Academic literature on the topic 'Regulación del metabolismo'

Memoria para optar el título de Bioquímico<br>Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015<br>La proteína co-chaperona Bag3 es un factor clave en el control de la autofagia selectiva, un proceso de degradación de proteínas y organelos activado en respuesta a distintos estresores, en tejidos altamente diferenciados, como el músculo esquelético. Este último tejido transforma la energía química del ATP en energía mecánica para la contracción, por lo que el control del metabolismo de la glucosa resulta fundamental para mantener su función fisiológica. En este sentido, insulina, a través de sus efectores intracelulares Akt y mTORC1, promueve el ingreso y metabolismo de la glucosa. No obstante, en condiciones de estrés nutricional la proteína AMPK activa la autofagia para aumentar el metabolismo celular por degradación de diversas macromoléculas. Prueba de esta relación funcional entre metabolismo y autofagia es que la inhibición de la autofagia lleva a resistencia a la insulina en células musculares esqueléticas. Por otro lado, existe evidencia que los ratones knock-out para Bag3 presentan una disminución en los niveles de glucosa e insulina circulantes, y mueren a las 3 semanas de nacimiento con deterioro muscular progresivo. Sin embargo, hasta hoy se desconoce si Bag3 regula el metabolismo energético de la célula, y si las vías que controlan ese metabolismo se relacionan con la autofagia. En vista de estos antecedentes, se investigó si Bag3 altera la señalización de la vía Akt-AMPK-mTORC1, produciendo efectos metabólicos y de autofagia en miotubos L6 (línea celular: músculo esquelético de rata). A través de ensayos de captura de 3H-2-desoxiglucosa, consumo de oxígeno y detección densitométrica de GLUT4-myc en superficie, se determinó que las células con niveles reducidos de Bag3 (RNA interferente) y sin insulina en el sistema, incorporaron mayor cantidad de glucosa por un incremento de transportadores Glut-4 en la membrana celular junto con una mayor capacidad oxidativa mitocondrial. Lo anterior es debido a un aumento de la activación basal de Akt, evidenciado por Western blot contra Fosfo-Ser-473. Además, estas células presentaron una menor capacidad de activar la autofagia debido a un procesamiento disminuido de LC3, además de una menor activación de AMPK (Fosfo-Thr-172) y una sobre-activación de mTORC1 (Fosfo-Ser-2448). Finalmente, en presencia de insulina (100 nM, 20 min), las células con niveles reducidos de Bag3 presentaron una incorporación deficiente de glucosa para la cantidad de transportador Glut-4 exportado a la membrana, y una menor capacidad oxidativa mitocondrial. En estas condiciones, Akt se activó de forma normal ante insulina, observándose sin embargo que AMPK y mTORC1 se activó e inactivó, respectivamente; comportamiento inverso respecto a lo normal. Con estos datos, se propone a Bag3 como un novedoso regulador del metabolismo y la autofagia muscular esquelética<br>The co-chaperone protein Bag3 is a key factor for the control of selective autophagy, a degradation process of proteins and organelles activated in response to stress, in highly differentiated tissues, as the skeletal muscle. The role of the latter is to transform the chemical energy from ATP into mechanical energy for contraction, thus the metabolism control of glucose is important to keep its biological function. In that way, the hormone insulin, by its intracellular effectors Akt and mTORC1, promotes the uptake and metabolism of glucose. However, in nutritional stress conditions the AMPK protein activate autophagy in order to increase cellular metabolism by macromolecular degradation. Proof of this functional relationship between metabolism and autophagy is that autophagy abrogation leads to insulin resistance in muscle cells. On the other hand, there is evidence that shows that Bag3 Knock-out mice present diminished glucose and insulin in blood, and die after 3 weeks from birth with progressive muscle wasting. However, it is not known yet whether Bag3 regulates energy metabolism in the cell, nor whether the pathways that control that metabolism are related with Bag3 mediated autophagy. With this in mind, we decided to determine if Bag3 was able to alter the Akt-AMPK-mTORC1 signaling pathway, leading to metabolic and autophagy effects, in L6 myotubes (cell line: skeletal muscle from rat). By 3H-2-desoxyglucose uptake, oxygen consumption and GLUT4-myc surface detection assays, we were able to determine that cells with reduced levels of Bag3 (interference RNA), and without insulin in the system, had increased glucose uptake because of an augmented Glut-4 translocation to the cell membrane, along with an enhanced mitochondrial oxidative capacity. This is explained by an increased Akt basal activation, evidenced by Phospho-Ser-473 western blot. Furthermore, these cells showed a diminished capacity to produce autophagy, because of a decreased LC3 processing, along with a diminished activation of AMPK (Phospho-Thr-172) and an over activation of mTORC1 (Phospho-Ser-2448). Finally, in the presence of insulin (100 nM, 20 minutes), cells with diminished levels of Bag3 showed a deficient glucose uptake for the amount of Glut-4 transporter exported to cell membrane, and a decreased mitochondrial oxidative capacity. Under these conditions, Akt protein increased its activation, as normal, but AMPK was activated and mTORC1 was inactivated, an inverted behavior with respect to normal metabolism. With these data, we propose Bag3 as a novel regulator of metabolism and autophagy in muscle

