Academic literature on the topic 'Résidu cystéine'

Le métabolisme de l'oxygène conduit à la formation d'espèces chimiques oxydantes, capables de provoquer l'oxydation de nombreux composants cellulaires, dont les résidus cystéines des protéines. L'oxydation du résidu cystéine est contrôlée par un système de réduction composé de deux branches distinctes, appelées la voie des thioredoxines et la voie du glutathion. Ces deux voies utilisent la chimie redox du soufre de la cystéine pour réduire les cystéines oxydées, avec des électrons fournis par le NADPH. Notre travail a consisté à étudier l'état d'oxydation des résidus cystéines de la cellule et la contribution respective des mécanismes opérant le contrôle de l'état redox des thiols. Pour cela, nous avons exploité les approches génétiques chez S.cerevisiae, et les avons couplés à une approche protéomique d'identification des thiols oxydés.
Ce travail nous a permis d'identifier de nombreuses protéines cytoplasmiques portant un ou plusieurs résidus cystéine oxydés et d'établir une différence frappante entre les voies des thioredoxines et du glutathion dans le contrôle de l'état redox des thiols intracellulaires. Au cours de notre travail, nous nous sommes également intéressés à la superoxyde dismutase, une protéine cytoplasmique, que nous avons identifié comme oxydée constitutivement. Nous avons étudié le mécanisme d'oxydation de Sod1, et avons observé que celui-ci semble se dérouler dans l'espace intermembranaire mitochondrial et fait intervenir une oxydase spécifique des thiols

Les cystéines sont des acides aminés possédant un groupement thiol dont la réactivité chimique leur permet de participer à la catalyse enzymatique, la chélation des métaux, l’acquisition de la structure tridimensionnelle, la signalisation et la régulation redox. Les réactions d’oxydation des thiols sont restreintes à des compartiments cellulaires, comme le réticulum endoplasmique ou l’espace intermembranaire de la mitochondrie, dans lesquels il existe des systèmes de thiol-oxydases spécifiques. À l’opposé, le cytosol est considéré comme un environnement réducteur, dû aux deux voies de réduction des thiols cytoplasmiques: la voie des thiorédoxines et la voie du glutathion. Afin de tester la contribution respective de ces deux voies dans le contrôle de l’état redox des thiols, nous avons développé une méthode d’identification des thiols cytoplasmiques oxydés à l’échelle du protéome. Pour cela, nous avons marqué spécifiquement les thiols oxydés par la biotine HPDP, permettant l’identification des protéines oxydées, et par un agent alkylant radiomarqué, permettant de quantifier l’oxydation des thiols. Nous avons mis en évidence de nombreuses protéines oxydées dans le cytoplasme des cellules de S. Cerevisiae et avons étudié la variation de l’oxydation des thiols en anaérobie, en réponse à l’H2O2 et à l’inactivation de l’une ou l’autre des deux voies de réduction des thiols. L’invalidation de la voie des thiorédoxines augmente l’oxydation des antioxydants alors que la déplétion du glutathion diminue l’ensemble des protéines oxydées. Ces effets contrastés suggèrent un rôle exclusif des thiorédoxines dans le métabolisme de l’H2O2 et un rôle du glutathion en tant que tampon redox
The thiol group of cysteine provides this amino acid high chemical reactivity exploited in enzymatic catalysis, metal binding, oxidative folding, H2O2 and NO signaling and redox regulation. The chemical nature of the sulfur atom of cysteine allows this amino acid to exist in several different redox forms. Oxidation of the thiol group of cysteine is mainly restricted to compartments that contain specific oxidases, catalyzing this oxidation as the endoplasmic reticulum or intermembrane space of mitochondria. In contrast, the cytoplasm is generally viewed as a highly reducing environment due to the presence of very efficient electron flow pathways that catalyze reduction of the cysteine residue: the thioredoxin and the glutathione pathways. We addressed the reducing nature of the cytoplasm by identifying oxidized protein-thiol using redox proteomics. We differentially labeled protein oxidized thiols using biotin-HPDP, followed by purification to identify oxidized proteins, and 14C- or fluorescent-labelled N-ethylmaleimide, that provide a quantitative estimate of oxidation. Both methods consistently revealed a high number of oxidized proteins in the cytoplasm of S. Cerevisiae cells. We also studied the effect of anaerobiosis, H2O2, and inactivation of the thioredoxin and glutathione pathways. Thioredoxin deletion generated a pronounced oxidation increase of antioxidants, while glutathione depletion decreased the oxidized proteins. Our main conclusion is the contrasted function of electron flow pathways, with thioredoxin having an exclusive role in H2O2 metabolism and glutathione acting as a cellular redox buffer

