Dissertations / Theses on the topic 'Salud y raza'

La raza bovina Murciano Levantina (ML) se utilizaba para labores agrícolas por su aptitud de trabajo. Hoy se encuentra en peligro de extinción por pérdida de utilidad ante la aparición de maquinaria agrícola. Los escasos criadores que la mantienen, no se dedican a la producción de ganado bovino, siendo los aspectos del folclore regional los que la hacen acorde con su aptitud de tracción. El Banco de Germoplasma de la raza se inició en el año 2000 y en la actualidad hay 7280 dosis seminales congeladas y almacenadas en N2L, pertenecientes a 13 toros ML, todos ellos muy emparentados. Con estas dosis se atiende tanto a la conservación in vivo, por cesión a los ganaderos y obtención de nuevos reproductores, como a la conservación ex situ in vitro para la futura reconstrucción de la raza en caso necesario; aunque el número de toros es insuficiente, puesto que se requiere semen de 25 toros conservados in vitro. El almacenamiento de dosis seminales es costoso por el aumento continuo de los precios del N2L y actualmente existen métodos para disminuir las necesidades de gametos masculinos; el sexado espermático disminuiría a la mitad estos gastos, aunque posteriormente sería necesaria la recongelación de los gametos. Los objetivos del presente trabajo son conseguir eficacia y eficiencia en el semen recongelado, disminuyendo el número de dosis seminales almacenadas, que serían descongeladas del Banco de Germoplasma, y a las que se les aplicaría un tratamiento similar al requerido por la tecnología de sexado espermático; siendo un objetivo derivado el estudio con técnicas convencionales del semen recongelado y relacionar los parámetros de calidad seminal del semen recongelado con aquellos toros que alcancen mejores valores de fertilidad con semen solamente congelado. Otro objetivo es poner a punto una técnica de recongelación que permita almacenar dosis seminales de forma más eficiente. En este trabajo se han utilizado los datos procesados de dosis seminales de 12 toros de esta raza y los espermatozoides congelados pertenecientes a 6 de esos toros. Los métodos de estudio del eyaculado y de las dosis seminales son los convencionales para la especie bovina. Las técnicas de congelación y recongelación utilizadas son las mismas que para el Banco de Germoplasma. En las experiencias de aplicación de frío, el semen descongelado fue sometido a una recongelación después de haber sufrido un tratamiento (CT), o bien recongelado sin tratamiento (ST). Para conocer el valor de los parámetros estudiados han sido utilizadas técnicas de microscopía óptica y fluorescencia, resistencia en baño de agua termostático, tinciones de E-N, IP, lectinas, azul de toluidina e IA con semen redescongelado a siete novillas de la raza Frisona. En el ganado Murciano Levantino existe variabilidad en los valores promedio de calidad seminal entre los sementales, aunque esto no es debido a la edad. Además, no existen diferencias reseñables en los valores promedio de los parámetros de semen procedente del primer y segundo eyaculado de cada toro. El análisis de los resultados permite conocer el daño en los espermatozoides durante la recongelación, siendo la calidad seminal en el semen descongelado superior a la del redescongelado; con gran variabilidad entre toros. Un semental presentó mejores valores para los parámetros tras la congelación y redescongelación, aunque en algún parámetro no hubo diferencias en ningún toro. Las anomalías espermáticas frecuentemente encontradas fueron las “colas en látigo”, pero ligeramente inferiores en el semen recongelado CT. La inseminación de 7 novillas Frisonas proporcionó un porcentaje de fertilidad del semen recongelado ST del 57’1%, lo que concluye que la recongelación espermática se puede utilizar como técnica de predicción de la fertilidad y ser utilizada para la conservación in vitro.
The Murciano Levantina (ML) bovine breed used to be employed for farming purposes because of their work aptitude. Nowadays, it is an endangered breed because it is no longer used for the mentioned purposes due to the arrival of technology and farming equipment. In addition, there are few ML bovine breeders and this is not their main occupation. This breed is mainly used during popular celebrations and festivals for transport. The Germplasm Bank breed has been carried out since 2000 and currently, there are 7280 seminal doses of 13 ML bulls with high consanguinity among them. With these doses it is possible to carry out both in vivo conservation, cession to the breeders and new breeding males; and ex situ in vitro conservation for the future reconstruction of the race -if necessary. Although the number of seminal doses may seem enough for the recovery of the breed in the future, the number of bulls is not sufficient, because the in vitro cryopreservation of spermatozoa belonging to, at least, 25 bulls is necessary. The storage of seminal doses implies more maintenance costs because of the continued increase in prices; currently there are some methods to reduce the male gametes necessities; the sexing sperm could reduce in the middle these expenses, although, afterwards could be necessary the gametes refreezing. The objectives of the present work are to obtain effectiveness and efficiency in refrozen semen, diminishing the number of frozen seminal doses stored at the Germplasm Bank, which would receive a treatment similar to that required by sexing technologies; being a derivative objective to study the usage of conventional technologies of refrozen semen, connecting the refrozen seminal quality parameters with the best fertility parameters in frozen semen. Another goal is the development of a refreezing technique that allows the storage of seminal doses more efficiently. In this work we have used the processed data of seminal doses belonging to 12 bulls of that breed and the frozen spermatozoa of 6 of those bulls. The methods to study the ejaculates and seminal doses are the conventional ones employed in bovine species. The freezing and refreezing techniques used are the same than those used for the Germplasm Bank. In the experiences with the application of cold, the thawed semen was refrozen after undergoing a certain treatment (CT), or it was refrozen without any treatment (ST). In order to know the value of the studied parameters the following methods have been used: the optical and fluorescent microscopy techniques, resistance in thermostatic water bath study, eosine-nigrosine, PI, lectins (PNA) and toluidine blue stainings and artificial insemination using refrozen semen in 7 Frisone breed heifers. In the ML livestock there is variability in the seminal quality average values among the studs, although this is not due to the bulls’ age. Additionally, there are not important differences regarding the average values between the first and the second ejaculation in each bull. Statistical results permit to know the damage in spermatozoa during recryopreservation, and it was observed that the seminal quality is higher in frozen semen than in refrozen semen, with a high variability among bulls. Among the bulls, one of them presented the best results in each parameter studied after cryopreservation and recryopreservation, although there were no differences among the bulls regarding some parameters. The most frequent sperm abnormalities were the “tails in whip”, but they were slightly lower in CT refrozen semen. The artificial insemination of 7 Frisone heifers showed a percentage of fertility with ST refrozen semen of 57’1%. These results conclude that the re-frozen semen can be used as a predictive technique of fertility, and thus, it can be used for the in vitro conservation of the studied bovine breed.

Tesis por compendio de publicaciones
La transferencia de embriones debería jugar un crítico papel en los sistemas actuales de producción porcina ya que posibilita el movimiento nacional e internacional de material genético. El objetivo principal de esta tesis fue desarrollar un procedimiento práctico y efectivo de transferencia intrauterina profunda de embriones frescos. En el primer trabajo estudiamos el efecto de dos dosis de eCG para inducir una respuesta superovulatoria en donantes y el rendimiento reproductivo de las receptoras después de la transferencia intrauterina profunda de embriones. En el segundo estudiamos el efecto de la sincronía del ciclo estral en el rendimiento reproductivo de las receptoras. Las transferencias se realizaron en receptoras que salieron en celo 24 h antes o 0 h, 24 h o 48 h después de las donantes. Finalmente, en el tercer estudio se evaluó la transferencia intrauterina profunda no quirúrgica con mórulas producidas in vivo y cultivadas durante 24 h en un medio líquido. En el experimento 1, se estudiaron dos temperaturas y dos medios. En el experimento 2, las mórulas obtenidas se cultivaron en el medio definido a 37 ºC y los blastocistos resultantes de ese se transfirieron a las receptoras. Los resultados de demuestran que el número de donantes para transferir 30 embriones por receptora por vía no quirúrgica se puede reducir mediante los tratamientos de superovulación. Concretamente, una dosis de 1000 UI de eCG es suficiente para obtener unos resultados reproductivos satisfactorios en las receptoras. Los embriones porcinos toleran mejor un ambiente uterino más temprano del que les corresponde cuando son transferidos por vía no quirúrgica en la profundidad de un cuerno uterino. El medio TL-PVA es un medio químicamente definido capaz de mantener una elevada viabilidad in vitro de mórulas porcinas cultivadas a 37 ºC durante 24 h. El rendimiento reproductivo de las receptoras tras la transferencia no quirúrgica en la profundidad de un cuerno uterino reportados en estos estudios representa un avance muy importante para la difusión y comercialización de esta tecnología por la industria porcina. Palabras clave: transferencia de embriones, no-quirúrgica
The use of porcine embryo transfer should play a critical role in pig production because it allows the movement of genetic resources. The main objective of this thesis was to develop an efficient and practical procedure for nonsurgical deep-uterine embryo transfer with fresh embryos. In the first study we evaluated the effect of two doses of eCG to induce superovulation in donor sows and evaluate the reproductive performance of recipients after nonsurgical deep-uterine embryo transfer. In the second study we studied the effect of recipient-donor estrous cycle synchrony on the reproductive performance of recipients. The transfers were conducted in recipients sows that started estrus 24 h before or 0 h, 24 h or 48 h after the donors. Finally, in the third experimental study we evaluated the potential application of non-surgical deep uterine transfers with in vivo-derived morulae cultured for 24 h. In Experiment 1, two temperatures and two media were assessed. In Experiment 2, morulae were cultured in the defined medium at 37 ºC for 24 h, and the resulting blastocysts were transferred to the recipients. The results achieved in these three studies demonstrate that the number of donors needed to nonsurgically transfer 30 embryos per recipient can be decreased and that a dosage of 1000 IU eCG is enough to obtain a satisfactory reproductive performance of the recipients. Porcine embryos tolerate better a less advanced uterine environment if they are nonsurgically transferred deep into a uterine horn. The TL-PVA medium provided a chemically defined medium capable of maintaining a high in vitro viability of porcine morula cultured at 37ºC for 24 h. The excellent reproductive performance of the recipients following NsDU–ETs reported in these three studies represents an important advance for the widespread commercial use of ET by the pig industry.

A epidemia de HIV/aids e a violência de gênero em mulheres apresentam elevada prevalência, configurando graves problemas de saúde pública. O objetivo geral deste estudo foi conhecer as trajetórias de vida de mulheres com HIV/aids em situação de violência de gênero. Os objetivos específicos foram: analisar as vulnerabilidades decorrentes das desigualdades de gênero, raça e classe social nas vidas de mulheres com HIV/aids; identificar as iniquidades presentes nas vidas destas mulheres e caracterizar como se constituem as vidas de mulheres com HIV/aids em situação de violência de gênero a partir dos conceitos de fascismo social, biopolítica e vidas nuas. É um estudo qualitativo que utilizou narrativas de 61 mulheres com HIV/aids em situação de violência cadastradas no Serviço de Assistência Especializada em DST/HIV/aids em um município do interior do Rio Grande do Sul, que apresenta a 5ª maior prevalência da doença entre as cidades brasileiras. Para a discussão e compreensão dos dados foi utilizada a análise de narrativa, considerando-se as experiências femininas de viver com HIV/aids e sofrer violências de gênero. A maioria das mulheres era jovem, solteira, com pouca escolaridade, pobre e inserida precariamente no mercado de trabalho. Grande parte adquiriu a doença do companheiro, eram negras, com início da vida sexual antes dos 15 anos, não usavam preservativos e referiram em média de nove anos vivendo com HIV/aids. Em suas trajetórias, sofreram diferentes formas de opressão/exploração na vida privada e no trabalho, em contextos de desigualdades que as vulnerabilizaram antes e depois de adoecer Mulheres pobres, negras e com HIV/aids referiram preconceito, discriminação e iniquidades como efeitos do capitalismo patriarcal racista. As negras narraram preconceitos e rejeição em decorrência da cor da pele e por serem portadoras de uma doença estigmatizada na sociedade. As pobres precisaram ocupar postos de trabalho precários e informais, e muitas se prostituíram para sobreviver. Todas sofreram discriminações, agudizadas pelo fato de serem portadoras de HIV/aids, indicando que os contextos socioeconômicos de pobreza e racismo aumentam a vulnerabilidade ao HIV/aids e pioram a vida das que adquirem a doença. As hierarquias de gênero ocasionaram dificuldades referentes à sexualidade e à conjugalidade, à falta de autonomia para negociar direitos sexuais nas relações maritais e com clientes, mantendo segredo em relação ao HIV/aids para evitar a culpabilização e o rechaço de familiares, amigos e comunidade. A biopolítica e o fascismo social são formas de governo capazes de determinar o limite entre a vida protegida e a vida exposta à morte daqueles considerados supérfluos, descartáveis e, portanto, matáveis A biopolítica, em relação a mulheres com HIV/aids, preocupa-se apenas em não deixar morrer, podendo-se considerar que são “vidas nuas”, marcadas pela pauperização, feminização e racialização da epidemia e a superposição das vulnerabilidades sociais indica que não se pode isolar os determinantes ou tratar a doença apenas em seus aspectos biológicos. Este estudo descortinou as condições de sofrimento, violências e discriminações em que vivem mulheres com HIV/aids em um município do interior do Rio Grande do Sul, considerando-as vidas precárias, descartáveis, vidas nuas. É responsabilidade do Estado produzir políticas públicas para o HIV/aids e para as violências, que considerem os determinantes de gênero, raça e classe social e disponibilizar cuidado integral, equânime e resolutivo às mulheres com HIV/aids.
The HIV/SIDA epidemic and gender violence in women are highly prevalent, resulting in serious public health problems. The general objective of this study was to know the life trajectories of women with HIV/SIDA in situations of gender violence. The specific objectives were: to analyze vulnerabilities arising from inequalities in gender, race and social class in the lives of women with HIV/SIDA; to identify the iniquities present in the lives of these women and to characterize the lives of women with HIV/SIDA in situations of gender violence from the concepts of social fascism, biopolitics and naked lives. It is a qualitative study that used narratives of 61 women with HIV/SIDA in a situation of violence registered in the STD/HIV/SIDA Specialized Service in a municipality in the interior of Rio Grande do Sul, which presents the 5th highest prevalence of the disease among The Brazilian cities. For the discussion and understanding of the data, the narrative analysis was used, considering the female experiences of living with HIV/SIDA and suffering gender violence. Most of the women were young, single, with little schooling, poor and poorly placed in the labor market. Most of them acquired the disease of the partner, were black, with sexual onset before the age of 15 years, did not use condoms and reported on average nine years living with HIV/SIDA. In their trajectories, they suffered different forms of oppression/exploitation in private life and at work, in contexts of inequalities that made them vulnerable before and after becoming ill. Poor, black and HIV/SIDA women have reported prejudice, discrimination and inequities as the effects of patriarchal racist capitalism. Black women have narrated prejudices and rejection as a result of their skin color and because they carry a stigmatized disease in society. The poor needed to occupy precarious and informal jobs, and many prostituted themselves to survive. All have suffered discrimination, exacerbated by the fact that they carry HIV/SIDA, indicating that socioeconomic contexts of poverty and racism increase vulnerability to HIV/SIDA and make life worse for those who acquire the disease. Gender hierarchies have caused difficulties related to sexuality and conjugality, lack of autonomy to negotiate sexual rights in marital and client relations, keeping secrets about HIV/SIDA to avoid blame and the rejection of family, friends and community. Biopolitics and social fascism are forms of government capable of determining the boundary between the protected life and the life exposed to the death of those considered superfluous, disposable and therefore killable. Biopolitics, in relation to women with HIV/SIDA, only worries about not letting them die and can be considered as "naked lives", marked by the pauperization, feminization and racialization of the epidemic, and the overlapping of social vulnerabilities indicates that One can isolate the determinants or treat the disease only in its biological aspects. This study revealed the conditions of suffering, violence and discrimination in which women living with HIV/SIDA live in a municipality in the interior of Rio Grande do Sul, considering them to be precarious, disposable lives, naked lives. It is the responsibility of the State to produce public policies on HIV/SIDA and violence, which consider determinants of gender, race and social class, and provide comprehensive, equitable and resolute care to women with HIV/AIDS.
La epidemia del VIH/SIDA y la violencia basada en el género en la mujeres tienen una alta prevalencia, el establecimiento de graves problemas de salud pública. El objetivo de este estudio fue saber las trayectorias de vida de las mujeres con VIH/SIDA en situación de violencia de género. Los objetivos específicos fueron analizar las vulnerabilidades derivadas de la desigualdad de género, la raza y la clase social en la vida de las mujeres con VIH/SIDA; reconocimiento de las desigualdades presentes en la vida de estas mujeres y caracterizar como son la vida de las mujeres con VIH/SIDA en situación de violencia de género desde los conceptos de fascismo social, biopolítica y vidas desnudas. Se trata de un estudio cualitativo utilizando narrativas de 61 mujeres con VIH/SIDA en situaciones de violencia registrada en el Servicio de Atención Especializada de ETS/VIH/SIDA en una ciudad del interior de Rio Grande do Sul, que tiene la quinta más alta prevalencia de la enfermedad entre ciudades brasileñas. Para la discusión y comprensión de los datos se utilizó el análisis narrativo, teniendo en cuenta las experiencias de las mujeres de vivir con el VIH/SIDA y sufren violencia de género. La mayoría de las mujeres eran jóvenes, solteras, con poca educación, pobres y mal insertado en el mercado laboral. Gran parte adquirida del compañero la enfermedad, eran negro, con el inicio de la actividad sexual antes de los 15 años, no hizo uso de condones y reportaron un promedio de nueve años que viven con el VIH/SIDA. En sus caminos, que han sufrido diferentes formas de opresión/explotación en la vida privada como en el trabajo, en contextos de desigualdad que vulnerabilizaram antes y después de enfermarse Las mujeres pobres, negros y con el VIH/SIDA mencionan los prejuicios, la discriminación y las desigualdades como los efectos del capitalismo patriarcal y racista. Las mujeres negras narró los prejuicios y el rechazo debido al color de la piel y debido a que están llevando a una enfermedad estigmatizada en la sociedad. Las pobres tenían para ocupar puestos de trabajo precarios e informales, y muchas prostituirse para sobrevivir. Toda discriminación que sufren, agudizado por el hecho de que viven con el VIH/SIDA, lo que indica que los contextos socio-económicos de la pobreza y el racismo aumento de la vulnerabilidad al VIH/SIDA y empeoran la vida de contraer la enfermedad. Las jerarquías de género causaron dificultades relacionadas con la sexualidad y la conyugalidad, la falta de autonomía para negociar los derechos sexuales en las relaciones maritales y clientes, mantener el secreto sobre el VIH/SIDA para evitar la culpa y el rechazo de familiares, amigos y la comunidad. La biopolítica y el fascismo social son formas de gobierno capaces de determinar el límite entre la vida protegida y la vida en peligro de muerte los que se consideran superfluos, desechable y, por tanto, killable. La biopolítica, para las mujeres con VIH/SIDA, se ocupa solamente de no dejar que muera, se puede considerar que son "vida desnuda", marcada por la pobreza, la feminización y la racialización de la epidemia y la superposición de vulnerabilidad social indica que hay se puede aislar los determinantes o tratar la enfermedad sólo en sus aspectos biológicos. Este estudio reveló condiciones del sufrimiento, la violencia y la discriminación en las mujeres que viven con el VIH/SIDA en una ciudad del interior de Rio Grande do Sul, teniendo en cuenta las vidas precárias, desechables, vidas desnudas. Es la responsabilidad del Estado producir políticas públicas para el VIH/SIDA y la violencia, para considerar l

Para los programas de mejora genética en el sector ovino, resulta imprescindible definir y evaluar los caracteres biológicos con relevancia económica en la producción. La raza ovina Ripollesa es autóctona de España y se localiza principalmente en el nordeste de Cataluña, explotada bajo sistemas semi-extensivos de producción y actualmente destinada a producción de carne. La caracterización morfológica de la raza Ripollesa se realizó a partir del estudio de 8 rebaños. Se diferenciaron 4 subpoblaciones con implicaciones relevantes a ser tomadas en cuenta en el programa de conservación de la raza. Las diferencias observadas pueden atribuirse a la localización geográfica, historia selectiva, manejo del rebaño, y genética. Los índices zoométricos clasifican a la raza de tamaño medio y longilínea, con orientación a la producción de carne y clara adaptación al ambiente. En los rebaños ovinos, la correcta identificación de los progenitores presenta a menudo problemas debidos a la presencia de varios candidatos posibles tanto por vía paterna como materna. Este fenómeno conlleva a un porcentaje moderado a bajo de corderos con pedigrí incompleto, con la subsecuente pérdida de información. Para identificar la madre del cordero abandonado, se adaptó un modelo Bayesiano integrando fuentes de información tanto genéticas como medioambientales sobre los datos fenotípicos, modelando a la oveja desconocida como un parámetro adicional. Se evaluó el rendimiento del modelo utilizando datos de simulación y asumiendo siete escenarios diferentes en donde de uno a cuatro corderos abandonados eran asignados a dos ovejas candidatas. La media general de la probabilidad de asignación materna correcta fue 0,59. Cualquier inferencia en maternidades desconocidas podría reducir los costes económicos de genotipado, permitiendo centrarse en aquellos corderos con mayor probabilidad de ser descendientes de ovejas de elite. La preocupación e importancia que ha tomado la composición de los alimentos y su relación con la salud humana durante las últimas décadas ha sido un punto clave para la industria ovina actual. Las técnicas de ultrasonido a tiempo real resultan de gran utilidad para predecir las características de la canal en el animal vivo de manera no invasiva. Con el objetivo de evaluar la precisión de las medidas de ultrasonido para predecir las características de la canal, se tomaron imágenes de ultrasonido en corderos pascuales, transversal y longitudinalmente a la columna vertebral, y a nivel torácico y lumbar. Las medidas de ultrasonido transversales en ambos niveles pueden ser una herramienta útil para predecir las características de la canal en corderos ligeros, dotando información relevante para productores de corderos ligeros a nivel mundial, y sobre todo en la zona del Mediterráneo en donde este tipo de sistemas de producción contribuyen con un porcentaje importante a la industria ovina. La carne de cordero es una fuente importante de diferentes ácidos grasos con numerosos beneficios a la salud para el consumidor. Con el objetivo de caracterizar caracteres de la canal y de la carne en corderos pascuales de raza Lacaune, Ripollesa y Lacaune×Ripollesa, se utilizaron medidas de ultrasonido y directamente sobre la canal y análisis de laboratorio de las muestras de carne. Las medias de las medidas de ultrasonidos y canal no difirieron significativamente entre razas y los coeficientes de correlación fueron significativos. El rendimiento a la canal fue mejor en Lacaune seguido de la Ripollesa. Los ácidos grasos (FA) mayormente representados fueron: oléico, palmítico y esteárico. Diferencias entre razas para los porcentajes de FA saturados (SFA), monoinsaturados y poliinsaturados (PUFA) fueron encontradas. En cuanto a la proporciones de valores nutricionales, solo se encontraron diferencias para la proporción PUFA/SFA. Toda esta información es esencial para productores de cordero ligero, un producto ganadero que tiene una alta demanda en el mercado Mediterráneo.
To be able to implement genetic selection programs in meat-producing sheep breeds, is essential define and evaluate biological traits with economic importance in the production. The Ripollesa sheep breed is an important Spanish local breed mainly located in the Mediterranean mountains and cultivated plains of Catalonia, exploited under semi-extensive production systems and currently intended for meat production. The morphologic characterization of the Ripollesa breed was carried out from the study of 8 flocks representative of different subpopulations. They were differentiated four subpopulations with relevant implications to be taken into account for the breed conservation program. The observed differences could be attributable to geographic location, selective history, flock management, and genetics. The estimated zootechnical indexes classified the Ripollesa sheep breed as a medium-sized and long-shaped body frame, with a marked orientation to meat production and with signs of adaptation to the environment. In sheep flocks, lamb’s parents can be misidentified or confounded due to the plausibility of two or more potential sires or dams. This phenomenon leads to a moderate-to-low percentage of lambs with missing pedigrees, with the subsequent loss of information for the corresponding animal breeding programs and selection schemes. To ascertain the dam of abandoned lambs we adapted a Bayesian model by integrating both genetic and environmental sources of information from phenotypic data and modeling the uncertain dam as an additional unknown parameter. The model performance was evaluated by using simulation data and by assuming seven different scenarios where one to four abandoned lambs had to be assigned to two candidate ewes. The overall average probability of assignment to the right dam was 0.59. Any inference on uncertain dams would reduce further economic costs by allowing to focus genotyping efforts on those lambs with higher probabilities to be offspring from elite ewes. Concern about meat composition and its relationship with human health has increased during the last few decades has been a key point for the actual sheep farming industry. Real-time ultrasound techniques are of great utility to predict carcass characteristics in the live animal in a non-invasive way. With the aim to assess the accuracy of the ultrasound measurements for predicting carcass traits, ultrasound images were taken in ‘pascual’-type lambs, transversal and longitudinal to the vertebral column, and at thoracic and lumbar locations. transversal ultrasound measurements at both thoracic and lumbar levels could be a useful tool for predicting carcass traits in light lambs, contributing with relevant information for light lamb producers worldwide, with a special emphasis in the Mediterranean basin where this kind of production system accounts for an outstanding percentage of the sheep industry. Lamb meat is an important source of different fatty acids with numerous health benefits for the consumer. With the aim of characterize carcass and meat traits in Lacaune, Ripollesa and Lacaune×Ripollesa ‘pascual’-type lambs ultrasound and direct measurements on carcasses were used and laboratory analyses on meat samples. They were not found significant differences between breeds for ultrasound and carcass measures. Carcass yield was better for Lacaune followed by Ripollesa. The meat fatty acid (FA) mostly represented in muscular tissue under examination were: oleic, palmitic and stearic. Differences between breeds for saturated (SFA), monounsaturated and polyunsaturated FA (PUFA) proportions were found. Differences for nutritional ratios were only found for PUFA/SFA ratio. All of this information becomes essential for light lamb producers, a livestock product that has high market demand in the Mediterranean basin.

La melatonina juega un papel esencial en la regulación del crecimiento óseo. El efecto de la melatonina sobre los odontoblastos podría ser similar a su acción sobre los osteoblastos. La hidroxiapatita (HA) y el fosfato beta-tricálcico (β-TCP) son biocerámicas usadas como sustitutos óseos que, unidas a colágeno (C) como soporte, tienen unas cualidades osteoconductoras satisfactorias. El objetivo de nuestro estudio es evaluar la respuesta de la pulpa de molares de rata a la melatonina y a la mezcla HA/β-TCP/C cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas y comparar sus efectos sobre la pulpa dental con el producido por el MTA. Además, queremos evaluar la acción antioxidante sistémica de la melatonina administrada por vía oral, y su influencia sobre el efecto que el MTA y la melatonina tienen sobre la pulpa dental cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas en molares de rata. METODOLOGÍA Se realizaron protecciones pulpares directas en los molares superiores de 28 ratas Sprague Dawley. Los grupos de estudio fueron: MTA 30 días, Melatonina 30 días, MTA + Melatonina administrada por vía oral (v.o.) 30 días; Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, MTA 60 días, Melatonina 60 días, HA/β-TCP/C 30 días. En los grupos MTA+ Melatonina v.o. 30 días y Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, se añadió melatonina en el agua de bebida que los animales bebieron ad líbitum (10 mg / 100 ml). Después del período de estudio, 30 ó 60 días según el grupo, los animales fueron sacrificados y se les extrajo 5 ml de sangre, los riñones y el hígado con el fin de evaluar el estrés oxidativo por medio de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Los fragmentos de maxilar que contenían los molares de estudio se prepararon para la evaluación histológica. A partir de estas muestras, se determinó el grado de inflamación pulpar, el grado de necrosis pulpar, la presencia de puente dentinario y dentina reparativa en la cámara pulpar, la presencia y la regularidad de la capa odontoblástica y la presencia de fibrosis pulpar. RESULTADOS No se observaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos en cuanto a grado de inflamación (p=0,024), vitalidad pulpar (p=0,61) y fibrosis (p=0,194). Para la variable puente dentinario y dentina reparativa hubo diferencias significativas (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a presencia y el grupo HA/β-TCP/C 30 días se asoció a ausencia de puente dentinario y dentina reparativa. Para la variable capa odontoblástica también hubo diferencias significativas entre los grupos (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a la presencia de una capa odontoblástica regular, el grupo MTA + Melatonina v.o. 30 días se asoció a la presencia de capa odontoblástica ya sea regular o irregular, los grupos Melatonina 60 días y HA/β-TCP/C 30 días se asociaron significativamente a la ausencia de una capa odontoblástica regular. En el análisis del estrés oxidativo no se detectaron diferencias significativas entre los distintos grupos: plasma (p=0.799), riñón (P=0.130) e hígado (p=0.724). CONCLUSIONES Los efectos sobre la pulpa dental de la melatonina y HA/β-TCP/C usados como materiales de recubrimiento pulpar son similares a los del MTA cuando valoramos el grado de inflamación, la vitalidad pulpar y la presencia de fibrosis pulpar. El consumo de melatonina por vía oral no añade ningún efecto histológico al producido por el MTA y la melatonina aplicados directamente sobre la pulpa dental. El nivel de estrés oxidativo en plasma, riñón e hígado no se modifican en ninguno de los grupos por el consumo de melatonina en el agua de bebida.
Melatonin plays an essential role in the regulation of bone growth. The actions that melatonin exert on odontoblasts may be similar to action on osteoblasts. Hydroxyapatite (HA) and beta-tricalcium phosphate (β-TCP) are bioceramics used as bone substitutes, which together with collagen (C) as support, have satisfactory osteoconductive qualities. The aim of this research was to evaluate pulp response to melatonin and to mixture HA/β-TCP/C used for direct pulp capping and to evaluate the antioxidant effect of melatonin administered orally and its influence on dental pulp. METHODS Direct pulp capping was performed on the upper molars of 28 Sprague-Dawley rats. The study groups were: MTA 30 days; Melatonin 30 days; MTA + Melatonin taken orally 30 days; Melatonin + Melatonin taken orally 30 days; MTA 60 days; Melatonin 60 days;.HA/β-TCP/C 30 days. In the groups MTA + Melatonin taken orally 30 days and Melatonin + Melatonin taken orally 30 days, the animals drank water dosed with melatonin ad libitum (10 mg/100 ml). After 30 or 60 days depend of the group, the animals were sacrificed and 5 ml of blood, the kidneys and liver were extracted in order to evaluate oxidative stress by means of thiobarbituric acid reactive substances testing (TBARS), and fragments of the maxilla containing the study molars were prepared for histological evaluation. The degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis, the presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber, the presence and regularity of the odontoblastic layer and the presence of pulp fibrosis were evaluated from these samples. RESULTS No significant differences were found between the study groups for the histological variables degree of pulp inflammation (p=0,024), degree of pulp necrosis (p=0,61) and presence of pulp fibrosis (p=0,194). There were significant differences for the histological variable presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber (p=0,002); group MTA 30 days was associated to presence and group HA/β-TCP/C 30 days was associated to ausence of reparative dentin and dentin bridging. There were significant differences for the variable presence and regularity of the odontoblastic layer between groups (p=0,002); group MTA 30 days was associated to regular odontoblastic layer; group MTA+Melatonin taken orally 30 days was significantly associated to odontoblastic layer regular or irregular; groups Melatonin 60 days and HA/β-TCP/C 30 days were associated to ausence of regular odontoblastic layer. In oxidative stress analysis no significant differences were found between the study groups: blood (p=0.799), kidney (P=0.130) and liver (p=0.724). CONCLUSION The effect of melatonin and HA/β-TCP/C on pulp is similar to that of MTA to the degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis and the present of pulp fibrosis. Oral administration of melatonin did not modify the local effects of MTA or of melatonin on dental pulp or reduce basal level oxidative stress.

