Academic literature on the topic 'Réplication virale – Dissertations universitaires comme sujet'

La Fièvre Aphteuse est une maladie animale très contagieuse à fortes répercussions économiques. L'agent responsable, FMDV, un picornavirus, se réplique et dissémine rapidement. Ce projet de thèse consiste à produire un virus recombinant chimère EMCV-FMDV utilisable comme vaccin vivant atténué marqueur contre FMD. Son génome sera constitué de régions codant les protéines non structurales du virus de l’encéphalomyocardite (EMCV), celles qui codent les protéines de capside seront issues du FMDV. Dans le but d'atténuer la virulence de l'EMCV, une délétion dans la protéine 2A a été introduite. L'étude du virus délété, EMCV1. 26Δ2A, a permis de montrer qu'il entraine la mort des cellules par apoptose contrairement au virus sauvage, suggérant que la protéine 2A de l'EMCV est nécessaire à l'inhibition de l'apoptose. De plus, nous avons pu montrer que le virus EMCV1. 26Δ2A était fortement atténué in vitro et in vivo, et qu'il protège efficacement des souris contre une dose létale du virus sauvage. Nos résultats indiquent que ce virus est un bon candidat comme vaccin vivant atténué contre l'EMCV et une base sûre pour la conception du virus chimère EMCV-FMDV. La production de ce virus recombinant chimère a nécessité plusieurs étapes de clonage qui ont permis d'obtenir un plasmide contenant un ADNc génomique EMC V1. 26 A2 A-PI FMDV (pMCl). Après transfection de pMCl, la production d'antigènes de capside FMDV a pu être détectée mais ces premiers essaies n'ont pas permis d'obtenir de virus infectieux. La formation de particules virales recombinantes ou les éventuelles étapes limitantes du cycle viral restent à déterminer mais les résultats obtenus jusque là sont encourageants et prometteurs
Foot and Mouth Disease is a highly contagious animal disease with important economic impacts. The causative agent, FMDV, a picornavirus, replicates and spreads extremely rapidly. The recent outbreaks in countries previously FMD-free demonstrated the need to develop control strategies to stop or at least slow the spread of the virus. The aim of this project is to develop a safe recombinant virus that would be made of FMDV capsid proteins, and the non structural proteins of the Encephalomyocarditis virus (EMCV). This recombinant virus will serve as a marker vaccine against FMD. In order to attenuate EMCV virulence, a deletion in the 2A protein was introduced. Study of EMCV1. 26 Δ 2A virus showed that it causes cell death by apoptosis in contrast to the wild type, suggesting that the EMCV 2A protein is necessary to inhibit apoptosis. Moreover, we have shown that EMCV1. 26 Δ 2A virus was strongly attenuated in vitro as in vivo, and efficiently protected mice after challenge with a lethal dose of wild type virus. Our results indicate that this virus is a good candidate for a live attenuated vaccine against EMCV and a safe base for the production of the EMCV-FMDV chimera virus. The production of this recombinant chimera virus required several cloning steps, leading to the construction of the EMC VA2 Δ -PI FMDV genomic cDNA (pMCl). The first attempts to produce recombinant virus EMC V Δ 2A-P1 FMDV allowed detection of FMDV capsid antigens, but did not succeed yet to produce infections recombinant virus. The formation of recombinant viral particles or the eventual limiting steps of the viral cycle remain to be determined. However, the results obtained up to now are heartening and promising

Dans le but d'évaluer le risque de transmission de l'EMCV de l'animal, en particulier le porc, à l'homme, notamment lors de xénotransplantations, nous nous sommes intéressés aux facteurs susceptibles de favoriser ou de limiter cette transmission par l'étude de l'interaction du virus avec des cellules humaines. Des outils permettant la mise en évidence de la multiplication du virus aux différentes étapes de l'infection ont été développés. Notamment, pour le suivi de la synthèse des protéines, un virus recombinant exprimant l'EGFP a été créé. Celui-ci, était pathogène pour la souris, à l'instar du virus parental. L'EGFP a pu être détectée par autofluorescence in vitro dans les cellules infectées et in vivo sur des empreintes de cerveaux de souris. Le pouvoir infectieux de différentes souches virales sur des lignées et des cellules primaires humaines, reflétant le tropisme du virus chez l'animal, a été