Dissertations / Theses on the topic 'Réponse T CD4'

L’infiltrat immunitaire joue un rôle déterminant dans la progression tumorale et sert d’indicateur quant à la réussite ou à la mise en échec des traitements antitumoraux, notamment dans le cadre des immunothérapies. Une dissection fine de ses composants cellulaires et de leurs interactions est donc fondamentale pour améliorer à terme les essais thérapeutiques. C’est dans ce contexte que notre équipe a identifié parmi les lymphocytes T infiltrant les mélanomes, des lymphocytes Tαβ co-exprimant les récepteurs CD4 et CD8 (LT DP) et réactifs à la tumeur de façon HLA-I restreinte. Nos travaux écartent l’hypothèse d’un rôle cytotoxique ou régulateur de ces cellules et mettent en évidence une fonction de type helper via l’expression de la molécule CD40L. L’interaction CD40L/CD40 permet aux LT DP d’induire la prolifération et la différenciation des lymphocytes B d’une part, et d’autre part, de promouvoir la maturation de cellules dendritiques capables d’induire efficacement une réponse lymphocytaire cytotoxique contre des antigènes tumoraux. Par ailleurs, nos travaux attribuent un rôle à la cytokine IL-9 dans la modulation fonctionnelle et dans l’homéostasie des LT DP. Nous montrons que via le récepteur à l’IL-9 exprimé par les LT DP, l’IL-9 impacte positivement leur survie et leur prolifération. De plus, l’IL-9 optimise leur réactivité face à la tumeur en potentialisant leur production cytokinique, en augmentant leur potentiel tumoricide et vraisemblablement leur fonction helper. Il serait désormais intéressant d’évaluer ex vivo la pertinence de ces cellules dans la réponse immune antitumorale en corrélant leur fréquence à l’évolution clinique du patient
The immune infiltrate is a key factor in the tumor progression and has a prognostic value for the efficacy of anti-tumor treatments especially for immunotherapies. Therefore, the understanding of the cellular components and their interactions taking place within the tumor microenvironment is necessary for the future optimization of anti-tumor therapeutic strategies. We previously documented among melanoma-infiltrating lymphocytes, an atypical tumor reactive and class-Irestricted T cell population co-expressing both CD4 and CD8 co-receptors. In this study, we excluded a cytotoxic and regulatory function for these cells and ascribed helper properties through the expression of the CD40L costimulatory molecule. Through the CD40L/CD40 interaction, DP T cells allow B cell proliferation and differentiation, as well as, the licensing of dendritic cells for the efficient priming of an anti-tumor cytotoxic CD8 T cell response. Also, our results described a potential role of the interleukin-9 cytokine in DP T cell function and homeostasis. Through its interaction with its cognate receptor, the IL-9 receptor, expressed by DP T cells, IL-9 increases their survival and proliferation and could enhance their enrichment in the tumor microenvironment. In addition, IL-9 enhances their functional properties including cytokine production, cytolytic activity and probably their helper potential. It would be interesting to now define the relevance of this population ex vivo in the anti-tumor immune response by correlating their intra-tumor frequency with the clinical status of the patients

Le système immunitaire comporte différents mécanismes de tolérance périphérique permettant de contrôler la réponse des cellules T CD8+. Dans certaines conditions encore peu connues, des cellules T potentiellement auto-réactives peuvent contourner les mécanismes de tolérance et se différencier en cellules effectrices, capables d’attaquer différentes organes de l’organisme, dans un processus d’auto-réactivité. En utilisant une souris transgénique exprimant un antigène modèle dans les cellules bêta du pancréas, j’ai étudié deux processus fondamentaux impliqués dans la différenciation des cellules T CD8+ en réponse aux antigènes du soi.1) Rôle de la translocation des lipopolysaccharides (LPS) dans la rupture de la tolérance. Nous avons préalablement démontré dans le laboratoire que des protocoles de lympho-déplétions, tels l’irradiation, étaient capables d’induire une rupture de la tolérance périphérique dans les cellules T CD8+. L’irradiation provoque la translocation des LPS des bactéries commensales vers la circulation sanguine, ce qui induit une activation du système immunitaire inné. Mes données ont montré que la translocation des LPS était corrélée avec l’activation systémique des cellules dendritiques (DC) CD11c+, en particulier les DC CD8+, responsables de la cross-présentation des auto-antigènes pancréatiques dans les tissus lymphoïdes. Alors que le traitement par des antibiotiques avant l’irradiation permet de prévenir la translocation des LPS, l’activation des DC n’est que partiellement affectée, et le développement de l’auto-immunité résultant d’une rupture de la tolérance périphérique des cellules T CD8+ ne peut pas être empêchée par le traitement.2) Visualisation de la coopération entre cellules T CD4+ et CD8+ effectrices dans la destruction des cellules bêta pancréatiques in vivo. En utilisant la microscopie intra-vitale à 2-photons, j’ai pu analyser, pour la première fois, la dynamiques des cellules T CD4+ et CD8+ auto-réactives exprimant un marqueur fluorescent, lors de l’infiltration du pancréas et du développement du diabète auto-immun. J’ai mis en évidence que l’infiltration des cellules T était accompagnée d’un remodelage de la matrice extracellulaire du pancréas, permettant la migration dirigée des lymphocytes. De plus, j’ai montré que l’arrêt MHC classe II-dépendant des cellules T CD4+, dû à des interactions avec des cellules présentatrices d’antigène recrutées au site d’inflammation et impliquant dans certains cas également les cellules T CD8+, contribuait au maintien des fonctions effectrices des cellules T CD8+
The immune system has evolved multiple mechanisms of peripheral tolerance to control CD8+ T cell responses. Under particular conditions that are not yet well understood, potentially autoreactive T cells may override tolerance and differentiate into effector cells capable of targeting the own components of the organism resulting in self-reactivity. Utilizing transgenic mice expressing a model antigen in the beta cells of the pancreas, I have studied two important processes involved in CD8+ T cells differentiation in response to self-antigens. 1) Role of lipopolysaccharides (LPS) translocation in the breakdown of CD8+ T cell tolerance. It has been previously shown in our laboratory that lymphodepleting protocols, such as total body irradiation, promote breakdown of peripheral CD8+ T cell tolerance. Irradiation induces translocation of commensal bacteria LPS, a potent innate immune system activator, into the bloodstream. My data demonstrated that LPS translocation correlated with systemic activation of CD11c+ dendritic cells (DC), in particular CD8+ DC, responsible for pancreatic self-antigen cross-presentation, in lymphoid tissue. While antibiotic treatment of mice before irradiation prevented LPS translocation, DC activation was only partially affected, and onset of autoimmunity and breakdown of CD8+ T cell tolerance could not be prevented.2) Intra-vital visualization of effector CD8+ and CD4+ T cell cooperation in beta cell destruction in the pancreas. Using two-photon microscopy, I have been able, for the first time, to simultaneously analyze dynamics of fluorescently tagged autoreactive CD8+ and CD4+ T cells as they infiltrated the pancreas and induced autoimmune diabetes. I found that T cell infiltration promoted extracellular matrix remodeling in the pancreas, which in turn served as a scaffold for T cell migration. In addition, I showed that MHC class II dependent arrest of effector CD4+ T cells, due to interactions with antigen presenting cells, occasionally also implicating CD8+ T cells, provided help to effector CD8+ T cells in maintaining their effector functions

L’ostéolyse est la caractéristique principale des maladies inflammatoires chroniques. Elle est due à une augmentation de la différenciation /activité des ostéoclastes (OCLs) sous l'influence des lymphocytes T (LT) CD4+ activés/mémoires. Les OCLs sont dérivés du lignage monocytaire mais, en condition inflammatoire, ils peuvent aussi dériver des cellules dendritiques. De plus, les OCLs jouent un rôle majeur dans le maintien des cellules souches hématopoïétiques (HSCs) dans leurs niches médullaires, et ils participent à leur mobilisation en réponse à des signaux de stress. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux interactions entre les OCLs et les LTs CD4+. Dans une prmière partie, j'ai analysé la capacité des OCLs à présenter des antigènes et à activer les LTs CD4+. Nous avons montré, pour la première fois, que les deux types d’OCLs peuvent présenter des antigènes et activer les LTs CD4+, mais dans des voies de polarisation différentes. Les OCLs dérivés de la moelle osseuse normale polarisent les LTs CD4+ en LTs régulateurs Foxp3+, alors que les OCLs dérivés des DCs induisent des LTs CD4+ inflammatoires (INFγ+, TNFα+). D’une façon intéressante, les OCLs différenciés à partir de la moelle osseuse enflammée perdent leur capacité à induire des LTs régulateurs, montrant l’importance de l’environnement de la moelle osseuse sur l’immunodulation par les OCLs. Etant donné que les LTs mémoires présentent la grande majorité des LTs CD4+ dans la moelle osseuse, et sont maintenus à l'état quiescent dans des niches spécialisées, le deuxième volet de ma thèse a été de définir si les OCLs jouent un rôle dans la mobilisation des LT mémoires, comme décrit pour les HSCs. Nous avons démontré que les OCLs contrôlent la mobilisation des LTs mémoires centrales de la moelle osseuse en modulant le phénotype des cellules mésenchymateuses constituant des niches. Cette étude présent une nouvelle vision des fonctions multiples des OCLs, depuis l’activation des LTs comme toute autre cellule présentatrice d’antigène jusqu’au contrôle de la mobilisation des LTs mémoires de la moelle osseuse vers la périphérie. Ces nouvelles fonctions décrites pour les OCLs pourraient participer à la mise en place de nouvelles stratégie thérapeutiques visant à limiter la propagation des maladies autoimmunes/inflammatoires
Osteolysis is a hallmark of chronic inflammatory diseases due to an over differentiation and activity of osteoclasts (OCLs), mainly induced by activated/ memory CD4+ T cells. OCLs are derived from the monocyte lineage and in inflammatory condition, they can also arise from dendritic cells. OCLs have been described to be a major player in maintaining hematopoietic stem cells (HSCs) in their medullar niches, and contribute to their mobilization under stress condition. During my PhD, I was interested in studying the role of OCLs on CD4+ T cells. First, I focused on the capacity of OCLs to present antigen and activate CD4+ T cells. We showed, for the first time, that both subsets of OCLs can present antigens and activate CD4+ T cells with a difference in polarizing T cells. OCLs derived from normal bone marrow polarize T cells toward regulatory T cells (Foxp3+), whereas OCLs derived from DCs induce inflammatory T cells (INFγ+, TNFα+). In an interesting way, OCLs differentiated from inflammatory bone marrow fail to induce regulatory CD4+T cells, demonstrating that the bone marrow environment is essential in the control of the immunomodulatory effect of OCLs. Since memory T cells represent a major CD4+ T cell population in the bone marrow and are maintained in specialized niches in quiescent state, the second part of my thesis was to define if OCLs may play a role in mobilizing those cells, as they do for HSCs. We demonstrated that OCLs control the mobilization of central memory T cells from the bone marrow by modulating the phenotype of the mesenchymal cells forming the niches. This study present a new vision of the multiple functionalities of OCLs, going from activating T cells as any other antigen presenting cells to controlling the mobilization of memory T cells from the bone marrow to the periphery. Those newly defined functions of OCLs may contribute to generate new therapeutic approaches to limit the propagation of autoimmune/inflammatory diseases

Bien qu'il ait été clairement établi que les lymphocytes T CD4 jouent un rôle majeur dans le rejet de greffe, les facteurs influençant leur polarisation en cellules Th1 ou Th2 restent à définir. Nous montrons ici qu'en absence d'activation des cellules cytotoxiques T CD8 ou NK de l'hôte, les réponses T CD4 qui se développent suite à une greffe de peau allogénique sont de forte amplitude et caractérisées par l'émergence de cellules Th2. Dans ces situations, le rejet est associé à des infiltrats massifs d'éosinophiles. Nous montrons ici que l'activation de ces cellules T CD8 et NKs est associée à une importante diminution de la persistance des DCs du donneur dans les ganglions drainants et ce par un mécanisme dépendant de la perforine. Nous proposons donc que les cellules cytotoxiques T CD8 et NKs, par le contrôle qu'elles exercent sur la persistance des DCs, modifient leur cinétique de différentiation modulant ainsi l'amplitude et la polarisation de la réponse T CD4 alloréactive durant le rejet de greffe
CD4 T cells play an essential in allograft rejection. However, factors influencing their polarization into Th1 or Th2 effector cells in vivo are still poorly understood. We report here that in absence of CD8 T cell and/or NK cell activation, a strong CD4 T cells occurs characterized by the development of type-2 cytokine producing cells. In this situation, allogeneic skin grafts are heavily infiltrated with eosinophil. The aim of the study here was to investigate the mechanisms by which CD8 T lymphocytes and NK cells can control CD4 T cell priming. We found that, they both act by limiting the accumulation of donor-derived dendritic (Dcs) cells through a perforin-dependent mechanism. We propose that CD8 T cells and NK cells, by controlling the half-life of allogeneic DCs, modify the kinetics of DC differentiation in lymph nodes thereby modulate the amplitude and the polarization of alloreactive CD4 T cells

Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de régulation de la phase d'expansion d'une réponse lymphocytaire T CD4+ in vivo. J'ai découvert un nouveau mécanisme de régulation qui s'intègre dans les données actuelles sur la régulation des réponses lymphocytaires T. Ce mécanisme permet l'adaptation de l'intensité de l'expansion à la quantité d'antigène par l'inhibition préférentielle de la prolifération des lymphocytes T activés, mais pas à celle des lymphocytes T naïfs. Cette inhibition est dominante et repose sur des interactions spécifiques entre les lymphocytes T activés. La spécificité antigénique de l'inhibition est liée à l'acquisition par les lymphocytes T des complexes CMH/peptide provenant des cellules dendritiques et dont ils sont spécifiques. Ce mécanisme d'inhibition permet d'expliquer que le nombre de lymphocytes T effecteur généré au cours d'une réponse immune soit proportionnel à la quantité d'antigène présente
Although T cells proliferate extensively during an immune response, they don't expand indefinitely. The mechanisms limiting the expansion are poorly understood, though the disappearance of antigen, or competition for limiting amounts of antigen, have been suggested. During my PhD, I studied the recruitment of antigen-experienced CD4 T cells into a localized immune response. We found that the recruitment of antigen experienced T cells is selectively inhibited compared to that of naïve T cells. This preferential inhibition begins as soon as day 2 of the immune response and takes place before antigen disappearance. Importantly, this inhibition is antigen specifie and relies on the presence of responding T cells that present MHCII/peptide complexes captured from their antigen presenting cells early in the response. This inhibition of antigen-experienced CD4 T cells proliferation by MHCII/peptide bearing T cells generates a negative feedback loop that regulates CD4 T cell proliferation

La 4ème de couverture indique : "La réaction mixte lymphocytaire autologue (aMLR) permet l'étude des circuits de régulation du système immunitaire et correspond à la prolifération des lymphocytes T CD4+ suite à une stimulation par des cellules dendritiques autologues (aMLRs déficientes dans: maladie de Hodgkin, syndrome de Down, lupus érythémateux systématique, arthrite rhumatoi͏̈de, cirrhose biliaire primitive, etc). Les lymphocytes T CD8+CD28- sont des cellules régulatrices capables de suppression directe de l'allo- et la xéno-réactivité de lymphocytes T CD4+ et de rendre tolérogènes des cellules dentritiques. L'objectif de notre étude est de développer un système de co-culture in vitro permettant l'étude des rôles suppresseurs des lymphocytes T CD8+CD28-. Ce sont les MLR autologues de 5 jours: (Mo-DCs. Cellules T CD4+. Cellules T CD8+CD28-). Les résultats montrent une forte réponse proliférative des cellules T CD4+, qui est inhibée par des anticorps monoclonaux dirigés contre HLA DR, CD2, CD11a, CD54 et CD86 et s'accompagne d'une sécrétion d'IFN-g et d'IL-12, reflétant une réponse de typeTh1. De plus, on observe l'émergence d'une population cellulaire de phénotype CD4+ CD25+ CTLA4+ (expression intracellulaire et membranaire) CD45RA- 45RO+ au cours de l'aMLR : ces cellules, dotées par ailleurs de faibles capacités prolifératives, sont capables de supprimer par contact cellulaire la réactivité de lymphocytes T CD4+ vis-à-vis d'auto- et d'allo-antigènes présentés par des DCs matures. Notre étude montre que cette population cellulaire T CD8+CD28- pourraitégalement exercer des fonctions régulatrices indirectes en générant une population de lymphocytes T aux fonctions suppressives. Nous montrons donc qu'il est possible de générer in vitro, et dans un modèle syngénique, des lymphocytes T régulatrices CD4+CD25+. S'agit-il ici de lymphocytes générés de novo? Ou alors la MLR autologue a-t-elle permis d'amplifier une population régulatrice existante et quiescente? Ce système pourrait refléter un mécanisme intervenant dans le maintien de la tolérance périphérique, par génération de cellules T régulatrices. "

