would be necessary, in this increase, under the effect of stress. This study led to the characterization of the role of each of the HP1 isoforms in maintaining the structure of the HC. We propose a model which would place predominantly HP1α, but also HP1γ in different regions of foci of HC limiting the expansion of the H4K20me3 mark. In this region, would interact Suv39h1. And the center, HP1β would have more affinity with Suv420h2, where also would find HP1γ.

INTRODUCCIÓ: Les neoplàsies colorectals ocupen actualment els primers llocs de les
neoplàsies més freqüents i també són les que causen més morts. Tot i que per una
banda, en els últims anys les millores en els tractaments quirúrgic, neoadjuvant i
adjuvant han contribuït a l'augment de la supervivència i al percentatge de curacions.
Per l'altra, es continuen fent servir els mateixos factors pronòstics que fa uns anys,
principalment les classificació de Dukes i Astler-Coller i l'estadi TNM. El fet que la
carcinogènesi colorectal sigui una de les més ben estudiades permet que els gens o
factors que es veuen alterats durant aquest procés puguin ser estudiats com a
possibles factors pronòstics per preveure l'evolució de la malaltia. L'activitat de la
telomerasa (AT), la longitud del telòmer (LT) i l'expressió del TRF1 han estat els factors
escollits per a ser estudiats com a factors pronòstics per la seva implicació en la
regulació i homeòstasi dels telòmers, els quals tenen un paper important en l'estabilitat
del genoma, la viabilitat cel·lular i el desenvolupament del procés carcinogènic.
HIPÒTESIS: Estudiar dins la nostra sèrie de pacients amb càncer colorectal (CCR)
l'activitat de la telomerasa, la longitud del telòmer (LT) i l'expressió del TRF1, veure com
es comporten dins la seqüència adenoma-carcinoma i determinar si poden ser nous
factors pronòstics independents per al temps lliure de malaltia i de supervivència
global.
PACIENTS I MÈTODES: L'AT es va determinar per la tècnica F-TRAP en la mucosa
tumoral, transicional, normal i pòlips. La LT es va analitzar per mitjà del Southern-blot en
la mucosa tumoral, normal, pòlips i sang de pacients amb CCR i en sang i mucosa
colònica de pacients sense cap afectació colorectal. L'expressió del TRF1 es va
determinar per Western-blot en mucosa tumoral i normal de pacients amb CCR. Es van
relacionar l'AT, la LT i l'expressió del TRF1 entre sí i amb les característiques
anatomopatològiques dels pacients. Els pacients van ser seguits durant els 4 anys
següents ala cirurgia i els anàlisis del temps lliure de malaltia i de la supervivència així
com la recerca de factors pronòstics independents es va realitzar als 2 i als 4 anys.
RESULTATS: L'AT en la mucosa tumoral era significativament més elevada que en la
mucosa normal, mentre entre les mucoses transicional i normal les diferències no eren
significatives. L'AT en els pòlips era més elevada que en la mucosa normal però inferior
a la de la mucosa tumoral, i els pòlips aïllats tenien una AT superior que els pòlips
sincrònics. La mitjana de la LT en la mucosa tumoral era significativament més curta
que la de la mucosa normal. Comparant la LT tumoral-normal de cada pacient
obteníem que un 55% dels tumors mantenien la LT similar respecte la corresponent
mucosa normal, un 10% els allargaven i un 35% els escurçaven. La LT en la mucosa
tumoral i normal presentaven un comportament paral·lel. La LT no es correlacionava
amb l'AT. La longitud del telòmer en sang va ser molt similar entre els pacients amb i
sense CCR però la LT en la mucosa normal dels pacients amb CCR era molt més curta
que en la mucosa colònica dels pacients sans. La LT dels pacients sans es
correlacionava amb l'edat, en la sang i també en la mucosa colònica. Les mostres
tumorals expressaven majors nivells de TRF1 i l'expressió del TRF1 semblava estar
relacionada amb la LT però no amb l'AT. Els pòlips van presentar una AT superior a la
corresponent mucosa normal i inferior a la tumoral i també van mostrar telòmers més
curts que la mucosa normal però més llargs que la tumoral. La ràtio de la longitud del
telòmer (RLT) va ser factor pronòstic independent per la supervivència als 2 anys en els
malalts de còlon. L'IT va ser un factor pronòstic independent per a la progressió de la
malaltia als 2 anys i per a la supervivència global als 2 i 4 anys només en els malalts de
recte.
CONCLUSIONS: L'AT augmenta a mesura que ho fa el grau de malignitat del tumor
mentre que la LT disminueix. L'IT (índex de la telomerasa) és un factor pronòstic
independent per a la progressió de la malaltia als 2 anys i per a la supervivència als 2 i
als 4 anys en els pacients amb càncer de recte. La ràtio de la longitud del telòmer era
un factor pronòstic independent per al temps de supervivència global als 2 anys en els
pacients amb càncer de còlon.
INTRODUCCIÓN: La neoplasia colorrectal ocupa el segundo lugar entre las más
frecuentes y también es la segunda que causa más muertes. Aunque, en los últimos
años las mejoras en los tratamientos quirúrgicos, neoadyuvantes y adyuvantes han
contribuido al aumento de la supervivencia y al porcentaje de curaciones. Por otra
parte, se continúan usando los mismos factores pronóstico que hace unos años,
variables anatomopatológicas del tumor. El hecho que la carcinogénesis colorrectal
sea una de las más bien estudiadas permite que los genes o factores que se ven
alterados durante este proceso puedan ser estudiados como posibles factores
pronóstico para prever la evolución de la enfermedad. La actividad de la telomerasa
(AT), la longitud del telómero (LT) y la expresión del TRF1 (factor 1 de unión al telómero)
han sido los factores escogidos para ser estudiados como factores pronóstico por su
implicación en la regulación y homeostasis de los telómeros, los cuales tienen un papel
importante en la estabilidad del genoma, la viabilidad celular y en el desarrollo
carcinogénico.
HIPÓTESIS: Estudiar dentro de nuestra serie de pacientes con cáncer colorrectal (CCR)
la actividad de la telomerasa, la longitud del telómero (LT) y la expresión del TRF1,
observar como se comportan dentro de la secuencia adenoma-carcinoma y
determinar si pueden ser nuevos factores pronósticos independientes para el tiempo
libre de enfermedad y de supervivencia global.
PACIENTES Y MÉTODOS: La AT fue determinada mediante la técnica F-TRAP en la
mucosa tumoral, transicional, normal y de pólipos colorrectales. La LT se analizó
