Dissertations / Theses on the topic 'Risposta fisiologica'

I lieviti sono frequentemente associati alla degradazione di alcuni prodotti tra cui succhi e bibite a base di frutta. Negli ultimi anni la ricerca di alternative al trattamento termico ha determinato un crescente interesse verso altre tecnologie, tra cui l’utilizzo di conservanti di origine naturale. Tra questi, oli essenziali e loro costituenti rivestono un ruolo molto importante poiché la loro attività antimicrobica è stata ampiamente dimostrata. Tra queste sostanze il citral, una miscela di due isomeri, nerale e geraniale, è risultata in grado di contrastare lo sviluppo microbico, agendo anche in modo sinergico con il pH. Lo scopo di questo elaborato è stato valutare l’effetto del citral su un ceppo di Saccharomyces cerevisiae isolato da bevande degradate. È stata individuata la minima concentrazione inibente, ossia la quantità di sostanza in grado di inibire lo sviluppo microbico, e la minima concentrazione fungicida, ossia la quantità di sostanza che determina la morte del microrganismo. In seguito il microrganismo è stato esposto a concentrazioni crescenti di citral ed analizzato mediante campionamento in piastra ed analisi citofluorimetrica, che permette di ottenere informazioni a livello di singola cella, discriminandole in base a caratteristiche specifiche. I risultati hanno mostrato come concentrazioni crescenti di citral determinino una progressiva diminuzione dei conteggi in piastra, anche se l’analisi citofluorimetrica ha rilevato la presenza di cellule danneggiate, ma non morte. La cinetica di abbattimento è leggermente più efficace a pH 6, dove si osserva una maggiore permeabilità della membrana cellulare, anche se la percentuale di cellule danneggiate a seguito dell’esposizione al citral è maggiore nei campioni a pH 4. Questo diverso comportamento in relazione al pH considerato dovrà essere meglio approfondito per identificare i meccanismi di risposta delle cellule in presenza di composti d’aroma come il citral.

La citofluorimetria è una tecnica applicata per misurare le caratteristiche fisiche, morfologiche e fisiologiche di cellule microbiche ed ha il pregio di generare un dato per ogni singola particella (cellula) analizzata. Poiché è noto che l’assenza di sviluppo in piastra non implica necessariamente l’assenza di forme microbiche vitali, questa tecnica ha un grande potenziale nello studio dei trattamenti termici che mirano alla stabilizzazione ed alla sicurezza igienico-sanitaria dei prodotti alimentari. Infatti, nel contesto industriale la tendenza è quella di ridurre l’entità di questi trattamenti (tempi/temperature). Ciò può avvenire anche grazie all’utilizzo di composti d’aroma, la cui attività antimicrobica è ben documentata, poiché il trattamento termico, incrementando la tensione di vapore di queste sostanze, ne potenzia l’attività antimicrobica. Questa tesi è incentrata su due aspetti: da una parte, l’effetto dell’esposizione di L. monocytogenes a diverse concentrazioni di timolo e carvacrolo (terpenoidi prevalenti in oli essenziali di Labiatae tra cui timo e origano), dall’altra la valutazione degli effetti di trattamenti termici subletali (45, 50, 55°C), anche in presenza di composti d’aroma, sulla disattivazione e sul successivo recupero di L. monocytogenes. I risultati hanno confermato la forte sinergia tra trattamento termico e presenza di sostanze terpeniche. È stato inoltre dimostrato che la presenza di tali composti incide drasticamente sulle potenzialità di recupero degli eventuali sopravvissuti dopo il trattamento termico. I risultati a volte discordanti tra l’analisi citofluorimetrica (focalizzata sull’integrità della membrana) e i conteggi in piastra hanno evidenziato come i due approcci debbano essere utilizzanti in modo complementare. L’utilizzo di altri coloranti legati ad altre funzioni biologiche e metaboliche permetterà l’ottenimento di informazioni aggiuntive circa la risposta fisiologica di questo microrganismo.

Lo scopo della tesi era valutare l’impatto di alcune condizioni di stress sulla risposta fisiologica di Lactobacillus sakei, una specie appartenente al gruppo dei lattobacilli con la capacità di dominare il microbiota di prodotti carnei fermentati anche quando gli zuccheri esosi (glucosio) o pentosi (ribosio) sono esauriti, utilizzando altri substrati (aminoacidi, piruvato) per ottenere energia tramite vie metaboliche secondarie. Per studiare questi aspetti, il ceppo target (L. sakei Chr82, starter commerciale) è stato pre-coltivato in presenza di glucosio o ribosio ed inoculato in terreno sintetico contenente tutti gli aminoacidi in forma libera. I risultati hanno mostrato che il metabolismo degli aminoacidi era influenzato dalla presenza degli zuccheri, con arginina, cisteina e serina consumati in maniera significativa. Sulla base di questi risultati, nella seconda fase il ceppo è stato inoculato in tampone fosfato a pH 7 o 5, addizionando i suddetti aminoacidi o acido piruvico (punto di partenza per diverse vie metaboliche per la produzione di energia e composti aromatici). I dati dei conteggi hanno mostrato una minore sopravvivenza a pH 5, soprattutto in cellule pre-coltivate con glucosio. L’analisi citofluorimetrica ha evidenziato una maggiore vitalità, ad eccezione del campione con cisteina dopo 6 ore di incubazione. La permeabilità della membrana cellulare era in generale maggiore a pH 7, mentre la depolarizzazione era maggiore a pH 5. Nei campioni con acido piruvico questi valori erano decisamente più bassi, ad indicare una maggiore integrità cellulare. I risultati relativi agli acidi organici hanno mostrato infatti un consumo di piruvato pari a circa il 50%, suggerendo che esso venga impiegato come substrato per vie metaboliche volte a ricavare energia favorendo la sopravvivenza microbica. I risultati ottenuti possono fornire informazioni utili per ottimizzare l'utilizzo di L. sakei nell’industria dei salumi fermentati.

La capacità di esprimere adeguatamente le emozioni attraverso l’uso di strategie adattive di regolazione delle emozioni è cruciale per il sano sviluppo dei bambini. Secondo la teoria dell'attaccamento di Bowlby, la reattività e la regolazione emotiva dei bambini sono correlate ai loro stili di attaccamento. Il presente studio mira ad indagare se l'interazione tra la classificazione di attaccamento e l’espressione emotiva può predire i cambiamenti nella reattività fisiologica dei bambini durante un compito stressante. In un primo momento (T1), le rappresentazioni di attaccamento di N = 59 bambini in età scolare sono state misurate utilizzando la Child Attachment Interview. In un secondo momento (T2), i bambini hanno sostenuto un’impegnativa procedura di laboratorio standardizzata in cui dovevano cercare di risolvere una serie di puzzles risolvibili e irrisolvibili. I livelli di conduttanza cutanea (SCL), l'aritmia sinusale respiratoria (RSA) ed i livelli di cortisolo sono stati registrati come indici fisiologici durante l’intero compito. Le espressioni emotive facciali dei bambini (tristezza e vergogna) sono state codificate durante il quarto puzzle irrisolvibile. I risultati hanno evidenziato che l'espressione dell'emozione modera la relazione tra l'attaccamento evitante e le risposte fisiologiche: in alcuni compiti sono stati mostrati una RSA più bassa e dei SCL più alti; inoltre, l'interazione tra attaccamento ed espressione emotiva di ritiro era associata ad un aumento quasi significativo dei livelli di cortisolo durante l’intera esecuzione dei puzzles. I risultati rivelano che la presenza di attaccamento evitante modulata dall'espressione emotiva di ritiro induce uno stress fisiologico più elevato nei bambini. Comprendere i fattori che influenzano la reattività allo stress nei bambini è essenziale nello sviluppo di interventi che promuovano un adattamento funzionale in risposta al disagio.

Gli ecosistemi acquatici sono il comparto ambientale finale per molti contaminanti introdotti nell’ambiente, specialmente per quelli persistenti, provenienti da diverse attività antropiche. Gli organismi acquatici sono esposti simultaneamente a differenti classi di composti chimici e, la loro fisiologia può esserne affetta anche da basse concentrazioni ambientali che ne determinano un effetto a cascata drammatico sull’intero ciclo vitale delle stesse. Per identificare gli effetti ecotossicologici si devono scegliere delle variabili di studio che sono sensibili a cambiamenti di esposizione e quindi possono registrare informazioni a differenti livelli di organizzazione biologica (ad es.: comunità, specie, alterazioni cellulari, molecolari). Il presente lavoro ha come scopo di studiare biomarker biochimici e bioindicatori su invertebrati acquatici capaci di rispondere all’effetto dei contaminanti e predirne il rischio di tossicità, requisito fondamentale dell’attuale legislazione comunitaria ambientale. Questo lavoro, nell’ambito della Water Frame Directive (WFD), affronta questa tematica con diversi tipi di approccio per implementare un sistema di monitorizzazione efficiente. Lo SPEAR ad esempio è in grado di diagnosticare la contaminazione di ecosistemi acquatici da pesticidi operando a livello di comunità di invertebrati acquatici. Inoltre si sono presi in considerazione anche biomarker a livello cellulare in bivalvi (Tapes philipphinarum and Mya arenaria): attività enzimatiche coinvolti nelle risposte aerobiche (CCO) e antiossidative (SOD and CAT), risposte genotossicologiche come la frequenza dei micronuclei, e, infine, a livello di organismo, risposte di carattere comportamentale.
Aquatic ecosystems are the final sink for most of contaminants introduced in the environment, especially persistent organic pollutants coming from different human activities. Most of the freshwater and coastal organisms are exposed simultaneously to different classes of chemicals, and their physiology may be affected by toxic chemical even at low environmental concentrations with a cascade event on population dynamics. Identifying ecotoxicological effects requires descriptors that are sensitive to changes in exposure and thus can indicate information at different levels of biological organisation (i.e. communities, sub-individual level). The present work aims to investigate biochemical biomarkers and bioindicators in aquatic invertebrates able to detect biological effects and predict risk of toxicity, with a special focus paid to the requirements of current EU regulation. Therefore, the present work faced on different kinds of approach identified to be efficient tools within the context of the WFD requirements (Water Frame Directive, 2000/60/EC), for investigative and operational monitoring. Work include the SPEAR approach as trait based indicator descriptor of freshwater aquatic macroinvertebrates communities, able to diagnose pesticide contamination in aquatic ecosystems. Further diagnostic approaches in environmental status are included, as assay representing biological responses for different enzymes involved in the aerobic (CCO) and antioxidant responses, (SOD, and CAT), behavioural endpoints, and genotoxicity biomarker associated with micronuclei frequency in bivalve species (Tapes philipphinarum and Mya arenaria).

