Academic literature on the topic 'Sécrétion régulée'

Le dossier thématique suivant a été rédigé par les étudiantes et étudiants de Master 1 de Biologie de l’École Normale Supérieure de Lyon à l’issue de l’UE Microbiologie Moléculaire et Structurale (2019-2020). Le Master de Biologie de l’ENS de Lyon, cohabilité par l’université Claude Bernard Lyon 1, accueille chaque année environ 50 étudiants en M1 et en M2 et propose une formation de haut niveau à la recherche en biosciences. Chaque étudiant y construit son parcours à la carte, en choisissant ses options parmi un large panel de modules, favorisant ainsi une approche pluridisciplinaire des sciences du vivant, et ce en relation étroite avec les laboratoires de recherche du tissu local, national et international. En participant à diverses activités scientifiques connexes aux UE de leur formation, les étudiants préparent également l’obtention du Diplôme de l’ENS de Lyon, qui valide leur scolarité à l’ENS. La rédaction du présent dossier, qui vise à transmettre de façon claire les messages issus d’une sélection d’articles scientifiques publiés récemment dans le domaine de la microbiologie, constitue l’une de ces activités connexes proposées aux étudiants. Les bactéries peuvent vivre en communautés dont la structure est régulée par de nombreuses interactions abiotiques et biotiques. Les interactions biotiques reposent sur des communications inter-bactériennes qui participent à la mise en place de relations de collaboration, de compétition ou de prédation. Ces communautés bactériennes peuvent en outre être en interaction avec des hôtes animaux, dans le cas des bactéries du microbiote ou des bactéries pathogènes par exemple, ou avec des virus parasites, les bactériophages. Le présent dossier illustre quelques aspects nouveaux de cette communication bactérienne, et de la façon dont les interactions bactéries/hôte ou bactéries/phages peuvent impacter cette communication. Deux nouvelles s’attardent sur des découvertes récentes autour du quorum sensing, une modalité de communication bactérienne permettant l’expression coordonnée des gènes à l’échelle de la population, en fonction de la densité de la population. La nouvelle intitulée « Le monoxyde d’azote : une arme du système immunitaire pour brouiller les communications entre bactéries » illustre comment le quorum sensing chez Staphylococcus aureus, une bactérie opportuniste, peut être affecté par un médiateur du système immunitaire de la souris. La nouvelle intitulée « Un bactériophage exploite le système de communication de son hôte bactérien pour entrer en cycle lytique » montre une stratégie étonnante par laquelle le phage VP882 décrypte des signaux issus du quorum sensing de la bactérie qu’il infecte pour réguler son propre cycle de réplication. Au-delà du quorum sensing, deux nouvelles décrivent de nouvelles modalités de communication inter-bactérienne. La nouvelle intitulée « Les nanotubes bactériens, acteurs de la compétition entre Bacillus subtilis et Bacillus megaterium » met en lumière le rôle des nanotubes, des structures de communication intercellulaire insoupçonnées jusque récemment chez les bactéries. La nouvelle intitulée « La bactérie Vibrio cholerae lyse les bactéries environnantes et assimile leur ADN qu’elle intègre dans son propre génome » illustre comment un système de sécrétion, qui permet l’injection d’effecteurs bactériens dans des cellules cibles, peut être exploité pour faciliter les transferts horizontaux de gènes chez les bactéries. Enfin, pour élargir la réflexion au monde des virus eucaryotes, deux nouvelles montrent comment l’infection virale peut interférer avec la communication entre cellules eucaryotes, sur l’exemple de la communication s’effectuant par l’intermédiaire de vésicules extracellulaires. La nouvelle intitulée « La sécrétion de vésicules extracellulaires par les plaquettes activées à l’origine de la létalité de la dengue ? » discute des mécanismes par lesquels le virus de la dengue déclenche la sécrétion de vésicules extracellulaires par les plaquettes, et des conséquences que cela peut avoir sur l’inflammation et le déclenchement de chocs hémorragiques. La nouvelle intitulée « Le coccolithovirus et Emiliania huxleyi : le détournement viral des vésicules extracellulaires » montre enfin comment ce virus d’algue unicellulaire exploite la communication intercellulaire de son hôte pour augmenter son pouvoir de diffusion au sein de la population, et des conséquences écologiques et géochimiques que cela peut entraîner à grande échelle.