mediante Southern-blot en la mucosa tumoral, normal, pólipos y sangre de pacientes
con CCR y en sangre y mucosa colónica de pacientes sin ninguna afectación
colorrectal. La expresión del TRF1 fue determinada por Western-blot en mucosa
tumoral y normal de pacientes con CCR. Se relacionaron la AT, la LT y la expresión del
TRF1 entre sí y con las características anatomopatológicas. Se realizaron los análisis del
tiempo libre de enfermedad y del tiempo de supervivencia y se estudiaron los factores
pronósticos independientes a los 2 y 4 años.
RESULTADOS: La AT en la mucosa tumoral fue más elevada que en la mucosa normal
(p< 0.001), mientras que entre las mucosas transicional y normal las diferencies no
fueron significativas. La AT en los pólipos fue más elevada que en la mucosa normal
pero inferior que en la mucosa tumoral, y los pólipos aislados presentaron una AT
superior que los pólipos sincrónicos (p = 0.020). La media de la LT en la mucosa tumoral
fue más corta que en la mucosa normal (p < 0.001). Comparando la LT tumoral-normal
de cada paciente obtuvimos que la LT era mantenida en un 55% de los tumores,
alargada en un 10% y acortada en un 35%. La LT en la mucosa tumoral y normal
presentaba un comportamiento paralelo (p < 0.001). La LT no se correlacionó con la
AT. La LT en sangre fue muy similar entre los pacientes con y sin CCR pero la LT en la
mucosa normal de los pacientes con CCR fue más corta que en la mucosa colónica
de los pacientes sanos. La LT de los pacientes sanos se correlacionó con la edad, en
sangre y también en la mucosa colónica (p <0.001; p = 0.037). Las muestras tumorales
expresaron niveles mayores de TRF1 y la expresión del TRF1 parecía estar relacionada
con la LT pero no con la AT. Los pólipos presentaron una AT superior a la
correspondiente mucosa normal y inferior a la tumoral y también mostraron telómeros
más cortos que en la mucosa normal pero más largos que en la tumoral. La ratio de la
longitud del telómero (RLT) fue factor pronóstico independiente para la supervivencia
a los 2 años en el colon (p = 0.022). El IT (índice de telomerasa) fue un factor pronóstico
independiente para la progresión de la enfermedad a los 2 años (p = 0.035) y para la
supervivencia global a los 2 y 4 años solamente en el recto (p = 0.040; p = 0.030).
CONCLUSIONES: La AT aumenta a medida que lo hace el grado de malignidad del
tumor mientras que la LT disminuye. El IT es un factor pronóstico independiente para la
progresión de la enfermedad a los 2 años y para la supervivencia a los 2 y 4 años en los
pacientes con cáncer de recto. La RLT es un factor pronóstico independiente para el
tiempo de supervivencia global a los 2 años en los pacientes con cáncer de colon.
INTRODUCTION: Colorectal cancer is the second cancer in incidence and mortality.
Although in the last years the improvements in surgical, adjuvant and neoadjuvant
therapies contributed to increase the survival rates and percentage of healings. But
we still use the same prognostic factors, based on the anatomopathological
characteristics of tumour. The fact that colorectal carcinogenesis is one of the most
known allows to study the genes or other factors that can be altered during this
process, and use them as possible prognostic factors to prevent the evolution of the
illness. For this study the factors selected are: telomerase activity (TA), telomere
length (TL) and TRF1 (telomeric repeat factor) expression due to their implication in
the regulation and homeostasis of telomeres, which have an important role in the
genome stability, cellular viability and carcinogenic development.
HYPOTHESIS AND OBJECTIVES: To analyse in our series of patients with colorectal
cancer (CRC) telomerase activity, telomere length and TRF1 expression, to observe
its behaviour in the adenoma-carcinoma sequence and to determine if they could
be new independent prognostic factors for disease-free survival and overall survival.
METHODS AND PATIENTS: The TA was determined by F-TRAP in tumoral, transitional
and normal mucosa and polyps in 108 patients. The TL was analysed by Shoutern
blot in tumoral and normal mucosa and blood cells in patients with CRC and in
blood cells and colon mucosa in healthy patients. The TRF1 expression was
determined by Western blot in tumoral and normal mucosa in patients with CRC. TA,
TL and TRF1 expression were related to anatomopathological characteristics of
patients. The disease-free survival and overall survival were realized and
independent prognostic factors were studied at 2 and 4 years.
RESULTS: The TA in tumoral mucosa was higher than normal mucosa (p< 0.001), while
the differences were not significant between transitional and normal mucosa. TA in
the polyps was higher than normal mucosa but was lower than tumoral mucosa,
and the isolated polyps had a higher TA than synchronic polyps (p = 0.020). The TL
mean in tumoral mucosa was shorter than normal mucosa (p< 0.001). When we
compared tumoral-normal TL in each patient we obtained that TL was maintained in
55% tumours, elongated in 10% and shortened in 35%. The TL in tumoral and normal
mucosa showed a parallel behaviour (p< 0.001). TL did not correlate with TA. TL in
blood cells was similar in patients with and without CRC, but TL in normal mucosa in
patients with CRC was shorter than normal mucosa in healthy patients. TL in healthy
patients correlates with age in blood cells and also in normal mucosa (p< 0.001; p =
0.037). Tumoral mucosa expressed greater levels of TRF1 and this expression seemed
to be related to LT but not to TA. Polyps showed a greater TA than their respective
normal mucosa and lower than tumoral mucosa, and polyps showed shorter
telomeres than normal mucosa but longer than tumoral mucosa. The telomere
length ratio (TLR) was an independent prognostic factor for overall 2 years survival in
patients with colon cancer (p = 0.022). Telomerase index (TI) was an independent
prognostic factor for 2 years disease-free survival (p = 0.035) and for overall
survival at 2 and 4 years in patients with rectal cancer (p = 0.040; p = 0.030).
CONCLUSIONS: TA increases and TL reduces as the tumour malignancy degree
increases. The TI is an independent prognostic factor for diseases-free survival at 2
years and for overall survival at 2 and 4 years in patients with rectal cancer. The TLR is
an independent prognostic factor for overall survival at 2 years in patients with colon
cancer.

