Dissertations / Theses on the topic 'Reins – Physiologie'

Le cotransporteur Na-K-CI rénal (NKCC2) couple le transport de 4 ions (1 Na+, 1 K+ ou 1 Rb +, et 2 Cr) à travers la membrane apicale de l'anse ascendante de Renle, contribuant à la réabsorption de l'ultrafiltrat glomérulaire. L'épissage alternatif de l'exon 4 engendre 2 variantes appelées ±A¿ et ±F¿ dont la séquence dans le deuxième segment transmem-branaire (tm2) et dans la première boucle intracellulaire (cs1) diffère. Il confère aussi des différences d'affinité ioniques, i.e., ± A ¿ a des Km beaucoup plus bas que ± F ¿ pour tous les ions grâce à des résidus spécifiques que nous avons identifiés par des études mutagéniques, i.e., les résidus 216 et 220 dans tm2 (qui moduleraient l'affinité pour le Rb et Cl, respectivement) et certains résidus de csl incluant 223, 229, 233 et peut être 225 (qui moduleraient l'affinité pour le Cl). À ce stade-ci, notre but principal est d'avancer notre recherche sur la compréhension des déterminants qui confèrent à ± A ¿ et ± F¿ leurs caractéristiques cinétiques propres. Nous savons que les résidus ± modificateurs d'affinité¿ identifiés opèrent en combinaison mais ignorons la séquence des cassettes en ~ant que tel et leur spécificité ionique. Nous avons donc créé des . chimères en interchangeant des paires de résidus entre ± A ¿ et ± F ¿, i.e. résidus 216 et 220 dans tm2, 223 et 225 dans cs1, 223 et 229 dans csl, et 220 et 225 dans tm2-cs1, pour ensuite exprimer les mutants dans des oocytes de Xenopus laevis et analyser leur dépendance à chacun des ions. Nous avons trouvé, de façon fort intéressante, que la cassette 220; 223; 225; 233 modulait l'affinité pour les ions Na+-Cr (incluant le site à haute affinité pour le Cl) et que la 'cassette 216; 225 modulait celle pour le Rb. Toutefois, les résultats obtenus pour l'une des chimères (± F ¿ chez qui les résidus 216 et 220 ont été remplacés par ceux de ± A ¿) avait un comportement inattendu puisque son affinité pour le Rb est demeurée identique à celle de ± F ¿. En conclusion, les résidus de tm2 et csl fonctionnent probablement en synergie pour assurer la coordination ionique par NKCC2. Par ailleurs, nos résultats suggèrent l'existence d'au moins 2 cassettes ± modificatrices d'affinité ¿, l'une pour le Na-Cl et l'autre pour le K-Cl.

Dans le but d'évaluer l'influence de l'infection rénale sur la toxicité de la gentamicine, une pyélonéphrite expérimentale à Escherichia coli est induite chez les rats. Plusieurs groupes d'animaux : infectés, traités ou infectés et traités ont été étudiés. Deux traitements à la gentamicine furent institués: 1- 10 mg/kg Q8H et 2- 30 mg/kg Q8H, pendant 3 jours. Plusieurs paramètres de toxicité rénale ont été analysés soient : la diurèse, l'osmolalité urinaire, la protéinurie, la B-galactosurie et Y-glutamyltransférase. Que ce soit a basse ou à haute dose, l'infection rénale semble potentialiser la néphrotoxicité de la gentamicine
Montréal Trigonix inc. 2018

Si les concepts utiles à l'évolution technologique des poumons artificiels étaient pour la plupart connus au début de leur utilisation, il a fallu 30 ans pour les concrétiser d'un point de vue application industrielle. Il est important, pour l'établissement du cahier des charges, de souligner les contraintes physiologiques inhérentes aux échanges respiratoires. L'importance du rôle joué par les hématies doit être rappelé : elles sont essentielles pour le transport d'oxygène, d'où la nécessité d'assurer un débit de sang minimum dans un tel appareil. Elles sont nécessaires à l'élimination du CO2 par leur équipement enzymatique (anhydrase carbonique). Des échangeurs à interface gaz-sang aux échangeurs dans lesquels une membrane sépare les phases, il a fallu 25 ans de recherche et de développement portant sur la chimie des polymères et la plasturgie, la modélisation, la conception de moyens de production industrielle. Ainsi ont été utilisés des appareils à fils sanguin (disques) réutilisables, des bulleurs à usage unique produits en série, des poumons à membrane pleine disposée en poche, puis à membrane microporeuse, enfin des poumons à faisceaux de capillaires. La mise au point de méthodes d'évaluation a été réalisée. Ces techniques s'utilisent suivant le stade de développement des appareils. Les méthodes ex vivo et in vivo s'adressent à des appareils dont la conception est fixée et pour lesquels ces essais sont nécessaires comme pré-requis avant utilisation en clinique humaine. Les méthodes d'évaluation in vitro sont celles qui s'avèrent les plus utiles dans la phase initiale d'élaboration, comme dans la phase finale de contrôle de qualité lors de la fabrication. L'utilisation de tests à l'eau (ou soluté ad hoc) trouve sa légitimité dans sa facilité de codification et sa relativement bonne corrélation prédictive avec les méthodes ex vivo en sang. Ceci est particulièrement vrai pour l'étude du CO2. Les méthodes facilitant les transferts sont présentées en particulier pour l'élimination du CO2 sous de faibles débits sanguins dérivés. Mais dans ce cas le recours au rein artificiel s'avère la solution la plus efficace.