Juments et étalons présentent une phase de reproduction pendant les jours croissants ou longs, au printemps et en été. La majorité des juments n’ont pas d’ovulation en hiver. Ce rythme annuel de reproduction est synchronisé par les variations annuelles de la longueur du jour. Un éclairement artificiel de 14,5 h, débuté en hiver, avance la première ovulation annuelle des juments.
 Certaines des étapes de la transmission de l’information lumineuse ont été vérifiées chez les équidés. Le message lumineux est transformé en influx nerveux par des cellules spécialisées de la rétine. Cet influx, via le noyau supra-chiasmatique puis le ganglion cervical supérieur, agit sur la glande pinéale. Les pinéalocytes répondent à une stimulation noradrénergique en libérant la mélatonine. Cette hormone, sécrétée pendant la phase obscure, agit sur des récepteurs membranaires spécifiques. L’administration de mélatonine exogène sous forme d’implants sous-cutanés ou, dans certaines conditions, sous forme orale, supprime l’effet photostimulant d’un jour long. L’utilisation d’implants est actuellement à l’étude pour mettre au point un traitement de désaisonnement.
 La sécrétion des neurones à GnRH est ensuite régulée par des neuromédiateurs. La naloxone, antagoniste des opiacées endogènes, induit une décharge de GnRH suivie d’une libération de LH et de FSH chez la jument en inactivité. Les hormones thyroïdiennes ont probablement une action à ce niveau.
 L’alternance d’un mois de jours courts et d’un mois de jours longs qui permet, chez les petits ruminants mâles, d’abolir les variations saisonnières est, dans l’état actuel des travaux, inefficace chez l’étalon ou la jument.
 Pour avancer la date de la première ovulation annuelle, les éleveurs ne disposent actuellement que d’un traitement comportant 14,5 h d’éclairement par jour, commencé vers le solstice d’hiver et appliqué pendant 35 jours.

Les principes, contraintes et questions de recherche relatifs à plusieurs perspectives d’alternatives thérapeutiques aux antibiotiques sont présentés. Différentes approches telles que la phytothérapie et la phagothérapie, basée sur l’activité lytique des phages infectant les bactéries, sont anciennes mais leur utilisation pratique nécessiterait des recherches complémentaires en matière de qualité, efficacité et sécurité ainsi que des évolutions réglementaires. D’autres approches sont plus récentes et requièrent de poursuivre des travaux de recherche avant d’envisager leur application sur le terrain. C’est le cas notamment des peptides de défense de l’hôte, molécules de l’immunité innée produites essentiellement par les cellules épithéliales et phagocytes, qui ont une activité antimicrobienne à large spectre et un pouvoir de régulation de l’immunité. Il y a peu de développement industriel lié à des difficultés techniques, malgré le grand nombre de peptides candidats. Une autre approche concerne le « quorum sensing », lié à la sécrétion de molécules de signalement par les bactéries, qui permet des changements coordonnés chez les bactéries présentes au-delà d’un certain seuil, notamment la production de facteurs de virulence ou de biofilms. Le blocage de ces mécanismes, ou « quorum quenching », pourrait permettre de réguler ces propriétés.


 
 
 
 Le foie gras des palmipèdes gavés est l’expression d’une stéatose hépatique d’origine nutritionnelle, hypertrophique, réversible et caractérisée par une accumulation de triglycérides dans les hépatocytes. Cette aptitude est favorisée par certaines particularités physiologiques et métaboliques des oiseaux en particulier un site prépondérant de synthèse des lipides qui est le foie et l’utilisation d’un aliment spécifique, le maïs riche en amidon et distribué en grandes quantités aux palmipèdes. Cet apport important de maïs va activer deux facteurs de transcription, SREBP-1c et ChREBP régulés respectivement par l’insuline et par le glucose, et qui vont agir ensuite sur la glycolyse et la lipogenèse. Toutefois, l’aptitude à la production de foie gras varie selon les espèces voire les souches de palmipèdes. Elle repose, essentiellement, sur une capacité de lipogenèse hépatique accrue, une capacité de sécrétion hépatique des triglycérides néo-synthétisés insuffisante et une capacité de captage des lipides circulants par les tissus périphériques limitée favorisant ainsi leur retour vers le foie et accentuant le développement de la stéatose. La sélection sur le poids de foie gras est efficace. Trois QTL agissant sur le poids de foie gras du canard mulard, ont été détectés sur les chromosomes 2, 9 et 21 de la cane commune. Par ailleurs, avec des conditions d’élevage et d’alimentation adaptées, les oies sont capables d’initier une stéatose hépatique spontanée. Cela constitue une perspective pour développer une production de foie gras sans recours au gavage.