analysé. Les résultats montrent que l'infection des cellules dépend du type cellulaire et de la souche virale et que l'adsorption varie essentiellement en fonction des souches. Par comparaison des séquences de capside, des acides aminés jouant un rôle probable dans cette adsorption ont été mis en évidence. L'analyse des partenaires cellulaires impliqués dans l'attachement a permis de montrer que l'adsorption de la souche 1086C est dépendante des acides sialiques et que la lysine 231 de VP1 jouerait un rôle important dans cette liaison. Par ailleurs, l'adsorption de la souche B279/95 est indépendante des acides sialiques mais dépend des héparanes sulfates. Ceci suggère l'utilisation probable de co-récepteurs portant des héparanes sulfates ou des acides sialiques
In order to evaluate the transmission risk of EMCV, from animal, mainly pig, to human, especially during xenotransplantations, we were interested in factors likely to support or limit this transmission by studying the interaction of EMCV with human cells. Tools allowing the detection of the virus multiplication at the various stages of the infection were developed. In particular, for the follow-up of the proteins synthesis, a recombinant EMCV expressing EGFP was created. The recombinant virus was pathogenic for mouse like the parental virus. EGFP could be detected by autofluorescence in vitro in infected cells and in vivo on prints of mouse brains. The infectious power of various viral strains on human cell lines and primary cells, reflecting the tropism of the virus in animal, was analysed. The results indicated that the infection of the cells depends on the cellular type and the viral strain and that adsorption varies primarily according to the strains. By comparison of the sequences of capsid, amino acids playing a probable part in this adsorption were highlighted. The analysis of the cellular partners implied in the attachment made it possible to show that the adsorption of the strain 1086C is dependent on sialic acid and that lysine 231 of VP1 would play an important part in this connection. In addition, the adsorption of the B279/95 strain is independent of sialic acid but depends on heparanes sulfates. This suggests the probable use of co-receptors carrying heparane sulfates or sialic acids

Dans le modèle du macaque rhésus infecté par un SIV pathogène de type sauvage, nous avons éprouvé l'hypothèse de l'épuisement des capacités prolifératives comme cause possible du déclin du nombre de lymphocytes T CD4-K Dans une seconde étude, nous avons évalué la pathogénicité à long-terme d'un virus atténué, ainsi que la dynamique lymphocytaire au cours d'une telle infection. Nous montrons qu'au cours de l'infection, le nombre de lymphocytes T CD8+ activés augmente progressivement dans le sang et dans les ganglions des animaux infectés par un SIV sauvage. Cette augmentation est corrélée avec la replication virale et l'évolution vers un SIDA. En revanche, nous n'observons aucune augmentation du nombre de lymphocytes T CD4+ en cycle. Ainsi, ces résultats mettent en évidence des comportements distincts des populations lymphocytaires T CD4+ et CD8+ suite à une activation, Lors de l'infection du macaque par un SIV atténué, nous montrons qu'en dépit d'une réplication virale très faible, ce virus conserve des propriétés pathogènes. La réplication virale, ainsi que l'activation de lymphocytes T CD8+ corrèlent positivement avec la vitesse d'évolution vers la maladie. Alors que l'apport thymique en lymphocytes T CD8+ est globalement augmenté, une relation très significative existe entre l'apport thymique en lymphocytes T CD4+ dans le sang périphérique et la non-progression vers la maladie. Globalement, nos données suggèrent que l'apport thymique en nouveaux lymphocytes T serait un facteur déterminant dans l'immunopathologie qui mène au SIDA