Aquesta tesi mostra, primerament, els resultats de l'enquesta efectuada als titulars d'explotacions araneses d'ovins, així com la caracterització morfològica de la raça Aranesa mitjançant l'estudi de 31 mesures morfològiques quantitatives, 17 índexs d'interès etnològic i funcional, i les variables qualitatives més importants en etnologia, així com un estudi de la llana. En total s'han enquestat 54 ramaderies, amidat 197 animals adults per a la biometria i mostrejat 53 animals per a l'estudi de la llana. El cens oví aranès l'any 2003 era de 2.569 ovelles i 92 marrans, estimant-se en unes 1.489 ovelles i uns 61 marrans els ovins purs aranesos. Aquestes xifres fan entrar l'Aranesa dins la categoria 4, estatus de perill d'extinció, d'acord amb els criteris de l'EAAP (European Association for Animal Production). Els ramats són de dimensions enormement variables i s'exploten en sistema extensiu en pastures naturals, amb aprofitament estival en peixius d'alta o mitjana muntanya. L'Aranès és un tipus oví d'aptitud càrnia poc marcada, que produeix corders de tipus pasqual pesat, criats "a braguer". El maneig productiu és força dissimilar entre explotacions. Poc menys de la meitat de les explotacions sincronitzen els zels mitjançant la separació dels mascles; en aquestes explotacions, la paridora es concentra sobretot els mesos de març a maig, i d'agost a gener, amb uns màxims a l'octubre i al novembre. Unes tres quartes parts dels ramaders practiquen alguna mena de desparasitació periòdica. La disposició d'electricitat és irregular entre explotacions, però és el recurs aigua el de més valor en les explotacions. Les explotacions són de tipus individual, poquíssimes a títol principal, i la mitjana d'edat dels ramaders és de 50,2 anys. Morfològicament, la raça ovina Aranesa presenta un dimorfisme sexual força marcat; es dóna poca variabilitat morfològica intrasexe i no es detecten subpoblacions biomètricament diferenciables, al menys entre terçons. És una raça subhipermètrica i longilínia; en relació al cap, podem definir els animals com a subconvexos, mesaticèfals, braquicraniots i mesoprosopis, de banya en espiral oberta, i de capa polícroma, les més habituals de la qual són la blanca, la negra, la beret i la capiroia. La llana està formada per metxes quadrades tancades amb un clar predomini de les fibres curtes-fines, de diàmetre mitjà, i que es classificaria com a tipus comercial V, "entrefí corrent" (XI si es tracta del fenotip negre) de la classificació espanyola. En aquesta tesi, a partir dels caracters morfològics i de la llana, es fa un estudi comparatiu entre races ovines pirinenques, que situa l'Aranesa en el que anomenem "entrefí occità pirinenc". Finalment, pel que fa a l'estudi genètic, es pot destacar que el grau de subestructuració entre els diferents peixius estivals és molt reduït i generalment poc significatiu. A nivell de marcadors microsatèl·lit, la raça ovina Aranesa mostra una elevada variabilitat genètica i una diferenciació genètica poc pronunciada amb races geogràficament veïnes, com la Tarasconesa i la Xisqueta. Les races Aranesa i Tarasconesa corresponen a agrupacions poc diferenciades entre elles, tant en el pla genètic com morfològic.
This thesis gives the results of the research done with the farmers of sheep farms in the Vall d'Aran. It indicates the morphological characteristics of the Araneses breed through the study of 31 measurements and 17 indexes of ethnological and functional value, the most important qualitative variables in ethnology as well as a study of the wool. 54 breeding flocks have been investigated, 197 adult animals have been measured biometrically and a sample study of the wool of 53 animals has been carried out. The ovine census in 2003 was of 2,569 ewes and 92 rams, of which 1,489 ewes and 61 rams were considered to be of pure Aranese breed. These figures put the Araneses breed in category 4, a status indicating danger of extinction according to the criteria of the EAAP (European Association for Animal Production). The flocks are of very different sizes. They are reared on extensive natural pastures, taking advantage of high and medium alps in summer. The Aranese is not a breed marked out for meat production. The lambs reach optimum weight around Easter after rearing by suckling. The way of rearing varies greatly from farm to farm. Slightly less than half the farms synchronize the coming on heat of the ewes by separating them from the rams. In theses farms lambing period goes from March to May and from August to January, peaking in October and November. About three quarters of the breeders periodically practise some form of deparasitation. The electricity supply is irregular on the farms but water resources are always readily avalaible. The main activity of the farmers is not sheep farming. The average age of the farmers is 50.2 yr. In morphological terms the Aranese breed exhibits a very pronounced morphological variability between the sexes and no biometrically different subpopulations can be detected at least among in the studied areas. The breed is subhypermetrical and longilineal. Their heads can be defined as subconvex, mesaticephalic, brachicranial and mesoprosopeial, with horns in an open spiral and with a polychrome coat. The white, the black, the "beret" and the "capiroia" are the most common. The wool is made up of closed square tufs wich a clear predominance of short-fine fibres of medium diametre, which are classified as of the commercial type V (XI if it is the black phenotype) according to the Spanish classification. In this Thesis, starting from the morphological characteristics and from the wool, there is a comparative study of the pyrenean sheep breeds. The Aranese breed belongs to the "entrefí occità pirinenc". Finally, as regards the study of theier genes the degreee of substructuration in the differents alps is very limited and of little significance. Using microsatellite markers, the Aranese breed shows high genetic variability and little genetic differentiation in geographically neighbouring breeds such as the Tarasconese and the Xisqueta. The Aranese and the Tarasconese appear in similar groupings both genetically and morphologically.
Aguesta tèsi mòstre, en prumèr lòc, es resultats dera enquèsta hèta as titulars d'espleites araneses d'ovins, atau com era caracterizacion morfologica dera raça Aranesa miejançant er estudi de 31 mesures morfologiques quantitatives, 17 indèxs d'interès etnologic e foncionau, e es variables qualitatives mès importantes en etnologia, atau coma un estudi dera lan. En totau s'an enquestat 54 ramaderies, mesurat 197 animaus adults entara biometria e mostrejat 53 animaus entar estudi dera lan. Eth cens ovin aranés er an 2003 ei de 2.569 oelhes e 92 mardans, estimant-se en ues 1.489 oelhes e uns 61 mardans es ovins purs aranesi. Aguestes chifres hèn a entrar ara Aranesa laguens dera categoria 4, estatus de perilh d'escandiment, cossent damb es critèris der EAAP (European Association for Animal Production). Es ramats son de dimensions enormament variables e s'espleiten en sistèma extensiu en peisheus naturaus, damb aprofitament estivau en peisheus de mieja o nauta o montanha. Er Aranés ei un tipe d'ovin d'aptitud càrnia pòc mercada, produsint anhèths de tipe pasqual pesat, criats "a braguèr". Eth maneg productiu ei fòrça desparièr entre espleites. Pòc mens dera mitat des espleites sincronizen es zèls miejançant era separacion des mascles; en aguestes espleites, era paridora se concentre sustot es mesi de març a mai, e d'agost a gèr, damb uns maxims en octobre e noveme. Ues tres quataus parts des ramadèrs practiquen bèra sòrta de desparasitacion periodica. Era disposicion d'electricitat ei irregulara entre es espleites, mès ei eth recors aigua eth de mès valor enes espleites. Es espleites son de tipe individuau, ben pògues a títol principau, e era mejana d'edat des ramadèrs ei de 50,2 ans. Morfologicament, era raça ovina Aranesa presente un dimorfisme sexuau fòrça marcat; se da pòga variabilitat morfologica intrasèxe e non se detècten sospoblacions biometricament diferenciables, aumens entre terçons. Ei ua raça subipermetrica e longilinha; en relacion ath cap, podem definir as animaus coma subconvèxi, mesaticèfals, braquicraniòts e mesoprosòpis, de còrna en espirau dubèrta, e de capa policròma, en tot èster era mès abituau era blanca e era nera, era beret e era capiroia. Era lan ei formada per mèches quarrades tancades damb un clar predomini des fibres cuertes-fines, de diamètre mejan, e que se classificarie coma tipe comerciau V, "entrefin corrent" (XI se se tracte deth fenotip nere) dera classificacion espanhòla. En aguesta tèsi, a compdar des caractèrs morfologics e dera lan, se hè un estudi comparatiu entre races ovines pirenenques, en tot èster era Aranesa en que nomentam "entrefin occitan pirenenc". Fin finau, per çò que hè ar estudi genetic, subergés qu'eth grad de sosestructuracion entre es diferenti peisheus estivaus ei plan redusit e generaument pòc significatiu. A nivèu de marcadors microsatellit, era raça ovina Aranesa mòstre ua elevada variabilitat genetica e ua diferenciacion genetica pòc prononciada damb races geograficament vesies, com era Tarasconesa e era Xisqueta. Es races Aranesa e Tarasconesa corresponen a agropacions pòc diferenciades entre eres, autant en plan genetic com morfologic.

El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue optimizar la crioconservación de semen caprino de la raza Blanca de Rasquera. Para ello, se diseñaron 4 estudios. En el primer estudio se evaluó la sustitución de la yema de huevo fresco por yema de huevo en polvo (YHP), para reducir el riesgo de contaminación microbiológica del diluyente, así como el efecto de la yema de huevo fresco clarificado obtenida por centrifugación ultrarrápida. Simultáneamente, se evaluó la presencia de plasma seminal en la congelabilidad espermática de donantes de uno y dos años de edad. En el segundo, se estudió la sustitución de los crioprotectores penetrante (glicerol vs trehalosa) y no penetrante (YHP vs lecitina de soja (LS)), así como la inclusión del antioxidante BHT y el tampón zwitteriónico Test, en lugar del Tris, en los diluyentes. En el tercer trabajo, se analizó la lecitina de soja como alternativa viable en la conservación de espermatozoides caprinos en presencia de plasma seminal, así como la concentración óptima del antioxidante BHT en los diluyentes a base de YHP o LS. Por último, en el cuarto estudio se valoró la calidad espermática a lo largo de todo el año, la adición de antioxidantes (BHT o melatonina) en los diluyentes y la aplicación de implantes de melatonina en los sementales en primavera, además de valorar el efecto de la edad y del individuo en la congelabilidad de los espermatozoides caprinos. Tras un complejo análisis de la calidad de los espermatozoides durante su conservación, podemos concluir que la yema de huevo en polvo puede sustituir a la yema de huevo fresco en la congelación de semen caprino, ya que, independientemente de la edad del donante, no se observó superioridad alguna en ningún tipo de yema de huevo analizadas, aunque permaneciendo la necesidad de eliminar el plasma seminal cuando está presente al 15%. Tampoco la yema de huevo clarificada supuso ninguna mejora, pero sí desventajas a la hora de elaborar los diluyentes. Respecto al uso de la lecitina de soja como crioprotector, ésta podría ser una alternativa viable a incorporar en los medios de refrigeración sin la necesidad de eliminar el plasma seminal. No obstante, tras la crioconservación de espermatozoides lavados y no lavados, en diluyentes a base de LS, la viabilidad espermática fue inferior, observándose una población espermática con membranas intactas pero sin función mitocondrial mayor respecto a los espermatozoides conservados con YHP. En cuanto a la sustitución del crioprotector penetrante y del sistema tampón, el glicerol y el tampón Tris continúan siendo las mejores alternativas en la conservación espermática caprina. La inclusión de BHT como antioxidante en los diluyentes apenas mostró efecto alguno, así como tampoco se observaron diferencias significativas al utilizar diferentes concentraciones de BHT (0.6, 2.0 y 5.0 mM) tras la conservación, tanto en los medios a base de YHP como de LS, aunque en éstos últimos, de nuevo, se observó un notable incremento de espermatozoides con membrana plasmática y acrosomal intactas pero sin función mitocondrial. Finalmente, tras recopilar los resultados obtenidos a lo largo de dos años de experimental, observamos que la viabilidad de los espermatozoides frescos fue superior a los 18 y 30 meses de edad en fotoperiodo positivo (final de la primavera) respecto a los 14 y 25 meses de edad en fotoperiodo negativo (final del otoño). El uso de implantes de melatonina en primavera afectó negativamente la viabilidad y resistencia al shock hipoosmótico del semen fresco y refrigerado, así como la motilidad total en los refrigerados. Por último, existen diferencias entre individuos tanto en el semen fresco como refrigerado y descongelado, identificando tres tipos de individuos: buenos, moderados y malos congeladores.
The main objective of present doctoral thesis was to optimize the semen cryopreservation of goat from Blanca de Rasquera breed. For this, four studies were designed. In the first study we assessed the replacement of fresh egg yolk by powdered egg yolk (PEY), to reduce the risk of microbiological contamination of extender, and the effect of the clarified fresh egg yolk obtained by centrifugation. Simultaneously, we also assessed the effect of the presence of seminal plasma on sperm freezability from males of one and two years old. In the second study, the aim was to substitute the penetrating cryoprotectants (glycerol vs trehalosa) and non-penetrating (PEY vs soybean lecithin (SL)), and the inclusion of the antioxidant BHT and Test zwitterionic-buffer, instead of Tris, in the extenders. The aims of third study were to determine whether SL-based media is a viable alternative in the preservation of goat sperm in the presence of seminal plasma and to determine the optimal concentration of the antioxidant BHT in PEY or SL-based media. Finally, the fourth study was conducted to assess sperm quality throughout the year, the addition of antioxidants (BHT or melatonin) in the extenders, and the application of melatonin implants in males in spring. In addition, we assessed the effect of donor age and the individual in the freezability of goat sperm. After a complex analysis of sperm quality during preservation, we can conclude that the PEY can be used in place of fresh egg yolk in the extenders for cryopreservation goat semen, since, regardless of donor age, there was not superiority in any of the egg yolk types, remaining the need to remove seminal plasma when the medium containing 15% egg yolk. The use of clarified egg yolk did not confer any benefit to the fresh egg yolk, complicated the process of drawing up preservation media. Regarding the use of SL as a cryoprotectant, this could be a viable alternative to incorporate in preservation at 5°C media, without the need to remove seminal plasma. However, after cryopreservation of washed and unwashed sperm, in LS-based media, sperm viability was low and the population of sperm with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function was high compared with sperm preserved PEY. Related to the replacement of penetrating cryoprotectant and the buffer, Tris-buffer system and glycerol were still the best alternative in preserving goat sperm. The inclusion of BHT as an antioxidant in extenders showed hardly any effect, nor when using different concentrations of BHT (0.6, 2.0 and 5.0 mM) after preservation, in PEY or SL-based media, although in the latter, again were observed a significant increase of spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function. Finally, after compiling the results throughout two years of experimental period, we observed that the viability and resistance to hypoosmotic shock of fresh spermatozoa was higher at 18 and 30 months old males during positive photoperiod (late spring) compared to the 14 and 25 months old males during negative photoperiod (late autumn). The use of melatonin implants in spring negatively affected the viability and hypoosmotic shock resistance of fresh and cooled semen, and the total motility in cooled semen. Finally, individual effect exists on buck sperm cryopreservation, identifying 3 types of males: good, average and bad freezers.

1) INTRODUCCIÓN

Las benzodiacepinas son unos fármacos ampliamente usados en nuestros días para el tratamiento clínico de síntomas relacionados con la ansiedad, pero estos fármacos producen por otro lados efectos miorrelajantes, anticonvulsivantes e hipnóticos. Las benzodiacepinas median estos efectos a través del receptor benzodiacepínico central el cual está unido a receptor del GABA y del ionóforo del cloro.

Aunque estos efectos farmacológicos están mediados a través del receptor benzodiacepínico central (Costa y col, 1979), existe otra clase de lugares de unión a las benzodiacepinas cuyo mecanismo de acción es menos claro. Estos lugares de unión se encuentran localizados tanto a nivel de tejidos periféricos (Baestrup and Squires, 1977) y en el cerebro, concretamente a nivel de la glia (Awad and Gavish, 1987, 1989). A este lugar de unión se le denomina receptor benzodiacepínico periférico, existiendo ligandos específicos para este lugar como son el Ro 5-4864 (que presenta una estructura de tipo benzodiacepínica y se diferencia del diazepam, que presenta una elevada afinidad por el receptor benzodiacepínico central, por la presencia de un cloro en posición 4') y el PK 11195 que presenta una estructura de isoquinoleínico.

Los objetivos del presente trabajo han consistido en llevar a cabo un estudio a nivel molecular para la caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tracto genital de rata. Asimismo, se ha realizado un estudio para demostrar una posible interacción entre este receptor con el receptor de la testosterona y con el receptor mitocondrial de las dihidropiridinas de alta capacidad y baja afinidad. También hemos considerado de interés ver el papel que puede desempeñar el ligano endógeno propuesto para este receptor, la protoporfirina IX.

Se planteó la necesidad de realizar estudios con tejido humano y más concretamente en próstata humana, debido al posible interés de este receptor como marcador de neoplasias.

En el presente trabajo se ha realizado un estudio para demostrar la existencia de un transporte de la adenosina a nivel mitocondrial y el papel que desempeñan las benzodiacepinas a nivel periférico inhibiendo dicho transporte.

2) METODOLOGÍA

Los tejidos de roedores se han obtenido a partir de ratas Sprage-Dawley macho adultas de 250-275 gramos ce peso (C.E.R.J., Le Genest, Francia). Los animales fueron estabulados en condiciones estándar de temperatura y mantenidos en un ciclo de oscuridad de 12 horas. Los animales se sacrificaron y los tejidos se homogeneizaron con un Polytron. El extracto crudo mitocondrial se obtuvo por doble centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante obtenido en este proceso se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min. Para cuantificar el contenido proteico del "pellet" obtenido se utilizó el método de Bradford, que se fundamenta en la utilización de un colorante Coomasie Brillant Blue G-250 que se une a la proteína al cabo de 2 min., formándose un complejo que se lee al espectrofotómetro a 595 nm.

Los estudios de Binding se realizaron usando [(3)H]-Ro 5-4864 y [(3)H]-PK 11195. El volumen del ensayo fue de 0.250 ml incluyendo 0.125 de la preparación mitocondrial. Las muestras fueron incubadas entre 0-4ºC durante 60 min. La incubación se terminó por filtración con ayuda del vacío a través de filtros Whatman GF/B que habían sido tratados previamente con polietilenenimna. Los filtros se colocaron son viales de centelleo y se añadió "cockteil" de centelleo, determinándose la radioactividad retenida en los filtros al cabo de 24 horas.

Para les estudios de transporte [(3)H] adenosina se utilizó testículo de rata realizándose los estudios a los 5 min.

3) RESULTADOS

Los estudios realizados en tejido de trata muestran la existencia de un lugar de unión de elevada afinidad tanto para el Ro 5-4864 en vesícula seminal, próstata y conducto deferente como para el PK 11195 en próstata de rata. En tejido de próstata humana se observa una disminución muy patente en la afinidad del Ro 5-4864 mientras que el PK 11195 continua teniendo en humanos una afinidiad dentro de un orden nanomolar. Los estudios cinéticos vienen a confirmar la elevada afinidad del PK 11195. Estos resultados confirman que en la especie humana el receptor benzodiacepínico periférico se aleja de una estructura relacionada con la molécula benzodiacepínica para reconocer de manera selectiva una estructura de tipo isoquinoleínico.

Se ha realizado un estudio comparativo entre tejido prostático de rata y humano y dentro del tejido humano se han comparado muestras control con muestras de adenoma de próstata. Se ha comprobado una mayor población de receptores benzodiacepínicos periféricos en tejido humano respecto a roedores y no se encuentran diferencias significativas entre tejido de adenoma de próstata y control, con lo cual el papel del receptor benzodiacepínico periférico como marcador de neoplasias queda en entredicho. Los estudios de competición demuestran que el PK 11195 presenta una afinidad de orden nanomolar en tejido de rata y humano, mientras que el Ro 5-4864 presenta una elevada afinidad en roedores. Se demuestra una interacción de tipo no competitivo entre los inhibidores del "carrier" ADP/ATP y el receptor benzodiacepínico periférico. Los compuestos que actúan inhibiendo el transporte de la adenosina desplazan con una afinidad dentro del orden micromolar la unión del Ro 5-4864 y del PK 11195. La protoporfirina IX presenta una afinidad dentro del orden micromolar para el receptor benzodiacepínico periférico en roedores. Se demuestra que este efecto no se realiza a través del receptor benzodiacepínico periférico.
The clinical use of benzodiazepines is due to their specific binding to the central benzodiazepine receptor, which is linked to the GABA receptor and ion chloride channel. At present there are no clinical applications based on the interaction of drugs peripheral benzodiazepine receptor. The aim of the present study is to investigate and characterize [(3)H]-Ro 5-4864 and [(3)H]-PK 11195 binding sites in rat and humans. PK 11195 had higher affinity by the peripheral type benzodiazepine receptor than Ro 5-4854 in human prostate. In rat the affinity was in nanomolar range for this receptor. The Ro 5-4864 binding in rat was inhibited no competivively by atractyloside and alpha, beta-methylene ATP, suggesting a modulation by the ADP/ATP mitochondrial carrier. We postulate that [(3)H]-Ro 5-4864 binding sites are regulated by purine nucleotides in a allosteric fashion, a result suggesting the involvement of these binding sites in mitochondrial metabolism, which could explain why both Ro 5-4864 and PK 11195 decrease respiratory control in isolated rat kidney mitochondria. Protoporphyrin IX the most potent endogenous ligand inhibitor of [(3)H]-PK 11195 binding (Verma and Snyder, 1989) was also able to displace [(3)H]-Ro 5-4864 binding but only a micromolar concentration range. Clonazepam, a characteristic central benzodiazepine ligand, did not displace [(3)H]-binding site. Flutamide is able to displace Ro 5-4864 and PK 11195 only a micromolar concentrations. However, the slopes of competition curves not differ from unity, we have characterized an adenosine carrier in rat mitochondria. Peripheral benzodiazepines inhibited the adenosine transporter in the micromolar range.

El de la raza de Lidia ha sido seleccionado durante siglos por caracteres relacionados al comportamiento, una peculiaridad que la distingue del resto de las razas vacunas, principalmente seleccionadas por características de interés productivo, como carne y leche. En España, la población de Lidia originaria ha sido estudiada por medio de información genómica, permitiendo conocer que la riqueza genética de ésta raza se debe al aporte proporcionado por cada uno de los múltiples encastes o linajes en los que se subdivide. En México la raza de Lidia representa un legado histórico y cultural importante y actualmente, su población no ha sido caracterizada genéticamente. En esta tesis analizamos la diversidad y estructura genética de la población Mexicana y la comparamos con información proveniente de la población originaria Española utilizando información genómica mediante diferentes tipos de marcadores moleculares. Primero analizamos los parámetros de diversidad genética en ambas poblaciones con marcadores autosómicos de tipo Microsatélite y Polimorfismos de nucleótido único, encontrando valores similares de heterocigosis esperada con ambos tipos de marcadores moleculares. Encontramos también valores elevados en términos de FIS en ambas poblaciones. Tanto los valores elevados de FIS en los encastes así como el comportamiento que presentan las Carreras de Homocigosis son consecuencia del bajo censo de los encastes, contribuyendo por ende a incrementar la tasa de endogamia. También encontramos una alta diferenciación genética entre poblaciones con ambos tipos marcadores moleculares; microsatélites y SNPs. La partición de la variabilidad genética total analizada con SNPs mostró que el 19% de la variación se explica por las diferencias genéticas entre linajes. Curiosamente, la estructura genética de la población mexicana reveló que comparte escasos orígenes genéticos en común con la población originaria española, ubicando a ambas poblaciones en grupos diferentes. El análisis de cromosoma Y mostró que la Casta Navarra ha dejado huella paterna en la población mexicana mediante una frecuencia elevada en el haplotipo H6, exclusivo de ésta casta así como del encaste de Miura. Los análisis de ADN mitocondrial, por otro lado, revelaron patrones de haplotipos similares en ambas poblaciones. Por último, considerando la peculiaridad en la selección de esta raza, realizamos un análisis para detectar huellas de selección que pudieran afectar caracteres asociados a comportamiento de tipo agonista, utilizando dos razas mansas españolas como referencia. Utilizando dos métodos que se basan en inferencias bayesianas, identificamos en común dos regiones genómicas seleccionadas. A demás, la dirección e intensidad en la frecuencia del alelo seleccionado en la raza de Lidia es opuesto a los de las razas mansas. En éstas regiones detectamos genes asociados a rutas metabólicas como las de la serotonina y la dopamina, así como genes expresados en corteza cerebral, los cuáles han sido relacionados con patrones de comportamiento agresivo en humanos y animales de laboratorio.
The cattle of the Lidia breed have been selected during centuries for behavioral related traits, a peculiarity that distinguishes it from the rest of the bovine breeds, selected mostly for characteristics of productive interest, such as meat and milk. In Spain, the original Lidia population has been studied through genomic data, allowing to know that the genetic richness of the breed is owed to the contribution of each of the multiple lineages or encastes in which it is subdivided. In Mexico, the Lidia breed represents an important historical and cultural legacy and currently, its population has not been genetically characterized. In this thesis we analyze the genetic diversity and structure of the Mexican population and compared it with data from the original Spanish population by using genomic information derived from different types of molecular markers. First, we analyzed parameters of genetic diversity in both populations using Microsatellite and Single Nucleotide Polymorphisms autosomal markers, finding similar values of expected heterozygosities with both types of molecular markers. We found also high values in terms of FIS in both populations. Both, the high values of FIS in the lineages and the behavior of the Runs of Homocigosity are a consequence of the lineages´ low census, contributing hence to increase the inbreeding rate. Furthermore, we detected high genetic differentiation between populations with both types of molecular markers: microsatellite and SNP, and the partition of the total genetic variability analyzed with SNPs showed that 19% of the variation is explained by the genetic differences among lineages within populations. Curiously, the genetic structure of the Mexican population revealed that it shares few common genetic origins with the original Spanish population, placing both populations in different groups. The Y chromosome analysis evidenced the paternal footprint that Casta Navarra has left in the Mexican population through a high frequency of the H6 Haplotype, exclusive of this lineage. Mitochondrial DNA analyzes, on the other hand, revealed similar haplotype patterns in both populations. Finally, considering the peculiarity of the selection performed in this breed, we carried out an analysis to detect signatures of selection that could affect agonistic behavioral related traits, using as a reference two tamed Spanish breeds. Using two methods based on Bayesian inferences, we jointly identified two selected genomic regions. Also, the direction and intensity in the frequency of the allele selected of the Lidia breed is opposite to that of the tame breeds. In these regions were detected genes associated to metabolic pathways such as serotonin and dopamine, as well as genes expressed in the brain cortex, which have been related to patterns of aggressive behavior in humans and laboratory animals.

La raza ovina Xisqueta, propia del N-O de Catalunya, se caracteriza por su gran rusticidad y máxima adaptación a los sistemas productivos de alta montaña, por su pigmentación centrífuga, típica del Tronco Ibérico al que pertenece, y por ser de producción cárnica. Es una raza muy apreciada por los ganaderos de las zonas de montaña donde se localiza, pero el abandono del sector agrario en éstas ha provocado su regresión censal durante las últimas décadas y, en la actualidad, se encuentra en peligro de extinción. Por ello, el presente trabajo tiene como objetivo el estudio de la raza Xisqueta a distintos niveles, para poder contribuir así al conocimiento y caracterización de la misma y para poder sentar las bases de un posible programa de conservación. Para conocer el funcionamiento de las explotaciones de la raza, se realizó una encuesta a un total de 108 ganaderos de las comarcas del Pallars Jussà, Pallars Sobirà y Alta Ribagorça. Se diseñó un amplio cuestionario que abarcaba aspectos que consideramos de interés, tales como el censo, manejos productivo y reproductivo, sanidad, instalaciones y otras cuestiones, y los datos obtenidos fueron tratados estadísticamente. Los resultados indicaron que los sistemas reproductivos más utilizados son las cubriciones controladas y la monta continua, mientras que el sistema productivo es el extensivo tradicional, en sus variantes de la trashumancia y los pastos estantes. En la Alta Ribagorça el porcentaje de xisquetas por explotación es más elevado que en las otras dos comarcas. Por otro lado, se realizó un estudio de la evolución censal de las ganaderías, también mediante un cuestionario, para ver la variación de las mismas tres años después del primer análisis y para valorar sus expectativas de futuro. En el intervalo de tiempo mencionado había desaparecido el 17% de las explotaciones y el censo de xisquetas se había reducido significativamente. Además, según los ganaderos, en los próximos diez años desaparecerá el 65% de las ganaderías restantes. A nivel morfológico, se colaboró con los ganaderos en la definición del patrón racial de la Xisqueta y, por otro lado, se realizó un estudio cuantitativo mediante la toma de veintiséis medidas y el cálculo de doce índices corporales en 304 animales. Los resultados obtenidos permitieron caracterizar morfológicamente a la Xisqueta e indicaron que es longilínea a mediolínea, eumétrica y dolicocéfala. A nivel genético molecular se quiso caracterizar la raza y comprobar su posible aislamiento en los distintos valles y regiones montañosas donde se ubica, por lo que en el esquema de trabajo se estructuró el territorio en catorce subpoblaciones o zonas. En éstas, se realizaron 622 extracciones sanguíneas, que fueron analizadas mediante marcadores moleculares de ADN de tipo microsatélite. Los resultados indicaron que la Xisqueta posee una elevada variabilidad genética y que no está estructurada reproductivamente por regiones. La combinación de 13 microsatélites utilizada en el estudio resultó ser un método efectivo para la asignación de paternidades en la raza.
The Xisqueta sheep breed, located in the north-western region of Catalonia, is characterized by its hardiness and suitability to high mountain pasture, by its centrifugal pigmentation (a typical trait of the Iberian Trunk from which it is descended), and by the value of its meat production. The Xisqueta is a very valuable breed for the mountainous areas where it is farmed, but the decline in the agricultural sector has led to a significant reduction in their population to the point where the breed is threatened with extinction. Because of this threat to their extinction, the objective of this work is a multi-layered study of the characteristics of the Xisqueta breed with a view to the establishment of an appropriate conservation program. In order to understand commercial farming techniques and practices, a survey of 108 Xisqueta farmers from the administrative divisions comprising a number of municipalities of the Pallars Jussà, Pallars Sobirà and Alta Ribagorça. An extensive questionnaire was designed which included questions related to the overall number of animals, productive and reproductive management, animal health and welfare, shelter (if any), sanitary conditions etc., and the collated data was statistically analyzed. The results showed that the most-commonly used reproductive management systems are controlled covering and continuous mounting, while the most common feeding regimens are traditional, extensive pasturing, augmented by "shepherding" over extended periods and enclosed "stay" pastures. In the Alta Ribagorça the percentage of Xisquetas per farm is higher than in the other administrative divisions within the study region. Additionally, the evolution of the population of the breed was monitored over a three-year period by several census studies and farmer questionnaires. During this period, the number of farms had reduced by 17 percent with a similar reduction in the Xisqueta population. Moreover, anecdotal evidence provided by the farmers themselves suggests that the loss of farms will continue over the next ten years, further reducing existing farms by some 65 percent. To facilitate the morphological study of the breed, and in close collaboration with the farmers, quantitative standards (some 26 in all) based on 12 appropriately-selected body indices were developed, and 304 animals were examined and measured. The results obtained enabled the Xisqueta breed to be characterized morphologically as longilinear to mesolinear, eumetrical and dolichocephalic. At the genetic molecular level, the study also wished to examine whether the genetic variability of the Xisqueta breed was affected by its possible isolation in the different valleys and mountainous areas where the breed is located. The studied region was subdivided into fourteen sub-populations or areas; blood samples were taken from 622 animals, which were then analyzed by microsatellites (DNA molecular markers). The results showed than the Xisqueta breed has a high genetic variability and that is not structured reproductively by regions (or indeed limited by the topographical features). The combination of the 13 microsatellites used in the study was an effective method to assign parenthood in the breed.

Se estudiaron los principales parámetros de valoración de la aptitud al ordeño mecánico en 232 ovejas lecheras de raza Manchega (Mn) y Lacaune (Lc), de distintas edades y potencial productivo, sometidas a dos ordeños diarios. Los caracteres se evaluaron antes del ordeño de la tarde, a los 30, 60 y 120 días post-parto. Se empleó también la ecografía para valorar el área cisternal de ambas razas y su capacidad productiva, además de un bloqueador de la oxitocina para estudiar el fraccionamiento de leche en la ubre.
Las ovejas Lc, de mayor productividad, presentaron ubres grandes de pezones pequeños, mientras que las Mn mostraron ubres más pequeñas con pezones grandes. Los caracteres morfológicos aumentaron con la edad, y los de ubre decrecieron a lo largo de la lactación, además de relacionarse positivamente con la leche producida. Las ubres con mayor altura de cisterna tendieron a presentar pezones menores y horizontales, con una peor adaptación al ordeño.
Los caracteres lineales propuestos para pezones y ubre se correlacionaron estrechamente con sus respectivas variables biológicas, y menos entre sí. Al realizar una evaluación subjetiva de la ubre (Gallego et al., 1983), se observó que los Tipos de ubre evolucionaron según la edad, no modificándose a lo largo de la lactación.
En el estudio ecográfico, las ovejas Lc presentaron mayor área y volumen de leche cisternal. Dichos caracteres, en ambas razas, se mostraron correlacionadas entre sí, con la producción de leche y con las medidas de ubre. Los resultados permiten afirmar que la ecografía es eficaz para evaluar el tamaño de la cisterna y la capacidad productiva de las ubres ovinas.
El análisis factorial mostró que las variables morfológicas se agrupan según tamaño de ubre, pezón, y altura de las cisternas más ángulo de inserción. Se propuso una nueva Tipología de ubre (conglomerados), observando que ésta es propia de cada raza, no está relacionada con la producción de leche, se mantiene constante a lo largo de la lactación, y varía con la edad de los animales, evolucionando hacia ubres peor conformadas.
Al estudiar el fraccionamiento de leche, se observó que la superioridad productiva de la raza Lc se fundamente en una mayor cantidad de leche cisternal almacenada y leche máquina emitida. Las fracciones de ubre y ordeño se relacionaron positivamente con el área ecográfica de la cisterna.
La cinética de emisión de leche mostró que la mayor parte de los animales, en un porcentaje similar en ambas razas, presentaron dos picos de emisión. Se definió un tipo de curva "en meseta", con mayores volúmenes y tiempos de emisión, aunque con similares caudales. Los parámetros de cinética se mostraron relacionados entre sí, con la producción de leche, el área cisternal y las fracciones.
La utilización de un antagonista de la oxitocina, permitió obtener el fraccionamiento de leche en la ubre, de un modo eficaz y con fiabilidad.
The objective of this project was to study the main aspects of milkability in 232 dairy Manchega (Mn) and Lacaune (Lc) ewes belonging to a different age groups and productivity. Two milkings par day were performed. Udder traits were measured before the evening milking, at 30, 60 and 120 days post-partum. To determine the area of the mammary gland and the production capacity in both breed, the ultrasonography method was used, as well as an oxytocin blocking agent for the study of the milk storage in the udder.
Lc sheep showed a higher milk production, larger udder and shorter teats. Otherwise, Mn ewes showed a smaller udder and bigger teats. Mammary morphology traits in both breeds reached the maximum values in ewes of three or more lactations. Udder sizes traits decreased through lactation and were positively related to milk production. Udders with a larger cistern height tended to present smaller teats with higher insertion angle, which implies a worse milkability.
Linear traits proposed were correlated to the descriptive morphological traits measured, and low related between them. Furthermore, the frequency of udder types evaluated following the typology proposed by Gallego et al. (1983) were high according to parity number, although it was not affected by the stage of lactation.
Ultrasound cistern area and the amount of cisternal milk were larger in Lc sheep. These characters were correlated in both breeds as well as milk production and udder size. Results showed that mammary ultrasonography is an efficient method to evaluate the cistern size and the productive capacity of the ovine udder.
The factor analysis showed that three factors (udder size, teat size and teat insertion angle and cistern height) explain an important amount of the variability. An new udder typology was proposed (clusters) for both breeds and presented enough differences to be grouped according to udder types characteristics of the breed, but there is any possibility to establish a universal udder classification. Udder types in our classification did show stability throughout lactation, but tended to evolve negatively as the age of the ewe increased.
The study of milk partitioning showed that the milk superiority of Lc ewes depends on machine milk fraction and amount of cisternal milk. A positive relation of the cisternal milk and the milking machine fraction with the cisternal area was observed.
The more frequent milk kinetics type was "2 peaks", reaching a similar proportion in both breeds. The "in plateau" type curve proposed showed larger volume and time of emission, without change in the milk flow. Positive correlation was observed in both breeds for total milk production, kinetic parameters, cisternal area and milk fractions.
The use of an oxytocin antagonist is useful in order to obtain the real cisternal milk and to analyse the actual differences in milk partitioning of dairy sheep with fiability.

