Academic literature on the topic 'Ribonucléases – Structure'

L'électrophorèse d'affinité avec ions métalliques immobilisés (IMAGE) peut être appliquée comme outil analytique du changement de disponibilité des histidines de surface qui résulte de changements subtils de structure tridimensionnelle de la protéine. Notre première étude avec l'IMAGE a été faite sur la ribonucléase bovine pancréatique native et glycosylée. La RNase A glycosylée par la voie chimique a montré une forte augmentation de la stabilité thermique, pourtant la résistance à la protéolyse n'a pas varié par rapport à la RNase A native. Pour l'affinité avec l'IDA-Cu(ll) a été légèrement augmentée par comparaison à l'enzyme native. Dans la deuxième partie, les deux différentes formes dimériques, MxM et M=M de la ribonucléase bovine séminale (BS-RNase) peuvent être séparés par IMAGE. La BS-RNase (MxM) a montré plus forte affinité avec les ions métalliques que les autres structures protéiques. Cette différence d'affinité entre MxM et M=M pour les ions métalliques immobilisés peut être due au changement conformationnel résultant d'échange du segment N-terminal (résidus 1 - 17) entre les deux sous-unités. La troisième étude concerne la séparation de la phosphatase acide prostatique (PAP) native, dénaturée et renaturée par IMAGE. La PAP renaturée possède une conformation différente de la PAP native malgré qu'elle aie 70 % de son activité initiale. Une meilleure résolution de ces trois enzymes a été obtenue avec le tampon MOPS par rapport au Tris. Néanmoins, la résolution des différentes PAP est meilleure avec l'augmentation du gradient de Tris. Cela peut être expliqué par le fait que le Tris convertit des interactions de type multi-sites en des interactions de type mono-site entre protéines et chélates d'ions métalliques. L'IMAGE est une méthode très utile afin d'étudier le changement subtil de la structure tridimensionnelle protéique après une petite modification protéique in vivo ou in vitro.

Cette thèse est consacrée à la recherche d'images médicales par leur contenu numérique, en utilisant les informations fournies par des processus de compression d'images. Deux axes principaux de recherche ont été développés. Le premier s'appuie sur une analyse de l'image par quantification vectorielle, qui a conduit à l'élaboration de signatures associées aux images dans la base : les cartes d'activationsʺ. Plusieurs métriques de similitude entre cartes ont été étudiées, et d'autres approches pour introduire de l'information spatiale aux signatures ont été développées. Le deuxième axe est basé sur les méthodes de compression JPEG-DCT et JPEG-2000 qui travaillent dans le domaine transformé. Des signatures spatio-fréquentielles mettant à profit les différentes étapes de la chaîne de traitement définie par ces normes sont proposées. Les méthodes de retrouvaille d'images développées sont évaluées quantitativement sur plusieurs bases d'images médicales.

L'etude des determinants au niveau moleculaire de la stabilite des proteines est d'une importance fondamentale en biochimie. La comprehension du chemin de repliement des proteines est aussi une autre question biochimique centrale. Afin d'etudier ces questions, nous avons choisi deux proteines modeles de l'archaebacterie sulfolobus solfataricus : la ribonuclease sso7d et une carboxypeptidase. Ces proteines d'archaebacteries sont connues pour leur extreme stabilite et leurs proprietes catalytiques qui font d'elles des candidates ideales pour ce genre d'etudes. Les experiences menees dans cette these constituent une investigation thermodynamique et cinetique par le biais de la pression afin d'etudier la relation structure-fonction des proteines. La comprehension notamment de l'effet de la pression sur les proteines est parmi les aspects les moins explores en biophysique. Notre travail sur la carboxypeptidase suggere que la pression peut etre employee dans le domaine biotechnologique en tant que facteur thermo-stabilisant des proteines. L'etude effectuee sur la ribonuclease sso7d a demontre l'importance de la juxtaposition des acides amines aromatiques a l'interieur du centre hydrophobe et des liaisons hydrogene afin de stabiliser la structure native des proteines. L'etude des cinetiques de repliement (induites par des sauts de pression) a permis de caracteriser l'etat de transition de la reaction du repliement de sso7d par son volume d'activation. De plus, l'analyse fine des spectres d'absorbance uv par la methode des derivees quatriemes a revele des informations nouvelles concernant la mobilite des residus a l'interieur des proteines.