We studied in the animal model of the rhesus macaque, the infection with a pathogenic SIV and with an attenuated SIV. Pathogenesis of these infections is still poorly understood. Our data show that activated CD8 T cell numbers progressively increase during the infection with a wild-type SIV in the blood and the lymph nodes. This increase is correlated with the viral replication and the progression to AIDS. We didn't observe any increase in CD4 activation. So these data show distinct profiles between CD4 and CD8 T cells. During a long-term attenuated infection, in spite of weak viral loads, the SIVAnef induced pathological CD4 T cell depletion. Virus replication and CD8 T cell activation positively correlated with the rate of disease progression. The frequency of TRECs within CD8+CD45RA+ increased in SIVAnef-infected animals compared to age-matched non-infected controls. Moreover, in the cohort of the attenuated SlV-infected animals TREC+CD45RA+CD4+ T cell counts inversely and highly correlated with the rate of disease progression. Altogether, our results suggest that the thymus plays a main role in the pathogenesis of the SIV and that a sustained thymic output could maintain CD4 T cell homeostasis in the context of low viral loads

La formation de nouveaux virus VIH-1 infectieux requiert la rencontre de trois composants majeurs viraux : la glycoprotéine d'enveloppe (Env), le précurseur Gag et l'ARN génomique. L'incorporation de Env dans la particule virale Gag est une étape cruciale puisqu'elle confère aux virions néoformés la capacité d'infecter de nouvelles cellules cibles. Pourtant les mécanismes qui la président sont largement méconnus. La première partie de mon travail de thèse a permis d'identifier le premier cofacteur cellulaire, TIP47, requis pour l'incorporation de Env. TIP47 permet l'association entre Gag et Env en interagissant simultanément avec le domaine matrice de Gag et avec le domaine cytoplasmique de la sous-unité transmembranaire TMgp41 de Env. L'incorporation de Env VIH-1 est régulée par un mécanisme actif, dans lequel l'interaction entre Gag, TIP47 et Env joue un rôle central. TIP47 est essentiel pour l'incorporation de Env dans des virions produits par divers types cellulaires cibles du VIH-1 comme les lymphocytaires T CD4+ ou les macrophages primaires. La seconde partie de ma thèse a permis la caractérisation d'un nouveau groupe de partenaires du domaine cytoplasmique de la TMgp41 de Env VIH-1 : des facteurs de transcription ancrés dans le réticulum endoplasmique. Env peut ainsi participer à la régulation de diverses voies cellulaires. L'interaction de Env avec l'un de ces facteurs, Luman, inhibe son activation. Luman inhibe l'activité de transactivation des gènes du VIH-1 et Env semble contrecarrer cette inhibition. A l'inverse, ATF6 et SREBP, les deux autres facteurs, qui sont nécessaires pour la replication du virus, seraient quan à eux activés lors de l'infection du VIH-1
The formation of new infectious HIV-1 viruses requires the encounter between three major viral components: the envelope glycoprotein (Env), the Gag precursor and the genomic RNA. Env incorporation into the viral Gag particles is a crucial step since it confers to the newly formed virions the capacity to infect new target cells. Yet the mechanisms of Env incorporation are not well known. The first part of my thesis allowed us to identify the first cellular cofactor, TIP47, required for Env incorporation. TIP47 permits the association between Gag and Env by interacting simultaneously with the matrix domain of Gag and with the cytoplasmic domain of the transmembrane subunit TMgp41 of Env. HIV-1 Env incorporation is an active mechanism, in which the interaction between Gag, TIP47 and Env plays a central role. TIP47 is essential for Env incorporation into virions produced by différent target cells of HIV-1, as T CD4+ lymphocytes and primary macrophages. The second part of my thesis allowed the characterization of a new group of partners of the cytoplasmic domain of TMgp41 of HIV-1 Env: transcription factors anchored in the endoplasmic reticulum. Thus, Env can participate in the regulation of different cellular pathways. The interaction between Env and one of these factors, Luman, inhibits its activation. Luman inhibits the transcriptional activity of HIV-1 genes, and Env seems to counteract this inhibition. On the other hand, ATF6 and SREBP, the other factors we identified, are necessary for viral replication and might be activated during HIV-1 infection