 
 
 

La vitamine D est une hormone stéroïde vitale synthétisée essentiellement de façon endogène sous l’effet des rayons ultraviolets sur la peau, mais aussi présente dans certains aliments (origine exogène), qui a un effet immuno-modulateur en stimulant l’immunité innée via la sécrétion de peptides antiviraux. Des publications récentes suggèrent que la carence en vitamine D pourrait compromettre les fonctions immunitaires respiratoires augmentant ainsi le risque d’infection par la COVID-19 mais aussi le risque de formes graves et de mortalité. La vitamine D induit la prolifération et la production cytokinique des cellules NK. Il est de plus en plus admis que la vitamine D joue un rôle dans L’immunité innée et adaptative et qu’elle limiterait les conséquences néfastes de l’immunopathologie induite par les agents infectieux. Ainsi la supplémentation en vitamine D pourrait réduire le risque de développement et de formes graves de la COVID 19 si instaurée précocement, avant une éventuelle atteinte pulmonaire, son efficacité n’est pas certaine dans les formes évoluées. Il a été également suggéré qu’une supplémentation en magnésium avec des suppléments de vitamine D serait bénéfique, car le magnésium aide à réguler l’homéostasie phosphatée et calcique. Il est donc recommandé une dose quotidienne de 800 UI/jour de cholécalciférol (ou équivalent). Des études randomisées contrôlées de large ampleur, en termes de taille et de typage clinique des populations, sont à mener afin de déterminer dans quelle mesure la gestion de la pandémie à Sars-CoV2 pourrait passer par celle de la carence vitaminique D.

Les propriétés et le rôle physiologique de la protéine prion sont encore mal connus, de même que la façon et les raisons pour lesquelles la protéine prion normale est transformée en protéine prion pathogène. Ces différentes questions sont importantes, à la fois pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles et pour rechercher des possibilités de thérapie. C’est la raison pour laquelle divers types de travaux sont conduits sur ces questions, utilisant différentes approches.
 L’article de Lepage et al. est basé sur l’approche physicochimique de la structure de la protéine prion. L’objectif de ces travaux est de rechercher les domaines de la protéine prion qui pourraient avoir un rôle clé dans la transconformation de la protéine normale en protéine pathogène, tant pour induire que pour réguler ce processus.
 L’article de Moudjou et al. est basé sur une approche immunochimique. Des anticorps monoclonaux ont été mis au point, avec des affinités particulières pour certaines régions de la protéine prion PrP. Ainsi certains anticorps reconnaissent différentes formes glycosylées de la protéine et discriminent les allèles de la PrP associés à la susceptibilité des moutons à la tremblante. Ces réactifs offrent des perspectives dans plusieurs domaines, notamment dans l’étude du rôle de la glycosylation dans la capacité de la protéine prion à être convertie en protéine pathogène et dans l’analyse fine des profils glycotypiques de la protéine anormale, dans le cadre du typage moléculaire des souches de prions. Ces anticorps peuvent également être utilisés comme moyen de génotypage rapide des moutons.
