Dissertations / Theses on the topic 'Secuenciación masiva en paralelo'

La presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de la variabilidad del DNA mitocondrial (DNAmt) por secuenciación masiva (NGS) y el impacto de dicha variabilidad en el glioma cerebral. Debido al papel que desempeña la mitocondria en la producción de energía celular, se ha postulado que alteraciones en el DNAmt pueden contribuir al proceso carcinogénico, sobre todo en aquellos tejidos que requieren más energía, como el cerebral. Así pues, el estudio del glioma deviene muy interesante en términos de análisis mitocondrial. Asimismo, los avances en la secuenciación del DNAmt mediante NGS permiten realizar estudios sobre la variabilidad mitocondrial de forma más precisa y exhaustiva, particularmente en aquellos centrados en la detección y la determinación de la heteroplasmia mitocondrial. Sin embargo, la detección de la heteroplasmia a bajas frecuencias no es un proceso sencillo debido a la gran dificultad para discriminar correctamente la presencia de falsos positivos y falsos negativos, sin que de momento exista un criterio único que determine cuál es la mejor metodología para establecer un límite de detección fiable. Considerando estos aspectos, en la presente tesis doctoral se han planteado 2 objetivos principales: 1) Evaluar la capacidad de detección y reproducibilidad de la Next Generation Sequencing (NGS), utilizando la metodología de Nextera XT® y la plataforma MiSeq (Illumina), en la detección fiable de la variabilidad del genoma mitocondrial tanto en homoplasmia como en heteroplasmia; y 2) Valorar la implicación del genoma mitocondrial en el desarrollo de gliomas cerebrales de diferentes grados de malignidad. Tanto la metodología como los resultados y discusión se han organizado en 4 capítulos. En el primer capítulo se han descrito todos los aspectos relacionados con el material y la metodología empleada en el presente trabajo. En el segundo capítulo se han presentado los resultados y la discusión en relación al análisis de la calidad de los datos generados a partir de la secuenciación de las muestras de DNAmt. En el tercer capítulo se han descrito los resultados y la discusión en relación a la determinación de la fiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en el análisis del DNAmt, a partir de la generación de librerías de NGS independientes. Además, se ha establecido una nueva estrategia para determinar los límites de detección de la heteroplasmia mitocondrial mediante NGS. Por último, en el cuarto capítulo se han presentado los resultados y la discusión basados en el análisis de la variabilidad mitocondrial de individuos afectos de glioma. El presente trabajo ha permitido ampliar los conocimientos respecto a la detección de la heteroplasmia mitocondrial mediante la tecnología de NGS y el papel del DNAmt en el glioma cerebral. A nivel de la detección de la heteroplasmia, se ha presentado una nueva estrategia para establecer sus límites de detección, intentando reducir errores en la interpretación de los resultados obtenidos. Respecto al estudio del glioma, este trabajo ha sido el primero en establecer una asociación de los haplogrupos mitocondriales J y T y el glioma cerebral y ha inferido en la probabilidad de que los tumores puedan progresar a grados de mayor malignidad según el haplogrupo. Asimismo, los resultados obtenidos respecto la baja cantidad tanto de mutaciones sobrerrepresentadas en el estudio como de mutaciones en posiciones estables que pueden tener cierto impacto a nivel patogénico, y la baja carga mutacional detectada en los individuos afectos de glioma, han sugerido una preferencia por parte del glioma de no acumular mutaciones en el DNAmt, con el fin de no generar una gran cantidad de ROS en el ambiente y poder progresar a estadios de mayor malignidad tumoral.<br>This PhD thesis was focused on the studying of the variability of mitochondrial DNA (DNAmt) by massive parallel sequencing (NGS) and the impact of such variability on the glioma. Due to the significant role of mitochondria in cellular energy production, it has been postulated that mtDNA alterations might contribute to the carcinogenesis process, particularly in those tissues that require more energy, such as the brain. Thus, the study of glioma becomes very interesting in terms of mitochondrial analysis. The advances on mtDNA sequencing with NGS allow studies based on mitochondrial variability to be carried out more precisely and thoroughly, particularly those focused on mitochondrial heteroplasmy detection and establishment. However, heteroplasmy detection at low frequencies is not a straightforward process due to the great difficulty in discriminating the presence of false positives and false negatives correctly, and so far, there is not specific criteria that determines the best methodology to establish a reliable detection limit. Considering these aspects, two main goals were proposed in this PhD thesis: 1) To evaluate the detection and reproducibility capacity of Next Generation Sequencing (NGS), using the Nextera XT® methodology and the MiSeq platform (Illumina), in detecting reliably mitochondrial genome variability in both homoplasmy and heteroplasmy; 2) To assess the involvement of mitochondrial genome in the development of gliomas with different malignancy degrees. Both the methodology and the results and discussion were organised in 4 chapters. In the first chapter, the material and the methodology used in this work were detailed. In the second chapter, the results and discussion regarding the analysis of the quality of the data generated from the sequencing of the mtDNA samples were reported. In the third chapter, the results and discussion of the reliability and reproducibility of the results obtained in mtDNA analysis by generating independent NGS libraries were reported. Moreover, a new strategy was established to define heteroplasmy detection limits using NGS. Finally, in the fourth chapter the results and discussion of the analysis of mitochondrial variability in individuals affected by glioma were described. This work has allowed us to expand the knowledge regarding mitochondrial heteroplasmy detection using NGS and the role of mtDNA in glioma. Concerning mitochondrial heteroplasmy detection, a new strategy was presented to establish its detection limits, in an attempt to reduce misinterpretations of results. Regarding the study of glioma, the present work was the first to establish an association between mitochondrial haplogroups J and T and glioma, and it inferred the likelihood of tumours to progress to higher levels of malignancy according to the haplogroup. Likewise, the low amount of both mutations overrepresented in the study and mutations in stable positions that might have some impact at the pathogenic level, and the low mutational load detected in individuals affected by glioma, suggested that glioma tends to not accumulate mtDNA mutations to avoid generating a large amount of ROS in the environment and to progress to stages of higher levels of malignancy.