Le cytomégalovirus est une cause infectieuse majeure de morbi-mortalité après une transplantation rénale. Une meilleure connaissance des acteurs du système immunitaire impliqués dans la réponse contre le CMV et de l'effet des médicaments immunosuppresseurs sur ces acteurs permettrait d'améliorer la prise en charge des patients. Nous avons précédemment démontré que les lymphocytes T γδ (LTγδ) (et plus particulièrement les populations n'exprimant pas la chaine Vδ2 du TCR) avaient des caractéristiques de cellules adaptatives et étaient des cellules effectrices clés répondant au CMV et associées à la guérison. Dans un premier temps, nous avons analysé le répertoire et les fonctions des lymphocytes T γδ Vδ2neg naïves pour mieux connaître leurs propriétés "innées" grâce à une analyse transcriptomique à l'échelle de la cellule (single cell RNASeq). Deuxièmement, un sous-groupe de LTγδ, les Vγ9negVδ2pos ayant également des caractéristiques adaptatives a été récemment décrit chez l'adulte. Nous avons montré que ces LTγδ Vγ9negVδ2pos sont également des composants de la réponse immunitaire contre le CMV tout en présentant des caractéristiques distinctes de celles des LTγδ Vδ2neg. Notamment, les LTγδ Vγ9negVδ2pos étaient le seul sous-groupe de LTγδ dont l'expansion était corrélée à la gravité de la maladie à CMV. Par conséquent, ce travail évalue un nouvel acteur dans la réponse immunitaire contre le CMV et ouvre des perspectives cliniques intéressantes pour l'utilisation des LTγδ Vγ9negVδ2pos comme immuno-marqueur de la gravité de la maladie à CMV.Enfin, nous avons analysé l'effet des inhibiteurs mTOR (mTORi), traitement anti-rejet utilisé en transplantation rénale, sur les lymphocytes T spécifiques du CMV. En effet, les mTORi sont associés à une moindre incidence d'infection à CMV chez les receveurs séropositifs (R+) de greffes de rein (KTR) mais leur impact sur la réponse T n'est pas connu. Nous avons émis l'hypothèse que la réactivation du CMV chez les patients R+ pourrait être due à une dysfonction des lymphocytes T qui pourrait être améliorée par les mTORi. Nous avons d'abord montré que les lymphocytes T alpha-bêta et gamma-delta présentaient un phénotype plus dysfonctionnel (LAG3+, TIM3+, PD-1+, CD85j+) à la transplantation chez les 16 R+ KTR chez qui survenait une réactivation sévère du CMV par rapport aux 17 patients sans reactivation ou avec une infection spontanément résolutive. Les patients sous mTORi (n=27) avaient une proportion diminuée de lymphocytes T alpha-beta et gamma-delta PD-1+ et CD85j+ par rapport aux patients traités par acide mycophénolique (MPA) (n=44), ce qui était corrélé avec une fréquence et une gravité moindre des infections à CMV. Les patients sous mTORi présentaient également des proportions plus élevées de lymphocytes T cytotoxiques. In vitro, les mTORi augmentaient la prolifération, la survie et la production d'interferon-gamma contre le CMV par les lymphocytes T alpha-beta et gamma-delta. Les proportions de cellules PD-1+ et CD85j+ étaient également diminuées sous mTORi dans les deux sous-populations et leur profil majoritaire devenait "EOMES low/ Hobit high". Dans les lymphocytes T gamma-delta, l'effet des mTORi était lié à une augmentation de la signalisation TCR. Ces résultats révèlent (i) qu'une réplication sévère du CMV est associée à un profil dysfonctionnel des lymphocytes T et (ii) que les mTORi améliorent leur aptitude de façon associée au meilleur contrôle du CMV. Le phénotype de lymphocytes T dysfonctionnel pourrait représenter un nouvel immuno-marqueur chez les patients R+ pour prédire l'infection post-transplantation et aider à stratifier les patients qui devraient bénéficier du traitement mTORi
Cytomegalovirus is a major infectious cause of mortality and morbidity following transplantation and a better knowledge about the immune cells acting against CMV and about their response to immunosuppressive drugs would help to better manage this life threatening infection. We have previously demonstrated that the tissue-associated adaptive Vδ2neg γδ T-cells are key effectors responding to CMV and associated to recovery. We analyzed here the repertoire and functions of naive Vδ2neg γδ T-cells to know better their "innate" properties against CMV. Secondly, an additional Vγ9negVδ2pos subgroup with adaptive functions has been recently described in adults. We demonstrated that these Vγ9negVδ2pos T-cells are also components of the CMV immune response while presenting with distinct characteristics from Vδ2neg γδT-cells. Notably Vγ9negVδ2pos T-cells were the only γδ T-cell subset which expansion tightly correlated with the severity of CMV disease. Consequently, we identified a new player in the immune response against CMV and open interesting clinical perspectives for using Vγ9negVδ2pos T-cells as an immune marker for CMV disease severity in immunocompromised patients.Finally, we analyzed the effect of mTOR-inhibitors (mTORi), immunosuppressive drugs, on CMV-specific T cells. Indeed, mTORi are inexplicably associated with a lower incidence of CMV infection in seropositive (R+) kidney transplant recipients (KTR). We hypothesized that CMV reactivation in R+ patients could be due to dysfunctional T cells that might be improved by mTORi. First we showed that both alpha-beta and gamma-delta T cells displayed a more dysfunctional phenotype (LAG3+, TIM3+, PD-1+, CD85j+) at day 0 in the 16 R+ KTR with severe CMV reactivation when compared to the 17 with spontaneously resolving or without CMV reactivation. Second, treating patients with mTORi (n= 27) decreased the proportion of PD-1+ and CD85j+ alpha-beta and gamma-delta T cells when compared to mycophenolic acid (MPA) treated patients (n=44), which correlate with the frequency and severity of CMV infections. mTORi-treated patients also lead to higher proportions of late-differentiated and cytotoxic gamma-delta T cells and increased percentages of IFN-gamma producing and cytotoxic alpha-beta T cells. In vitro, mTORi increased proliferation, survival and CMV-induced IFN-gamma-production of alpha-beta and gamma-delta T cells. mTORi also decreased PD-1 and CD85j expression in both subsets and shifted to a more efficient EOMESlow Hobit high profile. In gamma-delta T cells mTORi effect was related to increased TCR signaling. Those results reveal (i) that severe CMV replication is associated with a dysfunctional T cell profile and (ii) that mTORi improve their fitness in association with a better control of CMV. Dysfunctional T cell phenotype could represent a new biomarker in R+ patients to predict post-transplantation infection and help to stratify patients who should benefit from mTORi treatment

La PTHrP, protéine apparentée à l’hormone parathyroïdienne (PTH), est exprimée de façon ubiquitaire et agit localement, dans divers processus physiologiques. Cette thèse apporte des données nouvelles sur la PTHrP tant dans le domaine cardio-vasculaire que sur sa contribution à la fibrose rénale. Par l’utilisation d’un modèle d’excision conditionnelle de la PTHrP (souris SMA-CreERT2/PTHrPL2/L2), nous avons pu évaluer l’importance de la PTHrP endogène dans la régulation de l’hémodynamique cardio-vasculaire et rénale en condition physiologique normale, mais aussi lorsque le rein s’adapte à une surcharge saline isotonique. La délétion de l’expression de la PTHrP dans les muscles lisses vasculaires ne modifie pas la pression artérielle, mais conduit à une baisse du débit sanguin rénal, du débit de filtration glomérulaire et de la concentration plasmatique de rénine. La PTHrP induit la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et l’accumulation de matrice extra-cellulaire (MEC) sur des cellules épithéliales rénales d’origine humaine (HK-2). L’ensemble des données fait apparaître la PTHrP comme un facteur d’amplification des effets du TGF-beta1, notamment sur la synthèse de MEC. Elle est surexprimée en réponse au TGF-beta1 et contribue à son auto-induction. Elle active aussi une voie complémentaire d’induction de la TEM et de la fibrose, la voie Wnt/beta-caténine. Ce rôle a été confirmé in vivo dans un modèle expérimental de fibrose tubulo-interstitielle par ligature unilatérale de l’uretère (UUO), où un traitement par un anticorps neutralisant la PTHrP diminue l’expression du TGF-β1 et réduit la fibrose rénale, l’infiltration des lymphocytes T et des monocytes/macrophages
Parathyroid hormone (PTH)-related protein or PTHrP is ubiquitously expressed and acts locally in many physiological processes. Many studies have established that exogenous applied PTHrP or PTHrP overexpression in mice induces hypotension and vasodilatation, namely in the renal vasculature. More recently, PTHrP has also been involved in inflammation and fibrosis. This thesis provides new data about the cardiovascular effects of PTHrP as well as its contribution to renal fibrosis. Using a mouse model which allows conditional knockout of PTHrP (SMA-CreERT2/PTHrPL2/L2 mice), we were able to evaluate the importance of endogenous PTHrP in the regulation of cardiovascular and renal hemodynamics under physiological conditions but also in response to an isotonic saline overload. PTHrP deletion in vascular smooth muscle cells had no effect on blood pressure, but decreased renal blood flow, glomerular filtration rate, and plasma renin concentration. PTHrP elicited epithelio-mesenchymal transition (EMT) and extracellular matrix (ECM) synthesis on human kidney epithelial cells (HK-2). Our work presents PTHrP as an amplification factor for TGF-beta1 on ECM synthesis. TGF-beta1 induced massive overexpression of PTHrP and PTHrP contributed to TGF-beta1 auto-induction. Moreover, PTHrP activated another pathway for EMT induction and fibrosis, the Wnt/beta-catenin pathway. The contribution of PTHrP was confirmed in vivo, on an experimental model of tubulo-interstitial fibrosis induced by unilateral ureter ligation (UUO), in which a treatment with a PTHrP neutralizing antibody decreased TGF-beta1 mRNA, renal fibrosis, as well as lymphocytes T and monocytes/macrophages infiltration

Le fer est un élément essentiel pour la plupart des formes de vie, mais le fer en excès devient toxique. L'hepcidine, un peptide antimicrobien, synthétise principalement par le foie, est le régulateur de de l'homéostasie du fer. L'hepcidine agit en inhibant l'absorption intestinale du fer et son recyclage par les macrophages. La régulation de la synthèse de l'hepcidine est extrêmement complexe et répond à de multiples stimuli. En effet, l'hepcidine est stimulée par le fer et l'inflammation, et elle est réprimée par la carence en fer et par toutes les situations qui stimulent l'activité erythropoïétique. La voie de régulation la mieux caractérisée est la voie BMP6/SMADS. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la synthèse de l'hepcidine et son rôle dans différentes situations physiologiques et physiopathologiques : 1 - rôle du BMP6 dans l'hemochromatose hereditaire (hh) chez l'homme. L'HH est caractérisée par une surcharge en fer qui peut être à l'origine de complications graves. Notre travail décrit pour la première fois l'implication du gène bmp6 dans le développement de surcharges en fer chez l'homme. 2 - le rein a longtemps été négligé pour son rôle dans l'homéostasie du fer. Nos résultats indiquent que le rein est capable de synthétiser l'hepcidine et que cette production locale de l'hepcidine pourrait jouer un rôle essentiel dans le controle du fer renal et urinaire. 3- le rôle physiologique de l'hepcidine dans les infections urinaires (iu) a été étudié. Nos résultats indiquent que l'hepcidine participe à la défense antibactérienne rénale, et suggèrent que UPEC peut réprimer la production rénale de l'hepcidine pour échapper aux défenses de l'hôte
Iron is an essential element for nearly every living organism, but excessive iron accumulation is highly toxic. Hepcidin, an antimicrobial peptide synthesized mainly in the liver, is the key regulator of iron homeostasis. Hepcidin controls the major fluxes of iron by inhibiting the intestinal iron absorption and the delivery of recycled iron from macrophages. Hepcidin synthesis is highly complex and modulated by different stimuli. Indeed, hepcidin is stimulated by iron and inflammation, and is repressed by iron deficiency and all situations that stimulate erythropoietic activity. The best-characterized regulatory pathway of hepcidin expression is theBMP6/SMADS signaling. Herein, we studied the regulation of hepcidin synthesis and its role in various physiological and pathophysiological situations: 1 - involvement of BMP6 in hereditary hemochromatosis (hh) in humans. Hh is characterized by abnormal iron loading in parenchyma leading to serious complications. Our study describes for the first time the involvement of bmp6 gene in the development of iron overload in humans. 2 - the role of kidney in iron homeostasis has long been overlooked. Our results indicate that the kidney is able to synthesize hepcidin and that local hepcidin synthesis may play a key role in the control of renal and urinary iron content. 3 - the physiological role of hepcidin in urinary tract infection (uti) has been studied. Our findings indicate that hepcidin participates to renal antibacterial defense and suggest that upec may repress renal production of hepcidin to evade renal host defenses