L’aminopeptidase B (Ap-B ), Zn2+-métalloexopeptidase de 72 kDa, hydrolyse les acides aminés basiques présents en NH2-terminal de peptides. In vivo, deux substrats ont été identifiés : le glucagon et la cholécystokinine 9. L’Ap-B possède également, in vitro, une activité résiduelle capable d’hydrolyser le leucotriène A4 en leucotriène B4. Dans l’attente de la détermination de la structure 3D de l’Ap-B, un modèle moléculaire de cette dernière a été construit par homologie avec la structure cristallographique de la LTA4 hydrolase. L’activité catalytique de l’Ap-B est sensible aux réactifs des groupements thiol, ce qui suggère une implication directe ou structurale des cystéines dans le mécanisme enzymatique. L’ensemble de ces résidus a été étudié par mutagenèse dirigée. 34 mutants ont été exprimés dans E. Coli, purifiés et caractérisés sur le plan enzymatique et structural. Un pont disulfure, régulant la reconnaissance des substrats par l’Ap-B, a été identifié par spectrométrie de masse.

Les cotransporteurs K⁺-C1⁻ (KCCs) sont des protéines membranaires appartenant à la famille des cotransporteurs cation-C1⁻ (CCC). Leur activité de transport est sensible au NEM, un agent alkylant qui modifie les groupements sulfhydriles accessibles, et leur extrémité C-terminale interagit avec celle d'autres CCCs pour aider à la formation de structures oligomériques. Ces caractéristiques suggèrent que certains résidus cysteines dans les KCCs participent à la fonction et à l'assemblage du transporteur. Dans ce travail, nous avons exploité une approche mutagénique par laquelle l'isoforme neuronal KCC2 a été utilisé comme modèle pour identifier les résidus en cause et la nature de leur implication. Chacun des mutants étudiés renfermait une substitution C G unique dans ses extrémités, lesquelles incluent les domaines d'interaction CCCs/CCCs, sont exposées aux voies si-gnalétiques et baignent dans le milieu réducteur du cytosol, et les types cellulaires utilisés pour l'expression comprenaient les oocytes de la xénope ainsi que les cellules HEK-293. Nous avons observé que les activités de transport pour deux des mutants (C854G et C982G) étaient toujours inhibés par le furosémide, un diurétique de l'anse, mais différaient par rapport au sauvage dans certaines conditions, et étaient plus sensibles à l'effet inhibiteur du NEM. Pendant que, de façon intéressante, les activités de transport pour les différents KCC2 ne semblaient pas corréler avec l'expression à la surface, elles semblaient toutefois corréler avec la formation homooligomérique selon des études de coim-munoprécipitation, et en présence de NEM, le KCC2 sauvage était moins mobile dans les membranes. De façon combinée, ces résultats suggèrent que les résidus cysteines 854 et 982 jouent un rôle fonctionnel important, en supportant des interactions pertinentes entre les KCCs eux-mêmes ou entre les KCCs et d'autres partenaires.

SPC1/furine est une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ membre de la famille des convertases de mammifère et responsable de la maturation de plusieurs précurseurs protéiques tels pro-ADAMTSI, gp160 du HIV-1 et la pro-fibrilline. Un de ses domaines, la région riche en résidus cystéine (RRC), n'a pas de fonction connue. Trois approches furent utilisées afin d'élucider le rôle de la RRC. (1) L'expression de SPC1 dans un modèle de cellules d'insectes et la caractérisation enzymatique de deux formes tronquées, avec et sans RRC, a permis d'établir que la RRC n'a aucune influence sur les paramètres cinétiques de l'enzyme. Cependant, la RRC permet de stabiliser l'enzyme lui permettant d'être active 3 fois plus longtemps. (2) L'importance de la RRC dans la biosynthèse de SPC1 fut étudiée à l'aide de mutants de délétion et de protéines chimériques SPC1 et SPC4. L'expression dans les cellules 293 et l'analyse par marquage métabolique et immunoprécipitation permet [i.e. permettent] d'établir que, contrairement à SPC4, la RRC n'influence pas la biosynthèse de SPC1. La délétion de la RRC de SPC4 diminue l'efficacité d'autoactivation de l'enzyme; l'échange de la RRC de SPC4 par celle de SPC1 ne permet pas de rétablir l'activation efficace de SPC4 suggérant que chaque RRC est spécifique à son enzyme. Enfin, lorsque la RRC de SPC4 est greffée à SPC1 la protéine chimérique se retrouve dans des corps d'inclusion. (3) La RRC de SPC1 est homologue à celle de TNFRI/II. Des mutations dans cette région de TNFRI sont à l'origine du syndrome familial de fièvre épisodique. Des mutations similaires de SPC1 (C614Y/C641F) causent, tout comme pour TNFRI, une diminution marquée du largage. L'étude cinétique montre que le largage est le mécanisme utilisé par les cellules 293 pour réguler le niveau de SPC1 membranaire. Des études avec des inhibiteurs de protéases, agent acidotropiques et la biotinylation des protéines de surface montrent que le largage est fait par une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ et a lieu dans la voie endosomale. Finalement, le site de largage a été délimité aux résidus 683-687 de SPC1.