The zebra mussel and the Asian clam are two invasive aquatic species worldwide. Both species are present in the Iberian Peninsula for several years. However, introduction history and colonization routes of these two invasive species in the Iberian Peninsula remain mainly unknown. We have developed new molecular markers for each species to be used in population genetics studies. Then, we characterized the genetic structure of the Iberian populations in order to infer their possible colonization routes. Our results show how the zebra mussel invasion into the Iberian Peninsula involves a single invasion episode with a separate colonization history than the rest of Europe. In Asian clam, our results revealed that at least two colonization episodes have occurred in the Iberian Peninsula. Finally, we have developed a genetic method based on environmental DNA for dreissenid larvae detection in waterbody samples, increasing the sensibility of the routinely zebra mussel larvae detection methods<br>El mejillón cebra y la almeja asiática son dos especies acuáticas invasoras, presentes en la Península Ibérica desde hace muchos años. Sin embargo, no se conocen de manera cierta ni la historia de su invasión ni sus rutas de colonización. Desarrollamos nuevos marcadores moleculares para usarlos en estudios de genética de poblaciones. Seguidamente, caracterizamos la estructura genética de las poblaciones ibéricas para inferir posibles rutas de invasión. Nuestros resultados muestran que la invasión del mejillón cebra en la Península Ibérica se basa en un único y reciente episodio de invasión, diferente al resto de Europa. Respecto a la almeja asiática, nuestros resultados mostraron que ha habido al menos dos episodios de colonización en la Península Ibérica. Finalmente, desarrollamos un método genético basado en DNA ambiental para detectar larvas de especies de dreissenidos en masas de agua, incrementando la sensibilidad de los métodos rudimentarios de detección de larvas de mejillón cebra

INTRODUCCIÓN. Las enfermedades cardiovasculares constituyen la principal causa de muerte en el mundo. La mayoría de las miocardiopatías y canalopatías son de origen genético y se caracterizan por el riesgo de muerte súbita y morbilidad crónica. La detección de mutaciones en los pacientes, permite establecer el diagnóstico molecular y en algunos casos definir su pronóstico o medidas terapéuticas o preventivas, así como asesorar a las familias del afecto. Sin embargo, el gran número de genes implicados, hace que sea difícil su análisis utilizando técnicas convencionales de secuenciación. OBJETIVOS. Con este trabajo se pretende caracterizar, desde el punto de vista molecular, a un grupo de pacientes afectos de patología cardiovascular de origen heterogéneo, mediante la utilización de paneles de resecuenciación dirigida de 72 genes. Los objetivos propuestos fueron: 1. Diseñar y validar un panel de resecuenciación dirigida a enfermedades cardiovasculares genéticas heterogéneas con riesgo de muerte súbita. 2. Desarrollar una estrategia de estudio de alta sensibilidad y especificidad para aplicar al diagnóstico de enfermedades cardiogenéticas con riesgo de muerte súbita mediante secuenciación masiva. 3. Trasladar a la práctica clínica las nuevas técnicas de secuenciación masiva. Para ello se va a utilizar un modelo de enfermedades con gran heterogeneidad genética y un panel de genes asociado al desarrollo de diferentes patologías cardiovasculares para confirmar su diagnóstico. PACIENTES Y MÉTODOS. El diseño del panel para enfermedades cardiovasculares con riesgo de muerte súbita fue de 72 genes y se realizó mediante la búsqueda de información clínica y genética en las diferentes fuentes de información biomédica. Este diseño incluyó genes asociados a miocardiopatías, trastornos del ritmo cardíaco y aneurismas de aorta de tipo genético, monogénico y heterogéneo. El diseño bioinformático se realizó en la Unidad de Bioinformática de Sistemas Genómicos e incluyó 1.4 Mb de exones de los que 100 nucleótidos/gen correspondían a las zonas de splicing. Las regiones no traducidas 5’ y 3’ de los 72 genes se diseñaron con 1000 y 200 nucleótidos, respectivamente, mediante la herramienta eArray, proporcionado por Agilent. La validación bioinformática se llevó a cabo con la línea celular HapMap12144 y la validación clínica se realizó con 10 muestras de pacientes previamente diagnosticados de enfermedades cardiovasculares con riesgo de muerte súbita. El desarrollo de un pipeline de diagnóstico incluyó la aplicación de un sistema de filtrados para categorizar a las diferentes variantes encontradas, consulta de bases de datos, estudios de predicción in silico, clasificación de las variantes, validación por secuenciación Sanger de todas las variantes