La denaturation thermique, birefringence electrique, dichroisme circulaire et accessibilite de l'arn a la ribonuclease t1 des sous-unites ribosomiques 60s de foie de rat en elongation ou inactive ont ete etudiees. Une diminution de la stabilite thermique des arn due a la presence des proteines resistantes est decrite

De nombreux processus cellulaires reposent sur des interactions spécifiques entre les ARN et les protéines. Leur étude est fondamentale pour la compréhension des mécanismes intervenant dans le contrôle de l'expression des gènes. Nous avons ainsi étudié deux systèmes de régulation faisant intervenir ces phénomènes de reconnaissance entre ARN et protéines. L'endoribonucléase RegB du bactériophage t4 participe à la dégradation d'ARN messagers précoces. RegB clive spécifiquement les motifs ggag, entre le second g et le a. Tous les sites ne sont pas reconnus de façon équivalente. En outre, l'activité de RegB est stimulée en présence de la protéine ribosomique s1. Nous avons effectue des cinétiques enzymatiques, en présence de RegB, avec et sans s1, sur différents substrats. Nous avons mis en évidence que l'activité de RegB est influencée par la structure dans laquelle est implique le site ggag. L'analyse de certains de ces substrats par rmn, nous a permis de compléter cette étude. Nous avons montre que RegB reconnaît un motif particulier au sein des arn, dans lequel le ggag est implique dans une paire de bases, et au voisinage de deux boucles. Il est également apparu que s1 ne stimule pas de façon uniforme l'activité de RegB : s1 est également sensible a la structure et a la séquence des substrats. La protéine ribosomique l20, localisée à la surface de la sous-unité 50s du ribosome, intervient dans l'assemblage de cette sous-unité, en se liant avec l'arn 23s. L20 participe à la régulation de l'expression de différents gènes en se liant directement a l'arnm, en particulier un pseudonud. Nous avons entrepris d'identifier le mécanisme de fixation de l20 a l'arn. L'étude structurale de l20 par rmn, et la modélisation moléculaire qui a suivi, nous ont permis de montrer que l20 est constituée de deux domaines, et que la partie c-terminale est formée principalement de trois hélices.

Trz1 chez levure est responsable du clivage endonucléolytique à l'extrémité 3 'au cours du processus de maturation des ARNt. Trz1 appartient à la famille des RNases de type b-lactamase, caractérisé par la présence d'un motif de séquence HxHxDH qui est impliqué dans la fixation des ions de zinc catalytique. La famille des RNaseZ est partagée en deux sous-familles de longueur de séquence différente: les formes courtes (300-400 acides aminés) et les formes longues (700-900 acides aminés). Les structures cristallines des enzymes RNaseZ de forme courte ont montré qu'ils sont actifs comme des homodimères. Une sous-unité englobe les ARNt substrat en utilisant un bras en saillie et l'autre fournit le site catalytique. Nous présentons ici la structure cristalline de Trz1, la première pour une RNase Z de forme longue. Trz1 est organisé en deux domaines reliés par un long peptide charnière. Chaque domaine est composé d'un repliement de type β-lactamase. Le domaine N-terminal a perdu ses résidus catalytiques au cours de l’évolution, mais il contient le bras long qui est important pour la liaison de l'ARNt; tandis que c’est l'inverse pour le domaine C-terminal. À partir des études protéomiques, on sait que Trz1 forme un complexe ternaire avec NUC1, une nucléase mitochondriale impliquée dans l'apoptose, et avec une mutarotase (codée par YMR099C). Nous avons purifié le complexe ternaire Trz1/NUC1/mutarotase caractérisé ses propriétés biochimiques. Trz1/NUC1/mutarotase forme in vitro un heterohexamère très stable en solution. A partir de nos données SAXS et MALLS nous proposons que l'homodimère NUC1 est au centre du complexe et que chaque sous-unité interagit avec une copie de Trz1 et une copie de mutarotase
Yeast Trz1 is responsible for the endonucleolytic cleavage at the 3’-end during the maturation process of tRNAs. Trz1 belongs to the family of β-lactamase type RNases characterized by the presence of a HxHxDH sequence motif that is involved in the ligand formation of the catalytical required Zn-ions. The family consists of two subfamilies: the short forms with sequence lengths between and the long forms. A few crystal structures of short form RNase Z enzymes showed that they are active as homodimers. One subunit embraces the substrate tRNA using a protruding arm and the other provides the catalytic site. We here present the crystal structure of Trz1, the first of a long form RNase Z. Trz1 is organized in two domains connected by a large linker. Each domain is composed of a beta-lactamase type fold. The N-terminal domain has lost its catalytic residues, but contains the long arm that is important for tRNA binding; while it is the other way around of the C-terminal domain. From proteomics studies it is known that Trz1 forms a ternary complex with NUC1, a mitochondrial nuclease involved in apoptosis, and with a mutarotase (encoded by YMR099C). We purified the ternary Trz1/Nuc1/mutarotase complex and characterized its biochemical properties. Trz1/Nuc1/mutarotase forms in vitro a very stable heterohexamer in solution. From our SAXS and MALLS data we propose that the Nuc1 homodimer is at the centre of the complex and that each subunit interacts with one copy of Trz1 and mutarotase

