Dissertations / Theses on the topic 'Settore BIO/04 - Fisiologia Vegetale'

One of the challenges that living organisms face is to respond promptly to genotoxic stress to avoid DNA damage. To this purpose, they developed complex DNA damage response (DDR) mechanisms. These mechanisms are highly conserved among organisms, including plants, and need to be finely regulated to take place properly. In this scenario, microRNAs are emerging as active players, thus attracting the attention of the research community. The involvement of miRNAs in DDR has been investigated prominently in human cells wherease studies on plants are still scarce. In addition, recently, miRNAs started to be envisioned as trans-kingdom molecules able to exert regulatory functions in evolutionary distant organisms. Particularly, attention is drawn to plant miRNAs ingested with the diet; evidence is accumulating on their ability to regulate genes in organisms other than the one in which they were synthesized, including humans and pathogens.In the present PhD thesis, different bioinformatics approaches have been developed aiming at identifying plant miRNAs along with their endogenous and cross-kingdom targets to pinpoint conserved pathways between evolutionary distant species. Alonside model organisms, the developed pipeline may find application on any species of interest to address species-specific cross-kingdom interactions or to performe large-scale investigations involving several plant/animal species. The emergence of DDR-related miRNAs in plants and humans constitutes fundamental informations obtained from these approaches.To experimentally investigate the involvement of plant miRNAs in the regulation of DDR-associated pathways, an ad hoc system was developed, using the model legume Medicago truncatula. Specific treatments with camptothecin (CPT) and/or NSC120686 (NSC) targeting compoments of DDR, namely topoisomerase I (Top1) and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (Tdp1), were used. These treatments, imposed to M. truncatula seeds for a 7-day time period, do not influence the germination process, but result in inhibition of seedling development, causing an increase in cell death and accumulation of DNA damage. To demonstrate that the imposed treatments had an effect on DDR, the expression of SOG1 (suppressor of gamma response 1) master-regulator was investigated by qRT-PCR. Importantly, a phylogenetic study demonstrated that M. truncatula possessed a small SOG1 gene family, composed by MtSOG1A and MtSOG1B genes. The expression of both genes was significantly enhanced in treatment-specific manner. Additionally, the espression of multiple genes playing important roles in different DNA repair pathways, cell cycle regulation and chromatin remodelling, were differentially expressed in a treatment-specific manner. Subsequently, specific miRNAs identifyed from the bioinformatics approach as targeting genes involved in DDR processes, were investigated along side their targets, thus providing a first step in their function validation.To investigate plant miRNAs trans-kingdom potential, additional studies were conducted using apple (M. domestica) since it can be eaten raw and hence, can be a better system for feeding trials. As a proof of concept, artificial miRNAs (amiRNAs) were delivered to human colorectal adenocarcinoma cells and the expression of these microRNAs and their in silico predicted targets were evaluated by qRT-PCR. Specifically, amiRNAs mimicking mdm-miR482a-3p and mdm-miR858 were transfected into HT-29 cell lines. After 72 h, amiRNAs were clearly detected inside the cells and the performed qRT-PCR analysis showed a significant downregulation of the IL4R (Interleukin 4 Receptor) gene, involved in promoting Th2 differentiation, suggesting the possibility of apple miRNAs to regulate the activity of human genes in vitro. Taken together, the results presented in the current PhD thesis demonstrate the involvement of plant miRNAs in DDR-associated processes as well as present evidence on the plant miRNAs trans-kingdom potential.
