Academic literature on the topic 'Résonance magnétique nucléaire fonctionnelle RMNf'

Les travaux effectués au cours de ce doctorat ont porté sur le développement d'outils d'exploration atraumatique par résonance magnétique nucléaire (RMN) à 4 Tesla, pour l'étude du muscle strié squelettique, de sa fonction et de ses thérapies. Dans la première partie du travail nous abordons l'imagerie de la thérapie cellulaire. Nous avons étudié le marquage cellulaire par charge directe non spécifique avec deux agents de contraste RMN : un chélate de Gadolinium et un agent superparamagnétique. A l'aide d'un modèle de xénogreffe de myoblastes humains dans la patte de souris immunocompétentes, nous avons pu mettre en évidence la persistance d'un signal non spécifique des superparamagnétiques jusqu'à trois mois au-delà du rejet du greffon cellulaire dans notre modèle. Cette modalité, qui est la plus utilisée dans la littérature, est donc inappropriée pour le suivi à long terme de la thérapie cellulaire. La deuxième partie présente différents outils d'exploration fonctionnelle par RMN. La spectroscopie dynamique du phosphore 31 (31P) permet l'estimation des capacités oxydatives mitochondriales in vivo à l'exercice. Par ailleurs, l'imagerie combinée au marquage magnétique des spins de l'eau artérielle (ASL) permet la mesure quantitative de la perfusion tissulaire. Une étude théorique des modèles à 1 et 2 compartiments pour le calcul de la perfusion a permis de valider l'utilisation du modèle à 1 compartiment dans nos conditions expérimentales. Dans ce travail de thèse, nous avons mis au point un protocole d'exploration multiparamétrique fonctionnelle (mpf) du muscle à l'exercice électrostimulé adapté aux modèles murins et permettant l'entrelaçage des séquences de spectroscopie du 31P et d'imagerie ASL. Nous présentons les adaptations de l'instrumentation et des séquences et nous proposons un protocole de répétition d'exercices et la sommation des résultats successifs pour pallier le manque de signal 31 P inhérent à la taille de l'animal. Les résultats montrent l'établissement d'un état d'équilibre dans la réponse à l'exercice et autorisent la sommation des résultats au-delà des deux premiers exercices. Enfin, dans la dernière partie, la méthodologie mpf est appliquée à l'étude des relations entre l'apport perfusionnel et le métabolisme énergétique à l'exercice dans deux modèles d'hypertrophie musculaire, constitutive (knock-out pour la myostatine, mstn-/-) ou induite par électrotransfert du gène de la follistatine, inhibiteur de la myostatine
This work deals with the development of non-invasive NMR tools at 4T dedicated to the study of skeletal muscle function and therapies. The first part includes a review of cell therapy imaging technics. We explored the possibility of using direct loading with MR contrast agents: gadolinium chelates (Gd-DTPA) and iron oxide particles (SPIOs). A xenograft model was used to take advantage of the rapid rejection process. In this way, we evaluated the capacity of each agent to strictly reflect the status of the graft in vivo. Loaded human myoblasts were injected in the leg of immunocompetent mice and Tl weighted imaging was regularly performed until 3 months after injection. Results showed that SPIOs could dramatically overestimate cell surviving while Gd-DTPA was visible only few weeks after cells rejection. We concluded that SPIOs could hardly be recommended for long-term monitoring studies. The second part describes the classic NMR tools for perfusion and energy metabolism measurement. We compared one-compartment and two- compartment models for the calculation of perfusion. In a simulation study, we tested the validity of the one compartment model at 4T in our experimental conditions. In the third part, we proposed a new method to explore both perfusion and energy metabolism in vivo in exercising mouse leg. ³¹P-NMR spectroscopy and ASL-perfusion imaging were interleaved so that in a single exam both vascular and energetic responses were obtained. The strategy we use dis based on the repetition of several successive exercises and the gated summation of results. Improved coefficients of variation allowed for a better estimate of mitochondrial oxidative capacities. We then used our method to investigate perfusion and metabolism changes in different models of muscle hypertrophy: myostatin knock-out and myostatin blockade using follistatin coding plasmid electrotransfer