potencialmente patogénicas y de las variantes de significado desconocido y elaboración del informe clínico biológico. Este modelo de trabajo se aplicó sobre un grupo de 163 pacientes afectados de diferentes patologías cardiovasculares de tipo monogénico, analizados durante dos años en la Unidad de Genética Médica de Sistemas Genómicos. RESULTADOS. Los resultados obtenidos en 163 pacientes con diferentes enfermedades cardiovasculares y riesgo de muerte súbita, mediante el análisis de 4795 genes, fueron: detección de 45 mutaciones, 26 de ellas previamente descritas, 14 nuevas mutaciones y 178 variantes de significado desconocido que fueron evaluadas a través de predicciones in silico y validadas por secuenciación Sanger. En resumen, un 27.6% de los pacientes afectados de diferentes patologías susceptibles de producir muerte súbita, pudieron ser genéticamente diagnosticados y establecer el diagnóstico precoz y medidas preventivas en los familiares en riesgo. La sensibilidad bioinformática del panel de 72 genes fue de 96.68% para SNPs y 70.85% para Indels en la plataforma SOLID v.4, mientras que la validación diagnóstica fue del 100% para SNPs y del 90% para Indels. CONCLUSIÓN. La resecuenciación dirigida del panel de 72 genes asociado a patología cardiovascular de origen genético heterogéneo permite un análisis rápido, eficiente, de alto rendimiento y coste efectivo para la detección de mutaciones en todos los genes descritos, implicados en una patología, mejorando los registros de mutaciones. Estos resultados son importantes para establecer el diagnóstico molecular del paciente, explicar la variabilidad fenotípica de la enfermedad cardíaca y asesorar a la familia del afecto sobre la necesidad de políticas preventivas si son portadores de mutaciones.

[ES] El síndrome de Usher (USH) es un trastorno raro autosómico recesivo definido principalmente por sordera neurosensorial (SNHL), y una distrofia retiniana conocida como retinosis pigmentaria (RP). La patología muestra heterogeneidad genética, puesto que se conocen al menos 10 genes responsables. No obstante, las mutaciones en USH2A son la causa más frecuente de la enfermedad, en gran medida por la recurrencia de la variante patogénica c.2299delG. En esta tesis se ha desarrollado un ensayo de edición génica para revertir dicha anomalía genética por medio del sistema CRISPR/Cas9. Se diseñaron y probaron varios complejos CRISPR específicos de locus, y el más eficiente fue usado para la corrección de la mutación c.2299delG en células derivadas de pacientes. La tasa de corrección de la mutación obtenida fue del 2.5%. Otro objetivo de esta tesis ha sido la caracterización genética de pacientes USH aún sin diagnóstico molecular. Una primera fase implicó la secuenciación masiva dirigida de las regiones codificantes de todos los genes asociados a la enfermedad. Este estudio, cuya cohorte incluyó 58 pacientes no escrutados previamente, permitió la identificación de 42 nuevas mutaciones presuntamente patológicas, y una tasa general de detección de alelos responsables de la enfermedad de prácticamente el 83%. Sorprendentemente, uno de los sujetos presentaba mutaciones en CEP250, uno de los últimos genes correlacionados con la enfermedad. Una exhaustiva revisión clínica reveló que la degeneración retiniana se trataba en realidad de una distrofia de conos y bastones en lugar de RP clásica, lo cual permitió consolidación del gen CEP250 como responsable de un fenotipo similar al USH. El resto de casos sin resolver induce a sospechar de la existencia de otros genes vinculados con USH. Así pues, se analizó el exoma íntegro de dichos casos negativos del panel por medio de secuenciación de exoma completo, lo cual proporcionó resultados relevantes en seis de las muestras estudiadas. Uno de tales sujetos resultó ser un claro caso de fenocopia de USH, al albergar mutaciones patogénicas en dos genes independientes, TECTA y REEP6, siendo el primero responsable de la SNHL y el segundo de la RP. De forma parecida, en otro paciente se detectaron variantes patológicas para RP en el gen EYS, pero no se identificó paralelamente ningún cambio genético que explicara la SNHL. Tres individuos adicionales resultaron haber sido erróneamente diagnosticados como USH, dada la conclusiva inexistencia o ambigüedad de la sordera. Uno de ellos fue definido como homocigoto de una mutación en CNGB1, ya reconocido como responsable de RP. En el segundo de dichos sujetos se identificó una mutación en homocigosis en el gen GRN, cuyos defectos en estado heterocigoto están asociados a demencia frontotemporal y más raramente combinada con RP si ambos alelos se encuentran alterados. Por otro lado, el tercer paciente fue resuelto como heterocigoto compuesto de variantes en WDR19, un gen asociado en