De nombreux antigènes de tumeur ont été identifiés depuis la découverte du premier antigène de tumeur humain il y a une vingtaine d’années, et plusieurs d’entre eux ont été utilisés comme antigène cible pour l’élaboration de vaccins thérapeutiques anti-Cancer. Cependant, les résultats des essais cliniques visant à évaluer l’efficacité de ces vaccins se sont la plupart du temps révélés décevants. Aussi, il reste indispensable d’identifier de nouveaux antigènes de tumeur cibles capables d’induire des réponses anti-Tumorales fortes et durables. Parmi les antigènes de tumeur considérés comme cibles potentielles pour un vaccin anti-Tumoral se trouve la Cycline B1, une protéine endogène impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. Normalement exprimée de façon transitoire dans les cellules saines en division, cette protéine est surexprimée dans diverses tumeurs et est indispensable au développement tumoral. De plus, des réponses immunitaires spontanées spécifiques de cette protéine ont été observées chez des patients atteints de cancer. L’objectif de ma thèse était de caractériser la réponse en lymphocytes T CD4+, qui jouent un rôle capital dans la réponse immunitaire anti-Tumorale, spécifique de la Cycline B1 humaine chez des sujets sains et chez des patients atteints de cancer. Nous avons mis en évidence l’existence, chez des individus sains, de deux populations de lymphocytes T CD4+ préexistants spécifiques de cette protéine, à savoir des lymphocytes T CD4+ naïfs et des lymphocytes T CD4+ mémoires, cette seconde population lymphocytaire se retrouvant également chez des patients atteints de cancer. De multiples épitopes T CD4+ ont été identifiés dans cette protéine, et étaient différemment reconnus par ces deux populations de lymphocytes T CD4+. En outre, des anticorps IgG anti-Cycline B1 ont été détectés chez des patients atteints de cancer comme chez des individus sains, sans différence significative dans les taux d’anticorps entre ces deux catégories de sujets. Ainsi, cette étude montre que la Cycline B1 est un antigène de tumeur caractérisé par un profil singulier de réponses immunitaires, et confirme le potentiel vaccinal de cette protéine pour l’élaboration d’un vaccin anti-Cancer
Many tumor antigens have been identified since the discovery of the first human antigen about twenty years ago, and some of them have been used as targets for the development of therapeutic cancer vaccines. However, most of the time, the results of clinical trials designed to assess the efficacy of these vaccines proved to be disappointing. Thus, it is still necessary to identify new tumor antigens able to induce strong and long-Lasting anti-Tumor responses that could be used as targets for cancer vaccine. Cyclin B1, an endogenous protein involved in cell cycle regulation, is one of the tumor antigens which are currently considered as potential targets for a cancer vaccine. Usually expressed transiently in healthy dividing cells, this protein is overexpressed in numerous tumors and is necessary for tumor development. Moreover, Cyclin B1 specific spontaneaous immune responses have been observed in cancer patients. My PhD work aimed at characterizing the response of CD4+ T cells, which play a major role in anti-Tumor immune responses, specific to human Cyclin B1 both in healthy individuals and cancer patients. We showed that, in healthy individuals, there exists two pre-Existing Cyclin B1 specific CD4+ T cell populations, namely naive CD4+ T cells and memory CD4+ T cells, the latter lymphocyte population being also found in cancer patients. Multiple CD4+ T cell epitopes have been identified in this protein, and were differently recognized by these two CD4+ T cell populations. Besides, anti-Cyclin B1 IgG antibodies have been detected both in healthy individuals and in cancer patients, without significant differences in antibody levels between these two groups of donors. Therefore, this work shows that Cyclin B1 is a tumor antigen characterized by a singular pattern of immune responses, and confirms the potential of this protein as a target for a cancer vaccine

La jacaline, lectine extraite des graines du jaquier (artocarpus heterophyllus) est une glycoproteine qui existe sous de multiples isoformes genetiquement determinees et est constituee de trois types de sous-unites associes de facon non covalente selon une stoechiometrie encore mal connue. Ses meilleurs ligands sont les o-et p-no#2ph-alpha-d-galnac et le gal-beta-(1-3)-galnac. Elle precipite les lga1 et les lgd humaines. Elle peut bloquer in vitro l'infection par le vih-1. Elle induit specifiquement la proliferation de la sous-population de lymphocytes t humains exprimant l'antigene cd4, en presence de monocytes autologues. Nous avons montre que des lectines purifiees a partir d'autres especes d'artocarpus provenant du viet-nam partagent cette specificite de stimulation. Outre la molecule cd4, nous avons montre que la jacaline lie la molecule cd5 et etudie differents aspects de la stimulation cellulaire induite par cette lectine. Des interactions liees monocyte/lymphocyte t sont necessaires a son activite mitogenique. La jacaline n'induit pas de modification de l'autophosphorylation de la proteine tyrosine kinase p56#l#c#k, mais entraine l'apparition d'une forme de p56#l#c#k de mobilite electropherique reduite. Les profils electrophoretiques des proteines phosphorylees sur des residus tyrosyls en reponse a la jacaline sont similaires a ceux obtenus apres activation par la voie du cd3. La jacaline induit l'hydrolyse des phosphoinositides et une augmentation de la concentration calcique cytosolique. Les molecules de surface des lymphocytes t cd2, lfa-1, cd4, cd5 et le complexe tcr/cd3 paraissent etre impliquees dans l'activation cellulaire induite par cette lectine. Nous avons aussi montre que cette stimulation s'accompagne d'une production elevee d'il-6 par les monocytes et de la secretion d'ifn gamma, mais pas de celle d'il-2 ni d'il-4. Ces resultats indiquent que la stimulation par jacaline differe par divers caracteres de celle induite par d'autres mitogenes des lymphocytes t humains

La sensation douloureuse est une caractéristique de la réponse inflammatoire qui accompagne les infections par des pathogènes ou les lésions tissulaires. Un grand nombre de molécules libérées au niveau du site de l'inflammation (cytokines, leukotriènes, neuropeptides, prostaglandines ou protéases) vont permettre la mobilisation des cellules immunitaires et générer un signal douloureux via la stimulation des afférences primaires in situ. Les signaux de douleurs véhiculés par ces afférences primaires peuvent être modulés par les opioïdes endogènes libérés par les cellules immunitaires infiltrant le site inflammatoire. Le système opioïde endogène est constitué d'une vingtaine de neuropeptides répartis en trois familles : les endorphines, les enképhalines et les dynorphines qui se lient respectivement à trois classes de récepteurs opioïdes : MOR, DOR et KOR. Bien que la production d'opioïdes par la plupart des cellules immunitaires ait été décrite, l'analgésie périphérique semble associée à une infiltration par les lymphocytes T. Notre analyse par PCR quantitative des différentes populations de cellules immunitaires murines, a montré que seule l'activation des lymphocytes T (CD4+ et CD8+) et des cellules dendritiques s'accompagne d'une augmentation du niveau d'expression de l'ARNm de la pro-enképhaline. Ce niveau peut atteindre dans les lymphocytes T CD4+ plus de 50% du niveau mesuré dans le cerveau, principal organe producteur d'enképhalines. L'utilisation d'un test de sensibilité à un stimulus mécanique, nous a permis de mettre en évidence le rôle analgésique des opioïdes d'origine lymphocytaire. Les souris Nudes, qui ne possèdent pas de lymphocytes T, sont plus sensibles à la douleur associée à la réponse inflammatoire. Une sensibilité normale est restaurée par l'injection de lymphocytes T CD4+ naïfs spécifiques de l'antigène à l'origine de l'inflammation. La propriété analgésique des lymphocytes T CD4+ est acquise lors de leur activation par l'antigène dans les ganglions drainant le site inflammatoire, via la synthèse de novo d'enképhalines. La production d'enképhalines n'est pas tributaire d'une fonction effectrice particulière des lymphocytes T CD4+ et ne se produit qu'à la condition d'une nouvelle stimulation par l'antigène au niveau du site inflammatoire. L'activité analgésique des lymphocytes T CD4+ est dépendante de la stimulation des récepteurs opioïdes DOR exprimés sur les afférences primaires. La libération d'enképhalines par les lymphocytes T CD4+ effecteurs au niveau du site de l'inflammation pourrait également réduire le flux migratoire des cellules dendritiques vers les ganglions drainants contribuant ainsi à la réduction de l'amplitude de la réponse lymphocytaire T
Painful sensation is a hallmark of the inflammatory response induced by pathogens or tissue damage. A large spectrum of molecules released within the inflamed tissue including neuropeptides, prostaglandins, or proteases induces pain by stimulating primary afferents in situ. Painful messages conveyed by primary sensitive fibers are modulated by peripheral endogenous regulatory mechanisms involving local opioïd release by leukocytes infiltrating the inflammatory site. Endogenous opioïd peptides belong to three families: endorphins, enkephalins, and dynorphins, which are derived from protein precursors encoded by three distinct genes: the proopiomelanocortin, the proenkephalin, and the prodynorphin genes, respectively. The biological activities of the opioïd neuropeptides are mediated by three types of seven transmembrane segment G-protein-coupled receptors named µ- (MOR), d- (DOR), and κ- (KOR) opioid receptors. ß-endorphin and enkephalins bind to both MOR and DOR, whereas dynorphin interacts only with KOR. Among immune cells infiltrating the inflammatory site, T lymphocytes have been described to be more efficient to relieve pain. We have quantified the expression level of mRNA encoding for all three opioïd precursors in dendritic cells, CD4+ and CD8+ T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages in mice. We found that cell activation up-regulates proenkephalin mRNA level only in dendritic cells and CD4+ T lymphocytes. In activated CD4+ T lymphocytes, proenkephalin mRNA level were the highest, reaching more than 50% of that measured in brain, the main enkephalins producing organ. The role of T cell-mediated immunity in regulation of inflammatory pain was first appreciated by comparing nociceptive response to mechanical stimuli. T cell-deficient nude mice are more sensitive to inflammatory pain than wild-type mice. Normal sensitivity is restored by injection of naïve CD4+ T lymphocytes specific to the antigen responsible for inflammation. Analgesic property of CD4+ T lymphocytes is acquired in response to their specific antigen within draining lymph nodes, by de novo synthesis of enkephalins. Enkephalins production is irrespective of effector CD4+ T cell functions and is dependent upon specific antigen recognition at the inflammatory site. CD4+ T cell-induced analgesia is dependent on DOR activation on primary afferents. Enkephalins release by effectors CD4+ T cells within inflammatory site could also decrease dendritic cells migration to draining lymph nodes that contribute to T lymphocytes response reduction

Les lymphocytes T CD4 naïfs sont des cellules plastiques, capables de moduler finement leur programmation selon les signaux environnementaux qu'ils intègrent. Ils adaptent ainsi leur phénotype et leur fonction au type de danger Lors d'une infection par un agent pathogène intracellulaire par exemple, ils acquièrent un phénotype Th1 sous l'influence de médiateurs solubles tels que l'IL-12 et l' IFN-γ. Ces signaux mobilisent un set restreint de facteurs de transcription, coordonné par Tbet, qui programment la cellule afin qu'elle induise l'élimination du danger par des mécanismes impliquant une production massive d'IFN-γ. En réponse à des allergènes ou à des parasites extracellulaires, les lymphocytes T peuvent aussi acquérir un phénotype Th2, caractérisé par l'expression du facteur de transcription Gata-3 et par la production d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13. Afin de garantir la stabilité des lignages, ces processus de différenciation peuvent s'accompagner d'une perte de potentialité. Contrairement aux cellules T naïves, les cellules Th1 sont par exemple incapables d'allumer le programme d'expression génique Th2 en présence d'IL-4, et les lymphocytes Th2 verrouillent le programme Th1. Si nous savons aujourd'hui que l'acquisition des fonctions effectrices, comme l'équilibre entre détermination cellulaire et plasticité, sont régulés par des mécanismes épigénétiques, la plupart des acteurs moléculaires qui contrôlent la programmation des lymphocytes T au niveau de la chromatine reste encore à identifier. Durant ma thèse, j'ai étudié le rôle de la lysine méthyltransférase SETDB1, qui catalyse la di- ou tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone 3 (H3K9me3), dans la différenciation des lymphocytes T CD4. Il avait déjà été proposé qu'H3K9me3 ait un impact sur la programmation de ces cellules en réponse aux signaux de l'environnement, mais personne n'avait encore étudié le rôle de SETDB1 dans ces processus lorsque j'ai commencé ma thèse. A l'aide d'une lignée murine déficiente pour SETDB1 spécifiquement dans les lymphocytes T, nous avons montré in vitro et in vivo que la balance Th1/Th2 est fortement augmentée en l'absence de l'enzyme, et que cette dérégulation résulte d'une perte de répression du réseau génique Th1. [...]
Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper or regulatory T cell subsets depending on environmental signals received. This process relies on complex and lineage-specific gene expression programs whose dynamics and stability are regulated at the level of the chromatin. The epigenetic pathways involved, however, remain largely unknown. Here, we report that the histone methyltransferase SETDB1 critically controls the Th1 gene expression program. SETDB1-deficient naïve CD4 T cells show exacerbated Th1 priming, and when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not appear to control Th1 gene promoter activity. Instead, it deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell-type specific set of endogenous retroviruses (ERVs) strongly associated with genes involved in immune processes. Refined bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons either flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. In conclusion, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network

La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau, très fréquente chez les enfants et dont la prévalence augmente dans les pays industrialisés. La physiopathologie complexe de cette maladie met en jeu un défaut de la barrière cutanée et/ou des défauts génétiques résultant en une hypersensibilité aux allergènes de l'environnement tels que ceux issus d'acariens. Récemment, des études sur les interactions entre le système immunitaire et les bactéries commensales et pathogènes de la peau ont révélé leur importance dans cette maladie. Pour étudier le rôle du microbiote cutané dans la réponse T CD4+, des cohortes de jeunes enfants, atteints de DA et sensibilisés aux allergènes d'acariens (Der p) ou non DA (population contrôle), ont été recrutées. L'analyse du microbiote (MALDI-TOF) et du profil transcriptomique cutanés, ainsi que la quantification des T CD4+ anti-Derp (ELISpot) ont montré que la présence de S. aureus sur la peau inflammatoire des sujets AD était associée à des taux élevés d'IgE, des transcrits caractéristiques d'une orientation Th2/Th22 et à une réponse périphérique Th2. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC) de donneurs sains produisent respectivement de l'IFN-gamma et de l'IL-10 en présence de sécrétomes issus de souches de S. aureus et S. epidermidis provenant de patients. La prolifération de lymphocytes T CD4+ stimulés avec des moDC allogéniques traitées avec le sécrétome de S. aureus est atténuée par le traitement simultané des moDC avec le sécrétome de S. epidermidis. Les sécrétomes de S. aureus sont capables d'inhiber directement l'activité suppressive de lymphocytes T régulateurs en l'absence de cellule présentatrice d'antigène. L'ensemble de nos résultats nous permet de penser que S. aureus est un facteur pro-inflammatoire de la DA en exacerbant la prolifération de lymphocytes Th2 résidents et en inhibant la fonction des lymphocytes T régulateurs. Favoriser les effets anti-inflammatoires des bactéries commensales telles que S. epidermidis liés à l'induction d'une sécrétion d'IL-10 par les cellules dendritiques de la peau pourrait bénéficier aux patients atteints de DA
Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory and pruritic skin disease frequently affecting children. Its prevalence is increasing in industrialized countries. Its complex pathophysiology involves a skin barrier dysfunction and/or genetic abnormalities leading to sensitivity to environmental allergens such as house dust mites. Interactions between the immune system and skin bacteria, pathogens and commensals, appeared to be important in the disease. To study the influence of skin microbiota in the CD4+ T cell response, we designed a cohort of young AD children sensitized to house dust mite allergens (Der p) and their counterparts (controls). Analysis of skin microbiota (MALDI-TOF), transcripts profiling and quantification of anti-Der p CD4+ T cells showed that the presence of S. aureus on inflamed skin of AD subjects was associated with high IgE levels, Th2/Th22 transcripts and peripheral Th2 anti-Der p response. Monocyte-derived dendritic cells (moDC) were exposed to secretomes produced by S. aureus and S. epidermidis strains isolated from patients and released IFN-gamma and IL-10 respectively. Proliferation of CD4+ T cells induced by allogeneic moDC exposed to S. aureus secretome was blunted by concurrent exposure of moDC to S. epidermidis secretome. Regulatory T cells (Treg) lost their activity against conventional CD4+ T cells under the direct effect of S. aureus secretome. Overall, these results allow us to think that S. aureus is an important factor of the AD inflammation by inducing Th2 activation and silencing resident Treg. Commensals such as S. epidermidis could be used to counteract these effects by inducing IL-10 production by skin DC

L’infection par le cytomégalovirus est le plus souvent asymptomatique chez les sujets immunocompétents mais entraine une morbidité et une mortalité importantes chez les patients immunocompromis et en cas d’infection congénitale.

Après l’infection primaire, le virus persiste tout au long de la vie à l’état latent mais peut se réactiver de manière intermittente. Ceci est associé à l’expansion de lymphocytes T CD4+ fortement différenciés ayant des fonctions auxiliaires et cytolytiques. L’infection primaire est, par contre, caractérisée par une réplication virale intense qui dure plusieurs mois. Il a été montré que l’exposition prolongée à des concentrations élevées d’antigènes entraine une perte progressive de fonction par les lymphocytes T appelée épuisement et caractérisée par l’expression de récepteurs inhibiteurs. L’impact de la réplication virale intense observée au cours de l’infection primaire par le CMV sur la fonction des lymphocytes T CD4+ n’est pas bien connu.

La fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ a été explorée chez l’humain et le singe rhésus au cours de l’infection primaire et comparée à celle de sujets porteurs chroniques du virus.

Les résultats montrent que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ circulants ayant une faible capacité de prolifération et de production de cytokines et d’IL-2 en particulier.

L’impact de la différenciation sur la fonction des lymphocytes a été exploré en détail chez l’humain. Il a été observé qu’un degré de différenciation plus élevé des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV joue un rôle dans la production réduite d’IL-2. Toutefois, la fraction moins différenciée (exprimant la molécule CD28) présente également une sécrétion d’IL-2 moindre au cours de l’infection primaire. Ceci fait partie d’une diminution globale de la production de cytokines au cours de l’infection primaire qui affecte également la sécrétion d’IFNγ et TNFα, entraine une polyfonctionnalité réduite et est indépendante de la différenciation. L’épuisement des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV contribue à leur fonctionnalité moindre comme l’indique l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 et l’augmentation des réponses prolifératives en présence d’anticorps bloquant PD-1.

Le lien entre excrétion virale et fonction lymphocytaire a été étudié chez le macaque rhésus. L’infection par le CMV est observée chez les singes juvéniles et adultes mais pas chez les nourrissons. L’excrétion urinaire et salivaire est significativement plus fréquente et intense chez les singes juvéniles par rapport aux adultes. Comme chez l’humain au cours de l’infection primaire, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus sont moins

polyfonctionnels et prolifèrent moins efficacement chez les singes juvéniles par rapport aux singes adultes. Ceci est associé à l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 chez les singes juvéniles. La réponse proliférative des lymphocytes T CD4+ est accrue en présence d’anticorps bloquant PD-1 ou d’IL-2 exogène. Enfin, une association inverse entre fonction lymphocytaire et excrétion urinaire a été mise en évidence chez les macaques adultes.

Ces résultats indiquent que l’infection par le CMV présente des caractéristiques semblables chez l’humain et le singe rhésus. L’infection primaire est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ ayant une fonctionnalité moindre qu’au cours de l’infection chronique. L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 typique des cellules épuisées est l’un des mécanismes impliqués et pourrait être la cible de stratégies immunomodulatrices visant à améliorer les fonctions lymphocytaires et le contrôle de la réplication virale. Les résultats présentés indiquent que l’infection naturelle chez le singe rhésus constitue un modèle potentiellement utile à l’étude de la réponse immune au CMV humain et à l’évaluation de stratégies immunomodulatrices.

/

Cytomegalovirus infection is mostly asymptomatic in immunocompetent hosts but leads to severe morbidity and mortality in immunocompromised subjects and foetuses.

After primary infection, CMV establishes lifelong persistence but can reactivate intermittently. This is associated with the expansion of highly differentiated CD4+ T lymphocytes exhibiting helper functions and cytolytic activity.

Primary infection is characterised by an intense viral replication lasting several months. It has been shown that prolonged exposure to elevated antigen concentrations induces a progressive loss of function by T lymphocytes called exhaustion. This state of functional impairment is associated to the expression of inhibitory receptors. The consequence of the intense viral replication seen in primary CMV infection on CD4+ T cell function is unknown.

CD4+ T cell function has been studied in human and rhesus macaque during primary CMV infection. Chronic CMV carriers have been used as controls.

The results show that primary CMV infection is associated to the detection of circulating CD4+ T lymphocytes exhibiting weak proliferative capacities and reduced cytokine production affecting IL-2 in particular.

The impact of differentiation on lymphocyte function has been explored in detail in human. An increased proportion of terminally differentiated CD4+ T cells (CD28-) is observed during primary infection. These lymphocytes are unable to secrete IL-2 in response to CMV antigens. Interestingly, CD28+ CMV-specific CD4+ T cells also exhibit reduced IL-2 production during primary infection. This is part of a global reduction of cytokine production affecting IFNγ and TNFα as well. The impaired cytokine production is associated to reduced polyfunctionality and is independent of differentiation. Exhaustion of CMV-specific CD4+ T lymphocytes contributes to the reduced functionality as shown by an increased expression of the inhibitory receptor PD-1 and improved proliferative responses in the presence of PD-1 blocking antibodies.

The relationship between viral replication and lymphocyte function has been explored in rhesus macaques. CMV infection is observed in juvenile and adult monkeys but not in newborns. Excretion in urine and saliva is significantly more frequent and intense in juvenile monkeys than adults. As in primary infection in human, CMV-specific CD4+ T lymphocytes are less polyfunctional and have lower proliferative capacities in juveniles as compared to adults. This is associated with an increased expression of PD-1 in juvenile monkeys. CD4+ T cell proliferative responses are increased when PD-1 blocking antibodies or exogenous IL-2 are added to the culture medium. Finally, an inverse association between lymphocyte function and urinary excretion has been observed in adult macaques.

These results indicate that CMV infection shares common features in human and rhesus macaque. Primary infection is associated to the detection of CD4+ T lymphocyte displaying lower functional capacities as compared to chronic infection. Exhaustion contributes to the functional impairment and the inhibitory receptor PD-1 could be targeted by immunomodulatory strategies aiming at improving lymphocyte functions and controlling viral replication. Natural CMV infection in rhesus macaque might be useful as a model to evaluate the efficacy and safety of immunomodulatory approaches.
Doctorat en Sciences médicales
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) constituent une population de cellules suppressives naturelles essentielle au maintien de la tolérance et à l'inhibition de l'inflammation. Ces cellules se différencient dans le thymus avec les lymphocytes T conventionnels à partir d'un précurseur commun. Cependant le mécanisme sous-tendant le choix de lignage entre lymphocyte effecteur et régulateur reste peu défini. Nous avons démontré que la proportion de Treg qui se développent au sein de la population de thymocytes CD4+CD8- est génétiquement contrôlée chez la Souris et varie de manière significative entre les souches. Nous avons pu préciser que les gènes responsables, exprimés par les cellules T, modulent quantitativement la génération du compartiment régulateur, et identifier un locus d'intérêt sur le chromosome 17. En nous intéressant à un modèle spontané d'auto-immunité, la souris NOD, nous avons établi qu'un fort pourcentage de Treg se différencie dans cette souche et que la région identifiée co-localisait avec un locus de susceptibilité au diabète, Idd16. La sélection thymique ne semble pas être impliquée, ce qui suggère un mécanisme lié au choix de lignage. L'étude de nouvelles lignées congéniques nous a permis de réduire la région d'intérêt et de nous rapprocher de l'identification du (des) gène(s) responsable(s)
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg) are essential to maintain self-tolerance and control inflammation. It is a natural population that develops in the thymus from CD4-CD8- cells like its conventional counterpart. However, fate decision made by CD4+ thymocytes between effector and regulatory lineage remains poorly understood. We showed that distinct proportions of Treg were found in thymi of common mouse strains and that a genetic control modulated quantitatively regulatory compartment generation. We demonstrated that it was a polygenic trait and identified a locus on chromosome 17. We next focused on the diabetes-prone NOD strain, and surprisingly found a high level of Treg among mature CD4+ thymocytes. Genetic control in this strain is dependent on a region that colocalizes with the diabetes susceptibility locus Idd16. Our preliminary results tend to show that thymic selection is not involved, which suggests a lineage commitment linked mechanism. Study of new congenic lines should help us to restrain our region of interest and our candidate gene number

Mon sujet de thèse consiste à étudier le rôle des différentes voies possible à l’interaction CD40/CD40L au cours de la réponse primaire des lymphocytes T CD8 et à caractériser la réponse des lymphocytes T CD8 CD40-/-. Les résultats obtenus jusqu’à présent semblent montrer deux effets à une interaction CD40/CD40L en fonction de la localisation de la molécule CD40 selon le type cellulaire (sur les lymphocytes T CD8 ou sur les cellules présentatrices d’antigène). Le premier effet est la mis en place d’une réponse primaire optimale de la part des lymphocytes T CD8 et est dû à l’expression de CD40 par les cellules présentatrices d’antigène. Le deuxième effet est la génération de la mémoire immunitaire T CD8 au cours de la réponse primaire et est dû à l’expression de CD40 par les lymphocytes T CD8. Nos résultats montrent que l’interaction CD40/CD40L passant par les cellules présentatrices d’antigène envoie les signaux suffisants pour la prolifération et la cytotoxicité de la réponse primaire T CD8. En revanche, l’interaction CD40/CD40L passant par les lymphocytes T CD8 est indispensable à la génération de la mémoire T CD8. Si la déficience en CD40 par les lymphocytes T CD8 n’affecte pas la réponse primaire, ce n’est pas le cas de la réponse secondaire. En effet, dans ce cas, les lymphocytes T CD8 présentent une réponse secondaire altérée. Comparé à une réponse secondaire classique, les lymphocytes T CD8 CD40-/- présentent une amplitude de réponse diminuée et un pic de réponse décalé, une réponse plus proche d’une réponse primaire. Ces cellules présentent également une cytotoxicité et une survie altérées, ainsi qu’une sensibilité aux facteurs immunorégulateurs accrue
My thesis project is to study the role of different possible pathways possible for the CD40/CD40L interaction during the primary response of CD8 T cells and to characterize the response of CD8 T cell CD40-/-. The results suggest two CD40/CD40L interaction effects depending on the location of the CD40 molecule expressed on different cell types (on CD8 T cells or on antigen presenting cells). The first effect is to set up an optimal primary response from the CD8 T cells and is due to the expression of CD40 by antigen presenting cells. The second effect is the generation of memory CD8 T cells during the primary response and is due to the expression of CD40 by CD8 T cells. Our results show that the CD40/CD40L interaction via the antigen presenting cells sends signals sufficient for proliferation and cytotoxicity of CD8 primary response. However, the CD40/CD40L interaction via the CD8 T cells is essential for the generation of memory CD8 T cells. If the deficiency of CD40 by CD8 T cells does not affect the primary response, it is not the case of the secondary response. Indeed, in this case, CD8 T cells exhibit altered secondary response. Compared to a classical secondary response, the CD8 T cells CD40-/- exhibit a decreased response amplitude and delayed peak response, a response closer to a primary response. These cells also exhibit impaired cytotoxicity and survival. Finally these cells have a more sensitivity to immunoregulatory factors

Au cours du développement tumoral, le système immunitaire est constamment exposé aux antigènes tumoraux, mais le plus souvent dans un contexte non-inflammatoire qui favorise l'induction d'une tolérance envers ces antigènes. La tolérance peut être médiée par des mécanismes passifs (ignorance, anergie ou délétion des clones spécifiques de la tumeur) ou actifs, pour lesquels les lymphocytes T régulateurs (Tregs) jouent un rôle prépondérant. Les lymphocytes T (LT) CD4+ sont la source principale des Tregs mais présentent également des fonctions antitumorales directes et indirectes. Les connaissances actuelles sur le rôle des LT CD4+ au cours du développement tumoral proviennent en grande partie d'études de modèles murins de tumeurs transplantées. Cependant, l'inflammation initiée lors de l'inoculation de ces tumeurs due à une mort cellulaire importante favorise la présentation persistante par le MHC-II des antigènes tumoraux dans un environnement inflammatoire artificiel. Nous tentons ici de contourner ce problème en utilisant deux modèles murins différents: le premier est un modèle de tumeur transplantée dans lequel un néoantigène de classe II (DBY) est induit à distance du moment de l'inoculation de la tumeur. Le deuxième est un modèle d'adénocarcinome pulmonaire induit génétiquement exprimant l’epitope DBY, dans lequel la tumorigenèse est initiée par l'expression d’un oncogène associée à la délétion d’un gène suppresseur de tumeurs. La réponse antitumorale des LT CD4+ est suivie par le transfert de LT CD4+ spécifiques de DBY "Marilyn". Dans le modèle de tumeur transplantée, nous montrons que l'apparition d'un néoantigène dans une tumeur bien établie n'est pas ignorée par le système immunitaire. Bien au contraire, le néoantigène arrive au ganglion drainant la tumeur et induit une activation efficace des cellules Marilyn, qui prolifèrent, produisent de l'IFN-γ et recirculent jusqu'à la tumeur. En revanche, malgré une activation efficace des LT CD4+, les tumeurs ne sont pas rejetées. Dans le modèle génétiquement induit, nous montrons que des néoantigènes exprimés dès le début du développement tumoral, arrivent jusqu'au ganglion drainant la tumeur en quantité suffisante pour induire l'activation et la prolifération des LT CD4+, mais que cette activation est non-optimale et ne permet qu'une faible migration vers le site de la tumeur. En revanche, une partie des cellules Marilyn acquièrent l'expression de FOXP3 ainsi qu'une signature transcriptomique de Tregs et ce dès les stades précoces du développement tumoral, tandis que le reste des cellules Marilyn présentent un phénotype anergique (CD44hiCD73hiFR4hi). L'administration de CpG n'empêche pas la conversion en Treg des cellules Marilyn, malgré l'augmentation de la maturation des cellules dendritiques dans le poumon et le ganglion drainant la tumeur. La déplétion des Tregs de l'hôte en revanche inhibe cette conversion et favorise l'activation des cellules Marilyn en cellules effectrices compétentes, capables de migrer jusqu'au site tumoral. Enfin, les cellules Marilyn, lorsqu'elles sont activées hors du ganglion drainant la tumeur échappent à l'inhibition induite par la tumeur et deviennent des cellules effectrices compétentes. Ainsi, dans un modèle tumoral reproduisant le développement naturel progressif des tumeurs humaines, un état de tolérance est induit par la tumeur. Cette tolérance est dépendante des Tregs présents dans le ganglion drainant la tumeur, qui confèrent une tolérance aux LT CD4+ naïfs arrivant dans le ganglion
During tumor development, the immune system is persistently exposed to tumor-associated antigens, frequently in a non-inflammatory context, favoring the establishment of tolerance. Passive (ignorance, anergy or deletion of tumor-specific T cells) or active mechanisms mediated by regulatory T cells (Tregs) may be involved in tolerance. CD4+ T cells are the main source of Tregs but they also display indirect and direct antitumor activity. So far, the contribution of CD4+ T cells during tumor development has been mainly addressed in murine transplanted tumor models. However, in these models the artificial inflammation associated with the presence of dying tumor cells at the time of tumor inoculation favors a long-lasting MHC-II-restricted tumor antigen presentation in an artificial inflammatory context. Here, we addressed this issue using two different models: a transplanted one in which the MHC-II neoantigen (DBY) is induced long after tumor implantation and a genetically engineered mouse (GEM) model of lung adenocarcinoma also expressing the DBY epitope, in which malignant transformation results from both the expression of an oncogene and the deletion of a tumor suppressor gene. Tumor-specific CD4+ T cell response was followed by transfer of naive DBY-specific Marilyn CD4+ T cells. In the transplanted tumor model, we found that the appearance of a neoantigen in established tumors was not ignored by the immune system. On the contrary, the neoantigen reached the tumor-draining lymph node (TdLN) and induced efficient priming of Marilyn cells that proliferated, produced IFN-γ, and recirculated to the tumor site. However, despite efficient induction of a tumor-specific CD4+ T cell response, tumors were not rejected. In the GEM model, we found that starting at the early tumor stages, neoantigens were expressed and reached the TdLN in sufficient amount to induce activation and proliferation of naive Marilyn T cells. However, this priming was suboptimal and resulted in a weak migration to the tumor site. Instead, some of the activated Marilyn cells acquired the expression of FOXP3 and a Treg gene signature while the remaining FOXP3- cells displayed a CD44hiCD73hiFR4hi anergic phenotype. CpG administration did not revert the Marilyn Treg conversion despite reinforcing dendritic cell maturation in the lung and the TdLN. Depletion of the host Treg compartment however, inhibited this conversion and favored Marilyn cell activation into full-blown effector cells able to migrate to the tumor site. Finally, Marilyn cells that were primed at distance of the TdLN, escaped tumor induced inhibition and became full effectors. Thus, in a tumor model reproducing the natural development of slowly growing human tumors, a tumor-associated dominant tolerance is established in the lymph node draining the tumor. This state of unresponsiveness is highly dependent on the presence of Treg cells in the TdLN, conferring tolerance to incoming tumor-specific naive CD4+ T cells