L'érythropoïétine, hormone régulatrice de l'érythropoïèse, est synthétisée principalement par les fibroblastes rénaux interstitiels. Cette synthèse est sous le contrôle du facteur de transcription HIF2a dont l'abondance protéique est régulée par une prolylhydroxylase (PHD2). L'activité optimale de PHD2 nécessite la présence simultanée d'oxygène et de fer. Il est maintenant démontré que dans des conditions d'hypoxie ou de défaut d'érythropoïèse, PHD2 est inhibée et HIF2a est stabilisé aboutissant ainsi à une stimulation de la transcription du gène codant pour l'érythropïétine (EPO). Cependant, très peu de données existent concernant l'implication du fer et de l'hepcidine dans ce processus. L'hepcidine est un petit peptide hyposidérémiant qui est considéré comme le pivot de l'homéostasie du fer. Elle est d'origine principalement hépatique mais elle est également synthétisée par le rein, ce qui suggère sa participation à l'homéostasie rénale du fer. Notre objectif à travers ce travail était d'explorer le métabolisme du fer dans le rein et sa régulation par l'hepcidine ainsi que les mécanismes par lesquels le contenu rénal en fer peut jouer un rôle dans la régulation de l'EPO rénale. Dans le modèle d'hémochromatose Hepc-i-, nous avons mis en évidence une surcharge martiale dans le rein, particulièrement marquée dans la médullaire rénale. Des études de colocalisation avec des marqueurs spécifiques des différents segments du néphron ont montré que le fer s'accumule au niveau de la branche large ascendante de l'anse de Henle (TAL). Des dépôts de fer ont été observés par microscopie électronique dans les cellules tubulaires mais aussi dans les fibroblastes rénaux responsables de la synthèse de l'EPO. L'étude de la régulation des transporteurs DMT1, TFR1 et FPN et du transport trans-épithélial dans des lignées tubulaires rénales TAL (Thick Ascending Limb) et OK (Oppossum Kidney) a révélé un rôle important de DMT1 dans le phénotype de surcharge rénale en fer observé dans le modèle Hepc-/-. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence une régulation locale du contenu rénal en fer par l'hepcidine. A travers l'étude des niveaux d'expression de l'EPO dans le rein et de l'hepcidine hépatique et rénale dans des modèles de phlébotomie, de régimes variés en fer et d'inflammation systémique et locale, nous montrons que l'hepcidine, en régulant le contenu rénal en fer, joue un rôle important dans la modulation de la réponse en EPO. Des études in vitro sur des fibroblastes rénaux producteurs d'EPO, ont montré que l'expression de cette hormone est négativement régulée par le contenu intracellulaire en fer. Nos données indiquent que l'hepcidine, en régulant le transport transépithélial du fer dans le néphron distal, peut exercer un contrôle sur la production d'EPO par les fibroblastes interstitiels
Erythropoietin, the erythropoiesis regulating hormone, is mainly synthesized by renal interstitial fibroblatsts. This synthesis is under the control of the transcription factor HIF2a, which is regulated by the prolylhydroxylase PHD2. The optimum activity of PHD2 requires simultaneous availability of oxygen and iron. It is now clear that, under hypoxia or defective erythropoiesis, PHD2 activity is repressed and HIF2a is stabilized leading to the stimulation of erythropoietin (EPO) gene expression. However, little is known about the implication of iron and hepcidin in this regulation mechanism. Hepcidin is- a little peptide first known as antimicrobial but also considered today as the pivotai regulator of iron homeostasis. It decreases plasma iron by reducing its intestinal absorption and release from spleen and liver macrophages. Plasma hepcidine mainly originates from the liver but recent reports indicate that it is also locally synthesized in other organs including the kindney, suggesting a role for hepcidin in the regulation of renal iron content and therefore in the regulation of renal EPO synthesis. The study of hemochromatosis model Hepc-/-, revealed an iron overload in the kidney, especially in the medullar region. Colocalization studies, with specific markers of different tubular sections, showed that iron accumulates in the thick ascending Limb of the Henle's loop (TAL). By electron microscopy, we observed iron deposits not only in tubular cells but also in interstitial fibroblasts, responsible for EPO synthesis. The study of the regulation of iron transporters (DMT1, TfR1 and FPN) and trans-epithelial iron transport in tubular TAL and OK cell lines revealed that DMT1 plays an important role in the Hepc-i- renal iron overload phenotype. These results allowed us to evidence a local, hepcidin dependent, iron homeostasis regulation in the kidney. Using several models in with variable iron status, liver and kidney hepcidin and EPO expression in the kidney (Phlebotomy, iron restricted diet ,systemic and renal inflammation), we show that hepcidin by regulating renal iron content plays an important role in the modulation of EPO response. In vitro studies on renal EPO producing cells (REPC) suggest that the expression of this hormone is negatively regulated by intracellular iron content. Our results, taken together, suggest that hepcidin, by regulating iron transepithelial transport ir the distal nephron, could exert a control on EPO production in interstitial fibroblasts

Le tubule proximal participe à la diurèse en modifiant la composition de l'ultrafiltrat glomérulaire. Grâce à de nombreux transports transépithéliaux, il le glucose, les acides aminés et les protéines de bas poids moléculaires, ainsi que 80 % des ions HPO42- ou HCO3-, 60 % des ions Na+, Cl-, K+, Ca2+, 75 % de l’eau et 30 % des ions Mg2+ ultrafiltrés.Durant ma thèse, j'ai étudié les rôles physiologiques et physiopathologiques de deux protéines de transport exprimées dans le tubule proximal.Dans le cadre de ma première étude, j'ai évalué in vivo la fonction rénale de souris n'exprimant pas une protéine appelée Kir4.2, dont le rôle est inconnu. Nos résultats montrent que Kir4.2, associée à Kir5.1, forme un canal potassique basolatéral Kir4.2/Kir5.1 dans le tubule proximal. L'absence de Kir4.2 provoque chez la souris une acidose tubulaire proximale isolée, consécutive à une ammoniogénèse altérée. De fait, la perte de fonctionnalité de Kir4.2 pourrait être à l'origine d'acidoses tubulaires proximales isolées familiales idiopathiques.Dans le cadre de ma seconde étude, j'ai analysé in vitro la fonctionnalité d'un mutant pathogène de l'échangeur 2Cl-/H+ ClC-5 impliqué dans la maladie de Dent. Cette maladie, caractérisée par une protéinurie de bas poids moléculaire associées à divers troubles du tubule proximal, serait liée à un défaut d'acidification des endosomes précoces par ClC-5. Toutefois, le mutant de ClC-5 que nous avons étudié, converti en canal chlorure, acidifie autant les endosomes précoces que le ClC-5 sauvage. Surprenants, ces résultats suggèrent que la maladie de Dent puisse être causée par un défaut d'accumulation d'ions chlorure dans l'endosome
The proximal tubule is involved in diuresis by modifying the content of the glomerular ultrafiltrate. Using a variety of transepithelial transports systems, it reabsorbs all ultrafiltrated glucose, amino-acids and low molecular weight proteins, as well as 80% of HPO42- and HCO3- ions, about 60% of Na+, Cl-, K+, and Ca2+ ions, 75% of water and 30% of Mg2+.During this thesis, I determined the physiological and physiopathological roles of two transport proteins present in proximal tubule. Firstly, I evaluated the renal function of mice invalidated for the Kir4.2 protein, whose role was undetermined. Our results show that Kir4.2, in association with Kir5.1, form a Kir4.2/Kir5.1 potassium channel at the basolateral membrane of proximal tubular cells. Furthermore, Kir4.2-null mice exhibit a reduced ammoniagenesis leading to an isolated proximal renal tubular acidosis. This study provides the gene encoding Kir4.2 as a candidate gene for the yet unexplained autosomal dominant isolated proximal renal tubular acidosis.Secondly, I evaluated in vitro the functional consequences of a pathogenic mutation of the 2Cl-/H+ exchanger ClC-5, involved in Dent’s disease. This disease, characterized by a low-molecular-weigth-proteinuria in the context of a general proximal tubule dysfunction, is currently thought to be due to an acidification defect of early endosomes linked to a loss of function of ClC-5. Surprisingly, our results show that ClC-5, converted into a chloride channel by this mutation, indeed acidifies the early endosomes as well as the ClC-5 wild-type. Thus, Dent’s disease may originate from a defect in the accumulation of chloride ions into the early endosomes