mayor medida a una distrofia retiniana acompañada de trastornos renales y, más raramente, a la forma aislada del síntoma. En el último de los seis casos resaltados de este objetivo se detectó una mutación homocigota sin sentido en el gen ASIC5, cuyo papel en el organismo todavía se desconoce. Sin embargo, se han correlacionado funciones visuales y auditivas para miembros de la misma familia proteica. En conjunto, los hallazgos obtenidos en este trabajo avalan la importancia del uso de las más novedosas tecnologías en la búsqueda de soluciones para enfermedades raras, las cuales presentan por ahora un pronóstico terapéutico bastante desamparado. Asimismo, otras consecuencias positivas en cuanto a la caracterización genética de los pacientes son la corroboración (o rectificación) del diagnóstico inicial, así como la contribución a la estimación demográfica y correlaciones de genotipo-fenotipo, que en definit<br>[CAT] La síndrome d'Usher (USH) és una malaltia rara autosòmic recessiu definit principalment per sordera neurosensorial (SNHL) i una distròfia retiniana coneguda com a retinosi pigmentària (RP). La patologia mostra heterogeneïtat genètica, ja que es coneixen almenys 10 gens responsables. No obstant això, les mutacions en USH2A són la causa més freqüent de la malaltia, a causa de la recurrència de la variant patogènica c.2299delG. En aquesta tesi s'ha desenvolupat un assaig d'edició gènica per a revertir la dita anomalia genètica per mitjà del sistema CRISPR/Cas9. Es van dissenyar i van probar diversos complexos CRISPR específics de locus, i el més eficient va ser usat per a la correcció de la mutació en cèl·lules derivades de pacients. La taxa de correcció de la mutació obtinguda va ser del 2.5%. Un altre objectiu d'aquesta tesi ha sigut la caracterització genètica de pacients USH encara sense diagnòstic molecular. Una primera fase va implicar la seqüenciació massiva dirigida de les regions codificants de tots els gens associats a la malaltia. Aquest estudi, la cohort de la qual va incloure 58 pacients no escrutats prèviament, va permetre la identificació de 42 noves mutacions presumptament patològiques, i una taxa general de detecció d'al·lels responsables de la malaltia de pràcticament el 83%. Sorprenentment, un dels subjectes presentava mutacions en CEP250, un dels últims gens correlacionats amb la malaltia. Una exhaustiva revisió clínica va revelar que la degeneració retiniana es tractava en realitat d'una distròfia de cons i bastons en lloc de RP clàssica. Aquestes troballes han permés la consolidació del gen CEP250 com a responsable d'un fenotip similar al USH. La resta de casos sense resoldre induïx a sospitar de l'existència d'altres gens vinculats amb USH. Així, doncs, es va analitzar l'exoma íntegre dels casos negatius del panell a través de seqüenciació d'exoma complet, cosa que va proporcionar resultats rellevants en sis de les mostres estudiades. Un de tals subjectes va resultar ser un clar cas de fenocopia d'USH, a l'albergar mutacions patogèniques en dos gens independents, TECTA i REEP6, sent el primer responsable de la SNHL i el segon de la RP. De forma semblant, en un altre pacient es van detectar variants patològiques per a RP al gen EYS, però no es va identificar paral·lelament cap canvi genètic que explicara la SNHL. Tres individus addicionals van resultar haver sigut erròniament diagnosticats com USH, donada la final inexistència o ambigüitat de la sordera. Un d'ells va ser definit com a homozigot d'una mutació en CNGB1, ja reconegut com a responsable de RP. En el segon d'aquestes subjectes es va identificar una mutació en homozigosi en el gen GRN, els defectes del qual estan associats a demència frontotemporal en estat heterozigot, i més rarament en combinació amb RP si ambdós al·lels es troben alterats. D'altra banda, el tercer pacient va ser resolt com a heterozigot compost de variants en WDR19, un gen associat en major grau a una distròfia retiniana acompanyada de trastorns renals i, més rarament, a la forma aïllada del símptoma. En l'últim dels sis casos ressaltats d'aquest objectiu es va detectar una mutació homozigota sense sentit en el gen ASIC5, el paper en l'organisme del qual encara es desconeix. Amb tot, s'han correlacionat funcions visuals i auditives per a membres de la mateixa família proteica. En conjunt, les troballes obtingudes en aquest treball avalen la importància de l'ús de les més noves tecnologies en la recerca de solucions per a malalties rares, les quals presenten per ara un pronòstic terapèutic prou desemparat. Així mateix, altres conseqüències positives quant a la caracterització genètica dels pacients són la corroboració (o rectificació) del diagnòstic inicial, així com la contribució a l'estimació demogràfica i correlacions de genotip-fenotip, que