Durante la regeneración hepática el contenido de fructosa 2,6-bisfosfato, Fru-2,6-P(2) disminuyó rápidamente (1 h) manteniéndose los niveles bajos durante las primeras 24 h. A partir de este tiempo, los niveles tendieron a recuperarse sin alcanzar los valores control a los 7 días. El contenido de glucógeno mostró un perfil similar siendo la disminución inicial menos rápida (mínimo a las 6 h) y restableciéndose el contenido a los 7 días. Los bajos niveles de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial correlacionan con el incremento de la gluconeogénesis y la disminución de la glucolisis descritos. Posiblemente la causa de la rápida disminución del contenido de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial sea la fosforilación del enzima por la proteína quinasa dependiente de cAMP como así lo sugiere la rápida disminución de la actividad PFK-2 activa (que representa la actividad quinasa de la forma no fosforilada del enzima bifuncional 6-fosfofmcto 2-quinasa/fructosa 2,6-bisfosfatasa, PFK-2/FB/Pasa-2) y del cociente de actividades PFK-2 activa/total (reflejo del grado de fosforilación del enzima bifuncional). Otros factores como la disminución del contenido de hexosas 6-fosfato y el aumento de citrato y fosfoenolpiruvato podrían también contribuir al mantenimiento de estos bajos niveles.<br/><br/>Durante el proceso regenerativo aparece una forma del enzima bifuncional diferente a la del enzima de hígado adulto como lo indica su comportamiento cinético frente al glicerol 3-fosfato y a la incubación con la proteína quinasa dependiente de cAMP. El diferente reconocimiento de esta forma enzimática con anticuerpos específicos de la PFK-2/FBPasa-2 de hígado y con anticuerpos contra toda la proteína sugiere que tiene su extremo amino modificado. Durante todo el proceso proliferativo el ARNm que se expresa es específico de hígado por lo que la modificación del extremo amino no es debida a un alternativo "splicing" del gen sino a alguna modificación post-transcripcional aún no descrita para este enzima.<br/><br/>Los niveles de ARNm del enzima bifuncional disminuyeron rápidamente después de una hepatectomía parcial con un mínimo a las 6 h y aumentando después de este tiempo con un máximo a las 48-60 h, y tendiendo a normalizarse después de este tiempo. Estos niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional, no correlacionando las variaciones del contenido de ARNm con variaciones en el contenido del enzima. La velocidad de degradación del ARNm del enzima bifuncional no se modificó durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial sugiriendo un papel mis importante de la regulación transcripcional durante esta fase.<br/><br/>Los niveles de ARNm de los enzimas considerados reguladores de la glucolisis/gluconeogénesis: glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (L-PK), fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) fueron analizados por "Northern blot". En general, durante la fase pre-replicativa (0-12 h) se observa una disminución del contenido de ARNnl de los enzimas glucolíticos y aumento del de PEPCK. Esta correlación se rompe durante la fase replicativa (>12 h) donde se aprecia la recuperación del mensajero de GK (24 h), junto con elevados niveles de PFK-2FBPasa-2 y PEPCK. El contenido del mensajero de la LPK se recuperó a los 7 días, mientras que los niveles de FBPasa-1 no se modificaron significativamente durante todo el proceso regenerativo. El contenido de ARNm de estos enzimas también fue analizado en los animales laparotomizados y, aunque mostraron algunas modificaciones, éstas fueron mucho menos pronunciadas que en los animales hepatectomizados, normalizándose alrededor de las 24 h.<br/><br/>La administración de glucagón intraperitonealmente (1 mg/kg) produjo sobre el sistema de la Fru-2,6-P(2) (metabolito, enzima, mensajero) una situación similar a la detectada durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial. Así se observó una disminución del contenido de Fru-2,6-P2 en paralelo a la fosforilación del enzima. La actividad PFK-2 total y el contenido de ARNm también disminuyeron. Los niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional observándose una disminución de la velocidad de transcripción del gen en paralelo al contenido del ARNm. Sorprendentemente, la estabilidad del ARNm del enzima bifuncional aumentó en presencia de glucagón sugiriendo que quizás las vidas medias de los<br/>ARNm estimadas mediante este procedimiento "in vitro" no reflejen las vidas medias reales "in vivo". Esta estabilización de los niveles de ARNm en presencia de glucagón también ocurrió para la L-PK y la PEPCK. La estabilización de los ARNm se modificó en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, sugiriendo todos estos datos que en la estabilización de estos ARNm están involucradas proteínas con un recambio rápido y reguladas por un proceso dependiente de cAMP.<br><i>Glycogen and fmclose 2,6-bisphosphate levels in rat liver decreased quickiy after partial hepateciomy. After 7 days the glycogen level was normalyzed and fructose 2.6-bisphosphate concentration still remained low. The active (non-phosphorylaied) fonn of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2) varied in parallel with fructose 2.6- bisphosphate levels. The mRNA of PFK-2/FBPase-2 expressed during the hepatic regeneration is the adult liver form. The kinetic and immunological differences found for PFK-2/FBPase-2 during liver regeneration could reflect some as yet unidentified post-translational change.<br/><br/>The mRNA levels of glucokinase (GK), L-pyruvate kinase (L-PK), PFK-2EBPase-2, fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyurvate carboxykinase (PEFCK) were analyzed during liver regenerartion. The mRNA levels of glycolytic enzymes (GK, PFK-2/FBPase-2 and L-PK) decreased rapidly after partial hepatectomy. GK mRNA increased at 16-24 h, returning to normal values after his time. After six hours the PFK-2/FBPase-2 mRNA increased to a maximum at 48 hours, and returned to normal levels by 96 hours. L-pyruvate kinase mRNA recovered control levels al 168 h. In contrast, phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA increased rapidly after liver resection and remained high during the regenerative process. However, the levels of fructose 1,6-bisphosphatase mRNA, another gluconeogenic enzyme, were not modified significantly. These results correlate with reported rates and enzyme levels of increased gluconeogenesis after partial hepatectomy. The effect of stress on the mRNA levels was also studied. All enzymes showed variations in their mRNA levels following the surgical stress. The differences were more pronounced in regenerating than in sham animals, being practically normalized at 24 h. The rate of gene transcription of PEFCK, PFK-2/FBPase-2 and albumin was measured during liver regeneration. The transcription rate of albumin did not change whereas that of PEPCK was increased >12-fold at 6 hours and remained high during the regenerative process. The rate of gene transcription of PFK-2FBPase-2 decreased by 50 % at 6 hours and increased thereafter with a maximum at 72 hours, and then returned to control values at 96 hours. These results correlate with the mRNA levels and demonstrate that gene inscription of PEFCK and PFK-2FBPase-2 is specifically regulated, and that this regulation is in part responsible for the alterations in hepatic metabolism seen in regenerating liver.<br/><br/>The administration of glucagon reproduced in fructose 2.6-bisphosphate system (meitabolite, protein, mRNA) a similar situation that we have described during the first hours after partial hepatectomy. </i>