Gli ecosistemi acquatici sono il comparto ambientale finale per molti contaminanti introdotti nell’ambiente, specialmente per quelli persistenti, provenienti da diverse attività antropiche. Gli organismi acquatici sono esposti simultaneamente a differenti classi di composti chimici e, la loro fisiologia può esserne affetta anche da basse concentrazioni ambientali che ne determinano un effetto a cascata drammatico sull’intero ciclo vitale delle stesse. Per identificare gli effetti ecotossicologici si devono scegliere delle variabili di studio che sono sensibili a cambiamenti di esposizione e quindi possono registrare informazioni a differenti livelli di organizzazione biologica (ad es.: comunità, specie, alterazioni cellulari, molecolari). Il presente lavoro ha come scopo di studiare biomarker biochimici e bioindicatori su invertebrati acquatici capaci di rispondere all’effetto dei contaminanti e predirne il rischio di tossicità, requisito fondamentale dell’attuale legislazione comunitaria ambientale. Questo lavoro, nell’ambito della Water Frame Directive (WFD), affronta questa tematica con diversi tipi di approccio per implementare un sistema di monitorizzazione efficiente. Lo SPEAR ad esempio è in grado di diagnosticare la contaminazione di ecosistemi acquatici da pesticidi operando a livello di comunità di invertebrati acquatici. Inoltre si sono presi in considerazione anche biomarker a livello cellulare in bivalvi (Tapes philipphinarum and Mya arenaria): attività enzimatiche coinvolti nelle risposte aerobiche (CCO) e antiossidative (SOD and CAT), risposte genotossicologiche come la frequenza dei micronuclei, e, infine, a livello di organismo, risposte di carattere comportamentale.
Aquatic ecosystems are the final sink for most of contaminants introduced in the environment, especially persistent organic pollutants coming from different human activities. Most of the freshwater and coastal organisms are exposed simultaneously to different classes of chemicals, and their physiology may be affected by toxic chemical even at low environmental concentrations with a cascade event on population dynamics. Identifying ecotoxicological effects requires descriptors that are sensitive to changes in exposure and thus can indicate information at different levels of biological organisation (i.e. communities, sub-individual level). The present work aims to investigate biochemical biomarkers and bioindicators in aquatic invertebrates able to detect biological effects and predict risk of toxicity, with a special focus paid to the requirements of current EU regulation. Therefore, the present work faced on different kinds of approach identified to be efficient tools within the context of the WFD requirements (Water Frame Directive, 2000/60/EC), for investigative and operational monitoring. Work include the SPEAR approach as trait based indicator descriptor of freshwater aquatic macroinvertebrates communities, able to diagnose pesticide contamination in aquatic ecosystems. Further diagnostic approaches in environmental status are included, as assay representing biological responses for different enzymes involved in the aerobic (CCO) and antioxidant responses, (SOD, and CAT), behavioural endpoints, and genotoxicity biomarker associated with micronuclei frequency in bivalve species (Tapes philipphinarum and Mya arenaria).

vgf is an inducible gene implicated in the regulation of energy balance. Its derived gene product, VGF, acts as a multi-functional precursor, where from a modulated diversity of VGF peptides are differentially produced by post-translational processing. In the present context, it is relevant to note that chronic administration of the VGF derived peptide TLQP-21 delayed the onset of overt diabetes in Zucker diabetic fatty rats, and potentiated glucose stimolated insulin secretion from rat and human islets, resulting in improved glucose tolerance in vivo. The extended form TLQP-62 stimulated insulin secretion from insulinoma cell lines. Nonetheless, the precise localizations and in vivo response of several diversely acting VGF-peptides have been scarcely clarified. My aim has been to address the response to glucose of a number of VGF peptides, with a focus on: 3 peptide stretches within the C-terminal domain of the precursor (TLQP-21; NAPP-19 and VGF C-terminus), and the QQET-30 peptide. Thus, I have carried out an immunohistochemical and image-quantification study on the endocrine pancreas and the hypothalamic Suprachiasmatic Nucleus (SCN). In parallel, the same peptides were measured in plasma by ELISA. Specific antibodies for peptides related to the VGF C-terminus, and to the known VGF cleavage products: TLQP-21, NAPP-19, and QQET-30 were used. Antibodies were directed to the relevant N- or C-terminal end of the mentioned cleaved peptides. Affinity purification procedures (sequential and differential steps) were used to optimise antibodies and their applications, as well as to characterise their molecular specificity under non-competitive conditions. Mice (Group1, male, 12 weeks) underwent a period of starvation (18h), hence received (i.p.) a glucose load, or saline, and were sacrificed 30/120 min later. A pilot study (Group2) was perfomed on high-fat diet obese mice, similarly exposed to a glucose load. As expected, the glucose load resulted in a glicemia peak at 30 min, with return toward basal values at 120 min. TLQP-21 like peptides showed a progressive increase in plasma 30 and 120 min after the glucose load, in parallel to a major pancreatic islets degranulation at 30 min, and a reconstitution of their tissue stores at 120 min. Such peptides were not produced in the SCN, at least in their known, N-terminally cleaved form. Conversely, VGF C-terminus, QQET-30 and NAPP-19 related peptides were found to be reduced in plasma at 30 min, and returned toward basal values after 120 min. QQET-30 related peptides were not revealed in pancreatic islets, while showing a negative modulation (reduced immunoreactivity) in SCN 120 min after the glucose load. A similar trend was revealed for NAPP-19 related peptides. As to obese mice (Group2), TLQP-21 related peptides showed a clear cut increase vs. non-obese animals, both under basal and glucose-load conditions, associated with a blunted response to glucose in both pancreatic islets and plasma. In the same mice, NAPP-19 like peptides were somewhat more abundant in pancreatic islets and reduced in plasma, with little response to glucose. On the whole, VGF peptides appeared to show a significant response to the acute administration of glucose, with distinct differential patterns across the peptides studied. Of especial interest were TLQP-peptides, which showed a profile suggestive of prompt release to plasma upon the glucose load (30 min). Such pattern seemed to be maintained in the later phase studied (120 min), probably in connection with the biosynthesis and continuing release to plasma. In the obesity model studied, TLQP peptides were distinctly accumulated in pancreatic islets, in parallel with a absent response to glucose in plasma, suggestive of their deranged release. Taken together with known evidence of insulinotropic action of TLQP-peptides, the above results may be of relevance to the neuroendocrine response to an acute glucose load, hence to the pathophysiology of obesity.

Gli esseri animali sono continuamente sottoposti a stimolazioni provenienti tanto dall’ambiente circostante quanto dall’interno dell’organismo. Non tutti gli stimoli sono di tipo transitorio, ma alcuni di questi possono persistere nel tempo alla stessa intensità che possiedono quando applicati. L’organismo, vista la sua capacità finita di trasmettere e codificare informazioni, ha la necessità di sviluppare un meccanismo di adattamento agli stimoli persistenti. Questo tipo di meccanismo prende il nome di adattamento sensoriale periferico ed ha inizio nel sistema nervoso periferico a livello dei recettori. Nello specifico l’oggetto di interesse di questo elaborato è la risposta all’adattamento sensoriale periferico, cioè come i recettori comunicano al sistema nervoso centrale che lo stimolo persiste. Si è quindi voluto elaborare un modello unitario della risposta di adattamento sensoriale periferico in grado di convergere i risultati ottenuti da esperimenti condotti su differenti specie animali in risposta a stimoli diversi. Questo tipo di processo prende il nome di consilienza, cioè la convergenza di risultati ottenuti da differenti linee di studio o approcci ad un dato quesito. L’elaborato ripercorrerà i passi compiuti da Willy Wong, professore dell’università di Toronto, che ha messo a punto un unico andamento della risposta all’adattamento analizzando gli studi condotti nell’ambito della fisiologia sensoriale negli ultimi cento anni, mostrando elementi comuni che esistono in quasi tutte le modalità sensoriali (propriocezione, tatto, gusto, udito, vista, olfatto, elettroricezione e temperatura) e le specie animali. La conclusione a cui si è giunti è che indipendentemente dal meccanismo o dalla modalità, o dal periodo di tempo in cui è stato condotto lo studio, la coerenza delle prove fornisce un nuovo risultato fondamentale della neurofisiologia.

Gli ambienti limitati dalle basse temperature si stanno scaldando ad un tasso superiore alla media globale con effetti già evidenti benché eterogenei sulla vegetazione. Poiché ad alta quota le specie legnose operano spesso al loro limite fisiologico, comprendere le loro risposte climatiche è cruciale per prevedere scenari futuri o indirizzare misure di gestione forestale. Le piante possono adeguare i tratti morfo-fisiologici entro i limiti della loro plasticità ma, se le prestazioni richieste dalle condizioni esterne superano questi limiti, possono indebolirsi o morire. Pertanto, la presente tesi mira a quantificare la variabilità spaziale e temporale delle risposte climatiche delle conifere (i taxa dominanti della fascia di alta quota nell'Europa meridionale), sia erette che prostrate, che crescono al limite della distribuzione della specie, attraverso un approccio dendroanatomico e ecofisiologico. Juniperus communis è un arbusto tipico dell’ambiente alpino in quota, oltre a essere la conifera con la più ampia distribuzione nell'emisfero settentrionale. E’ altamente resistente alla siccità e con prestazioni idrauliche stabili, indipendenti da differenze genetiche o ambientali. Tuttavia, nonostante sembri in grado di ben tollerare future condizioni più xeriche, le popolazioni al limite più settentrionale potrebbero essere le prime ad essere idraulicamente compromesse. Inoltre, J. communis sembra beneficiare dello scioglimento nivale anticipato in termini di crescita, anche se, in caso di copertura prolungata, pare compensi la stagione vegetativa più breve con aggiustamenti fisiologici volti a massimizzare la crescita. Eppure, tali effetti si riducono negli anni grazie alla velocità di acclimatazione della specie, evidenziando l'importanza di considerare la dimensione temporale nelle previsioni sulle dinamiche vegetazionali della tundra. Bassa variabilità intraspecifica è emersa anche analizzando la sensitività climatica dei tratti anatomici in popolazioni di Pinus cembra tra Alpi e Carpazi, nonostante le differenze ambientali. In generale, condizioni fresche e umide inducono cellule più larghe con pareti sottili, al contrario, con condizioni più miti e asciutte, che si prevede possano verificarsi in futuro, la tendenza è inversa. Infine, temperature più elevate sembrano promuovere la crescita radiale. Le associazioni tra condizioni climatiche e tratti xilematici non sembrano però stabili: dagli anni 80 questa specie è sempre meno limitata, specie nei Carpazi, sia dalla temperatura che dalle precipitazioni. Tuttavia, nonostante il potenziale beneficio del riscaldamento, P. cembra potrebbe venire confinato ancor più in aree disgiunte di alta quota da altre specie più competitive che stanno avanzando in altitudine. Inoltre, per l’ecologia degli alberi al limite superiore del bosco sono cruciali anche le condizioni invernali. Infatti, le conifere al limite della foresta soffrono comunemente di una drastica perdita di conduttività idraulica, principalmente a causa di embolie da gelo. Si è visto però che molte specie recuperano tali danni a fine inverno, quando suolo e porzioni di xilema sono ancora gelati. Si è dimostrato che Larix decidua e Picea abies riescono ad assorbire acqua attraverso i rami, probabilmente derivata dallo scioglimento nivale in chioma, per poi redistribuirla all'interno della chioma stessa. In questo caso, il cambiamento climatico potrebbe avere un duplice effetto: positivo, favorendo il recupero idraulico per via dell’innalzamento termico, ma anche negativo diminuendo la quantità di neve sui rami. Questi risultati contribuiscono a capire come le conifere affrontino condizioni di crescita estreme in aree termicamente limitate e di quale sia la variabilità spazio-temporale delle loro risposte climatiche, supportando previsioni future sui dinamismi delle comunità vegetali di alta quota e decisioni gestionali volte a preservare questi sistemi così vulnerabili.
Heat-limited environments are facing significant climatic changes since they are warming at higher rate than the global average. This has already evident but heterogeneous effects on vegetation communities. At high-elevation long-lived woody species often operate at their physiological limit, and for this reason a deep understanding of their climate responses to changing conditions is of key importance when predicting future scenarios or taking forest management decisions. In fact, plants may adjust their traits spanning within the range of their plasticity and, when required performance to cope with external conditions exceed this threshold, plant is likely to lose fitness or die. In this context, this thesis aims to give new insight on spatial and temporal variability of the climatic responses of conifers, the dominant taxa of all the high-elevation belt of southern Europe, with both erect and prostrate growth form, growing at the limit of their distribution. To this end I applied both dendroanatomical and physiological approaches. Juniperus communis is a typical shrub species at high elevation on Alps and is the conifer with the widest distribution range in the Northern Hemisphere. It was found to have a strong drought-resistant and conservative hydraulic performance independently from phenotypical and genotypical differences or from environmental setting. However, despite this species is likely to well cope to future more xeric conditions, populations at the northernmost limit might be the first to be hydraulically impaired. In addition, common juniper seemed to benefit from anticipated snowpack melt in term of growth, though, in case of prolonged snow-cover, it seems able to offset shorter vegetative season through physiological adjustments likely aimed to maximize growth rate. Nonetheless, considering the remarkable acclimation speed, the effects of changed snow-melt timing weaken over years and highlighted the importance of considering temporal variability when making future predictions on tundra vegetation. A low intra-specific variability emerged also looking at the climate sensitivity of Pinus cembra’s anatomical traits in the Alps and Carpathians, despite distance and environmental differences of these two regions. In general, cool and wet conditions induce larger cells with thin cell wall and, on the opposite, warm and dry conditions, that are predicted to occur in the next future, tent to produce smaller and thicker walled cells. Lastly, high temperature seems to enhance radial growth. All these associations seemed not absolutely stable and from the 80s this species is less and less limited by both temperature and precipitation, especially in the Carpathians. Yet, despite the potential benefit of warming, Pinus cembra might be further restrained to high-elevation patches due to its low competitive advantage with other species that are advancing upward. For tree life at the upper forest limit not just the growing season conditions are crucial, but also winter ones. In fact, conifers at treeline commonly suffer of drastic loss of conductivity, mainly due to frost-drought induced embolisms, but they recover in late winter when soil and xylem portions are still frozen. Larix decidua and Picea abies are demonstrated to absorb water, likely from melting snow, through branches and redistribute it within the crown. In this case climate change may have twofold effects since it is likely to favour hydraulic recovery but also to reduce embolism recovery decreasing snow amount on branches. These results contributed to understand how conifers deal with extreme growing conditions in heat-limited areas and which is the spatial and temporal variability of their climatic responses, likely supporting future predictions and management decisions on such vulnerable systems.