en definitiva ajuden en la compressió d'US<br>[EN] Usher syndrome (USH) is a rare autosomal recessive disorder defined essentially by sensorineural hearing loss (SNHL) and a retinal dystrophy known as retinitis pigmentosa (RP). The condition shows a genetic heterogeneity, since there are at least 10 genes known to be causative of the syndrome. However, mutations in USH2A are the most frequent cause of the disease, due in a large measure to the recurrence of the c.2299delG pathogenic variant. A gene editing assay to reverse this specific genetic anomaly was developed in this thesis by means of the groundbreaking CRISPR/Cas9 system. Several locus-specific CRISPR complexes were designed and tested, and the most efficient was used to proceed with the c.2299delG mutation correction on patient-derived cells. The trial resulted in a mutation correction rate of 2.5%. Another goal of this thesis was the genetic characterization of molecularly undiagnosed USH patients. Given the genetic diversity of the disease, the procedure required the implementation of high-throughput sequencing, a technology that enables in bulk sequencing of any number of selected loci (or the indiscriminate totality) of the genome. The first phase implied the targeted sequencing of the coding-relevant regions of all known causative or disease-associated genes at the moment. The study, comprising a cohort of 58 previously unscreened patients, enabled the identification of 42 novel putative pathogenic mutations, and an etiologic-allele detection ratio shy of 83%. Remarkably, one of the subjects harbored nonsense mutations in CEP250, which is one of the latest USH-associated genes. However, an exhaustive review of the clinical features unmasked the retinal degeneration as a cone-rod dystrophy rather than RP, which reinforced the linkage of the gene to an USH-like phenotype. The remaining portion of unresolved cases lead to suspicion of the existence of other genes accountable for USH. Hence, the complete exome of such panel-negative cases was screened through whole exome sequencing. This venture provided relevant findings in six of the surveyed samples. One subject was plainly exposed as an USH phenocopy by harboring pathogenic splice-site mutations in two independent genes, TECTA and REEP6, the former responsible for the SNHL and the latter for the RP. Similarly, RP-causative variants in EYS were detected in another patient, yet no pathogenic changes explaining the HL were discovered. Three additional individuals were ultimately unveiled as USH misdiagnosed cases, being the HL actually absent or ambiguous. One of the patients in this set was homozygous for a mutation in CNGB1, already known to be accountable for RP. The other two cases showed a more peculiar outcome being compound heterozygous for putatively pathogenic variants in genes generally associated to other disorders. One presented a homozygous mutation in GRN, a gene associated to frontotemporal dementia under heterozygous condition and less commonly to combined RP for homozygous alterations. The third subject was found to be a carrier of mutations in WDR19, a gene best associated with retinal disorders accompanied by renal signs and rarely with the isolated visual symptom. The last case presented a homozygous nonsense variant in the ASIC5 gene, whose role has yet to be learned. However, some correlations to visual and hearing functions have been reported for members of the same protein family. Altogether, the results obtained from this work attest to the importance of applying the most up-to-date technologies in the search of solutions for rare diseases that realistically pose a despairing therapeutic prognosis. In addition, the positive consequences of the genetic characterization of the patients are the corroboration (or else correction) of the initial diagnosis, and the contribution to the appraisal of demographic and genotype-phenotype correlations, which ultimately aid in the understanding USH and other related diseases.<br>This work was financially supported by the Institute of Health Carlos III and FEDER funds (ISCIII; grants PI13/00638, PI16/00425, PI16/00539, and PIE13/00046), Fundación ONCE (grant 2015/0398), XVIII Fundaluce-FARPE, and “Telemaratón: Todos Somos Raros, Todos Somos Únicos” (grant IP58). C.F.-G. is a recipient of a fellowship (grant IFI14/00021) from the ISCIII. R.P.V.-M. is a Miguel Servet researcher (grant CP11/00090 funded by ISCIII, Madrid, Spain). The funds from the ISCIII are partially supported by the European Regional Development Fund. R.-P.V.M. is also a Marie Curie fellow (grant CIG322034 from the European Commission).<br>Fuster García, C. (2020). Therapeutic approaches and development of genomic diagnostic tools for Usher syndrome [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137034<br>TESIS

