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Dissertations / Theses on the topic 'Saccharase'
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Joucla, Gilles. "Caractérisation de l'alternane-saccharase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 : approche rationnelle et aléatoire pour la conception de nouvelles glucane-saccharases." Toulouse, INSA, 2003. http://www.theses.fr/2003ISAT0032.
Full textAbstract:
L'alternane-saccharase (ASR) catalyse, à partir de saccharose, la formation d'un polymère de glucose associé par des liaisons osidiques a-1,6 et a-1,3 alternées. L'objectif de l'étude était de caractériser l'ASR, dont la spécificité est unique dans la famille 70 des glycoside-hydrolases, pour avancer dans la compréhension du mode de synthèse du polymère et de la formation des liaisons alternées. Dans un premier temps, l'expression hétérologue du gène asr dans E. Coli a montré que l'enzyme était faiblement produite et fortement dégradée. La forme ASR C-del (161 kDa), tronquée des séquences répétées de type " APY " et obtenue par délétion du gène asr, a permis de multiplier par un facteur 120 le niveau de production de l'enzyme. Cette forme est très peu dégradée ce qui rend possible la caractérisation de l'activité. L'étude montre que le polymère est synthétisé à partir de l'extrémité non réductrice par transfert successif sur du glucose. S'opposant au mécanisme couramment admis pour les glucane-saccharases, il devra être étayé par des données structurales. Un procédé permettant de produire efficacement l'enzyme et de la purifier a été établi pour pouvoir initier les expériences de cristallisation. D'après des travaux de mutagénèse, le fragment 768YDA770 s'est révélé impliqué dans la spécificité d'alternance. Cependant l'absence de données structurales limite l'identification de nouvelles cibles. C'est pourquoi, nous avons créé des banques de variants par mutagénèse aléatoire et recombinaison, et développé des méthodes de criblage pour l'isolement de variants plus actifs et dépourvus d'activité ASR. Les protocoles ont été testés avec succès sur une fraction de la banqueThe alternansucrase (ASR) synthesizes from sucrose an homopolymer of glucose with a-1,6 and a-1,3 alternanted glucosidic linkages. The aim of this work was to characterise the ASR to understand the polymer synthesis and the process for alternanting the linkages which is unique in the 70 family of glucoside-hydrolases. Expression of asr gene in E. Coli led to low production and to degraded forms of the enzyme. However, the form ASR C-del (161 kDa), which is genetically truncated from "APY" amino acids repeated sequences, allowed a 120 fold increase in production without any degradation. Characterisation of the enzyme activity showed that the polymer is synthesized from the non-reducing end with successive transfers on glucose, the initial acceptor. Furthermore, sequence analysis followed with mutant constructions showed that the 768YDA770 fragment has a significant role in the alternating synthesis process. All theses results need to be confirmed by structural data. Thus, we developed a purification process to purify the ASR C-del in order to initiate crystallization experiments. To avoid limited design by the site directed mutagenesis without 3D structure, we generated libraries of variants of ASR C-del by random mutagenesis and combinatorial engineering and developed screening assays to isolate mutants more actives or affected in alternating function. Protocols were successfully set up and tested with the recent high throughput platform
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Willemot, René-Marc. "Etude de la dextrane-saccharase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F." Toulouse, INSA, 1993. http://www.theses.fr/1993ISAT0031.
Full textAbstract:
Differentes formes de la dextrane-saccharase de leuconostoc mesenteroides nrrl b-512f ont ete purifiees. Pour cela, le dextrane associe a l'enzyme a tout d'abord ete elimine par action d'une preparation hautement pure de dextranase fongique. Plusieurs protocoles de purification de la dextrane-saccharase sont decrits. Une preparation d'activite specifique egale a 161 u/mg a ete obtenue. L'analyse electrophoretique de l'enzyme conduit a des resultats dependant de la methode de purification utilisee: dans tous les cas un poids moleculaire de 130000 est observe, mais des molecules actives de poids moleculaire 65000 sont egalement obtenues lorsqu'on purifie l'enzyme par ultrafiltration. Il pourrait s'agir d'une forme monomerique active, mais le plus souvent presente sous une forme agregee dans les milieux. L'enzyme presente un point isoelectrique egal a 4. L'effet activateur et stabilisateur du dextrane sur l'enzyme a ete etudie, ceux-ci sont etroitement dependants de la forme enzymatique utilisee. Le calcium n'est pas indispensable a l'activite enzymatique, mais l'edta inhibe partiellement et reversiblement cette activite. La specificite des reactions d'accepteur catalysees par la dextrane-saccharase s'avere trop etroite pour pouvoir utiliser cette enzyme en vue de transferer des unites glucose vers d'autres molecules comme des proteines, des peptides, des acides amines ou des polyosides autres que le dextrane
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Daguer, Smith Jean Pierre. "L'opéron lévane saccharase de Bacillus subtilis : régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077046.
Full text
4
Aymerich, Stéphane. "Etude de la regulation de la synthese de la levane-saccharase de bacillus subtilis : modulation du niveau de la synthese, induction par le saccharose." Paris, Institut national d'agronomie de Paris Grignon, 1987. http://www.theses.fr/1987INAPA019.
Full text
5
BENYAHIA, BABAALI FADILA. "Etude du mecanisme de secretion de la levane saccharase chez bacillus subtilis." Paris 6, 1989. http://www.theses.fr/1989PA066553.
Full textAbstract:
La levane saccharase de bacillus subtilis, enzyme secrete pendant la phase exponentielle de croissance, inductible par le saccharase, representant chez un mutant haut producteur 8 a 10% des proteines membranaires, est utilisee comme modele d'etude du mecanisme de secretion proteique. Une forme lourde membranaire (53 kd) possedant une extension n-terminale de 29 acides amines, deja caracterisee dans les minicellules de e. Coli, hote du gene de structure de la ls et une forme legere membranaire (50 kd) de meme masse que la ls exocellulaire ont ete caracterisees comme intermediaires de secretion. Chez b. Subtilis ou les minicellules de e. Coli la maturation de la forme lourde est inhibee en presence d'agents amphiphiles. Purifiees, les deux formes membranaires sont actives qu'en presence d'ion fe#3#+. La forme lourde est convertie in vitro en forme legere par la leader peptidase de e. Coli. Nous proposons un mecanisme de secretion a deux etapes membranaires: la modification covalente de la forme lourde, la secretion de la forme legere resultante, le fer etant necessaire a cette etape. Le remplacement de la glycine, en position 366 (la ls mature est constituee de 444 acides amines) par un aspartate ou une arginine affecte uniquement la seconde etape. Le niveau de secretion du mutant aspartate est augmente d'un facteur 10 en presence de fer. In vitro, le fer augmente d'un facteur trois la vitesse de repliement de la ls sauvage purifiee. L'implication d'ions metalliques souvent requis pour la secretion du proteines de bacillacees pourrait etre un element general du mecanisme de secretion chez ces bacteries gram#+
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ARGUELLO, MORALES MARTHA ALICIA. "L'alternane-saccharase de leuconostoc mesenteroides nrrl b-1355 : structure primaire et synthese d'oligosides." Toulouse, INSA, 2000. http://www.theses.fr/2000ISAT0009.
Full textAbstract:
L'alternane-saccharase est une glucane-saccharase excretee par l. Mesenteroides nrrl b-1355. En presence de saccharose, l'enzyme catalyse la synthese d'alternane, un polymere compose de residus glucose associes par des liaisons osidiques 1,6 et 1,3 alternees. De plus, lorsqu'un accepteur tel que le maltose est ajoute dans le milieu, l'alternane-saccharase catalyse le transfert du glucose provenant du saccharose sur l'accepteur pour produire des oligosides de faible masse molaire egalement porteurs de liaisons 1,6 et 1,3 alternees. L'etude realisee a porte sur deux aspects. Tout d'abord, le clonage du gene codant pour l'alternane-saccharase a ete entrepris afin de comparer la structure primaire de cette enzyme aux autres glucane-saccharases connues de specificite differente. En parallele, la reaction en presence de differents accepteurs catalysee par l'alternane-saccharase a ete etudiee afin de cerner l'interet de cette enzyme pour la synthese de nouveaux oligosides. Les premiers travaux de clonage nous ont conduits a isoler un gene codant pour une dextrane-saccharase (dsr-c). Le gene codant pour l'alternane-saccharase (asr) a ete isole a l'aide d'une sonde specifique de la proteine. Les deux genes ont ete sequences et les proteines codees ont ete caracterisees. Le gene dsr-c est identique au gene dsr-b de l. Mesenteroides nrrl b-1299 indiquant que les deux genes proviennent du meme ancetre. L'analyse de la sequence proteique codee par le gene asr a permis d'identifier des segments absents dans les sequences des autres glucane-saccharases, ainsi que des segments differents. Ces regions pourraient etre impliquees dans la specificite de l'enzyme. L'activite alternane-saccharase en presence de differents oses accepteurs a ete comparee a celle de la dextrane-saccharase de l. Mesenteroides nrrl b-512f qui ne synthetise que des liaisons osidiques de type 1,6. Il est apparu de nombreuses differences entre l'alternane-saccharase et la dextrane-saccharase vis a vis des molecules testees, certaines etant mieux reconnues par une enzyme que par l'autre. En particulier, le cellobiose qui etait identifie comme un mauvais accepteur pour la dextrane-saccharase est apparu comme etant efficacement glucosyle par l'alternane-saccharase, avec un rendement de 30%. Les produits obtenus ont ete purifies et leurs structures determinees.
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Molina, Manon. "Exploration of the molecular determinants involved in alternansucrase specificity and stability." Thesis, Toulouse, INSA, 2019. http://www.theses.fr/2019ISAT0010.