La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) appliquée à l'état solide permet d'observer, outre les perturbations des niveaux Zeeman, un grand nombre d'interactions internes, généralement moyennées à l'état liquide. Lorsque les développements séquentiels expérimentaux ne permettent pas de s'affrranchir de certaines d'entre elles, l'interprétation des spectres est rendue délicate voire impossible. Théorie et méthodes numériques se mettent alors au service de l'expérience pour une meilleure compréhension des bservations. Néanmoins, un dilemme doit être résolu entre précision des calculs, taille des édifices atomiques traités et nature des noyaux sondés. A partir de l'approximation pseudo-potentiel développée dans le formalisme de la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT), il est montré dans ce travail qu'il est possible de prédire avec précision les paramètres de déplacement chimique et de gradient de champ électrique des éléments 3d dans des systèmes étendus. Une étude fine des différentes approximations présentes dans la méthode "gauge-including projector augmented-wave" (GIPAW) a permis le développement d'outils fiables pour l'étude des noyaux 49Ti, 51V et 55Mn. Après validation sur des composés modèles d'oxydes de vanadium, ces outils ont été légitimement appliqués à d'autres systèmes périodiques. Ainsi, l'étude de composés complexes comme un décavanadate de césium ou des phosphovanadates, a permis d'apporter des réponses quant aux indéterminations structurales et aux problèmes d'interprétation des spectres RMN. Quelques problèmes inhérents à l'approche DFT ont été soulevés et discutés
Besides Zeeman levels perturbation, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) applied to solid state allows the observation of numerous coupling interactions that are not accessible in liquid state. Despite sequential developments for high resolution measurements, interpretation of resonance spectra remains delicate. .

Au sein des cellules eucaryotes, l’ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l’unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l’ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d’histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d’une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d’autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d’étude des mécanismes moléculaires d’assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1

Le lactate est considéré comme un métabolite déchet depuis de très nombreuses années. Cependant, cette vision semble revisitée depuis quelques temps, avec l'apparition de la notion de glycolyse aérobie et de navettes lactate dans différents types cellulaires (muscle, cerveau et sperme). Concernant le cerveau, des études in vitro, ex vivo et in vivo réalisées ces 20 dernières années ont montré, d'une part, que les astrocytes produisent du lactate et d’autre part que le lactate pouvait être un substrat énergétique pour le système nerveux central (SNC), et plus particulièrement les neurones. Cette notion de navette lactate entre astrocyte et neurone a été proposée pour la première fois en 1994 par Pellerin et Magistretti (ANLS, pour astrocyte-neuron lactate shuttle). Malgré de nombreuses recherches depuis, l'existence d'un transfert net de lactate entre les astrocytes et les neurones n'a toujours pas pu être démontrée in vivo. Dans cet optique, la visualisation de la production de lactate in vivo dans le cerveau activé est essentielle. Le rôle des transporteurs au lactate, MCTs (Monocarboxylate Transporters), dans la détection de ce signal est également un point capital. L’objectif de cette thèse a été de développer la spectroscopie de RMN in vivo localisée dans le cortex somato-sensoriel du rat en condition d’activation cérébrale. Dans un premier temps, un travail de développement a été effectué afin de mettre au point le protocole de stimulation neuronale et d’obtenir un rapport signal sur bruit suffisant pour pouvoir quantifier de façon fiable le lactate. Une fois le protocole établi sur des rats contrôles, l’étude a été réalisée sur des rats modifiés génétiquement et réprimés pour le MCT, soit neuronal, soit astrocytaire. Le but était de déterminer si ce partenaire clef de l’ANLS avait une influence sur les fluctuations de lactate lors de l'activation cérébrale. En plus de la spectroscopie proton in vivo et de l’IRM fonctionnelle, des études de RMN du carbone-13 ont été réalisées ex vivo. Le résultat majeur de cette thèse montre qu’en l’absence du transporteur de lactate neuronal, non seulement on perd l’augmentation de lactate lors de la stimulation cérébrale mais on perd également le signal BOLD sur l’IRMf. Ce résultat suggère, et ce pour la première fois, que l’activité neuronale est fortement dépendante du transporteur au lactate
Lactate has been considered as a waste metabolite for many years. However, this vision has been reconsidered recently, with the appearance of the notion of aerobic glycolysis and lactate shuttles in different cell types (muscle, brain, and sperm). Concerning the brain, in vitro, ex vivo and in vivo studies carried out over the last 20 years have shown, on the one hand, that astrocytes produce lactate and, on the other hand, that lactate can be an energetic substrate for the central nervous system (CNS), and more particularly neurons. This lactate shuttle between astrocyte and neuron was first proposed in 1994 by Pellerin and Magistretti (called ANLS, for astrocyte-neuron lactate shuttle). Despite many studies since then, the existence of a net transfer of lactate between astrocytes and neurons has still not been demonstrated in vivo. In this regard, visualization of lactate production in vivo in the activated brain is essential. The role of lactate transporters, MCTs (Monocarboxylate Transporters), in detecting this signal is also a key issue. The objective of this thesis was to develop in vivo NMR spectroscopy located in the somato-sensory cortex of rats under brain activation conditions. First, experiments were carried out to develop the neural stimulation protocol and to obtain a sufficient signal-to-noise ratio to be able to quantify lactate. Once the protocol was established on control rats, the study was performed on genetically modified rats and down-regulated for MCT, either neuronal or astrocytic. The aim was to determine whether this key partner of the ANLS has an influence on lactate fluctuations during brain activation. In addition to in vivo proton spectroscopy and functional MRI, carbon-13 NMR studies were performed ex vivo. The major result of this thesis shows that in the absence of the neuronal lactate transporter, not only is the increase in lactate lost during brain stimulation but the BOLD signal on the fMRI is also lost. This result suggests, for the first time, that neural activity is highly dependent on the lactate transporter