Les protéines RGS (Regulator of G-protein Signaling) sont des inhibiteurs des voies de signalisation des protéines G. RGS4 atténue l’activité de protéines G dans plusieurs tissus tel que la diminution de son activité peut accroître la sévérité de la bradycardie, cardiomyopathies liées au diabète, l’invasion de cellule cancéreuse du sein, résistance à l’insuline et intolérance au glucose. RGS4 a été localisé à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires, cependant, son mode de trafique intracellulaire reste méconnu. En utilisant des outils de microscopie confocale sur cellules vivantes et méthode de détection d’activité des voies de signalisation conditionnée par les protéines G, nous avons caractérisé l’importance de deux sites de palmitoylation, ces deux sites : Cys2 et Cys12 montrent des intérêts complémentaires dans le trafic de RGS4 vers la membrane cellulaire. Dans un axe linéaire, nous avons identifié DHHC3 et 7, deux enzymes de palmitoylation participant au trafique intracellulaire de RGS4 et donc à la maximalisation de son activité inhibitrice des voies de signalisation contrôlées par Galphaq. Enfin des marqueurs de membranes endosomales, les protéines rab ont permis de caractériser les voies de trafic intracellulaire empruntée par RGS4, par exemple RGS4 est internalisé de la membrane plasmique par Rab5 et recyclé à la membrane cellulaire par Rab11. L’activation ou inhibition de Rab5 et 11 ont permis d’observer des changements d’activité de RGS4. Ces travaux confèrent une base de données pour des études ultérieures visant à développer des stratégies thérapeutiques à accroître les fonctionnalités de RGS4
RGS proteins (Regulator of G-protein Signaling) are potent inhibitors of heterotrimeric G-protein signaling. RGS4 attenuates G-protein activity in several tissues such that loss of its function may lead to bradycardia, diabetic cardiomyopathy, breast cancer cell invasion, insulin resistance and glucose intolerance. RGS4 has been localized to both plasma membrane and intracellular pools, however, the nature of its intracellular trafficking remains to be elucidated. G-protein inhibition requires the presence of RGS4 at the plasma membrane. In this work, we characterized the complementary roles of two putative palmitoylation sites on RGS4 to target intracellular compartments and plasma membrane. We identified palmitoylation on Cys2 and 12 respectively important for RGS4 endosomal targeting and plasma membrane localization, when mutations were introduced to the palmitoylation sites, RGS4 capability of inhibiting Gq-mediated signaling was impaired. As a continuum we identified two palmitoylating enzymes, DHHC3 and 7 as modulator of RGS4 localization and function. Knock downs of DHHC3 and 7 impaired RGS4 endosomal and plasma membrane targeting and capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling. Finally we used live cell confocal microscopy to define RGS4 intracellular trafficking routes. Specifically Rab5 mediated RGS4 trafficking from the plasma membrane to intracellular compartments while Rab11 mediated RGS4 trafficking to the plasma membrane. Activation and inhibition of Rab5 and 11 routes impaired RGS4 capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling pathway. These novel findings provide a strong rationale for future studies aimed at developing new strategies to increase the function of RGS4