Au cours des dernières années, l’étude des formes héréditaires de podocytopathies a permis d’identifier de nombreux gènes codant des protéines podocytaires, et de préciser la structure et le fonctionnement de la barrière de filtration glomérulaire. Par une analyse mutationnelle conduite sur une cohorte de 139 patients avec un syndrome néphrotique, nous avons identifié 9 nouvelles mutations du gène PLCE1. De façon inattendue dans une maladie autosomique récessive, nous avons observé une pénétrance incomplète dans 3 familles suggérant une oligogénie ou le rôle de gènes modificateurs et/ou de facteurs environnementaux, bien que le criblage de 19 gènes candidats n’ait pas permis d’identifier de variant causal. Par ailleurs, nous avons confirmé le rôle prépondérant du gène INF2 dans les podocytopathies autosomiques dominantes. Nous avons montré que la majorité des mutations se situe dans le domaine N-terminal de la protéine qui joue un rôle dans son autoinhibition en se liant à son domaine C-terminal, mais qui interagit également avec IQGAP1, autre protéine du podocyte et du cytosquelette. Enfin, du fait de l’interaction connue entre INF2, MAL et Cdc42, actrices essentielles de la myélinisation périphérique, nous avons émis l’hypothèse qu’INF2 pourrait être impliqué dans l’association particulière d’une podocytopathie avec la neuropathie de Charcot-Marie-Tooth. Nous avons criblé 16 familles et effectivement identifié une mutation chez 75% d’entre elles. Nous avons montré l’expression d’INF2 et de MAL dans le nerf périphérique, ainsi que leur colocalisation et interaction dans les cellules de Schwann, et observé une altération de l’interaction des mutants d’INF2 avec Cdc42
During the last decade, the identification of several podocyte genes in hereditary forms of podocytopathies has allowed to refine the glomerular filtration barrier structure and function. We conducted a mutational analysis on a worldwide cohort of 139 patients with nephrotic syndrome and identified 9 novel mutations of the PLCE1 gene encoding the phospholipase Cε1. Surprisingly in an autosomal recessive disease, we observed an incomplete penetrance in 3 pedigrees suggestive of oligogenic inheritance or genetic and/or environnemental modifiers, although the screening of 19 candidate genes failed to identify a causative variant. We confirmed the major role of INF2 encoding a diaphanous-related formin in autosomal dominant podocytopathies. We showed that most INF2 mutations are located in the N-terminal domain of the protein which is involved in its autoinhibition through the binding to its C-terminus, and also interacts with another podocyte and cytoskeletal component IQGAP1. Since INF2 interacts with MAL (Myelin And Lymphocyte protein) and the Rho GTPase Cdc42, essential players of the peripheral myelination process, we hypothesized that INF2 mutations could be involved in the intriguing association of a podocytopathy with the Charcot Marie Tooth peripheral neuropathy. We screened a cohort of 16 families with this neurorenal phenotype and identified mutations in 75% of them. We showed that INF2 is expressed in Schwann cells, where it colocalizes and interacts with MAL, and that mutations in INF2 alter INF2 interaction with Cdc42. This suggests that INF2 mutations could disturb the INF2-MAL-Cdc42 pathway and its role in myelin formation and maintenance

Chez les vertebres, l'erythropoiese resulte de la differenciation d'une sequence de progeniteurs issus de la cellle souche hematopoietique pluripotente. Les techniques de culture clonale ont permis la caracterisation de trois types de progeniteurs erythropoietiques: la bfu-e precoce (bfu-ep), la bfu-e tardive (bfu-et) et la cfu-e. La differenciation de ces progeniteurs est controlee in vitro par deux principaux types de regulateurs: 1) les molecules a activite bpa (burst promoting activity) qui supportent la proliferation des bfu-e. Les principales cytokines a activite bpa sont l'il3, l'il4, l'il9, le gm-csf, l'epa, l'hilda/lif et l'activine; 2) l'erythropoietine (epo) qui assure la differenciation des cfu-e et dont la presence est egalement necessaire a la differenciation terminale des bfu-e. Dans les cultures a long terme de moelle osseuse, l'erythropoiese reste bloquee, en l'absence d'apport exogene d'epo, au stade de la bfu-et. L'addition d'epo aux cultures a long terme induit la differenciation des progeniteurs erythroides et la synthese de molecules capables de stimuler la croissance des bfu-et en milieu semi-solide. Ces molecules ont ete appelees mbpa (mature burst promoting activity) en raison de leur specificite d'action sur les bfu-et (bfu-e matures en anglais). Nous avons montre que le mbpa est stocke dans les cellules stromales de cultures a long terme et que son emission dans le surnageant est liee a la stimulation des cultures a long terme par l'epo. Afin de caracteriser les molecules a la base de cette activite, nous avons immortalise une lignee de cellules stromales qui produit de maniere constitutive le mbpa: la lignee n. A partir du milieu conditionne par cette lignee, nous avons demontre que l'activite bpa observee etait due a une ou plusieurs proteines glycosilees et fortement hydrophobes. Par chromatographie de gel-filtration, nous avons determine la masse moleculaire apparente des molecules a activite bpa. On retrouve trois pics d'activite dans des fractions de chromatographie correspondant a des molecules de 100-130, 30-40, et 10-15 kda. Nous avons egalement detecte dans les extraits renaux, une activite bpa partageant de nombreuses caracteristiques avec le mbpa. Les activites bpa stromale et renale ont la meme cellule cible (la bfu-et) et la masse moleculaire apparente des molecules a activite bpa est identique dans les deux sources. Par ailleurs, comme cela a deja ete decrit pour l'erythropoietique, le taux de mbpa renal varie en fonction des etats erythropoietiques de l'animal. Il est augmente en cas d'anemie et diminue lors d'une forte polyglobulie. La disparition du mbpa renal endogene chez la souris polyglobulique s'accompagne d'une accumulation spectaculaire des bfu-et dans la rate et la moelle osseuse de l'animal traite. La differenciation de ces progeniteurs semble totalement dependante de la presence de mbpa. Le mbpa renal est egalement capable de stimuler l'erythropoiese dans les cultures a long terme. Enfin, l'injection de mbpa renal provoque une augmentation transitoire mais importante de la population des progeniteurs erythropoietiques spleniques du receveur. Nous avons pu apporter la preuve que l'activite bpa detectee dans les cellules stromales et dans les extraits renaux ne pouvait etre attribuee a aucune des cytokines actuellement connues. L'ensemble de ces resultats nous conduisent a penser que le mbpa pourrait etre un facteur erythropoietique original intervenant dans la regulation de l'erythropoiese in vivo

Cette thèse vise à démontrer l’importance de la PI 3-kinase dans la régulation hormonale de la réabsorption rénale du sodium. Ce contrôle extrêmement précis, notamment par l’aldostérone, s’effectue au niveau du néphron distal. Nous avons utilisé comme modèle l’épithélium de cellules A6, dérivées du tubule distal de Xenopus Laevis. Le transport unidirectionnel de sodium s’effectue en deux étapes: depuis, l’entrée à partir du milieu luminal par des canaux sodiques épithéliaux (ENaCs) insérés dans la membrane apicale, jusqu’à la sortie vers le liquide extracellulaire par des pompes Na+/K+-ATPases, situées dans la membrane basolatérale. L’insuline augmente ce transport de sodium et la PI 3-kinase semble assurer un rôle-clef.