Hcm1, es un factor transcripcional de la familia de los forkhead en Saccharomyces cerevisiae. Los factores forkhead se encuentran evolutivamente conservados, desde levaduras hasta humanos. En mamíferos estos factores regulan diversos procesos, entre ellos el ciclo celular, la supervivencia y la proliferación en respuesta a factores de crecimiento. Además, los factores FoxM, FoxO y sus ortólogos, participan en procesos como el envejecimiento y en enfermedades como el cáncer. Los estudios sobre Hcm1 en S. cerevisiae, indican que este factor es un regulador de la formación del spindle pole y de la expresión del cluster de genes necesarios en la fase S del ciclo celular. En el presente trabajo se estudió la regulación de Hcm1 sobre nuevos procesos celulares. En primer lugar, se demostró que Hcm1 regula positivamente la masa mitocondrial, el número de copias de ADN en esta organela y su actividad metabólica. Además, induce la metabolización de la glucosa favoreciendo el proceso oxidativo sobre la fermentación. Este cambio metabólico inducido por Hcm1, viene acompañado por una mayor resistencia celular al estrés. Además, se demostró que Hcm1 responde al estrés oxidativo aumentando su localización nuclear y su actividad transcripcional. Esta misma respuesta se observó cuando las células eran sometidas a restricción de glucosa o nitrógeno. En esta dirección estudiamos los mecanismos regulatorios de estas respuestas y se determinó que Sir2, una histona deacetilasa NAD+-dependiente relacionada con el envejecimiento y el silenciamiento genético, interacciona con Hcm1 y regula la respuesta a estrés de Hcm1. Paralelamente, analizamos la implicación de las vías AMPK y TOR/Sch9 en la regulación de Hcm1. De esta manera, demostramos que ambas vías son reguladoras de la respuesta de Hcm1 a restricción nutricional, ya que experimentos in vitro indicaron que Snf1 y Sch9 fosforilan Hcm1. El análisis de la expresión génica en la cepa salvaje y en el mutante hcm1, en diferentes puntos de la curva de crecimiento del cultivo, indicó que genes que se inducen durante esta cinética, y que están relacionados con el estrés y el metabolismo, son regulados por este factor. Los resultados obtenidos en este trabajo, permiten concluir que, además de su implicación en el ciclo celular, Hcm1 es un factor clave en la adaptación temprana de las células a la restricción nutricional y en la posterior entrada en fase diáuxica, a través de la inducción de metabolismo oxidativo mitocondrial y la respuesta a estrés.<br>Hcm1 is a forkhead transcription factor in Saccharomyces cerevisae. The forkhead factors are evolutionary conserved from yeast to human. In mammals, these factors regulate different processes, among them, cell cycle, cell survival and cell proliferation in response to growth factors. Moreover, FoxO, FoxM and their orthologues have been related to the aging process and cancer. Studies on Hcm1 in S. cerevisae indicate that this factor is related to spindle pole dynamics and the regulation of the cluster of genes required during the S phase of the cell cycle. In this work we studied Hcm1 implication on novel cellular processes. First, we demonstrated that Hcm1 positively regulates mitochondrial mass, mtDNA copy and mitochondrial activity. In addition, Hcm1 favours oxidative metabolism of glucose over its fermentation. This metabolic shift, is accompanied by an increase in cellular stress resistance. In response to oxidative stress treatments, Hcm1 shifts to the nucleus and its transcriptional activity is activated. A similar Hcm1 response was observed when the cells were submitted to glucose or nitrogen restriction. Additionally, we analyzed the regulatory mechanisms behind these responses. We demonstrated that Sir2, a NAD+ dependent histone deacetylase involved in aging and genetic silencing, interacts with Hcm1 and regulates its response to oxidative stress. In parallel, we analyzed the role of AMPK and TOR/Sch9 pathways on Hcm1 regulation. In this context, we observed that both pathways regulate Hcm1 in response to nutrient restriction in vivo. Moreover, Snf1 and Sch9 phosphorylate Hcm1 in vitro. Gene expression analysis on wild type cells and in hcm1 mutant at different points along the growth curve, indicated that genes that are upregulated during this kinetic and are related to stress response and metabolism, are regulated by Hcm1. Taken together, our results indicate that Hcm1 not only regulates cell cycle dynamics, but is also a key factor in the early adaptation of the cells to nutrient deficiency and later, to the entry into the diauxic phase. This adaptation is mediated by Hcm1 induction of oxidative metabolism and stress response.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario<br>Se estudió la plasticidad fenotípica inducida ambientalmente en la capacidad funcional aeróbica en el roedor de desarrollo tardío Phyllotis darwini. Se investigaron las tasas metabólicas basales y máximas (la medición del consumo de oxígeno de un animal es una expresión del metabolismo aeróbico de éste) en animales aclimatados a alta temperatura (bajo requerimiento energético de termorregulación: 30°C) y a baja temperatura (alto requerimiento: 15°C), en diferentes etapas del desarrollo. Se encontraron temperaturas corporales más altas y mayores velocidades de desarrollo en las capacidades termorregulatorias en crías nacidas de madres aclimatadas al frío. Esta diferencia podría ser explicada por efectos maternos sobre la camada, como por ejemplo, altos niveles de catecolaminas y tiroxina, o mayores cantidades de grasa parda como consecuencia de la aclimatación al frío. La exposición de las madres y la mantención del frío en las crías durante el desarrollo temprano serían responsables del alto metabolismo y mayor capacidad termorregulatoria de las crías