Encontramos una gran cantidad de información genómica en bases de datos para numerosos organismos pero existe un sesgo hacia ciertos grupos taxonómicos por el interés económico, social o sanitario. Los avances y el abaratamiento de los costes de las tecnologías de secuenciación masiva han permitido aplicar estas técnicas en organismos no modelo pero aun así no resulta rutinario el poder generar recursos genómicos de buena calidad. Las arañas, grupo de estudio de esta tesis doctoral, son organismos no modelo infrarrepresentados en las bases de datos. La disponibilidad de un nuevo genoma favorecería el conocimiento de importantes aspectos como la presencia del veneno, seda o la adaptación a los procesos de terrestralización y la evolución del sistema quimiosensorial. Los objetivos principales de esta tesis doctoral son el desarrollar herramientas bioinformáticas y generar recursos genómicos en organismos no modelo, especialmente en arácnidos. Hemos implementado la herramienta DOMINO, para la búsqueda e identificación de marcadores moleculares en organismos no modelo mediante datos de secuenciación masiva. Permite generar marcadores a diferentes rangos taxonómicos que pueden ser empleados de forma directa, amplificados por PCR o empleados en el desarrollo de regiones para métodos de captura de secuencia. Hemos validado el software mediante simulaciones computacionales y datos empíricos para ajustar, configurar los parámetros y maximizar su sensibilidad y precisión. Además, hemos desarrollado una interfaz gráfica que permite el acceso a usuarios menos familiarizados con los entornos de programación. También hemos generado un ensamblaje genómico de un representante del género de arañas Dysdera, combinando diferentes librerías de secuenciación. Mediante diferentes estadísticas descriptivas determinamos la calidad y continuidad del ensamblaje y lo anotamos estructural y funcionalmente mediante predicciones ab initio y evidencias de bases de datos y de ARN. Obtuvimos un ensamblaje genómico con N50 de 38 kb, que no podía ser mejorado por la complejidad del genoma que incluía un alto número de repeticiones, aunque la calidad del genoma en cuanto a la integridad de los genes era bastante buena. Por tanto, hemos generado un recurso genómico muy útil no sólo para el análisis de características específicas del género pero también de otros arácnidos o artrópodos.<br>There is a vast amount of information indexed in genomic databases from multiple species of organisms but there is a bias against some taxonomic groups for their relevance at social, sanitary and economical level. The progress and the reduction of sequencing technologies have allowed the implementation of these techniques in non-model organisms but still, it is neither straightforward nor cheap to obtain high quality genomic resources. Spiders, main group of interest of this thesis, are non-model organisms underrepresented in genomic databases. The availability of a new genome would shed light into relevant biological traits such as the presence of venom, silk or the adaptation to terrestrial ecosystems and the chemosensory system. The main objectives of this thesis are to develop bioinformatics methods and to generate genomic resources for non-model organisms, specifically, spiders. We have developed the tool DOMINO for the development of molecular markers in non-model organisms from next generation sequencing data. This tool allows identifying markers at different taxonomic ranges that could be employed directly, amplified using PCR in other related samples or for the generation of sequence capture strategies. We have validated the software using computer simulations and empirical data to adjust, configure and maximize its precision and sensitivity. Also, we have generated a graphical user interface to improve the usability of the software among those users with limited expertise in programming languages. We have also developed a genomic assembly of a representative spider of the genus Dysdera by combining multiple sequencing technologies. Using several descriptive statistics we determined the quality and completeness of the assembly and conducted the structural and functional annotation by ab initio and evidence-based predictions. We obtained a genome with a N50 of 38 kb, that it could not be improved because the complexity of the genome that include a high proportion of repetitive regions, nevertheless the quality of genome in terms of gene completeness was fairly good. Globally we have generated a very useful genomic resource not only for conducting studies of specific biological or evolutionary characteristics in this genus but also for other arachnids or arthropods.