Nous avons étudié l’importance de chacun des 3-phosphoinositides produits par la PI 3-kinase, sur le transport du sodium en ajoutant au milieu cellulaire des formes «perméantes» de ces phospholipides. Parmi ceux-ci, le PIP3 et dans une moindre intensité le PI(3,4)P2 augmentent ce transport. En revanche, le PI3P, le PI(3,5)P2, ainsi que le PI(4,5)P2 n’ont pas d’effet sur lui. Nous avons démontré par la technique du Western blot que la 3-phosphatase PTEN est exprimée dans les cellules A6. Cette phosphatase déphosphoryle le PIP3 en PI(4,5)P2. Nous avons surexprimé PTEN dans les cellules A6. Ceci réduit l’augmentation du transport du sodium induite par l’insuline, ainsi que celle induite par addition de la forme «perméante» de PIP3.

Nous avons ensuite vérifié si d’autres agents qui activent la PI 3-kinase, stimulent également le transport de sodium à travers cet épithélium. A cette fin, nous avons d’abord vérifié que l’EGF et le peroxyde d’hydrogène, connus pour stimuler la PI 3-kinase dans d’autres systèmes, activent également cette enzyme dans les cellules A6. Tous deux augmentent ce transport. L’importance de l’augmentation induite par H2O2 est comparable à celle de l’insuline, tandis que l’effet de l’EGF est plus transitoire. Un dosage d’activité de la PI 3-kinase, nous a permis de démontrer que l’intensité de l’activation de la PI 3-kinase est corrélée avec l’amplitude de l’augmentation du transport du sodium. Par comparaison avec l’effet de l’insuline et de l’H2O2, l’EGF augmente faiblement l’activité de la PI 3-kinase et induit une faible augmentation du transport.

Nous avons également examiné si la voie des MAPK influence la stimulation du transport du sodium par ces différents agents. Cette voie ne semble pas impliquée dans l’effet de l’insuline ou du peroxyde d’hydrogène. Par contre, elle diminue la stimulation du transport de sodium par l’EGF. L’effet de l’EGF sur le transport semble résulter d’un compromis entre l’activation de la voie de la PI 3-kinase qui l’augmente et l’activation de la voie des MAPK qui le diminue.

En conclusion, une augmentation de PIP3, soit par addition de PIP3 exogène, soit par augmentation endogène sous l’effet de l’insuline ou d’autres agents stimulant la PI 3-kinase, augmente le transport du sodium tandis qu’une diminution de PIP3 endogène (par surexpression de PTEN) le diminue. L’importance de l’activation de la PI 3-kinase est quantitativement corrélée avec l’importance de l’augmentation du transport du sodium. La PI 3-kinase est donc un médiateur-clef de la régulation rénale de ce transport.

Doctorat en sciences biomédicales
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La secretion d'aldosterone et de corticosterone par les cellules glomerulees de la surrenale de rat est dependante de la concentration de calcium extracellulaire. Nous avons donc realise une etude des canaux calciques. Grace a la technique du patch-clamp, nous avons pu mettre en evidence trois composantes calciques resultant de l'activation de trois types de canaux calciques sensibles au voltage. Les proprietes de ces canaux etant tres similaires a celles des canaux calciques presents dans les neurones de poulet, nous avons appele ces courants t, n et l. La composante t est une composante transitoire bas-seuil tandis que les composantes n et l sont des composantes haut-seuil tandis que les composantes n et l sont des composantes haut-seuil qui sont respectivement transitoire et soutenue. Par ailleurs, nous avons identifie trois types de canaux de fond permeables au calcium que nous avons appeles b#1, b#2 et b#3. La probabilite d'ouverture du canal b#1 est maximale a 70 mv et diminue lorsque le potentiel augmente ou diminue. Les canaux b#2 et b#3 ne semblent pas tres sensbles au potentiel. Aucun de ces canaux de fond permeables au calcium n'est sensible aux dihydropyridines. Par la suite, nous avons etudie le controle exerce par le principale secretagogue des cellules glomerulees de rat, l'adrenocorticotropine, sur l'activite des canaux t et l. Nous avons pu montre que cette hormone inhibe la composante t selon un processus biphasique et augmente l'amplitude de la composante l. L'analyse des effets de l'edrenocorticotropine sur les potentiels d'action confirme les resultats obtenus lors de l'etude realisees sur les courants calciques

UNE EXPOSITION NÉONATALE À L’OXYGÈNE MÈNE À DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: L’exposition à l’oxygène (O2) des ratons nouveau-nés a des conséquences à l’âge adulte dont une hypertension artérielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une néphropénie et des indices de stress oxydant. En considérant que les reins sont encore en développement actif lors des premiers jours après la naissance chez les rats, jouent un rôle clé dans le développement de l’hypertension et qu’une dysfonction mitochondriale est associé à une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions délétères néonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rénal sur la modulation de l’expression de protéines clés du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive d’espèces réactives de l’ O2. Méthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposés à 80% d’O2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considérant que plusieurs organes des rats sont encore en développement actif à la naissance, ces rongeurs sont un modèle reconnu pour étudier les complications d’une hyperoxie néonatale, comme celles liées à une naissance prématurée chez l’homme. À 4 et à 16 semaines, les reins sont prélevés et les mitochondries sont extraites suivant une méthode d’extraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et différentes centrifugations. L’expression des protéines mitochondriales a été mesurée par Western blot, tandis que la production d’ H202 et les activités des enzymes clés du cycle de Krebs ont été évaluées par spectrophotométrie. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± SD. Résultats: Les rats mâles H de 16 semaines (n=6) présentent une activité de citrate synthase (considéré standard interne de l’expression protéique et de l’abondance mitochondriales) augmentée (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), une diminution de l’activité d’aconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondrie), ainsi qu’une augmentation dans la production de H202 (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg protéines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mâles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) présente également une diminution dans l’expression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 unité relative, -23%; p<0.05), une protéine impliquée dans l’élimination d’ H202, de l’expression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 unité relative, -15%; p<0.05), une protéine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que l’expression de la protéine de découplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), impliquée dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmentée (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 unité relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines démontrent une augmentation significative de l’activité de l’aconitase (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondrie), de l’expression de l’ATP synthase sous unité β (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 unité relative, +25%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 unité relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que l’expression de Prx3 est significativement réduite (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 unité relative, -24%; p<0.05). À 4 semaines, les mâles H (vs Ctrl) présentent une augmentation significative de l’expression de Prx3 (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 unité relative, +31%; p<0.05) et les femelles présentent une augmentation significative de l’expression d’UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 unité relative, +18%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 unité relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition néonatale à l’O2 chez le rat adulte mène à des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associée à une augmentation dans la production d’espèces réactives de l’oxygène, suggérant que ces modifications mitochondriales pourraient jouer un rôle dans l’hypertension artérielle et d’un stress oxydant, et par conséquent, être un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires. Mots-clés: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygène, Stress Oxydant, Programmation
EVALUATION OF MITOCHONDRIAL FUNCTION IN A MODEL OF DEVELOPMENTAL PROGRAMMING OF HYPERTENSION ASSOCIATED WITH TRANSIENT NEONATAL OXYGEN EXPOSURE Introduction: Rats exposed to oxygen (O2) as newborns suffer complications in adulthood, including: arterial hypertension, vascular dysfunction, nephropenia and indices of oxidative stress. Although the rats are born at term, their organ development is equivalent to that of a preterm fetus, allowing organs of interest such as the kidney to be compared to premature infants. Given that impaired nephrogenesis or reduced nephron numbers has been shown to promote the development of hypertension and mitochondrial dysfunction is associated with increased oxidative stress, we hypothesised that exposure to high oxygen concentrations in the neonatal period would significantly impact the expression and activity of key proteins involved in renal mitochondrial function and lead to an excessive production of reactive oxygen species by the mitochondria. Methods: Sprague-Dawley rat pups were exposed to 80% O2 (Hyperoxic (H) group; O2 exposed) or 21% O2 (Control (Ctrl) group) from day 3 to day 10 of life. At 4 and 16 weeks of age, kidneys were rapidly excised and the mitochondria isolated following a standard protocol; with a buffer containing 0.32 M sucrose and differential centrifugations. Expression of mitochondrial proteins was assessed by Western blot, whereas the release of hydrogen peroxide (H202), activities of key citric acid cycle enzymes and mitochondrial swelling were assessed by spectrophotometry. Results are expressed as the means ± SE. Both male and female offspring were studied. Results: In male H rats at 16 weeks of age (n=6), citrate synthase activity (internal standard and measure of relative mitochondrial abundance) was significantly increased (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), whereas aconitase activity (sensitive to ROS) was significantly decreased (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondria) and H202 release was significantly increased (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg mitochondrial protein) compared to the controls (Ctrl, n=6 males and 4 females). The H group (vs Ctrl) also demonstrated a reduction in the expression of peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 relative units, -23%; p<0.05), a protein involved in the elimination of H202 and in the expression of cytochrome C oxidase (Complex IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 relative units, -15%; p<0.05), a protein in the mitochondrial respiratory chain, whereas the expression of uncoupling protein-2 (UCP2), a protein involved in dissipating the proton gradient, was significantly increased (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 relative units, +17%; p<0.05). Female H rats (n=6) (vs Ctrl, n=6) at 16 weeks of age demonstrated a significant increase in aconitase activity (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondria), in the expression of ATP synthase β subunit (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 relative units, +25%; p<0.05) (involved in ATP production) and in the expression of MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 relative units, +20%; p<0.05) (mitochondrial antioxidant involved in scavenging superoxide), whereas Prx3 expression was significantly reduced (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 relative units, -24%; p<0.05 ). In male H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age, the expression of Prx3 was significantly increased (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 relative units, +31%; p<0.05). Female H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age demonstrated a significant increase in the expression of UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 relative units, +18%; p<0.05) and in the expression of MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 relative units, +14%; p<0.05). Conclusion: The findings of this study demonstrate that transient oxygen exposure in the neonatal rat modifies protein expression, enzymatic activity and leads to indices of mitochondrial dysfunction (increase in ROS) in the adult kidney; these adverse changes in the mitochondria were more pronounced in adult males than in females. Overall, these findings, suggest that impaired mitochondrial function is associated with and could play a role in the development of arterial hypertension, oxidative stress and cardiovascular disease associated with transient neonatal hyperoxic stress. Keywords: Mitochondria, Hypertension, Kidneys, Developmental Programming, Oxygen, ROS