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica<br>La acumulación de proteínas mal plegadas dentro de las mitocondrias genera una respuesta transcripcional adaptativa, denominada UPR mitocondrial. A través de esta respuesta, las mitocondrias señalizan hacia el núcleo para aumentar la expresión de genes que permiten restaurar la homeostasis proteica. Sin embargo, se desconoce si además de esta respuesta genética, existe un cambio adaptativo en el metabolismo celular en las etapas tempranas del estrés mitocondrial. El acoplamiento físico-funcional del retículo endoplásmico (RE) con la mitocondria es uno de los principales reguladores del metabolismo mitocondrial, el cual permite el traspaso directo de Ca2+ entre ambos organelos. En la mitocondria, el Ca2+ actúa como cofactor de enzimas que participan en el ciclo de Krebs, potenciando la producción de ATP. No obstante, actualmente no existe información sobre posibles cambios en el acoplamiento mitocondria-RE y su papel durante el estrés mitocondrial. A partir de estos antecedentes, se planteó como hipótesis de esta tesis que la acumulación de proteínas mal plegadas al interior de la mitocondria (UPR mitocondrial) favorece el aumento del metabolismo mitocondrial y el incremento en el contacto funcional entre mitocondria y RE. Para responder esta hipótesis se trabajó con la línea celular HeLa, induciendo el estrés mitocondrial mediante el tratamiento con doxiciclina, antibiótico que inhibe la traducción de proteínas en la mitocondria. De esta forma, se produce un desbalance entre la expresión de las subunidades nucleares y mitocondriales de los complejos respiratorios lo que lleva a estrés por acumulación de proteínas no ensambladas. En estas condiciones se estableció que el tratamiento con doxiciclina produce, entre las 24 y 72 h, un desbalance mito-nuclear de proteínas que son parte de los complejos respiratorios e induce la respuesta frente a este estrés en cuanto a expresión de marcadores de la UPR mitocondrial (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), sin afectar la viabilidad celular. Por otra parte, a tiempos cortos de tratamiento, de entre 2 y 4 h, la doxiciclina aumentó los parámetros metabólicos celulares, como los niveles totales de ATP y el consumo de oxígeno. A estos mismos tiempos de tratamiento, doxiciclina incrementó los contactos físicos y funcionales entre mitocondrias y RE, evaluados mediante colocalización por inmunofluorescencia indirecta y cinéticas de captación de Ca2+ mitocondrial por microscopía confocal. Se puede concluir que el estrés mitocondrial inducido por doxiciclina estimula el acoplamiento RE-mitocondria y una potenciación del metabolismo celular a tiempos tempranos. Estos resultados sugieren que esta respuesta metabólica favorece la adaptación celular frente al estrés mitocondrial<br>The accumulation of unfolded proteins within the mitochondria generates an adaptive transcriptional response, denominated mitochondrial UPR. Through this response, the mitochondria signal back towards the nucleus to increase gene expression that allow restoring protein homeostasis. However, it is still unknown whether, in addition to this genetic response, there is an adaptive change in cell metabolism in the early stages of mitochondrial stress. The physical-functional coupling of the endoplasmic reticulum (ER) with the mitochondria is one of the main regulators of mitochondrial metabolism, which allows the direct transfer of Ca2+ between both organelles. In mitochondria, Ca2+ acts as a cofactor of enzymes involved in the Krebs cycle, enhancing ATP production. However, there is currently no information on possible changes in mitochondrial-ER coupling and its role during mitochondrial stress. From this background, we hypothesized that the accumulation of unfolded proteins inside the mitochondria (mitochondrial UPR) favours the increase in mitochondrial metabolism and in the functional contact between mitochondria and ER. To address this hypothesis, we worked with the HeLa cell line, inducing mitochondrial stress by treatment with doxycycline, an antibiotic that inhibits the translation of mitochondrial-encoded proteins. In this way, there is an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrial subunits of the respiratory complexes leading to a stress by accumulation of non-assembled proteins. Under these conditions, we established that the treatment with doxycycline produces a mito-nuclear imbalance of the proteins, between 24 and 72 h, that are part of the respiratory complexes and induces the response against this stress as an expression of the mitochondrial UPR markers (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), without affecting cell viability. On the other hand, at short treatment times (between 2 and 4 h), doxycycline increased cellular metabolic parameters, such as total ATP levels and oxygen consumption. At these times, doxycycline increases the physical and functional contacts between mitochondria and ER, evaluated by indirect immunofluorescence colocalization and kinetics of mitochondrial Ca2+ uptake using confocal microscopy. In summary, the mitochondrial stress induced by doxycycline stimulates an early mitochondrial-RE coupling and potentiates cell metabolism. These results suggest that this metabolic response favours cellular adaptation to mitochondrial stress<br>Conicyt; Fondecyt; Fondap

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico<br>Tradicionalmente se ha abordado el estudio del control del metabolismo analizando las propiedades de los componentes de un sistema (enzimas, transportadores y otros) aislados del sistema completo. Durante las dos últimas décadas se han desarrollado algunas teorías para analizar el comportamiento de sistemas metabólicos completos con una aproximación sistémica, entre ellas la llamada análisis del control metabólico. Esta teoría considera los sistemas metabólicos como un todo; así, la respuesta del flujo original (δJ) a un pequeño cambio en la actividad de una enzima (δe) será entonces consecuencia de todas las variaciones de las concentraciones de intermediarios. Esta respuesta puede ser cuantificada por el coeficiente de control del flujo. En este trabajo se intentó determinar qué grado de control ejercen en la regulación del flujo de la vía directa de síntesis de glicógeno las enzimas UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa) y glicógeno sintasa (GS), usando como modelo experimental los oocitos en estadio VI de rana Caudiverbera caudiverbera. UGPasa cataliza la reacción UTP + glucosa-1-P ⇔ UDP-glucosa + PPi. Ésta es una reacción que se encuentra en todos los organismos hasta ahora estudiados. Además de su función clave en la síntesis de disacáridos y polisacáridos, la enzima es esencial en la síntesis de la parte carbohidrato de glicolípidos, glicoproteínas y una variedad de metabolitos secundarios. La actividad de UGPasa en extractos crudos de oocitos de C. caudiverbera se midió en el sentido de la formación de UDP-glucosa por electroforesis capilar. Las corridas se realizaron en un capilar no protegido de 57 cm de longitud y 50 μm de diámetro, a un voltaje de 22 kV. La señal del nucleótido se determinó a 254 nm. Cuando se aplicó el método para medir la actividad de la enzima en extractos crudos se obtuvo una curva de tiempo lineal durante un tiempo experimental apropiado. La reacción reversa se midió por el método espectrofotométrico, acoplando y cuantificando la formación de NADPH a 340 nm. La actividad endógena de la enzima en oocitos resultó ser alrededor de 12 mU/oocito. La enzima presenta actividad máxima a pH 8,5. En relación a las constantes cinéticas para los sustratos de la reacción reversa, se encontró que la enzima tiene cinética sigmoidea para pirofosfato, con un K0,5 de alrededor de 460 μM y un nH mayor que 2,0. La cinética para UDP-glucosa es hiperbólica, con una Kmapp de 50 μM. Para la determinación del coeficiente de control de la enzima se procedió a inyectar en los oocitos cantidades crecientes de UGPasa pura. Se usó la enzima comercial de Sigma. Dado que ésta contenía impurezas, se procedió a purificarla por medio de una columna de exclusión molecular. La enzima microinyectada en los oocitos permaneció activa durante el tiempo que duraban los experimentos. El coeficiente de control para la enzima UGPasa en la vía directa de síntesis de glicógeno fué 0,15 y en la vía indirecta, 0,05. La glicógeno sintasa ha sido considerada tradicionalmente la enzima reguladora de la síntesis de glicógeno, pero estudios in vivo han puesto en duda esta afirmación. No existe enzima comercial disponible y no fue posible obtener enzima pura en la concentración adecuada para la microinyección. Como alternativa se procedió a la activación de la enzima por medio de glucosa-6- P. Los experimentos para determinar el efecto de la glucosa-6-P sobre la GS se realizaron microinyectando diferentes concentraciones de glucosa-6-P. Después de 8 min se procedió a la microinyección de UDP-[U-3H]glucosa 3 mM. Después de 12 min de incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. La activación máxima de la enzima fue entre 2 y 3 veces a 2 mM de glucosa-6-P inyectada. El efecto del éster fue transitorio, siendo máximo entre 5 a 10 min. Para la determinación del coeficiente de control se microinyectaeon diferentes concentraciones de glucosa- 6-P. Después de 8 min de incubación los oocitos recibieron [U-14C]glucosa (6 nmoles). Después de 12 min incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. El coeficiente de control para GS en la vía directa de síntesis de glicógeno fue igual a 0,01. Los coeficientes de control de las otras enzimas de la vía han sido previamente determinados en el laboratorio. Para hexoquinasa resultó ser de 0,6 y para fosfoglucomutasa de 0,2. Según el teorema de la suma, la suma de los coeficientes de control de todas las enzimas en una vía metabólica es igual a 1. Para el caso de la síntesis de glicógeno, la suma de los coeficientes de control de las enzimas en la vía directa en oocitos de anfibio fue 0,96. Esta es la primera vez que se determinan todos los coeficientes de control de una vía metabólica completa en un sistema in vivo.<br>Traditionally metabolic control and regulation has been studied by analysing the properties of the system components (enzymes, transporters and others) isolated from the whole system. During the last two decades, new proposals have emerged to analyze the behaviour of complete metabolic systems with a systemic approximation. Among them is the so called Metabolic Control Analysis. This approach considers the metabolic system as a whole; thus, the response of the original flux (δJ) to a small change in the activity of one enzyme (δe) will be then the consequence of all the variations of the intermediate concentrations. This response may be quantified by the flux control coefficient. The aim of this work was to determine the involvement of the enzymes UPD-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS) on the control of the flux through the direct path way for glycogen synthesis. Oocytes stage VI from C. caudiverbera were used as an in vivo experimental model. UGPase catalyzes the reaction UTP + glucose-1-phosphate ⇔ UDP-glucose + PPi. This is a reaction found in all the organisms so far studied. Besides its key function in the synthesis of disccharides and polysaccharides, the enzyme is essential in the synthesis of the carbohydrate part of glycolipids, glycoproteins and a variety of secondary metabolites. The activity of UGPase in crude extracts from C. caudiverbera oocytes was measured in the forward formation of UDP-glucose by capillary electrophoresis. Separations were performed in a non protected capillary of 57 cm long and 50 μm diameter, at a voltage of 22 kV. The signal of the nucleotide was determined at 254 nm. When the method was applied to measure the enzyme activity in crude extracts, a linear time curve was obtained during an appropiate experimental time. The reverse reaction was measured by the spectrophotometric method, coupling and quantitating the formation of NADPH at 340 nm. The endogenous activity of the enzyme in oocytes was about 12 mU/oocyte. The enzyme presents maximum activity at pH 8,5. In relation to the kinetic constants for the substrates of the reverse reaction, it was found that the enzyme has sigmoidal kinetics for pyrophosphate, with a K0,5 of about 460 μM and a nH higher than 2.0. The kinetic for UDP-glucose is hyperbolic, with a Kmapp of 50 μM. To determine the control coefficient of the enzyme, increasing quantities of pure commercial UGPase, were microinjected into the oocytes. Because the enzyme was not homogenous, it was purified by molecular exclusion. The