Full textAbstract:
L’alternane-saccharase (ASR) de Leuconostoc citreum NRRL B-1355 est une glucane-saccharase appartenant à la famille 70 des glycoside hydrolases (GH70). Cette α-transglucosylase utilise le saccharose, substrat peu coûteux et abondant, pour catalyser la formation d’un polymère d’α-glucane composé de liaisons osidiques α-1,6 et α-1,3 alternées dans la chaîne principale et appelé alternane. Avec une température optimale de 45°C, l’ASR est parmi les glucane-saccharases les plus stables. Afin d’avoir une meilleure compréhension des déterminants de la spécificité de liaison, de la polymérisation et de la plus haute stabilité de l’ASR, nous avons résolu la structure de cette enzyme. Notre étude par mutagénèse dirigée combinée à du docking moléculaire suggère que la spécificité de liaison est contrôlée par le positionnement de l’accepteur dans l’un ou l’autre des sous-sites +2 ou +2’. Des complexes de l’ASR avec différents ligands ont également mis en évidence un site signature de l’enzyme. Ce site est impliqué dans la formation du polymère d’alternane et pourrait servir de pont facilitant l’élongation processive de l’alternane. Enfin, nos travaux préliminaires indiquent que le domaine C pourrait être impliqué dans la stabilité de ces enzymes. Nos résultats ouvrent des nouvelles pistes d’investigation concernant l’étude des relations structure-fonction des glucane-saccharases et la conception de polymères de structure et propriétés physico-chimiques contrôléesThe alternansucrase (ASR) from Leuconostoc citreum NRRL B-1355 is a glucansucrase belonging to the family 70 of glycoside hydrolases (GH70). This α-transglucosylase uses a cheap and abundant molecule, sucrose, to catalyze the formation of a unique α-glucan polymer made of alternating α-1,6 and α-1,3 linkages in the main chain, called alternan. With a 45°C optimum temperature, ASR is among the most stable glucansucrases to date. To get a deeper insight in ASR determinants involved in linkage specificity, polymerization and stability, we have solved the unliganded 3D structure of this enzyme at 2.8 Å. Coupled to mutagenesis and molecular docking, our results suggest the alternance to be governed by the acceptor positioning in either +2 or +2’ subsite, and the key contributions of Trp675 or Asp772 residue, respectively. Complexes of ASR with various sugar ligands were also obtained and highlighted a site never identified in any other GH70 enzymes. This site is uniquely found in alternansucrase and could act as a bridge between the domain V and the active site facilitating alternan processive elongation. Finally, the construction and characterization of chimera enzymes suggested domain C to be involved in enzyme stability. Overall, our results improved our knowledge on the structure-function relationship of ASR and open new paths for the conception of polymers with controlled structures and physicochemical properties
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HADDAOUI, ELARBI. "Secretion de la levane saccharase et de l'alpha-amylase chez bacillus subtilis : caracterisation de l'etape cinetiquement limitante." Paris 11, 1997. http://www.theses.fr/1997PA112014.
Full textAbstract:
Le travail presente dans ce memoire est consacre a l'etude de la secretion proteique chez bacillus subtilis. La description du mecanisme de secretion proteique, en termes moleculaires, repose au moins en partie sur l'identification des etapes discretes cellulaires de ce processus. Cet objectif peut etre atteint grace a la caracterisation spatiale et temporelle des formes precurseurs de la proteine secretee completee par l'etude in vitro des reactions simulants les modifications que peut subir la proteine au cours de sa secretion. Deux enzymes secretes par ce microorganisme ont ete choisis comme proteines modeles, la levane saccharase et l'alpha-amylase. Un mecanisme de secretion a deux etapes a ete anterieurement propose pour la levane saccharase. J'ai contribue a l'identification des catalyseurs possibles de la deuxieme etape, etape cinetiquement limitante s'effectuant sur la face externe de la membrane et au cours de laquelle l'evenement de liberation de la proteine dans le milieu exterieur est etroitement couple a l'acquisition de la structure native resistante aux proteases. Avec l'alpha-amylase, j'ai entrepris la caracterisation des formes intermediaires cellulaires. Lorsque l'alpha-amylase est exprimee sous le controle de son propre promoteur amyri, aucune forme transitoire ne peut etre detectee. Cette recherche m'a conduit cependant a caracteriser une nouvelle amylase endocellulaire chez b. Subtilis. A un niveau de synthese plus eleve, obtenu en placant le gene amye sous le controle de sacr, j'ai identifie une forme precurseur transitoire, depourvue de peptide signal. Le temps de demi-liberation de cette forme est du meme ordre de grandeur que le temps de demi-reaction du repliement de la proteine in vitro. Les deux evenements exigent la presence de calcium. Ainsi, le processus de secretion de l'alpha-amylase et de la levane saccharase pourrait s'effectuer post-traductionnellement selon une sequence assez semblable de deux etapes discretes. L'efficacite de la seconde etape, cinetiquement limitante, couplee au repliement proteique pourrait dependre de la presence de catalyseurs de repliement sur la face externe de la membrane. La comparaison des proprietes de repliement de ces deux proteines revele des caracteristiques communes qui pourraient aider a definir un code interne de secretion des proteines chez b. Subtilis.
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Dumond, Pascale Morali Alain. "Le déficit congénital en saccharase-isomaltase étude rétrospective de 53 cas diagnostiqués en France de 1963 à 2003 /." [S.l.] : [s.n.], 2006. http://www.scd.uhp-nancy.fr/docnum/SCDMED_T_2006_DUMOND_PASCALE.pdf.
Full text
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Dols, Marguerite. "Etude de la dextrane-saccharase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 : production et application à la synthèse d'oligosides." Toulouse, INSA, 1996. http://www.theses.fr/1996ISAT0026.
Full textAbstract:
La dextrane-saccharase de leuconostoc mesenteroides nrrl b-1299 catalyse la synthese de dextrane, polymere de glucose, a partir du saccharose et, en presence de saccharose et maltose, la synthese d'oligosides contenant des liaisons (12) osidiques, molecules d'interet industriel. Une etude du metabolisme de la bacterie en presence de fructose, glucose et saccharose montre que la production de dextrane-saccharase par l. Mesenteroides est soumise a un systeme complexe de regulation faisant intervenir le saccharose (inducteur) et le fructose (regulation negative). De ce fait, il est difficile d'ameliorer le titre final d'activite dextrane-saccharase obtenu par les techniques couramment employees. D'autres methodes, inspirees par l'etude metabolique, sont donc mises au point: l'utilisation de glucose comme co-substrat du saccharose permet ainsi de doubler la quantite d'enzyme produite. Par ailleurs, l'etude du metabolisme du glucose et du fructose revele la presence d'une nouvelle dextrane-saccharase minoritaire, non induite par le saccharose. Les deux formes enzymatiques de la dextrane saccharase (dss soluble et dsi insoluble) produites sur saccharose sont concentrees et caracterisees. Un plan d'experience permet ensuite de determiner les conditions optimales de synthese d'(12) oligosides avec l'enzyme dsi libre. Les produits sont purifies par chromatographie, puis analyses par spectrometrie de masse et rmn du carbone 13. Un modele cinetique des premieres etapes de la reaction est etabli, qui permet de predire les performances de la reaction de synthese de l'oligoside panose (dp 3), avec l'enzyme utilisee en reacteur a lit fixe. Enfin, l'enzyme est encapsulee dans des billes d'alginate. L'efficacite maximale d'immobilisation est obtenue avec de faibles teneurs en alginate, avec une activite specifique de 4 u/g de support. Mais, la reaction est affectee par des problemes de diffusion interne, qui modifient le comportement enzymatique et rendent la synthese d'(12) oligosides moins efficace qu'avec l'enzyme dsi libre. Ce phenomene est accru lorsque l'enzyme est utilisee en reacteur a lit fixe, par l'apparition de problemes de diffusion externe, quelle que soit la configuration de reacteur envisagee
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Euzenat, Olivier. "La lévane-saccharase de Bacillus subtilis : production, purification et application à la synthèse de lévanes et de fructooligosides." Toulouse, INSA, 1994. http://www.theses.fr/1994ISAT0052.
Full textAbstract:
La levane-saccharase de bacillus subtilis catalyse le transfert de residus fructosyle a partir du saccharose. Les produits de cette enzyme, les levanes, sont des polymeres ramifies pouvant contenir plusieurs centaines de milliers de residus fructosyle. Nous avons optimise la production de l'enzyme en fermenteur par modification du milieu et des conditions de la culture cellulaire. La mise au point d'une methode de purification de la levane-saccharase nous a ensuite permis d'effectuer une etude cinetique de l'enzyme lors de laquelle l'effet inhibiteur du glucose a ete demontre, ainsi que l'effet activateur des courts fructooligosides. Nous avons egalement realise des syntheses de levanes en faisant varier la concentration initiale du saccharose ou la temperature de reaction. Ces syntheses ont ete realisees a partir de l'enzyme libre ou de sa forme immobilisee sur differents supports solides. Elles ont montre que l'enzyme immobilisee permettait d'obtenir un meilleur rendement en levanes que l'enzyme libre, par diminution de l'importance de l'hydrolyse (transfert de fructosyle sur une molecule d'eau). Par contre, les levanes produits par l'enzyme immobilisee ont des degres de polymerisation beaucoup plus importants que ceux obtenus avec la levane-saccharase sous forme libre. Ceci entraine une gelification du milieu, sauf dans des solutions de haute force ionique. En outre, l'enzyme immobilisee est difficilement reutilisable par suite d'une obstruction de ses pores par les levanes. Nous avons par ailleurs realise la separation des levanes et des autres constituants du milieu reactionnel par chromatographie et recherche des techniques de caracterisation des produits de l'enzyme. Enfin, nous avons produit des solutions a haute teneur en fructose par l'utilisation conjointe de la levane-saccharase de bacillus subtilis, de la glucose-isomerase d'actinoplanes missouriensis et de la fructosyl-transferase d'aspergillus niger, l'hydrolyse des produits etant effectuee par un melange d'inulinases
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Chantret, Isabelle. "Régulation de l'expression de la saccharase-isomaltase humaine dans des cellules cancéreuses coliques en culture rôle répresseur du glucose ? /." Grenoble 2 : ANRT, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb37612512f.
Full text
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SCOTTI, PIER ARNALDO. "Etude de la production et de l'adressage de la levane saccharase de bacillus subtilis dans la levure saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 1995. http://www.theses.fr/1995PA112148.