Hhip (Hedgehog interacting protein), un antagoniste de la voie de signalisation Hegehog (Hh) a était devouverte comme un antagoniste des 3 ligands Hh, soit Sonic (Shh), Indian (Ihh) et Desert (Dhh). La protéines Hhip régularise la fonction cellulaire autant par voie (Hh) canonique que non-canonique. Elle est formée de 700 acides aminés et est fortement exprimée dans les tissus riches en cellules endothéliales, comme les reins et le pancréas. Toutefois, son rôle dans le fonctionnement des cellules bêta matures soit en condition de bonne santé ou de maladie comme dans des conditions d’obésité provoquée par une diète riche en gras ainsi que son role dans les maladies chronique du rein et la dysfonction rénale. Les souris en déficience de Hhip (Hhip-/-) ont une malformation des ilots pancréatiques (une diminution de 45% des ilots et de 40% de la prolifération des cellules beta) et un problème pulmonaire qui cause la mort post-natale. L’objectif de notre étude initiale était de démontrer le role de Hhip dans le pancréas, en utilisant un KO corporel entier en réponse à une diète riche en gras (HFD) et la dysfonction des cellules beta in vivo et ex vivo sur des souris hétérozygotes pour Hhip (Hhip+/-) et des souris contrôles (Hhip +/+) Suite à une HFD, toutefois, les souris mâles et femelles HFD-Hhip+/+ ont développé une intolérance sévère au glucose (IPGTT) et cette intolérance a été améliorée chez les souris HFD-Hhip+/-. Associé a cette intolérance, les males HFD-Hhip+/- démontraient une hyperinsulinémie et leur taux d’insuline plasmatique (phase 1 et 2), contrairement aux souris males HFD-Hhip+/+, augmentait de façon significative. Dans les îlots de souris Hhip+/+, l’augmentation de Hhip induite par une HFD a été observée principalement dans les cellules bêta mais aucunement dans les cellules alpha. Sans varier le nombre total d’îlots et la quantité de cellules bêta, les souris mâles HFD-Hhip+/+ avaient un nombre supérieur de gros îlots dans lesquels le taux d’insuline était diminué. La structure de ces îlots était désorganisée, démontrant une évidente invasion des cellules alpha au coeur des îlots bêta, le stress oxidatif (8-OHdG et NADPH oxidase 2 (Nox 2)) est aussi augmentée. En revanche, chez les souris mâles HFD-Hhip+/-, il a été possible d’observer une augmentation du nombre de petits îlots, de la prolifération des cellules bêta, et aussi de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS), une amélioration du stress oxidatif et un maintien de l’intégrité des îlots ont été démontré. In vitro, la protéine recombinante Hhip (rHhip) a accentué le stress oxidatif (Nox2 et l’activité de NADPH oxidase 2) et a causé une diminution du nombre de cellules bêta ; par contre, le siRNA-Hhip augmente le GSIS et abolit la stimulation de l’expression du gène Nox2 induite par le palmitate de sodium (PA)-BSA. Grace a ces observations, il est démontré que les genes Hhip pancréatiques inhibe la sécrétion d’insuline en altérant la structure des ilots et en favorisant l’expression du gene Nox2 dans les ilots en réponse à la dysfonction des cellules beta suite a une diète riche en gras HFD. Le diabète engendre des risques élevés de complication tel que des problèmes chroniques des reins caractérisés par une perte graduelle des fonctions rénales. Cette situation a été récemment reliée au taux élevé d’obésité. On a aussi démontré dans notre modèle de diabète gestationnel que l’augmentation de Hhip causait des irrégularités durant la néphrogénèse des rejetons [127]. Ensuite, nos données récentes démontrent que, chez les souris adultes, l’hyperglycémie a provoqué une forte expression du gene Hhip rénales causant ainsi l’apoptose des cellules épithéliales des glomérules et la transition endothéliale à mésenchymateuse (EndoMT) - liée à fibrose rénale [128]. Dans l’étude présente, on a établi que la surexpression de Hhip dans les cellules des tubules proximaux rénaux contribuait au développement initial des problèmes chroniques des reins suite a une HFD de 14 semaines. Un gain de poids significatif a été observé chez les souris du groupe HFD comparativement aux groupes ND. Les souris du groupe HFD ont développé une intolérance au glucose mais sans changement apparent à la sensibilité à l’insuline ni à l’hypertension (pression arterielle) même si ces souris mâles avaient des légers dépôts du gras périrénal. Les fonctions rénales telle que mesurées par le taux de filtration glomérulaire restaient normales dans tous les groupes révélant ainsi que ces deux facteurs (HFD et surexpression de Hhip) n’avaient aucune influence sur l’hyperfiltration rénale. Néanmoins, la morphologie rénale a révélé que les souris du groupe HFD présentaient une lésion infraclinique et des signes de vacuolisation tubulaire et des lésions par rapport aux souris ND. Cette pathologie de lésion tubulaire et de vacuolisation était plus prononcée chez les souris transgéniques (Hhip-Tg) que chez les souris non-Tg, ce qui favorisait l'apoptose des cellules tubulaires bénignes et un stress oxydatif accru. En conclusion, l'obésité provoquée par l'HFD a eu des effets néfastes sur la tolérance au glucose et de légères modifications morphologiques des reins, caractérisées par la présence d'une néphrose osmotique, une augmentation du stress oxydatif rénal et une apoptose pouvant être induites par une augmentation de la FABP4 rénale. Cela a été exacerbé par la surexpression de Hhip dans les tubules rénaux proximaux.
Hedgehog interacting protein (Hhip), a signaling molecule in the Hedgehog Hh pathway, was originally discovered as a putative antagonist of all 3 secreted Hh ligands, i.e., Sonic (Shh), Indian (Ihh), and Desert (Dhh). Hhip regulates cell function via either canonical- or non-canonical Hh pathway. Hhip encodes a protein of 700 amino acids, and is abundantly expressed in vascular endothelial cell-rich tissues, including the pancreas, and kidneys. To date, less is known about Hhip’s expression pattern in mature islet cells, and its function under normal and/or disease conditions, such as diet induced-obesity, as well as its role in chronic kidney disease, and kidney dysfunction. Hhip null mice (Hhip-/-) display markedly impaired pancreatic islet formation (45% reduction of islet mass with a decrease of beta cell proliferation by 40%), however Hhip-/- mice die shortly after birth mainly due to lung defects. In our first study, we systemically studied the role of pancreatic Hhip expression by using a whole body knock out in response to 8 weeks high fat diet (HFD) insult, and HFD-mediated beta cell dysfunction in vivo, ex vivo and in vitro using heterozygous (Hhip+/-) vs. wild type (Hhip+/+) mice. Both HFD-fed Hhip+/+ male and female mice developed severe glucose intolerance (IPGTT), which was ameliorated in male and female HFD-Hhip+/- mice. Associated with this glucose intolerance, was hyperinsulinemia, which was observed only in HFD-fed male Hhip+/- mice. HFD-fed Hhip+/- mice had high levels of circulating plasma insulin in both insulin secretion phases compared to HFD fed Hhip+/+ mice. In the pancreas, Hhip expression was increased in the islets of HFD-Hhip+/+ mice, mainly co-localized in beta cells and none in alpha cells. While maintaining the total islet number, and beta cell mass, male HFD-Hhip+/+ mice had a higher number of larger islets, in which insulin content was reduced; islet architecture was disoriented, with evident invasion of alpha cells into the central core of beta cells; and an evident increase in oxidative stress markers (8-OHdG and NADPH oxidase 2 (Nox 2)). In contrast, male HFD-Hhip+/- mice had a higher number of smaller islets, with increased beta cell proliferation, pronounced glucose stimulated insulin secretion (GSIS), ameliorated oxidative stress and preserved islet integrity. In vitro, recombinant Hhip (rHhip) dose-dependently increased oxidative stress (Nox2 and NADPH activity), and decreased the number of insulin-positive beta cells, while siRNA-Hhip enhanced GSIS, and abolished the stimulation of sodium palmitate (PA)-BSA on Nox2 gene expression. We believe our data highlights a novel finding as to how pancreatic Hhip gene inhibits insulin secretion, by altering islet integrity, and promoting Nox2 gene expression in beta cells in response to HFD-mediated beta cell dysfunction. Diabetes presents high risk factors associated with complications such as chronic kidney disease (CKD) characterized by a gradual loss in kidney function. The increased incidence of diabetic related kidney complications has been recently correlated with increase rate of obesity. We recently established that impaired nephrogenesis in kidneys of offsprings of our murine model of maternal diabetes was associated with upregulation of Hhip gene expression [127]. Subsequently, our recent data also shows that hyperglycemia induced increased renal Hhip gene expression in adult murine kidneys leading to apoptosis of glomerular epithelial cells and endothelial to mesenchymal transition (Endo-MT) - related renal fibrosis [128]. In this current study, we demonstrated how Hhip overexpression in renal proximal tubular cells, contributes to early development of chronic kidney disease after 14 weeks of HFD. Mice in HFD-fed groups showed significantly greater weight gain as compared to mice in ND fed groups. IPGTT revealed that HFD fed mice also developed glucose intolerance, with no apparent changes in insulin sensitivity. HFD did not impact hypertension, even though we had a modest trend of increase in perirenal fat deposit in the HFD fed subgroups. Renal function as measured by the glomerular filtration rate was normal in all four subgroups, indicating that neither HFD, nor Hhip overexpression promoted renal hyperfiltration. Nonetheless, renal morphology revealed HFD kidneys had subclinical injury, presented signs of tubular vacuolization and damage compared to ND fed mice. This pathology of tubular damage and vacuolization was more pronounced in HFD-fed transgenic (Hhip-Tg) mice compared to non-Tg mice, and this promoted mild tubular cell apoptosis and enhanced oxidative stress. In conclusion, HFD feeding-induced obesity led to detrimental effects on glucose toleranc,e and mild morphological changes in kidneys, characterized by the presence of osmotic nephrosis, increased renal oxidative stress, and apoptosis which might be mediated by an increase in renal FABP4. This was exacerbated by the over-expression of Hhip in the renal proximal tubules.