One of the challenges that living organisms face is to respond promptly to genotoxic stress to avoid DNA damage. To this purpose, they developed complex DNA damage response (DDR) mechanisms. These mechanisms are highly conserved among organisms, including plants, and need to be finely regulated to take place properly. In this scenario, microRNAs are emerging as active players, thus attracting the attention of the research community. The involvement of miRNAs in DDR has been investigated prominently in human cells wherease studies on plants are still scarce. In addition, recently, miRNAs started to be envisioned as trans-kingdom molecules able to exert regulatory functions in evolutionary distant organisms. Particularly, attention is drawn to plant miRNAs ingested with the diet; evidence is accumulating on their ability to regulate genes in organisms other than the one in which they were synthesized, including humans and pathogens.In the present PhD thesis, different bioinformatics approaches have been developed aiming at identifying plant miRNAs along with their endogenous and cross-kingdom targets to pinpoint conserved pathways between evolutionary distant species. Alonside model organisms, the developed pipeline may find application on any species of interest to address species-specific cross-kingdom interactions or to performe large-scale investigations involving several plant/animal species. The emergence of DDR-related miRNAs in plants and humans constitutes fundamental informations obtained from these approaches.To experimentally investigate the involvement of plant miRNAs in the regulation of DDR-associated pathways, an ad hoc system was developed, using the model legume Medicago truncatula. Specific treatments with camptothecin (CPT) and/or NSC120686 (NSC) targeting compoments of DDR, namely topoisomerase I (Top1) and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (Tdp1), were used. These treatments, imposed to M. truncatula seeds for a 7-day time period, do not influence the germination process, but result in inhibition of seedling development, causing an increase in cell death and accumulation of DNA damage. To demonstrate that the imposed treatments had an effect on DDR, the expression of SOG1 (suppressor of gamma response 1) master-regulator was investigated by qRT-PCR. Importantly, a phylogenetic study demonstrated that M. truncatula possessed a small SOG1 gene family, composed by MtSOG1A and MtSOG1B genes. The expression of both genes was significantly enhanced in treatment-specific manner. Additionally, the espression of multiple genes playing important roles in different DNA repair pathways, cell cycle regulation and chromatin remodelling, were differentially expressed in a treatment-specific manner. Subsequently, specific miRNAs identifyed from the bioinformatics approach as targeting genes involved in DDR processes, were investigated along side their targets, thus providing a first step in their function validation.To investigate plant miRNAs trans-kingdom potential, additional studies were conducted using apple (M. domestica) since it can be eaten raw and hence, can be a better system for feeding trials. As a proof of concept, artificial miRNAs (amiRNAs) were delivered to human colorectal adenocarcinoma cells and the expression of these microRNAs and their in silico predicted targets were evaluated by qRT-PCR. Specifically, amiRNAs mimicking mdm-miR482a-3p and mdm-miR858 were transfected into HT-29 cell lines. After 72 h, amiRNAs were clearly detected inside the cells and the performed qRT-PCR analysis showed a significant downregulation of the IL4R (Interleukin 4 Receptor) gene, involved in promoting Th2 differentiation, suggesting the possibility of apple miRNAs to regulate the activity of human genes in vitro. Taken together, the results presented in the current PhD thesis demonstrate the involvement of plant miRNAs in DDR-associated processes as well as present evidence on the plant miRNAs trans-kingdom potential.

Nei primi stadi dell’infezione, i microrganismi fitopatogeni producono un arsenale di enzimi che depolimerizzano in maniera ordinata e sequenziale i componenti della parete cellulare vegetale (CWDEs - Cell Wall Degrading Enzymes). Le poligalatturonasi (PG) sono tra i primi enzimi pectici ad essere prodotti e favoriscono la macerazione del tessuto vegetale rendendo accessibili a cellulasi ed emicellulasi gli altri componenti della parete. I carboidrati rilasciati dal processo degradativo della parete cellulare vengono utilizzati dal patogeno per il sostentamento e per la crescita, conferendo al processo di degradazione un ulteriore significato biologico oltre quello di distruzione fisica della parete. Le PGIP (PolyGalacturonase Inhibiting Proteins) presenti nella parete cellulare vegetale, sono delle glicoproteine in grado di inibire e/o modulare in maniera specifica l’attività delle PG. La formazione del complesso PG-PGIP rallenta la capacità delle PG di degradare l’omogalatturonano della parete cellulare, favorendo l’accumulo di oligogalatturonidi in grado di attivare le risposte di difesa della pianta. Questo lavoro vuole contribuire allo studio del ruolo delle PG in Phytophthora nicotianae e Phytophthora capsici, che sono ritenuti tra gli agenti patogeni più pericolosi per molte specie vegetali. Argomenti specifici che vengono affrontati in questa tesi riguardano: 1) l’identificazione di PG da alcune specie di oomiceti considerate tra le più pericolose per le piante (generi Phytophthora, Pythium ed Aphanomycetes); 2) l'analisi filogenetica delle famiglie geniche PG; 3) l’analisi di sequenze proteiche delle PG identificate allo scopo di rilevare domini e/o amminoacidi responsabili dell'interazione PG-PGIP; 4) la caratterizzazione delle PG da P. nicotianae e P. capsici; 5) la costruzione di mutanti di P. capsici per indagare il ruolo di PG nella patogenesi, utilizzando diversi approcci di genetica “reverse” I risultati ottenuti in questa tesi, potenziano l'ipotesi che la molteplicità delle PG può dare flessibilità al patogeno e ogni PG, con le proprie caratteristiche uniche, contribuisce alla performance del patogeno per colonizzare le piante con successo.