Full textAbstract:
La levane saccharase de bacillus subtilis est une transfructosylase secretee durant la phase exponentielle de croissance selon un mecanisme a deux etapes dans lequel la flexibilite conformationnelle intrinseque de la proteine jouerait un role important. Ces proprietes liees a la structure de la partie mature ont-elles une implication dans la secretion heterologue ? afin de determiner le role respectif de la sequence signal et de la partie mature dans les mecanismes de secretion heterologue, mais aussi afin de determiner les effets eventuels de la n-glycosylation sur l'activite enzymatique, nous avons exprime le gene de structure de la proteine dans la levure saccharomyces cerevisiae. La sequence signal de la levane saccharase ainsi que celles d'exoproteines de s. Cerevisiae (phosphatase acide et invertase) couplees a la partie mature de la proteine ne lui permettent pas d'entrer dans la voie de secretion de la levure. La sequence signal de l'alpha-amylase de bacillus amyloliquefaciens permet a la levane saccharase de penetrer dans la lumiere du reticulum endoplasmique ou elle est glycosylee. Le caractere plus hydrophobe de cette sequence signal pourrait etre responsable de cette translocation effective. La proteine heterologue n'est cependant pas secretee. La glycosylation a pour effet de diminuer l'activite polymerase de l'enzyme ainsi que de reduire l'efficacite de detection par les anticorps. La levane saccharase en l'absence de clivage de son extension n-terminale dans la levure est associee a la membrane cytoplasmique. La purification a l'echelle du milligramme de ce precurseur ainsi accumule nous a permis d'etudier sa cinetique de repliement. La presence de la sequence signal n'affecte pas la vitesse de repliement de la proteine. Cependant le processus de repliement du precurseur et celui de la forme mature pourraient avoir un cheminement different d'un point de vue moleculaire
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Chantret, Isabelle. "Regulation de l'expression de la saccharase-isomaltase humaine dans des cellules cancereuses coliques en culture : role represseur du glucose ?" Paris 6, 1988. http://www.theses.fr/1988PA066135.
Full text
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Vasseur, Monique. "Modèles cinétiques d'activation des enzymes en fonction du pH : concept de familles de protons : le modèle tétard de la saccharase intestinale." Paris 11, 1985. http://www.theses.fr/1985PA112323.
Full textAbstract:
La corrélation étroite entre l'activation de la saccharase intestinale de lapin (sucrose α-D-glucohydrolase, EC. 3. 2. 1. 48) par le Na⁺ et l'activation par déprotonation de l'enzyme dans la zone de pH 4. 8 à 7. 2 a conduit à la formulation d'un modèle cinétique, le Modèle II ( Vasseur, 1982). Ce modèle fait le lien entre le modèle allostérique, indépendant du pH, le Modèle I (Alvarado, 1974), et les modèles classiques, dépendants du pH, de Michaelis, Alberty, Dixon ou Cleland, excepté que l'activation de la saccharase, au-dessous de pH 7, est liée à la perte simultanée de deux protons clés (pK₁ = 5. 7). Le modèle II, édifié essentiellement sur la base des modèles classiques, s'est révélé insuffisant pour expliquer l'effet antagoniste du Na⁺ (ou du substrat) avec lin seul des deux protons clés, un proton, Hₓ, se comportant comme un inhibiteur compétitif. L'autre proton, Hy, est responsable de l'activité catalytique. Nous proposons que les deux protons impliqués dans pK₁ jouent un rôle fonctionnel distinct et appartiennent à deux familles différentes: la famille K et la famille V, responsables respectivement des effets sur l’affinité et sur la capacité. Si Hₓ se fixe ou non, l'enzyme oscille entre deux formes ayant des propriétés de liaison différentes vis à vis des deux coactivateurs allostériques. L'effet des métaux alcalins, Li⁺ et Na⁺, consiste à déplacer cet équilibre. A faibles concentrations, ils facilitent la déprotonation de l'enzyme, donnant une activation de type K. Au contraire, à fortes concentrations, ils favorisent la reprolonation de l'enzyme causant une inhibition compétitive pure. Aussi, pour expliquer les mécanismes moléculaires d'activation et/ou d'inhibition de la saccharase par les métaux alcalins dans la zone de pH 4. 8 à 8. 8, nous proposons un modèle cinétique complet, le Modèle TETARD, qui considère la fonction et le nombre (3) des protons clés de l'enzyme. Contrairement aux concepts classiques d'activation des enzymes en fonction du pH, le modèle' têtard inclut la participation simultanée des deux familles de protons, V et K, dans la même réaction d'ionisation. Afin de généraliser, nous proposons que chaque famille de protons puisse contenir un ou plusieurs protons liés fonctionnellement qui sont perdus (ou gagnés) comme un seul bloc. Puisque, en principe, une enzyme possède deux pK caractéristiques et que chacun de ces pK peut contenir un maximum de deux familles de protons, nous obtenons un modèle à quatre familles de protons, le Modèle PAPILLON, qui peut servir de base à la construction de la plupart des modèles enzymatiques. Ce modèle peut générer des modèles-fils, le plus simple étant celui décrit par Michaelis et Davidsohn où seulement 2 familles de protons sont visibles au 11eu des 4 théoriquement possibles. Nous décrivons une méthode mathématique générale capable de donner directement l'équation globale décrivant pratiquement tous les modèles enzymatiques; cette équation est, de plus, directement adaptable pour le traitement global des résultats par ordinateurThe close relationship between sodium-dependent activation of rabbit intestinal sucrase (sucrose α-D-glucohydrolase, EC. 3. 2. 1. 48 ) and activation by enzyme deprotonation in the pH range 4. 8 to 7. 2 led us to build a kinetic model, Model II (Vasseur, 1982), derived in turn from an earlier pH-independent allosteric model, Model (Alvarado, 1974). Ln principle, Model II resembles the one first proposed by Alberty for anion and H⁺-dependent enzyme activation, except that formation of the active species involves loss of two protons rather than one ( pK₁ = 5. 7). Model Il, essentially based on classical models of Michaelis, Dixon or Cleland, does not explain fully the peculiar antagonistic relationship between Na⁺ (or the substrate) and one single key proton, Hₓ, which behaves as a fully competitive inhibitor. The second proton, Hy, is responsible for changes in enzyme catalytic activity. We postulate, therefore, that the two protons involved in pK₁ are functionally distinguishable and belong to two different families: the K family and the V family, responsible for affinity and capacity-type effects, respectively. Depending on whether Hₓ is bound or not, the enzyme alternates between two distinct forms exhibiting quite different binding properties. The alkali-metal ions Na⁺ and Li⁺ have a concentration-dependent dual effect on this equilibrium. At low concentrations, they facilitate the release of Hₓ, resulting in K-type activation. On the contrary, at higher concentrations they favor enzyme reprotonation, causing K-type (fully competitive) inhibition. To explain the molecular mechanisms underlying the complex activatory and inhibitory effects of the alkali-metal ions in the pH range 4. 8 to 8. 8, we propose a complete sucrase model, the Tetard (Tadpole) , which considers both the function and the number (three) of key protons participating. In contrast to classical concepts on pH-dependent enzyme activation, the Tetard model considers the participation of two proton families, V and K, in the same ionization reaction. Generalizing, we propose that a proton family consists of one or several protons that perform the same kinetic function and are either gained or lost as a bloc. Because all enzymes exhibit in principle two characteristic pK values, and since each of these pK values may involve a maximum of two proton families, we obtain, as a result, a four-proton-families general model, the Papillon (Butterfly), which should be able to explain any enzyme mechanism. By introducing appropriate simplifications, this model can generate any of a series of better known models, the simplest one of which is the classical Michaelis- Davidsohn one, where only two proton families are experimentally demonstrable instead of the theoretical four. We also describe a general mathematical treatment capable of yielding directly the global equation describing practically any enzyme, an equation which, furthermore, is readily adaptable for computer analysis
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Fabre, Emeline. "Caractérisation de la dextrane-saccharase DSR-E de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 et application à la synthèse de composés prébiotiques." Toulouse, INSA, 2004. http://www.theses.fr/2004ISAT0043.
Full textAbstract:
La dextrane-saccharase DSR-E de L. Mesenteroides NRRL B-1299, appartenant à la famille 70 des glycoside-hydrolases, se distingue sur le plan fonctionnel par sa capacité à synthétiser à la fois des liaisons glucosidiques de type a-1,6 et a-1,2 (ces dernières étant rares dans la nature). Cette propriété est mise en évidence par la synthèse d'un dextrane hautement ramifié à partir de saccharose, et est conservée lors de la production de glucooligosaccharides (GOS) en présence de maltose. Sur le plan structural, DSR-E est unique car elle possède deux domaines catalytiques (CD1 et CD2), séparés par un domaine de liaison au glucane (GBD). De plus, CD2 se distingue du fait de la présence de peptides originaux situés dans les régions catalytiques, habituellement très conservées. L'objectif de ce travail de thèse était la compréhension des rôles respectifs du CD1 et du CD2 dans la catalyse et la spécificité de l'enzyme. Pour y parvenir, plusieurs formes délétées du gène dsrE ont été clonées et exprimées chez E. Coli. La caractérisation structurale des produits (dextrane ou GOS) synthétisés par les enzymes correspondantes a révélé que le CD1 est spécifique de la synthèse de liaisons -1,6 alors que le CD2 ne synthétise que des liaisons de type -1,2. Ces études de structure/fonction ont permis de générer la forme GBD-CD2, nouvelle transglucosidase exempte de la capacité de polymérisation, et hautement spécialisée dans la synthèse de liaisons -1,2. Cette enzyme est capable de produire 90% (p/p) d'-1,2 GOS, alors que dans le cas de l'activité sauvage, ceux-ci sont produits dans les mêmes proportions que les -1,6 GOS (p/p). Les -1,2 GOS possèdent des propriétés prébiotiques et préviennent l' " intolérance au glucose ", symptôme précoce du diabète de type II. Concernant la synthèse de dextrane, le CD2 est responsable de la formation de points de ramification, selon un mécanisme ping-pong bi-bi. De plus, l'action concertée des deux domaines catalytiques, produits de façon dissociée et liés au GBD, permet de synthétiser une nouvelle structure de polymère en peigne, présentant 50% de liaisons -1,2The activity of the dextransucrase DSR-E from L. Mesenteroides NRRL B-1299, belonging to the glycoside-hydrolase family 70, is highly original, catalysing the syntheses of both a-1,6 and a-1,2 glucosidic linkages. This property is shown by the production, from sucrose, of a highly branched dextran, and also by the syntheses of glucooligosaccharides (GOS) in the presence of maltose. Moreover, DSR-E is unique in its enzymatic family, possessing two catalytic domains (CD1 and CD2), separated by a long Glucan Binding Domain (GBD). In order to understand the role of each domain, several truncated forms of DSR-E were produced in E. Coli. The structural characterization of the products revealed that CD1 is specific for the synthesis of -1,6 linkages, CD synthesizing only -1,2 linkages. The newly constructed GBD-CD2 is a transglucosidase highly specialized for the synthesis of -1,2 linkages, able to produce 90% (p/p) of -1,2 GOS, whereas the native activity leads to the synthesis of 50% of -1,6 GOS (w/w) and 50% of -1,2 GOS (p/p). -1,2 GOS possess a prebiotic activity and prevent the glucose sensitivity, first symptom of diabetes. Moreover, CD2 is responsible for the formation of -1,2 ramification points into the dextran structure, following a ping-pong bi-bi kinetic model. Finally, the concerted action of the two catalytic domains, dissociated but linked to GBD, permits the synthesis of a novel structure of glucan, possessing 50% of -1,2 linkages, reassembling a comb
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Moulis, Claire. "Ingénierie rationnelle de la dextrane-saccharase DSR-S : compréhension du mécanisme de polymérisation pour la synthèse de dextranes de taille contrôlée." Toulouse, INSA, 2006. http://www.theses.fr/2006ISAT0037.