La major conscienciació actual dels problemes de pol·lució que acompanyen les pèrdues de N del sòl cap a l'atmosfera ha reorientat les investigacions cap a un coneixement més profund dels processos implicats en les emissions dels compostos nitrogenats que comporten un major perjudici des d'un punt de vista ecològic així com els seus principals factors reguladors. La creixent preocupació per l'increment de la concentració atmosfèrica de N2O és deguda a les seves interaccions amb la fotoquímica atmosfèrica i el balanç de radiació de la Terra ja que intervé en la destrucció de la capa estratosfèrica d'ozó, contribueix a l'efecte hivernacle i participa de la pluja àcida. Es considera que els sòls són la principal font de N2O atmosfèric. Al voltant del 90% d'aquestes emissions són d'origen biòtic; els principals processos implicats són la desnitrificació i la nitrificació. L'emissió del N2O produït a través d'aquests dos processos es caracteritza pels diferents nivells de regulació que presenta ja que depèn de la taxa dels processos, de la proporció de N canalitzada per cada procés cap a la producció de N2O i del seu consum dins el mateix sòl el qual està relacionat amb les dificultats en el transport cap a l'atmosfera. Això comporta una gran dificultat a l'hora d'aprofundir en el coneixement de les emissions de N2O del sòl cap a l'atmosfera i de la seva regulació. El desconeixement dels nivells d'emissió de N2O i de la importància de la desnitrificació així com de la seva regulació tant en sòls agrícoles com naturals de les nostres contrades és el principal punt de partida dels objectius d'aquest treball.
The current increased awareness of pollution problems that accompany the loss of soil N to the atmosphere has reoriented research towards a deeper understanding of the processes involved in emissions of nitrogen compounds that lead to greater damage from an ecological point of view as well as their regulatory factors. The growing concern over the increased atmospheric concentration of N2O is due to their interactions with atmospheric photochemistry and radiation balance of Earth as it participates in the destruction of the stratospheric ozone layer, the greenhouse effect and in acid rain. It is considered that the soils are the main source of atmospheric N2O. Around 90% of these emissions are of biotic origin, the main processes involved are nitrification and denitrification. The emissions of N2O produced via these two processes are characterized by different levels of regulation, as it depends on the rate of processes, the proportion of N channeled by each process to N2O production and consumption within the same soil which is related to difficulties in transport to the atmosphere. This entails a great difficulty to deepen the knowledge of soil N2O emissions to the atmosphere and its regulation. The ignorance of N2O emission levels and the importance of denitrification as well as their regulation in both natural and agricultural soils is the main starting point of the objectives of this work.