Plus de 30 ans après la découverte du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), entre 20 et 30% des patients sous trithérapie anti rétrovirale (TARV) ne récupèrent pas un taux normal de lymphocytes (LT) CD4, ce qui est associé à une plus grande morbi-mortalité. Il existe de nombreux résultats discordants dans la littérature concernant le rôle joué par l'activation immunitaire des LT CD4 et CD8, ainsi que des incertitudes sur celui des LT régulateurs (Treg), dans cette non réponse immunologique (NRI). Dans le but de clarifier les liens entre NRI, activation immunitaire et Treg, nous avons formulé deux hypothèses : (i) il existe un lien entre le pourcentage de Treg, l'activation immune des LT CD4 et/ou LT CD8, et NRI; et (ii) le pourcentage de Treg mesuré à l'introduction de la TARV est utilisable en tant que marqueur indépendant de risque de NRI à la TARV. Afin de tester nos hypothèses, nous avons dans un premier temps amélioré le phénotypage des Treg en pratique quotidienne, d'abord en comparant différents phénotypes de Treg, puis en validant dans des échantillons cliniques une nouvelle méthode de marquage de FoxP3 intracellulaire en un temps. Puis nous avons analysé dans une étude transversale les liens entre NRI, activation immune, différentes sous populations de Treg et la détection d'une virémie résiduelle, au sein d'une population de patients infectés par le VIH-1, en succès virologique sous TARV depuis de nombreuses années. Les facteurs prédictifs associée à la NRI ont été analysés au moyen d'une analyse multivariée. Nous avons parallèlement étudié au moyen d'une étude prospective le rôle pronostic de la mesure du pourcentage de Treg à l'introduction de la TARV, sur la réponse immune en LT CD4 dans les 2 ans suivant le début du traitement. Nous avons montré que la NRI après 7 ans de TARV en moyenne était associée de façon indépendante au nadir de LT CD4 et au pourcentage de Treg. Nous avons retrouvé une augmentation significative de l'activation immune des LT CD4 en cas de NRI, mais pas des LT CD8. Enfin, nous avons montré que le pourcentage de Treg était, avec le nadir de LT CD4, un facteur prédictif de NRI dans les 2 ans suivant le début de la TARV, et que son impact sur la réponse immune était d'autant plus marqué que le nadir de CD4 était bas. La mesure du pourcentage de Treg à l'introduction de la TARV pourrait être un outil simple et facilement utilisable en routine pour mieux cibler les patients à risque de NRI, en association avec la mesure du nadir des LT CD4. Un suivi de la cohorte permettra de confirmer ces résultats à plus long terme. D'autres études devront être conduites, en se focalisant sur les patients avec un nadir de LT CD4 bas, ainsi que chez des patients plus âgés, afin d'explorer les interactions entre immunosénescence, activation immune et Treg
More than 30 years after the discovery of HIV, between 20 and 30% of patients on highly active antiretroviral therapy (ART) do not recover normal levels of CD4 T lymphocytes (CD4). This immunological non response (INR) to ART is associated with an increased morbidity and mortality. There are many conflicting results in the literature related the role of T cells immune activation of T regulator cells (Treg), in INR. In order to clarify the links between INR, immune activation and Treg, we made two hypotheses: (i) there is a link between Treg’s percentage, immune activation of CD4 and / or CD8, and INR; and (ii) the percentage of Treg measured at ART introduction can be used as an independent predictor for INR. To test our hypotheses, we initially improved the immunophenotyping of Treg in daily practice, by comparing different Treg’s phenotype, and by validating in clinical samples a new « one step» staining method of intracellular FoxP3. Then we analyzed in a crosssectionnal study the links between INR, immune activation, different Treg’s subpopulations and detection of very low level viremia, in a population of HIV-1 infected patients, under suppressive ART for many years. Predictive factors associated with the INR were analyzed using multivariate analysis. Simultaneously, we performed a prospective study to analyse the prognostic role of Treg’s percentage at ART introduction on the CD4 reconstitution within 2 years. We have shown that INR after 7 years of ART was independently associated with CD4 nadir and Treg’s percentage. We found in INR patients a significant increase of CD4 immune activation, but not of CD8. Finally, we showed that the Treg’s percentage and the CD4 nadir were independant predictors of INR within 2 years from the start of ART. The effect of Treg at baseline on CD4 evolution was as lower as the CD4 nadir was higher. Measuring the percentage of Treg at ART introduction could be a simple and easy tool to use in daily routine. It could help to better target patients at risk of INR in association with the measurement of CD4 nadir. A follow-up of the cohort will confirm these results in the long term. Further studies will be conducted, focusing on patients with a low CD4 nadir, and on older patients, in order to explore the interactions between immunosenescence, immune activation and Treg

L’inflammation chronique est une réponse immunitaire dérégulée caractérisée par l’accumulation et l’activation excessive de nombreuses cellules immunitaires, parmi lesquelles les lymphocytes T CD+. La perte osseuse inflammatoire est une des pathologies le plus souvent associée à un grand nombre de maladies inflammatoires chroniques comme la maladie de Crohn. Toutefois, les populations de lymphocytes T impliqués et les mécanismes moléculaires à la base de cette perte osseuse restent, à ce jour, inconnus. L’association d’études in vivo et in vitro chez la souris et chez des patients atteints de cette maladie nous ont permis d’identifier une population lymphocytaire ostéoclastogénique Th17 produisant du TNF-alpha. Cette population est maintenue au sein de la moelle osseuse et induit, via les cellules stromales, une augmentation du recrutement des précurseurs ostéoclastiques et leur différenciation en ostéoclastes. Une étude menée chez les patients atteints de cette maladie a permis de confirmer la présence et le rôle de cette population chez l’homme. Dans le cadre d’inflammations chroniques de bas grade que représente l’obésité, nous avons identifié une population de cellules dendritiques capables de polariser exclusivement des cellules Th17 produisant du TNF-alpha et qui pourraient également être impliquée dans la perte osseuse associée à la prise de poids observée chez les patients obèses. Nos résultats montrent que des lymphocytes T CD4+ produisant de l’IL-17 et du TNF-alpha représentent donc une population ostéoclastogénique qui faisant le lien entre inflammation et ostéopénie est ainsi une potentielle cible diagnostique et thérapeutique dans la perte osseuse inflammatoire
Chronic inflammation is a deregulated immune response characterized by a too important accumulation and activation of numerous cells, among them CD4+T cells. Inflammatory bone loss is the pathology mostly associated with several inflammatory diseases like Crohn’s disease. However, T cells populations and molecular mechanisms responsible of inflammatory bone loss still reaming unknown. Combination of in vivo and in vitro analysis in mice and human allows us to identify Th17 producing TNF-alpha osteoclastogenic T cell population and mechanisms linking inflammation and bone description. This population is maintained in vivo in the bone marrow and induces, via stromal cells, the recruitment of osteoclast precursors and their differentiation in osteoclast. Lastly, we confirm the presence and the osteoclatogenic effect of this population in human. In low-grade inflammation like obesity, we identify a subset of dendritic cells able to polarize mostly Th17-producing TNF-alpha CD4+T cells that could be responsible of bone loss that is observed in overweight patients. Altogether, our results showed for the first time that IL-17+ TNF-alpha+ cells represent an osteoclatogenic T cell subset witch link inflammation to bone destruction and represent a potential diagnostic and therapeutic target in inflammatory bone loss

La rencontre entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice d'antigène (CPA) est un évènement central dans l'initiation et le développement de la réponse immunitaire adaptative. L'interaction entre ces deux cellules entraîne de nombreuses réorganisations moléculaires au niveau de l'aire de contact intercellulaire conduisant à la formation d'une structure dynamique et spécialisée remplissant diverses fonctions biologiques : la Synapse Immunologique (SI). Cette interaction permet à un lymphocyte T CD4+ helper (TH) de s'activer et de mettre en place une signalisation intracellulaire nécessaire à la production de cytokines. Le second aspect crucial de cette interaction consiste en la polarisation de la machinerie sécrétoire du lymphocyte TH vers la CPA permettant ainsi une activation sélective de la CPA présentant l'antigène spécifique et donc une amplification sélective de la réponse immunitaire. Les lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs naturels (Treg) jouent un rôle capital dans le maintien de la tolérance périphérique au soi, leur absence conduisant au développement de syndromes lymphoprolifératifs auto-immuns. Les Treg sont également impliqués dans le contrôle des réponses immunitaires anti-infectieuses et ont un rôle délétère lors des réponses immunitaires anti-tumorales. Différents mécanismes de régulation impliquant le contact cellulaire ou bien la sécrétion de molécules effectrices solubles ont à ce jour été décrits. Mon travail de thèse a été de déterminer si les Treg humains pourraient inhiber les réponses immunitaires en altérant la polarisation des lymphocytes TH vers les CPA. Afin de répondre à cette question, nous avons utilisé des approches de microscopie confocale afin de visualiser un Treg et un lymphocyte TH interagissant simultanément avec une même CPA. Nous avons pu observer que les Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH (appareil de Golgi et cytosquelette de tubuline) vers la CPA via la production locale de TGF-bêta. L'obtention de ces résultats nous a permis d'identifier un nouveau mécanisme de suppression, qui pourrait permettre de mieux appréhender l'incroyable potentiel des Treg à réguler finement les réponses immunitaires
The encounter between a T lymphocyte and an antigen presenting cell (APC) is a central event in the initiation and development of adaptative immune responses. Interaction between these two cells leads to multiple molecular reorganizations of the intercellular contact site leading to the formation of a dynamical and specialized structure filling diverse biological functions: the Immunological Synapse (IS). This interaction enables a CD4+ T helper lymphocyte (TH) to activate and to put into place an intracellular sustained signaling necessary for cytokine production. The second key feature of this interaction consists in TH lymphocyte secretory machinery polarization towards APC thereby allowing a selective activation of the APC presenting the specific antigen and thus a selective amplification of the immune response. CD4+ CD25+ natural regulatory T lymphocytes (Treg) play a pivotal role in the maintenance of peripheral self tolerance, their absence leading to the development of autoimmune lymphoproliferative disorders. Treg are also involved in controlling anti-infectious immune responses and have a deleterious role during anti-tumoral immune responses. To date, different regulation mechanisms involving cellular contact or the secretion of soluble effector molecules have been described. My thesis work was to determine if human Treg could inhibit immune responses by altering polarization of TH lymphocytes towards APC. In order to answer this question we used confocal microscopy approaches so as to visualize a Treg and a TH lymphocyte simultaneously interacting with a same APC. We were able to observe that Treg inhibit secretory machinery polarization of TH lymphocytes (Golgi apparatus and tubulin cytoskeleton) towards APC via local TGF- production. These results enabled us to identify a novel suppression mechanism that could allow to better apprehend the incredible potential of Treg to finely regulate immune responses

L'utilisation d'un système de transfert adoptif de LT CD4+ monoclonaux dans des souris porteuses d'un fibrosarcome exprimant ou non l'antigène (Ag) reconnu par ces LT, nous a permis de montrer que les LT CD4+ sont capables de s'accumuler dans des tumeurs indépendamment de la présence de l'Ag in situ. Ces résultats indiquent de la présence de lymphocytes T infiltrant les tumeurs (TIL) ne reflète pas forcément une réponse anti-tumorale in situ. Nous avons ensuite étudié l'influence de l'intensité du signal (nombre de complexes CMH-peptide) sur l'accumulation intra-tumorale des TIL-CD4+. La présentation indirecte de l'Ag tumoral par les cellules (DC) dans le ganglion drainant la tumeur ne conduit pas à une activation optimale des LT C+. Malgré une prolifération continue et la capacité de sécrétion d'IFN-γ, les LT activités s'accumulent faiblement dans les tumeurs. Nous avons montré que le degré d'accumulation des TIL est lié au nombre de complexes CMH-peptide par DC
Using an adoptive transfert model of monoclonal CD4+ T cells into mice bearing a fibrosarcoma that expresses or not the specific antigen (Ag), we showed that CD4 T cells can accumulate in tumors independently of Ag presence in situ. These results indicate that tumor infiltrating T cells (TIM) presence does not always reflect an ongoing anti-tumor response in situ. Then we studied the influence of signal intensity (number of peptide-MHC complexes) on CD4+ TIL intra-tumor accumulation. Indirect way of tumor Ag presentation by dendritic cells (DC) in the tumor draining lymph node does not lead to an optimal activation of CD4+ T cells. Although, they proliferate continously and have capacity to secrete γ-IFN, activated T cells accumulate poorly in the tumors. We showed that the rate of TIL accumulation is related to the number of peptide-MHC complexes per DC

Le système immunitaire nous défend contre les pathogènes, tandis que plusieurs mécanismes, notamment le contrôle exercé par les lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+ régulateurs (Tregs), concourent au maintien de la tolérance immunitaire vis-à-vis des antigènes de l'organisme. Une rupture de tolérance aboutit au développement de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques (SEP). Nous avons montré le rôle protecteur des Tregs contre le développement de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle animal de SEP. Puis nous avons étudié le rôle du thymus et des antigènes du soi dans la génération de Tregs spécifiques d'antigènes du système nerveux central, et leur spécificité dans le cadre de l'EAE. A l'avenir, une meilleure connaissance des Tregs permettra de concevoir de nouvelles stratégies pour le traitement de la SEP
The immune system defends us against invasions of pathogens; meanwhile, several mechanisms, including the control exerted by CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes (Tregs), maintain an immune tolerance towards self-antigens. A disruption of this tolerance contributes to the development of auto-immune diseases, such as multiple sclerosis (MS). We have showed that Tregs protect mice against the development of experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE), which is an animal model for MS. We have then investigated the role of the thymus and of self-antigens in the generation of Tregs specific for central nervous system antigens, as well as their specificity in EAE. A better knowledge on Tregs will allow the design of new therapeutic strategies for MS patients

Dans l'optique de développer de nouvelles approches d'immunothérapie dans le mélanome, nous nous sommes intéressés à l'antigène MELOE-1 dont l'implication dans l'immunosurveillance du mélanome avait été montrée. Ce travail a permis d'une part de mieux documenter l'immunogénicité de cet antigène et d'autre part de définir les mécanismes de régulation impliqués dans l'expression du gène meloe, deux pré-requis pour une utilisation en vaccinothérapie. Nous avons montré que l'expression du gène meloe était contrôlée à la fois par des facteurs de transcription spécifiques du mélanome et par le statut de méthylation de sa région promotrice, spécifiquement hypométhylée dans la lignée mélanocytaire. Ces deux niveaux de contrôle restreignent l'expression de meloe aux cellules mélanocytaires. En ce qui concerne l'immunogénicité de l'antigène MELOE-1, un des produits issu de la traduction de meloe, nous avons identifié six épitopes de classe II situés dans différentes régions de la protéine, en plus de l'épitope de classe I déjà décrit. De plus, nous avons montré que l'antigène MELOE-1 était capable d'induire des réponses CD4 in vitro majoritairement Th1 à partir des lymphocytes circulants de tous les patients porteurs de mélanome testés. Enfin, des résultats préliminaires suggèrent que l'antigène MELOE-1 entier, ou un long peptide dérivé de cet antigène sont plus efficaces que l'épitope minimal de classe I pour induire in vitro des réponses T CD8 robustes à partir de lymphocytes T circulants. L'ensemble de ces résultats permettrait donc d'envisager l'utilisation de longs peptides dérivés de MELOE-1 pour l'immunothérapie du mélanome
In order to develop new approaches of immunotherapy in melanoma, we focused on MELOE-1 antigen which is involved in immunosurveillance in melanomas. This study allowed to better document the immunogenicity of this antigen and to define the mechanisms involved in the regulation of meloe gene expression, two prerequisites for a use as a cancer vaccine. We showed that meloe gene expression was controlled both by melanoma specific transcription factors and by the methylation status of its promoter region, specifically hypomethylated in the melanocyte lineage. These two levels of control lead to the exclusive expression of meloe gene in melanocytic cells. Regarding the immunogenicity of MELOE-1 antigen, a product resulting from the translation of meloe gene, we identified six class II epitopes in different regions of the protein, in addition to the class I epitope already described. Furthermore, we showed in vitro, that MELOE-1 antigen was able to induce CD4 responses predominantly Th1 from circulating lymphocytes of all melanoma patients tested. Finally, preliminary results suggest that whole MELOE-1 antigen or a long peptide derived from this protein are more effective than the minimal class I epitope to induce robust CD8 T cell responses in vitro from circulating T lymphocytes. Taken together, these results make the use of long peptides derived from MELOE-1 relevant for melanoma immunotherapy

Un enjeu majeur en cancérologie est de réduire le risque de développement métastatique et de rechute. La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), processus physiologique au cours de l'embryogenèse, est un mécanisme central de la carcinogenèse, contribuant de façon précoce à la transformation et la dissémination des cellules tumorales via l'inhibition de la surveillance cellulaire (apoptose et senescence) et l'acquisition de capacités migratoires et invasives. Une autre caractéristique des cancers est la capacité d'échapper à la réponse immunitaire, puissante barrière anti-tumorale. Mais les cellules tumorales entretiennent des relations complexes avec le système immunitaire. Alors que la propension de l'inflammation et des cellules immunitaires innées à favoriser le développement tumoral et l'échappement immunitaire, via l'induction de l'EMT et le maintien d'un microenvironnement immuno-suppresseur, a été bien étudiée, le rôle éventuel de la réponse immunitaire adaptative dans la promotion de l'EMT est quant à lui peu connu. Grâce au développement d'un modèle murin de lignée tumorale mammaire plastique surexprimant l'oncogène Her2/Neu, ce travail démontre in vivo la capacité des cellules tumorales à subir l'EMT, induite par la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T. La déplétion spécifique des lymphocytes T (LT) CD4 restaure le phénotype épithélial de la tumeur, indiquant que les LT CD4 médient une réponse immunitaire induisant l'EMT. En retour, l'EMT confère aux cellules tumorales la capacité de modeler l'immunité comme le recrutement de neutrophiles. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur les interactions entre cellules tumorales et système immunitaire
Current clinical challenge in many carcinomas is to reduce the risk of metastasis development and cancer recurrence. Epithelial-mesenchymal transition (EMT), a physiological process during embryogenesis, is a central mechanism in oncogenesis. EMT induction contributes to early transformation and dissemination through inhibition of cellular surveillance (apoptosis and senescence) and increased migrative and invasive behavior. Another necessary hallmark of cancer is the ability of tumor cells to evade immune surveillance, a powerful barrier against tumor progression. But cancer cells enjoy intricate relations with the immune system. Whereas inclination of inflammation and innate immune cells to favor tumor development and immune escape, via EMT induction and immunosuppressive microenvironment maintenance, has been well investigated, the role of adaptive immune response in EMT promotion is understudied. Based on the development of a plastic murine mammary tumor cell line model overexpressing Her2/Neu oncogene, this study demonstrate in vivo that tumor cells keep an epithelial phenotype in adaptive immunodeficient mice but undergo EMT under the pressure of T-cell mediated immune response, characterized by loss of epithelial EpCAM marker and acquisition of mesenchymal features and EMT transcriptomic signature. CD4 T cell depletion but not CD8 restores the epithelial phenotype of tumors, suggesting that CD4 T cells mediate an immune response that could lead ton EMT induction. In return, EMT confers the ability of tumor cells to shape immunity like intra-tumor neutrophil infiltration. This work shed a new light on interactions between tumor cells and immune system