L’elevata presenza dei residui dei farmaci nell’ambiente acquatico desta preoccupazione per la salute della fauna acquatica e per un eventuale rischio per l’uomo. Dopo l’assunzione, i farmaci vengono escreti come tali o come metaboliti attivi, risultando spesso resistenti ai processi di trattamento delle acque. Per questo motivo alcuni di essi sono pseudo-persistenti raggiungendo concentrazioni di ng-µg/L. I farmaci sono molecole disegnate per essere biologicamente attive a basse concentrazioni su bersagli specifici, per questo motivo possono indurre effetti anche su specie non target con bersagli molecolari simili all’uomo a concentrazioni ambientali. A tal proposito il presente lavoro intende investigare gli effetti della caffeina, ampiamente usata come costituente di bevande e come farmaco, presente nelle acque superficiali a concentrazioni di ng-µg/L. Come organismo di studio è stato scelto il Mytilus galloprovincialis, sfruttando le conoscenze disponibili in letteratura circa le sue risposte ai contaminanti ambientali. I mitili sono stati esposti in acquario a caffeina (5, 50 e 500 ng/L) per 7 giorni e poi analizzati attraverso una batteria di otto biomarker, alterazioni fisiologiche o biochimiche che forniscono informazioni circa lo stato di salute degli animali. I metodi utilizzati sono stati diversi a seconda dei biomarker (analisi citochimiche e saggi enzimatici). Le concentrazioni sono state scelte nel range ambientale. L’esposizione ha prodotto alterazioni della stabilità della membrana lisosomiale negli emociti e l’instaurarsi di processi di detossificazione nella ghiandola digestiva, evidenziati dall’aumento dell’attività della glutatione S-transferasi. Gli altri biomarker non mettono in evidenza che la caffeina, in queste condizioni sperimentali, possa indurre alterazioni della funzionalità lisosomiale, effetti ossidativi o neurotossici. I dati ottenuti sui mitili, quindi, suggeriscono che la caffeina, anche nel range di concentrazioni ambientali più elevato, possa essere considerata un contaminante che desta bassa preoccupazione.

The purpose of this thesis was to study the stress response of muscle cells using in vivo and in vitro experimental procedures. Animal models which replicate cytoprotective (mild exercise training) or pathologic (muscle disuse atrophy) conditions were used to analyze the extent of the stress response and the cellular distribution of stress proteins in muscle tissues. Here we show that mild exercise training (up to 30m/min treadmill run for 1h/day) significantly increased Hsp70 expression in cardiac and skeletal muscles. Studies on the cellular distribution of this protein showed that the percentage of Hsp70-positive myofibers increased about 3-fold in trained fast muscles of the posterior rat hindlimb, compared to the sedentary ones (P<0.001), and involved a larger subset of both type 2A and intermediate type 2A/2X-myofibers (P<0.001), and vascular smooth muscle cells. Therefore, chronic induction of Hsp70 expression in rat skeletal muscles is not obligatory related to the slow fiber phenotype, but reveals the occurrence of a stress-response (Tarricone et al. 2008). In addition, training significantly increased protein levels of HO-1 in the myocardium, which contributed to the reduced infarct size occurring after ischemia-reperfusion (Marini et al. 2007). Muscle disuse atrophy is characterized by increased ROS production. Experimental muscle disuse atrophy was achieved in the rat soleus muscles by means of hindlimb unloading by tail-suspension for 4 to 21 days. Our results showed significant and transient upregulation of heme oxygenase-1 at 7 days of unloading, whereas the relative amounts of the Glucose- regulated proteins Grp94 and Grp78 decreased significantly after 14 days of unloading to about 50% and 75%, respectively, of the protein levels of the non-suspended age- and sexmatched controls. In addition, protein oxidation was significantly increased in unloaded atrophic muscles. It is therefore possible that the reduced levels of the ER chaperones which bind calcium, such as Grp94 or Grp78, might adversley affect calcium homeostasis and potentially enhance oxidative stress of disused myofibers and favour progression of muscle atrophy. In vitro studies were then performed in order to analyze more precisely the contribution of Grp94 protein levels to cytoprotection of muscle cells againstapoptosis and oxidative damage, and mechanistichally to the control of calcium homeostasis. Grp94 overexpression was achieved by means of both stable and transient transfer of Grp94 cDNA into the myogenic cell line C2C12. The effects of pharmacological treatments, which selectively increased Grp94 cellular levels, were also explored. Results show that Grp94 overexpression obtained by gene transfer, protected myogenic C2C12 cells against apoptosis induced by exposure to 1µM staurosporin. Caspase-3 activation was reduced by 40-80% compared to control clones (p<0.05). Additional experiments showed that the percentage of apoptotic death, revealed by TUNEL assay, in C2C12 cells transiently transfected with grp94 cDNA was reduced by 50%, compared to empty vector-transfected cells. Furthermore, Grp94 overexpression reduced the degree of protein oxidation induced by exposure to hydrogen peroxide. A comparable effect was obtained when cells were transiently exposed, 24 hour in advance, to curcumin, an antioxidant which is also a SERCA inhibitor. Through its latter property, curcumin was effective in inducing a mild ER response, which apparently upregulated Grp94, in a selective manner, without changing protein levels of other ER chaperones, such as Grp78, calreticulin and HO-1. Subsequent exposure of curcumin- pretreated cells to hydrogen peroxide indeed showed reduced degree of protein oxidation. In order to identify the molecular mechanism through which Grp94 exerts antiapoptotic and anti-oxidant cytoprotection, we investigated changes in calcium homeostasis occurring in Grp94 overexpressing cells. By means of the fluorescent Ca2+ probe fura-2, Grp94- overexpressing clones showed a reduction ranging from 40 to 80% in ciclopiazonic acid-released Ca2+ compared to control clones. Transient co-transfection of C2C12 with both Grp94 and the cDNA coding for the recombinant luminescent Ca2+ sensor aequorin specifically targeted to the ER showed a slight (20%), but significant, decrease in [Ca2+]er (p<0.01), compared to control, void vector-transfected cells. However, when transient co-transfections were performed in HeLa or HEK-293 cells, no significant difference in [Ca2+]er was observed between Grp94 overexpressing and control cells, suggesting that Grp94 overexpression did not directly affect ER Ca2+ load. Experiments of immunoprecipitation from wild type C2C12 cells, processed with chemical cross-linking before lysis, showed that SERCA2 co-immunoprecipitated with Grp94. The Grp94-SERCA2 co-immunoprecipitation was clearly evident in C2C12 cells, whereas it was barely detectable in HeLa and HEK-293 cells, despite the higher relative amount of both Grp94 and SERCA2 in these two latter cell lines. The possibility that Grp94 overexpression affected [Ca2+]er by interaction with SERCA2 was further suggested by the analysis of the ER calcium refilling traces: the SERCA2 activity showed a significant decrease (20%) (p<0.01) in Grp94 overexpressing C2C12 cells compared to controls, while no differences were found in HeLa and HEK293. The possibility that Grp94 overexpression exerts a cytoprotective role by reducing [Ca2+]er load of myogenic cells through a specific inhibitory interaction with SERCA2 is supposed.

La forte crescita nella pescicoltura ha portato ad una significativa pressione ambientale di origine antropica nei sistemi costieri. Il bivalve locale Scrobicularia plana è stato usato come bioindicatore per valutare la qualità ambientale di un ecosistema affetto da scarichi di acque residuali di una piscifattoria nel braccio di mare Rio San Pedro (Spagna sud-occidentale). I bivalvi sono stati raccolti nei sedimenti intertidali nell'ottobre del 2010 da cinque siti del braccio di mare, seguendo un gradiente di inquinamento decrescente dall'effluente al sito di controllo. Per valutare l'esposizione e l'effetto di contaminanti legati alle acque residuali delle piscifattorie è stata selezionata una batteria di biomarker. Sono state misurate nei tessuti delle ghiandole digestive dei bivalvi: l'attività di enzimi del sistema di detossificazione della Fase I (etossiresorufina-O-deetilasi, EROD e dibenzilfluoresceina, DBF) l'attività di un enzima del sistema di detossificazione di Fase II (glutatione S-transferasi, GST), l'attività di enzimi antiossidanti (glutatione perossidasi, GPX e glutatione reduttasi, GR) e parametri di stress ossidativo (perossidazione lipidica, LPO, e danno al DNA). In parallelo sono state misurate in situ, nelle aree di studio, temperatura, pH, salinità e ossigeno disciolto nelle acque superficiali; nelle acque interstiziali sono stati misurati gli stessi parametri con l'aggiunta del potenziale redox. Sono state trovate differenze significative (p<0,05) tra siti di impatto e sito di controllo per quanto riguarda l'attività di EROD e GR, LPO e danno al DNA; è stato osservato un chiaro gradiente di stress riconducibile alla contaminazione, con alte attività di questi biomarker nell'area di scarico delle acque residuali della pescicoltura e livelli più bassi nel sito di controllo. È stata trovata inoltre una correlazione negativa significativa (p<0,01) tra la distanza alla fonte di inquinamento e l’induzione dei biomarker. Sono state analizzate le componenti abiotiche, inserendole inoltre in una mappa georeferenziata a supporto. Ossigeno disciolto, pH, salinità e potenziale redox mostrano valori bassi vicino alla fonte di inquinamento, aumentando man mano che ci si allontana da esso. I dati ottenuti indicano nel loro insieme che lo scarico di acque residuali dalle attività di pescicoltura nel braccio di mare del Rio San Pedro può indurre stress ossidativo negli organismi esposti che può portare ad un'alterazione dello stato di salute degli organismi.