 Enfin, l’article de Gatti et al. analyse le rôle physiologique de la protéine prion cellulaire. Des travaux ont été entrepris pour établir la présence et les voies de sécrétion de la protéine prion normale dans différents organes et tissus de l’organisme, ainsi que son rôle, en utilisant différents modèles animaux et cellulaires.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP permettant la libération du contenu des GS dans le milieu extracellulaire. Bien que très utiles, les méthodes électrophysiologiques et électrochimiques ne donnent d'informations ni sur la localisation ou les mouvements des GS avant fusion, ni sur le devenir de la membrane des GS après fusion. Plusieurs techniques d'imagerie in vivo cherchent à répondre à ces questions. La mieux adaptée est la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM) qui permet d'observer les mouvements de GS individuels à proximité immédiate de la MP. Nous avons appliqué cette approche à l'étude de la sécrétion des cellules BON (lignée dérivée d'un carcinome). Leur stimulation a été faite par la technique du Ca cagé, appliquée pour la première fois en microscopie TIRF. Après exocytose, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d'une partie des GS, ainsi que l'exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l'exocytose séquentielle représente ~25% des événements d'exocytose. L'analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu'environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l'accostage et l'arrimage des GS pourrait être la traduction d'évènements moléculaires impliqués dans l'amorçage des GS, nécessaire à la fusion.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP. Grâce à la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d’une partie des GS après exocytose, ainsi que l’exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l’exocytose séquentielle représente ~25% des événements d’exocytose. L’analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu’environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l’accostage et l’arrimage des GS pourrait être la traduction d’évènements moléculaires impliqués dans l’amorçage des GS, nécessaire à la fusion.

Les bases moléculaires de la sécrétion hormonale et de la libération de neurotransmetteurs dépendantes du calcium sont très semblables. Durant ma thèse, je me suis intéressé à divers aspects du cycle des granules de sécrétion dans des modèles cellulaires neuroendocriniens. J'ai en particulier étudié la contribution des transporteurs plasmiques de neuromédiateurs à la taille du quantum de sécrétion. Nous avons démontré que la surexpression de SERT (le transporteur plasmique de recapture de la sérotonine) au sein de la lignée neuroendocrine PC12 induit une augmentation de la taille des quanta sécrétés, et que le contrôle du remplissage vésiculaire était cinétique plutôt que thermodynamique. Ces observations ont permis de développer une méthode de mesure de l'activité sécrétrice d'une sous-population transfectée des cellules PC12. Cette technique permet de quantifier l'effet d'une protéine co-transfectée avec SERT sur l'activité sécrétrice.<br /><br />Une autre partie de mon travail concerne les petites GTPases Rab. Ces protéines régulent de nombreuses étapes du trafic cellulaire. Rab3 joue un rôle dans le contrôle d'étapes tardives de la neurotransmission/sécrétion d'hormones. Nos résultats, basés sur des analyses électrochimiques et biochimiques, suggèrent que Rab3 contrôlerait l'étape d'amorçage de la fusion.<br /><br />Plus récemment, notre attention s'est portée sur Rab27, une Rab proche de la famille Rab3, ainsi que sur MyRIP (Myosin and Rab Interacting Protein). Nous avons montré que MyRIP est un ligand de Rab27 et que ces deux protéines sont associées aux granules de sécrétion. MyRIP interagit aussi avec les myosines 7a/5a et avec l'actine. Ainsi, Rab27 et MyRIP lient les granules au cytosquelette d'actine et contrôlent leur mobilité au voisinage de la membrane plasmique.<br /><br />Nos études sur Rab3 et Rab27 ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires des processus impliquant ces GTPases, et illustrent la diversité des modes d'action de ces protéines.