La fonction des molecules du complexe majeur d'histocompatibilite (cmh) est de presenter les peptides antigeniques aux lymphocytes t. La fixation des peptides sur les molecules du cmh est la premiere etape essentielle mais la presence d'un recepteur t approprie capable de reconnaitre le complexe est aussi necessaire pour initier la reponse immunitaire. Dans cette these, les capacites de liaison de 96 peptides du vih derives des proteines gag p18 et p25, gp120 et nef sur les molecules hla-dr1 et dr103 ont ete etudiees. Ces deux molecules dr ne different que par trois acides amines situes aux positions 67, 70 et 71 de la chaine beta 1 au niveau du site de liaison des peptides et du site de reconnaissance par le recepteur de la cellule t (tcr). Parmi les peptides positifs, onze peptides ayant une bonne affinite pour hla-dr1 et/ou dr103 ont ete choisis pour essayer d'induire in vitro des lignees t cd4#+ a partir des cellules du sang peripherique de donneurs non infectes par le vih et homozygotes pour dr1 ou dr103. Seuls trois de ces peptides montrant une bonne affinite pour les deux alleles dr ont induit la proliferation de lignees t cd4#+. Dans plusieurs cas, nous avons observe egalement une forte proliferation de ces effecteurs contre les cellules lymphoblastoides autologues. Nous avons particulierement etudie la reactivite d'un clone t restreint par dr103 specifique du peptide du vih p25(263-277) qui possede une reaction croisee avec des complexes dr/peptides impliquant d'autres alleles dr et exprimes sur des cellules lymphoblastoides. Un seul recepteur semble implique dans ces differents types de reactivites. Ces reactions croisees pourraient etre causees par une similarite entre ce peptide du vih et des peptides du soi ou derives de l'ebv. Nous avons recherche des homologies entre le peptide du vih p25(263-277) et des peptides derives de proteines nucleaires de l'ebv et en avons trouve une avec le peptide ebna-3c(169-184). De telles similarites entre des complexes impliquant differentes molecules hla-dr et de peptides issus de proteines variees pourraient expliquer certains phenomenes auto-immuns observes pendant la progression du sida. Enfin, pour une therapeutique vaccinale anti-vih, le choix des peptides devrait donc se faire en fonction non seulement de leur affinite de liaison avec les molecules de classe ii les plus communes et de leur immunogenicite mais aussi de la faible frequence de ces reactivites croisees multiples

Dans la rate, les opioïdes modulent la sensibilité à l'apoptose via le récepteur de mort Fas. Les opioïdes peuvent-ils affecter d’autres tissus exprimant Fas ? Nous avons montré dans un modèle d’hépatite Fas-dépendante que l’administration d’un antagoniste des récepteurs opioïdes (naltrexone) réduit significativement la létalité des souris. Cette protection n’implique pas un relais du système nerveux central ni une interaction directe avec les hépatocytes ni un blocage de l’activité des neutrophiles infiltrant le foie lésé. Nous avons montré que le blocage du système opioïde au cours d’une réponse immunitaire T CD4 s’accompagne d’un peuplement plus rapide et plus intense des ganglions lymphatiques drainant le site d’immunisation. Cet effet n’est tributaire ni d’une modulation des chimiokines lymphoïdes ni d’une prolifération accrue ou d’une réduction de l’apoptose des lymphocytes. L’effet des opioïdes sur la migration des cellules dendritiques est actuellement en cours d’investigation.

Le rôle des lymphocytes T CD4+ dans la progression des tumeurs et dans l'immunité anti-tumorale est de plus en plus reconnu chez l'homme et chez la souris. Les mécanismes effecteurs de l’immunité T CD4+ contre le cancer ont été étudiés principalement dans des systèmes de tumeurs transplantées. Dans ces modèles, de nombreuses cellules tumorales meurent au moment de l'implantation, ce qui conduit à la libération de l'antigène tumoral (Ag) dans un contexte inflammatoire. Ceci contraste avec la croissance lente et non-destructrice des tumeurs humaines aux stades précoces. Nous avons montré que la présentation de l’Ag retreint par le CMH-II DBY, libéré par des cellules tumorales mortes injectées en sous-cutané, peut persister durant plusieurs semaines dans le ganglion drainant. L’activation précoce d’une réponse immune dirigée contre l’Ag lors de l’injection de lignées tumorales peut gêner l’étude des relations entre les tumeurs et le système immunitaire. Par conséquent, nous avons généré une lignée tumorale dans laquelle l’expression de DBY peut être induite in vivo à distance de l’implantation. Nous avons également utilisé un modèle de tumeurs pulmonaires endogènes se développant dans des souris transgéniques KrasG12D, p53flox et exprimant DBY de manière spécifique. Notre objectif était d'étudier dans ces deux modèles l'histoire naturelle de la réponse des lymphocytes T CD4+ spécifiques de la tumeur. Dans le système de tumeur transplantée «Ag inductible », nous avons montré que DBY est présenté de manière efficace à des cellules naïves T CD4+ spécifiques dans les ganglions drainant la tumeur. Les réponses prolifératives et effectrices sont similaires dans les systèmes où DBY est exprimé de façon inductible in vivo ou constitutive. Le récepteur de co-stimulation ICOS, ainsi que les récepteurs co-inhibiteurs PD-1 et BTLA sont régulés positivement sur les lymphocytes T CD4+ spécifiques en réponse à l’Ag. La production de cytokines en réponse à une restimulation in vitro révèle un profil effecteur mixte TH1 /TH17. Notamment, un petit pourcentage de lymphocytes T co-expriment les marqueurs de cytotoxicité LAMP-1 et granzyme B. Ainsi, lorsqu’un Ag apparaît à distance de l'implantation de la tumeur, il n’est pas ignoré et n’induit pas de tolérance immune. D'autres mécanismes doivent être considérés pour expliquer l'absence de rejet de tumeur efficace malgré l’activation et la migration des cellules effectrices T CD4+ dans les tumeurs. Les travaux réalisés sur le modèle de tumeurs pulmonaires endogènes sont en cours. A ce stade, nous avons observé que, comme dans les tumeurs transplantées, l’Ag est présenté aux LT CD4+ naïfs qui prolifèrent dans le ganglion drainant et ne se différencient pas en cellules T régulatrices, même aux stades très avancés de la maladie. La capacité des tumeurs à induire une réponse T effectrice semble liée à leur stade de développement. Durant la phase tumorale précoce, les LT spécifiques de DBY produisent de l’IFN-γ et du granzyme B. En revanche, des LT spécifiques produisant de l'IL-17 sont retrouvés dans les poumons de souris ayant des tumeurs invasives de stade terminal. Bien que l'IL-17 puisse favoriser la progression des tumeurs, y compris dans les modèles induits par l’oncogène KrasG12D, de nouvelles données suggèrent que les cellules effectrices TH17 possèdent un haut degré de plasticité et peuvent présenter une activité anti-tumorale. Notre modèle pourrait être utile pour tester de nouvelles stratégies de ciblage de l’IL-17 dans l'immunothérapie du cancer
The role of CD4+ T cells in both tumor progression and immunity is being increasingly acknowledged in humans and mice. CD4+ T cell immunity against cancer has been mostly studied using murine transplanted tumor systems. In these models, many tumor cells die at the time of surgical implantation, leading to the release of tumor antigen (Ag) in an inflammatory context. This contrasts with the slow and non-destructive growth of early stage human tumors. Here, we show that the presentation of a MHC class II-restricted model (male, DBY) Ag released by dying fibroblastic tumor cells may last more than 3 weeks in the tumor draining lymph node (dLN). This artificial, early and long lasting priming precludes the study of the interactions between the immune system and tumors at the steady state. We therefore generated a cell line that could be induced to efficiently express DBY as a neoAg after implantation. We also took advantage of a previously described mouse model of genetically engineered, KrasG12D p53flox lung adenocarcinoma to generate a “spontaneous” tumor model expressing DBY. Our aim was to study in these two models the natural history of the tumor-specific CD4+ T cell response. In the transplanted tumor system, we show that the Ag reaches the dLNs and is efficiently presented to naïve specific CD4+ T cells. The proliferative and effector responses were similar in the inducible and constitutively expressed Ag tumor systems. The ICOS co-stimulatory receptor, and the PD-1 and BTLA co-inhibitory receptors were upregulated on the Ag specific CD4+ T cells in the dLN. We did not observe de novo induction of tumor-specific regulatory T cells. Finally, the pattern of secreted lymphokines in the dLN, spleen and tumor after in vitro Ag restimulation was similar, with a mixed TH1/TH17 response. Notably, a small percentage of DBY-specific effector T cells also displayed a cytolytic phenotype marked by the co-expression of granzyme B and LAMP-1. Thus, when the neo-Ag appears at distance of tumor implantation, the tumor was not ignored and did not induce tolerance of naïve CD4+ T cells. Other mechanisms have to be thought to explain the absence of tumor rejection despite efficient priming and migration of effector CD4+ T cells into tumors. Similarly to the strong proliferative response mentioned above, the DBY tumor Ag was efficiently presented in LNs draining “spontaneous” lung tumors, and induced activation and proliferation of adoptively transferred naive T cells. After priming they did not convert into Tregs, even in end-stage disease. This work is still ongoing, but preliminary results show that activated DBY-specific T cells from the dLN and the lungs produced IFN-γ and granzyme B during early stages of the disease. In contrast, IL-17 secreting cells were found exclusively in the lungs from mice with late-stages invasive tumors. Although IL-17 may enhance tumor progression, including in models driven by the Kras oncogen, emerging data strongly suggest that TH17 effector cells demonstrate a high grade of plasticity and can display anti tumor activity. Little is known about the antigen specificity of IL-17 production in lung cancer patients, and our model could be useful to test new strategies targeting either positively or negatively tumor Ag-specific TH17 cells in cancer immunotherapy

Nous avons étudié les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la défense contre les stades sanguins et dans l'induction de l'immunodépression pendant la malaria à P. Yoelii. Nous avons montré, en utilisant des souris guéries déplétées in vivo en T CD4 ou T CD8, et en testant leur réactivité in vitro contre l'antigène des stades sanguins de P. Yoelii, une plus forte réactivité des cellules T CD8 pendant l'infection primaire alors que les deux sous-populations interviennent après réinfection. La déplétion en cellules T CD4, mais pas en T CD8, entraine la réapparition des parasites chez 25% des animaux réinfectés. Nous avons analysé par PCR les cytokines exprimées par différents nombres de splénocytes, ex-vivo et après stimulation in vitro par l'antigène des stades sanguins ou par les mitogènes des lymphocytes T. Les lymphocytes des animaux en début d'infection ou résistant après réinfection, expriment un large répertoire de cytokines et prolifèrent en présence des antigènes parasitaires, de l'ACM anti-CD3 ou des mitogènes des cellules T. Durant la phase aigue de l'infection, peu de cytokines sont exprimées et la réactivité des splénocytes est diminuée. L'expression des gènes de l'IL-2 et de l'IFN-gamma est corrélée avec le développement de l'immunité contre les stades sanguins du parasite. Nous avons observé 7 fois moins de cellules T dans les rates des animaux infectés comparé aux souris immunes. Pour compenser cette différence, nous avons utilisé des concentrations croissantes de splénocytes dans nos expériences. La diminution de la réponse cellulaire était associée à une faible production d'IL-2, a une diminution du nombre d'IL-2R sur les spénocytes infectés, et que l'IL-2 exogène restaurait partiellement la prolifération. Finalement, nous avons démontré l'existence d'antigènes(s) cross-réactif(s) entre les stades sanguins des Plasmodium murin et humain, reconnu(s) principalement par les cellules T CD8, protégeant partiellement les souris de l'infection par P. Yoelii.

Les « HIV controllers » (HICS) sont de rares patients qui contrôlent spontanément la réplication du VIH en absence de thérapie antirétrovirale. Ces patients sont caractérisés par un taux normal de Cellules T CD4+ et le maintien d'une charge virale indétectable (< 50 copies d'ARN viral / ml de plasma), et montrent un très faible risque de progression vers le sida, de nombreux travaux suggèrent que le contrôle de la réplication virale chez ces patients est dû à une réponse cellulaire antivirale. Particulièrement efficace, notre équipe a montré que ces hics maintiennent des réponses T CD4+ très sensibles, associées à l'expression de TCRS ayant une forte avidité pour certains peptides gag du VIH. Il a été montré en particulier que les cellules T CD4+ de hics répondent à de très faibles concentrations de l'épitope immunodominant GAG293. Dans une première étude, nous avons montré que les cellules T CD4+ des hics maintiennent une population de cellules effectrices de type THI, caractérisées par une production importante d'IFN gamma et du marqueur de dégranulation CD107a en réponse à une stimulation par GAG293, notamment, ces réponses TH1 effectrices persistent malgré la faible quantité d'antigènes viraux présents dans l'organisme des hics. Par contre, les patients traités voient leurs réponses T CD4+ effectrices décroître avec le temps suite à une inhibition par l'IL-10, ce qui suggère la persistance d'une immunosuppression. Malgré la thérapie antirétrovirale prolongée (> 10 ans), la persistance de réponses effectrices T CD4+efficaces malgré une faible virémie pourrait s'expliquer par la présence de cellules T CD4+ de haute avidité chez les hics. Ces résultats nous ont conduit à explorer les niveaux d'expression de T-BET dans les cellules de hics ex vivo, car ce facteur de transcription est critique pour la différenciation des T CD4+ naïves en cellules de type THI. Les niveaux d'expression de T-BET se sont révélés supérieurs chez les cellules TCD4+ des hics par rapport aux cellules issues de donneurs sains. Néanmoins, nous n'avons pas détecté une augmentation de l'expression de T-BET dans les cellules T CD4+ des hics par rapport à celles des patients traités. La possibilité que l'expression de T-BET diffère dans les cellules T CD4+ spécifiques du VIH chez les HICS et chez les patients traités reste à être explorée. La réponse de haute avidité observée pour les cellules T CD4+ des HICS semble s'expliquer par une propriété intrinsèque de leur TCR, en effet, les tétramères de molécules CMH II chargés en peptide GAG293 lient plus efficacement les TCR présents à la surface des cellules T CD4+ + des HICS que celles des patients traités, indiquant une différence dans l'avidité intrinsèque des TCRS, pour identifier les déterminants moléculaires qui sous-tendent cette réponse de haute avidité, nous avons caractérisé le répertoire TCR des cellules T CD4+ spécifiques de l'épitope immunodominant GAG293, les HICS ont montré un répertoire TCR hautement biaisé, caractérisé par une expression préférentielle des chaînes TCR TRAV24 et TRBV2, la présence de motifs conservés au sein des régions CDR3 de ces deux chaînes, et une prévalence élevée de clonotypes publics (n"18 pour chaque chaine de TCR). Les clonotypes publics les plus représentés ont été capables de générer des TCR fonctionnels ayant de affinité de l'ordre du micromolaire pour le complexe PCMH II, ce qui est remarquablement élevé pour les TCRS restreints par le CMH II. Nous avons montré que les TCR de haute affinité spécifiques pour GAG293 sont capables de reconnaitre jusqu'à 5 allèles différents de HLA-DR, de plus, après transduction à l'aide de lentivecteurs, ces TCR ont conféré une réponse spécifique à GAG293 très sensible et polyfonctionnelle aux cellules T CD4+ primaires. Par ailleurs, l'expression de ces TCR dans des cellules T CDS+ leur a permis de répondre à GAG293, malgré l'absence du corécepteur CD4, ces résultats suggèrent que des clonotypes publics ayant une fonctionnalité plus efficace sont impliqués dans le contrôle de l'infection par le VIH. Le transfert de ces TCR dans des cellules hétérologues pourraient contribuer au développement de nouvelles approches immunothérapeutiques contre le VIH
HIV controllers are rare individuals who spontaneously control HIV replication without the need for therapeutic intervention, these patients are characterized by normal CD4+ T cell counts and viral loads, which remain below the limit of detection (<50 RNA copies per milliliter plasma) for extended periods of time, importantly, HIV controllers very rarely progress to aids, accumulating evidence suggests that control of viral replication in these patients is mediated by a particularly efficient cellular immune response. Indeed, our team previously reported that HIV controllers maintain a population of specific CD4+ T cells of high functional avidity, these cells were shown to produce IFN gamma in response to minimal amounts of the immunodominant GAG293 peptide. In a first study, we have shown that HIV controller CD4+ T cells maintain a population of highly efficient effector cells, which are characterized by increased production of IFN gamma and the degranulation marker CD107A in response to stimulation with GAG293, notably, these THI responses persisted in HIV controllers despite the minimal amount of viral antigens available to induce such responses, in contrast, CD4+ T cells from treated patients showed increased expression of IL-10, indicating negative immunoregulation after long-term antiretroviral therapy, the persistence of efficient CD4+ T effector responses in spite of low antigenemia may be explained by the presence of high avidity CD4+ T cells in HIV controllers. These findings prompted us to explore the ex vivo expression patterns of T-BET, which is a key transcription factor driving the differentiation towards THI lineage, T-BET expression levels were higher in HIV controllers compared with healthy blood donors, However, we did not detect Increased T-BET expression in controller CD4+ T cells compared to patients receiving highly active antiretroviral therapy (haart), the possibility that T-BET expression differs in the HIV -specific CD4+ T cells of controllers and treated patients remains to be tested. The high functional avidity observed in controller CD4+ T cells could be explained by an intrinsic property of their t cell receptors (TCRS), which efficiently round GAG293-loaded MHC class-II tetramers, to identify the molecular determinants underlying this hight avidity response, we characterized the TCR repertoire directed at the immunodominant capsid epitope, GAG293. HIV controllers showed a highly skewed repertoire characterized by a predominance of the TRAV24 and TRBV2 variable gene families, the presence of conserved motifs in both CDR3 regions, and a high prevalence of public clonotypes (N=18 for each TCR chain), the most prevalent public clonotypes generated TCR with affinities in the micro-molar range, at the high end of values reported for naturally occurring TCRS, the high-affinity GAG293-specific TCRS conferred broad HLA 11 cross-restriction, with up to 5 HLA-DR alleles recognized, high antigen sensitivity, and polyfunctionalityTo primary CD4+ T cells, in addition, CD8+ T cells could be redirected to target the conserved capsid major homology region by expressing a high-affinity GAG293-specific TCR, these findings indicate that TCR clonotypes with superior functions are associated with HIV control, amplifying or transferring such clonotypes may contribute to immunotherapeutic approaches that aim at a functional HIV cure