microinjected enzyme inside the oocytes remained active during the time of the experiments. The control coefficient for UGPase in the direct path way for glycogen synthesis was 0.15 and 0,05 in the indirect way. Glycogen synthase has been traditionally considered the regulatory enzyme of glycogen synthesis, but studies in vivo have questioned this statement. There is no commercial enzyme available and it was not possible to obtain pure enzyme in the proper concentration for microinjection in our laboratory. As an alternative, activation of the enzyme by glucose-6-P was chosen. The experiments to determine the effect of glucose-6-P on GS were carried out by microinjecting into the oocytes different concentrations of glucose-6-P. After 8 min, microinjection of 3 mM UDP- [U-3H]glucose was performed. After 12 min incubation, the radioactivity on glycogen was measured. The maximum activation of the enzyme was between 2-3 times at 2 mM glucose-6-P. The effect of the ester was temporary, being maximum between 5 to 10 min. To determine the control coefficient into the cells, different concentrations of glucose-6-P were microinjected . After 12 minutes incubation, the radioactivity in glycogen was measured. The control coefficient for GS in the direct pathway for synthesis glycogen was 0.01. The control coefficient of the other enzymes of the pathway have been previously determined in the laboratory. For hexokinase it was 0.6 and for phosphoglucomutase, 0.2. According to the summation theorem, the sum of the control coefficients of all the enzymes involved in a metabolic path is equal to 1. In the case of glycogen synthesis pathway, the sum of the control coefficients of the enzymes in the direct route in amphibian oocytes was 0.96. This is the first time that all control coefficients for a complete metabolic pathway are determined in a system under in vivo conditions.

El hígado es un órgano capaz de regenerarse. La regeneración hepática precisa de una activación organizada y secuencial de sucesos que conllevan a la recuperación de la masa hepática. Durante este proceso el hígado debe de mantener sus funciones vitales, como el mantenimiento de la homeostasis de glucosa en sangre mediante la glucogenólisis y la gluconeogénesis. En situaciones de estrés, el aminoácido L-alanina es el principal sustrato gluconeogénico captado por el hígado. Este aminoácido se internaliza mediante los transportadores del Sistema A. Estudios previos han demostrado que la proteína Anexina A6 regula el tráfico de membranas en las vías de endocitosis y exocitosis. Esta proteína representa un 0.25% de la proteína hepática total, pero su función en la fisiología de este órgano permanece desconocida. Para determinar su función, se realizó un estudio de regeneración hepática en ratones control (wt) y en ratones que presentan la proteína Anexina A6 deplecionada (AnxA6ko). Los resultados del laboratorio mostraron una baja supervivencia a las 72 horas post-cirugía de los ratones AnxA6ko (18.5±7.5%) en comparación con los ratones wt (90±6.4%) debido a una severa y progresiva hipoglucemia. La administración de glucosa o la expresión de Anexina A6 restrictivamente en el hígado, rescata la supervivencia de los ratones AnxA6ko post hepatectomía parcial. Los hepatocitos aislados de los ratones AnxA6ko mostraron una incapacidad de producir glucosa a partir de L-alanina, debido a que el transportador SNAT4 no puede reciclarse a la membrana plasmática sinusoidal post hepatectomía parcial. Se concluye que la proteína Anexina A6 es esencial para realizar la gluconeogénesis a partir de L-alanina y para una correcta regeneración hepática.<br>The liver is an organ that can regenerate. Liver regeneration requires an organized and sequential activation of events that leads to the recovery of liver mass. During this process, the liver must maintain its vital functions, such as the maintenance of blood glucose homeostasis through glycogenolysis and gluconeogenesis. In stressful situations, the amino acid L-alanine is the main gluconeogenic substrate captured by the liver. This amino acid is internalized by System A transporters. Previous studies have shown that Annexin A6 protein regulates membrane traffic in the endocytic and exocytic pathways. This protein represents 0.25% of total liver protein, but its function in hepatic physiology remains unknown. To determine its function, a liver regeneration study was carried out in control mice (wt) and in mice with Annexin A6 protein depletion (AnxA6ko). Laboratory results showed a low survival at 72 hours post-surgery of AnxA6ko mice (18.5 ± 7.5%) compared to wt mice (90 ± 6.4%) due to severe and progressive hypoglycemia. Both the administration of glucose and the restrictive restoration of Annexin A6 expression in the liver, rescue the survival of AnxA6ko mice after partial hepatectomy. Hepatocytes isolated from AnxA6ko mice showed an inability to produce glucose from L-alanine, because the SNAT4 transporter cannot be recycled to the sinusoidal plasma membrane following partial hepatectomy. In conclusion, the Annexin A6 protein is essential for gluconeogenesis from L-alanine and for proper liver regeneration.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica<br>Las mitocondrias corresponden a una red organelar altamente dinámica e interconectada, mantenida por eventos frecuentes de fisión y fusión. A través de estos procesos, las mitocondrias adoptan diferentes formas en respuesta a señales internas y externas, así como también presentan diferencias de distribución y forma en los diferentes tejidos de los seres pluricelulares. En las células mamíferas, las principales reguladoras del proceso de fusión mitocondrial, corresponden a la GTPasa Mitofusina (Mfn) y la proteína de la atrofia óptica-1 (Opa-1). Aunque la disrupción de la expresión de cualquiera de ellas, disminuye la función mitocondrial, aún no está claro si la regulación fisiológica del metabolismo involucra directamente cambios en la dinámica de este organelo. Los cardiomiocitos corresponden a la unidad funcional básica del corazón, los cuales para funcionar adecuadamente necesitan del aporte continuo y elevado de sustratos metabólicos en la forma de ácidos grasos libres (AGL), glucosa y oxígeno. En el corazón, la insulina regula el ingreso de glucosa al compartimento intracelular, la velocidad de la glicólisis, la