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.
S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.
En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP.
La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.
En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.
En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF.
Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is a gram negative intracellular human pathogen causing gastroenteritis in humans as well as a systemic infection in mice similar to human typhoid fever (which is caused by S. Typhi). One of the main features of S. enterica infection is its capacity to actively invade epithelial cells and proliferate inside macrophages.
S. Typhimurium presents three classes of ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome: class Ia, class Ib and class III. RNRs are essential enzymes because they carry out the de novo synthesis of deoxyribonucleotides (dNTPs), needed for DNA synthesis and repair, by reducing ribonucleotides (NTPs). Up to date, three different classes of RNRs have been described, differing in their mechanism of radical generation, their three-dimensional structure, allosteric regulation and their oxygen dependence. Nevertheless, they all have in common the mechanism of reaction and the use of an organic free radical to initiate catalysis.
This work has studied the transcriptional regulation of the three RNR classes present in S. Typhimurium, giving importance to two main regulators: NrdR and Fur. We have studied the effects of NrdR deletion in each class of RNR gene expression. Our results indicate that NrdR is a repressor of all three classes, but it shows a stronger repression when regulating nrdHIEF expression. We have also described NrdR recognition sites (NrdR boxes) and we have obtained mutant proteins in some residues that affect NrdR functionality in vivo, possibly due to their participation in dATP/ATP union.
Mutation of Fur causes an upregulation of nrdHIEF expression up to five fold compared to the wild type strain. We have detected a putative Fur recognition sequence within the nrdHIEF promoter region. Mutation of this recognition sequence causes an upshift in nrdHIEF expression similar to the level observed in the fur mutant. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) we have confirmed that Fur interacts with the nrdHIEF promoter region.
Under normal conditions, S. Typhimurium uses class Ia RNR to de novo synthesize dNTPs in the presence of oxygen. Class Ia is essential for normal growth and class Ib is not able to complement its mutation unless an extra copy of nrdHIEF is introduced. The presence of two RNRs with redundant activities in the same organism, the fact that other bacterial species use class Ib for dNTP synthesis in then presence of oxygen, and that both E. coli and S. Typhimurium have retained class Ib enzymes during evolution, suggest that this class might be expressed under specific growth conditions.
We have studied the role of RNRs in the virulence of S. Typhimurium SL1344 by means of different mutants and double mutants in each RNR class as well as mutants in their transcriptional regulators (Fur, NrdR). Infection assays performed in macrophage cell lines and epithelial cell lines have allowed to elucidate which RNR is responsible for S. Typhimurium growth during infection. Our results indicate that class Ia is the RNR responsible for invasion and proliferation inside macrophages, while class Ib and class III do not seem to be essential. However, class Ia mutants overexpressing class Ib are capable of surviving the first hours of infection (2-6 h). We think that is in this first stage of the infection process (when the oxidative burst takes place), specific conditions generate and activate nrdHIEF expression. It is possible that hydrogen peroxide concentrations are responsible for the inhibition of the Fur repressor activity. The highest demand of dNTPs due to DNA lesions makes it necessary for an extra dNTP supply that will be provided by the NrdEF enzyme.