Le phéochromocytome (PCC) est une tumeur neuroendocrine rare qui se développe principalement aux dépens des cellules chromaffines de la médullo-surrénale. Dans la majorité des cas, les PCCs sont caractérisés par une hypersécrétion de catécholamines responsables de divers effets délétères chez les patients dont le principal est une hypertension (phéochromocytomes symptomatiques, PS). Cependant, il existe également une forme particulière de PCCs asymptomatiques qui sécrètent des taux physiologiques de catécholamines (phéochromocytomes incidentaux, PI). Parmi les patients porteurs de PI, certains sont hypertendus (PIH) et d’autres non (PIN). Afin de mieux caractériser les différents profils sécrétoires de PCCs (PS et PI), nous avons recherché une implication potentielle des microARNs (miRNAs). Nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle des miRNAs exprimés dans 32 échantillons de PCCs (12 PS, 12 PIN et 8 PIH). Le miRNome a été réalisé par qRT-PCR microfluidique (Taqman Low Density Array, TLDA) pour 671 miRNAs. L’analyse statistique (Limma) des données d’expression a permis d’identifier 4 miRNAs significativement sur-exprimés (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) et 3 miRNAs sous-exprimés (497-3p, 32-5p, 190b-5p) dans les tumeurs PIN par rapport aux PS. Pour identifier les cibles potentielles des miRNAs, de nombreux logiciels de prédictions bioinformatiques sont disponibles en ligne mais les résultats qu’ils génèrent sont très divergents. Afin de contourner ce problème nous avons développé miRabel, un nouvel outil de prédiction des cibles potentielles des miRNAs et des fonctions biologiques qui leurs sont associées. Le principe général consiste à agréger les résultats de 3 autres algorithmes de prédiction sélectionnés pour leur complémentarité. Au final, les analyses des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic), de la précision et du Recall ont montré que cet outil est plus efficace i) que les algorithmes qu’il agrège et ii) que d’autres logiciels de prédictions couramment utilisés tels que miRWalk, MBSTAR et TargetScan. Une analyse d'enrichissement (Modular Enrichment Analysis ou MEA, Genecodis3) des cibles prédites pour les miRNAs différentiellement exprimés a révélé qu’ils peuvent moduler significativement l’activité de quelques dizaines de voies de signalisation dont celles du cytosquelette d’actine et des SNAREs (impliquées dans le transport vésiculaire). En se basant sur l’expression des miRNAs, leurs énergies d’hybridation avec leurs cibles ainsi que leurs effets physiologiques potentiels, les ARNm des gènes PAK3, MLCP, MLCK (cytosquelette d’actine), SNAP25 et STX1A (SNAREs) ont été retenus pour la suite de l’étude. Les essais luciférases ont mis en évidence une interaction entre la totalité de l’extrémité 3’UTR des ARNm de MLCK et miR-32, STX1A et miR-550a-3p, SNAP25 et miR-7-1-3p ainsi que miR-550a-3p. Les autres interactions testées se sont révélées négatives. Les analyses par RT-qPCR ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm de MLCK et de STX1A suite à la transfection de miR-32-5p et miR-550a-3p respectivement. Concernant SNAP25, un effet inhibiteur de miR-550a-3p / 7-1-3p est observé. Cet effet a été confirmé au niveau protéique pour STX1A et SNAP25<br>Pheochromocytomas (PCC) are rare neuroendocrine tumors which arise from chromaffin cells of the adrenal medulla. In most cases, PCCs are characterized by a hypersecretion of catecholamines, which is responsible for most of deleterious effects in the patients with hypertension being the main symptom (symptomatic pheochromocytomas, SP). However, some PCCs are asymptomatic and secrete physiological levels of catecholamines (Incidental Pheochromocytomas, IP). Among patients with an IP, some are hypertensive (HIP) and other are strictly normotensive (NIP). In order to better understand the different secretory profiles of PCCs (SP and IP), we investigated the potential role of microRNAs (miRNAs) in this process. We started by identifying differentially expressed miRNAs between 12 SP, 12 NIP and 8 SP. The miRNome was done by microfluidic qRT-PCR (Taqman Low Density Array, TLDA) for 671 miRNAs. Statistical analysis (Limma) of the expression results identified 4 miRNAs significantly over-expressed (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) and 3 under-expressed (497-3p, 32-5p, 190b-5p) in NIP tumors when compared to SP. To identify potential miRNAs’ targets, numerous bioinformatic prediction methods are available but their results are quite divergent. To circumvent this issue, we developed miRabel, a new miRNAs’ targets prediction tool and their associated biological functions. MiRabel aggregated the results of 3 other prediction algorithms selected for their features complementarity. The analysis of ROC, precision and recall curves showed that this tool is more efficient i) than the aggregated prediction methods and ii) than other recent or widely used tools such as miRWalk, MBSTAR and TargetScan. A Modular Enrichment Analysis (MEA, Genecodis3) of the miRNAs’ predicted targets revealed that they could potentially regulate the activity of a few pathways of which the actin cytoskeleton and the SNAREs (involved in vesicular transport). PAK3, MLCP, MLCK (Actin cytoskeleton), SNAP25 and STX1A (SNAREs) were selected to be experimentally validated based on miRNA’s expression, hybridization energy and potential physiological impact. Experimental validations of the selected interactions are achieved by luciferase gene reporter, RT-qPCR assays and western-blots following the transfection of studied miRNAs. Luciferase assays