síntesis del glicógeno, así como el crecimiento, contractibilidad y sobrevida de los cardiomiocitos. Sus acciones metabólicas son mediadas por la activación del receptor de insulina (RI) y una serie de otras proteínas de señalización río abajo, entre las que se incluyen a la familia de las proteínas sustrato del receptor de insulina (IRS-1 e IRS-2), la proteína fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3-K) y la proteína serina/treonina kinasa Akt. Dado el papel crítico de insulina en el control metabólico y energético del corazón, el principal objetivo de este trabajo consistió en investigar si insulina modifica el metabolismo mitocondrial a través de la regulación de la dinámica. Trabajos recientes han mostrado alteraciones de la maquinaria proteica reguladora de estos procesos en pacientes obesos e insulino-resistentes, haciendo relevante el estudio de la señalización de insulina y su implicancia en la regulación de la morfología mitocondrial. Para probar esta hipótesis, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata se trataron con insulina 10 nM por 0 – 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Green en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microcopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número y volumen promedio de las mitoncondrias. Los resultados muestran que insulina indujo fusión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen mitocondrial promedio (+156%; p<0,001) y una disminución del número de mitocondrias por célula (-60%; p<0,001). Al mismo tiempo, estos cambios, se asociaron a un aumento en los niveles de la proteína Opa-1 (+3,7±1,5; p<0,05) y su colocalización efectiva con Mfn2. Por medio de microscopía electrónica también se observó la aparición de mitocondrias de gran tamaño en el mismo tiempo descrito anteriormente. Sin embargo, bajo estas mismas condiciones experimentales, tanto los niveles de Mfn2 y de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles. Con respecto a la regulación del metabolismo energético, insulina aumentó el potencial de la membrana mitocondrial (+21%; p<0,05), los niveles intracelulares de ATP (+28%; p<0,001) y la respiración celular (+19%; p<0,01). Paralelamente, la transducción de los cardiomiocitos con un adenovirus que codifica para un antisentido contra Mfn2 o un micro RNA dirigido a Opa-1 previno todos los incrementos metabólicos y morfológicos inducidos por insulina antes descritos. Para confirmar si estos resultados también ocurrían en un modelo in vivo, ratones silvestres C57BL6 se sometieron a un clamp euglicémico - hiperinsulinémico por 2 h, extrayéndose los corazones al término del experimento. Insulina aumentó los niveles totales de Opa-1 en el tejido cardiaco (1,8 veces; p<0,001) respecto a los controles así como la respiración (+38; p<0,05) y síntesis de ATP (+50%; p<0,05) en fibras cardiacas aisladas. Finalmente, el tratamiento previo de cardiomiocitos con inhibidores generales de la vía transduccional RI/PI3-K/Akt y del inhibidor específico del complejo mTORc1, rapamicina, previno la fusión mitocondrial inducida por insulina, Este último inhibidor también previno los incrementos en el metabolismo energético y en los niveles de Opa-1, sugiriendo un papel clave del complejo mTORc1 en la señalización río abajo activada insulina, en el control de la dinámica mitocondrial. En conclusión, estos antecedentes colectivamente indican que insulina regula el metabolismo energético en el cardiomiocito a través de un mecanismo dependiente de la fusión mitocondrial y de la vía transduccional Akt/mTORc1.<br>Mitochondria exist as a dynamic network of interconnected organelles that undergo frequent fission and fusion events. Through these processes mitochondria may adopt different shapes in response to internal and external signals and also display particular morphologies and distributions in the many different cell types of higher eukaryotes. In mammalian cells, the main regulators of mitochondrial fusion are the dynamin-related GTPase mitofusin (Mfn) and optic atrophy protein 1 (Opa- 1). Although a disruption in the expression of these proteins impairs mitochondrial function, it is not clear if the physiological regulation of mitochondrial metabolism directly involves changes in mitochondrial dynamics. Cardiomyocytes are the basic functional unit of the heart and in order to function properly, they require a constantly high supply of metabolic substrates in the form of free fatty acids (FFA), glucose and oxygen. In the heart, insulin regulates glucose transport inside the cell, glycolysis rate, glycogen synthesis, growth, cardiomyocyte contractility and survival. The metabolic actions of insulin are mediated through the activation of the insulin receptor (IR) and a series of downstream associated proteins, including the insulin receptor substrate family proteins (IRS-1 and IRS-2), the phosphoinositide 3-kinase (PI3-K) and the serine/threonine kinase Akt. Given the critical role of insulin in the metabolic and energetic control of heart, the goal of this study was to determine if insulin regulates mitochondrial metabolism affecting mitochondrial dynamics. Previous work from other groups had shown that obese and insulin-resistant patients have alterations in the protein machinery of mitochondrial dynamics, further implying insulin signaling in the control of mitochondrial morphology. To prove our hypothesis, cultured rat neonatal ventricular cardiomyocytes were treated with 10 nM of insulin for 0 - 24 h and three-dimensional images of cells were obtained using the mitochondrial dye Mitotracker Green and confocal microscopy. Three hours of insulin treatment promoted mitochondrial fusion as evidenced by an increase in the mean mitochondrial volume (+156%; p<0.001) and a reduction in the mitochondrial number (-60%; p<0.001). These changes were associated with both an increase in the levels of Opa-1 protein (+3.7±1.5; p<0.05) and in its effective colocalization with the protein Mfn2. By means of electronic microscopy we also observed the apparition of giant mitochondria at 3 hours of treatment. However, at these same conditions, we did not find any change in the total levels of Mfn2 or in the constitutive mitochondrial protein, mtHsp70, ruling out mitochondrial biogenesis or degradative processes. Regarding the control of metabolism, the treatment with