La recherche dans cette thèse de Ph. D. Fait partie d'un effort continu d'améliorer notre compréhension de la structure et de la stabilité de l'ARN : Dans la première partie, un aptamer d'ARN est étudié en complexe avec sa cible, le domaine Sec7 de la protéine intracellulaire cytohesin-1. Aptamers sont des molécules d'ARN sélectionnées in vitro qui ont une affinité rivalisant celle des anticorps monoclonaux, qui possèdent des propriétés pharmacologiques intéressantes et sont un outil puissant pour l'analyse fonctionnelle in vivo. Nous présentons également une recherche structurale systématique sur la façon dont les aptamers et leurs analogues naturelles se fixent sur leurs ligands afin de tracer des principes communs. Dans la deuxième partie, nous étudions le repliement de la RNase P prokaryotique induit par les counterions en utilisant la technique des fontes UV, avec comme but l'optimisation de la structure secondaire et tertiaire en vue de la cristallisation. Nous démontrons l'utilité de cette méthode tout d'abord dans deux cas d'exemple: Premièrement, des paramètres thermodynamiques sont extraits à partir du complexe dit de 'kissing', une interaction tertiaire typique présent dans de nombreux ARNs structurés. Ceci mène à la découverte que la dépendance de la temperature de fusion de la concentration ionique peut donner des indications sur la nature des transitions structurelles observées. Deuxièmement, nous étudions l'effet de mutations sur un ARN plus complexe, le site d'entrée du ribosome (IRES) du virus de l'hépatite C, et corrélons nos données de fonte UV avec un équilibre dynamique entre deux structures alternatives identifiées par empreinte chimique. Les leçons apprises de ces expériences sont alors appliquées à la RNase P pour perturber des interactions tertiaires spécifiques afin de faciliter la cristallisation. L'effet de ces mutations est étudié en utilisant la fonte UV et une nouvelle technique basée sur des oligonucléotides fluorescentes que nous développons. Finalement, des matrices de cristallisation pour la RNase P sont construits à partir de méthodes de plannification expérimentale, et une nouvelle approche pour la cristallisation en gels est développée
The research in this Ph. D. Thesis is part of an ongoing effort to improve our understanding of RNA structure and stability: In the first part, an RNA aptamer is studied in complex with its target, the Sec7 domain of intracellular protein cytohesin-1. Aptamers are in vitro selected RNA molecules that have an affinity rivaling that of monoclonal antibodies, possess interesting pharmacological properties and are a powerful tool for functional analysis in vivo. We also present a systematic structural investigation of how aptamers and their natural counterparts bind their ligands in order to delineate common principles. In the second part, we study the counterion-induced collapse of prokaryotic RNase P RNAs by UV melting, with the goal of optimizing secondary and tertiary structure for crystallization. We demonstrate the utility of this method in two test cases: First, thermodynamic parameters are extracted from the kissing complex, a typical tertiary interaction found in many RNAs. This leads to the discovery that the ionic strength dependence may give clues about the structural transitions observed. Second, we study the effect of mutations on a more complex RNA, the IRES site of hepatitis C virus, and correlate UV melting data to a dynamic equilibrium between alternative structures. The lessons learned from these experiments are then applied to RNase P to disrupt specific tertiary interactions to facilitate crystallization. The effect of these mutations is investigated using both UV melting and a novel, fluorescence-based approach. Finally, crystallization screens are constructed using methods of experimental design, and a new approach for crystallization in gels is developed

L'endoribonucléase RNase L est essentiellement connu comme étant un acteur critique de l'immunité innée pour enrayer la progression d'une infection virale en clivant les ARN cellulaires. Son activité est régulée par de nombreux facteurs tels que la 2-5A et son inhibiteur, la RLI. Au cours de cette étude, nous avons démontré une implication de l'activité de la RNase L dans la régulation de la structure du domaine centromérique. Nous présentons dans ce manuscrit, les perturbations majeures engendrées par une augmentation ou une inhibition de l'activité de la RNase L représentées par une délocalisation de HP1-alpha et de CENP-C causant une déstructuration générale des chromosomes. Ces délocalisations de protéines centrales de la structure chromatinienne seraient causées par un défaut de la maturation des transcrits majeures péricentromériques lors d'une modulation de l'activité de la RNase L. Pour terminer, nous avons également identifié un potentiel trafic cyto-nucléaire empreinté par la RNase L. Nous proposons ainsi une fonction nucléaire inattendue de la RNase L par son implication dans la régulation des transcrits péricentromériques assurant l'intégrité structurale de la chromatine
The endoribonuclease Latente (RNase L) is mostly known as a critical factor in the innate immunity during the cell's defence against a viral infection. The antiviral activity of RNase L which is characterize by it capacity of cleavage of viral RNA, is regulated by several factors like it activator the oligoadénylates 2-5A and his inhibitor RLI. In this manuscript, we have studied the role of the activity of RNase L in the regulation of the structure of centromeric domains. Our results show a general destructuration of chromosomes observed in cells over-expressing RNase L or RLI. These major aberrations are demonstrated by a delocalization of essentials proteins for the structure of chromatin: HP1-alpha and CENP-C. The mislocalization of these proteins could be provoked by a default in the maturation of major transcripts due to a modulation of the activity of RNase L. moreover, in this study, we have identified a mechanism regulating the cyto-nuclear shuttling of RNase L. therefore, we propose that a new nuclear function of RNase L: it's implication in the regulation of pericentromeric transcripts needed to stabilize the integrity of the structure of chromatin