De nombreux travaux suggèrent que la protéine Vpr du VIH-1 participe à l'établissement des étapes précoces du cycle de réplication virale. Les observations faites dans la littérature suggèrent qu'elle exercerait ce rôle en interagissant avec certains éléments du complexe du pore nucléaire, dont la nucléoporine hCG1. Les résultats obtenus durant ma Thèse révèlent que cette dernière propriété de Vpr est fonctionnellement liée aux autres fonctions connues de la protéine, et notamment à ses activités cytostatiques et pro-apoptotiques, et pourrait contribuer à la réplication du VIH-1 dans des cellules non prolifératives, de type macrophages. Nous avons également caractérisé une nouvelle interaction entre la nucléoporine hCG1 et la p50/dynamitine, élément central du complexe moteur microtubulaire dynéine/dynactine. Alors qu'il n'existait jusqu'à présent aucune information concernant les déterminants moléculaires de la p50/dynamitine impliqués dans son rôle structural au sein du complexe dynactine, nos travaux ont permis d'apporter les éléments nécessaires à la compréhension de ces aspects fonctionnels de la protéine
Numerous studies showed that HIV-1 Vpr plays a crucial role during establishment of the early steps of the viral life cycle. Previous results obtained in our laboratory suggest that Vpr would act by interacting with the nucleoporine hCG1, a component of the nuclear pore complex. The results obtained during my PhD revealed a functional link between this property of Vpr and other known functions of the protein, among which, its cytostatic and pro-apoptotic activities. Moreover, our results suggest that Vpr accumulation at the nuclear envelope could contribute to optimization of viral replication in nondividing cells, such as macrophages. We also characterized a new interaction between the nucleoporin hCG1 and the p50/dynamitin, a central subunit of the dynein/dynactin microtubular complex. Although no information exist in the literature concerning molecular determinants of the p50/dynamitin responsible for its structural role in the dynactin complex, our work revealed the molecular and functional basis of this property

La proteine tat du virus vih-1 est un trans-activateur puissant permettant la surexpression de tous les genes viraux, par l'intermediaire de sa cible arn, tar, situee dans le ltr 3' du virus. L'objectif premier de ce travail a ete de purifier la proteine tat sous forme native correctement repliee afin de tester son activite biologique. Differents systemes d'expression et schemas de purification ont ete etudies, dans lesquels l'usage d'agents denaturants a ete proscrit, car la renaturation d'une telle proteine genere le plus souvent un melange en partie inactif. Le gene tat a ete clone et exprime chez e. Coli, seul ou en fusion avec les genes de la glutathione s-transferase (gst) ou de la beta-galactosidase. Seule la fraction de proteine tat soluble, non agregee est utilisee dans les procedures de purification. Par rapport a tat, les niveaux d'expression et de solubilite de la fusion gst-tat sont significativement ameliores (7-8% des proteines totales, dont 80% solubles). Toutefois, l'utilisation de la beta-galactosidase en tant qu'etiquette de purification par affinite s'est averee plus efficace et specifique que la gst. La mise au point de la chromatographie d'immunoaffinite a finalement permis d'isoler tat, non fusionnee ou issue du clivage de la fusion beta-gal-tat par la thrombine, a plus de 90% de purete. Les differents echantillons de tat ont ete testees in vitro pour determiner leur capacite, d'une part a interagir avec tar, et d'autre part a trans-activer l'expression du gene rapporteur cat dans des cellules hela en culture. Les differentes voies de production de tat ne sont pas strictement equivalentes en terme d'activite biologique. Toutes les formes presentent une certaine activite trans-activatrice mais les resultats les plus coherents entre les deux tests sont obtenus avec la proteine non fusionnee. Ceci indique que le repliement de tat, implique dans son activite biologique, est probablement modifie par son partenaire de fusion. Des etudes preliminaires montrent par ailleurs que la proteine tat purifiee exogene est capable d'activer des cellules endotheliales, en provoquant leur adhesion a une lignee de macrophages en synergie avec le tnf-alpha. Tat pourrait ainsi jouer un role indirect dans l'inflammation et eventuellement dans la dissemination des tumeurs, associees a l'infection par le virus