The plant cell wall is a structural barrier to pathogens, composed of a network of polysaccharides such as cellulose, hemicellulose and pectin. The majority of pathogenic microorganisms produce cell wall degrading enzymes (CWDEs) that are essential for the invasion process. Among the different CWDEs, polygalacturonases (PGs) play a critical role since their action on pectin makes other cell wall components more accessible to other CWDEs and causes tissue maceration. PGIPs (polygalacturonase-inhibiting proteins) are plant cell wall proteins that specifically modulate the activity of the PGs, and hamper the invasion process by limiting the host tissue colonization. The PG–PGIP interaction retards pectin hydrolysis and favors oligogalacturonide (OGs) accumulation and leading to plant defense activation. This work wants to contribute to study the role of the PGs in P. nicotianae and P. capsici, among the most dangerous pathogens for many plant species: Specific points of this thesis are: 1) Identification of the whole set of the PGs from well-known oomycetes, which present different lifestyles. 2) Comparison of large PG families found in the oomycetes species using phylogenetic analysis for tracking evolutionary relationships. 3) Analysis of amino acid sequences on identified PGs to detect domains and/or amino acids involved in PG-PGIP interaction. 4) Characterization of PGs from P. nicotianae and P. capsici. 5) Construction of P. capsici mutants for investigate the role of PGs in the pathogenesis, using different approach of reverse genetics. The results from this thesis enhances the hypothesis that the multiplicity of PGs may give flexibility to the pathogen, with each enzyme having its own unique properties to contribute to the performance of all the enzymes to successfully colonize plants.

As rich sources of flavonoids, carotenoids, vitamin C, folic acid and dietary fibre, fruits and vegetables can help prevent cardiovascular diseases and cancers (Amine et al. 2002). According to the world health report that was published by the WHO (2002), 2.7 million deaths per year can be attributed to low fruit and vegetable intake. Apple is the most common fruit crop grown in temperate regions (FAOSTAT 2012) and apples are affordable and widely available in most parts of the world. Apple and apple-derived products have been subject of many studies that have linked their intake to a beneficial effect on many diseases (Hyson 2011). Several studies have indicated a positive effect of phenolic compounds, which are abundantly present in apple, on preventing coronary heart disease and cancer (Hertog et al. 1993; Keli et al. 1996; Gerhauser 2008). The dietary fibres that are present in fruits like apple seem to decrease the risk for developing coronary heart disease, stroke, hypertension, diabetes, obesity and some gastrointestinal diseases (Anderson et al. 2009). Apples have shown to have high anti-oxidant activity and the intake of apple is associated with a reduced risk for heart disease, lung cancer, type 2 diabetes, and asthma (Boyer and Liu 2004), substantiating the beneficial effects of apple consumption on human health

Plants host complex fungal and bacterial communities on and inside various organs. These microbial populations could have beneficial and detrimental effects on their host. Despite the importance of plant bark as potential reservoir of plant pathogens and beneficial microorganisms for perennial crops, no information is available on the composition of bark microbiota under different climatic and agronomic conditions. Due to its agricultural and economic relevance, apple (Malus domestica) was selected as model system, in order to characterise the composition and functional properties of the bark microbiota. Most of the commercially relevant apple cultivars are susceptible to several destructive diseases and require intense use of fungicides. Scab-resistant apple cultivars allow the reduction of fungicide treatments and are compatible with low-input disease management strategies. However, fungicides applied to control apple scab can also control secondary pathogens and the reduction of fungicide applications on scab-resistant cultivars may cause the outbreak of emerging pathogens hosted on bark tissues, as for example the canker agent Diplodia seriata. Although the risk of emerging secondary pathogens is real under low-input disease management strategies, no information is available on the composition and dynamics of bark-associated microbial communities. The main aims of this work are i) to develop metabarcoding-based approaches for the precise study of barkassociated microbial communities and to investigate proportions of plant pathogens and beneficial microorganisms associated with young (one year-old shoots) and old barks (three/four-year-old shoots), ii) to identify impacts of environmental factors (orchard location