Full textAbstract:
La dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyse à partir de saccharose la synthèse d’un polymère d’unités glucosyle appelé dextrane, dont plus de 95% des liaisons sont de type alpha-1,6. Ce polysaccharide trouve diverses applications, essentiellement dans la formulation de composés pharmaceutiques, mais aussi comme support de chromatographie et depuis peu comme agent texturant. L’objectif de cette thèse était d’approfondir l’étude des relations structure-fonction de cette dextrane-saccharase, afin de construire par ingénierie rationnelle des catalyseurs produisant des dextranes de taille, de structure et donc de propriétés physico-chimiques contrôlées. L’expression hétérologue du gène dsrS dans E. Coli a été améliorée d’un facteur 30. Une forme tronquée a été construite de manière à pouvoir purifier le catalyseur à homogénéité et disposer, pour la première fois, d’une préparation pure de dextrane-saccharase spécifique des liaisons alpha-1,6. Un suivi cinétique de la synthèse de dextrane nous a permis de mettre en évidence la formation de produits de taille intermédiaire au cours de la réaction, dont la concentration et la taille augmentent au cours du temps. Un mécanisme de polymérisation de type « semi-processif » n’impliquant qu’un seul site actif pour l’élongation des dextranes peut donc être aujourd’hui proposé, mettant fin à une trentaine d’années de polémiques. Enfin, l’identification de déterminants structuraux impliqués dans ce mécanisme nous a permis de construire des formes tronquées synthétisant en une seule étape et avec des rendements très avantageux (de 69 à 75 %) les dextranes de 10 000 et 40 000 Da les plus utilisés à l’heure actuelle. Le motif minimal de DSR-S responsable de l’affinité pour le dextrane a également été identifié, et la potentialité d’utiliser ce peptide comme étiquette d’affinité pour des purifications sur gel Sephadex® évaluéeDextransucrase (DSR-S) from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyses from sucrose the synthesis of a polymer of D-glucosyl units called dextran, in which more than 95 % of the glucosyl units are a-1,6 linked. This polysaccharide has diverse applications, essentially for pharmaceutical compound formulations, but also as chromatographic support and more recently as texturing agent. The objective of the study was to improve our knowledge on the DSR-S structure-function relationships, in order to design new enzymes producing dextrans of controlled size, structure and physico-chemical properties. Heterologous expression of the dsrS gene by E. Coli was optimised and the design of a truncated form allowed for the first time the high level purification of a dextransucrase specific for the a-1,6 linkage synthesis. A detailed characterization of the first steps of the polymer formation highlighted the formation of products of intermediate size during the reaction, for which the concentration and average molecular weight increase versus time. A “semi-processive” mechanism of polymerization, involving only one catalytic site for the chain elongation by their non-reducing extremity can thus be proposed. Finally, the identification of structural determinants involved in this process allowed the construction of truncated forms which synthesize, in only one step and with advantageous yields (69 to 75 %), the 10,000 and 40,000 Da dextrans the most widely used today
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Claverie, Marion. "GH70 dextransucases : Insights on the molecular determinants of dextran molar mass control." Thesis, Toulouse, INSA, 2017. http://www.theses.fr/2017ISAT0037/document.
Full textAbstract:
Les glucane-saccharases (GS) de la famille GH70 sont des enzymes produites par certaines bactéries lactiques. A partir de saccharose, substrat renouvelable et peu coûteux, elles sont capables de catalyser la synthèse d’α-glucanes, homopolysaccharides dont les propriétés diffèrent suivant la spécificité de l’enzyme (taille, type de liaisons α-osidiques, degrés de branchement). Les glucanes contenant une très grande majorité de liaisons α-(1,6), appelés dextranes, présentent de nombreuses applications industrielles qui dépendent principalement de leur taille. Cependant, la synthèse directe de dextranes de taille contrôlée (de 1 à plusieurs millions de kg/mol) avec une faible polydispersité et en utilisant une seule enzyme n’est encore pas envisageable. En effet, les mécanismes moléculaires mis en jeu pour le contrôle de la taille des polymères produits n’ont encore été que peu explorés. Dans ce contexte, deux GSs ont été sélectionnées. La première, DSR-M synthétise uniquement des dextranes de faible masse molaire (MM) (28 kg/mol) exclusivement composés de liaisons α-(1,6). A contrario, le second modèle, DSR-OK produit le plus long dextrane décrit à ce jour (>109 g/mol). La caractérisation biochimique et structurale ainsi que la construction de mutants ont permis l’exploration du mode d’action de ces deux candidats. Plusieurs structures 3D de DSR-M2 (forme tronquée de DSR-M) - sans ou en complexe avec son substrat ou ses produits (isomaltotetraose) - ont été résolues. C’est la première fois que de tels complexes sont décrits et l’une de ces structures présente le domaine V le plus complet décrit à ce jour. L’analyse de ces structures couplée au suivi cinétique de la synthèse du polymère ont montré que la spécificité de DSR-M pour la synthèse de dextranes courts s’explique par un mode d’élongation distributif dû à la faible affinité de deux poches à sucre de son domaine V envers la chaîne en cours de synthèse. Des analyses RMN (15N1H – HSQC) – jamais réalisées auparavant sur une protéine si grosse – ont également étayé l’importance de la présence de résidus aromatiques dans le domaine catalytique pour la synthèse de dextranes supérieurs à 2 kg/mol. En comparaison, la synthèse de dextranes de haute MM par DSR-OK est principalement due au plus grand nombre de poches à sucre de son domaine V, permettant d’assurer une meilleure interaction avec la chaîne en cours d’élongation. L’implication de ces poches dans la détermination de la taille du dextrane a été montrée pour les deux candidats. Leur fonctionnalité est fortement liée à la présence d’un résidu aromatique de stacking, et leur répartition le long du domaine V a aussi une influence. L’ensemble de ces résultats démontre la coopération du domaine V avec le domaine catalytique pour l’élongation des dextranes, tout en offrant de nouvelles perspectives pour approfondir la compréhension de ce mécanisme. Ils offrent également des stratégies prometteuses pour l’ingénierie d’enzyme de la famille des GH70 pour la modulation de la taille des glucanesGlucansucrases (GS) from glycoside hydrolase family 70 (GH70) are -transglucosylases produced by lactic acid bacteria. From sucrose, an economical and abundant agro resource, they catalyze the polymerization of glucosyl residues. Depending on the enzyme specificity, α-glucans vary in terms of size, types of glucosidic bonds and degree of branching and have found multiple industrial applications mainly related to their molar mass (MM). However synthesizing polymers of controlled size with average MM ranging from 1 kg/mol to several millions g/mol and low polydispersity using one single enzyme remains challenging. Indeed, the molecular mechanisms underpinning the control of polymer size have been scarcely explored. To tackle this question, two GSs producing dextran (glucan composed of a majority of α-(1,6) linkages) were selected, and their mode of action explored via biochemical and structural analyses coupled to mutagenesis. The first enzyme selected, called DSR-M synthesizes only low molar mass (LMM) dextran (28 kg/mol) exclusively composed of -(1→6) linkages without any trace of HMM dextran (105 to 108 g/mol). In contrast, DSR-OK (second model), produces the highest MM dextran (>109 g/mol) described to date. Several 3D crystallographic structures of a truncated form of DSR-M (DSR-M2), either free or in complex with its substrate or product (isomaltotetraose) in the domain V or in the active site were solved. Such complexes were never obtained before. Noteworthy, one structure encompassed the most complete domain V reported to date. Analyses of these structures coupled to dextran synthesis monitoring, showed that the LMM dextran specificity of DSR-M2 is explained by a distributive elongation mode due to the weak affinity of its two sugar binding pockets in the domain V which interact with the growing dextran chains and allow the synthesis of dextran longer than 16 kg/mol. 15N1H NMR analyses (HSQC), for the first time performed with such a big protein, further revealed the crucial role of aromatic residues in the catalytic domain for the production of dextran from 2 to 16 kg/mol. In comparison, synthesis of HMM dextran by DSR-OK was shown to be mainly due to the sugar binding pockets of its domain V, ensuring much stronger interactions with growing dextran chains. The role of these pockets was evidenced for both enzymes, their functionality proposed to be linked to the presence of one aromatic stacking residue. Their positioning along domain V relatively to the active site is also important to promote efficient binding. All these findings highlight the cooperation between domain V and the catalytic domain for dextran elongation, offer new perspectives to acquire a deeper knowledge on this interplay and open promising strategies for GH70 enzyme engineering aiming at modulating glucan size
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RODOLOSSE, ANNIE. "Repression de la transcription du gene de la saccharase-isomaltase humaine par le glucose dans la lignee d'adenocarcinome colique humaine caco-2." Paris 7, 1998. http://www.theses.fr/1998PA077137.
