Academic literature on the topic 'Réponse stringente'

La réponse stringente est un processus mis en place lors d'une carence nutritionnelle qui permet l'arrêt coordonné de la croissance. Cette réponse essentielle à la survie des bactéries est très conservée. Elle se caractérise par la production et l'accumulation de guanosine tretra- et pentaphosphate (ppGpp). Le ppGpp, en se fixant sur l'ARN polymérase modifie ses propriétés cinétiques et affecte ainsi de manière globale la transcription de très nombreux gènes. Principalement, l'accumulation de ppGpp inhibe la biosynthèse des ARNs stables (ARNr et ARNt) et en conséquence inhibe la biogenèse des ribosomes. Chez Escherichia coli, le niveau de ppGpp est régulé par les deux enzymes RelA et SpoT. Lors d'une carence en acides aminés, RelA fixée au ribosome détecte le blocage de la machinerie traductionnelle causée par la fixation d'un ARNt déacylé au site A du ribosome, et synthétise du ppGpp. SpoT quant à elle serait capable de détecter et de synthétiser le ppGpp en réponse à d'autres carences nutritionnelles notamment en source de carbone, mais les mécanismes et les signaux détectés sont inconnus. Il a été proposé que la protéine CgtA serait impliquée dans le contrôle de la réponse stringente, en interagissant avec SpoT au niveau des ribosomes. CgtA est une GTPase conservée et essentielle de la famille Obg, mais sa fonction précise est inconnue. Elle a été impliquée à la fois dans la maturation des ribosomes et dans la ségrégation des chromosomes et la division. Le gène cgtA est situé en aval des gènes rplU, rpmA, et yhbE codant respectivement pour les protéines L21 et L27 de la sous-unité 50S du ribosome et pour une protéine intégrale de membrane interne de fonction inconnue
The stringent response is a physiological process that occurs when bacterial cells encounter nutritional stresses, and allowing coordinated growth arrest. This conserved response is characterized by the accumulation of tetra- and pentaphosphate guanosine (ppGpp). ppGpp bind to RNA polymerase and modifies its kinetic properties, thereby affecting the transcription of many genes. Prinicpaly, ppGpp accumulation inhibits stable RNAs (rRNA and tRNA) biosynthesis, which in consequence inhibits ribosome biogenesis. Escherichia coli contains two enzymes involved in ppGpp metabolism, RelA and SpoT. During amino acid starvation, RelA bound to ribosomes produces ppGpp in response to the presence of uncharged tRNA in the ribosomal A-site. In contrast, SpoT produces ppGpp in response to other types of nutrient limitations, such as carbon starvation, but the detected signals and mechanism involved are still unknown. It has been proposed that the CgtA protein is involved in the stringent response control by interacting with SpoT at the ribosome. CgtA is a conserved and essential small GTPase of the Obg family. CgtA has also been implicated in ribosome maturation, chromosome segregation and division, but its precise function remains unknown. The cgtA gene is located downstream of rplU, rpmA and yhbE genes coding respectively for L21 and L27 proteins of the 50S subunit of the ribosome, and an integral inner membrane protein of unknown function. This genetic proximity with rplU and rpmA genes is highly conserved in bacteria. My thesis work was therefore organized around three questions. First, understanding the role of CgtA in growth control and in the stringent response

Dans la nature, les organismes sont constamment soumis à des variations de l'environnement, de nature chimique, physique ou nutritionnelle. La modulation du taux de mutation constitue un des mécanismes contribuant à l'adaptation des espèces bactériennes à de rapides changements environnementaux. L'objectif de ce travail a été de mettre en évidence l'action de facteurs environnementaux sur l'instabilité génétique caractérisée chez Streptomyces. Au travers de l'étude de mutants de S. Ambofaciens et S. Coelicolor, dépigmentés et non sporulants, produits lors de la formation du mycélium aérien, nous avons montré qu'une limitation en acides aminés constituait une condition mutagène. En effet, sur des milieux pauvres en acides