insulin increased mitochondrial membrane potential (+21%; p<0.05), intracellular levels of ATP (+28%; p<0.001) and oxygen consumption rate (+19%; p<0.01). Transduction of cardiomyocytes with an adenovirus harboring an antisense Mfn2 oligonucleotide or a micro RNA against Opa-1 prevented all the insulin-induced changes in mitochondrial morphology and function. To confirm that these changes also occur in an in vivo model, C57BL6 mice were subjected to hyperinsulinemic-euglycemic clamps for 2 h, at the end of which, hearts were harvested. Relative to controls, insulin increased the total levels of Opa-1 protein by 1.8±0.1- fold; (p<0.001), the ADP-stimulated respiration rate (+38; p<0.05) and ATP synthesis (+50%; p<0.05) evaluated in saponin-permeabilized fibers. Finally, the pre-treatment of cardiomyocytes with general inhibitors of the insulin transduction pathway RI/PI3- K/Akt avoided the insulin induced fusion, while rapamycin, a specific inhibitor of the mTORc1 protein, inhibited fusion and also also prevented the metabolic boost and the Opa-1 protein increase observed after insulin treatment, suggesting an active role for mTORc1, downstream the canonical insulin route in the control of mitochondrial dynamics. These data indicate for first time that insulin acutely regulates mitochondrial metabolism through a mechanism that is dependent upon increased mitochondrial fusion.<br>FONDAP; FONDECYT; MECESUP

Las plantas sintetizan una gran variedad de compuestos isoprenoides esenciales para su crecimiento y desarrollo. Sin embargo, la mayoría de los isoprenoides vegetales se incluyen en el grupo de los metabolitos secundarios y juegan un papel relevante en las interacciones de las plantas con su entorno. Algunos isoprenoides vegetales también son relevantes por su interés biotecnológico. A nivel metabólico todos los isoprenoides se sintetizan a partir de los precursores de 5 átomos de carbono isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP). Las plantas contienen dos vías metabólicas para la síntesis de dichos precursores metabólicos, la vía del mevalonato (MVA) (ubicada en el citosol) y la del metileritritol 4- fosfato (MEP) (ubicada en los plastos). En la actualidad, se conoce relativamente poco acerca de los mecanismos que participan en el control del flujo metabólico a través de la vía MEP y su interrelación con la vía del MVA. En el trabajo desarrollado en esta tesis se han utilizado estrategias de genética reversa para estudiar nuevos aspectos relacionados con la regulación de la biosíntesis de isoprenoides en planta modelo Arabidopsis thaliana. En particular los objetivos abordado se han centrado en el análisis fenotípico, bioquímico y molecular del mutante rif35 de Arabidopsis thaliana. Dicho mutante está afectado en la funcionalidad del gen At1g73470, que codifica para una proteína de función desconocida altamente conservada en todas las plantas y cuya sobreexpresión confiere resistencia a la fosmidomicina, un inhibidor específico de la vía del MEP. Entre los diferentes mecanismos que podrían conferir la resistencia a dicho inhibidor estaría un aumento de la actividad de la enzima diana DXR o un importe de IPP (u otro prenildifosfato) a los plastos, derivado de la vía del MVA. Es por ello que en este proyecto de tesis se ha abordado el estudio detallado de dicho mutante y la caracterización tanto del gen At1g73470 como de las proteínas correspondientes. Dentro de este contexto se han abordado los siguientes objetivos: 1) El estudio genético y fenotípico del mutante rif35 y de mutantes defectivos en el gen At1g73470, 2) La validación de las variantes de splicing descritas para el locus At1g73470 y el estudio de sus patrones de expresión en el mutante rif35 y en la variedad silvestre, 3) Estudios in silico de las proteínas correspondientes a las variantes de splicing del gen At1g73470 y análisis de su localización subcelular , y 4) La generación y caracterización de líneas transgénicas que sobreexpresan de los cDNAs correspondientes a las variantes de splicing de At1g73470.<br>Plants synthesize a large variety of isoprenoid compounds that are essential for growth and development. However, most plant isoprenoids are synthesized as secondary metabolites and play a key role in mediating the interactions of plants with their environment. Some plant isoprenoids are also relevant for their biotechnological interest. All isoprenoids are built from the 5-carbon precursors isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate. Plants contain two pathways for the synthesis from these precursors, the mevalonate (MVA) pathway (located in the cytosol/ER) and the recently elucidated methylerythritol 4- phosphate (MEP) pathway (located in the plastids). At present, very little is known about the regulatory mechanisms underlying the control of the metabolic flux through the MEP pathway and its cross-talk with the MVA pathway. The work in this thesis is based on the use of reverse genetics strategies to get new insights into the regulation of isoprenoid biosynthesis in the model plant Arabidopsis thaliana. The work has mainly focused rif35 mutant. This mutant is affected in the expression of the gene At1g73470, which encodes a protein of unknown function highly conserved among plants. The overexpression of this gene confers resistance to fosmidomycin, a specific inhibitor of the MEP pathway. Among the different mechanisms that may confer resistance to this inhibitor are: the increase in the activity of the target enzyme and the efficient import by the plastid of IPP derived from the MVA pathway. Based on this, the thesis project has focused on the study of the rif35 mutant and the characterization of the At1g73470 gene and the corresponding encoded proteins. This main objective has been addressed through the development of the following specific activities: genetic and phenotypic studies of the rif35 mutant and knock-out mutants defective in the At1g73470 gene; validation of the splicing variants described for the At1g73470 gene and study of their expression pattern in the rif35 mutant and wild type plants; in silico studies of the proteins encoded by the splice variants of the gene and analysis of their subcellular localization; and generation and characterization of transgenic plants overexpressing the cDNAs corresponding to splice variants of the At1g73470 gene.