Full textAbstract:
La saccharase-isomaltase (si) est une disaccharidase qui n'est exprimee, chez l'adulte, que dans la membrane en bordure en brosse de l'intestin grele. Elle est toutefois detectee dans le colon foetal, de facon transitoire, dans des cancers coliques et dans des lignees d'adenocarcinomes coliques en culture parmi lesquelles la lignee caco-2. Dans cette lignee, nous avons pu montrer que l'expression de la si est soumise a une regulation negative par le glucose s'exercant au niveau transcriptionnel. L'obtention de variants metaboliques issus du clonage de la lignee caco-2 nous a permis de proceder a l'etude des mecanismes moleculaires intervenant dans cette regulation. Nous avons mis en evidence, lors de l'analyse du promoteur du gene de la si, que la region (-370/+30) suffit a conferer la reponse au glucose a un gene heterologue. Outre les elements sif2 et sif3 deja caracterises dans cette region, nous avons identifie un troisieme site de liaison aux proteines hnf-1 que nous avons appele sif4. Comme nous l'avons determine par une etude fonctionnelle, les sites de liaison a hnf-1 sont necessaires a la repression du promoteur de la si par le glucose. Sur la base de resultats obtenus en retard sur gel, nous suggerons que la liaison differentielle des isoformes de la famille hnf-1, en particulier de vhnf-1c, constitue un mecanisme moleculaire de regulation de l'expression de la si par le glucose. Par ailleurs, nous avons montre que, en amont de ce mecanisme, la glycolyse est la voie metabolique determinante par laquelle s'exerce l'effet represseur du glucose sur l'expression de la si dans nos modeles cellulaires.
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Albenne, Cécile. "Ingénierie rationnelle de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea : de la structure tri-dimensionnelle aux bases moléculaires de la catalyse." Toulouse, INSA, 2002. http://www.theses.fr/2002ISAT0036.
Full textAbstract:
L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase de la famille 13 des glycoside-hydrolases qui utilise le saccharose pour synthétiser un homopolymère de type amylose et glucosyler très efficacement des accepteurs tels que le glycogène. L'obtention et l'analyse de complexes enzyme : substrat couplée à des expériences de mutagénèse dirigée, nous ont permis de montrer que la spécificité vis-à-vis du saccharose est conférée par des résidus du sous-site -1 (Asp144, Arg509, Tyr147 et Phe250). Les résidus du sous-site +1 (Asp394 et Arg446) assurent un positionnement correct des molécules acceptrices et sont responsables de la spécificité de synthèse mais aussi de rupture des liaisons a-1,4. En effet, nous avons révélé la capacité de l'AS à disproportionner efficacement les maltooligosaccharides de DP > 4, la présence d'un sous-site +4 fort (Arg415), associé à des sous-sites +1, +2 et +3 faibles (résidu Arg226 gênant), réduisant fortement l'accès au site actif des plus petites molécules. Une analyse approfondie des réactions catalysées en présence de saccharose seul nous a ensuite permis de démontrer que la formation du polymère résulte d'une élongation non-processive des maltooligosaccharides produits par l'AS, du côté de leur extrémité non-réductrice. Alors que les produits < DP4 sont accumulés du fait d'une fixation défavorable au niveau des sous-sites +1 à +3, la glucosylation des longues chaînes repose sur un arrimage performant au niveau de différents sites positionnés à la surface de l'enzyme. Enfin, un site secondaire, non catalytique, de fixation du saccharose a été révélé et pourrait être responsable du comportement cinétique atypique de l'AS, via de possibles modifications conformationnelles. Une étude de modélisation moléculaire a été initiée pour explorer l'éventualité d'une voie de passage pour le saccharose entre le site secondaire et le site actif. La modélisation a également permis de proposer une solution d'arrimage du glycogène, révélant une complémentarité de forme entre l'enzyme et cet accepteurAmylosucrase from Neisseria polysaccharea (AS) is a transglucosidase from family 13 of glycoside-hydrolases which uses sucrose to synthesize an amylose-like polymer and elongates acceptor molecules as glycogen. Enzyme-substrate complexe analyses associated to site directed mutagenesis experiments allowed us to show that residues of subsite -1 are responsible for the specificity towards sucrose (Asp144, Arg509, Tyr147, Phe250). Residues of subsite +1 (Asp394, Arg446) ensure a correct positionning of acceptor molecules and are responsible for the specificity of synthesis but also of cleavage of the a-1,4 linkage. Indeed, we have showed that AS is able to disproportionate efficiently maltooligosaccharides of DP > 4. A strong subsite +4 (Arg415), associated to weak subsites +1, +2 and +3 (Arg226), reduce the accessibility of small molecules to the active site. A deep analysis of the reactions catalysed from sucrose led us to demonstrate that polymer synthesis result from the non-processive elongation of maltooligosaccharides synthesised by AS, at the non-reducing end. Opposed to compounds of DP < 4 which are accumulated because of a weak binding at subsites +1, +2 and +3, longer molecules are efficiently glucosylated thanks to a strong binding at different sites situated on the surface of the enzyme. A non-catalytic sucrose binding site has been identified and should be responsible for the atypical kinetic behavior of AS, via conformationnal movements. A molecular modelling study was initiated to explore the trajectory of sucrose between this secondary sucrose binding site and the active site. Molecular modelling was also used to propose a solution of docking of glycogen, which reveal a groove complementary to a branch of glycogen on the surface of the enzyme
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Champion, Elise. "Glucane-saccharases optimisées pour la glucosylation de molécules intervenant dans la composition de vaccins." Toulouse, INSA, 2008. http://eprint.insa-toulouse.fr/archive/00000281/.
Full textAbstract:
La synthèse d’oligosides complexes et glycoconjugués reste difficilement réalisable par voie chimique, freinant ainsi l’exploitation de ces molécules à grande échelle. Le recours aux catalyseurs enzymatiques apparaît comme une alternative prometteuse mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates, en particulier sur le plan de leurs spécificités, pour être intégrées dans des voies de synthèse chimio-enzymatiques. Le défi de cette thèse a consisté à mettre à profit les techniques d’ingénierie enzymatique pour concevoir des glyco-enzymes déployant de nouvelles spécificités, produire à façon des intermédiaires de synthèse chimique et ouvrir la voie à de nouveaux procédés d’obtention d’oligosides d’intérêt thérapeutique. Il s’agissait de développer de nouvelles transglucosidases capables de glucosyler des dérivés de la N-acétyl-D-glucosamine et du L-rhamnose pour produire des disaccharides n’existant pas dans la nature mais pouvant entrer dans une voie de synthèse chimique destinées à synthétiser des haptènes oligosaccharidiques mimant les motifs antigéniques des lipopolysaccharides des sérotypes 1b et 3a de Shigella flexneri. A terme, l’objectif est de développer un vaccin multivalent de troisième génération contre ces pathogènes, responsables du décès de milliers de personnes chaque année dans le monde. Pour relever ce défi, nous avons tout d’abord évalué le potentiel de quatre glucane-saccharases sauvages, spécifiques de la synthèse de liaisons osidiques distinctes, à glucosyler les accepteurs cibles. Les résultats obtenus ont montré qu’aucune des enzymes testées ne catalysait efficacement la réaction attendue. Cette étude préliminaire a cependant permis de sélectionner l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, comme enzyme candidate au développement de biocatalyseurs à stéréo- et régio-spécificités contrôlées. Le remodelage du catalyseur a été guidé par l’analyse des modèles des complexes enzyme:accepteur. Sept acides aminés situés dans le site de fixation de l’accepteur (sous-site +1) ont été identifiés et individuellement remplacés par les 19 acides aminés possibles par mutagénèse dirigée. Une banque de 133 mutants a été créée qui renfermait 43 mutants d’intérêt pour les réactions de glucosylation considérées. Notamment, le mutant I228Y a révélé une toute nouvelle régio-spécificité vis-à-vis de l’α-methyl L-rhamnopyranose. Il s’agit du premier exemple de création de nouvelle spécificité pour les enzymes de cette famille et plus largement pour des α-transglycosidases. Le mutant F290K, également isolé dans cette première librairie, s’est montré capable de glucosyler l’α-allyl N-acétyl-D-glucoamine avec une efficacité catalytique 130 fois plus élevée que celle observée avec l’enzyme sauvage. Ces deux nouvelles enzymes ont été employées pour la synthèse des disaccharides ciblés et la validation de la voie chimio-enzymatique proposée pour la synthèse des haptènes saccharidiques. Cette stratégie a été poursuivie par la construction de banques de double-mutants permettant de générer une diversité plus importante, focalisée sur ces positions, et rechercher des effets synergiques entre les différentes mutations pour améliorer la réaction de glucosylation des accepteurs cibles. Vingt double-mutants ont pu être ainsi identifiésThe difficult access to complex carbohydrates and glycoconjugates by chemical synthesis impairs their development on a large scale. Therefore, the use of biocatalysts appears as an appealing alternative, yet poorly exploited in spite of the fast-growing development of engineering technologies allowing the search and the construction of better performing enzymes, displaying novel specificities. The objective of this thesis aimed to apply enzyme engineering techniques to conceive novel glyco-enzymes well-adapted for the glucosylation of naturally non- or poorly recognized molecules (N-acetyl-D-glucosamine and L-rhamnose derivatives fulfilling the subsequent chemical step requisites). The glucosylated motives obtained via the enzymatic route, and corresponding to the serotype-specific branched -D-glucopyranosyl linkages of Shigella flexneri 2a, 1b and 3a, are subsequently elongated through a chemical synthetic pathway to synthesize the antigenic oligosaccharides. This chemo-enzymatic road could open the way to oligosaccharide haptens at low cost, that could in the future be used in the development of a third-generation vaccine against S. Flexneri 1b and 3a. In a first study, we have evaluated the potential of four wild-type glucansucrases, specific for the synthesis of distinct osidic linkages, to glucosylate both types of targeted acceptors. Our preliminary results demonstrated that none of the tested glucansucrases allowed an efficient glucosylation of the target acceptors with the desired linkage specificity. On the basis of these results, amylosucrase from Neisseria polysaccharea was chosen as a candidate enzyme for the development of biocatalysts with controlled stereo- and regio-specificities that could enable the glucosylation of both types of acceptors of interest. A semi-rational approach based on the engineering of the acceptor binding site (subsite +1) was undertaken to evolve this enzyme. By individually exploring 7 positions of the active site using site-directed mutagenesis, the strategy led to the isolation of 47 mutants of interest for the considered glucosylation reactions (over the 133 generated mono-mutants) and to the identification of 2 key positions (228 and 290). Noteworthy, I228Y mutant displayed an entirely novel regio-specificity towards the -methyl L-rhamnopyranose and in the presence of allyl N-acetyl-D-glucosamine, F290K mutant permitted a 130 fold enhancement of catalityc efficiency compared to wild-type amylosucrase. This strategy was further pursued with the construction of double-mutant libraries enabling the generation of an enlarged diversity, focused on the identified positions, to investigate the synergistic effects between the different mutations in order to improve the glucosylation reactions of the target acceptors. Twenty double-mutants were thus identified
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Brison, Yoann. "Contribution à la compréhension du mécanisme de formation de dextranes ou gluco-oligosaccharides ramifiés en alpha-1,2 par l'enzyme GBD-CD2 : études cinétique et structurale." Thesis, Toulouse, INSA, 2010. http://www.theses.fr/2010ISAT0035/document.