aminés, la production de ces mutants était fortement augmentée. Une mutation dans leurs gènes whiG ou whiH, deux gènes intervenant dans les premières étapes du processus de sporulation, a fréquemment été détectée. Nous avons pu mettre en évidence, via l'étude du mutant relA de S. Coelicolor, l'existence d'un lien entre réponse stringente, réponse physiologique induite lors d'une limitation en acides aminés, et augmentation de la mutabilité de ces gènes. Il existe ainsi une relation entre une limitation nutritive et une augmentation de l'instabilité génétique via l'établissement d'un état mutateur global ou localisé, initié par le déclenchement de la réponse stringente. Les mutants produits pourraient contribuer à la survie de la colonie lors d'une limitation en acides aminés en métabolisant des substances différentes du reste de la colonie ou en permettant le relargage de nutriments, nourriture pour les cellules voisines
In nature, organisms are constantly subjected to chemical, physical or nutritional variations of the environment. The modulation of the mutation rate constitutes one of the mechanisms contributing to the adaptation of bacterial species to rapid environmental modifications. The aim of this work was to highlight the influence of environmental factors on the genetic instability characterized in Streptomyces species. Through the study of S. Ambofaciens and S. Coelicolor mutants, not pigmented, unable to sporulate and produced during the aerial mycelium growth, we showed that a limitation in amino acids constituted a mutagen condition. Indeed, on amino acid-limited media, the production of these mutants was strongly increased. A mutation in their whiG or whiH genes, two genes intervening in the first stages of the sporulation process, was frequently detected. We could highlight, via the study of the relA mutant of S. Coelicolor, the existence of a link between stringent response, the physiological response induced during an amino acid limitation, and increase in the mutability of these genes. There is thus a relation between a nutritive limitation and an increase in genetic instability via the establishment of a local or global mutator state, initiated by the induction of the stringent response. The produced mutants could contribute to the survival of the colony during an amino acid limitation metabolising substances different from the rest of the colony or allowing the release of nutrients, food for the neighbour cells

Les mécanismes d'adaptation d'Escherichia coli à une alternance quotidienne entre des conditions de croissance et de carence ont été étudiés grâce à une stratégie d'évolution expérimentale. Douze populations d'E. coli, dérivant d'un ancêtre commun, ont été propagées pendant plus de 40 000 générations par transferts journaliers dans un milieu minimum contenant une quantité limitante de glucose. L'évolution des 12 populations se caractérise par un degré important de parallélisme phénotypique (augmentation du fitness et du volume cellulaire, ...) et génétique, les mêmes gènes étant ciblés par la sélection naturelle dans la majorité des populations. Des mutations bénéfiques ciblant le gène spoT, acteur majeur de la réponse stringente permettant l'adaptation aux carences, avaient été identifiées dans 8 populations. Nous avons mis en évidence des mutations bénéfiques ciblant des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi (pbpA-rodA) et la superhélicité de l'ADN (topA, fis). L'étude moléculaire de 2 mutations bénéfiques touchant l'opéron pbpA-rodA révèle qu'elles diminuent la quantité de protéine PBP2. L'analyse de 3 mutations ciblant le gène spoT montre qu'elles atténuent le contrôle stringent lors de l'entrée en phase stationnaire sans modifier les niveaux cellulaires de (p)ppGpp. Différentes mutations d'un même gène ayant les mêmes effets, l'évolution révèle un parallélisme moléculaire important. Près de la moitié des mutations bénéfiques affecte les réseaux de régulation globale de l'expression des gènes (spoT, fis, topA). La plasticité des réseaux de régulation globale joue donc un rôle primordial au cours de l'évolution et l'adaptation des bactéries.