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.
Myo-inositol (MI) is an organic solute involved in various aspects of cell physiology, including cell signaling. It is also known as a compatible osmolyte. Three secondary active MI cotransporters have been identified; two are Na+- coupled (SMIT1 and SMIT2) and one is H+-coupled (HMIT). The main aim of this study was to characterize MI uptake throught SMIT2 as expressed in epithelial cells and in Xenopus laevis oocytes. In order to achieve the characterization of this transport system, we used purified brush border membrane vesicles (BBMv) isolated from rabbit kidney and rat intestine. We first performed a quantification of mRNA levels in rabbit kidney using real time PCR for both SMIT1 and SMIT2. We found that SMIT1 is mainly expressed in the renal medulla while SMIT2 is mainly localized in the renal cortex. This result was confirmed on Western blots using an antibody raised against SMIT2. Through inhibition studies using selective substrates for SMIT1 (inhibited by L-fucose) and SMIT2 (inhibited by D-chiroinositol), we showed that SMIT2 seems to be responsible for all the apical transport of MI into the proximal convoluted tubule with a Km of 57 ± 14 µM. By transport studies we established that rabbit intestine seems to lack apical transport of MI while rat intestine has a very active uptake of this molecule. qRT-PCR quantification confirmed the absence of MI transporters in rabbit intestine. As for kidney, SMIT2 seems to be the only transporter responsible for apical MI uptake in enterocytes with a Km of 150 ± 40 µM. Functional analysis of rat SMIT2 activity, via electrophysiological studies in Xenopus oocytes, demonstrated similarities to the activities of SMIT2 from rat intestine and rabbit kidney. SMIT2 displays high affinities for MI (270 ± 19 µM), DCI (310 ± 60 µM) and no affinity for L-fucose. SMIT2 is very sensitive to phlorizin (Pz; 16 ± 7 µM). Although these functional characteristics essentially confirmed those found in rat intestine, a iv discrepancy exists between the two systems studied. Indeed, the affinity constant for glucose was approximately 40-fold lower in vesicles than in oocytes. We also tested the ability of SGLT1 and GLUT5, other sugar transport systems present in enterocytes apical membranes, to perform MI uptake. Because the inhibition of these transporters did not alter radiolabeled MI uptake, we concluded that they had no significant contribution to MI transport in rat intestine. Finally, the basolateral efflux of MI was not mediated by GLUT2 because when expressed in oocytes, this transporter was not able to transport MI.

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.
It is well accepted that renin-angiotensin system (RAS) activation plays an important role in the development of hypertension and diabetic nephropathy (DN). With the discovery of angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) and recognition of MAS as the receptor of Angiotensin 1-7 (Ang 1-7), new players in RAS, ACE2/Ang 1-7/MAS axis, have been identified to counteract the effect of ACE/Ang II/ AT1 axis. Evidence implicates the intrarenal RAS’s contribution to DN. Previous studies from our laboratory using transgenic mice overexpressing rat Angiotensinogen (Agt) in their renal proximal tubular cells (RPTCs) have demonstrated the importance of the intrarenal RAS in renal damage and the induction of hypertension. We also recently observed that renal ACE2 expression and urinary Ang 1–7 were lower in type 1 diabetic Akita mice and that treatment with RAS blockers normalized ACE2 expression and prevented hypertension development in these Akita mice. In the diabetic milieu, both glycemia and angiotensin II (Ang II) can induce reactive oxygen species (ROS) generation, which contributes to kidney injury. To explore the relationship among ROS, ACE2 and DN, we created Akita transgenic mice overexpressing catalase (Cat) in RPTCs by crossbreeding type I diabetic Akita mice with our established transgenic mice overexpressing rat Cat in RPTCs. In another study, Akita mice were treated with Ang 1-7 or combination of Ang 1-7 and its antagonist, A779, to investigate the relations between Ang 1-7 action, systolic hypertension (sHTN), oxidative stress, kidney injury, ACE2 and Mas receptor expression. Our results showed that overexpression of Cat attenuated renal oxidative stress; prevented hypertension; ameliorated glomerular filtration rate, albuminuria, kidney hypertrophy, tubulointerstitial fibrosis, and tubular apoptosis; and suppressed profibrotic and proapoptotic gene expression in RPTCs of Akita Cat-Tg mice compared with Akita mice. Furthermore, overexpression of Cat in RPTCs of Akita mice normalized renal ACE2 expression and urinary Ang 1–7 levels. On the other hand, Ang 1-7 administration prevented systemic hypertension, normalized urinary albumin/creatinine ratio and attenuated glomerular hyperfiltration without affecting blood glucose levels in Akita mice. Furthermore, Ang 1-7 treatment also attenuated oxidative stress and the expression of NADPH oxidase 4, Agt, ACE, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and collagen IV, and increased the expression of ACE2 and Mas receptor in Akita mouse kidneys. These effects were reversed by co-administration of A779. These data demonstrated that Cat overexpression prevents hypertension and progression of nephropathy and highlight the importance of intrarenal oxidative stress and ACE2 expression contributing to hypertension and renal injury in diabetes. Furthermore, our data suggest that Ang 1-7 plays a protective role in hypertension and RPTC injury in diabetes, predominantly through decreasing renal oxidative stress-mediated signaling and normalizing ACE2 and Mas receptor expression. Our results also indicate Ang 1-7 as a potential therapeutic agent for treatment of systemic hypertension and kidney injury in diabetes. Therefore, Ang 1-7 mediates the major protective role of ACE2 in the hypertension and DN.