L'osteogènesi és un procés del desenvolupament dels vertebrats controlat per molècules senyalitzadores que proporcionen a les cèl·lules mesenquimals la informació necessària per a diferenciar al llinatge osteogènic.

D´entre aquestes, les citoquines de la família BMP (Bone Morphogenetic Protein) estan implicades en nombrosos aspectes del desenvolupament sent especialment importants en el desenvolupament de l'os. La unió d'aquestes BMPs als seus receptors inicia diferents vies de transducció de senyal que es classifiquen com a dependents o independents de Smads.

S'ha comprovat en cultius cel·lulars com les BMP estimulen l'expressió de factors de transcripció específics d'osteoblasts com són Runx2 i Osterix, així com marcadors de la diferenciació osteoblàstica com la Fosfatasa Alcalina, el Col·lagen tipus I o l'Osteocalcina.

Els objectius que ens vam platejar foren:

- Identificació de les vies de transducció de senyals induïdes per BMP-2 i
altres mecanismes moleculars involucrats en l'activació d'Osterix.

a) Anàlisi de la regió promotora d'osterix i identificació de les regions de resposta a BMP-2.
b) Identificació dels factors de transcripció que s'uneixen a aquestes regions i estudi de la seva regulació en resposta a BMP-2.

-Establiment de clons estables induïbles que ens permetin estudiar in vivo la regulació transcripcional d'Osterix.

-Estudi d'altres gens modulats transcripcionalment per BMP-2 i la seva implicació en l'osteogènesi.

El primer pas de la recerca fou aïllar dues seqüències del promotor d'osterix que es troben molt conservades entre humans i ratolins i clonar-les en un vector pGL2 que codifica per un gen reporter luciferasa. Mitjançant la transfecció i la deleció d'aquestes construccions vam observar una seqüència de 55 parells de bases a la regió més proximal que és la responsable de la resposta a BMP-2.

Mitjançant mutagènesi vam identificar una seqüència homeobox palindròmica (TAATTA) que és la responsable de la inducció d'osterix per BMP-2. La proteïna Dlx5, un factor de transcripció involucrat en l'osteogènesi, és capaç d'unir-se i activar el promotor d'osterix en aquesta seqüència. Aquesta observació es complementà amb estudis del patró d'expressió temporal d'aquests gens en que es comprovà que l'activació de Dlx5 per BMP-2 precedeix temporalment a la d'Osterix.

Mitjançant experiments de sobreexpressió i silenciació en cèl·lules C2C12 descrivim que Dlx5 és imprescindible per a l'expressió d'Osterix en resposta a BMP-2. No obstant, els experiments de sobreexpressió també indicaven que la BMP-2 té un efecte additiu a Dlx5 que ens permeté deduir que algun altre mecanisme havia d'estar implicat en l'activació d'Osterix per BMP-2.

Descartada una possible interacció de Dlx5 amb les proteïnes Smad, vam investigar les vies independents de Smads i observàrem que la proteïna p38-MAPK, que també és activada en resposta a BMP-2, és important per a l'activació d'Osterix induïda per BMP-2. Usant una variant constitutivament activa de MKK6, capaç d'activar p38, i SB203580, que és un inhibidor específic d'aquesta via, vam confirmar la fosforilació de Dlx5 per acció de p38 i que aquesta és funcional.