showed a direct interaction between the whole 3’UTR of MLCK mRNA and miR-32-5p, STX1A and miR-550a-3p, SNAP25 and miR-7-1-3p as well as miR-550a-3p. The other tested interactions came out to be negative. A significant decrease of MLCK mRNA and STX1A were observed by RT-qPCR analysis after transfecting miR-32-5p and miR-550a-3p respectively. As for SNAP25, the inhibitory effect of miR550a-3p/7-1-3p could be observed. This effect was confirmed at the protein level by western-blots for STX1A and SNAP25. We then evaluated the physiological effect of miR-550a-3p/7-1-3p on the regulated secretion of PC12 rat PCC cells. This was achieved using a nano-luciferase fused to growth hormone 1 (GH1). Once stimulated (59 mM potassium and 2 mM barium), miR-550a-3p over-expression decreased the secretory capacity of PC12 cells while miR-7-1-3p could not. This project represents the first study aiming to understand the regulation of the catecholamine secretion pathway by miRNAs in the pathophysiological context of PCC patients. Eventually, the characterization of this miRNA’s network should improve patient care in the field of hypersecreting neuroendocrine tumors

Des études récentes d'invalidation du gène codant la chromogranine A (CgA) ont suggéré que cette protéine jouerait un rôle clé dans la biogenèse des granules de sécrétion (GS) au sein des cellules neuroendocrines. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués au cours de ce processus demeurent mal connus. Récemment, nous avons montré que l'expression de la CgA dans les cellules non-endocrines COS-7 induit la biogenèse de structures granulaires apparentées aux GS, capables de stocker et de sécréter la CgA et des hormones co-exprimées (NPY, GH), de manière calcium-dépendante. Les analyses des cellules COS-7 exprimant la CgA en microscope confocale et en vidéomicroscopie, associées à des approches biochimiques, ont permis d'établir des interactions entre les granules contenant la CgA, les microtubules et les filaments d'actine. Ces deux éléments du cytosquelette exercent des fonctions régulatrices sur le trafic intracellulaire et l'exocytose calcium-dépendante des granules contenant la CgA. Ces résultats suggèrent que la CgA est suffisante pour induire la biogenèse de GS et instaurer ainsi une voie de sécrétion régulée dans des cellules non-endocrines. Le clonage de la CgA de grenouille ayant révélé la conservation des régions N- et C-terminales au cours de l'évolution des vertébrés, nous avons émis l'hypothèse de leur implication en tant que déterminants fonctionnels de la CgA. Ainsi, nos résultats démontrent que les peptides conservés confèrent à la CgA sa capacité à former des GS et dirigent l'adressage et la libération régulée des hormones exogènes co-exprimées avec la CgA dans les cellules COS-7, ainsi que la POMC endogène dans les cellules corticotropes AtT20<br>The nature of the sorting signals for entry of proteins into the dense-core secretory granules (SG) and the molecular machinery required to generate SG remain unclear. Recent studies revealed that chromogranin A (CgA) deficiency is associated with hormone storage impairment, suggesting that CgA plays a major role in the formation of SG in neuroendocrine cells. The cloning of frog CgA revealed high conservation though evolution of the global acidity and of the terminal regions of the protein, suggesting that these features are essential for the biological activity of CgA. Expression of CgA in the non-endocrine COS-7 cells induced the formation of dense-core vesicles containing CgA. As SG in neuroendocrine cells, trafficking and exocytosis of CgA-containing granules required interactions with microtubules and actin filaments. These SG-like organelles were able to store hormones that could be released in a calcium-dependent manner. Deletion of the terminal regions of CgA resulted in a reorientation of the proteins from the regulated to the constitutive secretory pathway, indicating that these domains were essential for the formation of functional SG-like structures in COS-7 cells. Expression of CgA in the corticotrope AtT20 cells increased POMC levels in SG, whereas the expression of terminal deletion-mutants provoked retention of the hormone in the Golgi area. Thus, CgA, but not its truncated forms, promoted POMC sorting to the regulated secretory pathway. Our results demonstrate that CgA, through its conserved terminal domains, directs the formation of SG and the sorting and release of hormones

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes. Les granules de sécrétion (GS) contenant ces hormones sont formés au niveau du réseau trans-golgien puis migrent jusqu'à la périphérie de la cellule. Ces hormones sont libérées dans le milieu extérieur par exocytose en cas de stimulation de la cellule. Grâce à l'observation des GS situés dans la région juxta-membranaire par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente, les mouvements de ces organites ont été étudiés à l'échelle du granule unique. Une méthode d'analyse permettant la mise en évidence de comportements transitoires au sein des trajectoires tridimensionnelles des GS a été mise au point. Grâce à son application à l'étude des effets de drogues du cytosquelette et à des observations en double marquage, nous avons pu associer chaque type de mouvements décrit par les GS à un environnement particulier (GS lié à la membrane plasmique, au cytosquelette d'actine ou de microtubules). Nous avons de plus étudié le rôle du complexe protéique Rab27A/MyRIP/Myosine Va lors de la capture des GS en périphérie de la cellule et leur accrochage aux filaments d'actine.