La réponse immunitaire anti-CMVH est protectrice et implique les différents effecteurs de la réponse immunitaire cellulaire. Nous avons, dans un but vaccinal, potentialisé la réponse TCD4+ dirigée contre la protéine IE1 grâce à l'utilisation d'une protéine de localisation cytoplasmique et de petite taille. Cette réponse est due à une présentation endogène de cette protéine suivie d'une présentation exogène à des temps tardifs d'infection. Enfin, cette présentation est dépendante du protéasome et des compartiments acides. Nous avons également montré que les clones de lymphocytes TCD4+ anti-IE1 pouvaient exercer une fonction cytotoxique sur des cibles sensibilisées par un peptide mais pas sur des cellules infectées. De plus, la réponse cytotoxique contre le peptide est inhibée par l'infection, ce qui suggère un mécanisme actif d'échappement à cette réponse par le CMVH. Il existe donc un équilibre entre l'immunité anti-CMVH et son inhibition au cours de l'infection
Human cytomegalovirus (HCMV) infects 50-100 % of the world population without overt symptoms but is pathogenic in immunosuppressed individuals. Cellular immunity plays a major role in the control of HCMV infection. Our data show potentiation of the CD4+ T cell response to a specific epitope of IE1 protein through shortening and relocation of an otherwise nuclear protein and suggest applications in vaccination. This response was due to endogenous presentation followed by exogenous presentation at later time points. Presentation was dependent on both proteasome and acidic compartments. We have also shown that although IE1-specific CD4+T cell clones were cytotoxic against peptide-pused targets, their cytotoxicity was undetectable on infected targets. The main reason for this lack of cytotocixity was found to be the selective inhibition of cytotoxicity of infected targets whereas IFN-g production was not impaired. Our data describe for the first the inhibition of cytotoxicity of CD4+ T lymphocytes against infected targets

Les basophiles sont les granulocytes les plus rares. Ils sont impliqués dans la polarisation des réponses immunitaires de type Th2, dans la différenciation des lymphocytes B et dans la protection contre les infections helminthiques. Les basophiles sont impliqués dans la modulation des réponses immunitaires, en particulier dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Des études récentes ont montré que les basophiles murins sont cellules présentatrices d'antigène (CPA) et induisent des réponses Th2 et IgE contre les allergènes et les infections helminthiques.Par conséquent, Nous avons exploré les fonctions des basophiles humains, en particulier comme CPA professionnelles. Les résultats montrent que les basophiles, contrairement aux cellules dendritiques et monocytes, n'expriment pas HLA-DR et les marqueurs de co-stimulations CD80 et CD86. De plus, la stimulation des basophiles par divers allergènes, comme des ligands de TLR et IgE, n'induit pas des changements dans l'expression de ces marqueurs. Enfin, nos résultats montrent que les basophiles ne favorise pas les réponses immunitaire de type Th2 ou Th17. Ainsi,notre étude montre que les basophiles humains circulant ne possèdent pas des fonctions de CPA professionnelles. Des plus, les basophiles sont impliqués dans la pathogenèse de maladies auto-immunes et inflammatoires dépendantes des réponses Th2 et médiées par les lymphocytes B. Puisque la dérégulation des basophiles joue un rôle important dans le développement des réponses immunitaires dans différentes conditions pathologiques, nous avons exploré les mécanismes de régulations qui modulent les fonctions les basophiles. En particulier, nous avons étudié le rôle suppresseur des lymphocytes T régulateurs (Tregs) CD4+CD25+FoxP3, des cellules clés dans la maintenance de l'homéostasie immune, sur les fonctions des basophiles. Nos résultats montrent que les fonctions des basophiles, contrairement à la majorité des cellules immunes, ne sont pas régulées par les Tregs. Bien au contraire, nos résultats montrent que les lymphocytes T favorisent l'activation des basophiles. En résumé, nous avons exploré de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation des fonctions des basophiles humains. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle des basophiles dans les conditions inflammatoires et dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La voie de signalisation mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) joue un rôle central dans la croissance cellulaire, le métabolisme, et l'homéostasie des lymphocytes T (LT). Lors de la transplantation d'organes, l'administration de rapamycine, un inhibiteur de mTOR (mTORi), bloque l'activation des LT et promeut la polarisation des lymphocytes T CD4 régulateur (Treg). En cancérologie, des mTORi sont utilisés pour leur action inhibitrice sur la prolifération et l'angiogenèse tumorales. Cependant l'immunosuppression via l'induction de Treg nécessaire à la prévention du rejet de greffe pourrait être délétère pour la réponse anti-tumorale. Notre hypothèse est que l'efficacité clinique des mTORi serait également dépendante de la modulation de l'immunité adaptative T induite par ces traitements chez les patients atteints de cancer.Au cours de cette thèse, nous avons abordé cette question immunologique dans une cohorte prospective de patients atteints de cancer rénal métastatique (mRCC) traités par évérolimus. L'analyse du taux de Treg et de la réponse spontanée T CD4 Thl anti-tumorale (anti-télomérase TERT) par Elispot-IFN-y a été effectuée au moment de l'inclusion des patients et tous les deux mois après le début du traitement. Nous avons observé chez la majorité des patients une augmentation du taux de Treg après traitement par évérolimus. Ces Treg expriment Hélios, suggérant un phénotype Treg naturel. La fréquence et la qualité de la réponse Thl anti-TERT sont également augmentées suite au traitement. Nous avons montré que conjointement ces deux paramètres immunologiques corrèlent avec l'efficacité clinique du traitement. Les patients présentant précocement une diminution des Treg associée à une augmentation des Thl anti-TERT ont une meilleure survie par rapport aux patients dont les paramètres immunitaires ne variaient pas, ou variaient dans une même direction (13,2 mois vs 8 et 4 mois). De plus, au moment de la progression la plupart des patients perdaient leur réponse Thl anti-TERT, et cet effet était associé à une augmentation des Treg. Les Treg traités par mTORi in vitro inhibent plus fortement la prolifération de LT allogéniques, par un mécanisme contact dépendant. Par l'utilisation d'anticorps monoclonaux déplétant les LT chez la souris et par l'utilisation de souris DEREG, nous avons montré que la présence de Treg in vivo altère l'efficacité anti-tumorale des mTORi, par un mécanisme impliquant l'inhibition des réponses T CD8 anti-tumorales. En conséquence, l'efficacité des mTORi a pu être augmentée par sa combinaison avec des agents bloquant les Treg. En addition, l'administration de temsirolimus améliore l'efficacité anti-tumorale d'un vaccin thérapeutique, en favorisant la différenciation des LT CD8 anti-tumoraux centraux mémoires (CD62L+CD127+) et précurseurs mémoires (CD127+KLRGl'°) induits par la vaccination.En conclusion, ces études ont montré pour la première fois le rôle de l'immunité T anti-tumorale sur l'efficacité clinique des mTORi et soulignent ainsi l'intérêt potentiel de combiner les mTORi avec des immunothérapies anti-tumorales
The mammalian Target of Rapamycin (mTOR) pathway plays a central role in the regulation of cell growth andmetabolism, and is involved in oncogenesis. Everolimus and temsirolimus are two mTOR inhibitors (mTORi) approvedfor renal and breast carcinoma treatments. However, accumulating evidence highlights a central role for mTOR pathwayin T cell immunity. We showed that 21 out of 23 metastatic renal cell carcinoma patients under everolimus treatmenthad an increase of Tregs atter everolimus treatment. Paradoxically, strong antitumor Th 1 responses were detected andthen greatly decreased at the time of disease progression when high expansion of Tregs occurred. Furthermore, weidentified three immune groups based on the early modulation of both Treg and anti-tumor Thl cells and found thatpatients with {low Tregs plus high anti-tumor Thl cells} showed the best survival. In vitro, mTORi-exposed Tregs highlysuppressed T cell proliferation and Thl-associated cytokines production. We showed in vivo that T cells depletiondifferentially modulated the antitumor efficacy of mTORi. Although anti-mTOR effect was loss in B16-OVA-bearingmice lacking CD8 T cells, CD4 T depletion increased mTORi efficacy. The studies conducted in mice demonstratedthat the presence of Tregs in vivo altered the responses to mTORi via a mechanism involving the inhibition of antitumorCD8 T cell responses. Finally the efficacy of mTORi was improved by combination with Tregs depleting agents andvaccines. Altogether, our results describe for the first time a dual impact of host adaptive antitumor T cell immunity onthe clinical effectiveness of mTQRi and prompt their association with immunotherapies

Ce projet a accompagné le développement pré-clinique de l'hormone humaine Relaxine-2 (Rln2) ayant induit des anticorps durant des essais cliniques, il est axée autour de 2 problématiques : (1) comprendre son immunogénicité, (2) étudier l’impact de modifications chimiques sur l’immunogénicité afin d'augmenter sa stabilité.Compte tenu du rôle des lymphocytes T CD4 dans les réponses immunitaires, la fréquence de cellules T spécifiques de la Rln2 dans un large panel de donneurs sains a été estimée et a permis d’expliquer le développement d’anticorps anti-Rln2. La cartographie des épitopes T a ensuite identifié les zones portant son immunogénicité. Puis, 6 modifications chimiques (acide aminé D, acide aminé isobutyrique, peptoïde, N-méthylation, C-méthylation et réduction de la liaison peptidique) utilisées pour augmenter la demi-vie ont été introduites à la plupart des positions d’un peptide hautement immunogène. La reconnaissance par des cellules T, la liaison aux molécules de présentation et la capacité à induire des lymphocytes T CD4 ont été étudiées pour les peptides analogues modifiés. La plupart des modifications se sont révélées être très efficaces pour minimiser les propriétés immunogéniques.Ce projet de thèse se situe donc à la croisée des chemins entre l’acquisition de connaissances nouvelles en immunologie et leur application dans des processus de conception et de gestion des risques de peptides thérapeutiques
This project has accompanied the pre-clinical development of the human hormone Relaxin-2 (Rln2) that induced antibodies during clinical trials, it focuses on two issues: (1) to understand its immunogenicity, (2) to study the impact of unnatural modifications on immunogenicity to increase its stability.Given the role of CD4 T-cells in immune responses, the frequency of Rln2-specific T-cells in a large panel of healthy donors was estimated, and explained the development of anti-Rln2 antibodies. The T epitope mapping then identified the areas responsible for its immunogenicity. Then, 6 unnatural modifications (D amino acid, amino isobutyric acid, peptoid, N-methylation, C-methylation & reduced peptide bond) used to increase the half-life were introduced at most positions of a highly immunogenic peptide. T-cell recognition, binding to HLA molecules and the ability to induce CD4 T-cells were studied for modified analog peptides. Most of the modifications were very effective in minimizing immunogenic properties.This thesis project is at the crossroads between the acquisition of new knowledge in immunology and its application in the process of design & risk management of therapeutic peptides

L'étude des populations de lymphocytes T CD4+ effecteurs (Teff) chez l'Homme présente un intérêt croissant dans les enjeux actuels que constitue l'élaboration de nouvelles immunothérapies. Ces travaux détaillent la caractérisation et la régulation d'une population de Teff exprimant l'ecto-nucléotidase CD73 ayant pour fonction de dégrader l'AMP extracellulaire en adénosine (Ado) immunosuppresseur. Cette population, enrichie en lymphocytes T helper de type Th1.17, est très polyfonctionelle et pro-inflammatoire. Les Teff CD73+ expriment peu de points de contrôles immunitaires inhibiteurs mais sont régulés par leur production autocrine d'Ado qui limite leurs fonctions effectrices et leurs capacités prolifératives. Les Teff CD73+ expriment par ailleurs fortement le transporteur ABC multidrug-resistance 1 (MDR1), responsable de l'exclusion de nombreuses drogues du cytoplasme des cellules. L'étude de cette population dans différents contextes pathologiques a permis de détailler le fonctionnement de cette population. J'ai pu mettre en évidence que l'expression de CD73 est en effet dynamique. Elle est notamment diminuée dans des pathologies arthritiques auto-immunitaires (la polyarthrite rhumatoïde et le rhumatisme psoriasique) dans lesquelles les Th17 et les Th1.17 sont fortement activés. La diminution d'expression de CD73 sur ces cellules constitue la levée d'un frein qui leur permet de contribuer pleinement à l'inflammation chronique caractérisant ces pathologies. Les Teff CD73+, présents dans les tumeurs solides humaines de sein et d'ovaire, pourraient en revanche présenter un avantage sélectif en contexte tumoral de par leur expression de MDR1 leur permettant de résister aux traitements de chimiothérapie. Ces traitements substrats de MDR1, combinés à des thérapies inhibant la fonction enzymatique de CD73, pourrait permettre la restauration d'une réponse immunitaire anti-tumorale efficace médiée par cette population pro-inflammatoire
Requirement for CD4+ effector T lymphocytes (Teff) comprehensive study in human is increasing since it can contribute to the emergence of new immunotherapy strategies. This work brings up important information concerning the characterization and regulation of a Teff population expressing the CD73 ecto-nucleotidase, which is able to degrade extracellular AMP into immunosuppressive adenosine (Ado). This population, highly polyfunctional and pro-inflammatory, is enriched in Th1.17 cells. CD73+ Teff express low levels of inhibitory immune checkpoints but are negatively regulated by the autocrine Ado production that limits their pro-inflammatory function and proliferative capacities. In addition, CD73+ Teff express high levels of the ABC transporter multi-drug resistance 1 (MDR1), responsible for the exclusion of cells’ cytoplasm of many drugs. The study of this population in different pathological contexts enabled to decipher its functions. I could evidence that CD73 expression is dynamic. CD73 is notably decreased in autoimmune arthritic pathologies (rheumatoid arthritis (RA) and psoriatic arthritis (PsA)) in which Th1.17 and Th17 are highly activated. CD73 decreased expression by these cells is a mechanism that alleviates self-inhibition by autocrine Ado production and enables them to fully contribute to chronic inflammation characterizing these pathologies. In tumor context, CD73+ Teff present in breast and ovarian tumors could on the contrary bear a selective advantage due to their high MDR1 expression enabling them to resist MDR1 substrates-based chemotherapy treatments. These chemotherapy treatments combined to therapies blocking CD73 enzymatic function could allow the restauration of an efficient anti-tumor immune response

Le recepteur du virus de la rougeole (vr) a recemment ete identifie comme la proteine humaine cd46. Nous avons cree des souris transgeniques presentant une expression ubiquitaire de cd46 afin d'etudier la pathologie rougeoleuse et la reponse immunitaire dirigee contre le vr. Aucune replication significative n'a pu etre detectee dans les organes des souris transgeniques preleves 5 a 8 jours apres l'inoculation du vr. En revanche, des experiences ex vivo montrent que la presence de cd46 permet l'entree du vr dans la cellule hote quelque soit le type cellulaire etudie (cellules t, cellules b, macrophages). Outre cd46, d'autres facteurs cellulaires sont necessaires pour la replication virale : les cellules b et t exprimant cd46 doivent etre activees pour repliquer le vr. D'autre part, les cellules b activees cd46 supportent la replication virale ce qui suggere l'expression d'un recepteur du vr, distinct de cd46, a la surface des cellules b activees. Enfin, les macrophages cd46+ ne supportent pas la replication du vr. Des experiences realisees sur des cellules humaines mettent en evidence pour la premiere fois une replication du vr dans les dc. De plus, nous montrons que la presence de cellules t activees potentialise la replication virale dans les monocytes et les dc. Enfin, une etude anterieure montre que des cellules provenant d'un lymphome b murin, transfectees et exprimant cd46, presentent efficacement les antigenes (ag) h et np du vr a des hybridomes t cd4#+ specifiques. Des experiences in vitro utilisant des hybridomes t cd4#+, i-e#d restreints, specifiques de la proteine h du vr, montrent que cd46 a un role dans la presentation de h par les cellules b et les dc. Apres immunisation de souris transgeniques et non transgeniques avec du vr non infectieux, des experiences de restimulation in vitro mettent en evidence des cellules t specifiques du vr dans la rate des souris transgeniques. D'autre part, la reponse anticorps specifique de h des souris transgeniques est significativement plus efficace que celle des souris controles. Ces donnees suggerent que la capture du vr par cd46 a pour consequence une presentation efficace des ag viraux par les molecules du cmh-ii in vivo. D'autre part, les resultats obtenus in vitro suggerent que les cellules b et les dc soient responsables de la reponse immunitaire dirigee contre le vr.