Full textAbstract:
Issue de la troncature de la dextrane-saccharase DSR-E, l’alpha-(1→2) transglucosidase recombinante GBD-CD2 catalyse à partir de saccharose le branchement de molécules acceptrices tels que les dextranes, les isomalto-oligosaccharides ou les gluco-oligosaccharides (GOS ; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, avec 1GBD-CD2 is a recombinant alpha-(1→2) transglucosidase constructed by truncation of the DSR-E dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. From sucrose, GBD-CD2 catalyses the alpha-(1→2) branching reaction onto acceptor molecules such as dextrans, isomalto-oligosaccharides or gluco-oligosaccharides (GOS; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, 1
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Beckmann, Klaus. "Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2009. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-ds-1229009550108-61973.
Full textAbstract:
Der erste Teil der Dissertation behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche im Honig ausgehend von der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach Einsatz als Bienenvertreibungsmittel vorliegen kann. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass der Gehalt an Phenylalanin sowie äußere Bedingungen, denen Honige ausgesetzt sind, für die Konzentration an Phenylacetaldehyd maßgebend sind. Diese Parameter müssen mindestens bekannt sein, um entscheiden zu können, ob Phenylacetaldehyd als Rückstand im Honig vorliegt. Der zweite Teil befasst sich mit der Filtration von Honig, welche in manchen Ländern durchgeführt wird, um eine Kristallisation zu herauszuzögern. Es wurde eine Methode entwickelt, um illegale Beimischungen gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen nachzuweisen. Dazu wird das Enzym Saccharase gelchromatographisch isoliert und diese Fraktion elektrophoretisch untersucht. Die Veränderung des Proteinspektrums lässt sich mit Hilfe einer densitometrischen Auswertung quantifizieren und zeigt gefilterten Honig auch in Mischungen bis zu einem Anteil von mindestens 15 % an.
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Grybaitė, Aušra. "DIRVOS BIOAKTYVUMO IR PIKTŽOLIŲ PLITIMO TYRIMAI SKIRTINGO TANKUMO VASARINIŲ RAPSŲ AGROCENOZĖSE." Master's thesis, Lithuanian Academic Libraries Network (LABT), 2006. http://vddb.library.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2006~D_20060609_110947-63859.
Full textAbstract:
Investigation of soil bioactivity and weed infestation in spring oilseed rape agrocoenosis of different density
Aušra Grybaitė
Field experiments were carried out in 2004 and 2005 at the Experimental Station of Lithuanian University of Agriculture to study the influence of different spring oilseed rape (Brassica napus L.) ‘Sponsor’ densities (50.1-100, 100.1-150, 150.1-200, 200.1-250, 250.1-300, 300.1-350, 350.1-400, 400.1-450 plants m-2) on soil bioactivity and weed infestation. Soil - Calc(ar)i-Endohypogleyic Luvisol.
By increasing of spring oilseed rape crop urease activity in the soil didn’t chage significantly. The saccharase activity in the rape agrocoenosis with density more than 150.1 plants m-2 significantly increased in comparison with saccharase activity in the thinest rape agrocoenosis. The content of humus (r = 0.73, P < 0.05) and available phosphorus (r = 0.71, P < 0.05) influenced the saccharase activity.
Spring oilseed rape crop density had no influence on number of weed species, weed sprouts and weed density before harvest. Efficiency of weed suppressing increased when weed density in crop at 3-4 leaves stage increased. This proved the small similarity indexes of weed density in crop at 3-4 leaves stage and before harvest. Rape crop density had no influence on weed species change. Significant negative relationship was found between weed air-dry biomass and rape crop density (r = -0.82, P < 0.01).
Most of weeds in rape crop were therophytes. Most of them... [to full text]
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Beckmann, Klaus. "Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig." Doctoral thesis, Technische Universität Dresden, 2008. https://tud.qucosa.de/id/qucosa%3A23742.
Full textAbstract:
Der erste Teil der Dissertation behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche im Honig ausgehend von der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach Einsatz als Bienenvertreibungsmittel vorliegen kann. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass der Gehalt an Phenylalanin sowie äußere Bedingungen, denen Honige ausgesetzt sind, für die Konzentration an Phenylacetaldehyd maßgebend sind. Diese Parameter müssen mindestens bekannt sein, um entscheiden zu können, ob Phenylacetaldehyd als Rückstand im Honig vorliegt. Der zweite Teil befasst sich mit der Filtration von Honig, welche in manchen Ländern durchgeführt wird, um eine Kristallisation zu herauszuzögern. Es wurde eine Methode entwickelt, um illegale Beimischungen gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen nachzuweisen. Dazu wird das Enzym Saccharase gelchromatographisch isoliert und diese Fraktion elektrophoretisch untersucht. Die Veränderung des Proteinspektrums lässt sich mit Hilfe einer densitometrischen Auswertung quantifizieren und zeigt gefilterten Honig auch in Mischungen bis zu einem Anteil von mindestens 15 % an.
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Daude, David. "Molecular evolutionary perspectives of amylosucrases : from natural substrate promiscuity to tailored catalysis." Thesis, Toulouse, INSA, 2013. http://www.theses.fr/2013ISAT0036/document.
Full textAbstract:
La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzymeInvestigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme
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BEZZATE-NAIRI, BEZZATE SAMIRA. "Etude genetique de bacillus polymyxa : caracterisation de deux genes impliques dans le metabolisme des fructanes, analyse preliminaire du role de la levane-saccharase dans le processus de colonisation de la rhizosphere du ble." Paris 11, 1994. http://www.theses.fr/1994PA112385.
Full textAbstract:
Afin d'analyser le role du levane, produit par bacillus polymyxa, dans le processus de colonisation de la rhizosphere du ble, nous avons construit par genetique inverse une souche derivee de b. Polymyxa cf43 mutee dans le gene de structure de la levane-saccharase, sacb. Celui-ci a d'abord ete clone et sequence. Il code pour une proteine de 499 acides amines qui presente 65% d'identite avec levane-saccharase (ls) de bacillus subtilis et une similarite notable avec d'autres fructosyltransferases. La ls de b. Polymyxa est exocellulaire et sa synthese est inductible par le saccharose. Le gene sacb de b. Polymyxa a ete inactive in vitro par insertion d'une cassette cat de resistance au chloramphenicol, puis transfere par conjugaison depuis e. Coli vers b. Polymyxa. Les transconjugants dans lesquels la copie sauvage chromosomique de sacb a ete remplacee par la copie mutee par recombinaison homologue ont ete reperes en selectionnant directement pour la resistance au chloramphenicol. La souche sacb'::cat de b. Polymyxa a ete analysee pour sa capacite a s'attacher aux racines de ble, mais aucun effet direct de la ls n'a pu etre mis en evidence par les tests utilises. Le gene lela de b. Polymyxa cf43, codant pour une activite saccharolytique, a ete isole a partir d'une bibliotheque genomique de b. Polymyxa criblee chez b. Subtilis. Ce gene a ete sequence ; il code pour une proteine de 512 acides amines qui presente 54% d'identite avec la levanase de b. Subtilis et une similarite notable avec d'autres fructanases et saccharases. Contrairement a la levanase de b. Subtilis, lela ne possede pas de sequence signal canonique. Nous avons montre que, outre le saccharose, lela est capable d'hydrolyser le levane et l'inuline. Ceci confirme que lela est une fructanase. Le gene lela chromosomique de b. Polymyxa a ete inactive par genetique inverse. Ce mutant n'est cependant pas affectee dans l'utilisation du levane ou de l'inuline comme seule source de carbone
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Guerin, Frederic. "Caractérisation structurale et fonctionnelle d'amylosaccharases." Thesis, Toulouse, INSA, 2012. http://www.theses.fr/2012ISAT0016/document.
Full textAbstract:
Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytiqueAmylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process
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Irague, Romain. "Ingénierie des glucane-saccharases de la famille 70 des glycoside-hydrolases pour la synthèse de nouveaux biopolymères." Thesis, Toulouse, INSA, 2011. http://www.theses.fr/2011ISAT0043/document.
Full textAbstract:
Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d’unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1→2) ; alpha (1→3) ; alpha (1→4) ou alpha (1→6)] que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d’élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d’un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1→6) et 5 % alpha (1→3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d’un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1→3) par rapport à l’enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d’identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l’aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentationGlucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1→2); alpha (1→3); alpha (1→4) or alpha (1→6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1→6) and 5 % alpha (1→3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1→3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation
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LELOUP, LAURENCE. "Mecanisme de secretion proteique chez bacillus subtilis : 1) approche quantitative du role de seca dans le processus de secretion de l'-amylase et de la levane saccharase, 2) caracterisation de l'etape cinetiquement limitante de la secretion de la levanase." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA112404.
Full textAbstract:
Cette these est consacree a la caracterisation du mecanisme de secretion proteique chez b. Subtilis. Il a ete montre au laboratoire que la levane saccharase et l'-amylase, deux exoenzymes natifs de b. Subtilis, sont secretes selon un mecanisme a deux etapes caracterisees temporellement et topologiquement. La premiere etape qui correspond a la translocation membranaire etant beaucoup plus rapide pour l'-amylase, j'ai explore l'hypothese qu'un des elements de la machinerie de secretion, seca, pouvait presenter une affinite differentielle pour les precurseurs de ces deux proteines. La modulation du niveau cellulaire de seca fonctionnelle a ete realisee en inhibant par l'azoture de sodium son activite atpase, en utilisant un mutant thermosensible et en surexprimant sa synthese. L'etablissement de correlations precises entre le niveau de seca et l'efficacite de secretion de chaque proteine ont permis d'evaluer des affinites tres differentes. Cette affinite differentielle pourrait permettre une adaptation du fonctionnement de l'appareil de secretion aux differentes phases du cycle cellulaire de b. Subtilis. La seconde etape du mecanisme de secretion correspond a la liberation des proteines matures dans le milieu exocellulaire. Cette etape est cinetiquement limitante pour les deux proteines et est etroitement associee a leur repliement. Le calcium, catalyseur de ce repliement, est present a concentration importante dans l'espace parietal. J'ai complete la caracterisation de cette etape pour l'-amylase en montrant avec des protoplastes que l'integralite de la paroi est indispensable pour en assurer l'efficacite. Enfin j'ai montre que la levanase, autre exoenzyme natif de b. Subtilis, etait secrete selon le meme mecanisme. Ce troisieme modele proteique a permis d'etablir clairement que la vitesse de l'ultime etape de secretion, qui implique la traversee de la paroi, est independante de la masse moleculaire de l'exoproteine mais correlee a sa vitesse de repliement.