Lors d’une carence nutritionnelle, les bactéries synthétisent du (p)ppGpp dont l’accumulation déclenche la réponse stringente, caractérisée par un arrêt de la croissance et une modulation de l’expression génétique. E. Coli possède deux protéines impliquées dans le métabolisme du (p)ppGpp, RelA et SpoT. Alors que RelA répond à une carence en acides aminés par un mécanisme bien défini, SpoT répond à une carence en acides gras ou en carbone par un mécanisme toujours inconnu. Au cours de ma thèse, nous avons caractérisé une interaction physique entre SpoT et l’Acyl Carrier Protein (ACP), co-facteur central de la synthèse des acides gras. La perte de cette interaction empêche l’accumulation de (p)ppGpp lors d’une carence en acides gras, suggérant que l’interaction ACP/SpoT est impliquée dans la réponse au stress SpoT-dépendante. Ainsi, nous avons proposé un modèle dans lequel une modification d’ACP signale une carence en acides gras à SpoT, entraînant un changement conformationnel de SpoT et la synthèse de (p)ppGpp. Afin d’étudier l’importance de cette interaction dans la physiologie bactérienne, nous avons construit des souches dans lesquelles l’interaction entre SpoT et ACP est abolie en introduisant des mutations ponctuelles dans le gène spoT. Ces souches présentent des phénotypes de croissance ainsi que des altérations de l’enveloppe cellulaire. De plus, dans ces souches la réponse à la carence en acides gras et l’interaction ACP/SpoT sont altérées dans un contexte ΔrelA mais pas dans un contexte relA+, suggérant un rôle de RelA dans l’interaction ACP/SpoT. L’étude de la conservation de l’interaction ACP/SpoT parmi différentes espèces bactériennes nous a permis de montrer que cette interaction n’est conservée que dans une minorité de bactéries contenant des enzymes de type SpoT. Enfin, nous avons caractérisé un réseau d’interactions centré autour de SpoT, liant des protéines impliquées dans la traduction et dans le métabolisme des lipides. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l’interaction ACP/SpoT est importante pour la physiologie bactérienne, notamment en conditions de carence
Bacteria respond to various nutritional stresses by producing (p)ppGpp. The accumulation of this nucleotide triggers the stringent response, which is characterized by growth arrest and the modulation of gene expression. E. Coli contains two enzymes involved in (p)ppGpp metabolism, RelA and SpoT. RelA responds to amino acid starvation by a well known mechanism, whereas SpoT produces (p)ppGpp during fatty acid or carbon starvation but the mechanism for this response is unknown. During my thesis, we characterized a physical interaction between SpoT and Acyl Carrier Protein (ACP), a central co-factor in fatty acid synthesis. The loss of this interaction prevents (p)ppGpp accumulation in response to fatty acid starvation, supporting the idea that the ACP/SpoT interaction is involved in SpoT-dependent stress response. This led us to propose a model in which an ACP modification signals fatty acid starvation to SpoT, triggering a conformational switch in SpoT and so leading to (p)ppGpp synthesis. Then, in order to study the importance of the ACP/SpoT interaction in bacterial physiology, we have engineered E. Coli strains in which this interaction is abolished by introducing specific point mutations in spoT gene. These strains present growth phenotypes and envelope defects. Furthermore, the response to fatty acids starvation and the interaction between ACP and SpoT mutated proteins in these strains are affected in a ΔrelA context but not in a relA+ context, suggesting a role for RelA in the ACP/SpoT interaction. Studying the conservation of the ACP/SpoT interaction between bacterial species, we show that this interaction is only present in bacteria containing SpoT enzymes. Lastly, we characterized an interaction network centred on SpoT, linking translation and lipid metabolism proteins. All these data suggest that the ACP/SpoT interaction is important for bacterial physiology, even more during starvation condition

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie commensale, présente de façon asymptomatique dans le rhinopharynx de 20 % d'adultes et 50 % d'enfants. Cette bactérie peut devenir un pathogène majeur responsable de pneumonies, de méningites et de septicémies, et cause 1,5 million de morts chaque année dans le monde. Il existe deux méthodes de lutte : l'antibiothérapie et la vaccination. Ces deux stratégies se heurtent à la grande variabilité génétique du pneumocoque, essentiellement due à sa capacité à transformer naturellement. La transformation requiert le développement d'un état physiologique transitoire appelé compétence. Sa régulation met en jeu une boucle autocatalytique conduisant à l'expression des gènes de compétence. Mon travail de thèse a porté sur l'étude des mécanismes moléculaires responsables de l'initiation de la compétence. Des études menées au laboratoire ont montré l'implication indirecte de Ami (transport d'oligopeptides) dans la répression de la compétence. Les acides aminés transportés par Ami pourraient servir de jauge métabolique sentie par RelA (réponse stringente) ou par CodY. Nos résultats montrent que le ppGpp est un activateur de la compétence, mais cette molécule n'est pas le seul signal aboutissant au développement de la compétence, et que CodY pourrait être un répresseur de la compétence. De plus, nous avons montré que codY est essentiel et que son inactivation peut aboutir à la formation de structures mérodiploïdes. De plus, l'absence de CodY peut être compensée par la présence de 2 mutations, fatC et amiC, ou par d'autres mutations qui n'ont pas encore été identifiées
Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is found in the nasopharynx of 20% of adults and 50% of children. The pneumococcus is a major pathogen, causing pneumonia, otitis media, meningitis and bacteriema. Every year, pneumococcal infections kill 1. 5 million people worldwide. The two methods used to fight this pathogen (vaccination and antibiotherapy) can be bypassed by the high genetic variability of the pneumococcus. Natural genetic transformation is responsible for this variability and requires the pneumococcus to enter a transitory physiological state called competence. This state is based on an autocatalytic loop that induces the expression of the genes involved in competence. This thesis focusses on molecular mecanisms that lead to competence initiation in the pneumococcus. Studies carried out in our lab have shown that the Ami transporter is involved in competence regulation. Amino acids (intrenaliszed throught Ami) may be a metabolic gauge for competence regulation. Results show that ppGpp is involved in competence development activation but that other regulatory signals are also involved. The regulator CodY might be a competence repressor. On the other hand, this study has shown that codY is an essential gene and that its inactivation can lead to merodiploid formation. Furthermore, the absence of CodY can be compensated by the presence of two mutations, in the fatC and amiC genes, or by the presence of other mutations not yet characterized

Les infections en biofilm, notamment de dispositifs médicaux, mettent fréquemment en échec les traitements antibiotiques, imposant le retrait du matériel. Pseudomonas aeruginosa s’est imposé comme le pathogène-type des infections en biofilm. Pour explorer les déterminants de l’échec du traitement antibiotique en biofilm, un modèle de biofilm in vitro à P. aeruginosa exposé à des doses supra-inhibitrices d’antibiotiques a été développé. En culture planctonique, une bithérapie deciprofloxacine et d’amikacine permettait de prévenir la sélection de mutants résistants pour des souches de P. aeruginosa de sensibilité diminuée à la ciprofloxacine ou à l’amikacine par surexpression d’efflux. En biofilm, l’association de la ciprofloxacine et de l’amikacine, administrées simultanément ou séquentiellement, n’était pas supérieure aux monothérapies, permettant une réduction bactérienne, mais pas d’éradication complète du biofilm. Quelles que soient les souches (sauvages ou exprimant un efflux) et l’antibiotique, l’échec microbiologique en biofilm était lié à la sélection de cellules persistantes, tolérantes aux antibiotiques. La ciprofloxacine induisait des modifications importantes de la structure du biofilm avec une réduction considérable des exopolysaccharides, composants majeurs de la matrice. L’étude transcriptomique de gènes potentiellement impliqués dans la persistance suggérait que l’activation précoce de la réponse stringente pourrait être une des voies principales de la tolérance en biofilm sous ciprofloxacine. Enfin, la présence de « small colony variants » au sein du biofilm, dotés d’une capacité accrue de formation de biofilm, témoignait de la diversité des populations en biofilm. Ces travaux participent ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes d’échappement aux antibiotiques de P. aeruginosa en biofilm
Biofilm device-related infections can lead to antibiotic failure requiring frequent removal of medical device. Pseudomonas aeruginosa has emerged as the typical pathogen for biofilm infections. To explore the determinants of antibiotic failure in biofilm, an in vitro P. aeruginosa biofilm model exposed to suprainhibitory antibiotic concentrations was developed. In planktonic culture, the ciprofloxacin and amikacin combination prevented the selection of resistant mutants in ciprofloxacin and amikacinlow-level resistant P. aeruginosa strains overexpressing efflux. In biofilm, the ciprofloxacin and amikacin combination, used simultaneously or sequentially, didn’t show superior effects compared to monotherapies. Despite an initial bacterial reduction, biofilm eradication was not obtained. Regardless of wild-type or efflux strains and antibiotic regimen used, antibiotic failure was related to the selection of antibiotic-tolerant cells named “persisters”. Ciprofloxacin induced significant alterations in the biofilm structure, notably a considerable reduction in the exopolysaccharides of the matrix. The transcriptomic analysis of genes, potentially involved in persistence, suggested that early activation of the stringent response might be one of the main pathways for ciprofloxacin tolerance in biofilm. Finally, the emergence of "small colony variants" within the biofilm, characterized by enhanced ability to form biofilm, attested to biofilm heterogeneity. This work therefore contributes to a better understanding of how P. aeruginosa biofilms escape antibiotic