Per tal de confirmar aquestes observacions sobre el promotor del gen osterix endogen, es realitzaren experiments d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) que confirmaren la unió de Dlx5 al promotor d'osterix in vivo que s´incrementa en presència de MKK6 constitutivament activa. També vam observar l'acetilació de la histona H3 en presència de Dlx5 i el paper sinèrgic de l'activitat histona actetil-transferasa de la proteïna p300.

Així doncs, descrivim que Dlx5 integra les vies dependents i independents de Smad en la regulació d'Osterix. A més d'aquests resultats, s'ha estudiat el paper de Msx2 i p53 en la repressió de l'expressió d'Osterix i s'ha identificat un nou gen reprimit per BMP-2 que sembla estar implicat en la regulació del patró d'expressió d'aquest gen.
Commitment of mesenchymal cells to the osteoblast phenotype is controlled by a specific set of transcription factors activated by signals and regulatory pathways. Among them, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) signalling has been shown to be involved in bone formation.

Binding of BMP-2 to its type I and type II receptors induces both Smad dependent and Smad independent signal transduction pathways. BMPs are able to induce osteogenic factors like Runx2 or Osterix, as well as bone phenotype markers such are Alkaline Phosphatase, Collagen or Osteocalcin.

The main objectives for this thesis are:

-Identification of the signal transduction pathways induced by BMP-2 and other molecular mechanisms involved in Osterix activation.
a) Analysis of the osterix promoter region and identification of the BMP-2 responsive regions.
b) Identification of the transcription factors that binds to these regions and study of its regulation by BMP-2.

-To obtain stable inducible clones which allow us to study the Osterix transcriptional activity in vivo.

-To study other BMP-2 modulated genes and its possible role in the osteogenesis.

Our results demonstrate that induction of Dlx5 by BMP-2 mediates Osterix transcriptional activation. First, BMP-2 induction of Dlx5 precedes the induction of Osterix. Second, Dlx5 binds to the BMP-responsive sequences that we indentified in the Osterix promoter. Third, Dlx5 overexpression and knock-down assays demonstrate its role in activating Osterix expression in response to BMP-2.

Furthermore, we show that Dlx5 is a novel substrate for p38-MAPK in vitro and in vivo and that phosphorylated Dlx5 increases the transactivation potential of Dlx5. Thus, BMP activates expression of Osterix through the induction of Dlx5 and its further transcriptional activation by p38-mediated phosphorylation.

In addition, we studied the repressive role of Msx2 and p53 in the Osterix promoter, and indentified a possible new gene involved in the regulation of the Osterix's expression pattern.

Les cèl·lules de llevat, al igual que les cèl·lules eucariotes d'organismes superiors, responen a situacions d'estrès extracel·lular activant la via de les MAP quinases, les quals transdueixen el senyal activant l'expressió de gens necessaris per a mantenir l'homeostasi cel·lular.

Evidències experimentals recents ens indiquen que la nova quinasa Srk1, identificada en el nostre grup en cèl·lules de llevat, participa tant en la resposta a estrès cel·lular com en la regulació del cicle cel·lular (López-Avilés S, Grande M, Gonzalez M, Helgesen AL, Alemany V, Sánchez-Piris M, Bachs O, Millar JB, and Aligue R (2005). Inactivation of the Cdc25 phosphatase by the stress-activated Srk1 kianse in fission yeast. Mol Cell, 17, 49-59).

Pel que fa al paper de la Srk1 en el cicle cel·lular normal, hem descrit que actua inhibint la transició g2/M mitjançant la fosforilació inhibidora de la fosfatsa CDc25, promovent la seva unió a una proteïna 14-3-3 (Rad24 en S. pombe) i la seva posterior exclusió del nucli tal i com s'havia descrit per a la quinasa de checkpoint Chk1.