Chez les vertébrés, l'activation des origines de réplication est soumise à une régulation spatiale et temporelle. Dans les embryons précoces de xénope, les origines sont positionnées sans aucune spécificité de séquence et sont activées en clusters à différents moments de la phase S. L'objectif principal de ce travail a consisté à caractériser cette régulation temporelle en analysant d'une part, l'activation des origines au sein de fibres individuelles d'ADN, et d'autre part, la distribution des foyers de réplication au sein de noyaux de spermatozoïde incubés dans des extraits d'œufs de xénope. Grâce à la technique de peignage moléculaire, nous avons comparé la distribution des origines de réplication au début de deux phases S consécutives. L'absence de coïncidence « temporelle » entre les origines démontre que le moment d'activation des origines ne dépend pas de la position génomique et qu'il n'existe pas de régulation épigénétique du moment de réplication à l'échelle des origines. Cependant l'observation d'une coïncidence entre les foyers utilisés au début de deux cycles consécutifs suggère qu'une organisation chromosomique pourrait influencer le moment de réplication. L'analyse de la réplication de l'ADN ribosomique par FISH a fourni un exemple de domaine chromosomique répliqué plus tardivement que l'ADN génomique global. Une structure chromatinienne particulière pourrait expliquer ce retard. Par ailleurs, la fréquence d'initiation à ce locus est deux fois plus faible dans l'espaceur intergénique très riche en G+C que dans la région codante. Au sein de ce locus, il pourrait donc exister des facteurs locaux influençant le positionnement des origines de réplication
In Vertebrates, replication origins are activated according to a spatial and temporal program. In early Xenopus embryos, origins are located at apparently random sequences and are activated in clusters that fire at different times throughout S phase. The main object of the present work is to characterize the temporal regulation of replication in Xenopus egg extracts through analysis of origin activation on single DNA fibers and replication foci distribution in sperm nuclei. Using molecular combing of DNA, we compared the distributions of replication origins fired at the beginning of two following S phases. Absence of significative coincidence between origins shows that the temporal order of replication does not depend on genomic position. Furthermore, no epigenetic central regulates the moment of origin firing. However the detection of coincidence between replication foci labeled at the beginning of two following S phases suggests that the chromosomal organization may influence the replication timing. Using FISH, we showed that the replication of the ribosomic DNA is delayed compared to the replication of whole genomic DNA. An altered chromatin structure may be responsible for this delay. Mapping of origins revealed that initiation frequency is two fold lower in the G+C rich intergenic spacer than in the coding rDNA sequence. At the rDNA, local parameters such as nucleotide composition may influence the localization of replication origins

Le travail présenté ici est une investigation de la réponse aux dommages à l’ADN induite par les rayons ultra-violets (UV), et plus particulièrement de la réponse H2AX induite par les UV pendant la phase de réplication de fibroblastes humains. Pendant la phase de réplication, les rayons UV induisent la phosphorylation de la serine 138 de l’histone H2AX (γH2AX), soit sous la forme de foci, soit de facon diffuse, hyperintense, dans tout le noyau cellulaire (pan-nucleaire). La détection en immunofluorescence de γH2AX sous forme de foci est utilisé comme mesure directe du nombre de cassures double brin de l’ADN. En effet, les foci de γH2AX peuvent etre induits expérimentalement directement par les rayons ionisants, ou indirectement par l’inhibiteur de la toposiomerase 2 (VP16) et après irradiation UV par rupture des fourches de réplication bloquées par les dimères de thymidines. De plus, la co-localisation des foci de γH2AX avec 53BP1, un autre marqueur de cassure double brin de l’ADN, est observée après irradiation ionisante et traitement par le VP16 à l’emplacement des cassures double brin. Après irradiation UV cependant, la réponse γH2AX est plus complexe qu’après irradiation ionosante. Ainsi, le pourcentage des foci de γH2AX indiquant la présence de cassures double brin de l’ADN reste indeterminé. Par ailleurs, la genèse et la fonction de la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication restent à découvrir. Pour répondre à ces questions, nous avons mesuré la fraction de foci de γH2AX co-localisant avec 53BP1 après irradiation UV en immunofluorescence. Nous avons ensuite caracterisé l’effet de l’inhibition des kinases