Bien que divers mécanismes coopèrent pour empêcher les erreurs lors de la synthèse des protéines chez les bactéries, des erreurs traductionnelles de type « frameshift » (ETFs) ou « faux-sens » peuvent avoir lieu. En particulier, les ETFs ont été détectées à de faibles niveaux lors de la phase de croissance exponentielle et à des niveaux plus élevés durant la phase de croissance stationnaire chez Escherichia coli et Bacillus subtilis. Ces observations ont conduit les chercheurs à revoir le rôle de la "réponse stringente" dans la survenue des ETFs, qui constitue l’un des mécanismes clé de l'adaptation bactérienne aux changements nutritionnels. Elle découle de l'interaction entre un ribosome en cours de traduction et la protéines RelA/SpoT ce qui permet de détecter les ARNs de transfert (ARNts) non chargés et résulte en la production d'une molécule appelée (p)ppGpp . Dans une souche mutante relA incapable de synthétiser le (p)ppGpp, les ETFs sont fortement augmentées.Dans ce contexte, notre objectif principal a été de revisiter le rôle de la réponse stringente dans le contrôle des erreurs traductionnelles et de clarifier le rôle des deux métabolites antagonistes GTP et (p)ppGpp. Par exemple, le GTP stimule l'initiation de la traduction (en ciblant le facteur d'initiation IF2) alors que le (p)ppGpp inhibe l'initiation de la traduction (en rentrant en concurrence avec le GTP pour se fixer sur IF2).A cette fin, nous avons utilisé le modèle des bactéries à Gram positif B. subtilis, conçu trois systèmes rapporteurs distincts pour détecter les ETFs et construit une souche incapable de synthétiser du (p)ppGpp (appelée "(p)ppGpp0"). Nous avons observé qu'au cours de la croissance dans des milieux pauvres, les ETFs augmentent en l'absence de (p)ppGpp durant la phase exponentielle et que, contrairement à la souche sauvage, la souche (p)ppGpp0 présente un pic d’ETFs en milieu riche pendant la transition à la phase stationnaire. En contrôlant les niveaux intracellulaires de GTP dans la souche (p)ppGpp0, nous avons montré que l'abondance de GTP est le facteur qui déclenche l'apparition des ETFs. Néanmoins, après une "faible" induction de la biosynthèse du GTP conduisant à des taux de croissance sous-optimaux, le niveau d’ETFs forme toujours un pic lors de la transition vers la phase stationnaire, ce qui montre que le mode d'action du (p)ppGpp pour prévenir l'apparition des ETFs ne repose pas uniquement sur son action inhibitrice de la biosynthèse du GTP. Nous nous sommes alors concentrés sur l'effet inhibiteur du (p)ppGpp sur IF2 et avons mimé son action en injectant des drogues connues pour inhiber l'initiation de la traduction. Nous avons ainsi démontré qu'en réduisant l'initiation de la traduction lors de l'épuisement des aminoacyl-ARNts, la souche "(p)ppGpp0" est capable de contrôler de façon optimale le taux d’ETFs lors de la transition vers la phase stationnaire.Dans une deuxième partie, nous avons étudié comment la transcription et la traduction sont affectées par les variations du niveau de GTP et de (p)ppGpp. Nous avons observé que les gènes possédant un "+1" de transcription (TSS, « transcription start site ») composé de deux guanines (gènes artificiels et ARNs ribosomaux) ont vu leur taux de transcription positivement corrélés au taux de croissance à l'inverse des gènes possédant un TSS composé de deux adénines. Cette différence est encore plus prononcée pour la souche (p)ppGpp0 cultivée en milieu riche lors de l'ajout de guanosine (ce qui conduit à un niveau élevé de GTP).En conclusion, nous avons démontré que le (p)ppGpp contrôle le niveau d'erreurs traductionnelles lors de la croissance en régime permanent en abaissant les niveaux de GTP et lors d’un changement nutritionnel en inhibant spécifiquement l'initiation de la traduction, assurant une allocation parcimonieuse des ressources au sein de la bactérie
Even though diverse mechanisms cooperate to prevent protein synthesis errors in bacteria, missense and translational frameshift errors (TFEs) can occur . In particular, TFEs were detected at low levels in the exponential growth phase and at higher levels in the stationary phase in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. This observation led researchers to revisit the role of the “stringent response” in the occurrence of TFEs since it is the key mechanism involved in the bacterial adaptation to nutritional downshifts. It relies on the interaction between the RelA/SpoT proteins and the translating ribosomes, which leads to the detection of uncharged tRNAs and to the production of an alarmone called (p)ppGpp. In a relA mutant strains unable to