L'objectif general de ce travail a ete d'etudier le role de la formation de s-nitrosothiols dans les effets vasculaires du no. L'information majeure que nous avons obtenue est que l'inhibition persistante de la contraction vasculaire induite par certains " donneurs de no " est liee a la formation de stocks mobilisables de no dans la paroi vasculaire, sous forme de s-nitrosothiols. Nous avons egalement montre des differences importantes entre les diverses familles de donneurs de no, et meme a l'interieur d'une meme famille de composes, quant a leur capacite a induire ou non des effets persistants sur le tonus arteriel par s-nitrosation de residus cysteine. En se basant sur les proprietes physico-chimiques de ces composes, nous avons pu proposer que ceux susceptibles d'induire des effets prolonges sont les porteurs de no sous forme redox de l'ion nitrosonium (no+) et suffisamment stables en solution physiologique pour permettre le transfert de no+ sur des residus cysteine dans le tissu vasculaire. En ce qui concerne la stabilite des s-nitrosothiols en solution et les relations entre stabilite et proprietes vasorelaxantes, nous avons montre le role preponderant des ions fer dans le processus de decomposition et de liberation de no a partir de la s-nitrosocysteine. Enfin, nous avons egalement apporte des arguments suggerant la participation de complexe dinitrosyle de fer dans le processus de decomposition et dans l'effet relaxant de la s-nitrosocysteine. De tels mecanismes seraient interessants a exploiter pour compenser la deficience de la production endogene de no par l'endothelium qui est associee a divers facteurs de risque et pathologies cardiovasculaires
The objective of the work was to study the role of s-nitrosothiol formation in the vascular effects of no. The major information that we have obtained is that the persistent inhibition of the vascular contraction induced by some "no donors" is due to the formation of releasable no stores as s-nitrosoproteins in the vascular wall. We also showed important differences between the various families of no donors, and even inside the same family of compounds, for their ability to induce or not persistent effects on arterial tone by s-nitrosation of cysteine residues in vascular tissue. On the basis of the physicochemical properties of these compounds, we propose that prolonged effects can be obtained by carriers of no in its oxidized form nitrosonium (no+) and by compounds enough stable in physiological solution to allow the transfer of no+ on cysteine residues in tissue. With regard to the stability of s-nitrosothiols in solution and the relationship between stability and vasorelaxant properties, we showed the predominant role of the iron ions in the process of decomposition and release of no from s-nitrosocysteine. We also brought arguments suggesting the participation of dinitrosyl iron complexes in the process of decomposition and in the relaxant effect of s-nitrosocysteine. These mechanisms might be interesting to compensate the deficiency in endogenous no production by the endothelium which occur during various cardiovascular diseases

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent l’une des plus grandes familles de cibles pharmacologiques. Afin de pouvoir extraire tout leur potentiel thérapeutique, il faut d’abord comprendre et caractériser le premier événement dans la cascade pharmacologique, c’est-à-dire la liaison d’un ligand à son récepteur. Nous nous sommes intéressés au récepteur CXCR4, car il fait partie de la famille des récepteurs peptidergiques qui demeure peu comprise au niveau de la structure et de leur mode de liaison. Au niveau physiologique, ce récepteur joue un rôle important pour l’homéostasie du système immunitaire ainsi que dans certaines pathologies comme l’infection au VIH-1 et le cancer. Nous avons d’abord caractérisé la pochette de liaison du récepteur CXCR4 à l’aide de photoanalogues du T140, un composé peptidomimétique anti-VIH. Nous avons identifié que le domaine transmembranaire 4 (TM4) est impliqué dans la pochette de liaison orthostérique du récepteur CXCR4. Nous avons aussi généré un modèle par homologie de séquence de la liaison du T140 sur CXCR4. Ce modèle nous a permis de constater que le T140 peut lier profondément au niveau de la pochette de liaison du CXCR4 ainsi qu’au niveau des boucles extracellulaires 2 et 3. À l’aide de la méthode d'accessibilité des résidus cystéines substitués (SCAM), nous avons procédé à la substitution individuelle des résidus du domaine TM4 en cystéine. Nous avons caractérisé ces mutants pour leur affinité et leur expression à l’aide d'études de radioliaison. Nous avons identifié que les résidus Asp171[indice supérieur 4.60] et Pro170[indice supérieur 4.59] se situent face à la pochette de liaison du récepteur à l’état basal. À l’aide du mutant constitutivement actif Asn119[indice supérieur 3.35]Ser, nous avons identifié qu’il y avait un mouvement rotatoire anti-horaire du domaine TM4 permettant au résidu Ile173[indice supérieur 4.62] d'être accessible. Ce mouvement serait couplé à un changement conformationnel de la boucle extracellulaire 2 permettant aux résidus Ser178[indice supérieur 4.67] et Val177[indice supérieur 4.66] d'être accessibles dans un état actif. Ces résultats suggèrent que le domaine TM4 participe à la pochette de liaison du récepteur CXCR4 ainsi qu’aux mouvements conformationnels lors de l’activation.