ATM, ATR, JNK et de la perte de la polymerase translesionelle Pol eta sur la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication. Nous avons découvert que moins de 50% du nombre total des foci de γH2AX co-localisent avec 53BP1 après irradiation UV, comparés aux pourcentages proche de 100% observés après irradiation ionisante ou exposition au VP16. Par ailleurs, pendant la phase de réplication, l’induction par les rayons UV de la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX n’est pas associée a la présence de foci de 53BP1. Nous montrons que la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication est un signal pré-apoptotic médié par les kinases ATM et JNK, dont l’intensité est augmentée par l’inhibition de ATR et en l’absence de la polymerase translesionelle Pol eta. Nos résultats indiquent par conséquent que la réponse γH2AX après dommages à l’ADN induits par les UV est complexe et suggèrent qu’elle peut survenir en l’absence de cassure double brin. γH2AX ne devrait donc pas être utilisé systématiquement comme mesure directe du nombre de cassures double brin de l’ADN sans corroborations independantes supplémentaires
We compared UV irradiation and treatment with etoposide, an agent that causes DSBs during DNA replication. We found that during DNA replication UV irradiation induced at least three classes of γH2AX response: a minority of γH2AX foci co-localizing with 53BP1 foci that represent DSBs at replication sites; a majority of γH2AX foci that did not co-localize with 53BP1 foci; and cells with high levels of pan-nuclear γH2AX without foci of either γH2AX or 53BP1. ATM and JNK mediated the UV-induced pan-nuclear γH2AX, which preceded and paralleled UV-induced S phase apoptosis. These high levels of pan-nuclear γH2AX were further increased by loss of the bypass polymerase Pol eta or inhibition of ATR, but required the presence of the damage binding proteins of excision repair XPA and XPC. DSBs therefore represent a small variable fraction of UV-induced γH2AX foci dependent on repair capacity and are not detected within high levels of pan-nuclear γH2AX, a pre-apoptotic signal associated with ATM and JNK-dependent apoptosis during replication. The formation of γH2AX foci after treatment with DNA-damaging agents cannot therefore be used as a direct measure of DSBs without independent corroborating evidence

Le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un virus enveloppé à ARN de polarité positive infectant plus de 170 millions de personnes dans le monde et responsable de maladies chroniques du foie. Nous avons, au cours d’une étude précédente, démontré que l’expression stable et transitoire de la protéine de capside virale diminue la concentration du calcium de Réticulum Endoplasmique (RE) et induit la mort cellulaire par apoptose-Calcium dépendante. Nous avons alors émis l’hypothèse que la modulation des concentrations calciques intracellulaires par l’intermédiaire de drogues ciblant spécifiquement la signalisation calcique pouvait avoir un impact sur la réplication et l’expression des protéines du VHC. Avec le développement de la lignée cellulaire Huh7 exprimant de manière stable le génome complet du VHC (modèle replicon du VHC) et plus récemment encore celle de la lignée générant des particules virales infectieuses en culture cellulaire, nous avons eu l’opportunité d’étayer notre hypothèse de départ en modulant l’homéostasie calcique cellulaire grâce aux drogues sélectionnées suivantes: CAI, CsA, DEBIO-025, Thapsigargine, tbuBHQ et CGP37157. Les concentrations intracellulaires de calcium sont mesurées grâce à des sondes recombinantes ciblant spécifiquement le Calcium cellulaire. Les techniques classiques de Western Blot et d’Immunocytochimie nous ont permis de quantifier l’expression des protéines virales et La réplication virale fut évaluée par RT-PCR quantitative en temps réel. Le RE est connu pour jouer un rôle majeur dans la régulation du Calcium intracellulaire mais aussi dans la maturation des protéines virales et la réplication du VHC. Nos résultats démontrent que la modulation pharmacologique du Calcium intracellulaire affecte aussi bien l’expression des protéines virales que la réplication du VHC. Ces données confortent le rôle pivot de la signalisation calcique dans le cycle de multiplication virale et mettent au jour une nouvelle classe de drogues potentiellement capables de contrôler l’infection par le VHC