The muscle metaboreflex activation has been shown essential to reach normal hemodynamic response during exercise. It has been demonstrated in numerous studies that patients with multiple sclerosis (MS) have impaired autonomic functions and cardiovascular regulation during exercise. However, to the best of our knowledge, no previous research to date has studied the metaboreflex in MS patients. The purpose of this study was to investigate the hemodynamic response to metaboreflex activation in patients with MS (n= 43) compared to an age-matched, control group (CTL, n= 21). Cardiovascular response during the metaboreflex activation was evaluated using the post-exercise muscle ischemia (PEMI) method and during a control exercise recovery (CER) test. The difference in hemodynamic parameters between the PEMI and the CER test was calculated and this procedure allowed for the assessment of the metaboreflex response. Hemodynamics was estimated by impedance cardiography. The MS group showed a normal mean blood pressure (MBP) response as compared to the CTL group (+6.5±6.9 vs. +8±6.8 mmHg respectively), but this response was achieved with an increase in systemic vascular resistance (SVR), that was higher in the MS with respect to the CTL group (+137.6±300.5 vs. -14.3±240 dyne·s-1·cm-5 respectively). This was the main consequence of the MS group’s incapacity to raise the stroke volume (-0.65±10.6 vs. +6.2±12.8 ml respectively). It was concluded that MS patients have an impaired capacity to increase stroke volume (SV) in response to metaboreflex activation, even if they could sustain the MBP response by vasoconstriction. This was probably a consequence of their chronic physical de-conditioning.

Il progetto di ricerca indaga la regolazione emotiva analizzando le interazioni complesse tra strategie di regolazione dell'individuo e variabili proprie dello stimolo elicitante. A tale scopo, il progetto si struttura in tre studi. Nello Studio 1, una batteria di questionari per la valutazione di strategie stabili di regolazione e coping è stata somministrata ad un campione di 198 studenti infermieri che partecipavano allo Studio 3 e ad un gruppo di controllo di 416 studenti universitari. Lo studio presenta inoltre una validazione preliminare dell'Emotion Regulation Questionnaire in lingua italiana. Lo Studio 2 riguarda la misurazione dell'impatto emotivo di stimoli elicitanti: una batteria di filmati emotivi è stata costruita attraverso la manipolazione di due dimensioni di appraisal emotivo e somministrata a 420 studenti universitari a cui era chiesto di valutare la propria esperienza emotiva. Infine, nello Studio 3, uno stesso filmato di chirurgia ma incorporato all'interno di contesti diversi (costituiti dai filmati testati nello studio 2) è stato sottoposto a 163 studenti infermieri allo scopo di analizzare gli effetti a breve termine di due strategie di rivalutazione cognitiva quando l'individuo affronta un evento ad alto impatto emotivo contestualizzato. Ai partecipanti era chiesto di osservare gli eventi cercando di immedesimarsi o di distanziarsi. Lo studio analizza le risposte emotive in tre sistemi di risposta emotiva: fisiologico, comportamentale ed esperienziale.
The present research program investigated emotion regulation analyzing the complex interaction between variables concerning individual regulatory strategies and variables concerning the eliciting stimulus. To this purpose, the research program was structured into three studies. In Study 1, a set of questionnaires assessing individual stable emotion regulation and coping strategies was administered to a sample of 198 nursing students who participated to Study 3 and to a control sample of 416 undergraduate students. A preliminary Italian validation of the Emotion Regulation Questionnaire (ERQ) was conducted. Study 2 aimed at measuring the emotional impact of eliciting stimuli: a set of emotion-generating films were constructed according to the manipulation of appraisal criteria and administered to 420 undergraduate students who were asked to rate their emotional experience. In Study 3, 163 nursing students watched the same surgery clip included within different contextual scenarios provided by the film stimuli tested in Study 2. The main goal was the investigation of the short-terms outcomes of two types of reappraisal when the individual is confronted with a contextualized high-impact emotional event: to this purpose, participants were asked to adopt a detached vs. immersed point of view. Three systems of emotional response were analyzed as indicated by emotion literature: behavioural, physiological and experiential.

Il progetto di ricerca indaga la regolazione emotiva analizzando le interazioni complesse tra strategie di regolazione dell'individuo e variabili proprie dello stimolo elicitante. A tale scopo, il progetto si struttura in tre studi. Nello Studio 1, una batteria di questionari per la valutazione di strategie stabili di regolazione e coping è stata somministrata ad un campione di 198 studenti infermieri che partecipavano allo Studio 3 e ad un gruppo di controllo di 416 studenti universitari. Lo studio presenta inoltre una validazione preliminare dell'Emotion Regulation Questionnaire in lingua italiana. Lo Studio 2 riguarda la misurazione dell'impatto emotivo di stimoli elicitanti: una batteria di filmati emotivi è stata costruita attraverso la manipolazione di due dimensioni di appraisal emotivo e somministrata a 420 studenti universitari a cui era chiesto di valutare la propria esperienza emotiva. Infine, nello Studio 3, uno stesso filmato di chirurgia ma incorporato all'interno di contesti diversi (costituiti dai filmati testati nello studio 2) è stato sottoposto a 163 studenti infermieri allo scopo di analizzare gli effetti a breve termine di due strategie di rivalutazione cognitiva quando l'individuo affronta un evento ad alto impatto emotivo contestualizzato. Ai partecipanti era chiesto di osservare gli eventi cercando di immedesimarsi o di distanziarsi. Lo studio analizza le risposte emotive in tre sistemi di risposta emotiva: fisiologico, comportamentale ed esperienziale.
The present research program investigated emotion regulation analyzing the complex interaction between variables concerning individual regulatory strategies and variables concerning the eliciting stimulus. To this purpose, the research program was structured into three studies. In Study 1, a set of questionnaires assessing individual stable emotion regulation and coping strategies was administered to a sample of 198 nursing students who participated to Study 3 and to a control sample of 416 undergraduate students. A preliminary Italian validation of the Emotion Regulation Questionnaire (ERQ) was conducted. Study 2 aimed at measuring the emotional impact of eliciting stimuli: a set of emotion-generating films were constructed according to the manipulation of appraisal criteria and administered to 420 undergraduate students who were asked to rate their emotional experience. In Study 3, 163 nursing students watched the same surgery clip included within different contextual scenarios provided by the film stimuli tested in Study 2. The main goal was the investigation of the short-terms outcomes of two types of reappraisal when the individual is confronted with a contextualized high-impact emotional event: to this purpose, participants were asked to adopt a detached vs. immersed point of view. Three systems of emotional response were analyzed as indicated by emotion literature: behavioural, physiological and experiential.

Il lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio dell’arousal come indice psicofisiologico di attivazione e sull’applicazione della metodica di stimolazione elettrica transcranica (tES) non invasiva con lo scopo di modulare tale indice. L’obiettivo è stato quello di indagare se, applicando la tES, fosse possibile migliorare la performance di soggetti giovani sani in compiti di tipo cognitivo. Il progetto di ricerca si è sviluppato in 2 studi principali per un totale di 4 esperimenti. Tali studi hanno previsto l’acquisizione e la successiva analisi sia di dati comportamentali (tempi di reazione, accuratezza), che di indici psicofisiologici (conduttanza cutanea, diametro pupillare). I risultati hanno evidenziato che è possibile modulare l’arousal con dei “bursts” di stimolazione elettrica transcranica, somministrati in concomitanza di stimoli salienti per il soggetto. Tale modulazione si è manifestata con una riduzione dei tempi di reazione ed un contemporaneo aumento della risposta di conduttanza cutanea. Questi dati supportano la possibilità di utilizzare questo protocollo in pazienti con difficoltà di attenzione o altri problemi cognitivi per aumentare l’efficacia di interventi di riabilitazione.
The thesis analyzed the role of the arousal as a psychophysiological index of activation, and the application of non-invasive transcranial electrical stimulation (tES) technique with the aim to modulate this index. In this work we investigated if the application of tES could increase the performance of healthy young subjects during cognitive tasks. The thesis is based on 2 main studies for a total of 4 experiments with the recording of behavioural (reaction times, accuracy) and psychophysiological (skin conductance, pupil diameter) indeces. The results showed that it is possible to modulate arousal with bursts of tES, administered during the presentation of salient stimuli for the subject. This modulation resulted in a reduction of reaction times and an increase of the skin conductance response. These data support the possibility to use this protocol of stimulation with patients with attentional and other cognitive deficits in a rehabilitative context.

Il lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio dell’arousal come indice psicofisiologico di attivazione e sull’applicazione della metodica di stimolazione elettrica transcranica (tES) non invasiva con lo scopo di modulare tale indice. L’obiettivo è stato quello di indagare se, applicando la tES, fosse possibile migliorare la performance di soggetti giovani sani in compiti di tipo cognitivo. Il progetto di ricerca si è sviluppato in 2 studi principali per un totale di 4 esperimenti. Tali studi hanno previsto l’acquisizione e la successiva analisi sia di dati comportamentali (tempi di reazione, accuratezza), che di indici psicofisiologici (conduttanza cutanea, diametro pupillare). I risultati hanno evidenziato che è possibile modulare l’arousal con dei “bursts” di stimolazione elettrica transcranica, somministrati in concomitanza di stimoli salienti per il soggetto. Tale modulazione si è manifestata con una riduzione dei tempi di reazione ed un contemporaneo aumento della risposta di conduttanza cutanea. Questi dati supportano la possibilità di utilizzare questo protocollo in pazienti con difficoltà di attenzione o altri problemi cognitivi per aumentare l’efficacia di interventi di riabilitazione.
The thesis analyzed the role of the arousal as a psychophysiological index of activation, and the application of non-invasive transcranial electrical stimulation (tES) technique with the aim to modulate this index. In this work we investigated if the application of tES could increase the performance of healthy young subjects during cognitive tasks. The thesis is based on 2 main studies for a total of 4 experiments with the recording of behavioural (reaction times, accuracy) and psychophysiological (skin conductance, pupil diameter) indeces. The results showed that it is possible to modulate arousal with bursts of tES, administered during the presentation of salient stimuli for the subject. This modulation resulted in a reduction of reaction times and an increase of the skin conductance response. These data support the possibility to use this protocol of stimulation with patients with attentional and other cognitive deficits in a rehabilitative context.