Els nitrils són compostos químics que contenen el grup ciano: C N. Són molt abundants en la naturalesa, però la seva síntesi és també molt important pel gran ventall d'aplicacions que aquests aporten a la indústria. A la naturalesa els trobem, entre d'altres, en forma de glucòsids cianogènics com és el cas de l'amigdalina a les ametlles amargants i la linamarina a la mandioca, i en forma d'aminonitrils, forma que es troba a les lleguminoses del gènere Lathyrus. A la indústria s'utilitzen com a dissolvents i productes intermediaris en la síntesi de plàstics, fibres artificials, resines, productes farmacèutics i altres substàncies químiques. El consum humà o animal de determinats nitrils provoca símptomes similars a la intoxicació per cianur. Aquest fet suggereix que en la metabolització d'aquests nitrils es produeix l'alliberament d'aquest compost i que seria el responsable de la intoxicació aguda. Alguns nitrils però, en aquest procés de metabolització alliberen menys cianur o n'alliberen més lentament i aquests són els que provoquen neurotoxicitat i síndromes neurològiques. L'estudi d'aquest tipus de nitrils adquireix importància com a models de neurotoxicitat i de síndromes de toxicitat humanes causades per nitrils d'origen natural.
A la primera part d'aquest treball de tesi s'ha pogut caracteritzar exhaustivament les dianes del 3,3'-iminodipropionitril (IDPN), l'al·lilnitril, el cis-crotononitril, el trans-crotononitril i el 2,4-hexadienenitril al sistema nerviós de la rata i establir la relació entre les lesions estructurals i els efectes comportamentals que aquests provoquen. Per a aquesta caracterització global, s'ha treballat amb un disseny experimental que combina experiments histopatològics amb tests d'avaluació comportamental animal. Els resultats han permès dividir els nitrils neurotòxics en dos grups, els que afecten al sistema nerviós central (trans-crotononitril i hexadienenitril) i els que afecten els sistemes sensorials (IDPN, al·lilnitril i cis-crotononitril).
A la segona part de la tesi es demostra que la toxicitat vestibular de nitrils no és un fenomen exclusiu de la rata, sinó que ocorre també en altres espècies incloent-hi mamífers i no mamífers. Aquest resultats obren la porta a l'ús de soques de ratolins transgènics en l'estudi d'aquesta toxicitat.
A la tercera part de la tesi s'estudia el paper de la metabolització d'aquests nitrils per a provocar els efectes neurotòxics. Concretament s'ha avaluat la bioactivació de la toxicitat vestibular del cis-crotononitril i l'al·lilnitril mitjançant el citocrom P450 2E1 utilitzant ratolins 129S1, ratolins transgènics pel citocrom P4502E1 i inhibidors selectius (Dial·lilsulfur) i no selectius (Aminobenzatriazol) d'aquest citocrom. A més, en aquesta segona part s'explica el procés d'optimització d'una metodologia que permet detectar simultàniament cianur i nitrils volàtils en sang, que combina la tècnica SPME (microextracció en fase sòlida) i la cromatografia de gasos amb detector NPD (detector nitrogen-fòsfor). Amb aquests treballs es demostra que tant l'al·lilnitril com el cis-crotononitril són substrats del citocrom P450 2E1 però que mitjançant aquest citocrom s'activa una via cianogènica no necessàriament vestibular. Els resultats obtinguts ens han permès concloure que la toxicitat vestibular d'aquets nitrils depèn d'un citocrom P450 diferent al 2E1 i que la via metabòlica amb efectes vestibulars més probable per a l'al·lilnitril és la de l'epoxidació del doble enllaç en posició beta-gamma.
SUMMARY:

Nitriles are increasingly used in the chemical industry, and they are also common in crop plants. They cause acute lethality, osteolathyrism and neurotoxicity.
In the first part of this thesis, we compared the behavioural effects of IDPN, allylnitrile, cis-crotononitrile, trans-crotononitrile, and hexadienenitrile in the rat using test methods sensitive to the ECC (Excitation with Choreiform and Circling movements) syndrome or to the trans-crotononitrile syndrome. In addition, we assessed the CNS effects of these nitriles with the Fluoro-Jade B stain, which selectively labels degenerating neurons. In conclusion, the present and previous data indicate that neurotoxic nitriles induce one of two syndromes of abnormal motor behaviour: (1) the ECC syndrome caused by IDPN, allylnitrile, and cis-crotononitrile, and resulting from degeneration of the vestibular sensory hair cells with no CNS toxicity role, and (2) the syndrome of faltering movements, caused by trans-crotononitrile and hexadienenitrile, and resulting from degeneration of the inferior olive neurons.
In the second part of this thesis, we demonstrate that nitriles that are toxic to the vestibular and auditory systems of the rat are also ototoxic to other animal species, both mammals and no mammals. The findings open up the possibility of using species other than the rat to study this toxic effect of nitriles and the possibility of using nitriles for inner ear research performed in diverse animal species.
In the third part of this thesis, we assessed the hypotheses that the vestibular or lethal toxicities of cis-crotononitrile and allylnitrile depend on CYP2E1-mediated bioactivation. Wild-type (129S1) and CYP2E1-null mice were exposed to cis-crotononitrile and allylnitrile in either a baseline condition or following exposure to 1% acetone in drinking water to induce CYP2E1 expression. In parallel groups, concentrations of cis-crotononitrile, allylnitrile and cyanide were assessed in whole blood using an optimized SPME GC-NPD methodology. Also further groups of animals were used to test the effect the non selective P450 inhibitor 1-aminobenzotriazole and the CYP2E1-selective inhibitor diallylsulfide on the toxicity of allylnitrile. We conclude that allylnitrile and cis-crotononitrile are CYP2E1 substrates and that CYP2E1-mediated metabolism of these nitriles leads to cyanide release and acute mortality, while a different P450 system bioactivates these nitriles for vestibular toxicity. We propose that CYP2E1 acts on allylnitrile by alfa-carbon hydroxylation and that an action on the beta-gamma-double bound is more likely responsible for the vestibular effect.
Los nitrilos son compuestos químicos que contienen el grupo ciano: -CN. Son muy abundantes en la naturaleza, pero su síntesis es también muy importante por el amplio rango de aplicaciones que estos aportan a la industria. En la naturaleza los encontramos en forma de glucósidos cianogénicos, como la amigdalina de las almendras amargas y la linamarina de la yuca, y en forma de aminonitrilos, forma que se encuentra en las leguminosas del género Lathyrus. En la industria se utilizan como disolventes i productos intermediarios en la síntesis de plásticos, fibras artificiales, resinas, productos farmacéuticos i otras sustancias químicas. El consumo humano o animal de determinados nitrilos provoca síntomas similares a la intoxicación por cianuro. Este hecho sugiere que en la metabolización de estos nitrilos se produce la liberación de este compuesto y que sería el responsable de la intoxicación aguda. Algunos nitrilos, en este proceso de metabolización, liberan menos cianuro o lo hacen de forma más lenta y estos son los que provocan neurotoxicidad y síndromes neurológicos. El estudio de estos nitrilos adquiere importancia como modelos de neurotoxicidad y síndromes neurológicos de toxicidad humana causados por nitrilos de origen natural.
En la primera parte de este trabajo de tesis se ha podido caracterizar de forma exhaustiva las dianas del 3,3'-iminodipropionitrilo (IDPN), el alilnitrilo, el cis-crotononitrilo, el trans-crotononitrilo i el 2,4-hexadienenitrilo en el sistema nervioso central y establecer la relación entre las lesiones estructurales y los efectos comportamentales que estos provocan. Para esta caracterización global, se ha trabajado con un diseño experimental que combina experimentos hitopatológicos con tests de evaluación comportamental animal. Los resultados han permitido dividir los nitrilos neurotóxicos en dos grupos, los que afectan al sistema nervioso central (trans-crotononitrilo y hexadienenitrilo) y los que afectan a los sistemas sensoriales (IDPN, alilnitrilo y cis-crotononitrilo).
En la segunda parte de la tesis se demuestra que la toxicidad vestibular de nitrilos no es un fenómeno exclusivo de la rata, sino que ocurre también en otras especies incluyendo mamíferos y no mamíferos. Estos resultados abren las puertas a la utilización de ratones transgénicos en el estudios de dicha toxicidad.
En la tercera parte de la tesis se estudia el papel de la metabolización de estos nitrilos para provocar los efectos neurotóxicos. Concretamente se ha evaluado la bioactivación de la toxicidad vestibular del cis-crotononitrilo y el alilnitrilo mediante el citocromo P450 2E1 utilizando ratones 129S1, ratones transgénicos para el citocromo P450 2E1 y inhibidores selectivos (dialilsulfuro) y no selectivos (aminobenzatriazol) de este citocromo. Además, en esta tercera parte se explica el proceso de optimización de una metodología que permite detectar simultáneamente cianuro y nitrilos volátiles en sangre, que combina la técnica SPME (microextracción en fase sólida) y la cromatografía de gases con detector NPD (detector nitrógeno-fósforo). Con estos trabajos se demuestra que tanto el alilnitrilo como el cis-crotononitrilo son sustratos del citocromo P450 2E1 pero que mediante este citocromo se activa una vía cianogénica no necesariamente vestibular. Los resultados obtenidos nos han permitido concluir que la toxicidad vestibular de estos nitrilos depende de un citocromo P450 diferente al 2E1 y que la vía metabólica con efectos vestibulares más probable para el alilnitrilo es la epoxidación del doble enlace en posición beta-gamma.

La raça bovina Bruna dels Pirineus és una raça càrnia autòctona de les àrees muntanyoses de Catalunya. Els treballs que conformen la present tesi doctoral pretenen optimitzar l’avaluació genètica que actualment es duu a terme en aquesta raça. Les anàlisis s'han realitzat a partir de 8.130 registres de pes al naixement i 1.245 registres de pes al deslletament de vedells nascuts entre els anys 1986 i 2010, i procedents de 12 i dos explotacions, respectivament. En aquest sentit, el primer dels treballs investiga dues fonts noves de variació genètica d'origen patern en els caràcters pes al naixement i pes al deslletament. En concret, la influència dels gens localitzats a la regió no autosòmica del cromosoma Y i la contribució de l'imprinting patern. S’ha determinat que la regió no autosòmica del cromosoma Y aporta un 2 % de la variància fenotípica del pes al naixement i un 6 % del pes al deslletament. A més, l’imprinting patern repercuteix en un 13 % de la variabilitat en el cas del pes al deslletament, però sense afectar al pes al naixement. El segon treball explora la presència d’efectes genètics additius que influeixen la variabilitat residual en el pes al naixement, i caracteritza la tendència genètica dels diferents ramats després d'anys de selecció estabilitzadora per a aquest caràcter. El model de variàncies heterogènies amb els efectes sistemàtics del tipus de part i del ramat-any-estació, també contribuint al terme residual, ha obtingut el millor ajust estadístic, detectant-se variància genètica residual amb una correlació moderada i positiva de 0,44 respecte la variabilitat genètica directa. Es van observar tendències genètiques tant positives, com negatives i nul·les per als valors millorants directes, fet que suggereix l’aplicació real de criteris heterogenis de selecció per a aquest caràcter per part dels ramaders de la raça Bruna dels Pirineus. Per als efectes genètics residuals no es van detectar tendències genètiques rellevants a excepció d'un ramat que incrementava sistemàticament la variabilitat durant els darrers anys. Finalment, a l’últim treball es descriu la presència de purga de la depressió endogàmica tenint en compte la contribució combinada de coeficients parcials de consanguinitat i del nombre de generacions transcorregudes entre l’individu consanguini i l’ancestre que origina la consanguinitat (de 1,5 a 7,5 generacions en aquestes anàlisis). En el cas de la Bruna dels Pirineus s'ha determinat un 14,6 % de vedells consanguinis amb una consanguinitat mitjana lleugerament inferior al 10 %. Aquests han representat el punt de partida per identificar un efecte decreixent de la depressió endogàmica sobre el pes al naixement a mesura que augmentava la distància generacional entre l'individu consanguini i l'ancestre que originava la consanguinitat. A tall d'exemple, un coeficient de consanguinitat parcial del 15% originaria una reducció en el pes al naixement de més de mig quilogram si el seu origen es situa 1,5 generacions enrere, mentre que es reduiria a poc més de cent grams si l'ancestre responsable es troba a l'inici de la genealogia, a 7,5 generacions de distància. En conjunt, aquests estudis aporten noves parametritzacions per capturar fonts de variabilitat genètica additiva que actualment escapen dels procediments sistemàtics d'avaluació genètica de la raça, així com modelen detalladament la contribució de la depressió endogàmica, la qual no s'acostuma a considerar en els models d'avaluació genètica. A més de la importància específica per a la Bruna dels Pirineus, les contribucions científiques derivades d'aquesta tesi doctoral representen un punt de partida molt destacable per a la indústria bovina càrnia d’arreu del món, optimitzant procediments d'avaluació que poden ser adaptats a la majoria de races.
The Bruna dels Pirineus beef cattle breed is an autochthonous breed located in the mountainous regions of Catalonia. The researches involved in this dissertation aimed to optimize the genetic evaluation procedures currently used in this cattle breed. All analyses were performed on 8,130 records of birth weight and 1,245 records of weaning weight from calves born between years 1986 and 2010 from 12 and two herds, respectively. The first research studied two new sources of sire-specific genetic variance on birth and weaning weight. More specifically, this accounted for the contribution of loci located in the non-autosomal region of Y-chromosome and paternal imprinting. It has been demonstrated that the non-autosomal region of Y-chromosome contributed 2 % of the phenotypic variance of birth weight, whereas this percentage rose up to 6 % for weaning weight. Additionally, paternal imprinting accounted 13 % of the phenotypic variability of weaning weight, although without contributing on birth weight. The second research evaluated the presence of additive genetic effects influencing residual variability of birth weight; moreover, this also characterized the within-herd genetic trend after several years of stabilizing selection. The model accounting for heterogeneous residual variance included two systematic effects in the residual term (birth type and herd-year-season) and obtained the best goodness-of-fit. This model detected a relevant source of residual additive genetic variability, that being moderately and positively correlated with direct additive genetic variability (genetic correlation: 0.44). Positive, negative and even null within-herd genetic trends were described for direct genetic effects, these suggesting heterogeneous selection criteria across herds. Focusing on residual genetic effects, there were not relevant within-herd genetic trends with the only exception of one herd that systematically increased residual variability during last years. The last research described the purge of inbreeding depression on birth weight in the Bruna dels Pirineus, after accounting for the combined contribution of partial inbreeding coefficients and the number of generations between the inbred calf and the ancestor originating identity-by-descent (from 1.5 to 7.5 generations in our case). The data set included a moderate percentage of inbred calves (14.6 %), with the average inbreeding coefficient being slightly smaller than 10 %. The effect of inbreeding depression on birth weight decreased when increasing the number of generations between the inbred calf and the ancestor originating identity-by-descent. As a representative example, a 15% partial inbreeding coefficient reduced birth weight in ~500 g or ~100 g, depending on the number of generations elapsed (1.5 and 7.5 generations, respectively). As a whole, these studies contribute novel parameterizations capturing new sources of additive genetic variability; note that they currently escape from systematic procedures of genetic evaluation in the Bruna dels Pirineus beef cattle breed. Moreover, inbreeding depression has been modeled in detail, and this parameterization can be updated in a broad range of genetic evaluation models. It is important to note that in addition to the relevance for the Bruna dels Pirineus itself, scientific developments and results from this dissertation must be viewed as a very appealing starting point for the beef industry worldwide, optimizing genetic evaluation procedures that could be applied to the majority of breeds.

En l'estudi de l'ansietat, models animals com ara les soques de rates Roman High i Low-Avoidance (RHA-I i RLA-I respectivament), seleccionades per llur alta o baixa adquisició de l'evitació activa en dos sentits, han demostrat tenir una gran validesa. A la primera part d'aquest treball es presenta l'avaluació d'aquestes soques a la prova de resposta de sobresalt potenciada per por i a la de condicionament de por clàssic. Tal com seria predictible, en base a la seva conducta en altres proves d'ansietat, les rates RLA-I van mostrar més potenciació per por de la resposta de sobresalt i més condicionament de por, mesurat com a resposta de petrificació.
En la segona part es presenta, per primera vegada, l'avaluació conductual d'una gran mostra de rates genèticament heterogènies N/Nih-HS en una bateria de sis proves d'ansietat incondicionada i condicionada. Les soques genèticament heterogènies són una eina molt valuosa pels estudis de mapeig genètic d'alta resolució de "QTLs" (Quantitative Trait Loci), que poden permetre la identificació de gens. L'anàlisi factorial de les dades mostra una estructura multidimensional de les conductes relacionades amb la por i l'ansietat. En tots dos sexes, s'obté ha un primer factor anomenat de "Timidesa" que agrupa totes les variables relacionades amb la por de les proves incondicionades, i un segon factor en el que pesen les mesures de resposta de sobresalt ("Fugida defensiva"). Així, el present treball proporciona evidència de que existeixen relacions entre conductes d'ansietat incondicionades i d'altres condicionades. Els diferents tipus d'anàlisis estadístiques mostren resultats coherents, proporcionant per tant un cert índex de consistència interna. Els resultats d'aquest treball representen un bon punt de partida per al posterior estudi de marcadors genètics ("QTLs") de la conducta ansiosa en rates. De fet, es presenten dades preliminars que indiquen l'existència d'un QTL per a la conducta ansiosa, obtingut amb mètodes d'alta resolució, a la posició 100 Mb del cromosoma 5 de les rates N/Nih-HS. En la regió cromosòmica definida per aquest QTL es troben menys d'una desena de gens coneguts. Actualment, s'estan portant a terme estudis per avaluar la possible expressió diferencial d'aquests gens en àrees cerebrals vinculades a l'ansietat i la por en les rates RHA-I (poc ansioses) i RLA-I (molt ansioses).

Determinadas razas autóctonas de asnos (Andaluza, Catalana, Mallorquina, Asno de las Encartaciones y Zamorano-Leonesa) han sufrido a lo largo del tiempo importantes y frecuentes variaciones cuantitativas, generalmente negativas y particularmente atribuibles al olvido técnico impuesto por la marginación que ha provocado la explotación de otras especies y la industrialización del campo. La disminución de sus efectivos y el cruce indiscriminado con otras razas las ha conducido al estado de razas en peligro de extinción (RD 1682, 1997), y ha conllevado a un gran confusionismo descriptivo de sus características etnológicas. El objetivo último y fundamental del proyecto CICYT AG98-0503 que se está llevando a cabo, es sentar las bases para la conservación, mantenimiento y mejora de los animales que integran cada una de estas razas, centrándose principalmente en las fases I, II y III del protocolo marcado por la FAO para poblaciones en peligro de extinción, es decir, en la conservación "in situ". Esta tesis doctoral se ha centrado en una parte de la fase II del programa de conservación, concretamente en su caracterización racial a nivel morfológico, hematológico y bioquímico clínico. Para ello, se ha llevado a cabo un trabajo de campo centrado en la búsqueda de ejemplares de las 5 razas en distintas comunidades autónomas, con la finalidad de reflejar la situación actual de la población, tomar diferentes medidas zoométricas para realizar su caracterización fenotípica (morfológica), así como extraer muestras sanguíneas, para poder establecer los valores de referencia y normalidad tanto a nivel hematológico, bioquímico y de proteínas plasmáticas. Se efectuaron extracciones sanguíneas a 491 animales de ambos sexos, tanto jóvenes como adultos; y en los animales adultos, o sea, aquéllos mayores de 3 años (317 animales), fueron tomadas un total de 26 medidas corporales (cefálicas, troncales y extremidades) para el análisis biométrico. La descripción y análisis de los parámetros estadísticos de tendencia central y de dispersión, así como el estudio y análisis de los factores: edad, sexo y raza, tanto para las variables hematológicas, bioquímicas, proteínas plasmáticas y morfológicas, nos proporcionaron valores de referencia fiables para ser utilizados tanto en la caracterización racial como en el ámbito clínico.
Mediante la caracterización morfológica, aspiramos a la diagnosis racial; esto es, al encuadre del animal objeto de observación y estudio, a un grupo etnológico diferenciado. Los resultados obtenidos a partir de las 26 mediciones biométricas nos proporcionaron datos importantes para diferenciar unos animales de otros, para agruparlos en conjuntos específicos y, fundamentalmente, para deducir proporciones que a su vez indiquen aptitudes funcionales. Estas proporciones las obtuvimos con el análisis de 12 índices zoométricos corporales (etnológicos y funcionales), los cuales evidenciaron las relaciones existentes entre algunos elementos de compacidad, alzada, longitud y peso. El análisis de las correlaciones entre las 26 medidas morfométricas, para cada una de las razas y por sexos, permitieron identificar las interacciones existentes entre y dentro las distintas regiones corporales (tronco, extremidades y cabeza), y el análisis factorial de componentes principales (ACP) permitió observar el grado de relación existente entre dichas razas, así como determinar las variables de mayor importancia en la definición morfoestructural, con la finalidad de reducir el número de variables a emplear en la caracterización práctica y rutinaria de los animales en trabajos posteriores, reduciendo así la complejidad de los mismos. Para ello la matriz de datos de las 26 variables zoométricas estudiadas fue sometida a un análisis multivariante, es decir, sometimos los datos a un análisis canónico, en el que las variables fueron transformadas en variables canónicas (factor I, II y III). Estos tres factores resumieron en total un 99,71 % de la información aportada por las 26 variables de origen, el factor I contribuyó en un 95,85 %, el factor II en un 3,25 % y el factor III en un 0,61 % al total de la varianza explicada. El perímetro torácico, alzada a la cruz, diámetro longitudinal, alzada a las palomillas, alzada al nacimiento de la cola, alzada al dorso, alzada a la pelvis, y la alzada a la grupa, diámetro dorso-esternal y longitud de la cabeza, determinaron principalmente el factor I siendo éstas por tanto, las variables de mayor peso en la caracterización racial
Por otro lado, el análisis del nivel de divergencia existente entre las 5 poblaciones de asnos estudiados, basándonos en caracteres cuantitativos, lo realizamos mediante el uso de la Distancia de Mahalanobis, así como con el análisis de componentes principales (ACP). Los resultados mostraron la existencia de tres grupos, sin una evidencia clara de agrupamiento por distancia geográfica. Por ello, debemos suponer que la filogenia y evolución morfológica de los asnos peninsulares ha sido un proceso complejo, englobando distintos patrones de diferenciación para los distintos grupos de caracteres, debido probablemente a la acción medioambiental y a presiones selectivas desiguales. Las mayores diferencias las encontramos entre la raza Andaluza y el Asno de las Encartaciones, mientras que las menores se localizaron entre el asno Zamorano-Leonés y el Mallorquín. Tanto en el ACP como en el cálculo de la distancia de Mahalanobis observamos como la raza Zamorano-Leonesa es la que de algún modo se encontraría en medio de todas ellas, es decir, la que presenta menores distancias morfológicas con las cuatro restantes.
Los resultados de los principales estadísticos descriptivos, analizados en el estudio de 15 variables hematológicas, 11 variables bioquímicas y proteínas plasmáticas, nos proporcionaron los valores de normalidad en cada una de las razas. El análisis de varianza para el factor raza indicó la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre las 5 poblaciones de asnos. La edad resultó ser el factor modulador con más peso sobre los parámetros sanguíneos, ya que las diferencias encontradas entre animales jóvenes (<3 años) y adultos (>3 años) fueron notables (11 de 15 variables hematológicas y 7 de 11 bioquímicas presentaron diferencias significativas). Sin embargo, las diferencias encontradas para el factor sexo reflejaron la existencia de un bajo dimorfismo sexual en lo referente a parámetros hematológicos y bioquímicos, y nulo en cuanto a las proteínas plasmáticas.
Certain autochthonous breeds of donkeys (Andaluza, Catalana, Mallorquina, Encartaciones and Zamorano-Leonesa) have suffered important and frequent quantitative variations throughout the time, that generally have been negative, probably due to the intense mechanization of the country-side and the introduction of other species of asses. The decrease of the census of their populations and the indiscriminate mixture with other breeds have lead them to the state of "endangered breeds" (RD 1682, 1997), and have done confuse their ethnic characteristics. The main objective of this thesis is first of all, reflect the present situation of the Spanish donkey breeds and in the other hand, make the biometrical, haematological and biochemical characterization of their endangered populations. This work has followed the rules marked by the FAO Expert Consultation for the identification of possible stocks for conservation and as basic tool for the study, maintenance and conservation of animal genetic biodiversity.
For the biometrical study 317 adult animals (older than 3 years) have been sampled and a total of 26 corporal measures (cephalic, trunk and extremities) for each individual were taken. The results obtained from these measurements provided us important information to differ individuals from others, to group them in specific sets and, mainly, to deduce proportions that indicate functional aptitudes. We obtained these proportions analysing 12 corporal indices (ethnological and functional), which demonstrates the existing relationships between some elements of compactness, height, length and weight.
For the haematological, biochemical and plasma proteins study, blood samples have taken from 491 animals of both genders and age (young and adult). The description and analysis of the average, variance, and age, sex and race factors provided us guaranteed reference values to be used for the racial characterization and for the clinical scope.
The correlation's analyses between the 26 corporal measures, for each one of the breeds and genders, allowed identifying the existing interactions between and within the different corporal regions (trunk, extremities and head). The factorial analysis of principal components (ACP) allowed to observe the existing relationship degree between these breeds, and to determine the most important variables of the morphological definition, with the purpose to reduce the number of variables to be used in the practical and routine characterization of the animals in later studies, reducing then the complexity of them. To do it, all the information of the 26 corporal variables was subject to a multivariate analysis, in fact, subject in a canonical analysis, where the variables were transformed into canonical variables (factor I, II and III). These three factors summarized 99.71 % of the information by the original 26 variables, the factor I contributed in 95.85 %, factor II in 3.25 % and factor III in 0.61 % to the total of the explained variance. The thoracic perimeter, length diameter, withers height, sacrum height, root of tail height, back height, pelvis height, and rump height, the back-sternal diameter and head length, mainly determined factor I, being the heaviest weight variables for the racial characterization.
On the other hand, using the Mahalanobis Distance, and also with ACP, we obtained the divergence level between the 5 donkey populations studied, according on quantitative characters. The results showed the existence of three groups, without clear evidence of clustering by geographic distance. For this reason, we must suppose that phylogenetic and morphologic evolution of the peninsular donkeys have been a complex process, including different patterns of differentiation for the different characters groups, probably coming from the environmental action and to unequal selective pressures. The greater differences were found between the Andaluza and Encartaciones breeds, while the minors were located between the Zamorano-Leonesa and Mallorquina. Using the ACP and also in the Mahalanobis Distance, we observed that the Zamorano-Leonesa breed is the one that presents minor morphologic distances with the others.
The analysis of breed factor of 15 haematological parameters, 11 biochemical parameters and plasma proteins indicated the existence of statistically significant differences between the 5 populations analyzed. Age had the most influence on blood parameters because the differences found between young and adult animals were remarkable (11 of 15 haematological variables and 7 of 11 biochemical ones presented significant differences). In contrast, less significant differences between genders were found for sex factor so we demonstrate the existence of a low sexual dimorphism for haematological and biochemical parameters.

L'objectiu d'aquest estudi ha estat caracteritzar la colitis induïda amb Trichinella spiralis en rata i investigar les semblances que comparteix amb la colitis ulcerosa.
S'ha utilitzat la tècnica del bany d'òrgans aïllat per l'estudi de l'activitat mecànica, els microelèctrodes intracel·lulars per l'estudi de l'activitat elèctrica i tècniques d'immunohistoquímca i/o immunofluorescència pel marcatge de neurotransmissors i la caracterització de determinats tipus cel·lulars.
Les rates infectades presenten 2 períodes de disminució d'ingesta i pes. El primer es dóna entre el dia 1 i 4 post infecció (PI) i el segon entre els dies 11 i 15 PI, a partir del dia 15 les rates es recuperen sense arribar als valors observats en els animals control. Les rates infectades presenten a més a més leucocitosi amb neutrofília i eosinofília del dia 6 al 21 PI. La consistència de les femtes disminueix i la presència de mucus augmenta del dia 2 al 20 PI. Les troballes histològiques en aquest model consisteixen en: atròfia epitelial, edema, hiperplàsia de la mucosa i edema de la submucosa a dia 2 PI; microúlceres i larves en la mucosa i edema submucós sever amb augment de l'infiltrat inflamatori a dia 6 PI; a dia 14 PI s'observa regeneració de la mucosa i presència d'algunes larves; a dia 30 PI no s'observa cap tipus de lesió inflamatòria. El nombre de cèl·lules immunoreactives a l'OX-6, que reconeix l'antigen del complex major d'histocompatibilitat de tipus II (MHCII), es troba dramàticament incrementat al plexe mientèric i submucós de les rates infectades (6-14 PI). El nombre de cèl·lules immunoreactives a l'ED1, que s'expressa en monòcits i macròfags de rata, es troba molt incrementat en ambdós plexes submucosos dels animals infectats. La inflamació colònica induïda amb T. spiralis també es caracteritza per un increment en l'expressió de la iNOS a l'epiteli i infiltrat inflamatori de la mucosa i submucosa, i s'associa a la disminució de la motilitat colònica observada en les rates infectades. Les tires circulars del còlon d'aquestes rates presenten a més a més una resposta disminuïda a l'acetilcolina i/o al clorur potàssic; en canvi, la depleció del calci intracel·lular disminueix més marcadament la contracció induïda per acetilcolina en les rates infectades. Aquesta troballa suggereix que la utilització del calci extracel·lular pot estar alterada durant la inflamació colònica per T. spiralis. El potencial de membrana de les cèl·lules musculars llises del còlon inflamat es troba més hiperpolaritzat que en animals control. Els potencials d'unió de tipus inhibitori (IJPs) tenen una durada disminuïda en el còlon inflamat, fet que suggereix una disminució en l'alliberament d'òxid nítric des de les motoneurones inhibidores del plexe mientèric. La disminució en el nombre de neurones immunoreactives a la nNOS observada en el plexe mientèric de rates infectades, pot explicar la disminució observada en la durada dels IJPs.
El model de colitis induïda per l'administració intra rectal de larves de T. spiralis presenta semblances amb la colitis ulcerosa, tant pel que fa el curs clínic com les troballes histològiques i les alteracions funcionals. La presència de macròfags ED1 positius que expressen MHC II podrien mediar els canvis neurals i alteracions musculars que s'observen en aquest model; per altre costat, l'increment en l'expressió de la iNOS contribueix a l'increment de l'activtat d'aquest enzim i dóna lloc a la formació de quantitats molt grans d'òxid nítric. L'increment en la síntesi d'òxid nítric és un factor determinant per l'agreujament de la inflamació contribuint al desenvolupament de dany tissular, i pot ser considerat un factor rellevant en la disminució de motilitat i contractilitat que observem en aquest model.
We intended to study to what extent T. spiralis-induced colitis shares similarities with UC and may thus be useful as a model of such human disease
Colitis was induced by an intra-colonic enema of T. spiralis larvae. We examined the temporal relationship between the severity of inflammation and the altered contractility of the underlying circular muscle as well as the role of NANC inhibitory pathways in the disruption of the motility pattern. Colitis was induced by intrarectal administration of T. spiralis larvae. Responses to acetylcholine (ACh) and increased extracellular potassium as well as the effect of tetrodotoxin (TTX, 1 µM), L-nitro-N-arginine (L-NOARG, 1 mM) and apamin (1 µM) were determined in vitro in the organ bath with circular muscle strips from sham and infected rats at days 2-30 postinfection (PI). Microelectrode recordings were performed to study the putative changes in electrical activity of colonic smooth muscle cells. Whole mounts preparations of the SMP and MP were used for immunofluorescence studies.
Altered stool consistency was found from day 1 to 21 PI; leukocytosis peaked on days 6-21 PI. Edema and cell infiltration were found in mucosa and submucosa (day 2-14 PI). Contractility displayed a disorganized pattern with decreased high amplitude low frequency (HALF) contractions. A progressive fading of spontaneous activity was observed and was partly restored in strips devoid of submucosa. iNOS immunoreactivity increased in epithelial and infiltrating cells (days 2-14 PI). Responses to ACh and KCl were decreased at all days PI compared to sham. Intracellular calcium depletion had a greater inhibitory effect in inflamed tissue (6-14 PI). The effect of TTX, L-NOARG and apamin on the spontaneous contractions was found to be altered in all infected rats, i.e. their effects were transient and milder. Inflamed tissue showed lower resting membrane potential and a decreased duration of inhibitory junction potentials induced by electrical stimulation. PGP9.5-immunoreactive neurons were decreased in the myenteric plexus (MP) and were significantly reduced in the submucous plexus (SMP) at 14 days PI. Substance P innervation of submucosal blood vessels was also reduced after infection. No changes in vasoactive intestinal peptide, choline acetyl transferase and CGRP immunoreactivity were observed.
These data suggest that the decreased contractility of colonic circular smooth muscle induced by the intrarectal T. spiralis infection results from NO generated from mucosal and submucosal iNOS, the impairment of the excitation-contraction coupling, from a persistent hyperpolarization of smooth muscle cells and from impaired NANC inhibitory neurotransmission. The reduction in NOS neurons appears to underlie changes in gut motility. Macrophages are found extensively in the enteric plexuses and may play a pivotal role in the neuromuscular alterations.
This model of colitis bears some traits with changes observed in ulcerative colitis and might thus be useful to study the dismotility observed in this human disease.