Les dishormonogènesis tiroïdals (DT) representen aproximadament el 20% dels casos d’hipotiroïdisme congènit (HC) primari. En aquests pacients s’acostuma a identificar una glàndula tiroide in situ (GIS) normal o augmentada de mida. Les DT es deuen a defectes genètics en la biosíntesi d’hormones tiroïdals que habitualment es transmeten de forma autosòmica recessiva. El coneixement cada vegada més precís dels processos i activitats enzimàtiques que intervenen en la síntesi de les hormones tiroïdals ha permès identificar diferents factors de transcripció i proteïnes específicament implicats en la regulació de l’hormonogènesi tiroïdal. L’expressió clínica de les DT és molt àmplia, amb formes clíniques que van des del hipotiroïdisme subclínic fins al desenvolupament de goll. Molts dels pacients diagnosticats d’HC en el cribratge neonatal presenten un perfil suggestiu de DT, en base a criteris clínics, hormonals i gammagràfics, però pocs estudis han analitzat sistemàticament el defecte molecular en aquests pacients. En aquest treball s’han inclòs 70 pacients amb sospita de DT procedents del programa de cribratge neonatal de l’HC i se’ls ha realitzat, mitjançant tècniques de seqüenciació massiva, un estudi molecular de gens relacionats amb DT. S’ha detectat que un 77.1% (n = 54) d’ells presentava defectes moleculars en algun d’aquests gens. Els gens més freqüentment afectats en els pacients amb un diagnòstic molecular que justifiqués el seu fenotip van ser: TG (n = 18), seguit de TPO (n = 10) i DUOX2 (n = 9). També es van trobar variants genètiques en PAX8 i TSHR (n = 5 i n = 3, respectivament). En total, es van detectar 72 variants genètiques diferents: 28 en TG, 16 a TPO, 15 a DUOX2, 5 a PAX8, 6 a TSHR, 1 a DUOXA2 i 1 a IYD. D’aquestes 72 variants, un total de 31 són noves (43%). Segons la classificació de l’American College of Medical Genetics, 23 d’aquestes variants són patogèniques (32%), 10 probablement patogèniques (13.9%), 35 variants de significat incert (48.6%) i 4 probablement benignes (5.5%). Es va realitzar un estudi per correlacionar el genotip i el fenotip d’aquests pacients. Es va observar que els pacients portadors de variants genètiques presentaven un hipotiroïdisme més sever que els pacients sense variants genètiques. Així mateix, els pacients portadors de variants genètiques van presentar, majoritàriament (91.3%) un HC de caràcter permanent en la revaluació diagnòstica. Per contra, la majoria dels pacients sense variants (83.4%) van presentar un HC de caràcter transitori. Es va realitzar un estudi per relacionar el fenotip clínic amb el gen afecte i la mutació trobada. Així mateix, es va realitzar un estudi de les variables que podien ser útils per predir el caràcter permanent o transitori de l’hipotiroïdisme i es va concloure que l’únic paràmetre que permet diferenciar entre els dos fenotips és la dosi de levotiroxina que necessiten els pacients durant la seva evolució. Els punts de tall òptims de la dosi de levotiroxina, basats en el màxim índex de Youden, van ser els següents: 4 mcg / kg / dia a l’any de vida; 3.1 mcg / kg / dia als 2 anys de vida i 2.4 mcg / kg / dia als 4 anys de vida. Del nostre estudi es pot concloure que la DT és la principal causa de l’HC amb GIS. L’estudi genètic en aquests pacients permet predir l’evolució clínica d’aquests pacients i prendre decisions sobre la necessitat o el moment de realitzar la revaluació diagnòstica. A més, s’ha constatat, mitjançant l’estudi de cosegregació familiar, que les variants són heretades dels progenitors i no de novo, de manera que l’estudi genètic en els progenitors d’aquests pacients és d’utilitat per a realitzar un diagnòstic i tractament precoç en la descendència futura.<br>Las dishormonogénesis tiroideas (DT) representan aproximadamente el 20% de los casos de hipotiroidismo congénito (HC) primario. En estos pacientes se suele identificar una glándula tiroidea in situ (GIS) normal o aumentada de tamaño. Las DT se deben a defectos genéticos en la biosíntesis de hormonas tiroideas que habitualmente se transmiten de forma autosómica recesiva. El conocimiento cada vez más preciso de los procesos y actividades enzimáticas que intervienen en la síntesis de las hormonas tiroideas ha permitido identificar distintos factores de transcripción y proteínas específicamente implicados en la regulación de la hormonogénesis tiroidea. La expresión clínica de las DT es muy amplia, con formas clínicas que van desde el hipotiroidismo subclínico hasta el desarrollo de bocio. Muchos de los pacientes diagnosticados de HC en el cribado neonatal presentan un perfil sugestivo de DT, en base a criterios clínicos, hormonales y gammagráficos, pero pocos estudios han analizado sistemáticamente el defecto molecular en estos pacientes. En este trabajo se han incluido 70 pacientes con sospecha de DT procedentes del programa de cribado neonatal del HC y se les ha realizado, mediante técnicas de secuenciación masiva, un estudio molecular de genes relacionados con DT. Se ha detectado que un 77.1% (n=54) de ellos presentaba defectos moleculares en alguno de estos genes. Los genes más frecuentemente afectados en los pacientes con un diagnóstico molecular que justificara su fenotipo fueron: TG (n=18), seguido de TPO (n=10) y DUOX2 (n=9). También se encontraron variantes genéticas en PAX8 y TSHR (n=5 y n=3, respectivamente). En total, se detectaron 72 variantes genéticas distintas: 28 en TG, 16 en TPO, 15 en DUOX2, 5 en PAX8, 6 en TSHR, 1 en DUOXA2 y 1 en IYD. De estas 72 