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Römer, Ulrike. "Charakterisierung und Anwendung der rekombinanten Saccharose- Synthase-1 aus Kartoffel zur Synthese von Saccharose-Analoga." [S.l. : s.n.], 2003. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=968537421.
Full text
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Roques, Nathalie. "Transport du saccharose dans les végétaux." Lyon 1, 1989. http://www.theses.fr/1989LYO10170.
Full textAbstract:
Des desoxysaccharoses sont synthetises a partir du saccharose. Les conformations de ces derives sont analysees par rmn du proton et calculees empiriquement. L'interaction de ces molecules avec le transporteur de saccharose, proteine du monde vegetal, est alors mesuree. L'importance relative des hydroxyles glucosidiques durant le transport du saccharose dans les plantes est ainsi evaluee
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Simiand, Cécile. "Modifications régio- et stéréosélectives du saccharose." Grenoble 1, 1993. http://www.theses.fr/1993GRE10180.
Full textAbstract:
Les dextrane-saccharases utilisent le saccharose comme glucosyle donneur pour la biosynthese de dextranes. Des saccharoses modifies ont ete synthetises puis testes comme analogues de substrat de ces enzymes. Le 3-oxo-saccharose, obtenu par biooxydation du saccharose, a ete utilise comme compose precurseur pour les modifications en c-3. Les 3-oximino, 3-amino et 3-thio-saccharoses ont ete obtenus avec de bons rendements. La strategie developpee pour les modifications en position c-4 a permis d'obtenir, de facon stereoselective, les 4-amino, 4-thio et 4-fluoro-saccharoses. Des tests enzymatiques en presence de dextrane-saccharases ont mis en evidence le caractere inhibiteur des amino et thio-saccharoses
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Badel, Agnès. "Oxydation periodique du saccharose et de quelques dérivés." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO10078.
Full textAbstract:
L'oxydation periodique de derives du saccharose proteges ou substitues sur les positions hydroxyles primaires est ici etudiee: elle est generalement selective de l'unite glucopyranosidique et correspond a la coupure des liaisons c::(2)-c::(3) ou (et) cs-c::(4)
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PARPOT, PIER. "Oxydation régiosélective du saccharose par voie électrocatalytique." Poitiers, 1993. http://www.theses.fr/1993POIT2301.
Full textAbstract:
En vue de son oxydation electrocatalytique regioselective, une etude du comportement electrochimique du saccharose a ete realisee sur des electrodes de metaux nobles (pt modifie ou non par adatomes metalliques (pb, bi, tl et cd), au, pd et rh), ou non nobles (ni, cu, co, ag, fe, ir, pb) en milieu alcalin, seul milieu dans lequel le saccharose est suffisamment stable pour permettre des electrolyses prolongees. Les produits d'oxydation du saccharose sur l'or, le nickel et le platine en presence d'adatomes de plomb ont ete identifies par diverses techniques analytiques (cg-sm, rmn, ir, ccm) et doses par chromatographie liquide ionique a haute performance (clihp). Parmi les produits les plus interessants, on note la presence de monoacides du saccharose. L'influence des parametres experimentaux a ete etudiee dans le cas d'une electrode de pt modifiee par adatomes de plomb, qui donne la meilleure selectivite en faveur du monoacide 1 du saccharose (1-mas). Une cellule a flux continu a ete mise en uvre afin de definir des conditions d'electrolyse plus proches de l'industrie. Les resultats de ces travaux montrent la voie a suivre pour la synthese selective des monoacides du saccharose par voie electrocatalytique
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Pierre, Ronan. "Valorisation chimique du saccharose et autres disaccharides." Lyon 1, 2004. http://www.theses.fr/2004LYO10167.
Full textAbstract:
Dans un contexte de raréfaction des ressources pétrolières, il est essentiel d'établir de nouvelles voies d'accès aux produits d'usage courant ainsi qu'à des produits de spécialités à partir de matières premières renouvelables issues de la biomasse. Des possibilités de valorisation chimique du saccharose et d'autres disaccharides largement disponibles comme l'isomaltulose ont été étudiées. Des monohydroxyalhyléthers de saccharose tensioactifs ont été préparés par ouverture nucléophile d'un époxyde gras et leurs propriétés physico-chimiques ont été évaluées. Une étude mécanistique approfondie a permis de mieux comprendre le rôle joué par les amines tertiaires utilisées comme catalyseurs. La préparation de la 3,4,6-tri-O-acytul-[alpha]-D-glucopyranoside-2-O-lactone à partir d'isomaltulose et d'isomalt a aussi été étudiée. Ce synthon a ensuite été exploité pour la synthèse de pseudo disaccharides à lien amide, de pseudo glycoaminoacides et d'un système trivalent glycosylé
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Lallemant, Olivier. "Utilisation d'un nouveau type de saccharose comme excipient pour mélanges structures." Strasbourg 1, 1988. http://www.theses.fr/1988STR15066.
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Badel, Agnès. "Oxydation périodique du saccharose et de quelques dérivés." Grenoble 2 : ANRT, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb376114974.
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Preziosi, Laurence. "Etude des activités saccharolytiques de zymomonas mobilis." Aix-Marseille 2, 1988. http://www.theses.fr/1988AIX22053.
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Poirier-Brulez, Fabienne. "Etude de la stabilité physique de mélanges biopolymère-sucre amorphes." Dijon, 2006. http://www.theses.fr/2006DIJOS017.
Full textAbstract:
L'instabilité des produits vitreux, attribuée depuis une vingtaine d'années à la transition vitreuse, peut également se produire à l'état vitreux. Ces modifications sont donc probablement fortement influencées par la mobilité moléculaire résiduelle du matériau vitreux. L'objectif principal de cette étude est de comprendre les bases physico-chimiques de la stabilité des produits vitreux afin d'assurer par la suite, un meilleur contrôle de leur qualité. Les matériaux d'étude sont l'amidon et le saccharose seuls et en mélange (0-20% de saccharose /matière sèche) faiblement hydratés (0-13. 5% d'eau /matière humide). Une fois les matériaux caractérisés, leur évolution structurale au cours de leur conservation a été suivie par analyse enthalpique différentielle. Les relaxations secondaires ont été étudiées par spectroscopie mécanique et diélectrique, dans le but d'appréhender l'influence de la composition des verres sur ces mouvements locaux. Enfin, une étude de la mobilité à l'échelle des protons, sur des verres d'amidon, a été réalisée. Le saccharose semble diminuer la mobilité de l'amidon vitreux probablement par modification de la structure du verre, tandis que l'eau plastifie le verre d'amidonFor twenty years, the loss of glass stability has been attributed to the glass transition which is regarded as the only predictive parameter of stability. Recently, studies suggested that the loss of stability could also occur in the glassy state. These changes are probably dependent on local motions. The main purpose of this study is to better understand the physical basis of the stability of glassy materials for a better control of quality. This study is focused on local molecular mobility of glasses. All the studies were carried out on gelatinized waxy maize starch at different sucrose content (0 to 20 % solids) equilibrated between 0 to 13. 5% water (wet basis). The structural evolution of the materials during storage was followed with differential scanning calorimetry (DSC). Then, secondary relaxations were studied by dynamic mechanical (DMTA) or dielectric spectroscopy, to investigate the influence of the glass composition on local motions. Finally, a study of protons mobility (NMR) was performed. Sucrose could reduce starch motions probably by glass structure changes ; however, water increases molecular motions of glassy starch by plasticization
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Jhurry, Dhanjay. "Synthèse et caractérisation de polymères à base de saccharose." Bordeaux 1, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR10528.
Full textAbstract:
Le saccharose est un compose organique particulierement abondant, bon marche et d'une purete superieure a 99%. Hormis le secteur de l'alimentation, il ne trouve, cependant, que de rares debouches industriels. La recherche de nouvelles voies de valorisation du saccharose dans le domaine des materiaux macromoleculaires a fait l'objet de cette etude. Deux voies de synthese visant a la preparation de polymeres contenant des motifs saccharose pendents ou incorpores dans la chaine principale ont ete examinees: la polymerisation, selon un processus radicalaire, de molecules de saccharose monofonctionnalisees par des groupes acryloyle, methacryloyle, styrenyle ou styryle via des fonctions ester, ether ou acetal. Des homopolymeres hydrosolubles de hautes masses molaires ont ete synthetises avec les derives acryloyl- et methacryloyl-saccharose. Des copolymeres ont aussi ete obtenus avec le styrene. Leur caractere hydrophile-hydrophobe est directement relie au taux de compose saccharidique incorpore; la polycondensation, en presence de divers reactifs difonctionnels, d'une part a l'aide de saccharose selectivement difonctionnalise et, d'autre part a partir de saccharose non modifie. La synthese de polyethers et de polyurethanes monodimensionnels, de masses molaires satisfaisantes, a ete realisee
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Sudhakaranpillai, Seena. "Approaches to IR-responsive saccharide sensors." Thesis, University of East Anglia, 2010. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.527632.
Full text
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Péron, Thomas. "Caractérisation moléculaire et régulation de la force de puits de la plante parasite Phelipanche ramosa (L. ) Pomel vis à vis du saccharose prélevé chez son hôte." Nantes, 2010. http://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show.action?id=cda3646c-71df-4638-b24a-029650e571a2.