La plupart des cellules du système immunitaire sont des cellules sécrétrices capables de libérer des molécules immuno-modulatrices en réponse à des stimuli variés. Cette sécrétion régulée qui permet l’orchestration de la réponse immunitaire et inflammatoire est assurée grâce aux organites apparentés aux lysosomes (LRO) qui vont contenir les molécules nécessaires à la fonctionnalité des cellules immunes. On retrouve par exemple les granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques qui permettent à ces cellules d’effectuer leurs fonctions lytiques ou encore les granules de sécrétion des mastocytes qui contiennent les médiateurs de l’inflammation. Le transport et l’exocytose des LRO impliquent une machinerie commune et conservée. C’est notamment le cas de la petite GTPase Rab27 qui joue un rôle central dans le transport et la sécrétion de ces LRO. De précédentes études réalisées au sein de notre laboratoire ont pu mettre en évidence l’implication du complexe moléculaire Rab27a/Slp3/kinésine-1 dans le transport terminal des granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques chez l’homme. De plus, un modèle murin dont la chaîne lourde de la kinésine-1 est spécifiquement invalidée dans les cellules immunitaires a pu être généré. L’objectif de ma thèse a été dans un premier temps de caractériser le phénotype de ce modèle murin déficient pour la kinésine-1 puis d’analyser plus précisément l’impact de l’absence de la kinésine-1 sur la fonctionnalité des lymphocytes T cytotoxiques et mastocytes murins. Dans un premier temps nous avons pu montrer que les souris déficientes pour la kinésine-1 ont un phénotype comparable à celui des souris contrôles à l’état basal. Nous avons ensuite montré que l’absence de la kinésine-1 au sein des lymphocytes T cytotoxiques murins n’induit pas de défauts d’activation et de sécrétion des granules lytiques in vitro. Cependant les comportements des granules lytiques à la synapse immunologique semblent anormaux. Néanmoins après un test d’infection au LCMV, qui ne révèle aucunes différences entre les souris contrôles et déficientes en kinésine-1, nous en venons à la conclusion que des mécanismes compensateurs pourraient compenser l’absence de la kinésine-1 dans les lymphocytes T cytotoxiques chez la souris. Pour finir des études fonctionnelles réalisées au niveau des mastocytes murins nous ont permis de mettre en évidence l’implication de la kinésine-1 dans le mécanisme de transport des granules de sécrétion. En effet, l’absence de kinésine-1 conduit à des défauts de dégranulation des mastocytes in vitro mais aussi in vivo (souris moins sensibles aux chocs anaphylactiques). En revanche l’absence de kinésine-1 n’affecte pas les capacités d’activation et de sécrétion des cytokines des mastocytes. Enfin, nous avons pu caractériser le complexe moléculaire Rab27b/Slp3/kinésine-1 impliqué dans le transport des granules mastocytaires et avons pu constater que la formation de ce complexe était dépendante de la voie d’activation liée à la PI3K (Phospatidylinositol 3-kinase). Ce travail permet d’apporter de nouveaux éléments quant aux mécanismes gouvernant la sécrétion des granules mastocytaires et ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des hypersensibilités de type 1 (dépendantes des IgE)<br>Most of immune cells are secretory cells capable of releasing immunomodulatory molecules in response to various stimuli. This regulated secretion, which allows the orchestration of the immune and inflammatory responses, is ensured by the lysosome-related organelles (LRO) which will contain the molecules necessary for the functionality of the immune cells. For example we found the lytic granules of cytotoxic T lymphocytes, which allow their lytic functions or the secretory granules of mast cells which contain the inflammatory mediators. The transport and exocytosis of LRO involves a common and conserved machinery. This is particularly the case of the small GTPase Rab27 which plays a central role in the transport and secretion of these LRO. Previous