Uno de los grandes desafíos a los que se enfrenta la cirugía oncológica es el tratamiento de las metástasis hepáticas bilobares del carcinoma colorectal. Tan sólo un 20% de los pacientes son resecables en el momento del diagnóstico, debido fundamentalmente a un volumen del remanente hepático insuficiente para mantener la homeostasis del organismo. En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas quirúrgicas encaminadas a inducir un estímulo hipertrófico en el remanente hepático (ligadura/embolización portal). Sin embargo, el elevado tiempo de espera para obtener un volumen de remanente suficiente conllevaba la progresión tumoral en muchos casos. La asociación de ligadura portal selectiva y transección hepática in situ (ALPPS) es una técnica de resección hepática en dos tiempos caracterizada por la inducción de un mayor estímulo hipertrófico en el remanente hepático en un tiempo significativamente más corto. Los mecanismos por los que se produce tal estímulo proliferativo son aún desconocidos, aunque se piensa que la transección hepática juega un papel clave en el proceso. El objetivo de nuestro estudio es comparar el proceso regenerativo en el remanente hepático que acontece en la técnica ALPPS, comparado con la técnica de ligadura portal selectiva en un modelo experimental en rata. MATERIAL Y MÉTODOS Para la realización de nuestro estudio se utilizaron un total de 90 ratas SD distribuidas en 3 grupos de 30 animales a los que se le realizaron diferentes técnicas quirúrgicas: grupo control, grupo ALPPS y grupo PVL. El segundo tiempo quirúrgico se realizó al 8º dia. Se tomaron muestras a 1h, 24h, 48h, 8 dias y 12 semanas. Se realizó un estudio histopatológico de las muestras y se analizó la expresión de los siguientes genes: IL1-β, TNF-α, TGF-α, TGF-β, IL-6, EGFR, HGF, STAT-3, NFκB, VEGF y HIF1α . Así mismo, se evaluaron parámetros clínicos y de morbimortalidad. RESULTADOS La técnica ALPPS provoca un mayor estímulo proliferativo de hepatocitos del remanente hepático que la ligadura portal selectiva a las 48 horas. El patrón de expresión molecular es diferente en ambas técnicas, presentando la técnica ALPPS una mayor expresión de mitógenos relacionados con la proliferación de hepatocitos (IL-6, HGF Y TNF-α ) y citoquinas proinflamatorias ( IL-1β, TNF-α) en comparación con la ligadura portal. Sin embargo, la técnica ALPPS induce una mayor morbimortalidad postoperatoria que la ligadura portal selectiva. CONCLUSIONES Nuestro modelo de ALPPS en rata es un modelo válido para el estudio del proceso regenerativo del hígado. Dicha técnica provoca un mayor estímulo proliferativo en el remanente hepático aunque conlleva un aumento de la morbimortalidad postoperatoria. La respuesta regenerativa inducida por dicha técnica está mediada por una compleja interacción de citoquinas donde las citoquinas proinflamatorias parecen jugar un rol importante.
INTRODUCTION Only 20% of patients diagnosed with hepatic metastasis of colorectal carcinoma are resectable at the time of diagnosis, mainly due to a insufficient volumen of the liver remnant to maintain homeostasis. The association of portal vein ligation and liver transection (ALPPS) is a two-stage hepatectomy technique characterized by inducing a greater hypertrophic stimulus in the remnant liver in a significantly shorter period of time than conventional techniques (portal vein ligation / embolization), and might reduces the risk of tumor progression. The mechanisms by such proliferative stimuli occurs are still unknown, although it is thought that liver transection plays a key role in this process. The aim of our study is to compare the regenerative response in the liver remnant in ALPPS procedure, compared with portal vein ligation (PVL) in a rat model. MATERIAL AND METHODS A total of 90 SD rats were divided into 3 groups of 30 animals (control, ALPPS and PVL), with a second step (hepatectomy) at 8 days in ALPPS and PVL groups, evaluating morbidity and mortality. We performed morphometry of the liver remnant at 1h, 24h, 48h, 8 days and 12 weeks. Liver samples for immunohistopathology, analysis of mRNA expression ( for IL1-β, TNF-α, TGF-α, took TGF-β , IL-6, EGFR, HGF, STAT-3, NFkB, VEGF and HIF1α) were taken, as well as blood samples for biochemistry and clotting tests. RESULTS ALPPS procedure causes a greater proliferative stimuli of the hepatocytes in the remnant at 48 hours tan portal vein ligation. The molecular expression pattern is different in both techniques, being the expression of mitogens related to hepatocyte proliferation (IL-6, TNF-α and HGF) and proinflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) increased in ALPPS compared with PVL. However, ALPPS induces more postoperative morbidity and mortality that PVL. CONCLUSION Our ALPPS procedure model in rat is a valid model for the study of liver regeneration. This technique induces a greater proliferative stimuli in the liver remnant but leads to increased postoperative morbidity and mortality. The regenerative response induced by this technique is mediated by a complex interaction of cytokines, where proinflammatory cytokines seem to play a key role.

Los procedimientos quirúrgicos actualmente disponibles frente a la enfermedad pulmonar avanzada, irreversible y terminal son la cirugía de reducción de volumen pulmonar y el trasplante de pulmón. Expandir la práctica del trasplante de pulmón constituye uno de los grandes retos que la neumología y la cirugía torácica tienen delante. La posibilidad de solucionar los problemas citados constituye el motor de la investigación en transplante de pulmón.

Introducció
El treball "Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata" parteix de la hipòtesi de treball de què la carcinogènesi i el desenvolupament són processos que comparteixen mecanismes de funcionament com són l'elevat índex de proliferació, la capacitat de migració cel·lular o l'angiogènesi sostinguda i que, per tant, deuen compartir els gens que els regulen. Amb aquest plantejament a l'horitzó, aquest treball té com objectiu detectar gens implicats en el desenvolupament per, en un futur proper, estudiar si estan o no implicats en la carcinogènesi.
Per detectar gens durant el desenvolupament es va utilitzar una tècnica de fingerprinting, RNA arbitrarily primed PCR ( RAP-PCR). La RAP-PCR és una tècnica destinada a l'estudi d'expressió gènica diferencial que utilitza, com a material, RNA de les diferents mostres que es volen comparar. En primer lloc el RNA s'ha de convertir a cDNA mitjançant la retrotranscripció (RT) amb la utilització d'un primer de disseny arbitrari. El cDNA obtingut s'amplifica per una reacció de PCR que, en la RAP-PCR, presenta tres particularitats: temperatures baixes d'hibridació en els primers cicles, augment de concentració de sals a la mescla i la utilització d'un primer arbitrari, el mateix o no de la RT. El resultat és l'amplificació d'un determinat nombre de seqüències de DNA que, mitjançant una electroforesi, es visualitzen com un patró de bandes en un gel desnaturalitzant d'acrilamida, poden així comparar-se l'expressió de cada transcrit entre les diferents mostres.

Material i mètodes
El material, per a la realització de la tècnica de RAP-PCR, es va obtenir mitjançant microdissecció de fetus (E17-E20) procedents de 7 rates (Rattus norvergicus) gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley). Els segments microdissecats corresponien a subdivisions amb criteris anatòmics i embriològics, del tub digestiu des de l'estómac fins al recte. Dels diferents segments microdissecats es va realitzar l'extracció de RNA amb el mètode d'extracció amb tiocianat de guanidini i fenol-cloroform (Chomczynski i Sacchi, 1987). A partir del RNA es va realitzar la retrotranscripció, mitjançant l'acció de l'enzim M-MLV i amb la participació d'un primer arbitrari (D4S 2912-GT), obtenint-se, d'aquesta manera, una primera selecció de cDNAs. El cDNA obtingut es va amplificar per PCR, amb les característiques descrites prèviament, i utilitzant el mateix primer que en la retrotranscripció (D4S 2912-GT). Els productes de PCR varen ser sotmesos a electroforesi en gels de seqüenciació obtenint-se com a resultat un patró de bandes característic i reproduïble. Les diferents bandes es varen retallar dels gels, varen ser eluïdes en aigua i conservades a 4ºC. Després de l'estudi dels patrons d'expressió dels diferents seqüències en els gels d'acrilamida es varen seleccionar 10 bandes per a la seva clonació i posterior seqüenciació.
Per a dur a terme la clonació, les bandes es varen lligar al plasmidi pCR2.1, per l'acció d'una lligassa durant 16 hores a 14ºC de temperatura. El producte del lligatge es va utilitzar per transformar, per xoc tèrmic, bacteris competents de l'espècie Escherichia coli (soca To F-10) que, després d'un temps curt de creixement, es sembraven a plaques de Petri que contenien LB-Agar. Després de 14-16 hores de creixement es seleccionaven les colònies de bacteris que havien incorporat el plasmidi amb l'insert i mitjançant PCR es confirmava la incorporació de l'insert de la mida (núm. de parells de bases) desitjada. Amb la informació proporcionada per la PCR s'efectuava la selecció de clons per realitzar la seqüenciació automàtica. Les seqüències obtingudes per la tècnica de la seqüenciació automàtica eren analitzades mitjançant el programa BLAST a les bases de dades de la NCBI i de la UCSC, obtenint-se un llistat d'homologies amb gens seqüenciats en diferents espècies i en el genoma humà, respectivament.
A fi de confirmar els resultats i obtenir una informació precisa de la localització de l'expressió es va realitzar la tècnica de la hibridació "in situ" de la banda que, segons la seqüenciació, corresponia a un fragment d'hsp86. Per a tal fi es varen construir ribosondes sense i antisense a partir d'un dels clons bacterians que havien incorporat l'insert. Per a la construcció de les ribosondes, la banda va ésser transferida al plasmidi pBluescript SK, que posseeix promotors de T3 i T7 RNA polimerases (per a la síntesi de les sondes sense o antisense, respectivament), a diferència del pCR2.1 que només en posseeix un d'ells. La síntesi de les ribosondes es va realitzar mitjançant l'acció de les RNA polimerases T3 o T7, utilitzant nucleòtids marcats amb digoxigenina pel marcatge de la sonda i com a motlle el plasmidi linealitzat. La tècnica de la hibridació "in situ" es va efectuar sobre talls sagitals, realitzats en criòstat i adherits a portaobjectes, de fetus sencers de rata, fixats per perfusió amb Paraformaldehid al 4% en PB, procedents de 4 rates gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley) de 17 a 20 dies de gestació.
Resultats i discussió

Els resultats d'aquest treball varen ésser obtinguts a tres nivells:
1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida
2. Anàlisi de les seqüències
3. Hibridació "in situ"

1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida:
Els patrons de bandes en els gels d'acrilamida varen mostrar patrons d'expressió de les diferents bandes, que varen ser identificades per un codi de lletres i números. Aquests resultats varen proporcionar la informació per a decidir les bandes a seqüenciar però en cap cas varen ser considerats com a resultats definitius.
2. Anàlisi de les seqüències:
Donat que la metodologia de la RAP-PCR amplifica tot tipus de RNAs, en el nostre cas, hem obtingut tres seqüències de RNA ribosòmic (H3, N0 i N1.2), dues procedents del genoma mitocondrial (E3 i G1), tres RNAs missatgers (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein) i, finalment, dues seqüències (J2 i N1.1) han mostrat una seqüència desconeguda de nucleòtids. Respecte a les seqüències que varen mostrar màxima homologia amb RNAs missatgers l'anàlisi bioinformàtica ens va proporcionar la següent informació:
La banda G0, que a la RAP-PCR s'expressa més intensament a la part més anterior del duodè, va mostrar homologia d'un 93% amb Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) i d'un 87% amb Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 és homologa a nivell del seu exó 1 amb Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 que s'ha clonat en un estudi en el que es va considerar com un probable gen supressor de tumors, donada la seva expressió diferencial en dues línies cel·lulars, l'una tumoral i l'altre no. (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).
La banda M2, que a la RAP-PCR s'expressa a les diferents localitzacions sense diferencies remarcables, ha mostrat homologia d'un 92% amb Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein i d'un 84% amb Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , per la qual cosa considerem que és homòloga al gen de l'atròfia òptica tipus 1, a nivell del seu domini GTP.
La banda F8, que a la RAP-PCR s'expressa a les mostres corresponents a les parts més distals del tub digestiu, va mostrar homologia d'un 98-100% amb Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homòloga a la hsp 90a humana.
3. Hibridació "in situ" :
La Hibridació "in situ" amb les sondes construïdes a partir de la banda F8, corresponent a un fragment del gen de la hsp86 de la rata, va mostrar els següents resultats: la sonda sense no va mostrar hibridació a cap dels talls estudiats i la sonda antisense va mostrar un patró d'expressió molt conservat a les diferents edats del període fetal de la rata. Les localitzacions en les que va hibridar la sonda antisense, amb diferents intensitats de marcatge, són, amb una ordenació craniocaudal, les següents: escorça cerebral, capa ependimaria dels plexes coroïdals, epiteli de les cavitats nasal i nasofaringea, glàndules salivals, glàndules glossopalatines, epiteli de revestiment dels bronquis de gran mida, timus, greix bru, ganglis raquidians, cèl·lules hematopoètiques o hepatòcits a nivell hepàtic, epiteli i serosa del intestí prim i gros, escorça renal i suprarenal i cèl·lules germinals del testicle.
Dels resultats obtinguts en la HIS amb la sonda F8 destaquem que existeix expressió del gen de la hsp86 en els epitelis nasal i bronquial, revestiment ependimari dels plexes coroïdals i en cèl·lules germinals del testicle, localitzacions en les què les cèl·lules presenten cilis o flagels. Els cilis i flagels estan formats per una estructura interna, l'axonema, constituïda, en vertebrats, per nou doblets de microtúbuls que n'envolten a dos centrals. Cada microtúbul esta format per protofilaments constituïts per heterodímers d'a i b tubulina. Es coneix bé que la hsp90a es la xaperona que col·labora en el plegament de les tubulines, pel que considerem que l'expressió de la sonda F8 en les localitzacions en les que hi ha elements mòbils, es deu a aquest fet.
S'ha relacionat hsp90a amb càncer degut a què aquestes proteïnes col·laboren en el plegament de proteïnes necessàries pel creixement i la divisió cel·lular. Per altre banda, Mizuno et al (2001) recentment han descrit la interacció de hsp90a i hsp90b amb Pim-1, un protooncogén relacionat amb proliferació cel·lular en limfomes i leucèmies. Així mateix, s'ha observat sobrexpressió d'hsp90a en diferents tipus de càncer (d'endometri, de pàncrees, de mama, de nasofaringe, de glàndules salivals i en leucèmies), alguns dels quals es desenvolupen en teixits a on s'expressa la sonda F8 durant el període fetal de la rata. Tots aquests fets recolzen la relació de hsp90a amb hiperproliferació i càncer.
Recapitulant, veiem que en aquest treball hem trobat dues seqüències G0 (Chaperonin subunit 5 (epsilon)) i F8 (hsp 86) que podem relacionar amb càncer, el primer com a probable gen supressor de tumors i el segon com a gen relacionat amb proliferació cel·lular. Creiem que després d'aquest treball, en el que només es pretenia identificar gens del desenvolupament, la porta que pretenem travessar en la següent fase, per relacionar genèticament càncer i desenvolupament, està una mica més oberta.
Introduction
"Detection and study of gens implicated in the prenatal development of the rat" is a doctoral thesis based on the working hypothesis that carcinogenesis and development are processes that share functional mechanisms, such as high proliferation index, celular migration ability and sustained angiogenesis, and consequently it must share the gens that regulate them, too. With this idea in mind the objective of this work is the detection of development implicated gens in order to, in a future, determine its implication in carcinogenesis.
In order to detect genes during development the fingerprinting technique RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) was used. RAP-PCR is a technique for the study of differential genic expression that use RNA from different samples to be compared. First, RNA is transformed in cDNA through retrotranscription (RT) using of an arbitrary primer. cDNA is then amplified by a PCR that, in RAP-PCR, displays three peculiarities: low hibridization temperatures in the first cicles, an increase in the concentration of salts in the mix and the use of an arbitrary primer, the same of the RT or not. The result is the amplification of a determined number of sequences of DNA that can be observed as a fingerprinting pattern in a denaturalising acrilamide gel, thus permitting to compare transcrit expression between two samples.

Material and Methods
For the RAP-PCR technique, the material was obtained by microdissection of fetusses (E17-E20) from 7 pregnant rats (Rattus norvergicus) of the OFA strain (Sprange-Dawley line). The microdissected segments corespond to subdivisions with anatomic and embryologic criteria, from stomach to rectum. The RNA extraction from the microdissected segments was done by the Guanidium tiocianate extraction method (Chomczynski & Sacchi, 1987). Once the RNA was obtained, the retrotranscription was done, through the action of the M-MLV enzime and the participation of an arbitrary primer (D4S 2912-GT), obtaining, in this way, a first cDNA selection. The cDNA was amplified by PCRs, with the previously described characteristics, and using the same primer than in the retrotranscription (D4S 2912-GT). PCR's products were submited to electrophoresis in sequentiation gels, obtaining a characteristic and reproducible pattern. The different bands were cuted out from the gels, eluted in water and keeped at 4ºC. After analyzing the expression patterns of the different transcrits in acrilamide gels, ten bands were selected for its clonation and posterior sequentiation.
To carry out the clonation the bands were ligated to pCR®2.1 plasmidium, by the action of a ligase enzime during 16 hours at 14ºC. The ligation product was used to transform by thermic shock competent E Coli bacteriums (To F-10 strain) that, after a short growing period, were sow in Petri plaques containing LB-Agar growing media. After 14-16 hours of growing, the bacterial clones that had incorporated the plasmidium with the insert were choosed and was confirmed by PCR which of them had the insert with the expected size, in order to select them for the automatic sequentiation. The obtained sequences were analized through BLAST programe in the NCBI and UCSC data bases, obtaining, in this way, homologies with gens in different species and in human genome, respectively.
In order to confirm the results and to obtain accurate information on the localization of the expression, "in situ" hibridization technique of the band that, according to sequentiation, corresponded to a hsp86 fragment, was performed. For that purpose riboprobes sense and antisense were constructed from one of the bacterial clones that had incorporated the insert. For the construction of the riboprobes, the band must be transferred to the pBluescript SK plasmidium, that possesses promotors of the T3 and T7 RNA polimerases (for the sintesis of the sense and antisense probes, respectively), diferently of pCR2.1 that only has one of them. Riboprobes Synthesis of the was done by the action of RNA polimerases T3 and T7, using digoxigenin marked nucleotides, in order to mark the probe, and the linealizated plasmidium as mould. The "in situ" hibridization was done over sagital sections, carried out in criostate and adhered to glass slides , of whole rat fetuses, fixed by perfusion with 4% Paraphomaldehid in PB, obtained from 4 pregnant rats of the OFA strain (Sprague-Dawley line) at the 17-20 days of pregnancy.

Results and discussion
Results of this work were obtained in three levels:
1. Band pattern in the acrilamide gels
2. Sequences analysis
3, "In situ" hybridization

1. Fingerprinting pattern in the acrilamide gels:
Fingerprinting patterns showed expression patterns of the diferent bands, that were identified by a number and a letter code. These results gave us the information for deciding wich which bands to be sequenciate, but in no case this was considered to be definitive.
2. Sequence analysis:
Due to the fact that RAP-PCR amplifies all kinds of RNA, we have obtained in our study three sequences of rRNA (H3, N0, N1.2), two from the mitochondrial genome (E3 and G1), three mRNA (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein). Finally, two sequences (J2 i N1.1) have shown a unknown nucleotid sequence. In respect to the sequences that showed the highest homology with mRNA, the bioinformatic analysis gave us the following information:
The G0 band, that in the RAP-PCR is more intensivily expressed in the more anterior part of the duodenum, showed 93% of homology with Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) and 87% with Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 is homologue in exon 1 with Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 that was cloned in a study where it was considered a probable tumor supressor gen, due to its differential expression in two celular lines, one tumoral and not the other (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).
The M2 band, that in RAP-PCR is expressed with no remarkable differences between different localizations, has shown 92% of homology with Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein and 84% with Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , two reasons to consider it homologue with optic atrophy 1 gene, in its GTP dominium.
The F8 band, that in RAP-PCR, is expressed in the more distal parts of the digestive tube, showed 98-100% homology with Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homologue to hsp 90a.
3. "In situ" Hibridization:
The "in situ" hibridization with probes constructed from F8 band, that corresponded to a fragment of the hsp86 gene of the rat, showed the following results: Sense riboprobe showed no hibridization in the studied sections and the anti-sense showed an expression well conserved pattern in the different ages of the fetal period of the rat. Localizations where antisense probe hibridizated, with different mark intensities, were the following, in a craniocaudal order,: Cerebral cortex, ependimary layer of the choroidal plexus, epithelia of the nasal and nasopharinx cavities, salival glands, glosopalatine glands, surface epithelium of the larges bronchii, thimus, brown fat, raquidial ganglia, hematopoyetic cells or hepatocites in the liver, epithelia and serose layer in the small and large bowel, renal and suprarenal cortex and germinal cells in the testes.
From our results obtained by "in situ" hibridization with the F8 probe we emphasize that expression of the hsp86 gene exists in the nasal and brochial epithelia, ependimary layer of the choroidal plexus and germ cells of the testes, all of them locations where cells display cilia or flagelae. Ciliae and flagelae are formed by and internal structure, axonem, consisting in vertebrates, by nine protophylaments constituted by a and b tubulin heterodimers. Is well known that hsp90a is the chaperon that collaborates in the folding of tubulines, reason for which we consider that the expression of the F8 probe in the locations with mobile elements is due to this fact.
Hsp90a has been related to cancer because these proteins collaborate in the folding of the proteins neededfor celular growth and division. In the other way Mizuno et al. (2001) have recently described the interaction of hsp 90a and hsp90b with pim-1, a protooncogen related to celular proliferation in leukemias and limphomas. It has similarly been observed overexpression of hsp90a in different cancers ( endometrium, pancreas, breast, nasopharinx, salival glands and leukemias ), some of them developed in tissues where F8 probe is expressed during the rat fetal period. All these facts support the relation between hsp90a with hyperproliferation and cancer.
Summarizating, we have found in this work two sequences G0 ( Chaperonin subunit 5 (epsilon)) and F8 (hsp86) that can be related to cancer, the first as a probable tumor supressor gene and the second as a gen related to celular proliferation.. We belive that, after this study, that only pretended to identify development gens, the door that we pretend to cross is now a little more open, for genetically relate cancer and development in the next phase.

En el tratamiento de los procesos inflamatorios, no sólo tiene importancia conseguir una buena analgesia, sino poder controlar otros aspectos derivados de este proceso, como son el edema, la extravasación plasmática y la migración leucocitaria que caracterizan la zona inflamada. Si bien hasta el momento se conocen los mecanismos periféricos a través de los cuales los opioides inducen analgesia durante la inflamación, se desconoce el papel preciso del sistema opiode endógeno (SOE; ligandos endógenos y los receptores opioides) en la respuesta inflamatoria. Poco se sabe de la influencia que sobre el SOE ejercen los distintos mediadores liberados durante la respuesta inflamatoria desde estructuras anatómicas implicadas en ésta como son: las terminaciones nerviosas sensoriales, las fibras simpáticas postganglionares, las células inmunes, el endotelio vascular y los mastocitos, hecho que nos ha llevado a profundizar en el estudio del papel que desempeñan los opioides en la respuesta inflamatoria. La expresión de los RO así como su caracterización y función antinociceptiva está bien documentada, no sólo a nivel de SNC sino también en tejidos nerviosos periféricos y células inmunes. Por el contrario, su posible función antiinflamatoria no es tan conocida. Nuestra hipótesis plantea que la modulación opioide del edema y la extravasación plasmática, durante la respuesta inflamatoria aguda, se debe a la activación de RO periféricos y a las posibles interrelaciones que se establecen con otros sistemas endógenos, distintos al opioide e implicados en la inflamación. De los resultados obtenidos se concluye que edema y extravasación plasmática son variables inflamatoririas moduladas por mecanismos distintos, con una importante participación en la modulación de la extravasación de plasma de los opioides endógenos, principalmente las encefalinas. La administración sistémica de opioides m y d induce una respuesta bifásica sobre la extravasación plasmática, dosis-dependiente, de manera que se obtiene un efecto inhibidor a dosis iniciales para llegar a un máximo a partir del cual se recuperar nuevamente los niveles basales de exudado plasmático. El empleo de agonistas/antagonistas que no atraviesan la barrera hematoencefálica demuestra la participación de estructuras periféricas en la modulación de esta variable inflamatoria. Si bien el efecto final obtenido sobre la extravasación es el mismo tras la administración de agonistas m y d, el mecanismo de acción implicado en ello es distinto según el fármaco empleado. Mientras que morfina requiere de terminaciones simpáticas periféricas, receptores opioides d, H2 y H3 activados, fentanilo precisa interaccionar con los receptores opioides principalmente expresados en las terminaciones sensoriales nociceptivas, así como que los receptores H2 y H3 estén activados. No obstante, el bloqueo del H3 lleva a aumentar la formación de exudado plasmático hasta el doble de los valores basales. Los receptores d no requieren la acitvación del sistema histaminérgico para inducir su efecto antiexudativo, si bien, en situaciones en las se ha disminuído la población de fibras nociceptivas o simpáticas los porcentajes de inhibición varían. La participación del sistema inmune en una inflamación aguda periférica en cuanto a la modulación de la extravasación de plasma es irrelevante.
The objective in the treatment of inflammatory processes, is not only achieve a good analgesia, but also control another aspects derivated of this process, like edema, plasma extravasation and cells transmigration towards the injured tissue. To date the opioid peripheral analgesia mechanisms are well known, but not the antiinflammatory effects induced by these drugs. It does not known the influence of OES (opioid endogenous system: receptors (OR) and ligands) over the different mediators release during inflammatory response from: sensorial fibers, sympathetic postganglionar nerve terminals, inmune cells, vascular endothelium and mast cells. By this reason we have sudied in depth the role of opioids in the inflammatory response.
The expression, distribution, characterization and function of OR in the nociceptive response is well documented, not only in mammalian central (CNS) but also in peripheral tissues, inmune and mast cells. Contrary, their possible antiinflammatory funcion is not as well as known. Our hipotesis establish that the opioid modulation of edema and plasma extravasation during acute inflammatory response it's due to the activation of peripheral opioid receptors and the relationships established among other endogenous systems, all the implicated in the inflammation. The results show that edema and plasma extravasation are modulated by different mechanisms, with a very important participation of enkephalins, like endogenous opioids, in the plasma extravasation modulation. The systemic administration of m and d opioids induce a biphasic dose-related inhibition of plasma extravasation. The effects of peripheral agonists/antagonists demostrate the participation of peripheral structures in the modulation of this inflammatory variable. The administration of m and d opioid agonists induce the same effect on the extravasation, although the implicated mechanism is different, according the drug used. While mophine requires sympathetic peripheral fibers, d-opioid, H2 and H3 activated receptors, fentanyl needs its interaction with opioid receptors expressed in the nociceptive fibers principally, and H2 and H3 receptors must be activated, also. However, the blockade of H3 receptor induces an increase on plasma exudated, twice basal value. d-receptors do not need the activation of histaminergic system for inducing their antiexudative effect, still when have been decreased nociceptive and simpathetic fibres we can see a variation on the inhibition percentages. The participation of the inmune system in the plasma extravasation modulation during an acute peripheral inflamation is irrelevant.