La destruction de tumeurs par le système immunitaire est très rare chez l'Homme. Afin de mieux comprendre cette absence de rejet de nombreuses études ont été/sont menées chez la souris grâce à des modèles de tumeurs transplantées. Ces modèles présentent de nombreux inconvénients pour l'étude des réponses immunes anti-tumorales dus, en particulier, à la libération d'une grande quantité d'antigène par les cellules tumorales mourantes ou mortes dans un contexte traumatique lors de l'implantation des tumeurs. Nous avons établi un modèle de tumeur spontanée dans lequel il est possible de faire exprimer un antigène nominal uniquement par les cellules tumorales ainsi que des modèles de tumeurs transplantées dans lesquels l'expression de l'antigène peut être induite à distance de l'implantation évitant ainsi/les sources d'artefacts. Nous pouvons désormais étudier dans de meilleures conditions les relations entre tumeur et système immunitaire.

Une réplication résiduelle et une évolution génétique du HIV-1 semblent pouvoir persister chez les sujets recevant un traitement antirétroviral. Notre étude du tropisme viral dans les réservoirs cellulaires a mis en évidence une sélection progressive de virus utilisant le corécepteur d'entrée CXCR4, ainsi qu'une compartimentalisation cellulaire des quasi-espèces virales sous traitement antirétroviral. L'infection par des virus X4 est associée à un défaut de reconstitution du taux de lymphocytes T CD4 sous traitement antirétroviral. La production thymique et l'export d'émigrants thymiques récents dans le compartiment T CD4 naïf périphérique semblent conservés chez les sujets ayant un défaut de reconstitution immunitaire. La persistance de taux élevés d'activation et d'apoptose lymphocytaire T pourrait être responsable d'une destruction périphérique accrue des T CD4.

Afin de mieux caractériser le phénotype des cellules T régulatrices de type 1 (Tr1), nous avons cherché à identifier les molécules qu'elles expriment de façon différentielle. L'analyse du transcriptome de clones cellulaires T effecteurs et régulateurs humains a permis de mettre en évidence l'expression des intégrines CD18 et CD49b par les cellules Tr1. Nous montrons que leur co-expression identifie une population mineure de lymphocytes T périphériques, secréteurs d'IL-10. L'observation que la fréquence des cellules T CD18highCD49b+ est augmentée chez les patients atteints d'asthme sévère et non contrôlé indique que cette sur-expression pourrait constituer un outil diagnostique pour cette forme d'asthme. Nous avons ensuite évalué les effets des rayons ultra-violet solaires, connus pour leur activité suppressive, sur la fréquence des cellules T infiltrant des sites inflammatoires cutanés. Nous montrons, dans un modèle in vivo d'hypersensibilité de contact au nickel, qu'une seule irradiation solaire induit une immuno-suppression associée à une infiltration cutanée de cellules Tr1 productrices d'IL-10. Dans une troisième étude, nous montrons par une approche biochimique qu'un anticorps monoclonal, généré contre un clone lymphocytaire T cutané, est spécifique de CD66a. L'expression de Cd66a par les kératinocytes de patients psoriasiques, mais pas par ceux atteints de dermatite atopique, souligne le rôle de CD66a dans l'immunité anti-microbienne. Enfin, nous mettons en évidence que son expression sur les kératinocytes et les lymphocytes T est réciproquement induite par les cytokines produites par ces deux types cellulaires activés, à savoir l'IFN-γ et l'IL-7, respectivement.

Les réponses immunes contre les traitements de thérapie génique rAAV, dirigées non seulement contre la capside du vecteur, mais aussi contre le transgène, représentent un défi majeur en particulier dans le contexte d'un transfert de gènes vers le muscle pour le traitement de diverses maladies monogéniques du muscle. Cette thèse est focalisée sur la réponse dirigée contre le transgène. Celle-ci se met en place contre des éléments du transgène thérapeutique qui ne sont pas initialement présents, ou insuffisamment exprimés, chez l'hôte et peut entraîner l'élimination des cellules qui produisent le transgène. Dans ce contexte il est nécessaire de concevoir des protocoles de traitement capable d'imposer en périphérie une tolérance immunitaire spécifique du transgène. Nous avons exploré comment l'induction de l'expression d'un transgène étranger dans le foie à l'aide d'un vecteur rAAV impose une tolérance immunologique après transduction du muscle, et ceci malgré l'initiation dans le muscle d'une réponse T CD8+ et CD4+ dirigé contre le transgène. Nous avons démontré que l'expression du transgène dans le foie promeut une tolérance immunitaire envers une injection du vecteur rAAV dans le muscle et ce malgré la présence d'une réponse mémoire spécifique du transgène. Sur le plan de la réponse T CD8+, nous constatons une délétion totale ou partielle ainsi qu'une conversion des cellules vers un phénotype d'épuisement, avec l'expression du marqueur PD-1. La présence d'une réponse T CD4+ mémoire contre le transgène, ne semble pas altérer la tolérance induite par le foie. Nous discutons ensuite, en nous confrontant aux auteurs du domaine, le mécanisme global éventuellement mis en jeu : Une fois la réponse adaptative complète T CD8+ et T CD4+ initiée dans le ganglion drainant le muscle, ces cellules T doivent, avant de retourner vers le muscle, circuler par le foie. Dans le foie, elles s'y accumulent et rencontrent une seconde fois l'antigène, ce qui semble conduire à l'épuisement, suite à l'expression de PD-1, ou à la mort des cellules T CD8+ par un mécanisme décrit sous le nom d'emperipolesis suicidaire ou d'apoptose dépendant du facteur BIM. Les cellules CD4+, elle, ne subiraient pas de délétion, mais une éventuelle modification phénotypique, vers un phénotype tolérogène ou suppresseur. Ce processus serait dépendant de la rétention des cellules T dans le foie que nous avons mis en évidence, ainsi que de l'affinité de la réponse contre le transgène qui rend compte de nos résultats. Nous exposons finalement le domaine d'application de notre méthode, permettant de surmonter une réponse locale initiée dans le muscle, ce qui peut s'avérer crucial pour le traitement par thérapie génique des dystrophies musculaires monogéniques, basé sur l'emploi de transgènes potentiellement immunogènes dû au défaut d'expression chez le receveur
It is increasingly realized that immune responses to rAAV gene therapy treatments, not only to the vector capsid but also to reparative transgenes can cause adverse effects of importance in the case of muscle gene delivery in monogenic muscle disorders. These responses to "foreign" sequence elements of the reparative transgene that are not initially present or insufficiently expressed in the host represent a threat which can eliminate the transduced cells of interest. It is therefore highly desirable to design immune tolerance protocols able to impose transgene-specific immunological unresponsiveness. We explored here how liver-based recombinant adeno-associated viral vector (rAAV) mediated expression of foreign transgene imposes immune tolerance after immunogenic rAAV muscle transduction. We found that liver transgene expression driven with the hAAT hepatocyte specific promotor is effective to promote robust muscle-associated transgene expression, nullifying transgene-specific CD8+ T cell responses as well as humoral responses. Liver transgene expression equally promotes immune tolerance to subsequent rAAV muscle injections despite the presence of transgene-specific memory responses. Importantly, the CD8+ T cell tolerization process leads to partial deletion and conversion into PD-1+ CD8+ T cells, a hallmark of T cell exhaustion. Likewise, CD4+ T cell responses elicited in muscle do not compromise liver-based tolerance induction. Our results demonstrate that liver transduction with rAAV vectors using hepatocyte specific hAAT promotor imposes immune tolerance to transgene-specific T cells elicited from the naïve T cell repertoire after muscle transduction. Confronting our results with others, we suggest that CD8+ T cell depletion occurs after antigen recognition through direct capture and internalization of T cell corpses by hepatocyte in a mechanism already described and referred to as suicidal emperipolesis. Alternatively, BIM-dependent apoptotic process may also occur as a result of T cell-hepatocyte interactions. Regarding transgene-specific CD4+ T cells, we presume that they undergo phenotypic conversion such as Treg conversion as evidenced in multiple sclerosis models. Our results also suggest that the retention time and affinity of transgene-specific T cells next to transduced hepatocytes is critical for their fate. Last, considering applications for muscle gene therapies, control of local muscle immune response is of crucial importance in the treatment of several muscular dystrophies including Duchenne's muscular dystrophy. In this context our liver-based tolerance induction protocol is relevant, provided that the transgene of interest does not alter hepatocytes functions and is beneficial against adverse immune responses

Les cellules du système immunitaire sont capables de reconnaître et d'éliminer les cellules cancéreuses prévenant ainsi l'apparition de cancers. Parmi celles-ci, l'activité antitumorale est principalement attribuée aux lymphocytes T CD4 helper de type 1 (Thl). Les lymphocytes CD4 sont activés lors de la reconnaissance d'un antigène (Ag) de tumeur présenté par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Ils possèdent des propriétés cytotoxiques propres et activent les autres cellules immunitaires. Dans un premier temps, nous nous somme intéressés au mécanisme de présentation sur le CMH-II de la télomérase (hTERT). La protéine hTERT est capable d'interagir avec les HSPGs facilitant ainsi son internalisation par les DC. Elle emprunte ensuite les voies endolysosomale et cytosolique pour générer des peptides nommés UCP présentés dans le contexte HLA-DR. Cette découverte soutient son utilisation en immunothérapie associée aux chimiothérapies. Nous avons ensuite identifié quatre peptides dérivés de hTERT restreints HLA-DP4 puis comparé leur immunogénicité avec les UCP. Cette analyse a mis en évidence la supériorité des UCP en termes d'immunoprévalence et d'immunodominance. Enfin, nous avons étudié l'impact de l'acquisition d'une résistance à l'oxaliplatine sur le profil antigénique de lignées tumorales de cancers colorectaux (CCR). L'évaluation des réponses immunitaires de patients atteints de CCR nous a permis d'identifier des peptides immunogènes dérivés d'Ag surexprimés après une exposition à l'oxaliplatine. En conclusion, ces travaux pourront participer à l'amélioration des stratégies d'immunothérapie et d'immunomonitoring ciblant les lymphocytes CD4 Thl
Immune cells are able to recognize and eliminate cancer cells to prevent from cancer development. Among them, antitumoral activity is mainly attributed to CD4 T helper 1 (Thl) cells. CD4 Thl cells are activated upon recognition of tumor antigen presented on the Major Histocompatibility Complex class II (MHC-II) molecules. These cells possess their own cytotoxic capacities and activate other immune cells. Firstly, we were interested in the mechanism of presentation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT) which is an attractive tumor antigen target for immunotherapies. hTERT protein can interact with cell surface HSPGs facilitating its internalization by DC. Then, hTERT uses thé endo-lysosomal and cytosolic proteolysis pathways to generale immunogenic peptides named UCP (Universal Cancer Peptide) presented in HLA-DR context. This discovery is an additional argument in favor of using hTERT as a target for cancer immunotherapies. Then, we identified four novel hTERT-derived peptides presented by HLA-DP4 and compared their immunogenicity with UCP. This analysis highlighted the superiority of UCP in term of immunoprevalence and immunodominance. This stresses the importance of considering MHC-II locus for immunotherapy strategies stimulating CD4 T cells. Finally, we studied the impact of oxaliplatin treatment and/or oxaliplatin résistance acquisition on CRC antigenome. Evaluation of immune responses in CRC patients permitted the identification of immunogenic peptides derived from antigens upregulated after oxaliplatin exposition. In conclusion, this work could participate in the improvement of cancer immunotherapies and immunomonitoring targeting CD4 Thl cells

L'objectif de cette thèse était de caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les cellules NK activées par l'IL-21 et d'étudier leur interaction avec les lymphocytes T CD4*. Les lymphocytes Natural Killer (NK) sont essentiels pour la protection exercée par l'immunité innée. Les cellules NK, en plus de leurs fonctions cytotoxiques, peuvent orienter la réponse immunitaire adaptative vers un profile TH1 grâce à leur production d'IFN-y. Dans cette étude, nous avons montré que l'IL-21, une cytokine produite in vivo au cours de l'inflammation chronique ou de maladies infectieuses, induit la différenciation d'une sous-population spécifique de cellules NK co-exprimant ÇD86 et HLA-DR. Les cellules NK HLA-DR* induites par l'IL-21 sont capables d'apprêter et de présenter des antigènes aux lymphocytes T CD4*. De plus, ces cellules produisent MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor) et apportent un signal de costimulation durant le priming des lymphocytes T CD4 naïfs en induisant leur différenciation vers un profile central mémoire (Tcm) peu différencié. Les Tcm activés en présence des cellules NK HLA-DR" sont CXCR3' CCR4' CCR6' CXCR5' et produisent de PIL-2 et du TNF-a. La costimulation des lymphocytes T ÇD4 par les cellules NK HLA-DR" prévient l'acquisition d'un phénotype effecteur mémoire induit par l'IL-2. Ainsi, ces résultats montrent une nouvelle fonction pour l'IL-21 qui peut moduler l'interaction NK/CD4 et favoriser l'expansion des lymphocytes centraux mémoires
Natural Killer lymphocytes are critical for innate immunity-mediated protection. Main roles of NK cell rely on their cytotoxic functions or depend on the tuning of TH1 adaptive immunity by IFN-y. Here, we provide evidence that 1L-21, a cytokine produced in vivo during chronic inflammation or infectious diseases, promotes the differentiation of a specifie subset of NK co-expressing CD86 and HLA-DR. IL-21-propagated HLA-DR' NK were able to process and present antigens to CD4' T lymphocytes. More importantly, IL-21-propagated HLA-DR' NK produced macrophage migration inhibitory factor and provided a co-stimulatory signaling during naive CD4* T cell priming inducing the differentiation of uncommitted central memory (Tcm) lymphocytes. Tcm expanded in the presence of HLA-DR* NK were CXCR3 CCR4" CCR6' CXCR5' and produced IL-2, as well as low levels of TNF-a. Co-stimulation of CD4* T cells by HLA-DR' NK prevented the acquisition of effector memory phenotype induced by IL-2. Altogether, these results demonstrate a novel function for IL-21 in tuning NK and CD4~ T cell interactions promoting a specifie expansion of central memory lymphocytes

Nous étudions les réponses cellulaires T spécifiques du virus HHV-8 dans différentes situations cliniques : au cours de la maladie de Kaposi-MK et de la maladie de Castleman multicentrique-MCM, qui sont liées au virus, et chez des porteurs asymptomatiques du virus-PA. Notre premier travail montre qu’au cours de la MK classique et liée au VIH (n=29 patients), dans un test ELISpot IFN, il existe un déficit quantitatif de cellules T anti-HHV-8 par rapport à des PA (n=23 patients). Cette étude identifie 8 nouveaux épitopes CD8 et CD4 du virus et suggère un déficit spécifique de l’immunité cellulaire anti-HHV-8 dans le sang au cours de la MK. Notre second travail mené chez des patients MCM (n=12) montre que les cellules T anti-HHV-8 ne sont pas déficitaires, mais que leur phénotype est plus différencié par rapport aux PA (n=12). Le pourcentage de cellules effectrices peu différenciées est inversement corrélé à la charge virale HHV-8. Par ailleurs, les cellules CD8 anti-HHV-8 sont polyfonctionelles chez les patients MCM et PA. Ces résultats montrent qu’au cours de la MCM, les réponses CD8 anti-HHV-8, bien que quantitativement présentes et polyfonctionnelles dans le sang, semblent inefficaces sur le contrôle de la maladie. Ces travaux nous permettent d’élaborer 2 modèles physiopathologiques différents au cours de la MK et de la MCM
We study specific-T cell responses to HHV-8 in different clinical situations: during Kaposi sarcoma (KS) and multicentric Castleman disease (MCD), which are HHV-8 related diseases, and in HHV-8 asymptomatic carriers (AC). Our first work during classic and HIV-related KS (n=29 patients) shows a lack of HHV-8-specific T cells in ELISpot IFN assays when compared to AC (n=23 patients). This study identifies 8 new CD4 and CD8 T cell epitopes on HHV-8. Our second work shows that during MCD (n=12 patients), HHV-8-specific CD8 T cells in ELISpot IFN assays are conserved in peripheral blood when compared to AC (n=12 patients), but their phenotype is more differentiated. Percentages of early differentiated effector HHV-8-specific T cells are inversely correlated to HHV-8 viral loads. Furthermore, HHV-8-specific T cells are polyfunctional in MCM and PA patients. These results suggest that during MCD, HHV-8-specific T cells are quantitatively normal and polyfunctional but seems inefficient on MCD control. These studies permit us to elaborate different physiopathological mechanisms for KS and MCM