Il sistema immunitario è costituito da una varietà di cellule, molecole e processi biologici che interagiscono per prevenire le invasioni microbiche, riconoscere le molecole estranee ed eliminare le fonti esistenti di lesioni cellulari, ripristinando le normali funzioni tissutali una volta risolto il problema. L'immunità innata è la prima linea di difesa contro le invasioni di agenti patogeni. Nelle vacche da latte, il suo funzionamento subisce gravi alterazioni durante il periodo di transizione (TP). In questa fase è stata segnalata una compromissione delle funzioni delle cellule polimorfonucleate (PMN) correlate alla produzione di metaboliti reattivi dell'ossigeno (ROM), all’attività della mieloperossidasi (MPO), alla chemiotassi e alla fagocitosi. I PMN bovini hanno un alterata espressione dei geni codificanti per tali funzioni tra -1 e 2 settimane dal parto, rispetto al livello rilevato 4 settimane dopo il parto per gli stessi geni. La causa esatta delle disfunzioni immunitarie che si verificano nel periparto non è mai stata chiaramente identificata. In esse possono contribuire diversi fattori, principalmente imputati alle alterazioni metaboliche tipiche del periparto (cambiamenti nell’assetto ormonale, limitazione della risposta immunitaria materna al fine di mantenere la gravidanza, alterazioni nel bilancio energetico e stato di stress ossidativo). Tuttavia, la durata e l’entità delle disfunzioni immunitarie può aumentare qualora subentri uno stato di squilibrio fisiologico (PI). In tali condizioni, le alterazioni metaboliche del periparto sfuggono al controllo dei meccanismi omeostatici e omeoretici, ed una infiammazione sistemica è la conseguenza frequente di questo squilibrio. Lo stato infiammatorio sistemico è scatenato da un aumento dei livelli di citochine proinfiammatorie (PIC), che è collegato ad un aumento della temperatura corporea al parto, e che tipicamente inficia le funzionalità epatiche, modificando le priorità anaboliche dell'organo in fase di inizio lattazione. A seguito di tale slittamento, il fegato produce più α-globuline, note come proteine positive di fase acuta (+APP), cioè aptoglobina, ceruloplasmina e siero amiloide alfa (SAA). Al contrario, riduce la sintesi di albumina, retinol binding protein (RBP), paraoxonasi (PON) e lipoproteine, note come proteine negative di fase acuta (-APP), e sequestra minerali, quali zinco e ferro, dal flusso ematico. L'infiammazione porta all'attivazione dei PMN, mentre la ridotta competenza immunitaria comunemente riportata in TP è stata associata ad un effetto opposto sui leucociti. Pertanto, questi dovrebbero essere considerati come due fenomeni distinti, ma lo stato di PI potrebbe essere considerato un denominatore comune, direttamente correlato al rischio di patologie in avvio di lattazione. Le strategie nutrizionali per ottimizzare l'immunità delle vacche da latte durante il TP dovrebbero quindi essere focalizzate sulla riduzione del grado di PI correlato al parto. Tra tali strategie nutrizionali, dovrebbe essere presa in considerazione la corretta gestione delle fonti energetiche per adattarle alle variazioni dei fabbisogni. Inoltre, il profilo degli acidi grassi delle fonti lipidiche può contribuire nel modificare le funzioni immunitarie. Infine, la somministrazione di prodotti supplementari con attività antiossidanti o antinfiammatorie, così come di specie donatrici di gruppi metilici, potrebbero essere strategie utili a favorire la funzionalità immunitaria delle bovine durante il TP. In una prospettiva più ampia, sebbene strategie nutrizionali e supplementi possano talora mitigare le alterazioni immunitarie, possiamo concludere che l'adozione di pratiche volte a minimizzare il PI durante il periodo di transizione sia la strategia più efficace per prevenire le disfunzioni. Al fine di chiarire il legame tra le alterazioni che si verificano nel periparto e le disfunzioni immunitarie delle bovine da latte sono stati condotti tre esperimenti. Bovine di razza frisona sono state alloggiate in poste individuali a stabulazione fissa e monitorate regolarmente per le condizioni corporee (BCS), il peso (BW), l'assunzione di alimenti (DMI), la produzione di latte (MY) e il tempo di ruminazione. Campioni di sangue sono stati raccolti regolarmente per valutare un ampio profilo ematochimico e per testare le funzioni dei globuli bianchi mediante stimolazioni ex-vivo. Inoltre, la diapedesi dei PMN è stata testata in vivo mediante test della carragenina e sono stati raccolti campioni di rumine a 30 giorni dal parto (DFC). Il primo esperimento era volto a chiarire le cause dei cambiamenti metabolici che si verificano al momento della messa in asciutta, ed il contributo del livello produttivo in tali alterazioni. Infatti, i profondi cambiamenti nell’alimentazione, gli adattamenti gastrointestinali, del metabolismo e dei parametri immunitari che si verificano nelle bovine alla messa in asciutta sono note scatenare il rilascio di cortisolo, indurre segnali di infiammazione sistemica ed alterare il bilancio redox. Produzioni di latte elevate al momento della messa in asciutta hanno un ruolo nell'aggravare tali condizioni. Nel nostro studio, un gruppo di 13 bovine è stato asciugato a 55 giorni dalla data prevista per il parto. Gli animali sono stati divisi in due gruppi in base alla produzione media dell'ultima settimana di lattazione, assumendo un cut-off di 15 kg * d-1: bassa (LM; 6 animali) e alta produzione (HM; 7 animali). I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo il livello produttivo al termine della lattazione, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. L'aumento delle quantità di fibra nella razione di asciutta ha ridotto la DMI e aumentato il tempo di ruminazione. La migrazione dei leucociti nella ghiandola mammaria per contribuire alla fase di involuzione ha ridotto la loro abbondanza nel sangue e aumentato la loro attività. Tale attivazione dei leucociti nella mammella ha aumentato l'abbondanza di specie reattive dell’azoto nel plasma e innescato un'infiammazione sistemica in tutti gli animali (aumento delle +APP e riduzione delle -APP). Tale infiammazione ha compromesso le funzioni epatiche (aumento delle concentrazioni di gamma-glutamil transferasi -GGT- bilirubina e fosfatasi alcalina -ALP-). Sia la produzione di specie dell’azoto che lo stato infiammatorio sistemico hanno contribuito all'esaurimento degli antiossidanti circolanti (gruppi tiolici -SHp-, tocoferolo, β-carotene, potere antiossidante ferrico riducente -FRAP- e capacità antiossidante contro specie reattive dell'ossigeno -ORAC-). Gli animali con una produzione più elevata alla messa in asciutta hanno mostrato la peggiore condizione, probabilmente per i più profondi cambiamenti metabolici che hanno affrontato dopo l'interruzione delle mungiture, e per la fase involutiva verosimilmente più dispendiosa. Questo studio evidenzia la messa in asciutta come una fase critica per gestire la salute delle vacche da latte, e suggerisce un potenziale legame della messa in asciutta con le alterazioni delle funzioni immunitarie che si verificano nel periparto. Nel secondo esperimento si sono cercati di identificare i cambiamenti del sistema immunitario che precedono l'insorgenza della chetosi, al fine di chiarire il loro ruolo nella comparsa della malattia. Pertanto, 13 bovine sono state monitorate tra -48 e 35 DFC e suddivise in due gruppi sulla base dei loro livelli plasmatici di beta idrossibutirrato (BHB): inferiore (CTR, 7 animali) o superiore a 1,4 mMol / L (KET; 6 animali). I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo lo stato di salute, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. Le vacche KET hanno avuto una maggiore attivazione del sistema immunitario prima del parto (maggiori concentrazioni plasmatiche di PIC, MPO e specie ossidanti e maggiori produzione di interferone gamma in risposta alla stimolazione con Mycobacterium avium) alterazioni della funzionalità epatica (più alta concentrazione sanguigna di GGT) e minori minerali plasmatici. Elevati livelli plasmatici di NEFA, BHB e glucosio nelle vacche KET suggeriscono uno stato di insulinoresistenza e una marcata mobilizzazione del grasso corporeo durante il periodo di asciutta. Tali andamenti dei parametri relativi al metabolismo energetico durante l’asciutta sono stati associati alla riduzione della DMI al momento del parto e al peggioramento del bilancio energetico negativo ad avvio lattazione. Ciò ha causato a sua volta una riduzione di MY e accresciuto ulteriormente la mobilizzazione dei grassi in avvio di lattazione. Compromissione della funzionalità epatica e attivazione dei leucociti durante il periodo di asciutta hanno determinato una marcata risposta infiammatoria di fase acuta nelle vacche KET dopo il parto (maggiori concentrazioni di +APP minori concentrazioni di RBP), ed ulteriormente compromesso la funzionalità epatica (maggiori concentrazioni di glutammato-ossalacetato transaminasi -AST-GOT- e bilirubina). I leucociti delle vacche KET hanno mostrato ridotte funzioni infiammatorie dopo stimolazione ex-vivo con lipopolisaccaridi batterici (minore produzione di PIC e maggiore produzione di lattato). Queste alterazioni potrebbero essere guidate dall'azione combinata dei metaboliti legati alla mobilizzazione dei lipidi e delle azioni antinfiammatorie volte a prevenire un'infiammazione eccessiva. Ciò suggerisce che le alterazioni dei parametri immunitari osservate prima del parto siano altamente correlate con la probabilità di sviluppare chetosi in avvio di lattazione. Nel terzo esperimento è stato somministrato un prodotto immunostimolante dalla comprovata efficacia nel migliorare le funzioni leucocitarie degli animali immunodepressi e nel ridurre l'incidenza delle malattie infettive delle bovine ad inizio lattazione. La sua modalità di azione non è mai stata chiarita, e un’indagine approfondita sul suo effetto metabolico potrebbe evidenziarne l’efficacia anche nei confronti dei disordini metabolici del periodo di transizione. Pertanto, un gruppo di10 bovine è stato monitorato da -62 a 42 DFC. Il gruppo trattato (TRT, 5 animali) ha ricevuto 32,5 g di Omnigen-AF® (Phibro Animal Health Corporation) due volte al giorno (65 g d-1), mentre il gruppo di controllo (CTR, 5 animali) non ha ricevuto alcun supplemento. I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo il trattamento, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. La somministrazione dell’immunostimolante alla messa in asciutta non ha influenzato BW, BCS, MY, composizione del latte e del fluido ruminale e nemmeno modificato la concentrazione di neutrofili del sangue. Tuttavia, ha aumentato il tempo di ruminazione e migliorato il metabolismo energetico dopo il parto (concentrazioni di NEFA e BHB inferiori). Le bovine TRT avevano maggiori concentrazioni ematiche di linfociti e i loro leucociti avevano una maggiore efficienza nel rispondere alla stimolazione con lipopolisaccaridi batterici (produzione di lattato inferiore e minore consumo di glucosio). Nonostante questi effetti positivi sulle cellule immunitarie, l'immunostimolante non ha influenzato le concentrazioni di +APP dopo il parto. Inoltre, l’immunostimolante ha ridotto le concentrazioni di albumina, PON e antiossidanti dopo il parto, suggerendo la compromissione di alcune funzioni epatiche negli animali trattati. Tuttavia, la mancanza di qualsiasi effetto sui biomarcatori di funzionalità (bilirubina) e danno epatico (GGT, AST-GOT, ALP) smentisce una reale compromissione delle attività epatiche a seguito del trattamento. Gli effetti positivi nel favorire il recupero delle funzioni del rumine, riducendo la mobilizzazione dei grassi corporei dopo il parto, suggeriscono che l'immunostimolante sia una strategia efficace nella prevenzione dei disturbi metabolici del periodo di transizione.
Immune system is made of a variety of cells, molecules and biological processes that interacts to prevent microbial invasions, recognize foreign molecules and eliminate existing sources of cellular injuries to restore tissues to their normal functions once problem has been solved. Innate immunity is the primary defense line against pathogens invasions. Its functioning typically undergoes severe alterations during transition period (TP) of dairy cows. An impairment of polymorphonuclear cells (PMN) functions related to reactive oxygen metabolites (ROM) production, myeloperoxidase (MPO) activity, chemotaxis and phagocytosis has been reported in this phase. Bovine PMN have an altered abundance in mRNA transcripts encoding for such functions between -1 and 2 weeks from calving, in comparison to the level found at 4 weeks after calving for the same genes. The exact cause of immune dysfunctions occurring in peripartum has never been clearly identified. Reduced immune competence could arise from the interaction of different factors affected from the typical peripartum trends (i.e. changes in endocrine asset, limitations of maternal immune responses against the allogeneic conceptus, alterations in energy balance and oxidative stress status). Nevertheless, its duration could be modified when peripartal changes exceed the control of homeorhetic and homeostatic mechanisms, leading to the physiological imbalance (PI) condition. Such a condition could also trigger the inflammatory-like status. It consists in a prepartal raise of pro-inflammatory cytokines (PICs) levels, that is linked to a raise in body temperature at calving, and that typically affects liver metabolism, implying severe losses in hepatic functions and a shift of anabolic priority of the organ in early lactation. The liver produces more α-globulins, known as positive acute phase proteins (APP), i.e. haptoglobin, ceruloplasmin and serum amyloid alpha (SAA). Conversely, it reduces the synthesis of albumin, retinol binding protein, paraoxonase (PON) and lipoproteins, known as negative APP and sequesters minerals, as zinc and iron, from blood flow. Inflammation lead to the activation of PMN, while the reduced immune competence commonly reported in TP has been associated to an opposite effect on leukocytes. Thus, these should be considered as two distinct phenomena, but they could arise from a common cause with a different magnitude and duration. Nutritional strategies to optimize dairy cow’s immunity during TP should be focused on reducing the PI degree related to calving, as this condition could be referred as a common denominator between immune dysfunction and diseases causes. Among such nutritional strategies, the correct management of energy sources to fit with altered requirements should be considered. Furthermore, fatty acids profile of lipid sources administered could also modify immune functions. Finally, the administration of supplementary products exerting antioxidant or anti-inflammatory activities, as well as methyl donors species, could be beneficial for dairy cows immunity in TP. In a wider perspective, although feed additives and nutritional strategy could be effective in mitigate immune alterations, we can conclude that adoption of proper management practices aimed to avoid PI condition in peripartal period of dairy cows could be the most effective strategy to prevent dysfunctions. Three experiments have been designed to elucidate the linkage between sudden changes occurring in peripartum and immune alterations in dairy cows. Throughout such experiments Holstein dairy cows were housed in tied stalls and monitored regularly for body condition score (BCS), body weight (BW), dry matter intake (DMI), milk yield (MY) and rumination time. Blood samples were collected regularly to assess a wide hematochemical profile and to test white blood cell functions through ex-vivo challenges. Furthermore, PMN diapedesis has been tested in-vivo through a carrageenan-skin test and rumen samples were collected at 30 days from calving (DFC). The first experiment was aimed in investigate the main causes of metabolic changes occurring at dry-off and the contribution of MY in such alterations. In fact, dry-off is related to deep changes in feeding behavior, gastro intestinal adaptations, metabolism and immune parameters in high-yielding cow’s career. Indeed, the release of cortisol, signals of systemic inflammation and altered redox balance have been reported immediately after milking interruption, and high MY have a role in aggravating such conditions. In our study, a group of 13 Holstein dairy cows were dried off at 55 days from expected calving day, and regularly monitored from -7 to 34 days from dry-off (DFD). Animals were retrospectively divided in two groups according to their average MY in the last week of lactation, assuming a cut-off of 15 kg*d-1: low MY (6 cows) and high MY (7 cows). Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including MY at dry-off, time and their interaction as fixed effects. Increased fiber amounts of dry ration reduced DMI and increased rumination time. Leukocytes migration into mammary gland to contribute in the involution phase decreased their abundance in blood at dry-off, and their activity. Such activation of leukocytes at mammary site increased the abundance of nitrogen species in plasma and triggered a systemic inflammation in all the animals, as reflected from increased concentrations of positive and reduced concentrations of negative APPs. Such inflammation impaired liver functions, as suggested from the increased gamma-glutamyl transferase (GGT), bilirubin and alkaline phosphatase (ALP) concentrations. Both the production of nitrogen species and the systemic inflammatory status contributed in the depletion of antioxidant system in blood (thiol groups -SHp-, tocopherol, β-carotene, ferric reducing antioxidant power -FRAP- and oxygen reactive antioxidant capacity -ORAC-). Animals with higher MY at dry-off showed the worst condition, likely for the deeper metabolic changes they faced at milking interruption, and to the greater amount of mammary parenchyma to be reabsorbed. This study highlights the dry-off as a thorny point to manage dairy cows’ health and depose for a relationship between dry-off and immune alteration that typically occurs at calving. The second experiment was aimed in investigate changes occurring in the immune system prior to ketosis onset to elucidate their role in disease occurrence. Thus, a group of 13 Holstein dairy cows were monitored from -48 to 35 DFC and retrospectively divided into 2 groups basing on their plasma BHB levels: lower (CTR; 7 cows) or higher than 1.4 mMol/L (KET; 6 cows). Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including health status, time and their interaction as fixed effects. KET cows had a greater activation of the immune system prior to calving (higher plasma concentrations of PICs, myeloperoxidase and oxidant species, and greater interferon gamma responses to Mycobacterium avium) impaired liver functions (higher blood concentration of GGT) and lower plasma minerals. High plasma NEFA, BHB and glucose levels in KET cows suggest an insulin resistance status and a marked mobilization of body fat occurring during dry period. They were also associated to reduced DMI around calving and worse negative energy balance in early lactation. This caused in turn reduced MY and increased fat mobilization in early lactation. Impairment of liver function and activation of leukocytes during the dry period accentuated the acute phase response in KET cows after calving (greater concentrations of positive APPs and lower concentration of retinol binding protein), further impairing liver function (higher blood concentrations of glutamate-oxaloacetate transaminase -AST-GOT- and bilirubin). Leukocytes of KET cows had reduced inflammatory functions after an ex vivo stimulation assay (lower production of PICs and greater production of lactate). These alterations on WBC could be driven by the combined action of metabolites related to the mobilization of lipids and of anti-inflammatory actions aimed to prevent over exuberant inflammation. This suggests that prepartal trends of immune parameters be highly related with the likelihood of developing diseases in early lactation. The third experiment consisted in the administration of Omnigen-AF (OAF), an immune stimulant that is effective in increasing leukocytes functions in immunosuppressed animals and in reducing incidence of infectious diseases in early lactating dairy cows. Its mode of action has never been elucidated, and a wider perspective of its metabolic effect could highlight its effectiveness in facing metabolic disorders of transition period also. Thus, a group of 10 Holstein dairy cows were divided into 2 groups: treated group (TRT; 5 cows) received 32.5 g of Omnigen-AF® (Phibro Animal Health Corporation) twice a day (65 g d-1) as top-dress on the morning and afternoon feeds, while control group (CTR; 5 cows) did not receive any supplementation. From -62 to 42 DFC animals were monitored regularly. Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including treatment, time and their interaction as fixed effects. Administration of OAF at dry-off did not affect BW, BCS, milk yield, milk and rumen fluid composition, and neither affected blood neutrophils concentrations. Nevertheless, it increased rumination time and improved the energy metabolism after calving (lower NEFA and BHB concentrations). TRT cows had an increased lymphocytes abundance at blood level, and their leukocytes had greater efficiency in facing biological stressors during the peripartum (lower lactate production and lower glucose consumption after a challenge with bacterial lipopolysaccharides). Despite these positive effects on immune cells, OAF did not affect the positive APPs concentrations after calving. A reduced abundance of albumin, PON and antioxidants also occurred with OAF after calving, suggesting some impairment of hepatic functions to occur. Nevertheless, the lack of any effect on main biomarkers related to liver function (bilirubin) and liver damage (GGT, AST-GOT, ALP) dismisses a real impairment of liver activities to occur with OAF. Positive effects in favoring the recovery of rumen functions, reducing mobilization of body fats after calving suggest OAF to be an effective strategy in preventing metabolic disorders of transition period.