synthesize (p)ppGpp, translational errors are highly increased.In this context, the main goal of our work was to revisit the role of the stringent response in the translational error control and to clarify the role of the two key, antagonistic metabolites GTP and (p)ppGpp. Indeed, while GTP enhances translation initiation (targeting the initiation factor IF2) and elongation (targeting the elongation factor EF-Tu) , (p)ppGpp inhibits GTP biosynthesis (reducing the enzyme activity of Gmk, HprT and GuaB) and translation initiation (competing with GTP on IF2).For this purpose, we used the Gram positive model bacterium B. subtilis, designed three distinct reporter systems to detect TFEs and built a strain unable to synthesize (p)ppGpp (called “(p)ppGpp0”). We observed that during growth in poor media TFEs were increased in the absence of (p)ppGpp in the exponential phase (i.e. steady-state growth) and that by contrast to the wild type, the (p)ppGpp0 strain exhibited a TFE burst during the transition in rich medium to the stationary phase. By controlling intracellular levels of GTP in the (p)ppGpp0 strain, we showed that GTP abundance is the trigger factor of TFEs occurrence. Nevertheless, upon a "weak" induction of GTP biosynthesis leading to sub-optimal growth rates, the TFEs rate still peaked during the transition to the stationary phase, which demonstrated that the mode of action of (p)ppGpp to prevent TFEs occurrence did not only rely on its inhibition of GTP biosynthesis. We then focused on the (p)ppGpp inhibitory effect on IF2 and mimicked its action by injecting drugs known to inhibit translation initiation. Hence, we demonstrated that by reducing translation initiation (injecting drugs) upon aminoacyl-tRNAs depletion (p)ppgGp0 wild-strain type cells is are able to optimally control the rate of TFEs in the transition to the stationary phase. The same conclusion is obtained even in presence of a high GTP level.In a second part, we studied how transcription and translation are affected by variations in GTP and (p)ppGpp abundances. We observed that genes possessing a transcription start site (TSS) made of two guanines were more importantly transcribed at higher growth rates than genes possessing a TSS made of two adenines. This difference was even more pronounced for (p)ppGpp0 strains grown in rich medium upon guanosine addition (leading to a high level of GTP). Moreover, the ribosomal RNAs (rrns; for which the TSS is a guanine) synthesis level seemed to be positively correlated to GTP levels during exponential growth in poor and rich media as observed by the modulation of GTP biosynthesis.In conclusion, we demonstrated that (p)ppGpp controls the occurrence of translational errors during steady-state growth by decreasing GTP levels and during a nutritional downshift by specifically inhibiting translation initiation ensuring a parsimonious , which also globally affects resource allocation

La synthèse des protéines cellulaires requiert à la fois des ribosomes fonctionnels et des ARN de transfert (ARNt) matures comme molécules adaptatrices. Les ribosomes sont de larges complexes ribonucléoprotéiques dont la biogenèse représente la plupart de la transcription cellulaire et consomme une majeure partie de l’énergie de la cellule. Par conséquent, la biogenèse des ribosomes fait l’objet d’une régulation importante afin d’ajuster le nombre de ribosomes aux besoins de la cellule et de dégrader efficacement les particules défectueuses qui pourraient interférer avec la traduction. Les ARNs ribosomiques (ARNr) et les ARNt sont tous deux transcrits sous formes de précurseurs et sont universellement maturés pour devenir fonctionnels pour la traduction. Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un couplage entre la maturation des ARNt et la biogenèse des ribosomes chez la bactérie modèle à Gram positif Bacillus subtilis. Ainsi, l’accumulation d’ARNt immatures lors d’une déplétion en enzymes de maturation, abolit spécifiquement la maturation en 3’ de l’ARNr 16S par l’endoribonucléase YqfG/YbeY, dernière étape dans la formation de la petite sous-unité ribosomique (30S). Nous avons mis en évidence que ce défaut de maturation résultait d’un défaut d’assemblage tardif du 30S coïncidant avec des changements d’expression de plusieurs facteurs d’assemblage du ribosome. Nous avons montré que cette modulation d’expression provenait d’effets transcriptionel et post-transcriptionel. De façon inédite, nos résultats indiquent que l’accumulation d’ARNt immatures est perçue par RelA (le facteur de la réponse stringente), déclenchant la production de (p)ppGpp. Nous avons observé que cette synthèse de (p)ppGpp et la baisse concomitante des niveaux de GTP cellulaire, inhibe la maturation de l’ARNr 16S en 3’, probablement via un blocage des GTPases impliquées dans l’assemblage des ribosomes. L’inhibition de la maturation de l’ARNr 16S côté 3’ est supposée conduire, par la suite, à une dégradation des particules partiellement assemblées par la RNase R. Ainsi, nos résultats supportent un modèle où RelA jouerait un rôle central ; en percevant une déficience de maturation des ARNt et en ajustant, en conséquence, la biogenèse des ribosomes via la production de (p)ppGpp. Ce mécanisme de couplage permettrait de maintenir un équilibre fonctionnel entre ARNt et ARNr, les deux composants majeurs de la machinerie de traduction