Au niveau cellulaire, une communication continue et régulée doit être maintenue entre les centres de contrôles internes (en charge de la production et de la gestion des macromolécules biologiques) et les récepteurs périphériques (extra ou intracellulaires) initiateurs moléculaires de la réponse. Cette opération a pour but de préserver l'intégrité de tout organisme vivant. Le décryptage moléculaire des différentes étapes requises pour expliquer les systèmes complexes d'interactions (transduction du signal) nécessite de disposer de méthodes biophysiques puissantes, susceptibles de fournir des informations pertinentes pour la construction de modèles physiologiques ou pathologiques intégrés. Ainsi, trois méthodes biophysiques complémentaires (calorimétrie de titration isotherme, résonance magnétique nucléaire et fluorescence) ont été analysées en terme de stratégies d'investigation et de limites de validité. Par la suite, deux sujets liés à des modulations de pathogénicité bactérienne et virale ont été abordés. Dans une première phase, le phénomène de résistance de souches bactériennes aux molécules antibiotiques a été abordé selon deux angles différents. Tout d'abord, plusieurs expériences RMN ont été effectuées afin d'améliorer le niveau de connaissance actuel concernant les détails moléculaires de la transduction du signal requise pour la destruction des antibiotiques de type beta-lactames. Plus particulièrement la levée de répression du gène codant pour la beta-lactamase a été étudiée. Dans une seconde approche, de nouvelles cibles protéiques ont été recherchées et la structure en solution d'une nouvelle protéine a été résolue. Les résultats obtenus et les modèles déduits sont exposés dans ce manuscrit. Pour terminer, une étude combinant génie génétique, RMN, cristallographie et fluorescence in vivo a ouvert une brèche, à l'échelle atomique, vers la compréhension intégrée du phénomène de transmissibilité inter-espèce du virus influenza (notamment grâce à l'obtention de la première structure haute-résolution du ITagment C-terminal de la sous-unité PB2 de la polymérase virale d'irifluenza)
At the cellular level, a continually regulated communication must be maintained between internai control centers (in charge of biological macromolecules production and management) and the peripheral receptors (extra or intracellular) starting points of the response. This process is dedicated to the living organism integrity preservation. Decoding the molecular steps required to explain complicated interaction mechanisms (like signal transduction requires the use of powerful biophysical tools, as they are able to provide appropriate information for the building of integrated physiological or pathological models. Thus, three complementary biophysical methods (isothermal titration calorimetry, nuclear magnetic resonance and fluorescence) were analyzed in terms of investigation strategy and limitations. Two projects linked to bacterial and viral pathogenicity modulations were subsequently treated. One ofthem, the phenomenon ofbacterial resistance to antibiotics, was approached according to two different angles. First ofall, several NMR experiments were performed to improve the current knowledge ofmolecular details constituting the signal transduction processes responsible for the destruction ofbeta-lactams antibiotics. More particularly, the lack ofrepression of genes encoding for the beta-lactamase was studied. Ln a second approach, new protein targets were searched and the solution structure oh new protein was solved. Acquired results and deduced models are displayed in this manuscript. To finish, a study combining genetic engineering, NMR, crystallography and in vivo fluorescence was intended to break through an understanding of the inter-species transmissibility phenomenon of the influenza virus at the atomic level (notably thanks to the first high-resolution structure of the C-terminal ITagment of the PB2 subunit of the viral irifluenza polymerase)