Il sistema immunitario è costituito da una varietà di cellule, molecole e processi biologici che interagiscono per prevenire le invasioni microbiche, riconoscere le molecole estranee ed eliminare le fonti esistenti di lesioni cellulari, ripristinando le normali funzioni tissutali una volta risolto il problema. L'immunità innata è la prima linea di difesa contro le invasioni di agenti patogeni. Nelle vacche da latte, il suo funzionamento subisce gravi alterazioni durante il periodo di transizione (TP). In questa fase è stata segnalata una compromissione delle funzioni delle cellule polimorfonucleate (PMN) correlate alla produzione di metaboliti reattivi dell'ossigeno (ROM), all’attività della mieloperossidasi (MPO), alla chemiotassi e alla fagocitosi. I PMN bovini hanno un alterata espressione dei geni codificanti per tali funzioni tra -1 e 2 settimane dal parto, rispetto al livello rilevato 4 settimane dopo il parto per gli stessi geni. La causa esatta delle disfunzioni immunitarie che si verificano nel periparto non è mai stata chiaramente identificata. In esse possono contribuire diversi fattori, principalmente imputati alle alterazioni metaboliche tipiche del periparto (cambiamenti nell’assetto ormonale, limitazione della risposta immunitaria materna al fine di mantenere la gravidanza, alterazioni nel bilancio energetico e stato di stress ossidativo). Tuttavia, la durata e l’entità delle disfunzioni immunitarie può aumentare qualora subentri uno stato di squilibrio fisiologico (PI). In tali condizioni, le alterazioni metaboliche del periparto sfuggono al controllo dei meccanismi omeostatici e omeoretici, ed una infiammazione sistemica è la conseguenza frequente di questo squilibrio. Lo stato infiammatorio sistemico è scatenato da un aumento dei livelli di citochine proinfiammatorie (PIC), che è collegato ad un aumento della temperatura corporea al parto, e che tipicamente inficia le funzionalità epatiche, modificando le priorità anaboliche dell'organo in fase di inizio lattazione. A seguito di tale slittamento, il fegato produce più α-globuline, note come proteine positive di fase acuta (+APP), cioè aptoglobina, ceruloplasmina e siero amiloide alfa (SAA). Al contrario, riduce la sintesi di albumina, retinol binding protein (RBP), paraoxonasi (PON) e lipoproteine, note come proteine negative di fase acuta (-APP), e sequestra minerali, quali zinco e ferro, dal flusso ematico. L'infiammazione porta all'attivazione dei PMN, mentre la ridotta competenza immunitaria comunemente riportata in TP è stata associata ad un effetto opposto sui leucociti. Pertanto, questi dovrebbero essere considerati come due fenomeni distinti, ma lo stato di PI potrebbe essere considerato un denominatore comune, direttamente correlato al rischio di patologie in avvio di lattazione. Le strategie nutrizionali per ottimizzare l'immunità delle vacche da latte durante il TP dovrebbero quindi essere focalizzate sulla riduzione del grado di PI correlato al parto. Tra tali strategie nutrizionali, dovrebbe essere presa in considerazione la corretta gestione delle fonti energetiche per adattarle alle variazioni dei fabbisogni. Inoltre, il profilo degli acidi grassi delle fonti lipidiche può contribuire nel modificare le funzioni immunitarie. Infine, la somministrazione di prodotti supplementari con attività antiossidanti o antinfiammatorie, così come di specie donatrici di gruppi metilici, potrebbero essere strategie utili a favorire la funzionalità immunitaria delle bovine durante il TP. In una prospettiva più ampia, sebbene strategie nutrizionali e supplementi possano talora mitigare le alterazioni immunitarie, possiamo concludere che l'adozione di pratiche volte a minimizzare il PI durante il periodo di transizione sia la strategia più efficace per prevenire le disfunzioni. Al fine di chiarire il legame tra le alterazioni che si verificano nel periparto e le disfunzioni immunitarie delle bovine da latte sono stati condotti tre esperimenti. Bovine di razza frisona sono state alloggiate in poste individuali a stabulazione fissa e monitorate regolarmente per le condizioni corporee (BCS), il peso (BW), l'assunzione di alimenti (DMI), la produzione di latte (MY) e il tempo di ruminazione. Campioni di sangue sono stati raccolti regolarmente per valutare un ampio profilo ematochimico e per testare le funzioni dei globuli bianchi mediante stimolazioni ex-vivo. Inoltre, la diapedesi dei PMN è stata testata in vivo mediante test della carragenina e sono stati raccolti campioni di rumine a 30 giorni dal parto (DFC). Il primo esperimento era volto a chiarire le cause dei cambiamenti metabolici che si verificano al momento della messa in asciutta, ed il contributo del livello produttivo in tali alterazioni. Infatti, i profondi cambiamenti nell’alimentazione, gli adattamenti gastrointestinali, del metabolismo e dei parametri immunitari che si verificano nelle bovine alla messa in asciutta sono note scatenare il rilascio di cortisolo, indurre segnali di infiammazione sistemica ed alterare il bilancio redox. Produzioni di latte elevate al momento della messa in asciutta hanno un ruolo nell'aggravare tali condizioni. Nel nostro studio, un gruppo di 13 bovine è stato asciugato a 55 giorni dalla data prevista per il parto. Gli animali sono stati divisi in due gruppi in base alla produzione media dell'ultima settimana di lattazione, assumendo un cut-off di 15 kg * d-1: bassa (LM; 6 animali) e alta produzione (HM; 7 animali). I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo il livello produttivo al termine della lattazione, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. L'aumento delle quantità di fibra nella razione di asciutta ha ridotto la DMI e aumentato il tempo di ruminazione. La migrazione dei leucociti nella ghiandola mammaria per contribuire alla fase di involuzione ha ridotto la loro abbondanza nel sangue e aumentato la loro attività. Tale attivazione dei leucociti nella mammella ha aumentato l'abbondanza di specie reattive dell’azoto nel plasma e innescato un'infiammazione sistemica in tutti gli animali (aumento delle +APP e riduzione delle -APP). Tale infiammazione ha compromesso le funzioni epatiche (aumento delle concentrazioni di gamma-glutamil transferasi -GGT- bilirubina e fosfatasi alcalina -ALP-). Sia la produzione di specie dell’azoto che lo stato infiammatorio sistemico hanno contribuito all'esaurimento degli antiossidanti circolanti (gruppi tiolici -SHp-, tocoferolo, β-carotene, potere antiossidante ferrico riducente -FRAP- e capacità antiossidante contro specie reattive dell'ossigeno -ORAC-). Gli animali con una produzione più elevata alla messa in asciutta hanno mostrato la peggiore condizione, probabilmente per i più profondi cambiamenti metabolici che hanno affrontato dopo l'interruzione delle mungiture, e per la fase involutiva verosimilmente più dispendiosa. Questo studio evidenzia la messa in asciutta come una fase critica per gestire la salute delle vacche da latte, e suggerisce un potenziale legame della messa in asciutta con le alterazioni delle funzioni immunitarie che si verificano nel periparto. Nel secondo esperimento si sono cercati di identificare i cambiamenti del sistema immunitario che precedono l'insorgenza della chetosi, al fine di chiarire il loro ruolo nella comparsa della malattia. Pertanto, 13 bovine sono state monitorate tra -48 e 35 DFC e suddivise in due gruppi sulla base dei loro livelli plasmatici di beta idrossibutirrato (BHB): inferiore (CTR, 7 animali) o superiore a 1,4 mMol / L (KET; 6 animali). I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo lo stato di salute, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. Le vacche KET hanno avuto una maggiore attivazione del sistema immunitario prima del parto (maggiori concentrazioni plasmatiche di PIC, MPO e specie ossidanti e maggiori produzione di interferone gamma in risposta alla stimolazione con Mycobacterium avium) alterazioni della funzionalità epatica (più alta concentrazione sanguigna di GGT) e minori minerali plasmatici. Elevati livelli plasmatici di NEFA, BHB e glucosio nelle vacche KET suggeriscono uno stato di insulinoresistenza e una marcata mobilizzazione del grasso corporeo durante il periodo di asciutta. Tali andamenti dei parametri relativi al metabolismo energetico durante l’asciutta sono stati associati alla riduzione della DMI al momento del parto e al peggioramento del bilancio energetico negativo ad avvio lattazione. Ciò ha causato a sua volta una riduzione di MY e accresciuto ulteriormente la mobilizzazione dei grassi in avvio di lattazione. Compromissione della funzionalità epatica e attivazione dei leucociti durante il periodo di asciutta hanno determinato una marcata risposta infiammatoria di fase acuta nelle vacche KET dopo il parto (maggiori concentrazioni di +APP minori concentrazioni di RBP), ed ulteriormente compromesso la funzionalità epatica (maggiori concentrazioni di glutammato-ossalacetato transaminasi -AST-GOT- e bilirubina). I leucociti delle vacche KET hanno mostrato ridotte funzioni infiammatorie dopo stimolazione ex-vivo con lipopolisaccaridi batterici (minore produzione di PIC e maggiore produzione di lattato). Queste alterazioni potrebbero essere guidate dall'azione combinata dei metaboliti legati alla mobilizzazione dei lipidi e delle azioni antinfiammatorie volte a prevenire un'infiammazione eccessiva. Ciò suggerisce che le alterazioni dei parametri immunitari osservate prima del parto siano altamente correlate con la probabilità di sviluppare chetosi in avvio di lattazione. Nel terzo esperimento è stato somministrato un prodotto immunostimolante dalla comprovata efficacia nel migliorare le funzioni leucocitarie degli animali immunodepressi e nel ridurre l'incidenza delle malattie infettive delle bovine ad inizio lattazione. La sua modalità di azione non è mai stata chiarita, e un’indagine approfondita sul suo effetto metabolico potrebbe evidenziarne l’efficacia anche nei confronti dei disordini metabolici del periodo di transizione. Pertanto, un gruppo di10 bovine è stato monitorato da -62 a 42 DFC. Il gruppo trattato (TRT, 5 animali) ha ricevuto 32,5 g di Omnigen-AF® (Phibro Animal Health Corporation) due volte al giorno (65 g d-1), mentre il gruppo di controllo (CTR, 5 animali) non ha ricevuto alcun supplemento. I dati sono stati sottoposti ad ANOVA utilizzando un modello per misure ripetute, assumendo il trattamento, il tempo e la loro interazione come effetti fissi. La somministrazione dell’immunostimolante alla messa in asciutta non ha influenzato BW, BCS, MY, composizione del latte e del fluido ruminale e nemmeno modificato la concentrazione di neutrofili del sangue. Tuttavia, ha aumentato il tempo di ruminazione e migliorato il metabolismo energetico dopo il parto (concentrazioni di NEFA e BHB inferiori). Le bovine TRT avevano maggiori concentrazioni ematiche di linfociti e i loro leucociti avevano una maggiore efficienza nel rispondere alla stimolazione con lipopolisaccaridi batterici (produzione di lattato inferiore e minore consumo di glucosio). Nonostante questi effetti positivi sulle cellule immunitarie, l'immunostimolante non ha influenzato le concentrazioni di +APP dopo il parto. Inoltre, l’immunostimolante ha ridotto le concentrazioni di albumina, PON e antiossidanti dopo il parto, suggerendo la compromissione di alcune funzioni epatiche negli animali trattati. Tuttavia, la mancanza di qualsiasi effetto sui biomarcatori di funzionalità (bilirubina) e danno epatico (GGT, AST-GOT, ALP) smentisce una reale compromissione delle attività epatiche a seguito del trattamento. Gli effetti positivi nel favorire il recupero delle funzioni del rumine, riducendo la mobilizzazione dei grassi corporei dopo il parto, suggeriscono che l'immunostimolante sia una strategia efficace nella prevenzione dei disturbi metabolici del periodo di transizione.
Immune system is made of a variety of cells, molecules and biological processes that interacts to prevent microbial invasions, recognize foreign molecules and eliminate existing sources of cellular injuries to restore tissues to their normal functions once problem has been solved. Innate immunity is the primary defense line against pathogens invasions. Its functioning typically undergoes severe alterations during transition period (TP) of dairy cows. An impairment of polymorphonuclear cells (PMN) functions related to reactive oxygen metabolites (ROM) production, myeloperoxidase (MPO) activity, chemotaxis and phagocytosis has been reported in this phase. Bovine PMN have an altered abundance in mRNA transcripts encoding for such functions between -1 and 2 weeks from calving, in comparison to the level found at 4 weeks after calving for the same genes. The exact cause of immune dysfunctions occurring in peripartum has never been clearly identified. Reduced immune competence could arise from the interaction of different factors affected from the typical peripartum trends (i.e. changes in endocrine asset, limitations of maternal immune responses against the allogeneic conceptus, alterations in energy balance and oxidative stress status). Nevertheless, its duration could be modified when peripartal changes exceed the control of homeorhetic and homeostatic mechanisms, leading to the physiological imbalance (PI) condition. Such a condition could also trigger the inflammatory-like status. It consists in a prepartal raise of pro-inflammatory cytokines (PICs) levels, that is linked to a raise in body temperature at calving, and that typically affects liver metabolism, implying severe losses in hepatic functions and a shift of anabolic priority of the organ in early lactation. The liver produces more α-globulins, known as positive acute phase proteins (APP), i.e. haptoglobin, ceruloplasmin and serum amyloid alpha (SAA). Conversely, it reduces the synthesis of albumin, retinol binding protein, paraoxonase (PON) and lipoproteins, known as negative APP and sequesters minerals, as zinc and iron, from blood flow. Inflammation lead to the activation of PMN, while the reduced immune competence commonly reported in TP has been associated to an opposite effect on leukocytes. Thus, these should be considered as two distinct phenomena, but they could arise from a common cause with a different magnitude and duration. Nutritional strategies to optimize dairy cow’s immunity during TP should be focused on reducing the PI degree related to calving, as this condition could be referred as a common denominator between immune dysfunction and diseases causes. Among such nutritional strategies, the correct management of energy sources to fit with altered requirements should be considered. Furthermore, fatty acids profile of lipid sources administered could also modify immune functions. Finally, the administration of supplementary products exerting antioxidant or anti-inflammatory activities, as well as methyl donors species, could be beneficial for dairy cows immunity in TP. In a wider perspective, although feed additives and nutritional strategy could be effective in mitigate immune alterations, we can conclude that adoption of proper management practices aimed to avoid PI condition in peripartal period of dairy cows could be the most effective strategy to prevent dysfunctions. Three experiments have been designed to elucidate the linkage between sudden changes occurring in peripartum and immune alterations in dairy cows. Throughout such experiments Holstein dairy cows were housed in tied stalls and monitored regularly for body condition score (BCS), body weight (BW), dry matter intake (DMI), milk yield (MY) and rumination time. Blood samples were collected regularly to assess a wide hematochemical profile and to test white blood cell functions through ex-vivo challenges. Furthermore, PMN diapedesis has been tested in-vivo through a carrageenan-skin test and rumen samples were collected at 30 days from calving (DFC). The first experiment was aimed in investigate the main causes of metabolic changes occurring at dry-off and the contribution of MY in such alterations. In fact, dry-off is related to deep changes in feeding behavior, gastro intestinal adaptations, metabolism and immune parameters in high-yielding cow’s career. Indeed, the release of cortisol, signals of systemic inflammation and altered redox balance have been reported immediately after milking interruption, and high MY have a role in aggravating such conditions. In our study, a group of 13 Holstein dairy cows were dried off at 55 days from expected calving day, and regularly monitored from -7 to 34 days from dry-off (DFD). Animals were retrospectively divided in two groups according to their average MY in the last week of lactation, assuming a cut-off of 15 kg*d-1: low MY (6 cows) and high MY (7 cows). Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including MY at dry-off, time and their interaction as fixed effects. Increased fiber amounts of dry ration reduced DMI and increased rumination time. Leukocytes migration into mammary gland to contribute in the involution phase decreased their abundance in blood at dry-off, and their activity. Such activation of leukocytes at mammary site increased the abundance of nitrogen species in plasma and triggered a systemic inflammation in all the animals, as reflected from increased concentrations of positive and reduced concentrations of negative APPs. Such inflammation impaired liver functions, as suggested from the increased gamma-glutamyl transferase (GGT), bilirubin and alkaline phosphatase (ALP) concentrations. Both the production of nitrogen species and the systemic inflammatory status contributed in the depletion of antioxidant system in blood (thiol groups -SHp-, tocopherol, β-carotene, ferric reducing antioxidant power -FRAP- and oxygen reactive antioxidant capacity -ORAC-). Animals with higher MY at dry-off showed the worst condition, likely for the deeper metabolic changes they faced at milking interruption, and to the greater amount of mammary parenchyma to be reabsorbed. This study highlights the dry-off as a thorny point to manage dairy cows’ health and depose for a relationship between dry-off and immune alteration that typically occurs at calving. The second experiment was aimed in investigate changes occurring in the immune system prior to ketosis onset to elucidate their role in disease occurrence. Thus, a group of 13 Holstein dairy cows were monitored from -48 to 35 DFC and retrospectively divided into 2 groups basing on their plasma BHB levels: lower (CTR; 7 cows) or higher than 1.4 mMol/L (KET; 6 cows). Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including health status, time and their interaction as fixed effects. KET cows had a greater activation of the immune system prior to calving (higher plasma concentrations of PICs, myeloperoxidase and oxidant species, and greater interferon gamma responses to Mycobacterium avium) impaired liver functions (higher blood concentration of GGT) and lower plasma minerals. High plasma NEFA, BHB and glucose levels in KET cows suggest an insulin resistance status and a marked mobilization of body fat occurring during dry period. They were also associated to reduced DMI around calving and worse negative energy balance in early lactation. This caused in turn reduced MY and increased fat mobilization in early lactation. Impairment of liver function and activation of leukocytes during the dry period accentuated the acute phase response in KET cows after calving (greater concentrations of positive APPs and lower concentration of retinol binding protein), further impairing liver function (higher blood concentrations of glutamate-oxaloacetate transaminase -AST-GOT- and bilirubin). Leukocytes of KET cows had reduced inflammatory functions after an ex vivo stimulation assay (lower production of PICs and greater production of lactate). These alterations on WBC could be driven by the combined action of metabolites related to the mobilization of lipids and of anti-inflammatory actions aimed to prevent over exuberant inflammation. This suggests that prepartal trends of immune parameters be highly related with the likelihood of developing diseases in early lactation. The third experiment consisted in the administration of Omnigen-AF (OAF), an immune stimulant that is effective in increasing leukocytes functions in immunosuppressed animals and in reducing incidence of infectious diseases in early lactating dairy cows. Its mode of action has never been elucidated, and a wider perspective of its metabolic effect could highlight its effectiveness in facing metabolic disorders of transition period also. Thus, a group of 10 Holstein dairy cows were divided into 2 groups: treated group (TRT; 5 cows) received 32.5 g of Omnigen-AF® (Phibro Animal Health Corporation) twice a day (65 g d-1) as top-dress on the morning and afternoon feeds, while control group (CTR; 5 cows) did not receive any supplementation. From -62 to 42 DFC animals were monitored regularly. Data were submitted to ANOVA using a mixed model for repeated measures including treatment, time and their interaction as fixed effects. Administration of OAF at dry-off did not affect BW, BCS, milk yield, milk and rumen fluid composition, and neither affected blood neutrophils concentrations. Nevertheless, it increased rumination time and improved the energy metabolism after calving (lower NEFA and BHB concentrations). TRT cows had an increased lymphocytes abundance at blood level, and their leukocytes had greater efficiency in facing biological stressors during the peripartum (lower lactate production and lower glucose consumption after a challenge with bacterial lipopolysaccharides). Despite these positive effects on immune cells, OAF did not affect the positive APPs concentrations after calving. A reduced abundance of albumin, PON and antioxidants also occurred with OAF after calving, suggesting some impairment of hepatic functions to occur. Nevertheless, the lack of any effect on main biomarkers related to liver function (bilirubin) and liver damage (GGT, AST-GOT, ALP) dismisses a real impairment of liver activities to occur with OAF. Positive effects in favoring the recovery of rumen functions, reducing mobilization of body fats after calving suggest OAF to be an effective strategy in preventing metabolic disorders of transition period.