Hepatitis C Virus (HCV) is a positive strand RNA virus affecting more than 170 million people in the world and responsible for chronic liver disease. We have previously shown that transient and stable expression of HCV Core protein decreases ER Calcium concentration and induces apoptotic cell death in a calcium dependent manner. We thus tested the hypothesis that modulation of calcium concentrations in the ER by specific drugs can have an impact on HCV protein expression and HCV replication. With the advent of the Huh7 cell line stably expressing the full length HCV genome (replicon system) and more recently systems to generate infectious virus particles in cell culture, we have the opportunity to check our initial hypothesis by modulating intracellular calcium concentrations with the following drugs: CAI, CsA, Debio-025, Thapsigargin, TbuBHQ and CGP37157. Intracellular calcium concentrations were assessed by specifically targeted recombinant aequorin calcium probes. Viral proteins expression was measured by Western Blot and Immunocytochemistry. The amount of viral RNA was evaluated by real-time quantitative RT-PCR. The ER is known to have a major role both in regulation of calcium signalling and in HCV proteins maturation and genome replication. Our results show that pharmacological modulation of intracellular calcium concentration affects HCV proteins expression and HCV replication. Our results are consistent with a pivotal role of calcium signalling in HCV replication and show a new class of drugs potentially able to control HCV infection

Les spumarétrovirus (ou virus foamy) constituent la troisième sous-famille des rétrovirus complexes, à côté des oncovirus et des lentivirus. L'isolat humain HFV (Human Foamy Virus) fut le premier rétrovirus mis en évidence chez l'homme. Les spumarétrovirus sont caractérisés par un fort effet cytopathogène en culture mais semblent non pathogènes chez leurs hôtes naturels, chez lesquels ils induisent des infections à long terme. Afin de mieux cerner les mécanismes de la persistance virale, nous avons analysé l'ADN proviral et l'expression de HFV dans un modèle d'infection persistante que nous avons établi dans la lignée cellulaire Dami d'origine mégacaryocytaire. Nous avons montré que ces lignées chroniques qui ne produisent pas de virus et ne sont pas lysées , ont majoritairement intégré le génome viral dans celui de la cellule hôte. Cette situation contraste avec l'infection aigue͏̈ par HFV, où l' ADN proviral est presque totalement sous forme libre. Nous avons également mis en évidence dans ces lignées la présence de la délétion spécifique dans le transactivateur Bel1, conduisant à l'absence du transactivateur viral indispensable à la réplication du virus. Nous avons montré que la différence majeure entre l'infection lytique et l'infection persistante est l'absence de synthèse des protéines virales structurales. En effet, seule la protéine Bet est exprimée dans les clones Dami chroniques et nos expériences suggèrent qu'elle pourrait être impliquée dans l'établissement et/ou le maintien de la persistance virale. Au cours d'études sur la variabilité des LTRs des spumarétrovirus, nous avons mis en évidence une nouvelle délétion dans la LTR de HFV (nommée " S "), à côté des deux autres formes de LTR déjà décrites (nommées " L " et " M "). Nous avons alors recherché ces différentes formes dans les systèmes en infections virales aigue͏̈s et chroniques, in vivo et in vitro. Nos études ont montré la coexistence au cours d'infections virales aigue͏̈s des trois formes de LTRs alors que les formes délétées sont majoritairement ou exclusivement présentes dans des cas d'infections chroniques aussi bien in vivo que in vitro. Les fonctions promotrices des LTRs ne sont pas altérées par ces délétions, néanmoins, des nuances dans les taux d'activation et les activités basales apparaissent. Nous avons également montré que ces LTRs différaient les unes des autres par des délétions spécifiques bordées par des répétions directes de quelques paires de bases. En nous basant sur des modèles établis antérieurement, nous avons émis l'hypothèse que ces LTRs délétées soient générées à partir de la forme entière par un mécanisme non aléatoire impliquant un saut de la transcriptase inverse facilité par ces séquences répétées. Le rôle de ces délétions et leur possible implication dans l'établissement de la chronicité sont discutés.