variantes, un total de 31 son nuevas (43%). Según la clasificación de la American College of Medical Genetics, 23 de estas variantes son patogénicas (32%), 10 probablemente patogénicas (13.9%), 35 variantes de significado incierto (48.6%) y 4 probablemente benignas (5.5%). Se realizó un estudio para correlacionar el genotipo y el fenotipo de estos pacientes. Se observó que los pacientes portadores de variantes genéticas presentaban un hipotiroidismo más severo que los pacientes sin variantes genéticas. Asimismo, los pacientes portadores de variantes genéticas presentaron, en su mayoría (91.3%) un HC de carácter permanente en la reevaluación diagnóstica. Por el contrario, la mayoría de los pacientes sin variantes (83.4%) presentaron un HC de carácter transitorio. También se realizó un estudio para relacionar el fenotipo clínico con el gen afecto y la mutación encontrada. Asimismo, se realizó un estudio de las variables que podían ser útiles para predecir el carácter permanente o transitorio del hipotiroidismo y se concluyó que el único parámetro que permite diferenciar entre ambos fenotipos es la dosis de levotiroxina que precisan los pacientes durante su evolución. Los puntos de corte óptimos de la dosis de levotiroxina, basados en el máximo índice de Youden, fueron los siguientes: 4 mcg/kg/día al año de vida; 3.1 mcg/kg/día a los 2 años de vida y 2.4 mcg/kg/día a los 4 años de vida. De nuestro estudio se puede concluir que la DT es la principal causa del HC con GIS. El estudio genético en estos pacientes permite predecir la evolución clínica de estos pacientes y tomar decisiones sobre la necesidad o el momento de realizar la reevaluación diagnóstica. Además, se ha constatado, mediante el estudio de cosegregación familiar, que las variantes son heredadas de los progenitores y no de novo, por lo que el estudio genético en los progenitores de estos pacientes es de utilidad para realizar un diagnóstico y tratamiento precoz en la descendencia futura.<br>Thyroid dyshormonogenesis (TD) represent approximately 20% of cases of primary congenital hypothyroidism (CH). In these patients, a normal or enlarged thyroid gland in situ (GIS) is usually identified. TDs are due to genetic defects in the biosynthesis of thyroid hormones that are usually transmitted in an autosomal recessive manner. The increasingly knowledge of the enzymatic processes and activities involved in the synthesis of thyroid hormones has allowed the identification of different transcription factors and proteins specifically involved in the regulation of thyroid hormonegenesis. The clinical expression of TD is very broad, with clinical forms ranging from subclinical hypothyroidism to the development of goiter. Many of the patients diagnosed with CH in neonatal screening have a suggestive TD profile, based on clinical, hormonal and scintigraphic criteria, but few studies have systematically analyzed the molecular defect in these patients. In this study, 70 patients with suspected TD, diagnosed in the neonatal HC screening program, have been included and a molecular study of genes related to TD has been carried out using massive sequencing techniques. We detected that 77.1% (n = 54) of them had molecular defects in any of these genes. The most frequently affected genes in patients with a molecular diagnosis that justified their phenotype were: TG (n = 18), followed by TPO (n = 10) and DUOX2 (n = 9). Genetic variants were also found in PAX8 and TSHR (n = 5 and n = 3, respectively). In total, 72 different genetic variants were detected: 28 in TG, 16 in TPO, 15 in DUOX2, 5 in PAX8, 6 in TSHR, 1 in DUOXA2 and 1 in IYD. Of these 72 variants, a total of 31 are new (43%). According to the American College of Medical Genetics classification, 23 of these variants are pathogenic (32%), 10 probably pathogenic (13.9%), 35 variants of uncertain significance (48.6%), and 4 probably benign (5.5%). A study was conducted in order to know the relationship between the genotype and phenotype of these patients. Patients carrying genetic variants were observed to have more severe hypothyroidism than patients without genetic variants. Likewise, patients with genetic variants presented, in their majority (91.3%) a permanent CH in the diagnostic re-evaluation. On the contrary, the majority of the patients without genetic variants (83.4%) presented a transient HC. A study was also carried out to relate the clinical phenotype with the affected gene and the detected mutation. Likewise, we studied the variables that could be useful to predict the permanent or transitory nature of hypothyroidism and we concluded that the only parameter that allows differentiating between both phenotypes is the dose of levothyroxine that patients require during their evolution. The optimal cut-off points for the levothyroxine dose, based on the maximum Youden index, were as follows: 4 mcg / kg / day at 1 year of age; 3.1 mcg / kg / day at 2 years of age and 2.4 mcg / kg / day at 4 years of age. From our study, we can conclude that TD is the main cause of CH with GIS. The genetic study in these patients allows predicting the clinical evolution of these patients and making decisions about the need or the time to carry out the diagnostic re-evaluation. In addition, we verified, through the family co-segregation study, that the variants are inherited from the parents and not de novo, so that the genetic study in the parents of these patients is useful for making an early diagnosis and treatment in the future offspring.