Actualment, l’estudi de la relació entre nutrició i salut ha comportat que la immunonutrició esdevingui una ciència d’interès creixent. El cacau és un aliment ric en macronutrients (fibra, proteïnes, carbohidrats i lípids), micronutrients (minerals i vitamines) i conté una quantitat relativament elevada de flavonoides. Aquests inclouen majoritàriament els flavan-3-ols, com (-)-epicatequina, (+)-catequina i procianidines, compostos amb capacitat antioxidant i amb efectes antitumorals, en processos neurodegeneratius i sobre el sistema cardiovascular i el sistema immunitari. És per aquest motiu que el cacau s’ha convertit en un aliment amb gran interès com a potencial nutracèutic. L’al·lèrgia alimentària representa un problema de salut important en els països industrialitzats amb elevada prevalença en la població adulta i sobre tot en infants. Els individus afectats presenten una resposta immunitària anòmala quan ingereixen certs aliments o components alimentaris. La seva patogènia inclou la pèrdua de tolerància oral a proteïnes dels aliments i, en la majoria de casos, s’acompanya de la producció d’IgE. Entre les diferents manifestacions clíniques destaquen les alteracions gastrointestinals, les afeccions cutànies i l’anafilaxi, que pot arribar a xoc anafilàctic i comprometre la vida del pacient. En base a aquests antecedents, l’objectiu principal de la tesi ha estat determinar si la capacitat immunomoduladora del cacau podia ser útil per controlar la patogènia de l’al·lèrgia alimentària i establir el paper dels flavonoides en aquest efecte. De forma preliminar, es va desenvolupar un model d’al·lèrgia no alimentària, que va permetre estudiar els efectes d’una dieta enriquida amb cacau convencional sobre la resposta immunitària i establir variables objectives per avaluar la resposta anafilàctica. L’efecte del cacau en el model d’al·lèrgia desenvolupat mitjançant una única immunització intraperitoneal d’ovoalbúmina (al·lergogen), hidròxid d’alumini i toxina de Bordetella pertussis (adjuvants) va revelar, principalment, que el cacau atenuava la síntesi d’anticossos específics relacionats amb la resposta immunitària Th2. D’altra banda, en aquest mateix model, es van quantificar els canvis produïts en l’activitat motora immediatament després de realitzar una provocació oral. D’aquesta manera es va poder establir una variable objectiva per avaluar l’anafilaxi que es correlacionava inversament amb la concentració de proteasa II mastocitària sèrica. Posteriorment es va desenvolupar un model d’al·lèrgia alimentària en rata mitjançant la combinació d’una única immunització intraperitoneal, com la descrita anteriorment, amb l’administració oral de l’al·lergogen catorze dies més tard i durant tres setmanes. Aquest model es caracteritza principalment per l’exacerbació en la síntesi d’anticossos relacionats amb la resposta Th2 (IgE, IgG1, IgG2a) conseqüent a l’inici de l’administració oral i que ja és patent a la primera setmana. A més, la provocació oral dels animals amb al·lèrgia alimentària va provocar un increment de fins a sis vegades de la concentració de proteasa mastocitària II i de la seva expressió gènica a nivell intestinal. Un cop desenvolupat i caracteritzat el model d’al·lèrgia alimentària, es va determinar l’efecte d’una dieta enriquida amb cacau en aquest model. Els animals van rebre una dieta rica en cacau convencional des del moment de la immunització intraperitoneal i fins al final de l’estudi. El cacau va ser capaç de reduir la síntesi d’anticossos específics associats a la resposta tipus Th2, especialment d’isotip IgE. També va inhibir la secreció de citocines de tipus Th2 i, a més, en realitzar una provocació oral, va protegir parcialment de la resposta anafilàctica ja que va disminuir la síntesi i alliberament de la proteasa mastocitària II. Per identificar si els responsables d’aquest efecte eren els flavonoides, es va determinar sobre aquest mateix model d’al·lèrgia alimentària, l’efecte d’una dieta enriquida amb cacau no fermentat, el qual proporcionava principalment flavonoides i menys proporció d’altres components. Els cacau no fermentat va tenir un cert impacte en l’al·lèrgia alimentària però els seus efectes van ser menys potents que els observats amb la dieta enriquida amb cacau convencional. Per tant, a la vista dels resultats obtinguts, es pot concloure que els flavonoides del cacau no són els únics responsables del seu poder modulador en la resposta Th2. En resum, la intervenció nutricional amb una dieta enriquida en cacau en el model d’al·lèrgia alimentària desenvolupat, demostra l’efecte beneficiós d’aquest aliment i li confereix un interès especial en el camp de la immunonutrició com a potencial nutracèutic.
Nowadays, immunonutrition has become a very interesting issue of study. Due to cocoa has a relatively high content of flavonoids (mainly flavanols such as epicatechin, catechin and procyanidins), and it has a beneficial role in cardiovascular, chronic inflammation and cancer, cocoa has a potential role in immunonutrition as a nutraceutical. On the other hand, food allergy is an immune disease which is caused by food allergens, and is mainly mediated by IgE. During the past decades has become a major public health in westernized countries with an increasing prevalence. Based on these antecedents, the aim of the present study was to ascertain the effect of a cocoa-enriched diet on a food allergy rat model and also to establish the role of cocoa flavonoids in these effects. As a preliminary study, an allergy model by means of an intraperitoneal immunization with ovalbumin (allergen), aluminum hydroxide and toxin from Bordetella pertussis (adjuvants), was achieved. Using this rat model, a diet with conventional cocoa was tested and animals were orally provoked with the allergen to establish unbiased variables to study an anaphylactic response. The conventional cocoa diet was able to reduce Th2-associated antibodies, mainly specific IgE, and cytokines. The anaphylactic response produced a decrease in the number of animal movements which was inversely correlated with serum mast cell protease release. Then, a food allergy model was set up by means of the combination of only one intraperitoneal immunization (as above) with an oral administration of the allergen, fourteen days later and for three weeks. The model was achieved after the first week of oral gavage as demonstrated by a rise in the synthesis of specific antibodies related with Th2 immune response. Finally, using the food allergy model, a nutritional intervention with cocoa was assay. The animals received a conventional cocoa-enriched diet which was able to reduce the synthesis of Th2-specific antibodies and also partially inhibit the anaphylactic response because the diet produced a reduction in the serum concentration of mast cell protease and a down-regulation of its intestinal gene expression. To establish the role of cocoa flavonoids in this immunomodulation, food allergic animals received a diet containing non fermented cocoa which provided mainly flavonoids and no other cocoa components. Although a certain tendency of protection was detected, the conventional cocoa effect was stronger demonstrating that not only flavonoids are responsible for the protection in front of food allergy, and suggesting that cocoa has a high interest in the field of health and immunonutrition.

Per a modelar alguns aspectes bioquímics i anatomopatològics de la malaltia de Parkinson en la rata, en aquesta tesi hem començant utilitzant la neurotoxina MPP+, de relativament recent aparició i la més veterana 6-OHDA i hem acabat emprant el propi neurotransmissor de les neurones que degeneren, la dopamina, intentant esbrinar els seus mecanismes de lesió. L’estudi s’ha iniciat en el animal in vivo, ha continuat en talls gruixuts de teixit ex vivo i ha acabat en mitocondris in vitro. Hem volgut reproduir resultats d’altres grups però amb abordat¬ges experimentals més senzills i econòmics, al nostre abast. Hem volgut aplicar el nostre model animal per a estudis comparatius amb la malaltia humana Per a la introducció he partit d’uns 50 articles de revisió actualitzats, amb la voluntat d’adquirir una visió panoràmica de la malaltia de Parkinson: les hipòtesis etiopatogèniques, les manifestacions clíniques, els trets anatomopatològics i bioquímics, així com dels models animals que s’utilitzen per a reproduir-la. En aquests articles he trobat les referències biblogràfiques per aprofundir en els aspectes més directament relacionats amb els experiments realitzats. Per als resultats, que s’han de contemplar dins el marc de la participació en projectes dels nostre grup i d’altres que utilitzaven aquests models animals d’experimentació, hem triat aquells en els que he participat directament, treballs que en alguns casos han estat els preliminars per altres treballs de doctorat del grup. Pràcticament tots els resultats que presentem han estat publicats, com article, en revistes internacionals, aquí queden recollits en l’apartat d’annexes, raó per la qual en la introducció general no consten alguns conceptes introductoris que apareixen en cadascun d’ells.

En la presente tesis doctoral se evaluo la posibilidad de modificar los sistemas y métodos de ordeño mecánico utilizados habitualmente, con el fin de modificar su rutina y hacerlo lo mas eficaz posible. En una primera experiencia se suprimieron, durante una lactación, los repasos manuales en el ordeño mecánico diario. Como resultado de la supresión, la producción media diaria de leche, y la total ordeñada, se vio disminuida, con lactaciones más cortas. La composición química de la leche y estado sanitario de la ubre, valorado por el indice cmt, no se vieron afectados por la supresión de repasos manuales. El valor de la fracción de "leche de repaso manual" fue semejante a las pérdidas de producción observadas, lo que indica una ausencia de inhibicion de la producción de leche por la supresión de repasos. Las ovejas de 2 picos soportaron mejor la supresion del repaso manual, con una menor perdida de produccion que las de 1 pico y con un fraccionamiento de leche mas favorable al ordeño a maquina. En una segunda experiencia, se comparo el efecto de 2 pulsadores comerciales. La producción de leche, su fraccionamiento y composición quimica no se vieron afectadas por el tipo de pulsador empleado, asi como tampoco la caida de pezoneras y la sanidad de la ubre. Sin embargo, el pulsador de 120 p/mn-50% mantuvo mas tiempo, a lo largo de la lactación, el reflejo de eyección en las ovejas de 2 picos, que fraccionaron la leche a maquina de un modo mas adecuado. Durante la lactación disminuyeron, fundamentalmente, los valores del volumen y caudal del 2 pico. En una tercera experiencia, se utilizaron 3 manguitos de pezonera de distinto diámetro de embocadura. No se encontraron efectos del diámetro del manguito sobre la producción y composicion de leche. Las dimensiones del pezón de las ovejas, la longitud más que la anchura, presentaron correlaciones positivas y significativas con la "leche de repaso manual". Por tanto, parece conveniente el empleo de manguitos de pezonera de mayor longitud.

Introducció: La radioteràpia neoadjuvant pot tenir un impacte negatiu als vasos receptors en la reconstrucció microquirúrgica, i afectar així l'èxit d'un penjoll microvascular. El projecte de recerca és un estudi experimental analític preclínic en animals per avaluar si la irradiació externa (20 Gy) de la zona cervical de rata compromet la viabilitat de l'anastomosi microquirúrgica arterial i venosa. Per dur a terme el projecte s'ha creat un model experimental assegurança de fibrosi vascular radioinduïda per a l'estudi de la viabilitat de l'anastomosi vascular microquirúrgica en població irradiada. Material i mètode: 1) Model preclínic d'irradiació cervical segur: Estudi en model animal: 72 rates Sprague-Dawley de 350-400 gr. Grup I: Grup control. 24 rates avaluades clínicament durant 2 setmanes. Grup II: Grup d'avaluació d'efectes secundaris post-irradiació aguts. 24 rates irradiades (20 Gy) avaluades clínicament durant 2 setmanes. Grup III: Grup d'avaluació d'efectes secundaris post-irradiació subaguts. 24 rates irradiades (20 Gy) avaluades clínicament durant 6 setmanes. Les variables avaluades són: avaluació clínica, pes, permeabilitat vascular (arterial i venosa), supervivència / mortalitat, estudis histològics (artèria carótida comuna bilateral, vena jugular externa bilateral, nervi vago bilateral, tràquea, esòfag, tiroides). 2) Estudi sobre la viabilitat de l'anastomosi vascular microquirúrgica en població irradiada: Estudi en model animal: 140 rates Sprague-Dawley de 350-400 gr. El grup irradiat està format per 70 rates irradiades (20 Gy). En 35 d'aquestes rates (grup irar), 2 setmanes després, es realitza una arteriotomía carotídia i anastomosi microquirúrgica arterial terme-terminal. En les altres 35 (grup IRVE), es realitza una venotomía jugular i anastomosi microquirúrgica venosa terme-terminal. El grup control estarà format per 70 rates. En 35 d'aquestes rates (grup NIRAR) es realitza una arteriotomía carotídia i anastomosi microquirúrgica arterial terme-terminal. En les altres 35 (grup NIRVE), es realitza una venotomía jugular i anastomosi microquirúrgica venosa terme-terminal. Les variables avaluades són: avaluació clínica, pes, permeabilitat vascular (arterial i venosa), dificultat tècnica de la microsutura, supervivència / mortalitat, estudis histològics (artèria carótida comuna bilateral, vena jugular externa bilateral). Conclusions: 1) La irradiació externa neoadjuvant de la zona cervical de la rata disminueix la taxa de viabilitat de l'anastomosi microquirúrgica venosa terme-terminal. 2) La irradiació externa neoadjuvant de la zona cervical de la rata no compromet la viabilitat de l'anastomosi microquirúrgica arterial terme-terminal. 3) El model dissenyat d'irradiació cervical indueix canvis rádicos vasculars selectivament, sense afectar els teixits circumdants, disminuint les taxes de morbimortalitat del model experimental. 4) Aquest model permetrà dissenyar i realitzar nous estudis experimentals terapèutics sobre els efectes de la radioteràpia en el paquet vascular cervical. 5) Atès que en el nostre estudi sobre la viabilitat de l'anastomosi vascular microquirúrgica en població irradiada, l'aplicació de radioteràpia externa ha augmentat la taxa de trombosi venosa, s'ha de considerar com la principal causa del fracàs d'un penjoll microquirúrgic en un context d'irradiació externa neoadjuvant.
Introducción: La radioterapia neoadyuvante puede tener un impacto negativo en los vasos receptores en la reconstrucción microquirúrgica, y afectar así al éxito de un colgajo microvascular. El proyecto de investigación es un estudio experimental analítico preclínico en animales para evaluar si la irradiación externa (20 Gy) de la zona cervical de rata compromete la viabilidad de la anastomosis microquirúrgica arterial y venosa. Para llevar a cabo el proyecto se ha creado un modelo experimental seguro de fibrosis vascular radioinducida para el estudio de la viabilidad de la anastomosis vascular microquirúrgica en población irradiada. Material y método: 1) Modelo preclínico de irradiación cervical seguro: Estudio en modelo animal: 72 ratas Sprague-Dawley de 350-400 gr. Grupo I: Grupo control. 24 ratas evaluadas clínicamente durante 2 semanas. Grupo II: Grupo de evaluación de efectos secundarios post-irradiación agudos. 24 ratas irradiadas (20 Gy) evaluadas clínicamente durante 2 semanas. Grupo III: Grupo de evaluación de efectos secundarios post-irradiación subagudos. 24 ratas irradiadas (20 Gy) evaluadas clínicamente durante 6 semanas. Las variables evaluadas son: evaluación clínica, peso, permeabilidad vascular (arterial y venosa), supervivencia/mortalidad, estudios histológicos (arteria carótida común bilateral, vena yugular externa bilateral, nervio vago bilateral, tráquea, esófago, tiroides). 2) Estudio sobre la viabilidad de la anastomosis vascular microquirúrgica en población irradiada: Estudio en modelo animal: 140 ratas Sprague-Dawley de 350-400 gr. El grupo irradiado esta formado por 70 ratas irradiadas (20 Gy). En 35 de esas ratas (grupo IRAR), 2 semanas después, se realiza una arteriotomía carotidea y anastomosis microquirúrgica arterial término-terminal. En las otras 35 (grupo IRVE), se realiza una venotomía yugular y anastomosis microquirúrgica venosa término-terminal. El grupo control estará formado por 70 ratas. En 35 de esas ratas (grupo NIRAR) se realiza una arteriotomía carotidea y anastomosis microquirúrgica arterial término-terminal. En las otras 35 (grupo NIRVE), se realiza una venotomía yugular y anastomosis microquirúrgica venosa término-terminal. Las variables evaluadas son: evaluación clínica, peso, permeabilidad vascular (arterial y venosa), dificultad técnica de la microsutura, supervivencia/mortalidad, estudios histológicos (arteria carótida común bilateral, vena yugular externa bilateral). Conclusiones: 1) La irradiación externa neoadyuvante de la zona cervical de la rata disminuye la tasa de viabilidad de la anastomosis microquirúrgica venosa término-terminal. 2) La irradiación externa neoadyuvante de la zona cervical de la rata no compromete la viabilidad de la anastomosis microquirúrgica arterial término-terminal. 3) El modelo diseñado de irradiación cervical induce cambios rádicos vasculares selectivamente, sin afectar los tejidos circundantes, disminuyendo las tasas de morbimortalidad del modelo experimental. 4) Este modelo permitirá diseñar y realizar nuevos estudios experimentales terapéuticos sobre los efectos de la radioterapia en el paquete vascular cervical. 5) Dado que en nuestro estudio sobre la viabilidad de la anastomosis vascular microquirúrgica en población irradiada, la aplicación de radioterapia externa ha aumentado la tasa de trombosis venosa, debe considerarse como la principal causa del fracaso de un colgajo microquirúrgico en un contexto de irradiación externa neoadyuvante.
Introduction: Prior radiation therapy, in theory, has a detrimental impact on the recipient vessels in microsurgical reconstruction and may impact microvascular success. The research project is an analytical preclinical experimental animal study to evaluate whether external irradiation (20 Gy) of the rat cervical compromises the viability of the arterial and venous microsurgical anastomosis. To carry out the project has created a safe experimental model radiation-induced vascular fibrosis to study the feasibility of microsurgical vascular anastomosis on irradiated population. Material and methods: 1) Preclinical model of cervical irradiation. Animal model study. 72 Sprague-Dawley rats of 350-400 g. Group I: Control group. Twenty-four rats evaluated clinically for 2 weeks. Group II: Evaluation of post-irradiation acute side effects. Twenty-four rats irradiated (20 Gy) evaluated clinically for 2 weeks. Group III: Evaluation of subacute post-irradiation side effects. Twenty-four rats irradiated (20 Gy) evaluated clinically for 6 weeks. The variables evaluated include clinical assessment, weight, vascular permeability (arterial and venous), survival/mortality, histological studies (bilateral common carotid artery, external jugular vein bilateral, bilateral vagus nerve, trachea, esophagus, thyroid). 2) Viability of microsurgical vascular anastomoses on irradiated population. Study in a rat model: 140 Sprague-Dawley rats of 350-400 g. The irradiated group consists of 70 rats irradiated (20 Gy). In 35 of these rats (IRAR group), 2 weeks later, a carotid arteriotomy and microsurgical end-to-end arterial anastomosis is performed. In the other 35 (IRVE group), jugular venous venotomy and microsurgical end-to-end anastomosis is performed. The control group will consist of 70 rats. In 35 of these rats (group NIRAR) a carotid arteriotomy and microsurgical end-to-end arterial anastomosis is performed. In the other 35 (NIRVE group), jugular venous venotomy and microsurgical end-to-end anastomosis is performed. The variables evaluated include clinical evaluation, weight, vascular permeability (arterial and venous), technical difficulty of microsuture, survival/mortality, histological studies (bilateral common carotid artery, external jugular vein bilateral). Conclusions: 1) Neoadjuvant external irradiation of the cervical region of the rat decreases the rate of viability of microsurgical venous anastomosis. 2) Neoadjuvant external irradiation of the cervical region of the rat does not compromise the viability of microsurgical arterial anastomosis. 3) The model designed cervical irradiation induces vascular changes electively without affecting the surrounding tissues, decreasing morbidity and mortality rates of the experimental model. 4) It will enable new therapeutic design and conduct experimental studies on the effects of radiotherapy in cervical vascular bundle. 5) Given that in our study on the feasibility of the vascular anastomosis microsurgical in irradiated population, the application of external radiation therapy has increased the rate of venous thrombosis should be considered as the main cause of failure of a microsurgical flap in a context of external irradiation neoadjuvant.

La síntesi de colesterol es veu regulada principalment per l'enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzim A reductasa o HMG-CoA reductasa. L'HMG-CoA reductasa està sotmesa a nombrosos mecanismes que li'n regulen tant la quantitat com l'activitat. Aquests mecanismes es classifiquen en dos grups, els que actuen a llarg plaç regulant fonamentalment la quantitat de l'enzim i actuant a nivell de la síntesi i degradació d'aquest, i els que actuen a curt plaç controlant-ne l'activitat. El segon tipus de regulació a curt plaç es du a terme principalment a través d'un mecanisme de fosforilació i desfosforilació reversible.

En l'esquema de regulació de l'HMG-CoA reductasa de molts altres sistemes interconvertibles per fosforilació, cada proteïna fosfatases en la regulació del sistema subjecte a vegada més, es dona una major importància al paper de les
proteïna fosfatases en la regulación del sistema subjecte a interconversió. Aquest fet condueix al plantejament de l'existència d'altres proteïnes, com ho són les proteïnes inhibidores que regulen, a la vegada, l'actuació de les proteïna fosfatases.

L'objectiu principal d'aquesta Memòria fou, per tant, aprofundir en el conêixement del control del procés d'activació per fosforilació covalent de l'HMG-CoA reductasa, mitjançant l'estudi dels Inhibidors de proteïna fosfatases.

Des de l'any 1976, es coneix l'existència de dues proteïnes Inhibidores de fosfatasa tipus 1, l'inhibidor 1 i l'inhibidor 2. Tots aquests estudis han estat realitzats fonamentalment sobre el sistema fosforilasa fosfatasa, per tant ens plantejarem fer un estudi d'aquests inhibidors en el sistema reductasa fosfatasa ja que l'HMG-CoA reductasa és també un enzim regulable per un procés de fosforilació reversible.

EIs resultats obtinguts d'aquest estudi demostren l'existència de dos inhibidors de proteïna fosfatases emprant HMG-CoA reductasa com a substrat. El primer d'ells, que inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 1, ha estat purificat a homogeneïtat a partir de citosol de fetge de rata. Aquest inhibidor te un pes molecular aparent d3 45 Kd determinat per filtració molecular en gel de 31 Kd determinat per electroforesi en gel d'acrilamida-SOS.

L'estudl previ de la distrlbució subcel.lular d'aquest inhibidor de la fosfatasa tipus 1 i substrat HMG-CoA reductasa mostrà que el 90% de l'activitat inhibitòria total està localitzada en la fracció citosòlica. Aquest inhibidor presenta una gran reSsistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol.

L'inhibidor de la fosfatasa 1 inhibeix a la fosfatasa de tipus 1 a concentracions nanomolars, mentre que inhibeix a la fosfatasa 2A a concentracions micromolars, tant si el substrat emprat és I'HMG-CoA reductasa com si es tracta de la glicogen fosforilasa. Aquest comportament cinètic és similar al que presenta l'inhibidor-2 de múscul esquelètic de conill.

L'inhibidor de la fosfatasa 1 és capaç de formar complexes inactius d'alt pes molecular de fosfatasa tipus 1. Aquests complexes són reactivables quan se'ls incuba en presència de GSK-3 i ATP-Mg.

Aquest inhibidor és fosforilable per acció de la proteïna quinasa dependent d'AMP cíclic i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+ i per l'acció de la GSK-3 i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+.

L'anàlisi del conjunt de resultats indica l'existència d'una gran similitud en el comportament cromatogràfic, electroforètic, cinètic, etc. entre l'inhibidor de la fosfatasa 1 I l'inhibldor-2 ja descrit de múscul esquelètic de conill, i ens permet afirmar que ambdos inhibidors són similars.

El segon inhibidor purificat a homogenertat a partir de fetge de rata inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 2A i presenta un pes molecular aparent de 30 Kd quan es determina per filtració en gel i de 20 Kd quan es determina per electroforesi en gel d'acrilamida-SDS.

L'activitat inhibitòria sobre la fosfatasa tipus 2A està localitzada en la fracció citosòlica i presenta també una gran resistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol.

Aquest inhibidor inhibeix la fosfatasa 2A a concentracions nanomolars, mentre que no inhibeix la fosfatasa de tipus 1, quan el substrat emprat és l'HMG-CoA reductasa. Si el substrat és la glicogen fosforilasa cap d'ambdues activitats fosfatàsiques es veuen inhibides.

L'inhibidor da la fosfatasa tipus 2A no és fosforilable ní per GSK-3 ni per la quinasa dependent d'AMP cíclic. L'anàiisi del conjunt de resultats indica que l'inhibidor de la fosfatasa 2A és un inhibidor especlfic de l'activitat reductasa fosfatasa no descrit fins ara.
A protein inhibitor of HMG-CoA reductase phosphatise 1 activity was purified to homogeneity from rat liver. The purified protein has a molecular mass of 31 kDa. This spontaneously active protein is thermostable and acid resistant. The protein inhibitor is phosphorylated by glycogen synthase kinase-3 and cAMP-dependent protein kinase without change in its inhibitory activity. The inhibition caused by this inhibitor on phosphatase and 2A is similar to that of inhibitor-2 from rabbit skeletal muscle using hydroxymethylglutaryl-CoA reductase as substrate.

Another heat-stable protein inhibitor of the hydroxymethylt-glutaryl CoA reductase phosphatase 2A activity has been identified and purified to homogeneity. The apparent molecular mass was 20,000 Da. The protein lost its inhibitory properties when incubated with trypsin or treated with ethanol. The inhibitor protein does not inhibit type 1 phosphatase when either phosphorylase or hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is the substrate but not when phosphorylase A is the substrate. In contrast, this protein inhibitor inhibits the rat liver type 2A phosphatase activity when hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase activity but also by the absence of (32)p release from (32)p- labeled hydroxymethylglutaryl-CoA reductase. The inhibition on the phosphatase activity is shown not only by the modified hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase. The inhibitor protein is not activated by incubation with ATP and cAMP-dependent protein kinase and it is not phosphorylated by glycogen synthase kinase-3. These results, together with those of the kinetic experiments, suggest that the reductase phosphatise inhibitor is distinct from protein phosphatase inhibitor-1 and inhibitor-2.

El enzima hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa) es el principal enzima regulador de la vía de síntesis del colesterol. Al igual que otros muchos enzimas, éste intercambia sus estados inactivo o activo por fosforilación / desfosforilación reversible, dependiendo su nivel de actividad del grado de fosforilación. En estudios "in vitro" se ha demostrado que en el mecanismo de fosforilación reversible intervienen HMG-CoA reductasa quinasas y HMG-CoA reductasa fosfatasas, tanto de origen microsomal como citosólico.

Nuestro objetivo ha sido profundizar en la caracterización y purificación de las protein fosfatasas localizadas en microsomas de hígado de rata, en especial la actividad fosfatasa, que a lo largo de este trabajo denominaremos HMG-CoA reductasa fosfatasa M, ya que presenta un comportamiento cromatográfico que la diferencia de otras protein fosfatasas descritas.

Los resultados obtenidos en el subfraccionamiento celular, en el fraccionamiento cromatográfico y la caracterización enzimática de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa apoyan las siguientes conclusiones:

1.- El estado nutricional de las ratas no modifica la actividad total HMG-CoA reductasa fosfatasa presente en el sobrenadante postrnitocondrial de hígado. La actividad no se ve modificada por ayuno prolongado ni por la administración de glucagon.

2.- El tratamiento con glucagon determina la redistribución de la actividad, la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa asociada a microsomas disminuye significativamente.

3.- El subfraccionamiento por centrifugación a 100.000 xg del sobrenadante postmitocondrial, obtenido de ratas alimentas, provoca la precipitación de una parte (aproximadamente el 15%) de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa inicial. Esta actividad se distribuye a partes iguales entre microsomas y precipitado de glucógeno.

4.- La actividad presente en microsomas no se debe a contaminación por proteínas de origen citosólicas.

5.- La actividad presente es microsomas no se debe a contaminación por proteínas procedentes del precipitado glucógeno-proteico ya que: a) tiene afinidad por el glucógeno; b) las pautas de solubilización son distintas para microsomas y glucógeno; c) cuando se intenta la purificación de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa a partir de glucógeno siguiendo la misma metodología que la empleada para la HMG-CoA reductasa fosfatasa M se pone de manifiesto un comportamiento cromatográfico diferenciador entre las muestras procedentes de glucógeno y las de microsomas.

6.- La distribución de PrP sobre sustrato HMG-CoA reductasa, tras la centrifugación en un gradiente de sacarosa permite concluir que existe una actividad localizada en rnicrosomas.

7.- La actividad presente en microsomas puede solubilizarse con tratamientos suaves (detergentes no aniónicos a baja concentración o tratamiento con sales a baja molaridad) sin que queden cantidades significativas en el precipitado final, lo que indica que la proteína responsable de la actividad fosfatasa no es una proteína intrínseca de membrana.

8.- En microsomas están presentes tres actividades proteína fosfatasa sobre sustrato HMG-CoA reductasa: PrP 1, PrP 2A y PrP 2C. No se detecta actividad PrP 2B en microsomas.

9.- Se purifica la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M a partir de microsomas solubilizados con detergente. La preparación final presenta un peso molecular aparente de 85 kDa en gel filtración.

10.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M en presencia de 0.5 M KCl se disocia produciendo dos subunidades: una con actividad catalítica que presenta un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, tanto en gel filtración como en geles de acrilamida/SDS y otra de menor peso molecular que es la subunidad de anclaje al retículo endoplasmático.

11.- El enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M no es específico para el sustrato HMG-CoA reductasa. De forma inversa el sustrato HMG-CoA reductasa puede ser desfosforilado por las cuatro serin protein fosfatasas hasta ahora descritas: PrP 1, 2A, 28 y 2C.

12.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M se clasifica como PrP 1, al ser inhibida por el inhibidor 2 y al mismo tiempo no ser activable por protamina. Son necesarias para su inhibición mayores concentraciones que las descritas para la PrP 1 citosólica.

13.- La rotura del holoenzima de 85 kDa, o de la subunidad de 55 kDa, por precipitación con acetona o por proteolísis controlada con tripsina, provoca la aparición de una actividad protein fosfatasa de peso molecular en cromatografía de gel filtración de 35-37 kDa.

14.- La obtención del fragmento de 35-37 kDa conlleva en todas las ocasiones pérdida de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa que no se recupera por tratamientos posteriores.

15.- Vistas las conclusiones anteriores, el enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M, purificado y parcialmente caracterizado a partir de microsomas de hígado de rata, tiene un comportamiento que lo distingue de otras PrP descritas. Es de origen microsomal y no se debe a contaminación por glucógeno o citesol. Está constituido por una subunidad de anclaje y otra con actividad catalítica. En su constitución no interviene el modulador o inhibidor 2 si bien lo reconoce y es inhibida por él.
3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase (E.C. 1.1.1.34) the main rate limiting enzyme for synthesis of cholesterol and isoprenoids, has been shown to be regulated by covalent modification. AMP-activated reductase kinasa inactivates and phosporylates HMG-CoA reductase. Inactivated, homogeneous P-labelled HMG-CoA reductase is reactivated in vitro by rat liver protein phospatases with a concomitant release of P bound to serin residues.

HMG-CoA reductase phosphatise activity present in the post-mithocondrial supernatant partially sedimented (13%) into the particulate fraction upon centrifugation at high speed. The sedimented activity was distributed in a similar
grade level between the microsomal membranes (7%) and the gIycogen pellet (6%). The phosphatase activity associated to the endoplasmic reticulum was not due to glycogen contamination. The whole HMG-CoA reductase phospatase activity present in microsomal membranes can be isolated with either 0,1% Triton X-100 or 0.5 M KCI of which it is concluded that this activity is not associated to membrane as a integral protein. By using standard enzymatic methods can be characterized three protein phosphatase activities in the detergent solubilized microsomal membranes: type 1, 2A and 2C, but not type 2B. The purified protein HMG-CoA reductase phosphatase microsomal PrP-M characterized as type 1 requires higher concentrations of inhibitor-2 than the rabbit muscle cytosolic type 1 protein phosphatase. PrPn was not affected by the protein inhibitor that inhibits PrP type 2A activity when HMG-CoA reductase is the substrate. A model of the microsolnal PrP type-1 is presented, deduced by the molecular masses observed after solubilization either by Triton X-100 or 0.5 M KCI, and by the trypsin treatment.

Els xenobiòtics són compostos exògens als éssers vius, i encara que no formen part de la seva bioquímica normal, s´incorporen a les seves vies metabòliques. Els xenobiòtics entren a l´organisme per diferents vies: oral (p.o.), intravenosa (i.v.) subcutània (s.c.), intramuscular (i.m.), respiratòria, etc. Els xenobiòtics es poden classificar segons el seu origen i segons els seus efectes. Els organismes, per la seva part, han desenvolupat sistemes de detoxificaxió per eliminar-los. En aquest treball, s´estudien xenobiòtics que tenen o estan desenvolupats per tenir una activitat terapèutica (fàrmacs). Aquests compostos són normalment de naturalesa lipofílica, de forma majoritària amb capacitat de difondre per les membranes cel.lulars, encara que alguns interaccionen amb transportadors específics. Un cop dins de la cèl.lula són normalment difícils d´eliminar. Per aquest motiu, els organismes transformen els xenobiòtics mitjançant processos metabòlics, i així faciliten la seva eliminació. En aquest procés de detoxificació intervenen un conjunt d´enzims poc específics que reconeixen una àmplia gamma de compostos. Les reaccions de metabolisme d´aquests enzims s´anomenen reaccions de biotransformació de fase I, i reaccions de conjugació o de fase II. En el present treball s´estudien les reaccions de fase I, que són processos d´oxidació, reducció i hidròlisi que es donen a temperatura fisiològica. El Citocrom P450, CYP450, és el principal complexe enzimàtic encarregat de les reaccions de fase I, i es caracteritza per la gran varietat de processos que poden catalitzar així com la quantitat de substractes diferents que poden metabolitzar. L´estudi es porta a terme mitjançant experiments in vitro en un sistema d´incubacions en microsomes de fetge de rata. Les isoformes on s´estudien les possibles interaccions en la seva activitat són: CYP1A1/2, CYP2A1/2, CYP2B1/2, CYP2C, CYP2C11, CYP2D1, CYP2E1 i CYP3A1/2. Per assolir aquest objectiu global, es va obtenir i caracteritzar el sistema experimental (microsomes de fetge de rata), es van posar a punt sistemes analítics per avaluar les cinètiques enzimàtiques, i es van desenvolupar models cinètics pel tractament de les dades experimentals.

OBJETIVO: Fructosa 1,6-bisfosfat (F1,6BP) protege los órganos contra gran número de procesos que provocan inflamación. Hipotetizamos que el efecto primario de la F1,6BP es el de prevenir la activación de los macrófagos y la secreción de citoquinas. Nuestra intención fue determinar las dianas tisulares y celulares de este azucar bifosforilado e investigar en profundidad su mecanismo de acción.

INTERVENCIONES: La acción protectora de F1,6BP fue analizada en ratas Sprague-Dawley (de entre 200 y 250 gramos de peso corporal) a las cuales se les había inducido hepatitis mediante la inyección de galactosamina (GalN). Los efectos in vivo de la F1,6BP fueron evaluados mediante la determinación de la actividad transaminasa en plasma, la determinación de endotoxinas en plasma y la determinación del factor necrótico de tumoración alfa (TNF-alfa) en plasma y en hígado total en ratas tratadas con GalN. Las dianas de la F1,6BP para reducir la respuesta de los macrófagos al lipopolisacárido (LPS) fueron determinadas mediante el estudio de la correlación entre los cambios en la producción de TNF-alfa y los flujos de potasio a través de la membrana celular en cultivos primarios de células de Kupffer.

DETERMINACIONES Y PRINCIPALES RESULTADOS : Los resultados obtenidos in vivo indican que el tratamiento con F1,6BP previene el daño causado por la administración de GalN en células del parénquima hepático. Esta protección se ha asociado principalmente a la reducción en la respuesta inflamatoria. F1,6BP previene la endotoxemia inducida por GalN en rata y ésta correlaciona con la inhibición de la secreción de histamina por parte de los mastocitos peritoneales, evento que precede al incremento de endotoxinas en plasma y de la producción hepática de TNF-alfa. Por otro lado, el tratamiento con F1,6BP reduce la sensibilidad de los macrófagos al LPS, cosa que provoca un descenso en la producción de TNF-alfa. Los resultados in vitro muestran que la F1,6BP inhibe la respuesta y la secreción de TNF-alfa por parte de las células de Kupffer a las que se ha administrado LPS. La F1,6BP previene estos efectos mediante la inhibición de la activación de los canales de potasio por LPS en este modelo celular.