Pel que fa al paper de la Srk1 en resposta a estrès, estudis paral·lels duts a terme pel grup de la Dra. Quinn van descriure que la Srk1 és fortament induïda en resposta a estrès i que sota aquestes condicions és fosforilada de manera depenent de la MAPK Sty1. Amb la finalitat de determinar la naturalesa d'aquesta fosforilació i la seva rellevància en la resposta a estrès vam realitzar una sèrie d'assajos de fosforilació in vitro que demostren que la Srk1 és fosforilada i activada en la T463 per la MAP quinasa Sty1. A més a més, hem observat que l'activitat i estabilitat de la Srk1 depèn de la presència de la MAP quinasa, ja que en absència de Sty1 la Srk1 no és activa i es degrada via proteasoma. Per altra banda, hem establert el paper de la Srk1 en resposta a estrès: és la responsable d'aturar el cicle cel·lular en la transició G2/M per tal d'evitar que les cèl·lules continuin dividint-se fins que s'hagin adaptat a l'estrès imposat. Aquesta funció la realitza a través de la fosforilació de la Cdc25, promovent la seva unió a Rad24 i exclusió del nucli. A més a més, hem descrit que la fosforilació de la Srk1 per la MAPK és necessària per a que les cèl·lules responguin correctatment a l'estrès.

Finalment, experiments recents indiquen un nou paper de la Srk1 controlant negativament la via de les MAP quinases de resposta a estrès. Hem observat que en absència de Srk1, Sty1 es manté fosforilada durant períodes de temps molt més llargs, fet que suggereix un paper en el mecanisme de silenciament de la via un cop la font d'estrès ha desaparegut o la cèl·lula s'ha adaptat a ella. Els nostres resultats indiquen que la Srk1 fosforila la T225 de la MAPKK Wis1 afectant la seva unió amb la MAPK Sty1, de manera que s'afavoreix la defosforilació per les fosfatses Pyp1 i Pyp2 i s'evita una possible reactivació de la via que resultaria tòxica per a la cèl·lula.
Activation and regulation of the Srk1 kinase in stress response in Schizosaccharomyces pombe

Control of cell cycle progression by stress-activated protein kinases (SAPKs) is essential for cell adaptation to extracellular stimuli. The Schizosaccharomyces pombe SAPK Sty1/Spc1 orchestrates general changes in gene expression in response to diverse forms of cytotoxic stress. Here we show that Sty1/Spc1 is bound to its target, the Srk1 kinase, when the signaling pathway is inactive. In response to stress, Sty1/Spc1 phosphorylates Srk1 at threonine 463 of the regulatory domain, inducing both activation of Srk1 kinase, which negatively regulates cell cycle progression by inhibiting Cdc25, and dissociation of Srk1 from the SAPK, which leads to Srk1 degradation by the proteasome.

Moreover, we have found a possible role for the Srk1 kinase in the inhibition of the MAPK pathway through a negative feedback mechanism. As srk1 gene is highly induced in response to several types of stress in a Sty1-dependent manner, it seems to be necessary to downregulate the pathway. Our results suggest that Srk1 phosphorylates Wis1 at threonine 225 to impair its binding with the MAPK Sty1, in order to avoid the reactivation of the stress response pathway. Therefore, Sty1 will be dephosphorylated and inactivated by the tyrosine phosphatases Pyp1 and Pyp2. The importance of these results lays on the inactivation of a MAPK pathway by a kinase.

El crecimiento de la Sociedad de la Información (SI), y las Tecnologías de la Información y la Comunicación (TIC) por las cuales éste se logra, brinda una particular contribución al sistema productivo. Su adopción masiva “realiza” transformaciones: económicas, políticas, sociales; y, por la convergencia, alcanzan a todo, en el campo de juego único -Internet-, en el cual interactúan todos los agentes. El objetivo de este trabajo es investigar las razones que están afectando el crecimiento de la SI en Perú, medición que se hace a través del Índice de Desarrollo de las TIC (IDT). En sucesivas mediciones, Perú figura con puntaje exiguo en comparación con países pares: tenemos la hipótesis que la regulación de telecomunicaciones causa este decrecimiento, en tanto las TIC reposan en la conectividad de Internet. Usamos las metodologías bibliográfica y comparada de dos extremos en la regulación: mucha, o poca. El modelo teórico utilizado toma en cuenta las características de estos mercados (híper-conectividad, competencia de gigantes digitales, etc.), pero, sobre todo, existencia de competencia. En competencia, la regulación ex ante debe limitarse a brindar las condiciones para que existe auténtica rivalidad, habida cuenta de que es ésta (la competencia), “el mecanismo más eficiente y equitativo para disciplinar mercados y maximizar bienestar social” (Bartolomé & Sáenz, 2016). Y estas condiciones se crean a través de tres regulaciones, de: acceso al mercado; acceso universal; y, fomento de la competencia. Comparamos la regulación entonces en estos tres aspectos. El resultado es que, en Perú, el mercado relevante móvil es el que presenta mayor rivalidad, crecimiento y penetración; y, menor concentración. La conclusión principal es entonces, que el modelo funciona en mercados en los que se ha aplicado y que la regulación debería reformarse para aplicarlo en los mercados relevantes más grandes, eliminando la que no aporta a este fin.
Trabajo de investigación