Cellular protein synthesis both requires functional ribosomes and mature transfer RNAs (tRNAs) as adapter molecules. The ribosomes are large essential ribonucleoprotein complexes whose biogenesis accounts for most of cellular transcription and consumes a major portion of the cell’s energy. Ribosome biogenesis is therefore tightly adjusted to the cellular needs and actively surveilled to rapidly degrade defective particles that could interfere with translation. Interestingly, tRNAs and ribosomal RNAs (rRNAs) are both transcribed from longer primary transcripts and universally require processing to become functional for translation. In this thesis, I have characterized a coupling mechanism between tRNA processing and ribosome biogenesis in the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. Accumulation of immature tRNAs during tRNA maturase depletion, specifically abolishes 16S rRNA 3’ processing by the endonuclease YqfG/YbeY, the last step in small ribosomal subunit formation. We showed that this maturation deficiency resulted from a late small subunit (30S) assembly defect coinciding with changes in expression of several key 30S assembly cofactors, mediated by both transcriptional and post-transcriptional effects. Interestingly, our results indicate that accumulation of immature tRNAs is sensed by the stringent factor RelA and triggers (p)ppGpp production. We showed that (p)ppGpp synthesis and the accompanying decrease in GTP levels inhibits 16S rRNA 3’ processing, most likely by affecting GTPases involved in ribosome assembly. The inhibition of 16S rRNA 3’ processing is thought to further lead to degradation of partially assembled particles by RNase R. Thus, we propose a model where RelA senses temporary slow-downs in tRNA maturation and this leads to an appropriate readjustment of ribosome biogenesis. This coupling mechanism would maintain the physiological balance between tRNAs and rRNAs, the two major components of the translation machinery

La production de protéines hétérologues permet de développer une nouvelle génération de vaccins. La bactérie Escherichia coli est l’un des organismes hôtes les plus utilisés pour la production de protéines hétérologues, appelées également protéines recombinantes. Le déclenchement de la production de protéine altère la croissance bactérienne en réponse à la réallocation des ressources métaboliques vers la synthèse de la protéine ; ce qui peut conduire à l’arrêt complet de la croissance. Le maintien de la croissance bactérienne durant la production de la protéine recombinante est pourtant essentiel pour améliorer significativement la quantité et la fonctionnalité des protéines produites. Dans une démarche rationnelle visant à développer un système biologique robuste et performant pour la production d’une grande diversité de protéines recombinantes chez E. coli, les contraintes métaboliques liées à leur production ont été quantifiées. A partir de ces résultats, le système d’expression T7 a été intégré à la régulation métabolique et traductionnelle de la bactérie E. coli BL21 (DE3) afin d’adapter la vitesse de production avec les capacités métaboliques de la souche. Ce nouveau système biologique de production a ainsi permis d’augmenter considérablement les quantités de protéines produites et offre la possibilité de développer de nouveaux procédés performants de production semi-continus et continus en milieu chimiquement défini
The production of heterologous proteins offers the ability to develop a new generation of vaccines. The most used organism for the production of heterologous proteins, also called recombinant proteins, is the bacterium Escherichia coli. However, the induction of the production often alleviates the bacterial growth by the new allocation of metabolic resources toward the production of the recombinant protein. Even, this may also lead to growth arrest. The production of high quantities of functional recombinant proteins requires a good balance between of bacterial growth and production of the recombinant protein.In order to rationally develop a robust and an efficient biological system for the production of a large variety of recombinant proteins in E. coli, the metabolic constraints associated to their production have been quantified. From this observation, the T7 expression system has been integrated into the metabolic and translational regulation of the E. coli BL21 (DE3) in order to adjust as perfect as possible the protein production rate to the metabolic capacities of the strain. This new biological production system has made it possible to significantly increase the quantities of proteins produced and opens up the possibility of developing performant semi-continuous and continuous production processes in a chemically defined medium