During the last years, fish welfare is receiving increasing attention in public and therefore in the world of research, industry and governments. In aquaculture, fishes are often exposed to stress conditions, due to practices such as manipulation, grading, high stocking densities, transport, pre-slaughter conditions and slaughter methods. In order to reduce this stressors and to increase both fish welfare and production needs, it is seeking to introduce organic agriculture principles to the conventional aquaculture. Organic aquaculture is still relatively new in concept and development all over the World. Consumers expect organic producers to follow higher animal welfare standards. In this study, fish welfare was investigated in European sea bass (Dicentrarchus labrax) reared under organic aquaculture in a standard commercial farm, comparing it with a parallel conventional farming. At the beginning of the trial, the main difference between the two rearing systems was in the diet. Welfare was evaluated through different stress and immunological parameters, besides growing performances. Particularly, stress response was evaluated through the analysis of both serum and muscle cortisol, and oxidative stress was investigated with an histochemical (melanomacrophage centres count and relative pigments content) and an immunohistochemical approach, using an antibody anti-HNE (a lipid peroxidation marker), besides glutathione analysis. Hematological and innate immunity parameters was also carried out, such as hematocrit, leucocrit and serum lysozyme activity. The aims of the study were to investigate both differences in fish welfare between the two rearing systems and the seasonal variations of the parameters carried out. Concerning differences between rearing systems, this study highlighted a different growing trend, in which conventional fishes were longer and heavier than organic ones. On the other hand, stress and immunological parameters didn’t show any significant differences, if not in some samplings, suggesting that more severe conditions may be required to affect these activities. Since this was a monitoring study on a commercial farming, potential differences in the investigated parameters may have been mitigated, as the two systems didn’t differed so pronounced. Concerning seasonality, all parameters investigated exhibited some seasonal trend, probably correlated to water temperature and photoperiod or to their combination.
Negli ultimi anni, il benessere dei pesci o “fish welfare” sta ricevendo crescente attenzione nel pubblico e quindi nel mondo della ricerca, dell'industria e dei governi. In acquacoltura, i pesci sono spesso esposti a condizioni di stress, a causa di pratiche di allevamento come la manipolazione, la selezione, l’alta densità di allevamento, il trasporto, le condizioni di pre-macellazione e i metodi di macellazione. Al fine di ridurre questo stress e per aumentare sia il benessere dei pesci sia le esigenze di produzione, si sta cercando di introdurre i principi dell'agricoltura biologica nell’acquacoltura tradizionale. L'acquacoltura biologica è un concetto ancora relativamente nuovo nel mondo dell’acquacoltura. I consumatori si aspettano che i produttori biologici seguano standard più elevati per quanto riguarda il benessere animale. In questo studio, il benessere dei pesci è stato valutato in branzini (Dicentrarchus labrax) allevati secondo disciplinare biologico in un allevamento commerciale. Contemporaneamente, gli stessi parametri sono stati studiati in branzini allevati in un parallelo allevamento convenzionale. All'inizio della sperimentazione, la differenza principale tra i due sistemi di allevamento riguardava il mangime utilizzato nella dieta. Il benessere è stato valutato attraverso parametri immunologici e di stress, oltre alle performance di crescita. In particolare, la risposta allo stress è stata valutata attraverso l'analisi di cortisolo sierico e muscolare e lo stress ossidativo è stato studiato con un approccio sia istochimico (conteggio dei centri melanomacrofagici e relativo contenuto in pigmenti) sia immunoistochimico, utilizzando un anticorpo anti-HNE (un marker della perossidazione lipidica), oltre all’analisi del glutatione totale. Inoltre si sono investigati parametri ematologici e immunitari, come l’ematocrito, il leucocrito e l'attività lisozimatica del siero. Gli obiettivi dello studio hanno riguardato sia la valutazione di eventuali differenze nel benessere dei pesci tra i due sistemi di allevamento sia lo studio delle variazioni stagionali dei parametri ricercati. Per quanto riguarda le differenze tra i sistemi di allevamento, questo studio ha evidenziato un diverso trend di crescita, per il quale i pesci allevati in modo convenzionale hanno mostrato un accrescimento maggiore sia in termini di peso che di lunghezza rispetto a quelli biologici. D'altra parte, lo stress e i parametri immunologici non hanno evidenziato particolari differenze significative, se non in alcuni campionamenti, suggerendo che condizioni più severe sarebbero necessarie per incidere su questi indicatori. Dal momento che questo è stato uno studio di monitoraggio su una azienda ittica a fini commerciali e non un allevamento sperimentale di ricerca, eventuali differenze nei parametri indagati potrebbero essere state mitigate, considerando anche che i due sistemi non differivano in modo pronunciato. Per quanto riguarda la stagionalità, tutti i parametri indagati hanno mostrato un trend stagionale, probabilmente correlato alla temperatura dell'acqua e al fotoperiodo o alla loro combinazione.