Plusieurs expériences et études cliniques ont démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) peut induire l’hypertension, un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et rénales. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique substrat du RAS. Cependant, il n’a pas encore été démontré si l’activation du RAS intrarénal peut à elle seule induire des dommages rénaux, indépendamment de l’hypertension systémique, et ainsi jouer un rôle prépondérant dans la progression de la néphropathie diabétique. Afin d’explorer le rôle du RAS intrarénal dans les dommages rénaux, un diabète a été induit par l’injection de streptozotocin chez des souris transgéniques (Tg) surexprimant l’Agt de rat dans les cellules des tubules proximaux du rein (RPTC). Les souris Tg diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS (perindopril et losartan), de l’insuline ou une combinaison des deux pour 4 semaines avant d’être euthanasiées. Pour une autre étude, des souris Tg non-diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS, l’hydralazine (vasodilatateur) ou l’apocynine (inhibiteur de la NADPH oxydase) pour une période de 8 semaines avant l’euthanasie. Des souris non-Tg ont été utilisées comme contrôles. Des cellules immortalisées de tubule proximal de rat (IRPTC) transfectées de manière stable avec un plasmide contenant l’Agt ou un plasmide contrôle ont été employées comme modèle in vitro. Nos résultats ont démontré que les souris Tg présentaient une augmentation significative de la pression systolique, l’albuminurie, l’apoptose des RPTC et l’expression de gènes pro-apoptotiques par rapport aux souris non-Tg. Les mêmes changements ont été observés chez les souris Tg diabétiques par rapport aux souris non-Tg diabétiques. L’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS ont permis d’atténuer ces changements, sauf l’hypertension qui n’était réduite que par les inhibiteurs du RAS. Chez les IRPTC transfectées avec l’Agt in vitro, les hautes concentrations de glucose augmentent l’apoptose et l’activité de la caspase-3 par rapport aux cellules contrôles et l’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS empêchent ces augmentations. En plus des changements physiologiques, les RPTC des souris Tg présentent aussi une augmentation significative de la production des espèces réactive de l’oxygène (ROS) et de l’activité de la NADPH oxydase, ainsi qu’une augmentation de l’expression du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1), de l’inhibiteur activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1), des protéines de la matrice extracellulaire, du collagène de type IV et de la sousunité p47 de la NADPH oxydase. Le traitement des souris Tg avec l’apocynine et le perindopril a permis d’améliorer tous ces changements, sauf l’hypertension qui n’était pas corrigée par l’apocynine. D’autre part, l’hydralazine a prévenu l’hypertension, sans modifier l’albuminurie, l’apoptose des RPTC ou l’expression des gènes pro-apoptotiques. Ces résultats montrent bien que l’activation du RAS intrarénal et l’hyperglycémie agissent de concert pour induire l’albuminurie et l’apoptose des RPTC, indépendamment de l’hypertension systémique. La génération des ROS via l’activation de la NADPH oxydase induit en partie l’action du RAS intrarénal sur l’apoptose des RPTC, la fibrose tubulo-interstitielle et l’albuminurie chez les souris Tg. D’autre part, une expérience en cours a tenté d’encore mieux délimiter les effets de l’activation du RAS intrarénal, tout en éliminant la néphrotoxicité du STZ. Pour cette étude, les souris Tg surexprimant l’Agt de rat dans leurs RPTC ont été croisées aux souris Ins2Akita, un modèle spontané de diabète de type I, afin de générer des souris Akita-rAgt-Tg. Les résultats préliminaires indiquent que le RAS intrarénal est activé dans les souris Akita et que la combinaison avec l’hyperglycémie induit du stress du réticulum endoplasmique (ER) dans les RPTC in vivo. Le stress du ER contribue à l’apoptose des RPTC observée dans le diabète, à tout le moins dans le modèle Akita. Le traitement avec des inhibiteurs du RAS permet d’atténuer certains des dommanges rénaux observés dans les souris Akita-rAgt-Tg.
Experimental and clinical studies have shown that renin-angiotensin system (RAS)activation may lead to hypertension, a major cardiovascular and renal risk factor. Angiotensinogen (Agt) is the sole substrate of the RAS. However, it is unclear whether intrarenal RAS activation alone could induce kidney injury independently of systemic hypertension and play an important role in the progression of diabetic nephropathy (DN). To explore the role of intrarenal RAS in kidney injury, transgenic (Tg) mice overexpressing rat Agt in their renal proximal tubular cells (RPTCs) were rendered diabetic by streptozotocin (STZ). Diabetic Tg mice were treated with RAS blockers (perindopril and losartan), insulin or a combination of both and then euthanized after 4 weeks of treatment. In a separate study, non-diabetic Tg mice were treated with RAS blockers or hydralazine (a vasodilator) or apocynin (an NADPH oxidase inhibitor) and then euthanized after 8 weeks of treatment. Non-Tg littermates served as controls in both studies. Immortalized rat proximal tubule cells (IRPTCs) stably transfected with Agt cDNA or control plasmid were used in the experiments as an in vitro model. Our results showed that non-diabetic Tg mice displayed a significant increase in systolic blood pressure (SBP), albuminuria, RPTC apoptosis, and proapoptotic gene expression. Diabetic Tg mice had a further increase of albuminuria, RPTC apoptosis, and proapoptotic gene expression, though the SBP of the diabetic Tg mice was similar to that of non-diabetic Tg mice. RAS blockers and/or insulin treatments markedly attenuated these changes, except that insulin had no impact on hypertension. In vitro, high-glucose melieu significantly increased apoptosis and caspase-3 activity in Agt stable transfectants compared to control cells, and these changes were attenuated by insulin and/or RAS blockers. Furthermore, non-diabetic Tg mice showed significantly elevated reactive oxygen species (ROS) production and NADPH oxidase activity, as well as enhanced expression of transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), extracellular matrix proteins, collagen type IV, and NADPH oxidase subunit p47 in their RPTC. Treatment with apocynin and perindopril ameliorated these changes, but apocynin had no effect on SBP. In contrast, hydralazine prevented hypertension but not albuminuria, RPTC apoptosis, or proapoptotic gene expression. These data indicate that intrarenal RAS activation and hyperglycemia act in concert to induce albuminuria and RPTC apoptosis independent of systemic hypertension. ROS generation via NADPH oxidase activation mediates, at least in part, intrarenal RAS action on RPTC apoptosis, tubulointerstitial fibrosis and albuminuria in Tg mice. On the other hand, in an on-going experiment, to avoid the nephro-toxic effects of STZ and further delineate the effects of intrarenal RAS activation, Tg mice overexpressing rat Agt in their RPTCs were crossbred with Ins2Akita mice, a spontaneous type I diabetes model, to generate Akita-rAgt-Tg mice. Preliminary data indicated that hyperglycaemia and intrarenal RAS activation induced endoplasmic reticulum (ER) stress in RPTC in vivo, and the ER stress pathway contributed to RPTC apoptosis in diabetes, at least in the Akita model. RAS blockade was effective in attenuating some parameters of renal injury in AkitarAgt-Tg mice.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI)
Monomers like triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) leach from dental composites and adhesives due to incomplete polymerization or polymer degradation. The release of these monomers causes a variety of reactions that can lead to cell death. This death can be either necrotic, which is characterized mainly by inflammation and injury to the surrounding tissues, or apoptotic, which elicits little inflammatory responses, if any at all. TEGDMA-induced apoptosis in human pulp has been reported recently. However, the molecular mechanisms and the apoptotic (pro and anti) proteins involved in this process remain unclear. The objective of this study was to determine the apoptotic proteins expressed or suppressed during TEGDMA-induced apoptosis. Human pulp fibroblasts (HPFs) were incubated for 24 hours with different TEGDMA concentrations (0.125-1.0 mM). Cytotoxicity was determined using the cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). TEGDMA was shown to cause cell cytotoxicity at concentrations of 0.50 mM and up. The highest concentration with no significant cytotoxicity was used. Cells were incubated with or without 0.25 mM TEGDMA for 6 h and 24 h. Cell lysates were then prepared and the protein concentrations determined using the Bradford protein assay. A Human Apoptosis Array kit (Bio-Rad Hercules, CA ) was utilized to detect the relative levels of 43 apoptotic proteins. The results of this study showed statistically significant increases of multiple examined pro-apoptotic proteins. The anti-apoptotic proteins were also altered. Pro-apoptotic proteins involved in the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways were increased significantly. The results indicated that TEGDMA has effects on both the extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.