Le syndrome de Sézary (SS) est un variant leucémique et érythrodermique de lymphomes T cutanés épidermotropes. Son diagnostic repose à la fois sur des critères cliniques, la présence de lymphocytes T à noyau atypique cérébriforme sur un frottis sanguin et la mise en évidence dans la peau, les ganglions et le sang d’un clone lymphocytaire T CD4+. Notre laboratoire a identifié KIR3DL2 comme premier marqueur membranaire spécifique des cellules tumorales de Sézary. KIR3DL2 peut ainsi être utilisé pour le diagnostic et le suivi des patients atteints du SS. Toutefois, aucune étude n’a démontré de lien entre sa structure de récepteur inhibiteur et sa fonction dans les lymphocytes tumoraux de Sézary, et plus particulièrement son implication possible dans les mécanismes régulant la prolifération et/ou la résistance à l’apoptose des cellules tumorales.Au cours de ce travail deux axes ont été développés :- Un premier axe visant à mieux comprendre la fonction de KIR3DL2 et les mécanismes de signalisation intracellulaire initiés lors de son engagement par l’anticorps AZ158 dans les lymphocytes T tumoraux de Sézary. Nos résultats mettent en évidence un rôle de corécepteur inhibiteur pour KIR3DL2 dans les cellules tumorales de Sézary. En effet, l’engagement de KIR3DL2 inhibe la prolifération et l’AICD induites par la stimulation CD3, cette inhibition étant corrélée à une modulation négative des signaux médiés par le TCR. Ainsi, KIR3DL2 ne se comporte pas comme une unité de signalisation indépendante dans les cellules tumorales de Sézary, contrairement à ce qui est observé dans les cellules NK.- Un second axe portant sur l’évaluation d’une nouvelle fonction de KIR3DL2 comme récepteur pour les ODN CpG. Ainsi, nous rapportons pour la première fois un effet direct de l’ODN CpG sur les cellules tumorales T CD4+ de Sézary. En effet, nous avons observé un effet apoptotique de l’ODN CpG-C caspases-dépendant sur les lignées et les cellules tumorales circulantes. De plus, le traitement des cellules tumorales de patients Sézary avec l’ODN CpG-C conduit à une inhibition de l’activation constitutive du facteur de transcription STAT3.La réalisation de cette étude a permis de mieux comprendre la fonction et les mécanismes initiés à partir de KIR3DL2 dans les cellules tumorales T CD4+ de Sézary. De plus, ce travail ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques basées sur le ciblage direct et spécifique des cellules tumorales de Sézary pouvant être associé à une stimulation des acteurs immuns grâce à l’action des ODN CpG
Sézary syndrome (SS) is an aggressive leukemic and erythrodermic variant of cutaneous T-cell lymphoma. It is characterized by the presence of a clonal CD4+ T lymphocyte population in the skin, lymph nodes and peripheral blood. Our laboratory has previously identified the NK cell receptor KIR3DL2 as a valuable diagnostic and prognostic marker for the detection of the tumoral T cell burden of Sézary syndrome patients. However, the function of this receptor on the malignant T lymphocyte population remained unexplored. The specific expression of KIR3DL2 by SS patients malignant cells prompted us to investigate its possible influence on mechanisms regulating the tumoral cells outgrowth and apoptosis process.To this aim, two axes were developed. The first axis aimed to highlight the function of KIR3DL2 on the malignant T lymphocyte population and to elucidate the intracellular signaling mechanisms initiated by engagement of the receptor with the monoclonal antibody AZ158. Our results show that KIR3DL2 can exert an inhibitory co-receptor function in malignant Sézary cells. Indeed, triggering of KIR3DL2 inhibits the CD3-mediated proliferation and cell death of the CD4+ KIR3DL2+ cells, this inhibition being correlated to a down-modulation of the TCR-mediated signals. Thus, KIR3DL2 does not behave as an independent signaling unit in Sézary cells, unlike NK cells.The second axis aimed to evaluate a new function of KIR3DL2 as CpG ODN receptor. We show for the first time a direct effect of CpG ODN on tumoral CD4+ T Sézary cells. Thus, we observed a caspase-dependent apoptotic effect of CpG ODN-C on Sézary cell lines and circulating malignant T cells. This process of cellular death is correlated to a dephosphorylation of the transcription factor STAT3, which is found constitutively phosphorylated and activated in Sézary cells.This study has provided new insights into the function and the intracellular signaling pathways initiated by KIR3DL2 in malignant Sézary T cells. Furthermore, this work opens new therapeutic perspectives based on the direct and specific targeting of tumor cells that could be associated to immune cell stimulation through the use of ODN CpG

Le virus d'Epstein-Barr est un virus persistant, contrôlé mais jamais éliminé par le système immunitaire, qui infecte la majorité de la population. Les lymphocytes T CD4+, peu nombreux in vivo mais néanmoins essentiels dans l'immunité anti-virale, sont globalement peu caractérisés. Nos travaux ont permis de caractériser une réponse T CD4+ cytotoxique dirigée contre la protéine lytique BHRF1, impliquée dans le contrôle des cellules infectées de façon latente par l'EBV. Cette protéine lytique est en effet cross-présentée par les cellules latentes des BLCL n'exprimant pas cet antigène, permettant ainsi leur reconnaissance par les lymphocytes T CD4+ spécifiques de BHRF1. Nous avons également mis en évidence l'existence de fortes réponses alloréactives au sein du répertoire T CD4+ anti-EBV, potentiellement dangereuses lors du traitement des lymphoproliférations liées à l'EBV chez les transplantés, par transfert adoptif de lymphocytes T anti-EBV
Epstein-Barr virus is a persistent virus, controlled but never eliminated by the immune system, which infects 90% of the population worldwide. CD4 T cell responses are essential in anti-viral immunity but found at low frequency in vivo, thus explaining their poor characterisation. We have characterised a cytotoxic CD4 T cell response directed against the lytic protein BHRF1, important in the control of EBV latently infected B cells. In fact, this lytic protein is cross-presented by latently infected B cells, which do not express this antigen, thus leading to their recognition by BHRF1-specific CD4 T lymphocytes. We also show the existence, in the EBV-specific CD4 T cell repertoire, of alloreactive cells potentially dangerous for engrafted people whose B-EBV lymphoproliferations are treated with adoptive transfer of EBV-specific T cell lines

La mémoire immunologique est le mécanisme biologique fondamental à la base du développement de la vaccination. La compréhension de ce mécanisme ainsi que de ses interactions avec les différents acteurs du système immunitaire a permis l’élaboration de vaccins qui sont aujourd’hui les garants d’une protection accrue face à l’émergence de maladies infectieuses potentiellement mortelles. La voie d’injection et le mode de transfert de ces vaccins sont des paramètres majeurs à prendre en considération car ils définissent une modulation des réponses immunitaires et de leurs spécificités d’action. De nos jours, seule la voie intramusculaire demeure la voie majoritaire d’administration de vaccins lors de la prophylaxie primaire en santé humaine. Au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à comparer l’injection d’un antigène (l’ovalbumine) selon deux voies d’administration : la voie intramusculaire et la voie intradermique. Nous nous sommes également appuyés sur une technologie du laboratoire qui consiste à transférer des gènes par des vecteurs AAV2/1 recombinants. Nous disposions de deux constructions de ces vecteurs ayant une spécificité pour cibler les cellules musculaires et permettant l’apport d’un effet auxiliaire par les lymphocytes T CD4+ lors d’injections dans des souris femelles. De plus, une de ces constructions nous permettait d’éviter la voie de présentation directe de l’antigène par les cellules dendritiques (DCs) aux lymphocytes T CD8+. Les capacités modulatrices de ces vecteurs nous permirent de montrer pour la première fois que le vecteur AAV2/1 recombinant était capable de faire exprimer un transgène au sein de la peau et d’y générer une réponse cellulaire forte. Nous avons également montré qu’il existait une synergie d’action entre l’effet auxiliaire et la voie intradermique qui améliorait considérablement les réponses cellulaires issues de la présentation croisée d’antigène. Enfin, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD8+ générés suite à cette synergie d’action présentaient un profil phénotypique de cellules mémoires polyfonctionnelles et capables de protéger l’hôte face à un challenge pathogénique
Immunological memory is the fundamental biological mechanism at the beginning of the development of vaccination. Understanding this mechanism and its interactions with the various players of the immune system has allowed the development of vaccines that are today the most effective barrier against the emergence of life-threatening infectious diseases. Route of injection and the nature of carriers of these vaccines are key parameters to be taken into consideration because they define a modulation of immune responses and their specific features. Nowadays, only the intramuscular injection route remains the major route of vaccines injection in the context of primary prophylaxis in human health. During our study, we were interested in comparing the injection of antigen (ovalbumin) following two routes of administration: intramuscular and intradermal routes. We also relied on a technology in the laboratory that involves the transfer of genes by rAAV2/1 vectors. We had two constructs of these vectors having specificity to target skeletal muscle cells and allowing us to provide a helper effect from CD4+ T cells during injections into female mice recipients. Moreover, one of these constructs enabled us to avoid the direct presentation of antigens by dendritic cells (DCs) to CD8+ T cells. The capacity of modulation of these vectors allowed us to show for the first time that the rAAV2/1 vector was able to trigger the expression of a transgene in the skin, and there to generate a strong cellular response. We have also shown that CD4+ T cell help and the intradermal route of immunization synergize to improve greatly cellular responses from the cross-presentation of antigens. Finally, we have demonstrated that CD8+ T cells generated following this synergism exhibited a phenotypic profile of polyfunctional memory cells and able to protect the host against a pathogenic challenge

L'infection chronique par le VHB reste un problème de santé publique majeur, touchant 400 millions de personnes dans le monde. La présence d'anticorps spécifiques de la protéine « Hepatitis-B spliced-generated protein » (HBSP) chez 30% des porteurs chroniques du VHB a été associée à la sévérité de la fibrose hépatique, suggérant un rôle possible de la réponse immunitaire spécifique de HBSP dans la fibrogenèse. Nous avons identifié plusieurs épitopes dérivés de HBSP capables d'activer une réponse T CD8 chez des souris transgéniques pour les molécules HLA-A2 et HLA-B7 immunisées à l'aide de vecteurs codant pour HBSP. Nous avons ensuite montré que ces épitopes étaient également apprêtés et reconnus chez les porteurs chroniques du VHB. Nous recherchons actuellement les liens éventuels entre la réponse T spécifique de HBSP et la sévérité de la fibrose hépatique et/ou la réplication virale. Dans une deuxième partie, nous avons étudié la fonction auxiliaire de deux épitopes du VHB présentés par HLA-DR1. Le transport et l'apprêtement efficaces de ces épitopes grâce à la chaîne invariante de nos vecteurs a permis d'aider au développement d'une réponse T CD8 polyfonctionneîle spécifique de l'enveloppe virale. Les épitopes décrits ici sont de puissants activateurs des réponses T CD8 et/ou CD4. Leur utilisation au sein de vaccins polyépitopiques pourrait améliorer les réponses cellulaires activées par ces vaccins. De plus, l'identification de réponses T cellulaires spécifiques de HBSP corrélant avec l'évolution de la maladie hépatique, pourrait avoir un impact clinique notamment dans le développement d'un outil de diagnostique de la progression de la fibrose
Chronic HBV infection remains a Worldwide health problem, as 400 million people are chronic HBV-carriers. Detection of antibodies against the recently identified "Hepatitis B spliced-generated protein" (HBSP) in 30% of HBV chronic carriers has been related to the severity of fîbrosis. This suggests a possible role of HBSP-specific T cell immune response in fibrogenesis. We first studied the HBSP-specific T cell immune response in HLA-A2 and HLArB7:transgenic mice immunized with HBSP-encoding vectors. Several epitopes activated CD8 T cell responses in immunized mice. Then, we showed that these epitopes were efficiently processed and recognized by T cells from HBV chronic carriers. We are currently investigating the possible link of these immune responses with severe fibrosis and/or viral replication by exploring the HBSP-specific T cell immune response/in patients with different clinical settings. In a second part, we studied the helper potential of two HLA-DRl-restricted epitopes derived from HBV. Invariant chain of our vectors allowed efficient transport and processing of HLA-DR1 epitopes. These epitopes efficiently helped to develop a polyfunctional CD8 T cell response specific for HBV envelope. Ail the epitopes described here are strong activators of CD8 and/or CD4 T cell immune responses. They could be included in polyepitopic DNA vaccine constructs to increase the cellular responses primed by such vaccines. Moreover, if HBSP-specific T cell responses are correlated with outcome of disease, it could have a great clinical impact, for example to develop a diagnostic tool for fibrosis progression

Les lymphocytes T CD4 (LT CD4) jouent un rôle central dans la régulation des réponses immunitaires vis-à-vis des agents infectieux et des vaccins. Cependant, leur différenciation in vivo est encore mal comprise et les caractéristiques des LT CD4 capables de persister à long terme tout en assurant une réponse immunitaire protectrice sont mal définies. L’approfondissement de ces connaissances est indispensable pour le développement de nouveaux vaccins.

Pour approcher cette question, nous avons utilisé deux approches expérimentales. La première est un suivi de la différenciation des LT CD4 au cours de la réponse immune primaire chez des sujets vaccinés contre l’hépatite B ;la deuxième est la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des LT CD4 mémoires antigène(Ag)-spécifiques pendant la phase d’état. Cette analyse a été réalisée au sein des LT CD4 spécifiques d’Ag vaccinaux, l’Ag de surface du virus de l’hépatite B (HBs) et la toxine tétanique (TT), ainsi que ceux spécifiques des Ag du cytomégalovirus (CMV). Les LT CD4 Ag-spécifiques ont été mis en évidence par cytométrie de flux après marquage intracytoplasmique du ligand du CD40 (CD40L) exprimé en réponse à une stimulation de courte durée par l’Ag. Des expériences basées sur la stimulation par la toxine du syndrome du choc toxique et le marquage du segment Vbeta2 du récepteur des LT ont démontré la bonne sensibilité et spécificité de cette méthode.

Le suivi de la réponse primaire chez 11 donneurs jusqu’à plus d’un an après immunisation par le vaccin anti-hépatite B a permis d’établir un modèle de différenciation des LT CD4 Ag-spécifiques in vivo chez l’homme. Nous avons mis en évidence des LT CD4 spécifiques d’un nombre limité de peptides immunodominants de la protéine HBs suggérant une réponse de type oligoclonale. Grâce à l’utilisation d’un cytomètre neuf couleurs, nous avons mené une analyse détaillée de l’hétérogénéité de la population mémoire HBs-spécifique. L’expression du CCR7 permet de distinguer des cellules de type mémoire centrale (LTCM, CCR7+) et effectrice (LTEM, CCR7-) se distinguant notamment par leur capacité à migrer vers les ganglions lymphatiques ainsi que par leurs propriétés fonctionnelles. Nous avons montré l’existence de ces deux sous-populations au sein des cellules HBs-spécifiques mais par opposition à leur définition initiale, ces LTCM sont capables de produire des cytokines effectrices. La proportion importante de LTCM exprimant le Ki67 témoigne d’une activité proliférative persistante in vivo et suggère la capacité de ces cellules à s’auto-renouveler et éventuellement à alimenter le pool des LTEM. La proportion importante de LTCM exprimant la chaîne alpha du récepteur à l’IL-7 (CD127) suggère que ces cellules sont sensibles aux signaux émanant de l’IL-7, une cytokine dont le rôle dans le maintien de la mémoire lymphocytaire T est connu. Compte tenu de la relevance potentielle de ces caractéristiques uniques pour le développement de vaccins et de l’accumulation de travaux montrant l’avantage sélectif des LTCM à conférer une immunité protectrice, nous avons focalisé la dernière partie de ces recherches sur cette sous-population. Une étude transversale des LTCM spécifiques de plusieurs types d’Ag (éliminés (HBs et TT) ou persistants (CMV)) a été menée. Nos résultats montrent une hétérogénéité, variable selon l’Ag, de la capacité de ces cellules à produire des cytokines effectrices et de leur phénotype de différenciation. Cette donnée nouvelle soulève la possibilité que les LTCM soient hétérogènes dans leur capacité à conférer une immunité protectrice. L’acquisition du marqueur KLRG1 par une fraction des LTCM s’associe à une capacité accrue à produire des cytokines effectrices et à une expression élevée du CD127. La possibilité que ces cellules soient particulièrement aptes à conférer une immunité protectrice et durable est discutée, tout comme les mécanismes menant à leur génération et l’intérêt de ces connaissances pour la conception de nouveaux vaccins.

Doctorat en Sciences médicales
info:eu-repo/semantics/nonPublished