Full textAbstract:
Le mode de vie parasitaire de Phelipanche ramosa la rend responsable de ravages considérables. Son incapacité à réaliser la photosynthèse la rend entièrement dépendante vis-à-vis des photoassimilats de la plante hôte. Le développement de l'orobanche repose sur sa capacité à se connecter au phloème de l'hôte et à devenir un organe puits compétitif. Dans ce contexte, l'utilisation d'un traceur phloémien a permis de démontrer l'existence d'un continuum symplasmique à l’interface hôte-parasite et la nature majoritairement de type apoplasmique de la décharge phloémienne dans les différents tissus puits de P. Ramosa. Les principaux acteurs impliqués dans le transport (SUT = sucrose transporter) et le métabolisme du saccharose (invertases et saccharose synthétases) ont été identifiés. Par des approches moléculaires, d’immunolocalisation et d’hybridation in situ, ces travaux ont précisé l'implication de certains de ces acteurs dans des processus majeurs, tels que le transport du saccharose à longue distance et sa décharge dans les organes puits (PrSUT1 et PrSUT3), la mise en réserve d'hexoses via une invertase acide vacuolaire (PrSAI1), la différentiation des trachéides et la synthèse d'amidon via des saccharose synthétases (PrSUS1 et PrSUS2, respectivement). D'autres marqueurs, tels que l'isopentényl transférase PrIPT et la cytokinine oxydase PrCKX, joueraient un rôle dans l'équilibre hormonal de l'orobanche et contribueraient à réguler sa force de puits. L'ensemble de ces gènes/protéines indispensables au développement de P. Ramosa constitueraient ainsi de bonnes cibles pour valider l'efficacité d'une lutte biotechnologique contre les orobanchesAs a consequence of its incapacity to carry out photosynthesis, Phelipanche ramosa turns out to be fully dependent on the photosynthates from the host plant and due to its obligatory parasitic lifestyle this plant is responsible for considerable devastations. The development of broomrape relies on its capacity to establish connection with the phloem of the host and to become a competitive sink organ. In this context, the use of a phloem tracer demonstrated the existence of a symplasmic continuum at the host-parasite interface and, that the phloem unloading in various sinks tissues of P. Ramosa is mainly an apoplamic type. The main actors involve in transport (SUT = sucrose transporter) and sucrose metabolism (invertases and sucrose synthases) were identified. Using molecular approaches, immunolocalization, and in situ hybridization, we demonstrated the implication of some of these actors in major processes, such as the long-distance transport of sucrose and its unloading in sink organs (PrSUT1 and PrSUT3), hexose accumulation via a vacuolar acid invertase (PrSAI1), the tracheid differentiation and the starch synthesis via sucrose synthases (PrSUS1 and PrSUS2, respectively). Other markers, such as the isopenthenyl transferase PrIPT and the cytokinin oxidase PrCKX, would play a role in the hormonal balance of broomrape and would contribute to control its sink strength. All of these genes/proteins which are essential to the development of P. Ramosa are then putative good targets in biotechnological strategies to control broomrapes
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Meyer, Jenny. "Sucrochimie et catalyse homogène : synthèse d'alkylsaccharides par réaction de télomérisation entre le butadiène et le saccharose : synthèse d'hydroxyalkylsaccharides via l'ouverture d'époxydes par le saccharose." Lille 1, 1996. https://pepite-depot.univ-lille.fr/LIBRE/Th_Num/1996/50376-1996-346.pdf.
Full textAbstract:
La synthèse d'agents tensioactifs à base de sucre nécessite le greffage d'une longue chaine alkyle sur la tête polaire osidique. La réaction de telomerisation entre le butadiène et le saccharose permet d'obtenir des éthers ayant généralement une chaine à 8 carbones. En utilisant une phosphine hydrosoluble et une solution basique très concentrée de saccharose, la réaction a pu être effectuée en milieu aqueux. En système diphasique, la butan-2-one additionnée à la solution basique de saccharose permet l'extraction des télomères de degré 2 et 3 de la phase aqueuse, limitant ainsi la polysubstitution. L'etude de l'influence de divers parametres (rapport molaire butadiène/saccharose, volume de l'autoclave, nature du co-solvant, système catalytique,) a permis d'optimiser la réaction pour aboutir à la synthèse sélective d'un mélange de monooctadienylethers et de dioctadienylethers de saccharose (50/50). La synthèse d'éthers d'alcools de saccharose peut être réalisée par action du saccharose sur un 1,2-epoxyalcane. L'emploi de catalyseurs acides à base de sels d’étain-cobalt et de lanthanides ne favorise pas la réaction d'ouverture de l'epoxydodecane par le saccharose. La synthèse d'hydroxydodecylethers a été ensuite réalisée avec un catalyseur de type alcoolate dans un solvant organique: le dimethylformamide. L'utilisation d'une amine en tant que catalyseur améliore nettement la réactivité du système et rend la réaction possible en milieu aqueux. L'utilisation des catalyses micellaire et de transfert de phase ont également été étudiées.
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Knop, Christian. "Zur Bedeutung von Saccharose-Transportern in Pflanzen mit offener Phloemanatomie." [S.l.] : [s.n.], 2001. http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/2001/knop/knop.pdf.
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Bourré, Martin. "Cristallisation du saccharose dans la production de sucre dur d'érable." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1997. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp05/mq25282.pdf.
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VERONESE, THIERRY. "Etude de la production d'un isomere du saccharose : le trehalulose." Toulouse, INSA, 1999. http://www.theses.fr/1999ISAT0001.
Full textAbstract:
Le travail presente dans cette these a pour objectif d'etudier la possibilite de produire un isomere du saccharose, le trehalulose, par voie biotechnologique. Ce disaccharide possede des potentialites interessantes en tant qu'edulcorant massique puisqu'il est acariogene et tolerable par les sujets diabetiques. L'etude a ete orientee sur des micro-organismes qui ont la capacite d'isomeriser le saccharose a la fois en trehalulose et en isomaltulose, ce dernier isomere etant le produit majoritaire a plus de 80%. Ces bacteries ont donc ete largement utilisees a l'echelle industrielle pour la production de l'isomaltulose, mais de facon empirique, sans maitriser les mecanismes biochimiques intervenant dans cette reaction. L'etude de ce type de micro-organisme a ete mise en oeuvre dans la perspective de produire majoritairement du trehalulose. Pour cela il a ete necessaire de comprendre les mecanismes qui regissent la formation de ces deux sucres chez ces bacteries, afin de les maitriser dans le but d'inverser le rapport isomaltulose/trehalulose. Des enzymes particulieres produites par ces bacteries ont ete purifiees et identifiees comme etant des -glucosyl-transferases, qui ont ete designees sous le nom de saccharose-isomerases et dont nous avons caracterise le mecanisme d'action. Cette etude fondamentale a conduit a la conception d'un procede enzymatique continu de production d'un sirop enrichi a 95% en trehalulose. La forte stabilite de ce procede a permis d'envisager une extrapolation au niveau industriel dont l'evaluation technique et economique a ete realisee.
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Nugier-Chauvin, Caroline. "Modifications regioselectives du saccharose par voie chimique et/ou enzymatique." Rennes 1, 1991. http://www.theses.fr/1991REN10071.
Full textAbstract:
La possibilite de modifier selectivement le saccharose, produit naturel tres abondant et peu couteux, sans protection prealable des hydroxyles, constitue un probleme fondamental au plan scientifique et au niveau economique. Les travaux decrits dans ce memoire, ont ete consacres a la recherche de methodes d'acylations selectives de ce disaccharide, les esters et les carbamates correspondants, etant des derives interessants en tant qu'intermediaires de synthese d'une part et du fait de leur interet propre d'autre part. Nous avons developpe une synthese tres selective de 2-o-acylsaccharoses (esters et carbamates). A notre connaissance, une telle selectivite vers un hydroxyle secondaire, n'avait pas ete mise en evidence par d'autres equipes. Les 6-o-acylsaccharoses ont ete obtenus soit par isomerisation intramoleculaire controlee des 2-o-acylsaccharoses correspondants, soit par acylation directe de l'hydroxyle le plus nucleophile. En faisant intervenir une acylation par voie chimique suivie d'une hydrolyse enzymatique partielle, nous avons abouti aux 6-o-acylsaccharoses. La plupart des derives precedents sont des composes originaux. La determination des structures des divers regioisomeres a necessite notamment l'utilisation de techniques nouvelles en spectrometrie de masse (lc-isp/ms et lc-isp/ms/ms). Les 6-o-acylsaccharoses ont ete utilises pour synthetiser des diesters mixtes qui pourraient constituer des tensioactifs bicatenaires, destines a preparer des vesicules
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Maazouzi, Nadia. "Étude du métabolisme du saccharose et production de polyosides chez streptococcus salivarius subsp thermophilus." Nancy 1, 1991. http://www.theses.fr/1991NAN10206.
Full textAbstract:
Une souche de streptococcus salivarius subsp. Thermophilus a été sélectionnée, après modification du milieu m17 et optimisation des conditions de culture, pour son aptitude à métaboliser le saccharose avec un rendement élevé en polyosides. Le saccharose pénètre dans la cellule par l'intermédiaire d'une permease atp dépendante puis il est hydrolysé par une invertase intracellulaire, de mm=180000 da. Le glucose libéré est incorporé rapidement dans la glycolyse tandis que le fructose est excrété avant d'être réutilise grâce à une perméase atp dépendante lorsque la concentration du saccharose résiduel n'est plus inhibitrice. Des enzymes de type isomérases, mutases ou pyrophosphorylases permettent à la bactérie, en déviant le flux carbone, de synthétiser à partir de différents oses, des polymères osidiques qui ont été isolés suivant leur charge et leur masse moléculaire. Quelle que soit la source carbonée, les polyosides contiennent tous globalement, en proportion variable selon la charge nette, du glucose, du galactose, du mannose, des acides uroniques et des traces d'hexosamines. Ils sont localisés majoritairement autour de la paroi sous forme de capsule, le stockage des polyosides sous forme de réserve intracellulaire étant très minoritaire. La source carbonée influe sur la proportion respective des oses au sein des polymères mais pas sur leur nature. L'ensemble des résultats suggère que la perméation des oses met en œuvre des mécanismes plus ou moins spécifiques tandis que leur incorporation au sein des polymères passe par des voies de synthèse communes
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Hartley, James Holroyd. "Saccharide accelerated hydrolysis of boronic acid imines." Thesis, University of Birmingham, 2000. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.369335.
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