CONCLUSIONES: El efecto modulador de los canales de potasio en la adición exógena de F1,6BP explica sus efectos como antihistamínico y antiinflamatorio, cosa que incrementa enormemente el interés terapéutico de este compuesto bifosforilado.

La pèrdua de funció del sistema vestibular causa vertigen, pèrdua d’equilibri i pèrdua de mirada fixa durant el moviment, sovint acompanyats de marejos i nàusees. Els trastorns de l’equilibri són comuns a les persones grans i alteren el seu patró de marxa, sent un important factor de risc per a les caigudes. En els éssers humans, una de les causes de pèrdua de funció vestibular és la toxicitat d’alguns fàrmacs, com antibiòtics aminoglicòsids, medicaments antipalúdics, diürètics de nansa, agents quimioterapèutics com el cisplatí, així com una sèrie de productes químics d’exposició laboral. La diana principal de la toxicitat són les cèl·lules ciliades. Estudis d’exposició aguda en animals han demostrat clarament que els components ototòxics poden causar discapacitat permanent perquè causen la degeneració de moltes o totes les cèl·lules ciliades. Aquestes cèl·lules no poden regenerar o ho poden fer de manera limitada en algunes espècies de mamífers com el conill d’Índies i la xinxilla i en qualsevol cas la recuperació funcional és limitada o nul·la. En peixos, amfibis i ocells les cèl·lules ciliades es produeixen i es poden regenerar al llarg de tota la vida. Les noves cèl·lules ciliades procedeixen de les cèl·lules de suport seguides de dos possibles mecanismes: mitosis o transdiferenciació. Aquestes evidències d’estudis experimentals no serveixen per explicar la recuperació funcional que té lloc en els humans després de la interrupció de l’exposició crònica ototòxica. Quan en pacients a qui s’ha diagnosticat ototoxicitat es para el tractament, els resultats són molt variables: des de la persistència completa dels símptomes fins una recuperació incompleta o completa. Encara que la recuperació comportamental es pot explicar en part per fenòmens de compensació al sistema nerviós central, es coneix molt poc sobre els mecanismes cel·lulars i moleculars involucrats en el dany vestibular crònic i la seva possible recuperació, així como la seva rellevància a nivell comportamental. Per a estudiar els processos involucrats en el dany i reparació vestibulars associats amb la ototoxicitat crònica i la subsegüent recuperació, es van exposar rates Long Evans mascles a IDPN (3,3’-iminodipropionitrilo) via l’agua de beguda durant vàries setmanes i es van avaluar al final del període d’exposició i al final d’un període de recuperació. Per a identificar les etapes de dany que són susceptibles de reparació i que poden ser la base de la recuperació funcional, es van examinar les característiques ultraestructurals de les crestes i els utricles. La intoxicació crònica per IDPN provoca pèrdua de les cèl·lules ciliades per extrusió. Per a revelar més característiques ultraestructurals del dany ototòxic i la seva posterior recuperació, així com dels efectes ciliars, es van examinar les crestes per microscòpia electrònica de transmissió. Per a caracteritzar la dinàmica del dany aferent i del procés de reparació, es van estudiar mitjançant immunohistoquímica i microscòpia de fluorescència confocal l’expressió de proteïnes prèviament identificades en el contacte entre el calze aferent i la cèl·lula ciliada de tipus I. El següent pas va ser estudiar que passava amb les cintes de les sinapsis aferents de les cèl·lules ciliades de tipus I i de tipus II. El model d’ototoxicitat crònica induït per IDPN a l’aigua de beguda, causa retracció i fragmentació del calze aferent abans que tingui lloc la mort de les cèl·lules ciliades per extrusió. En aquest treball es presenten les evidències que el desmantellament de les unions septades és un procés anterior al dany aferent durant la ototoxicitat crònica i que l’extensa reparació de les unions septades i del calze aferent són possibles després d’aturar-se l’agressió.
Acute toxic insults to the mammalian vestibular system cause loss of the sensory hair cells and subsequent loss of equilibrium. In animal models, many studies have demonstrated apoptosis, sometimes necrosis, of the hair cells. In most mammalian species the functional loss is permanent because the hair cells do not regenerate. Human vestibular dysfunction most commonly arises progressively as a result of chronic exposure to ototoxic compounds such as the aminoglycoside antibiotics. If the exposure is discontinued, a highly variable degree of recovery is observed, being either complete, only partial, or minimal with persistent dysfunction. The cellular and molecular bases of the vestibular dysfunction associated with chronic toxicity and of its remarkable variability in the degree of recovery are not established. One reason for this limited knowledge is the scarcity of animal studies of chronic vestibular toxicity, owing to, at least in part, the resiliency of rats and mice to aminoglycoside ototoxicity. Ototoxic nitriles offer an alternative model to study vestibular toxicity in these species. A particularly dependable model is the one of chronic drinking water exposure of rats to 3,3’-iminodipropionitrile (IDPN). We have established a protocol to study the vestibular sensory epithelia simultaneously by scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and confocal immunofluorescence microscopy in rats previously assessed for vestibular dysfunction during chronic ototoxic exposure followed by variable times of recovery. This allows identifying the structural and molecular events associated with the loss and recovery of vestibular function. Initial data indicate that a deep but fully reversible functional loss is associated with synaptic and afferent damage and intact ciliary structure. With continued IDPN exposure, hair cell damage and more persistent functional are observed. We hypothesize that similar events occur in humans and are relevant to chronic damage, including that associated with age.

Para optimizar la crioconservación de semen de morueco de las razas Xisqueta y Aranesa, se estudió utilizar otras alternativas a la yema de huevo fresca en la elaboración de los medios para reducir la heterogeneidad, contaminación microbiológica y algunos de sus componentes que interfieren negativamente en su capacidad crioprotectora, analizando diferentes tipos de yema de huevo (fresca, en polvo y clarificada), así como la eliminación del plasma seminal previamente a la conservación y la edad del donante. En segundo lugar, con el afán de elaborar diluyentes libres de crioprotectores de origen animal y de composición definida se analizó la eficacia de la lecitina de soja o el butil hidroxitolueno (BHT), combinados con glicerol o trehalosa, así como dos sistemas tampón, TRIS vs TEST, y la adición de BHT como antioxidante en la criosupervivencia espermática. Asimismo, se pretendió determinar la concentración óptima de BHT, estudiando simultáneamente el efecto de la presencia de plasma seminal en el diluyente. Finalmente, se valoró el efecto de la edad del donante y fotoperiodo, así como de la aplicación de implantes de melatonina en los sementales en primavera, la adición de antioxidantes (BHT vs melatonina) en el medio y el efecto del individuo en la criopreservación espermática. Para ello se utilizaron 8 moruecos (4 de cada raza), a los que se les colectó semen, desde 1 a 2.5 años de edad aproximadamente, realizando un total de 6 réplicas/experimento. Brevemente, tras recolectar los eyaculados y valorar su motilidad masal y volumen, éstos fueron mezclados y divididos en las alícuotas requeridas en cada experimento, excepto cuando se congeló individualmente. Para la eliminación del plasma seminal, el semen se centrifugó 2 veces (a 600 g por 10') y el sedimento fue resuspendido en el diluyente correspondiente a una concentración final de 400 x106 de espermatozoides/mL. Las distintas suspensiones fueron refrigeradas a 5ºC durante 4h, envasadas en pajuelas 0.25 mL y congeladas en vapores de nitrógeno y sumergidas en él hasta su descongelación (30'' a 37ºC). La viabilidad, morfología y resistencia osmótica de las suspensiones espermáticas en fresco y refrigeradas se evaluó mediante eosina-nigrosina y el test de endosmosis (HOST). Los parámetros cinéticos tras la refrigeración y descongelación se analizaron mediante el sistema ISAS®, asi como la morfometría espermática siguiendo el protocolo comercial Diff-Quik. Para evaluar la integridad de las membranas espermáticas y actividad mitocondrial tras la descongelación, se utilizó una tinción cuádruple con las sondas fluorescentes (SYBR14, ioduro de propidio, lectina Arachis hipogea con Ficoeritrina y Mitotracker deep red,) y la ayuda de un citómetro de flujo. Los resultados obtenidos mostraron que la yema de huevo en polvo puede utilizarse de forma satisfactoria en la refrigeración y congelación de espermatozoides ovinos, presentando una mejor capacidad crioprotectora cuando se combina con glicerol y el sistema tampón TRIS. Por otra parte, la eliminación del plasma seminal mediante centrifugación mejoró la criosupervivencia espermática, aunque su presencia en los diluyentes no afectó negativamente la calidad seminal. Generalmente, la adición de BHT (5.0mM) mejoró la calidad de los espermatozoides conservados, independientemente del lavado del semen, edad del donante o fotoperiodo, mientras que el uso de melatonina como antioxidante en el diluyente, no. Tampoco el uso de implantes de melatonina proporcionó ninguna ventaja a la hora de conservar espermatozoides de morueco en primavera. Respecto a la edad del donante, nuestro trabajo parece indicar que el semen de moruecos de 18 meses, junto la adición de BHT en el diluyente, presenta una criosupervivencia similar a la de individuos mayores. Por último, la congelación individualizada del semen de nuestros moruecos parece mostrar la existencia de individuos malos, buenos y también “regulares” congeladores.
In order to optimize ram semen preservation of Xisqueta and Aranesa breeds, we studied alternatives to the fresh egg yolk in extender making to reduce heterogeneity, microbiology pollution and some components that interfere negatively in its cryoprotection capability, analyzing different types of egg yolk (fresh, powdered and clarified). Simultaneously, seminal plasma removal previous to cryopreservation and donor age were tested. Secondly, our aim was to obtain an extender free of animal origin cryoprotectants with a clearly-defined composition, therefore the efficiency of the soy lecithin or butylhydroxytoluene (BHT), combined with glycerol or trehalose were assessed. Moreover, the effect of two buffer systems, TRIS vs TEST, and the addition of BHT as antioxidant on sperm cryosurvival was analyzed. Optimal concentration of BHT and the presence of seminal plasma in the extender were also studied. Finally, donor age and photoperiod as the application of melatonin implants on rams in spring, the addition of antioxidants (BHT vs melatonin) in the extender and individual effect on sperm cryopreservation were evaluated. Therefore, semen from 8 rams (4 of each breed from 1 to 2.5 years old approximately) were collected, doing a total of 6 replicas/experiment. Briefly, after semen collection, mass motility and volume were assessed. Then ejaculates were pooled and split in the required aliquots in each experiment, except when semen was preserved individually. For seminal plasma removal, pooled semen was centrifuged twice (at 600 g for 10 minutes) and the sediment was resuspended in the corresponding media at a final concentration of 400 x106 of sperm/mL. The different sperm samples were refrigerated at 5ºC during 4h, packaged in straws of 0.25 mL, freezed in nitrogen vapors and immerged in it, until the samples were thawed (30'' at 37ºC). Viability, morphology and osmotic resistance of fresh and refrigerated sperm samples were tested by eosine-nigrosine stain and hypoosmotic swelling test (HOST). The kinetic parameters after the refrigeration and thawing were analyzed by ISAS® system as sperm morphometry, following the trade protocol Diff-Quik. Integrity of sperm membranes and mitochondrial activity after the thawing were evaluate using a quadruple fluorescent stain (SYBR14, propidium iodide, Arachis hipogea lecithin labeled with phycoerithin and Mitotracker deep red) with a flow cytometer. Our results showed that powdered egg yolk can be used satisfactorily on refrigeration and cryopreservation of ram semen, obtaining a better cryoprotectant capability when is combined with glycerol and TRIS buffer system. On the other hand, seminal plasma removal by centrifugation improved sperm cryosurvival, although its presence in the extender does not affect negatively sperm quality. Generally, the supplementation of BHT (5.0mM) improved the quality of preserved sperms, regardless of semen washing, donor age or photoperiod, meanwhile the use of melatonin as antioxidant in the media does not. Neither the use of melatonin implants on males provided any advantage on ram sperm cryopreservation in spring. Related to the age of the donor, our work seems to indicate that semen from 18 months old rams, together to the addition of the BHT in the extender, shows a similar cryosurvival that semen of older males. Finally, the individual semen preservation seems to show the existence of bad, good and regular freezer rams.

Els caràcters amb major importància econòmica en el sistema de producció de la raça Bruna dels Pirineus són: interval entre parts, prolificitat, longevitat de les vaques, supervivència del vedell fins a l'escorxador, pes al deslletament, creixement durant l'engreix i conformació de la canal. Dins d'aquests, la longevitat de les vaques es una qualitat desitjable, ja que la seva millora permetria disminuir els costos de reposició i augmentar el percentatge de vaques en edats més productives. La supervivència dels vedells fins al deslletament incrementa els ingressos per la venta dels vedells i redueix significativament els costos.
L'objectiu d'aquest treball es l'estudi dels factors que afecten la longevitat de les vaques de carn de la raça Bruna dels Pirineus i la supervivència dels seus vedells fins al deslletament mitjançant tècniques d'anàlisi de supervivència.
El primer capítol és una revisió bibliogràfica que dóna una visió general de la situació i l'evolució de les tècniques d'anàlisi de supervivència en la seva aplicació a la producció animal.
El segon capítol és l'anàlisi dels factors que influeixen la longitud de la vida productiva i les taxes de reposició de les vaques. La mitjana de la longitud de la vida productiva és aproximadament de 9 anys, que implicaria una taxa de reposició anual del 11%. Utilitzant un model de riscos proporcionals, hem vist que la taxa de reforma diaria augmenta amb edats al primer part tardanes, dificultats de part creixents, pesos al naixement dels vedells molt grans, guanys de pes fins al deslletament dels vedells molt petits i intervals entre parts molt llargs. A més, aquest increment també depèn de la seqüència de valors per a la mateixa variable en els parts previs. Una major taxa d'eliminació diària incrementa les taxes de reposició anuals, encara que la pèrdua de productivitat al reduir-se el percentatge de vaques en edats més productives no és molt important.
El tercer capítol s'ha dedicat a l'anàlisi dels factors genètics i ambientals que afecten la supervivència dels vedells fins al deslletament, que és del 96.9%. Usant un model de riscos proporcionals, hem vist que la taxa de mortalitat diària no és constant durant tota la lactació sinó dins d'uns d'intervals: es major les primeres dos setmanes, disminueix les dos següents i a partir del mes de vida es gairebé negligible. Aquesta taxa s'incrementa per als vedells nascuts en la segona part del període de parts (de principis de març a agost), fills de mares joves, amb dificultat de part alta i amb pes al naixement petit. En el pla genètic, malgrat que el valor estimat de la variància genètica additiva sota un model pare és relativament alta (0.3), l'heretabilitat del caràcter al deslletament és només del 0.037.
Finalment, el quart capítol és una validació per simulació d'un mètode aproximat amb dos passos per estimar correlacions genètiques entre caràcters lineals i de supervivència per a la seva aplicació a l'avaluació genètica. En el primer pas s'estimen les variàncies additives i es fa l'avaluació genètica de cada caràcter per separat amb el model univariant ideal per obtenir els pseudo-registres per cada caràcter i els seus pesos. En el segon pas, aquests registres s'utilitzen en l'avaluació genètica conjunta de los tres caràcters mitjançant la utilització de models lineals i mètodes de tipus BLUP y REML en la valoració genètica i l'estimació dels components de variància. El promig de les correlacions genètiques i les precisions obtingudes de les dades simulades confirma la validesa del procediment per a estimar correlacions genètiques en un ampli ventall de situacions (diferents correlacions genètiques, heretabilitats i nivells de censura).
The most economically important traits in the production system of the Bruna dels Pirineus beef breed are: calving interval, prolificity, cow longevity, calf survival until sale, weaning weight, growth rate during fattening and carcass conformation. Within these, cow longevity is a desirable quality, because its improvement would allow to reduce the replacement costs and increase the percentage of cows in more productive ages. Calf survival up to weaning increases the incomes from calf sales and reduce significantly the costs.
The aim of this work is to study the factors that afect longevity of Bruna dels Pirineus beef breed cows and survival up to weaning of its calves using survival analysis techniques.
The first chapter is a bibliographic revision that gives a general view of the situation and evolution of survival analysis techniques in its application to animal production.
The second chapter is the analysis of factors that influence cow´s length of productive life and replacement rates. The average length of productive life is approximatelly of 9 years, which implies an annual replacement rate of 11%. Using a proportional hazard model, we have observed that the daily culling rate increases with late ages at first calving, increasing calving difficulties, very large calf birth weights, very small weight gains until weaning and very long calving intervals. Furthermore, this increase also depends on the sequence of values of the variable in previous calvings. A higher daily culling rate increases the annual replacement rates, in spite of the loss in productivity by reducing the percentage of cows in more productive ages is not very important.
The third chapter analyses the genetic and environmental factors that afect calf survival up to weaning, which is 96.9%. Using a proportional hazard model, we have observed that the daily mortality rate is not constant during all the lactation but within intervals: is higher during the first to weeks, diminishes the next two weeks and after the first month of life is nearly depreciable. This rate increases for calf born in the second part of the calving period (from the beginning of march to august), born from young cows, with high calving difficulty and small birth weight. From a genetic point of view, despite the additive sire variance is relativelly high (0.3), the heritability of the trait at weaning is only 0.037.
Finally, the fourth chapter is a validation via simulation of an approximate two-step approach to estimate genetic correlations between survival and linear traits for its aplication to genetic evaluation. In the first step, additive variances are estimated and a genetic evaluation is done separatelly for each trait with its ideal univariate model to obtain the pseudo-record for each animal and its weight. In the second step, these pseudo-records are used in the joint genetic evaluation of all traits using linear models and BLUP and REML methods in the genetic evaluation and the variance components estimation. The mean of the genetic correlations and accuracies obtained in simulated data confirmed the suitability of the approach to estimate genetic correlations in a wide range of situations (different genetic correlations, heritabilities and censoring levels).

1) INTRODUCCION

A lo largo de la última década se ha caracterizado un grupo de compuestos farmacológicos que comparten la propiedad biológica de disminuir la entrada de iones de calcio en varios tipos de células. Estas drogas han sido usadas extensamente en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares y neurológicos.

En los últimos años han aparecido trabajos basados en observaciones clínicas y datos experimentales que tratan de la existencia de una posible interferencia entre ciertos antagonistas de canales de calcio y la transmisión dopaminérgica.

A pesar de varias inconsistencias, los datos revisados sugieren que los antagonistas de canales de calcio (AC) reducen la transmisión dopaminérgica. Sin embargo, ya que estos fármacos son un grupo muy heterogéneo de compuestos con estructuras moleculares diversas, la cuestión planteada es si los diversos efectos descritos son consecuencia de la inhibición del flujo transmembrana de calcio a través del canal de calcio o si algunos de ellos interfieren con la transmisión dopaminérgica por un mecanismo independiente del de la interacción con el transporte de calcio.

Para intentar contestar a esta cuestión, se ha estudiado el posible efecto de la administración oral aguda y crónica de antagonistas de canales de calcio en el funcionalismo dopaminérgico en el cerebro de rata. Para ello se han estudiado los niveles de dopamina y sus metabolitos en muestras de tejido estriatal y límbico así como en líquido extracelular estriatal.

2) MATERIALES Y METÓDOS

Técnicas utilizadas: Obtención de muestras a partir de tejido cerebral y de diálisis intracerebral. El análisis de los niveles de dopamina y sus metabolitos se realizó mediante cromatografía liquida de alta eficacia con detección electroquímica. La actividad del enzima tirosina hidroxilasa se observó midiendo la velocidad de síntesis de la dopamina tras la administración de un inhibidor del enzima L-aminoácido decarboxilasa.

Animales: Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de un peso entre 190 y 220 gr. Se mantuvieron en un ciclo estándar de luz y oscuridad y se les permitió acceso libre a comida y agua.

Anestesia: En los experimentos de estandarización de la técnica de diálisis se utilizó el tiopental® (42mg/Kg/ip). En el resto de los experimentos, hidrato de cloral (440mg/Kg/ip).

Implantación estereotáxica: Las ratas anestesiadas se colocaron en un aparato David Kopf 1404. Se introdujo una fibra de diálisis en un estriado y se permitió la recuperación de la anestesia.

Procedimiento de diálisis intracerebral: En los experimentos de estandarización del método se dejó pasar, al menos, un tiempo de 24 h entre la implantación quirúrgica y la diálisis. Luego los animales fueron conectados a una bomba Harvard y dializados con una solución de Ringer. En el resto de los experimentos los animales fueron conectados a una bomba CMA/100 a las 48 h de la intervención y perfundidos con liquido cefalorraquídeo artificial.

Tratamientos: Se administraron AC (flunaricina, cinaricina, verapamil, nicardipina y nifedipina) por vía oral. En una primera etapa se utilizaron dosis elevadas en una única o en repetidas administraciones (10 días). Se midieron los niveles de dopamina (DA) y sus metabolitos en tejido estriatal y límbico así como la actividad estriatal del enzima tirosina hidroxilasa. En una segunda etapa las dosis fueron menores y se añadió el haloperidol con el fin de comparar efectos. La administración fue única o repetida (l8 días). En un grupo de animales se midieron los niveles de DA y sus metabolitos en tejido estriatal y límbico y en otro, en el liquido extracelular estriatal. En este grupo se observó, además, la respuesta a la despolarización con potasio y al estimulo agudo con haloperidol después del tratamiento crónico con todos los fármacos en estudio.

3) RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El método de diálisis intracerebral es adecuado para el estudio de los cambios en la DA y sus metabolitos en el espacio cxtracelular siempre que se utilice pasadas las 24 h de la implantación y antes de los 4 días de la misma. Permite estudiar la actividad de las terminales dopaminérgicas en su propio medio así como su comportamiento en el tiempo tras la administración de diversos fármacos.

Los AC que poseen un radical fenilalquilamina en su molécula presentan un mecanismo de acción similar al de los neurolépticos.

El aumento en los niveles extracelulares de DA o sus metabolitos tras la administración crónica de varios de los fármacos empleados, que en algunos de los casos resulta potenciado por la despolarización, sugiere una dificultad en el mecanismo de recaptación de DA causada por los AC. El bloqueo de los canales de calcio de tipo L por el tratamiento crónico con los AC no disminuye la respuesta a la despolarización con potasio lo que apoya la idea de que este tipo de canales no participa en la entrada de calcio necesaria para la liberación de DA. El estimulo sobreañadido de haloperidol a una administración repetida de los diversos fármacos da lugar a una respuesta menor que la producida por una única dosis del mismo, lo que indica una disminución del encendido de las neuronas dopaminérgicas provocada por el tratamiento crónico con haloperidol o con AC.

Por todo lo anterior se puede concluir que el tratamiento con fármacos antagonistas de los canales de calcio produce una afectación en el funcionalismo dopaminérgico.
Calcium antagonists (CA) are widely prescribed for cardiovascular and neurological disorders, but clinical and experimental observations suggest the possibility of a significant interference of CA with dopaminergic transmission. In line with this we have investigated the role of single and repeated oral administration of several CA (flunarizine, cinnarizine, verapamil, nifedipine and nicardipine) in dopaminergic functionalism in rat brain. The first part of the study consisted of establishing the standard conditions of intracerebral dialysis in rats awake and moving freely. Afterwards, animals were allocated to one of two experimental groups. In group 1 high doses of CA were used. After a single or repeated administration (10 days), levels of dopamine (DA) and metabolites were measured in striatal and limbic tissue. In group 2, smaller doses were administered and haloperidol was also added in order to compare effects. After a single or repeated (18 days) administration of CA or haloperidol, a group of animals were killed by decapitation and levels of DA and metabolites were measured in striatal and limbic tissue. Another group was dialysed and levels of DA and metabolites were measured in striatal extracellular fluid. We also studied the effect of depolarization as well as the effect produced by an acute challenge with haloperidol on extracellular levels of DA and metabolites after a chronic treatment with CA or haloperidol. The results indicate that the CA with a phenylalkylamine moiety has a neuroleptic-like mechanism of action. The increase in extracellular levels of DA and metabolites after the chronic administration of several of the drugs used, which in some cases is potentiated by depolarization, suggests a difficulty in DA reuptake due to CA. The inhibition of L channels owing to chronic treatment with CA does not decrease the response to depolarization so channels of this type do not participate in the entry of calcium ions necessary for DA liberation. The acute challenge of haloperidol after a chronic administration of CA or haloperidol produces a lower response than that produced by a single dose, indicating a decrease in firing of dopaminergic neurons. In conclusion, treatment with CA affects the dopaminergic functionalism in rat brain.

La función barrera intestinal constituye la primera línea de defensa del tracto digestivo. Ésta se ve condicionada por el transporte hidroelectrolítico, la permeabilidad y la motilidad intestinales. Alteraciones de estas funciones favorecen la estimulación continua, por antígenos y microorganismos luminales, del sistema inmune local llevando a estados inflamatorios más o menos crónicos. Estos cambios parecen caracterizar diversas patologías inflamatorias y funcionales gastrointestinales, incluyendo la enfermedad inflamatoria intestinal y el síndrome de intestino irritable. Los mastocitos (MCs), a través de un proceso de activación y liberación de mediadores neuroinmunes, participan como células efectoras en la respuesta inmune asociada a estas enfermedades. Este trabajo profundiza en las implicaciones de los MCs en las disfunciones intestinales, haciendo un especial énfasis en la función barrera. Para ello, se empleó un modelo de parasitosis por Trichinella spiralis en ratas. Tras la infección, se observó la evolución temporal (días 2 a 30 post‐infección) en las poblaciones de MCs de mucosa y de tejido conectivo en el yeyuno. Las variaciones en los infiltrados mastocitarios se acompañaron de una sobreexpresión en las proteinasas mastocitarias. Las proteinasas, actuando como enzimas sobre sustratos específicos, incluyendo la activación de receptores activados por proteinasas (PARs), regulan las funciones secretomotoras y sensoriales gastrointestinales. Acompañando estos cambios, se han caracterizado remodelaciones neuroepiteliales post‐infecciosas que resultan en una alteración de la función barrera, en concreto: una alteración de la secreción hidroelectrolítica basal, de la respuesta a secretagogos y en el incremento de la permeabilidad intestinal. Estas disfunciones de la barrera tienen como base cambios temporales específicos en la expresión de proteínas de las uniones estrechas intercelulares. A su vez, la parasitosis produjo un aumento de la actividad motora espontánea intestinal, en parte mediada por los MCs, ya que se revierte parcialmente en animales tratados con el estabilizador mastocitario ketotifeno. Por otro lado, las respuestas secretoras intestinales a la degranulación mastocitaria y a la activación de PAR‐2 se vieron reducidas en la fase post‐infecciosa (día 30 post‐infección). Si bien, ello sugeriría una desensibilización epitelial a los mediadores mastocitarios, la estabilización de los MCs con ketotifeno no tuvo efectos sobre las respuestas secretoras basales o mediadas por PAR‐2 ni sobre los incrementos post‐infecciosos en la permeabilidad. En resumen, hemos definido los cambios en las poblaciones mastocitarias y la función barrera intestinal, así como su relación con la expresión de proteínas de uniones intercelulares y con la expresión de PAR‐2 y sus efectos secretores en un modelo de disfunción intestinal post‐infecciosa. Aunque estos datos apoyan una implicación de los MCs en los cambios morfo‐funcionales asociados a la infección cuestionan una participación directa de los mismos en la función barrera intestinal. Mecanismos de regulación similares pueden operar en enfermedades inflamatorias y funcionales gastrointestinales.
Epithelial barrier function is considered part of the defensive mechanisms of the gastrointestinal tract. Barrier function results from an interplay of at least three components: hydroelectrolytic transport, permeability and intestinal motility. Alterations of these functions favor a state of luminal antigens‐ and microorganismsdependent stimulation of the local immune system, leading to an inflammatory‐like stage. These changes are common to several gastrointestinal pathologies, including inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome. Mast cells (MCs), throught a process of activation and release of endogenous neuroimmune mediators, act as effector cells in the neuroimmune responses associated to these alterations. This work aims the characterization of MCs’ implications in gastrointestinals dysfunctions, with emphasis in barrier function. For this, we used a model of Trichinella spiralis infection in rats. After the infection, time‐related (days 2 to 30 postinfection) changes in mucosal and connective tissue MCs were assessed in the jejunum. Changes in MCs infiltrates occurred together with an up‐regulation of proteinases gene expression. MC‐derived proteinases, throught the enzymatic cleavage of specific substrates, including proteinase‐activated receptors (PARs), regulate gastrointestinal secretomotor and sensory functions. In addition, we characterized postinfectious neuroepithelial remodelations, leading to functional changes in barrier function. In particular, alterations in basal electrolytic secretion, secretory responses to secretagogues and an increase in epithelial permeability were observed. These barrier dysfunctions are associated to time‐related changes in the expression of tight junctions‐related proteins. In parallel, an increase in spontaneous intestinal motor activity was also observed. Treatment with the MC stabilizer ketotifen partially prevented these motor alterations, thus suggesting that MCs are implicated, at least partially, in these responses. In addition, secretory responses to MCs degranulation and PAR‐2 activation were reduced during the postinfectious phase (day 30 postinfection). This might suggest a desensitization of the epithelium to MC mediators. However, treatment with the MC stabilizer ketotifen was without effect, thus suggesting the contribution of additional, MCs‐independent mechanisms. In summary, this work characterizes changes in MCs populations and epithelial barrier function in a model of postinfectious gut dysfunction in rats. Furthermore, the relationship with the expression of tight junction‐related proteins and PAR‐2 and its secretory effects was characterized. Overall, results obtained support an implication of MCs in the morphological and functional alterations associated to the infection. However, they also question a direct role of MCs in the control of epithelial barrier function. Similar mechanisms might operate in inflammatory and functional gastrointestinal disorders.

Objetivo: valorar el comportamiento de los índices campimétricos (IC) en obstrucciones de rama venosa temporal retiniana (ORVTR) tras la fotocoagulación láser (FCG) con los nuevos programas de medición campimétrica. Material y método: 182 casos de OVRTR desde enero 1991 a enero 2001 con los criterios de FCG siguientes: Formas edematosas con exudados duros, edema de mácula y agudeza visual (AV) inferior a 0,5; con AV superior a 0,5 si la campimetría indica pérdida de sensibilidad retiniana, o escotoma absoluto. Formas mixtas con los mismos criterios anteriores y si la isquemia retiniana (IR) es superior a 5 diámetros papilares (dp). Formas isquémicas si la IR es superior a 5 dp con/sin neovasos. Excluimos pacientes con alteración del segmento anterior o retiniana por su patología sistémica, vítreo no transparente o índice de fiabilidad campimétrico mayor de 10% y a los que no acuden a los controles, quedando 68 OVRTR. Se establece curación cuando la angiografía (AGF) no demuestra difusión de contraste y se realiza el último campo visual. Estudiamos 36 variables, entre ellas los IC: Sensibilidad media (MS), Defecto medio (MD), Varianza de la pérdida (LV), Varianza de la pérdida corregida (CLV). Estudio en cuatro fases: descriptivo, evolución de las variables tras el tratamiento, valoración de factores pronósticos y concordancia entre cambio en MS y cambio en AVL. Resultados: vemos que la edad media es 63,5 años, la agudeza visual lejana (AVL) de 0,22 y la agudeza visual próxima (AVP) de 5,03. Un 68,20% son mujeres. El síntoma más frecuente (30,44%) es disminución progresiva de la AV. Destaca como antecedente personal la HTA. Encontramos 69% de emétropes. La rama venosa más afectada (65%) es la temporal superior. El ojo contralateral presenta patología obstructiva en un 10%. El vítreo con desprendimiento completo en 59%. El 59% de las OVRTR son por IR, con 93% con IR superior a 5 dp. Sólo un 7% respeta la fóvea y un 41% tienen los 4 cuadrantes de la arcada perifoveal afectados. Necesitamos en 57,35% 2 sesiones de FCG. Observamos que AVP y AVL mejoran (p<0,001). MS y MD permanecen estables (p<0,001). LV y CLV aumentan (p<0,001). Los hipertensos incrementan la AVL (p=0,003) y los diabéticos (DM) la AVP (p=0,01). Aquellos con HTA (p=0,05) y disminución progresiva de AV (p=0,01) pierden MS y aumentan MD. A mayor edad (p=0,01) y varones (p=0,007) aumentan LV y CLV. Observamos que con 55,5 años el 91,3% de los ojos mejoran en más de 2 líneas su AVL tras FCG. Determinamos que no existe concordancia entre MS y AVL excepto en pacientes con 52 años (p=0,03), presión intraocular de 10,4 mmHg (p=0,05), varones (p=0,03) e historia de HTA (p=0,008). Conclusión: tras FCG MS disminuye y MD, LV y CLV aumentan. Después de FCG AV aumenta en OVRTR que respetan la fóvea y disminuye con la arcada perifoveal afectada. La AVP mejora menos en OVRTR con infarto de fibras nerviosas. La HTA y la DM son factores favorecedores de la respuesta funcional a la FCG.
Objective: to evaluate the behaviour of the campimetric indexes (IC) in retinal temporal branch vein occlusions (ORVTR) after laser photocoagulation (FCG) with the new programs of campimetric measurement. Material and method: 182 cases of OVRTR from January 1991 to January 2001 with the following criteria of FCG: oedematous forms with hard exudates, macular oedema and visual acuity (AV) inferior to 0,5; with AV superior to 0.5 if the campimetry indicates loss of retinal sensitivity, or absolute escotoma. Mixed forms with such previous criteria and if retinal ischemia (RI) is superior to 5 disc diameters (dd). Ischemic forms if RI is superior to 5 dd with/without new vessels. We excluded patients with alteration of the anterior chamber, retina affected by its systemic pathology, not transparent vitreous, campimetric reliability index more than 10% and patients who failed the controls, we obtained 68 OVRTR. When the angiography (AGF) does not demonstrate diffusion the last visual field is made. We studied 36 data, among them the IC: Average Sensitivity (MS), Average Defect (MD), Variance of the loss (LV), Variance of the corrected loss (CLV). Study in four phases: descriptive, evolution of the variables after the processing, valuation of factors prognoses and agreement between change in MS and change in AVL. Results: we see that the average age is 63.5 years, the distant visual acuity (AVL) of 0.22 and the next visual acuity (AVP) of 5,03. A 68.20% are women. The most frequent symptom (30,44%) is progressive diminution of the AV. The most important personal antecedent is hypertension (HTA). There is 69% of emetropy. The more affected temporal venous branch (65%) is the superior. The fellow eye presents obstructive pathology in a 10%. The vitreous has complete loosening in 59%. 59% of the OVRTR are RI, with 93% with RI superior to 5 dd. Only a 7% respect the fovea and a 41% have the 4 affected quadrants of the perifoveal arcade. We needed in 57,35% 2 sessions FCG. We observe that AVP and AVL improve (p<0,001). MS and MD remain stable (p<0,001). LV and CLV increase (p<0,001). The hypertensive ones increase the AVL (p=0,003) and the diabetics (DM) the AVP (p=0,01). Those with HTA (p=0,05) and progressive diminution of AV (p=0,01) lose MS and increase to MD. Aged patients (p=0,01) and men (p=0,007) increase LV and CLV. We observe that with 55.5 years 91.3% of the eyes improve in more than 2 lines their AVL after FCG. Agreement between MS and AVL does not exist except in patients with 52 years (p=0,03), intraocular pressure of 10.4 mmHg (p=0,05), men (p=0,03) and history of HTA (p=0,008). Conclusion: after FCG MS it diminishes and MD, LV and CLV increase. After FCG AV it increases in OVRTR that respect the fovea and diminishes with the affected perifoveal arcade. The AVP improves less in OVRTR with nervous fibber infarct. The HTA and the DM are favourable factors of the functional answer to the FCG.

El trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbè) és un polifenol que es troba a diferents components de la dieta amb propietats beneficioses per a la salut. Per aquesta raó, ha estat considerat com un compost bioactiu i, recentment, com un nutracèutic. En el present treball s’ha aprofundit en l’estudi d’aquest compost per tal de conèixer nous aspectes metabòlics i terapèutics del trans-resveratrol. En primer lloc, s’han estudiat els canvis que pateix durant el seu trànsit intestinal així com el seu metabolisme a l’enteròcit al ser administrat per via oral a la rata. S’ha demostrat que el trans-resveratrol és metabolitzat a l’enteròcit formant els seus conjugats glucurònid i sulfat. Aquests compostos retornen majoritàriament a la llum intestinal mitjançant les proteïnes transportadores ABC. El trans-resveratrol no absorbit i que arriba a l’intestí gruixut és convertit en dihidroresveratrol per acció de la microbiota que redueix el doble enllaç del trans-resveratrol. També el dihidroresveratrol és conjugat i convertit en els seus respectius glucurònid i sulfat. Per determinar aquests compostos, s’ha posat a punt una tècnica per a la determinació del dihidroresveratrol a plasma per extracció en fase sòlida i el resveratrol a contingut intestinal mitjançant una extracció líquid-líquid seguides de l’anàlisi per HPLC. Els mètodes que s’han descrit són exactes, precisos i tenen recuperacions superiors al 95%. En una segona part, s’ha posat a punt un model d’inducció de càncer de còlon en rata per tal d’avaluar l’efecte del trans-resveratrol sobre les lesions preneoplàstiques induïdes per 1,2-dimetilhidrazina. L’administració de 60 mg/kg durant 49 dies, ha demostrat que el trans-resveratrol, el sulfat, el glucurònid i el dihidroresveratrol es troben en el contingut intestinal i que es produeix una reducció del 52% dels focus de criptes aberrants i del 45% dels focus amb depleció de mucines. S’observa una correlació directa entre la disponibilitat del trans-resveratrol a còlon i la reducció de les lesions preneoplàstiques. A continuació s’ha fet un estudi de la biodisponibilitat en ratolins modificats genèticament que no expressen la glicoproteïna P (Mdr1a-/-) i, per últim, en ratolins sense la breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-), comparant-la amb la dels ratolins control. Els resultats indiquen similar biodisponibilitat en els controls i Mdr1a-/- mentre que es modifica en els ratolins Bcrp1-/- indicant que aquesta proteïna participa en l’absorció i la distribució del trans-resveratrol i els seus derivats. Finalment, s’ha desenvolupat un model farmacocinètic per al trans-resveratrol i els seus conjugats glucurònid i sulfat seguint una aproximació poblacional. El model que millor descriu les concentracions plasmàtiques en rata vincula els models bicompartimentals del trans-resveratrol, del glucurònid i del sulfat. Aquest model és robust i capaç de predir adequadament les concentracions plasmàtiques, possibilitant així la planificació de futurs estudis PK-PD per tal d’establir la contribució relativa dels conjugats en l'eficàcia del trans-resveratrol.
trans-Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) is a polyphenol found in several components of the diet with beneficial health properties. Therefore, it has been considered a bioactive compound, and most recently as a nutraceutical. This work has studied this compound in-depth to meet new therapeutic and metabolic aspects. Firstly, we evaluated the changes that occur during intestinal transit and metabolism in the enterocyte when it is orally administered in the rat. trans-Resveratrol is metabolized in the enterocyte forming its glucuronide and sulfate conjugates that mostly return back into the intestinal lumen by ABC transporters. Unabsorbed trans-resveratrol reaches the colon where microbiota converts this polyphenol in dihydroresveratrol by its double bond reduction which is also conjugated in its glucuronide and sulfate in the intestine. Two techniques have been developed to determine dihydroresveratrol in plasma by a solid-phase extraction and trans-resveratrol in the intestinal content by a liquid-liquid extraction followed by HPLC analysis. The methods are accurate, precise with recoveries exceeding 95%. Secondly, a colon cancer model in rats has been developed to evaluate the effect of trans-resveratrol on preneoplastic lesions induced by 1,2-dimethylhydrazine. After 49 days of administration, trans-resveratrol, its sulfate and glucuronide, and dihydroresveratrol are found in the intestinal content and produce a reduction of aberrant crypt foci and mucin-depleted foci. There is a direct correlation between the availability of trans-resveratrol in colon and the reduction of preneoplastic lesions. Afterward a study of the bioavailability has been carried out in mice lacking P-glycoprotein (Mdr1a-/-) and in knockout mice for breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-) as compared with that in wild-type mice. The results indicate similar bioavailability in controls and Mdr1a-/- mice while it is altered in Bcrp1-/- mice indicating that only BCRP is involved in the absorption and distribution of trans-resveratrol and its metabolites. Finally, we have developed a pharmacokinetic (PK) model for trans-resveratrol and its glucuronide and sulfate conjugates following a population PK approach. A three-linked two-compartment model was built for trans-resveratrol, glucuronide and sulfate which describes the plasmatic concentration profile in rat. This model is robust and able to accurately predict plasmatic concentrations, thus enabling future PK/PD studies to establish the relative contribution of the conjugates in the efficiency of trans-resveratrol.

En els últims anys ha crescut considerablement l’interès per descobrir aliments naturals funcionals amb propietats beneficioses per a l’hoste. En aquest sentit, el cacau ha passat a ser un dels principals subjectes d’estudi pel seu contingut en flavonoides. Són molts els estudis que associen la ingesta de cacau amb efectes beneficiosos sobre la salut. A més, se li han atribuït propietats immunomoduladores en rata. En base a aquests efectes descrits, l’objectiu d’aquesta Tesi Doctoral va ser establir l’efecte de dietes enriquides amb cacau, flavonoides del cacau i fibra de cacau sobre la microbiota intestinal així com sobre la funció immunitària intestinals. Per tal d’assolir aquests objectius, s’han portat a terme estudis preclínics en rata amb una dieta enriquida amb cacau convencional al 10%, dietes elaborades a partir de dos extractes de cacau no fermentats i una dieta amb fibra de cacau. Pel que fa als resultats de microbiota, es va observar diferent patró de composició després de la intervenció nutricional amb les dietes enriquides amb flavonoides del cacau però únicament la dieta de fibra de cacau va mostrar un efecte prebiòtic al promoure el creixement dels gèneres Bifidobacterium i Lactobacillus. A més, la dieta de fibra de cacau va comportar els canvis més pronunciats en la producció d’AGCC en femtes i contingut cecal. Particularment, va augmentar la concentració a nivell fecal i cecal dels àcids acètic, propiònic i butíric. A més, les dietes de cacau i fibra de cacau van modular de forma diferencial l’expressió gènica de TLR en còlon. Quant a les immunoglobulines en el compartiment mucosal, totes les dietes enriquides amb polifenols del cacau van modular la secreció d’IgA intestinal, tot i que de forma no proporcional al seu contingut en flavonoides. La fibra de cacau, depenent del compartiment intestinal estudiat, va exercir un efecte o un altre. Pel que fa al compartiment extraintestinal, tot i que la dieta de fibra de cacau va mostrar el mateix efecte atenuador de la síntesi d’IgA i d’IgM que la dieta de cacau, el mecanisme d’acció va ser diferent. A més, totes les dietes enriquides amb flavonoides del cacau, van disminuir la seva proporció de bacteris fecals units a IgA independentment del seu contingut en flavonoides, mentre que aquest percentatge va incrementar amb la dieta de fibra de cacau. Únicament la dieta al 10% de cacau provoca un alentiment en la corba ponderal. Aquest efecte es correlaciona amb els canvis produïts en la microbiota i es pot associar amb la modificació de l’expressió en còlon dels gens implicats en el metabolisme lipídic. Pel que fa al perfil metabòlic en orina, les dietes de cacau i fibra de cacau van provocar patrons diferencials, els quals poden ser usats com a marcadors d’ingesta. El perfil metabòlic es correlacionen amb els efectes del cacau sobre el pes corporal, amb les hormones metabòliques, amb la immunitat intestinal i amb la composició de la microbiota. A més, aquestes variables també mostren correlació entre si. Els efectes del cacau són el resultat de la suma del efectes del components bioactius present en el cacau: polifenols i fibra de cacau, els quals exerceixen efectes sinèrgics o bé contraris depenent de la variable estudiada. Altres components del cacau també estan involucrats en aquests efectes.
In the last few years, cocoa has become one of the main subjects of study due to its high content in flavonoids. Several studies have associated the cocoa intake with health benefits. Moreover, immunomodulatory properties in rats have been also attributed to cocoa. On this basis, the aim of the present thesis was to establish the impact of diets enriched with cocoa, cocoa flavonoids or cocoa fiber on the fecal microbiota composition and its activity as well as on the immune function in the gut. To achieve this objective, preclinical studies were carried out in rats fed a 10% conventional cocoa-enriched diet, diets elaborated with different amounts of non- fermented cocoa extracts and cocoa fiber diet. Regarding microbiota results, differential composition pattern was observed after all the experimental diets intake but only the cocoa fiber diet increased the Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. proportion. In addition, the cocoa fiber diet was the one which caused the most pronounced changes in the short chain fatty acids (SCFA) production. Particularly, it increased the cecal and fecal concentration of acetic, propionic and butyric acids. Moreover, both the 10%-cocoa diet and cocoa fiber diets differentially modulated the TLR gene expression in the colon. Concerning the mucosal immunoglobulin production, all cocoa polyphenol-enriched diets modulated the intestinal IgA secretion although this effect was not proportional to their flavonoid content. The cocoa fiber diet also exerted an effect on intestinal IgA secretion but in a different way depending on the compartment. Focusing on the extraintestinal compartment, although the cocoa fiber diet showed the same down- modulatory effect on IgA and IgM secretion as the cocoa diet, its mechanisms were different. In addition, all cocoa flavonoid-enriched diets decreased IgA-coated bacteria proportion in a non-dose dependent manner whereas this percentage increased by the cocoa fiber intake The 10% cocoa diet was the only one that caused a slower body weight gain. This effect is correlated with the microbiota modulation. The change induced by cocoa diet on the expression of genes involved in the lipid metabolism in the colon could be also involved. Regarding the urinary metabolites, the cocoa and the coca fiber diets caused differential metabolic profile that can be used as consumption marker. The metabolic fingerprint correlated well with the body weight, the metabolic hormones, the intestinal immunity and the microbiota composition. Moreover, all these variables showed also an association between them. Therefore, the effects produced by cocoa intake are due to the differential effects caused by each one of its main bioactive compounds - polyphenols and fiber - which act in a synergistic or opposite manner depending on the variable. Other cocoa compounds are also involved in such effects.

Background. Recent experimental studies have suggested a relevant contribution of lipid abnormalities in the development of the glomerulosclerosis associated with NIDDM-related nephropathy. Furthermore, clinical studies have recently suggested that HMG-CoA reductase inhibitors reduce proteinuria in diabetic population. However, it remains unclear how lipids cause glomerulosclerosis. The aim of this study was to assess whether primary lipid correction diminishes glomerulosclerosis and to characterize the mechanisms involved.
Methods. Obese Zucker rats were used as a model of early diabetic nephropathy. Histological (desmin, chemokines, ED1, Ki67), biochemical and molecular analysis (TGF-b1 and PDGF-B) were performed to characterize the glomerular lesions. The high-tissue affinity ACE inhibitor quinapril was selected as a positive control of treatment
Results. Multivariate regression analysis showed that lesions in OZR may have been produced mainly by cholesterol. The lesions showed positive desmin staining in podocytes and weak cytokine expression. ACE inhibition normalized proteinuria, glomerular lesions and desmin staining in podocytes. HMG-CoA inhibition with atorvastatin ameliorated renal damage and proteinuria, and was independently associated with high cholesterol levels.
Conclusions. Renal lesions in OZR were correlated with high blood cholesterol levels, proteinuria and glomerular damage. Atorvastatin decreased proteinuria and preserved podocyte injury, probably due to the improvement on blood lipids as well as to its non-lipid effects. As expected, quinapril exerted a more marked beneficial effect on those parameters. Treatment with ACE inhibitors and statins could be relevant for the treatment of diabetic nephropathy in humans.
Key words: cholesterol, atorvastatin, podocyte, Zucker obese, quinapril.

En la presente tesis se estudian dos enfermedades poco frecuentes, con una alta prevalencia de enfermedad ósea y un alto impacto en la morbilidad de los pacientes; la enfermedad de Gaucher y el trasplante renal. Hemos realizado un estudio exhaustivo de la salud ósea, con técnicas diagnósticas que van más allá de las clásicamente aplicadas, ya que éstas pueden no determinar correctamente la resistencia ósea de los pacientes con trasplante renal o con enfermedad de Gaucher y el consecuente riesgo de fractura.  Evaluación ósea en los pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 usando microindentación de impacto En el primer estudio, abordamos el tema del estudio de calidad ósea en pacientes con EG tipo 1.  La literatura carece de ninguna descripción in vivo de las propiedades biomecánicas del tejido óseo en este grupo de pacientes. Encontramos que los pacientes con EG1 presentaban un iFMO significativamente menor comparado con controles aparejados. Estos resultados son especialmente importantes ya que estos pacientes tienen una alta prevalencia de enfermedad ósea, siendo una de las principales causas de morbilidad, a pesar de que a menudo son asintomáticos. Tras ajustar por edad, sexo, peso, altura y DMO lumbar persistía un deterioro significativo de las características mecánicas del hueso comparado con los controles apareados. Densidad ósea, microarquitectura y fuerza ósea en pacientes con enfermedad renal crónica en el momento del trasplante En el segundo estudio nos planteamos analizar el estatus de la salud ósea de una cohorte de pacientes con ERC en el momento del trasplante renal, atendiendo a diferentes características del hueso que contribuyen a la fuerza ósea. Valoramos el estado mineral y óseo utilizando tres técnicas diferentes que miden densidad ósea, microarquitectura trabecular y calidad a nivel tisular. Describimos un importante deterioro en todos estos marcadores de fuerza ósea proporcionando una imagen exhaustiva del impacto de la ERC en el hueso. A pesar de ello el metabolismo calcio/fósforo y los niveles de iPTH estaban relativamente controlados, recalcando la importancia de realizar evaluación ósea pre-operatoria (DXA o si miliar) para identificar los pacientes que están en riesgo de presentar fracturas en el periodo de post-trasplante.
In this thesis, we have studied two uncommon diseases with a high prevalence of bone disease and a high impact in the morbidity of these patients; Guahcer’s disease and kidney transplant. We have performed an exhaustive study on bone health, with diagnostic techniques that are different from the ones usually applied, since these ones are unable to assess bone resistance in patients with kidney transplant or Gaucher’s disease, and their consequent fracture risk. Bone Assessment in Patients with Type 1 Gaucher’s Disease using impact microindentation In this series of patients, we have found that GD1 patients have a significantly lower BMSi compared to matched controls. As far as we know this is the first description in the literature of in vivo bone tissue biomechanical properties measurement with impact microindentation in this group of patients. These results are important due to the high prevalence of bone disease in GD1, who are often asymptomatic, although bone disease is a prominent cause of morbidity. After adjusting by age, gender, weight, height and lumbar BMD, persisted a significant bone tissue mechanical characteristics deterioration, compared to matched controls. Bone density, microarchitecture and material strength in chronic kidney disease patients at the time of kidney transplantation We have performed a cross-sectional study in a cohort of a ESRD patients undergoing KT, in whom we assessed bone and mineral status using three different techniques that measure bone density, trabecular microarchitecture and tissue-level quality. We describe an important deterioration in all these markers of bone strength providing a comprehensive picture of the skeletal impact of ESRD. Despite all this, calcium/phosphate and iPTH levels were relatively controlled, stressing the value of pre-operative specific bone health assessments (DXA or similar) for the identification of patients at high risk of post-transplantation fractures.

En estudios de la era pre-reperfusión la presencia de bloqueo de rama (BR) asociado a infarto agudo de miocardio (IAM) se asoció a altas tasas de mortalidad a corto y largo plazo. Los cambios terapéuticos que se han producido en los últimos años, especialmente la aplicación de la terapia de reperfusión, fibrinolisis y angioplastia primaria, se asocian a un beneficio en el pronóstico de los pacientes con IAM. Objetivos Conocer las características clínicas y el pronóstico a corto y largo plazo asociado a la presencia de BR e IAM atendiendo a la localización derecha o izquierda del BR, al tiempo de aparición, y a la duración, transitoria o permanente en el caso de los BR de nueva aparición. Pacientes y métodos Estudio prospectivo de 5.570 pacientes ingresados consecutivamente por IAM en dos Unidades Coronarias de dos hospitales de la Región de Murcia durante un periodo de 10 años. Los pacientes fueron seguidos durante una mediana de 7,2 años. Se determinó el hazard ratio a corto y largo plazo mediante modelos de regresión multivariable de Cox. Resultados Los BR estuvieron presentes en 964 (17,3%) pacientes. De los cuales el 10,6% fueron bloqueos de rama derecha (BRD), y el 6,7% bloqueos de rama izquierda (BRI). Globalmente la mortalidad a los 30 días fue del 13,2 % (n=738), y a los 7 años fue del 40,7% (n=2.268). Ambos, BRD y BRI fueron más frecuentemente previos, 42,9% y 58,8%. La presencia de BR de nueva aparición fue más frecuente entre los BRD 35,9% vs 27,0% en los BRI. Comparados con los pacientes sin BR, los pacientes con BR se asociaron a mayor edad y alta prevalencia de comorbilidades especialmente diabetes (49,0 vs 34,3%, p<0,001), y mayores tasas de insuficiencia cardiaca durante la hospitalización (54,5 vs 26,6%, p<0,001). Frente a los pacientes con BRD los pacientes con BRI mostraron mayores tasas de comorbilidades y recibieron en menor frecuencia tratamiento de reperfusión. En el análisis multivariable sólo el BRD (HR 1,27, IC 95% 1,11-1,45, p<0,001) fue predictor independiente para la mortalidad a largo plazo. Frente a los pacientes con BR previos e indeterminados, los pacientes con BR de nueva aparición presentaron infartos más extensos, más complicaciones y mayores tasas de mortalidad a los 30 días y a largo plazo. Entre los pacientes con BR nuevos, los que presentaban BR transitorio tuvieron menos tasas de insuficiencia cardiaca y menor mortalidad a corto y largo plazo que los pacientes con BR nuevos y permanentes. El BRD nuevo permanente fue predictor independientemente de mortalidad a los 30 días (HR 2,01 IC 95% 1,45-2,79) y 7,2 años (HR 3,12 IC 95% 2,38-4,09). El BRI nuevo y permanente resultó así mismo predictor independiente de mortalidad a los 30 días (HR 2,15 IC 95% 1,47-3,15) y 7,2 años (HR 2,91 IC 95% 2,08-4,08). Conclusiones. En pacientes con IAM, sólo el BRD fue predictor de mortalidad a largo plazo. Atendiendo a la antigüedad y transitoriedad de los BR, sólo los BRD y BRI nuevos y permanentes resultaron predictores de mortalidad a corto y largo plazo.
Abstract In studies of pre-reperfusion era the presence of bundle branch block (BBB) associated with acute myocardial infarction (AMI) was associated with high mortality rate in the short and long term. Therapeutic changes that have emerged in recent years, especially the application of reperfusion therapy, fibrinolysis and primary angioplasty have been associated with a significant benefit with regards the prognosis of patients with AMI. Objectives To investigate whether the prognosis associated with BBB might be different depending on the location, time of appearance and duration in patients admitted with AMI. Patients and methods From 1st, January 1998 through January 2008, we prospectively recruited 5570 patients admitted with AMI in two Coronary Care Units of two hospitals in the region of Murcia. Patients were followed for a median of 7.2 years. The hazard ratios in the short and long term were estimated by mean of multivariate Cox regression models. Results The BBB were present in 964 (17.3%) patients (10.6% were right bundle branch blocks (RBBB), and 6.7% left bundle branch block (LBBB) 6.7%). Overall 30-day mortality rate was 13.2 % (n=738) and 7-years was 40.7% (n=2268). Both, RBBB and LBBB were more frequently prior, 42.9% and 58.8%. The presence of new-onset BBB was more frequent among RBBB compared to LBBB (35.9 vs 27.0%, p<0.001). Compared with non-BBB, all BBB groups showed higher prevalence of comorbidities, especially diabetes (49.0 vs 34.3%, p <0.001), and more often heart failure during hospitalization (54.5 vs 26.6%, p <0.001). Compared with RBBB, LBBB patients had higher prevalence of comorbidities, lower creatine-kinase MB, received less reperfusion therapy versus patients with RBBB and Non-BBB patients. In the multivariate analysis, RBBB (HR 1.27, 95% CI 1.11 to 1.45, p <0.001) was independent predictor of long-term mortality. Compared to patients with previous and indeterminate BBB, new-onset BBB patients showed larger infarcts, experienced more frequently complications and showed higher mortality rates at 30 days and long-term. Among patients with new BBB, those with transient BR had lower rates of heart failure and reduced mortality in the short and long-term compared to patients with new permanent BBB. The new permanent RBBB was an independent predictor of mortality at 30 days (HR 2.01 CI 1.45 to 2.79) and at 7.2 years (HR 3.12 CI 2.38 to 4.09). The new permanent LBBB was an independent predictor at 30 days (HR 2.15 CI 1.47 to 3.15) and at 7.2 years (HR 2.91 CI 2.08 to 4.08) of mortality. Conclusions In patients with AMI, RBBB was predictor of long-term mortality. Considering age and transience of BBB, only new permanent RBBB and LBBB were predictors of short and long-term mortality.

El objetivo de esta tesis ha sido estudiar y analizar las modificaciones estructurales, mecánicas y funcionales que se producen en un proceso inflamatorio en general y en concreto en un episodio de isquemia cerebral.
El trabajo realizado se compone de dos partes: i) estudio del efecto de un proceso de isquemia-reperfusión sobre las propiedades estructurales, mecánicas y miogénicas en la arteria cerebral media de rata. ii) estudio mediante un modelo "in vitro" de inflamación que consiste en la incubación de las arterias en medio de cultivo con una de las citoquinas (IL-1ß) que se sobrexpresan después de un período de isquemia-reperfusión, sobre las propiedades estructurales, mecánicas y funcionales de la arteria mesentérica de resistencia de rata.
El proceso de isquemia (90 minutos)-reperfusión (24 horas) produjo los siguientes cambios en la arteria cerebral media: 1) disminución importante del tono miogénico acompañado por un aumento en la producción de aniones superóxido 2) incremento en el tamaño de la pared vascular debido al aumento en el número de células adventicias 3) aumento en el tamaño de las fenestras de la lámina elástica interna, hecho que podría asociarse al aumento en la elasticidad intrínseca observado en estas arterias 4) disminución del estrés de la pared como consecuencia del aumento en el tamaño de la misma 5) este proceso también modificó aunque con menor intensidad, algunos de los parámetros estructurales analizados en arterias del lado contralateral . Estos cambios, se deban probablemente a alteraciones sistémicas consecuencia de la isquemia focal.
La incubación de las arterias mesentéricas de resistencia en medio de cultivo con IL-1ß durante 14 horas: 1) no modificó ni la estructura ni la mecánica de la pared arterial 2) empeoró las relajaciones dependientes de óxido nítrico sin afectar a la capacidad vasorelajadora general del vaso. El empeoramiento de la relajación parece ser debido, al menos en parte, a una disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico 3) aumentó la producción de anión superóxido en la pared vascular que parecería estar sintetizado principalmente por la xantina oxidasa. Los aniones superóxido producidos por acción de la xantina oxidasa serían los principales responsables de la disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico, que a su vez sería el responsable de la disminución de las respuestas relajantes mediadas por óxido nítrico.
Estos resultados indicarían que la arteria cerebral media sufre una serie de cambios provocados por el proceso de isquemia-reperfusión que permitirían a estas arterias adaptarse a los cambios en el flujo sanguíneo necesarios para reducir el daño neuronal, mejorando la irrigación del cerebro después de un episodio de isquemia-reperfusión. El efecto de las citoquinas durante este período podría también afectar a las respuestas funcionales de las arterias debido al aumento en la producción de anión superóxido observado en esta patología. Las aportaciones de estos estudios podrían en un futuro abrir líneas de investigación que podrían contribuir al diseño de nuevos fármacos con capacidad para prevenir episodios de isquemia cerebral.
The aim of the present study has been to analyse the structural, mechanical and functional alterations that take place in an inflammatory process as cerebral ischaemia.
Our results are divided in two parts: i) a study of the effect of ischaemia-reperfusion on structural, mechanical and myogenic properties of rat middle cerebral artery and ii) to analyze, using an in vitro model of inflammation, the effect of incubation with IL-1ß, one of several cytokines that is overexpressed after a period of ischemia-reperfusion, on structural mechanical and functional properties of rat mesenteric resistance arteries.
The occlusion of the right middle cerebral artery (90 minuts) following 24 hours of reperfusion produced: 1) a decrease of myogenic tone together with an increase in superoxide anion production 2) an enlargement of the vascular wall due to the increase in the total number of adventitial cells 3) an enlargement of fenestrae area of the internal elastic lamina that was associated with the increase on intrinsic elasticity observed in these arteries 4) a diminished wall stress as a result of the increase in the wall thickness 5) ischaemia-reperfusion also modified although to a lesser degree, some of the structural parameters in arteries from the contralateral side of ischemia. These changes observed in the contralateral side could likely be associated to systemic alterations produced as a consequence of focal ischaemia.
Fourteen hours incubation of mesenteric resistance arteries in culture medium with IL-1ß: 1) did not modify either the structure or the mechanics of the arterial wall; 2) impaired nitric oxide dependent relaxation without affecting the vasodilatation capacity of the arteries. The impairment of nitric oxide induced relaxation by IL-1ß could be due to a decrease on nitric oxide availability; 3) increased superoxide anion production in the vascular wall that seems to be mainly synthesized by xanthine oxidase. The superoxide anion produced by xanthine oxidase would play a role in decreasing nitric oxide availability, which in turn would diminish vasodilatation mediated by nitric oxide.
These results suggest that the middle cerebral artery undergoes multiple changes caused by ischaemia-reperfusion that will allow these arteries to adapt to the blood flow alterations needed to reduce the neural damage, improving brain blood flow. Cytokines could affect functional responses of the arteries due to the increase in superoxide anion production observed in this pathology. In the future, this study could open new research that could contribute to the design of new drugs with potential interest to prevent cerebral ischaemia episodes.

1. Introducción y Material y métodos
Aprovechando la aparición de una nueva tecnología (el suministrador automático de consumo alimentario) y motivados por la disminución del apetito (consumo diario de alimento) observado en la especie porcina durante los últimos años, decidimos explorar el comportamiento alimentario del cerdo para después relacionarlo con otros factores. Algunos de los objetivos que nos propusimos estudiar fueron: la influencia de la luz sobre la conducta circadiana alimentaria, las relaciones internas (correlaciones) entre los parámetros de comportamiento alimentario, el patrón alimentario de cada raza, la influencia del gen del halotano y de la jerarquía social sobre el comportamiento alimentario y la relación entre la conducta alimentaria y la productividad.
En el Centre de Control Porcí de Monells (IRTA) analizamos 205 cerdos machos enteros de cuatro razas distintas: 47 de raza Duroc, 60 de raza Landrace, 69 de raza Large White y 29 de raza Piétrain. Realizamos dos experimentos de 50 días, uno en otoño de 1995 y otro en la primavera de 1996. La alimentación fue ad libitum y el ciclo de iluminación fue el natural. Los animales fueron distribuidos en corrales de 12,85 m2. Cada corral contenía entre 12 y 14 cerdos de una misma raza. El registro de la información se hizo por medio de los suministradores automáticos de consumo alimentario IVOG -station. Cada corral disponía de un único suministrador, cuyo diseño permitía la competencia entre los cerdos en el momento de visitar el comedero. A partir de la información recogida por el suministrador y después de realizar un proceso de filtrado y depuración de los datos se construyeron los parámetros alimentarios: consumo de alimento diario (CAD = g), consumo de alimento por visita o tamaño de la visita (CAV = g), tiempo de ingestión diario (TID = min), tiempo de ingestión por visita o duración de la visita (TIV = min), número de visitas diarias o frecuencia de visitas (NVD) y velocidad de ingestión diaria (VID = g/min).
El gen del halotano se identificó a partir de muestras de sangre de cada animal por medio del test del DNA basado en la multiplicación y restricción selectiva del gen "ryanodine", cuya mutación es la causa del síndrome del estrés porcino. El estudio de la jerarquía se realizó únicamente en la raza Large White y consistió en la filmación de los animales con la posterior observación de las interacciones antagónicas entre pares de animales con el fin de establecer el grado de dominancia de cada animal. En cada corral se distinguió a los animales en dos categorías: a los de mayor rango jerárquico se les llamó dominantes y a los de menor, sumisos.

2. Resultados más destacados
2.1. Influencia de la luz sobre la conducta alimentaria
Observamos que la conducta circadiana del cerdo fue sensible a la luz: a) la salida y la puesta del sol desencadenaron picos de consumo. b) En la estación de mayor horario solar (primavera) se amplió también el nivel de actividad alimentaria: en primavera los animales dedicaron tres horas más que en otoño a la actividad máxima de ingestión. c) Esta ampliación del horario solar pudo ser la causa de que en primavera apareciera un tercer pico de consumo, alrededor de las 13.00 horas. A los animales les dio más tiempo para expresar otro pico de consumo. d) Los cerdos presentaron actividad alimentaria durante las 24 horas del día pero fue mucho mayor durante las horas de luz que durante la noche.

2.2. Relaciones internas entre los parámetros alimentarios
1ª relación: los dos parámetros alimentarios de mayor correlación con el apetito (consumo diario) fueron el tamaño (r entre 0,65 y 0,28) y la velocidad (r entre 0,59 y 0,32). 2ª relación: el consumo y la velocidad se relacionaron positivamente (r entre 0,59 y 0,32) y el tiempo y la velocidad presentaron relación negativa (r entre --0,79 y -0,67)-. 3ª relación: existió relación positiva entre la duración y el tiempo diario (r entre 0,5 y 0,28), y entre el tamaño y el consumo diario (r entre 0,65 y 0,28). 4ª relación: la frecuencia siempre presentó relación inversa con el tamaño (r entre -0,84 y -0,77) y con la duración (r entre -0,86 y -0,72), y estos dos parámetros se relacionaron entre sí de forma estrecha y positiva (r entre 0,90 y 0,87).