Esta tesis doctoral aborda los cambios sufridos en la estructura de la televisión en España desde que se produjo el apagón analógico en el año 2010 hasta 2016, año en que se liberó el primer dividendo digital y se lanzaron seis nuevos canales de TDT en abierto. En el mercado de la televisión en abierto en España, durante el periodo de estudio, los dos grandes actores de la etapa analógica, Atresmedia y Mediaset, consolidaron sus posiciones mediante dos grandes procesos de absorción empresarial que, influidos por las políticas públicas nacionales y europeas, y por las dinámicas globales del audiovisual, reforzaron la estructura duopólica en la vertiente privada. Por otro lado, la intervención sobre el espectro radioeléctrico a nivel europeo (tanto con la digitalización misma como con el primer dividendo digital) implicó la entrada de nuevos actores en el mercado en abierto, que sin embargo no han alcanzado un papel relevante en dicho mercado. Paralelamente, los avances tecnológicos y la convergencia del sector audiovisual con el de las telecomunicaciones e Internet han beneficiado la aparición de nuevas fórmulas de distribución televisiva por parte de operadores nacionales y globales emergentes. En el caso español, por un lado, los operadores de telecomunicaciones han retomado su rol central en el mercado televisivo de pago después de una etapa de letargo. Por otro lado, han irrumpido en el mercado nuevos actores, eminentemente globales, que comienzan a moldear la estructura del mercado televisivo español mediante un modelo altamente fragmentado de distribución de tipo long tail. Desde una aproximación híbrida entre tecnología, economía y políticas de comunicación, esta tesis comienza haciendo un repaso a la etapa analógica de la televisión española y su estructura. Posteriormente, detalla cuáles son los actores tradicionales y emergentes presentes en el mercado español entre 2010 y 2016 y su posición en la estructura televisiva nacional. Además, explica los procesos tecnológicos y regulatorios derivados del cambio digital que han afectado al mercado español, para explicar en qué aspectos y tendencias se concreta la transformación de la industria televisiva española entre 2010 y 2016. Para ello, además, se toman en cuenta otras experiencias europeas (Reino Unido, Francia e Italia), con el objetivo de identificar las dinámicas comunes del contexto europeo y las particularidades del caso español.
This thesis inspects the changes that the Spanish television’s structure has undergone since the moment of the digital switchover in 2010 until the release of the first digital dividend and the launch of the last free-to-air channels in 2016. Within this reference period, Atresmedia and Mediaset, the two foremost players leading the free-to-air TV market before the arrival of DTT, strengthened their positions through two large acquisitions. These market concentration processes were influenced by the national and European media policy, as well as by the global dynamics of the audiovisual sector, and they ended up reinforcing the private duopoly in the Spanish market. Besides, the European regulation over the radio spectrum (including the very digitalisation and the first digital dividend) entailed the emergence of new players entering the free-to-air TV market, which nevertheless have not reached a relevant role in the market. In parallel, technological advances, along with the convergence between the audiovisual and the telecommunications and Internet sectors, have fostered the rise of new forms of distributing TV content via Over-the-Top, therefore traditional and emergent players are keen on taking part on the business. In the Spanish case, on the one hand, telecoms have resumed their interest and participation over the pay-TV business after a period of lethargy. On the other hand, emergent players (which are mainly global) have barged into the market and they appear to slightly erode the Spanish television market’s structure through their highly fragmented long tail distribution model. Form a hybrid approach that brings together technology, economy and media policy, this piece of research starts summarizing the years of analogic television in Spain, its main actors, regulation and structure. Subsequently, it defines and classifies the traditional and new actors in the Spanish television market and their position and performance within it between 2010 and 2016. Moreover, it explains the implications resulting from the technological and regulatory changes that affected the television industry after the digital switchover, so as to determine the features and trends in which the transformation particularizes between 2010 and 2016. Finally, in order to identify the common dynamics of the European context, and to highlight the particularities of the Spanish scenario, this thesis also reviews the English, French and Italian television markets during the reference period.