Les cytochromes c3 sont multihémiques et caractérisés par des potentiels redox très bas. Plusieurs gènes codant pour un cytochrome c sont présents dans le génome de la bactérie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). Nous avons étudié par arrimage moléculaire sous contraintes de données de RMN les complexes formés par le cytochrome c3 soluble de type I de DvH avec ses deux partenaires redox. La surface d'interaction du cytochrome c3 est similaire dans les deux complexes, impliquant l'hème 4 du cytochrome dans le transfert d'électron avec les deux protéines. L'analyse du génome de DvH nous a permis de déterminer la présence de trois opérons codant pour trois formiate déshydrogénases différentes dont deux possèdent une sous-unité cytochrome c3. Nous avons mis en évidence l'expression de ces trois enzymes et caractérisé l'une de ces sous-unités cytochrome c3. Nos études d'interactions par RMN hétéronucléaire montre que cette sous-unité est le donneur terminal d'électron de l'enzyme.

Chez les bactéries à Gram négatif, certaines molécules comme les sidérophores ou l’hème doivent être activement transportées à travers la membrane externe via des récepteurs membranaires qui permettent la fixation et l’internalisation du ligand. Ce type de transport nécessite la protéine de membrane interne TonB qui interagit avec ces récepteurs via un domaine globulaire appelé domaine périplasmique. En plus de la protéine TonB, la bactérie Serratia marcescens possède une protéine homologue, appelée HasB, impliquée dans le système d’acquisition de l’hème via les hémophores. Ce système est basé sur la sécrétion d’une protéine extracellulaire qui capture l’hème libre ou lié à des hémoprotéines et qui le délivre ensuite à un récepteur spécifique de la membrane externe (HasR). Chez S. Marcescens, les deux protéines HasB et TonB sont actives pour le transport de l’hème via le récepteur HasR. Cependant, HasB ne peut pas remplacer TonB pour les autres fonctions TonB-dépendantes. La protéine HasB se comporte donc comme une protéine TonB spécifique de l’acquisition de l’hème via le récepteur HasR. Afin de comprendre les bases de cette spécificité, l’étude structurale par RMN du domaine périplasmique de HasB a été entreprise. Pour cela, les étapes de clonage, d’expression et de purification d’un échantillon isotopiquement marqué ont été mises au point. L’analyse des spectres 3D hétéronucléaires correspondants a permis l’attribution des signaux de la protéine ainsi que l’identification des éléments de structures secondaires. L’interaction entre le domaine périplasmique de HasB et HasR a aussi été étudiée par ITC afin de mieux comprendre la spécificité de cette interaction
In Gram negative bacteria, some molecules such as siderophores or heme must be actively transported through the outer membrane. This transport requires outer membrane receptors which interact and internalize the ligand through the membrane. This transport requires the inner membrane protein TonB, which interacts with these receptors through a globular domain named periplasmic domain. In addition to the TonB protein, the Gram negative bacteria Serratia marcescens possesses a supplementary TonB-like protein called HasB. This protein is a component of the hemophore-dependent heme acquisition system of S. Marcescens. This system involves a soluble extracellular protein that acquires free or hemoprotein-bound heme and delivers it to a specific outer membrane receptor (HasR). In S. Marcescens both HasB and TonB are active for heme uptake via the HasR receptor. However, HasB can not replace TonB for the others TonB-dependent processes. There is a great deal of evidence that HasB behaves as a specific TonB-like protein dedicated to heme uptake through the HasR receptor. In order to understand the basis of this specificity, NMR structural study of the periplasmic domain of HasB was carried out. Cloning, expression and purification steps of an isotopically labeled sample were optimized. Heteronuclear 3D spectra analysis enabled us to assign backbone and side chain resonances and to localize secondary structure elements. Additionally, the HasB-HasR interaction was studied by ITC microcalorimetry in order to characterize the specificity of this interaction