studies carried out in our laboratory have highlighted the involvement of the molecular complex Rab27a / Slp3 / kinesin-1 in the terminal transport of lytic granules of cytotoxic T lymphocytes in humans. In addition, a murine model in which the heavy chain of kinesin-1 is specifically invalidated in immune cells has been generated. The objective of my thesis was first to characterize the phenotype of this murine model deficient for kinesin-1, then to analyze more precisely the impact of kinesin-1 absence on the cytotoxic T lymphocyte and mast cell functionality. In a first step, we have been able to demonstrate that mice deficient for kinesin-1 have a phenotype comparable to the control mice in a basal state. We have then shown that the absence of kinesin-1 in murine cytotoxic T lymphocytes does not induce defects in activation and in lytic granules’ secretion in vitro. However, the behavior of the lytic granules at the immunological synapse seems abnormal. Nevertheless, after an infection essay with LCMV, which revealed no differences between control and kinesine-1-deficient mice, we conclude that compensatory mechanisms may complement the absence of kinesin-1 in mice. Finally, functional studies carried out on murine mast cells have enabled us to demonstrate the involvement of kinesin-1 in the mechanism of granules’ transport. Indeed, the absence of kinesin-1 leads to degranulation defects in vitro and also in vivo (mice were less sensitive to anaphylactic shocks). On the other hand, the absence of kinesin-1 does not affect the activation and cytokines secretion capacities of mast cells. Finally, we were able to characterize the molecular complex Rab27b / Slp3 / kinesin-1 involved in mastocytic granules’ transport and found that this complex formation was dependent on the PI3K-related activation pathway (Phospatidylinositol 3-kinase). This work allows us to introduce new elements for the mechanisms governing the secretion of mast cell granules and thus opens new therapeutic perspectives for the treatment of type I hypersensitivity (IgE dependent)

Nous avons étudié le rôle de deux gènes stimulés par le neuropeptide PACAP au cours de la différenciation des cellules sympatho-surrénaliennes PC12. Le facteur de régulation transcriptionnelle inhibitor of dna binging 3 (Id3) est un gène de réponse précoce dont l’expression est stimulée par le PACAP suite à une élévation de l’AMPc. La surexpression de ce gène dans les cellules PC12 augmente la survie cellulaire, contribuant ainsi à l’effet anti-apoptotique du PACAP. L’étude de la sélénoprotéine T a montré que son ARNm est exprimé de façon ubiquiste et que la protéine est localisée dans le réticulum endoplasmique. La surexpression de la SelT augmente la concentration calcique intracellulaire et l’inhibition de son expression par ARN interférence abolit l’élévation de la concentration calcique induite par le PACAP dans ces cellules. Enfin, la SelT participe à l’effet stimulateur du PACAP sur la sécrétion dans des cellules neuroendocrines différenciées<br>The neuropeptide PACAP induces neuroendocrine differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells. Our aim was to determine the functions of two genes up-regulated by PACAP in PC12 cells. The helix-loop-helix factor Id3 is an early PACAP and cAMP responsive gene. Overexpression of Id3 in PC12 cells increased the number of living cells in basal condition and after exposure to oxidative stress, indicating that Id3 may contribute to the pro-survival effect of the neuropeptide during neuroendocrine cell differentiation. Selenoprotein T functional characterization revealed that SelT gene up-regulation by PACAP in PC12 cells depends on cAMP and calcium. This protein is expressed in the endoplasmic reticulum. We found that enhanced SelT expression provokes an increase in cytosolic calcium concentration. Conversely, SelT gene knockdown inhibited the PACAP-induced increase in intracellular calcium concentration and subsequent hormone secretion in differentiated neuroendocrine cells