2.3. El patrón alimentario de cada raza
El estudio del efecto raza sobre los parámetros alimentarios nos permitió agrupar las razas de la siguiente manera: respecto a la velocidad y al tiempo diario de ingestión observamos que las razas Landrace y Large White tuvieron mayor velocidad de ingestión y requirieron menor tiempo de ingestión que las otras dos. A estas razas las llamamos rápidas y a las otras, lentas. Respecto a la frecuencia y al tamaño, obtuvimos que las razas Duroc y Landrace visitaron menos veces al día el comedero pero aprovecharon más cada visita (mayor tamaño). A estas dos razas las denominamos glotonas mientras que a las razas Large White y Piétrain, que van muchas veces al comedero pero que comen poco en cada visita, las llamamos mordisqueadoras. La combinación de los diferentes caracteres descritos nos aporta la descripción del patrón alimentario propio de cada raza. Así tenemos que la raza Duroc fue glotona lenta, la Landrace fue glotona rápida, la Large White fue mordisqueadora rápida y la raza Piétrain fue mordisqueadora lenta.

2.4. La influencia del gen halotano sobre el comportamiento alimentario
Los animales sensibles al estrés porcino (genotipo halotano recesivo) presentaron mayor tiempo de ingestión diaria y menor velocidad que los animales homocigotos dominantes o heterocigotos. Así pues, el genotipo halotano recesivo afectó al comportamiento alimentario de manera significativa. Suponemos que estos animales -que son los más nerviosos- interrumpen con mayor frecuencia sus comidas, perjudicando la velocidad y requiriendo mayor tiempo de ingestión para compensar la baja velocidad.

2.5. La influencia de la jerarquía social sobre el comportamiento alimentario
Los cerdos dominantes presentaron mayor consumo y frecuencia, y menor tamaño y duración. Por tanto, podemos concluir que la jerarquía afectó a los parámetros alimentarios a pesar de que el sistema de alimentación fue ad libitum. Suponemos que el hecho de que el suministrador automático de consumo alimentario presente un comedero único por corral provoca una restricción virtual de alimento en los animales sumisos, perjudicado su consumo diario.

2.6. La relación entre el comportamiento alimentario y la productividad
Los parámetros alimentarios que presentaron mayor relación con el crecimiento fueron, de más a menos, el consumo diario (r entre 0,93 y 0,80), el tamaño (r entre 0,54 y 0,28) y la velocidad (r entre 0,43 y 0,32). Por tanto, los parámetros alimentarios que tuvieron mayor relación con el consumo diario son los que, junto con éste, presentaron mayor correlación con el crecimiento.
1. Introduction, materials and methods
Taking advantage of the appearance of a new technology (automatic food supplier) and motivated by the loss of appetite (daily food intake) noticed in the pig species during the last few years, we decided to investigate the feeding behaviour of the pig, and then relate it to with other factors. Some of the facts we decided to study were: the influence of light on circadian feeding behaviour, internal relations (correlation) between parameters of feeding behaviour, feeding pattern of each breed, influence of the halothane gene and social hierarchy on feeding behaviour, and the relationship between feeding behaviour and productivity.
In the "Centre de Control Porcí de Monells (IRTA)" we studied 205 pigs (boars) of four different breeds: 47 Duroc, 60 Landrace, 69 Large White and 29 of the Pietrain breed. We performed two experiments lasting 50 days each, autumn 1995 and in spring 1996.
The feeding was ad libitum and the cycle of light was natural. Animals were distributed in stiles of 12.85 m2. Each stile had between 12 and 14 pigs of the same breed. Information was recorded by the automatic food supplier IVOG -station. Each stile had only one supplier, whose design allowed competition between pigs trying to visit the feeder. From information recorded by the supplier, and subsequently sorted and filtered, the following parameters were constructed: daily food intake (DFI = g), food intake per visit (FIV = g), duration of daily food intake (DDFI = min), duration of food intake per visit (DFIV = min), number of daily visits or frequency of visits (NDV) and rate of daily food intake (RDFI = g/min).
The halothane gene was identified from blood samples of each animal using a DNA test which consisted in the multiplication and selective restriction of the "ryanodine" gene, whose mutation is the cause of pig stress syndrome. The study of hierarchy was performed only with the Large White breed and consisted in filming the animals in order to observe any antagonistic interactions between pairs of animals, and later establish the degree of dominance exhibited by each one. In each stile animals were divided into two categories: animals with the greater hierarchical range were classified as dominant and animals with smaller ones, submissive.

2. More important results
2.1. Influence of light on feeding behaviour
We observed that the circadian behaviour of the pigs was sensitive to light: a) Daybreak and sunset excited peaks of food intake. b) During the season with more hours of light (spring) the food intake activity level was greater as well: in spring the maximum feeding activity was tree hours longer than in Autumn. c) This increase in solar hours could be the cause of a third feeding peak which appeared in Spring around 13.00 h: the animal had more time during which to exhibit another feeding peak. d) The pigs exhibited feeding activity during the 24 hours of the day but the food intake level was much higher during the hours of light, than at night.

2.2. Internal relationships between feeding parameters
1st relationship: the two feeding parameters which showed a greater correlation with appetite (daily food intake) were the food intake per visit (r between 0.65 and 0.28) and the rate of daily food intake (r between 0.59 and 0.32). 2nd relationship: the total daily food intake and the rate of daily food intake exhibited a positive correlation (r between 0.59 and 0.32), while the duration of daily food intake and the rate of daily food intake had a negative correlation (r between -0.79 and -0.67). 3rd relationship: existed positive correlation between the duration of food intake per visit and the duration of daily food intake (r between 0.50 and 0.28), as well as between the food intake per visit and the daily food intake (r between 0.65 and 0.28). 4th relationship: frequency always exhibited an inverse relationship with food intake per visit (r between -0.84 and -0.77) as well as with the duration of food intake per visit (r between -0.86 and -0.72), while these latter two parameters showed a close and positive correlation with each other (r between 0.90 and 0.87).

2.3. Feeding pattern of each breed
The study of the breed effect on food intake parameters allowed to group the breeds in the following way: with respect to the rate of daily food intake and the duration of daily food intake we observed that Landrace and Large White breeds had a greater rate of daily food intake and needed less duration of daily food intake than the two others. The Landrace and Large White breeds were dominated "speedy" while the other two were called "slow-coach". With respect to frequency and food intake per visit, results showed that the Duroc and Landrace breeds visited the feeder fewer times a day but consumed more each time (higher food intake per visit). These two breeds were referred as "meal eaters" while that Large White and Pietrain breeds, which visited the feeder many times but ate little each time, were called "nibblers". The combination of the different behaviours just described allowed a description of each breed's feeding pattern. Thus, we found the Durocs breed to be slow-eaters, the Landraces speedy-meal eaters, the Large Whites speedy-nibblers and the Pietrais slow-nibblers.

2.4. Influence of the halothane gene on feeding behaviour
The PSS animals (recessive halothane genotype) had a higher duration of daily food intake and a lower rate of daily food intake than the dominant homozygotes or the heterozygotes. Thus, the recessive halothane genotype affected feeding behaviour in a significant way. We suppose these animals -the most nervous of the lot- interrupted their meals more frequently, thus adversely affecting their feeding rate and requiring more feeding time to compensate for their low rate of daily food intake.

2.5. Influence of social hierarchy on feeding behaviour
The dominant pigs exhibited a higher level of daily food intake and frequency, as well as a lower level of food intake per visit and duration of food intake per visit. Therefore, we can conclude that hierarchy affected feeding behaviour parameters although the feeding system was ad libitum. We suppose that the fact that the automatic food supplier has only a single access to feeder per stile provokes a virtual restriction of food intake on submissive, adversely affecting their daily food intake.

2.6 Relationship between feeding behaviour and productivity
The feeding parameters which had a close relationship with daily growth were, in descending order, daily food intake (r between 0.93 and 0.80), food intake per visit (r between 0.54 and 0.28) and rate of daily food intake (r between 0.43 and 0.32). Therefore, the feeding parameters that were more closely related to daily food intake were those which, along with the latter, exhibited a higher correlation with daily growth.

Evidencias recientes sugieren que la microbiota comensal del intestino constituye un factor dinámico que se relaciona activamente con el hospedador, mediante sistemas específicos de reconocimiento bacteriano, y participa en la regulación de funciones sensoriales, motoras y secretoras gastrointestinales. En particular, la microbiota comensal del intestino se ha implicado en los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad inflamatoria intestinal.
Este trabajo de investigación tiene como objetivo principal demostrar como variaciones en las condiciones ambientales llevan a cambios adaptativos espontáneos de la microbiota comensal del intestino de la rata, y como estos cambios afectan a los mecanismos intestinales de reconocimiento de la microbiota y modulan las respuestas inflamatorias y la expresión de sistemas endógenos sensoriales (en particular del sistema canabinoide).
En primer lugar se ha caracterízado de la microbiota cecal comensal en ratas criadas en condiciones de barrera (SPF) y en ratas criadas en condiciones convencionales y los cambios espontáneos que se producen en el proceso de adaptación de uno a otro ambiente (ratas criadas en barrera adaptadas a condiciones convencionales). Para ello, se emplearon técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) para los principales grupos bacterianos descritos en la microbiot intestinal y análisis de polimorfismos de fragmentos terminales de restricción (t-RFLP). Con la intención de correlacionar la microbiota con los sistemas de reconocimiento bacteriano se determinó también la expresión de los receptores de tipo Toll (Toll like receptors) 2 (TLR-2) y 4 (TLR-4); para ello se emplearon técnicas de RT-PCR. Los resultados obtenidos demuestran que las ratas criadas en barrera tienen mayor cantidad de Bacteroides spp y Clostridium spp y menor cantidad de bifidobacterias y lactobacilos que las ratas criadas en condiciones convencionales. Las ratas adaptadas a un ambiente convencional tienen las mismas poblaciones bacterianas pero en cantidades intermedias. Según el análisis de t-RFLP, la biodiversidad de las poblaciones bacterianas fue similar los tres grupos de animales. En particular, se observo una alta homogeneidad en el tiempo de las poblaciones bacterianas en el grupo barrera. La expresión de TLR-2 fue similar en los tres grupos, mientras que el TLR-4 mostró una clara tendencia a la sobre-expresión en condiciones de barrera y una reducción progresiva en la adaptación a condiciones convencionales. En general, los niveles de expresión no se correlacionaron con ninguno de los grupos bacterianos cuantificados.
A continuación, se ha empleado un modelo de enteritis (íleitis) aguda inducida por indometacina para valorar variaciones de la microbiota comensal asociadas a la inflamación así como diferencias en la susceptibilidad a la inflamación entre ratas criadas en condiciones extremas de higiene (SPF) adaptadas a un ambiente convencional y ratas criadas en condiciones convencionales. Los resultados obtenidos muestran, que durante la inflamación aguda la microbiota comensal, tanto del ileon como del ciego, varía cualitativa y cuantitativamente. Además, se afectan los sistemas intestinales de reconocimiento bacteriano, con una sobre-expresión de los receptores TLR-2 y TLR-4 durante la inflamación. Con respecto a la respuesta inflamatoria propiamente dicha, las ratas criadas en condiciones convencionales mostraron, en general, una mayor susceptibilidad a la inflamación aguda que los animales SPF adaptados, tal y como mostró la evaluación clínica, histológica y bioquímica de la inflamación.
Finalmente, se ha evaluado como la microbiota comensal del intestino puede afectar otros mecanismos sensoriales intestinales; en particular, mecanismos dependientes de receptores canabinoides. Para ello, se ha determinado la expresión intestinal de receptores canabinoides, CB1 y CB2, en ratas mantenidas en condiciones de barrera (SPF), ratas mantenidas en condiciones convencionales y animales criados en barrera y adaptados a condiciones convencionales. En general, los dos receptores se expresaron en tejido cecal, aunque los niveles de CB2 fueron mayores a los de CB1. Además, independientemente del receptor considerado, la expresión se reduce en el paso de un ambiente de barrera a un ambiente convencional. Estas variaciones en la expresión se correlacionaron positivamente con los cambios espontáneos en las poblaciones de Bacteroides spp y Clostridium spp y negativamente con la población de Bifidobacterium spp.
En su conjunto, estos resultados muestran que la microbiota intestinal es un sistema dinámico, que varía y se adapta espontáneamente a las condiciones ambientales en las cuales se mantienen los animales de experimentación. Estos cambios implican variaciones en la homeostasis intestinal que afecta a la expresión de receptores de reconocimiento bacteriano (TLR-2 y TLR-4) o de receptores canabinoides, así como a la susceptibilidad a la inflamación, al menos en su fase aguda. Estas observaciones indican que la microbiota intestinal es un factor de variabilidad que puede afectar a los resultados experimentales y debe tenerse en cuenta en la interpretación de resultados experimentales, particularmente en el área de gastrointestinal.
Recent data suggest that gut commensal microbiota is a dynamic factor with an active relationship with the host, through the interaction with specific bacterial recognition systems, and directly involved in the regulation of gastrointestinal sensory, motor and secretory responses. In particular, gut commensal microbiota has been implicated in the pathophysiology of inflammatory bowel disease (IBD).
This work aims to demonstrate how environmental variations lead to spontaneous adaptive changes of gut commensal microbiota in rats, and how these changes affect the expression of bacterial recognition systems and modulate gut inflammation and the expression of endogenous sensory systems (in particular the cannabinoid system).
First, we determined changes in cecal commensal microbiota and expression of Toll Like Receptors (TLR), (TLR-2) and (TLR-4) in rats bred under microbiologically-controlled conditions (barrier), under standard conditions (conventional) and in barrier animals adapted to standard conditions (barrier/conventional). In these groups, cecal microbiota was analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH) and microbial profiles were assessed by terminal restriction fragment length polymorphism (t-RFLP). As to correlate microbiota and bacterial recognition systems within the gut, cecal expression of TLR-2 and TLR-4 was also determined by RT-PCR. Total number of cecal bacteria was similar in the three groups. However, the barrier group showed a higher number of strict anaerobic bacteria, namely Bacteroides spp and Clostridium spp, while Bifidobacterium spp and Lactobacillus spp were scarce. Re-housing the barrier-bred rats into conventional conditions led to a microbiota with intermediate characteristics between the barrier and the conventional groups. Richness of the cecal microbial ecosystem was similar in the three groups. Although a relative time-dependent variation was observed in microbiota composition, the barrier group showed high consistency over time. Expression levels of TLR-2 and TLR-4 were relatively low, without clear correlation with the microbiota. Only TLR-4 showed a tendency to be over-expressed in the barrier group.
Thereafter, a model of indomethacin-induced acute enteritis (ileitis) in rats was used to assess inflammation-induced changes in gut commensal microbiota as well as differences in the susceptibility to inflammation between rats bred under high hygienic conditions (SPF) adapted to conventional conditions and rats bred and maintained under conventional conditions. Results obtained show specific, inflammation-induced, qualitative and quantitative changes of ileal and cecal comensal microbiota. Moreover, gut bacterial recognition systems are also affected by acute inflammation, with an over-expression of both TLR-2 and TLR-4. As it relates to inflammation per se, rats breds under conventional conditions showed, in general, higher susceptibility to inflammation than SPF animals adapted to the conventional environment; as demonstrated using clinical histological and biochemical parameters.
Finally, we assessed how gut comensal microbiota affects other intestinal sensory mechanisms, in particular cannabinoid receptor-dependent mechanisms. For this, we determined the cecal expression of cannabinoid receptors 1 (CB1) and 2 (CB2) in the same groups of rats described above: 1) maintained under barrier conditions (SPF); 2) maintained under conventional conditions; and 3) bred under barrier conditions but adapted to a conventional environment. In general, both receptors were expressed in cecal tissues, although levels of expression of CB2 were higher than those of CB1. Moreover, independently of the receptor subtype considered expression levels diminished with the change from barrier to conventional conditions. These variations correlated positively with spontaneous changes in the counts of Bacteroides spp and Clostridium spp and negatively with the counts of Bifidobacterium spp.
As a whole, these results show that gut commensal microbiota is a dynamic system, which varies and adapts spontaneously to the environmental conditions of maintenance of laboratory animals. These changes involve variations in gut homeostasis and affect the expression of bacterial recognition receptors, namely TLR-2 and TLR-4, and cannabinoid receptors (CB1 and CB2) and the susceptibility to acute intestinal inflammation. These observations suggest that gut commensal microbiota is a variable factor that can affect the experimental output and that, therefore, must be considered in the interpretation of studies, particularly in the field of gastrointestinal.

Con el objeto de caracterizar genéticamente a las poblaciones asnales españolas, que se encuentran en peligro de extinción, se llevo a cabo un estudio a partir del análisis de 15 loci microsatélites (AHT4, AHT5, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, HTG15 y VHL20), en un total de 513 individuos, correspondiendo a: Andaluza (87), Catalana (140), Encartaciones (74), Mallorquina (104) y Zamorano-Leonesa (108). Adicionalmente se incluyeron 9 asnos de Marruecos, utilizados como población de referencia, y 24 caballos, utilizados como población "outgroup". Similarmente se evaluaron dos regiones parciales del mtDNA, específicamente del citocromo b y del D-loop, en 79 y 91 secuencias, respectivamente, de las razas antes mencionadas, así como, de 10 y 11 secuencias adicionales correspondientes a la raza Majorera y asno de Zimbabwe, respectivamente. Los análisis mostraron que los microsatélites amplificaron exitosamente, excepto ASB2, que no amplificó y HMS1 que resultó ser monomórfico con 165 pb. El HT promedio sobre todos los loci fue 0,683, sin diferencias significativas entre razas, mientras que el número medio de alelos osciló entre 3 (HMS5) y 15 (AHT4), con ligeras diferencias entre las razas. La PE global resultó ser del 99,99%, para todas las razas. El grado de diferenciación genética resultó ser del 4,1%, contribuyendo todos los loci a ella. El déficit promedio de heterocigotos por raza fue del 17,8%, mientras que en la población total ese déficit fue del 21,1%. A nivel jerárquico la diferencia entre razas fue del 6.4%; y las principales causas del déficit de heterocigotos intrarracial resultaron ser la consanguinidad, en las razas AND, CAT y ZAM, y la subestructuración reproductiva en ENC y MALL; no obstante no podemos obviar la posible presencia de alelos nulos en la población, pero debido a la carencia de registros genealógicos no se pudo corroborar. Las relaciones genéticas mostraron que las razas más próximas siempre fueron la Catalana y Mallorquina, estando la Andaluza siempre más alejada de las razas del norte de España. Por otro lado, el análisis de las secuencias del mtDNA, nos permitió detectar entre 6 y 7 haplotipos, para el citocromo b y el D-loop, respectivamente, con este número reducido los valores de diversidad nucleotídica correspondieron a 0,001 y 0,007, para ambas regiones, respectivamente. Los resultados del mtDNA nos permiten indicar que el estado actual de las razas asnales españolas parecen corresponder al producto de una mezcla de líneas maternas debido a un elevado flujo de genes entre ellas, o bien qué, su origen, se corresponde con la de un ancestro único y común con las razas africanas. Los análisis con marcadores moleculares del tipo microsatélite resultan muy útiles y valiosos para la caracterización genética de las poblaciones asnales, y de esta manera ayudan y contribuyen a una mejor gestión de los planes o programas de conservación de esta especie.
In order to characterize genetically the Spanish donkey breeds, which are in danger of extinction, was carried out a study from the analysis of 15 loci microsatellites (AHT4, AHT5, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, HTG15 and VHL20), in a total of 513 individuals, corresponding to: Andaluza (87), Catalana (140), Encartaciones (74), Mallorquina (104) and Zamorano-Leonesa populations (108). Additionally, 9 asses of Morocco were used like population of reference, and 24 horses, used like population included themselves outgroup. Similarly, two partial regions of mtDNA were evaluated, specifically of Citocromo b and the D-loop, in 79 and 91 sequences, respectively, of the breeds before mentioned, as well as, of 10 and 11 additional sequences corresponding to the Majorera breed and ass of Zimbabwe, respectively. The analysis showed that all the microsatellites amplified successfully, except ASB2, that did not amplify and HMS1 that turned out to be monomorphyc with 165 pb. The HT average on all loci was 0.683, without significant differences between breeds, whereas the average allele number oscillated between 3 (HMS5) and 15 (AHT4), with slight differences between the breeds. The cumulative exclusion probability (PE) was 99.99%, for all the breeds. The degree of genetic differentiation turned out to be from the 4.1%, contributing all loci to her. The deficit average of heterozygotes by race was of the 17.8%, whereas in the total population that deficit was of the 21.1%. At hierarchical level the difference between breeds was of the 6.4%; and main the causes of the intraracial deficit of heterozygotes turned out to be the consanguinity, in the breeds AND, CAT and ZAM, and the reproductive structure in ENC and MALL; despite we cannot avoid the possible presence of null alleles in the population, but due to the deficiency of genealogical registries it was not possible to be corroborated. The genetics relationship showed that the next breeds always were Catalana and the Mallorquina, being the Andaluza always remoter of the breeds of the north of Spain. On the other hand, the analysis of the sequences of mtDNA, allowed detecting between 6 and 7 haplotipos, for citocromo b and the D-loop, respectively, with this reduced number the values of nucleotide diversity corresponded to 0.001 and 0.007, for both regions, respectively. The results of mtDNA allow us to indicate that the present state of the Spanish donkey breeds seems to correspond to the product of a mixture of maternal lines due to a high flow of genes among them, or what, its origin, corresponds with the one of ancestral only and common with the African breeds. The analyses with molecular markers of the type microsatellites are very useful and valuable for the genetic characterization of the donkey populations, and this way they help and they contribute to one better management of the plans or programs of conservation of this species.

La tesi doctoral engloba l'estudi de les adaptacions funcionals i estructurals que es produeixen en el còlon distal deguts als canvis en la ingesta de sodi. En concret s'ha estudiat el paper de tres hormones, l'angiotensina II, l'aldosterona i la vasopressina, en el transport de Na+, en la permeabilitat de l'epiteli i en el desenvolupament miofibroblàstic de la zona pericriptal.

Mitjançant un model animal d'activació del RAAS en rata, s'han reproduït les adaptacions funcionals i estructurals en la mucosa del còlon distal en l'adaptació d'una dieta amb alt contingut en sodi (HS) a una dieta amb baix contingut en sodi (LS). Després de tan sols 3 dies de dieta LS augmenta el transport electrogènic de sodi i disminueix la permeabilitat del teixit, fet que es confirma per un augment en la densitat de les unions estretes, concretament de l'expressió de claudina 4, i per un augment en la resistència transepitelial. S'ha confirmat que en tan sols tres dies de dieta LS, la capa de miofibroblasts presents en la zona pericriptal prolifera, ja que augmenta l'expressió d'alfa-actina de múscul llis i la síntesi de col·lagen IV, augmenta l'expressió de les unions adherents que uneixen aquests miofibroblasts, concretament d'E- i OB-caderina, i es produeix acumulació de sodi en aquesta zona pericriptal. El tractament amb captopril, inhibidor de l'ECA, losartan, inhibidor dels ATr1, o espironolactona, antagonista del receptor mineralcorticoide, reverteix aquests efectes, confirmant la implicació de l'angiotensina II i l'aldosterona.

Per determinar el paper concret de l'angiotensina II i de l'aldosterona en aquests efectes s'ha posat a punt un model animal d'activació del RAAS minimitzant la síntesi d'aldosterona mitjançant una operació d'adrenalectomia i controlant la concentració plasmàtica d'ambdues hormones mitjançant la seva infusió exògena. L'aldosterona, sense la presència d'angiotensina II, aconsegueix reproduir els efectes de la dieta LS augmentant el transport electrogènic de sodi, disminuint la permeabilitat del teixit, incrementant la resistència transepitelial, afavorint el creixement miofibroblàstic i augmentant l'acumulació de sodi a la zona pericriptal. L'angiotensina II, en canvi, per si sola no reprodueix aquests efectes. Els resultats obtinguts estan recollits en dues publicacions (Moretó et al., 2005; Cristià et al., 2005).

També s'han estudiat els efectes del grau de deshidratació sobre les funcions del còlon distal, comprovant la implicació directa de la vasopressina i determinant els receptor implicats. Tant la deshidratació com concentracions elevades de vasopressina donen lloc a una disminució de la permeabilitat del teixit, un augment en l'acumulació de sodi a la zona pericriptal i un augment del creixement miofibroblàstic. Ambdós tipus de receptors, V1 i V2, hi estan implicats. Aquests resultats, tot i ser similars a les accions de l'aldosterona, no han demostrat un sinergisme entre ambdues hormones. A més, s'ha confirmat l'expressió d'aquaporina-2 (AQP-2) en la mucosa del còlon distal i l'augment de la seva expressió tant en estats de deshidratació com d'administració de vasopressina. L'expressió d'AQP-2 està mitjançada pel receptor V2, ja que tan sols el tractament amb Tolvaptan, un antagonista específic d'aquests receptors, l'inhibeix.

Aquest estudi destaca l'aldosterona com l'hormona clau de les adaptacions del còlon distal al disminuir la ingesta de sodi de la dieta, descartant un paper directe de l'angiotensina II en aquests efectes. En condicions de deshidratació, la vasopressina també disminueix la permeabilitat de l'epiteli i indueix el desenvolupament de la beina pericriptal, a més de regular el moviment d'aigua a través d'aquaporines mitjançant els seus receptors V2 al còlon distal de rata.
Fluid and electrolyte absorption by colonic crypts depends on the transport properties of crypt cellular and paracellular routes and of the pericryptal sheath. During the transition from a high-Na+ (HS) to a low-Na+ (LS) diet there are changes in the colonic crypt wall and pericryptal sheath. The effect of angiotensin II, aldosterone and vasopressin in these changes was studied. The extracellular Na+ concentration in isolated rat distal colonic mucosa was determined by confocal microscopy using a low-affinity Na+-sensitive fluorescent dye (Sodium red, and Na+-insensitive BODIPY) bound to polystyrene beads. Crypt permeability to FITC-labelled dextran was monitored by its rate of escape from the crypt lumen into the pericryptal space. Mucosal ion permeability was estimated by transepithelial electrical resistance (TER) and amiloride-sensitive short-circuit current. Different epithelial, myofibroblasts and extracellular matrix proteins and membrane receptors were determined by immunolocalization. After only 3 days of a LS diet all colonic changes were reproduced, a decrease in crypt wall permeability, an increase in electrogenic sodium transport and a growth in the pericryptal space, that produced an increase in Na+ accumulation in the pericryptal space. The treatment with captopril, losartan and spironolactone reversed all these effects, showing the implication of angiotensin II and aldosterone. High plasma aldosterone concentrations, independently of the diet or angiotensin II, decreased crypt wall dextran permeability, increased TER, increased Na+ accumulation in the pericryptal sheath and ENaC expression, increased extracellular matrix, membrane receptors and myofibroblast proteins. Angiotensin II did not reproduced LS diet effects. High vasopressin plasma concentration raised alpha-SMA expression in the pericryptal sheath, increased the pericryptal Na+ accumulation in this space and caused a reduction of crypt wall permeability. All these effects were reversed by selective blocking of V1 and V2 receptors. Dehydration and vasopressin infusion increased AQP-2 expression in distal colonic mucosa, an effect mediated by the V2 receptor, as only the specific V2 receptor antagonist inhibited this effect. In conclusion, these findings show that aldosterone alone is responsible for the adaptative changes in the colonic crypts of distal colon due to the sodium content and that vasopressin has similar effects as aldosterone in permeability and growth development.

Evidencias experimentales demuestran que tras un episodio transitorio de isquemia cerebral focal se inducen cambios estructurales, mecánicos y miogénicos en la pared de las arterias cerebrales, así como un aumento en la producción de peroxinitrito, tanto en los vasos sanguíneos como en el parénquima cerebral. Todas estas alteraciones se han asociado con la expansión del daño cerebral. El peroxinitrito es una especie oxidante/nitrante que, debido a su elevada capacidad de modificar proteínas, puede deteriorar diferentes tejidos, incluido el cerebro. De acuerdo con ello, la presente tesis doctoral hemos hipotetizado que el peroxinitrito es un factor clave implicado en las alteraciones de la arteria cerebral media y del daño cerebral que se observan tras episodios de isquemia-reperfusión. El ácido úrico es un potente antioxidante endógeno que supone las 2/3 partes del poder antioxidante del plasma en humanos, y que tras su administración exógena ha mostrado efectos protectores alentadores en la isquemia. Sin embargo, hasta la fecha, únicamente un estudio ha mostrado una reducción del volumen de infarto cerebral y del daño neurológico después del tratamiento con ácido úrico administrado en un plazo clínicamente relevante. Por otro lado, en estudios previos, el desarrollo de hiperemia reactiva durante el periodo de reperfusión después de un episodio de isquemia cerebral se asoció a un mayor volumen de infarto y déficit neurológico. En la presente tesis confirmamos que las ratas hiperémicas sufren infartos más severos que las que no presentan hiperemia, y que el ácido úrico administrado a los 135 min después de la oclusión de la arteria cerebral media es capaz de atenuar dicho infarto y el daño neurológico asociado. Por lo tanto, demostramos que el ácido úrico administrado exógenamente es altamente efectivo en ratas que presentan signos de hiperemia durante la reperfusión, es decir, en aquellas ratas que padecen un mayor daño cerebral. Además, mostramos que la vasorrelajación inducida por SLIGRL, agonista de los receptores PAR2, en arteria cerebral media precontraída con U46619, análogo estable del TXA2 y agonista de los receptores TP, es mayor en ratas isquémicas que en sham (control). También demostramos que este incremento de la relajación tras la isquemia-referfusión podría estar relacionado con la incapacidad del U46619 para bloquear la relajación mediada por los canales SKCa endoteliales. El mecanismo subyacente a esta observación implicaría un aumento de la acumulación de peroxinitrito y la consiguiente disrupción de la F-actina endotelial, que limitaría la capacidad del U46619 para inhibir la función de los canales SKCa, facilitando así la relajación por EDH tras un episodio de isquemia-referfusión. En conjunto, los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que, tras la isquemia-referfusión, el peroxinitrito, mediante su actividad oxidante/nitrosilante, participa en las alteraciones estructurales, mecánicas y vasodilatadoras que se observan en la arteria cerebral media tras un episodio de I/R. Estos hallazgos ayudan a comprender la fisiopatología del ictus isquémico, a la vez que refuerzan el potencial terapéutico de los compuestos antioxidantes con capacidad de neutralizar la acción del peroxinitrito.
Experimental evidence shows that, after a transient episode of focal cerebral ischemia, structural, mechanical and myogenic changes in the wall of the cerebral arteries, as well as an increased production of peroxynitrite, are induced in both blood vessels and brain parenchyma. All these alterations have been associated with the expansion of brain damage. Peroxynitrite is an oxidizing/nitriding specie that due to its high capacity to modify proteins, can deteriorate different tissues, including the brain. Accordingly, in this thesis we hypothesized that peroxynitrite is a key factor involved in the alterations of the middle cerebral artery and brain damage observed after episodes of ischemia-reperfusion. Uric acid is a powerful antioxidant endogenous that represents 2/3 of plasma antioxidant in humans and that after exogenous administration has shown promising protective effects in ischemia. However, to date, only one study has shown a reduction in brain infarct volume and neurological damage after treatment with uric acid administered within clinically relevant time. Furthermore, in previous studies, the development of reactive hyperemia during the reperfusion period after a cerebral ischemic episode was associated with increased infarct volume and neurological deficit. In this thesis we confirm that the hyperemic rats suffer more severe infarcts than those ones that don’t experiment hyperemia, and uric acid administered to 135 min after occlusion of the middle cerebral artery is able to attenuate said infarction and associated neurological damage. Therefore, we show that exogenously administered uric acid is highly effective in rats signs of hyperemia during reperfusion, namely, in those rats having higher brain damage. Moreover, we show that vasorelaxation induced by SLIGRL, PAR2 receptor agonist, in middle cerebral artery precontracted with U46619, stable analog of TXA2 and TP receptors agonist, is higher in ischemic rats than in controls (sham). Furthermore, we demonstrate that this increase in relaxation after ischemia-reperfusion may be related to the inability of U46619 to block endothelial relaxation mediated by SKCa channels. The mechanism underlying this observation involve increased accumulation peroxynitrite and consequent disruption of F-actin endothelial, which limit the ability of U46619 to inhibit the function of SKCa channels, thus facilitating the relaxation after an episode of ischemia-reperfusion. Overall, the results obtained in this study show that, after ischemia-reperfusion, the peroxynitrite participates in the structural, mechanical and vasodilator alterations observed in the middle cerebral artery. These findings help to understand the pathophysiology of ischemic stroke, while reinforcing the therapeutic potential of antioxidant compounds capable of neutralizing the action of peroxynitrite.