Les chaperonines sont des chaperonnes moléculaires indispensables pour le repliement de certaines protéines dans les cellules. La taille et la complexité de ces machineries biologiques rendent complexes l'étude de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. La spectroscopie RMN permet de suivre des changements structuraux et dynamiques en temps réel avec une résolution atomique. Cependant, l'étude par RMN de protéines ou de complexes de haut poids moléculaires a été un challenge pendant de nombreuses années. Dans la première partie de cette thèse, il a été montré que la combinaison de marquage spécifique des groupements méthyles, d'expériences RMN optimisées et de microscopie électronique peut être utilisée pour suivre différents états du cycle fonctionnel d'une chaperonine de 1 MDa. Pour étudier ce mécanisme, la chaperonine native a été reconstituée avec un marquage des groupements méthyles des méthionines et valines. Les résidus méthionines ont pu être utilisés comme des sondes pour identifier les spectres RMN correspondant aux états intermédiaires et aux espèces actives du cycle fonctionnel. Grâce à ces sondes il a été possible de suivre en temps réel les réarrangements structuraux correspondant aux différentes conformations de la chaperonine durant son cycle fonctionnel. La seconde partie traite de la caractérisation de l'interaction de la chaperonine avec une protéine cliente dépliée. L'observation de la stabilisation de l'état déplié de la protéine par la chaperonine a permis de mettre en évidence une activité de "holdase" de la chaperonine. En utilisant une combinaison astucieuse de différents marquages de groupements méthyles et d'expériences RMN optimisés pour des assemblages de haut poids moléculaire, il a été possible d'observer le repliement de cette protéine par la chaperonine et les effets de la présence d'une protéine dépliée sur le cycle fonctionnel de la chaperonine en action
Chaperonins are essential molecular chaperons for the refolding of proteins in the cells. Size and complexity of these biological machineries make complex the study of their structural and functional properties. NMR spectroscopy offers an unique ability to monitor structural and dynamic changes in real-time and at atomic resolution. However, the NMR studies of large proteins and complexes has been a real challenge for a long time. In the first part of this thesis, it has been shown that the combination of methyl specific labeling, optimized NMR spectroscopy for large assemblies and electron microscopy can be used to monitor the different states of the functional cycle of a 1 MDa chaperonin. To study this mechanism, the native chaperonin was reconstituted with a labeling of the methionines and valines methyl groups. Methionines residues have been used as probes to identify the NMR spectra corresponding to intermediates states and active species of the functional cycle. Thanks to theses probes, it has been possible to follow in real time the structural rearrangements corresponding to the different conformations of the chaperonin during its functional cycle. The second part deals with the characterization of the interaction between the chaperonin and an unfolded protein. Observation of the stabilization of the unfolded protein by the chaperonin allowed to identify the holdase activity of the chaperonin. Using a clever combination of a differential methyl labeling and optimized NMR spectroscopy for large assemblies, it has been possible to follow the refolding of the unfolded protein by the chaperonin and the effects of the unfolded protein on the functional cycle of the chaperonin in action

Ce travail est centre sur les developpements methodologiques en imagerie par resonance magnetique des fonctions du cerveau. Une nouvelle methode d'irm fonctionnelle quantitative basee sur la mesure du debit sanguin est tout d'abord decrite. Des images angiographiques ont permis de mesurer le debit dans une veine drainant le cortex moteur. Des variations significatives du debit sanguin entre des periodes de repos, de simulation mentale et d'execution d'un acte moteur ont ete mises en evidence. Ces informations fonctionnelles ne permettent pas de localiser precisement les regions corticales activees. Cette localisation a ete effectuee en appliquant un traitement approprie sur des images sensibles aux variations du taux d'oxygenation sanguine. Des cartes d'activation cerebrale de bonne resolution spatiale ( 3 mm) sont ainsi obtenues. Nous avons alors demontre que l'aire motrice primaire est activee lors de la simulation mentale d'un acte moteur. Les mouvements de la tete survenant pendant un examen fonctionnel induisent des erreurs sur les cartes d'activation. Un nouvel algorithme de correction des deplacements dans le plan des images est presente. Cet algorithme utilise les proprietes de la transformation de fourier concernant les rotations et les translations afin de determiner rapidement les parametres du deplacement. Des tests sur des images simulees ont permis de montrer la fiabilite et la precision de l'algorithme.