Lo scopo di tale lavoro e' stato quello di studiare e approfondire ulteriormente la proliferazione e l’espansione delle cellule Th17 come risposta funzionale alla stimolazione antigenica e i meccanismi molecolari che la caratterizzano.

Dottorato di Ricerca in Biologia Animale, XIX Ciclo
At date, a plethora of evidence regarding adverse morpho-functional and neurobiological aspects provoked by environmental stressors has been considered. Following exposure to stress factors, the activation of both specific neurosignaling mechanisms and molecular pathways account for the modulation of complex adaptative processes in animal targets. In this context, the aim of the present work is to analyze the neuroprotective role of histaminergic system and heat shock proteins towards environmental neurotoxicants such as heavy metals and pesticides in the Teleost Thalassoma pavo. Such environmental stressors account for significative alterations on motor and feeding behaviors, which are tightly correlated to neurodegenerative processes in key brain regions. In this work, the molecular characterization of H2R and H3R permits to demonstrate a conservation of specific sequences, which appear to be determinant for the function of such subtypes in phylogenetically distant Vertebrates. Moreover, the inactivation of H2R and H3R, via the application of selective antagonists (Cimetidine and Thioperamide, respectively), induces in Thalassoma pavo abnormal behaviors and trascriptional alterations, suggesting a clear physiological role of this neuronal system in our model. The expression pattern of histaminergic system results to be highly modified following exposure to environmental stressors in a region-dependent manner. In particular, the heavy metals induce downregulations of H2R mRNA in some brain regions such as mesencephalon, which is involved in the regulation of motor activities. On the other hand, both heavy metal and pesticides account for an increasement of H3R trascriptional levels in hypothalamic and telencephalic areas. From the concomitant exposure to histaminergic antagonists and environmental stressors, it was possible to demonstrate that H2R blockade is responsible for enhanced stressors-dependent neurotoxic effects. On the contrary, the inhibition of H3R activities accounts for an amelioration of both abnormal motor behaviors and neuronal damage induced by such environmental stressors. Consistent with the effects on histaminergic system, heavy metals and pesticides also promote the activation of cellular defence processes through the stimulation of heat shock proteins trascription, i.e. HSP90 e HSP70. The histaminergic antagonists are able to influence heat shock proteins expression, inducing a heterogeneous pattern of HSP90 trascription levels, while in the case of HSP70 an enhanced expression is typical of all encephalic areas. The results of the present work demonstrate, for the first time in an aquatic Vertebrate, a possible interactions between histaminergic system-dependent neurosignaling activities and HSPs network, which could be represent an important neurophysiological mechanism operating during neuronal stress conditions.
Università della Calabria

Scuola di Dottorato Life Sciences, Indirizzo: Biologia animale, Ciclo XXVIII, a.a. 2015-2016
The myocardial response to mechanical stretch (Frank-Starling law) is an important physiological cardiac determinant. Modulated by many endogenous substances, it is impaired in the presence of cardiovascular pathologies and during senescence. Catestatin (CST: hCgA352-372), a 21-amino-acid derivate of Chromogranin A (CgA), displays hypotensive/vasodilatory properties and counteracts excessive systemic and/or intra-cardiac excitatory stimuli (e.g., catecholamines and endothelin-1). CST, produced also by the myocardium, affects the heart by modulating inotropy, lusitropy and the coronary tone through a Nitric Oxide (NO)-dependent mechanism. This study evaluated the putative influence elicited by CST on the Frank-Starling response of normotensive Wistar Kyoto (WKY) and hypertensive (SHR) hearts by using isolated and Langendorff perfused cardiac preparations. Functional changes were evaluated on aged (18-month-old) WKY rats and SHR which mimic human chronic heart failure (HF). Comparison to WKY rats, SHR showed a reduced Frank-Starling response. In both rat strains, CST administration improved myocardial mechanical response to increased end-diastolic pressures. This effect was mediated by EE/IP3K/NOS/NO/cGMP/PKG, as revealed by specific inhibitors. CST-dependent positive Frank-Starling response is paralleled by an increment in protein S-Nitrosylation, AKT/eNOS/nNOS and PLN phosphorylations. Our data suggested CST as a NO dependent physiological modulator of the stretch-induced intrinsic regulation of the heart. This may be of particular importance in the aged hypertrophic heart, whose function is impaired because of a reduced systolic performance accompanied by delayed relaxation and increased diastolic stiffness.
Università della Calabria