and climatic conditions), host properties (plant species, cultivar and tissue age) and agricultural practices (integrated and low-input disease management) on the bark microbiota composition and iii) to evaluate fungicide impacts against a scarcely studied canker agent of apple under controlled conditions. A metabarcoding approach was optimized to characterise the composition of barkassociated microbial communities of two apple and two pear cultivars (Chapter II). Several potential plant pathogenic fungi (e.g. Alternaria spp., Diplodia spp., Gibberella spp., Peltaster spp., Penicillium spp., Phoma spp., Rosellinia spp., Stemphylium spp. and Taphrina spp.) and bacteria (e.g. Pseudomonas spp., Clavibacter spp., Curtobacterium spp., Nocardia spp.and Pantoea spp.) were found in presence of beneficial fungi (e.g. Arthrinium spp., Aureobasidium spp., Cryptococcus spp., Rhodotorula spp.,2 Saccharomyces spp. and Sporobolomyces spp.) and bacteria (e.g. Bacillus spp., Brevibacillus spp., Burkholderia spp., Deinococcus spp., Lactobacillus spp., Methylobacterium spp. and Sphingomonas spp.). The composition of bark communities was affected by the tissue age, plant species and cultivar and it strongly differed between young (one year-old shoots) and old barks (three/four-year-old shoots). The optimised protocol was then applied to characterize the bark-associated communities of the scabresistant apple cultivar Fujion under integrated and low-input disease management strategies in two different locations and consecutive seasons (Chapter III). In addition to the tissue age, orchard location and environmental conditions strongly affected fungal and bacterial richness and diversity of the bark communities. In particular, the orchard location affected the abundance of some potential plant pathogens, such as Alternaria spp., Cadophora spp., Diaporthe spp. Diplodia spp., Phoma spp. Curtobacterium spp., Pantoea spp. and Ralstonia spp. Moreover, the abundances of Cryptococcus, Leptosphaeria, Curtobacterium and Pseudomonas genera differed according to the disease management strategy, suggesting that it can shape the composition of plant-associated microbial communities. In particular, the low-input disease management strategy increased the abundances of sOTUs assigned to Alternaria, Cryptococcus, Rhodotorula, Curtobacterium, Methylobacterium, Rathayibacter and Rhizobacter, while the integrated disease management positively affected the abundances of Filobasidium, Erwinia and Pseudomonas. The functional characterization of apple secondary pathogens was then conducted on the canker agent D. seriata (Chapter IV). Diplodia seriata growth was inhibited by fungicides (captan, dithianon and fluazinam) in vitro although canker symptoms were not affected by dithianon on Fujion plants under greenhouse conditions. The overall work revealed a high complexity of the bark-associated microbial communities, highlighting bark as an overwintering site and reservoir of potential plant pathogens and beneficial microorganisms. Bark-associated fungal and bacterial communities were mainly affected by tissue age, orchard location, environmental conditions, disease management strategies, plant species and cultivars, indicating strong plasticity of the bark community to the environmental and host factors. However, cavities in the bark possibly protect microorganisms form perturbing factors and probably limit the efficacy of conventional fungicides against some secondary pathogens, such as D. seriata. Protocols optimised in this work can be further applied for the impact estimation of innovative agronomic practices (e.g. training systems and rain covers) on pathogenic and beneficial communities and for the precise assessment of D. seriata incidence under field conditions.

As a result of the constant demand to ensure food security and crop growth, there is an urgent need of a more sustainable and resilient agriculture. Chemical fertilisers and pesticides are widely used in conventional agriculture and they cause possible environmental impacts. Tomato (Solanum lycopersicum) is cultivated worldwide under field and greenhouse conditions, requires an extensive use of chemical fertilisers and is greatly affected by arthropod feeding damages. Microbial biofertilisers and non-microbial biostimulants can contribute to plant development. Among them, plant growth promoting endophytic bacteria can internally colonise plant tissues and promote plant growth. Likewise, humic acids (HA) are organic substances that improve soil structure and can facilitate plant nutrient uptake. However, scarce information is available on the synergistic effects of endophytic bacterial strains and HA on the bacteria-mediated plant growth promotion. Moreover, beneficial insects, including the generalist predators Macrolophus pygmaeus and Nesidiocoris tenuis, can be used in biological control for the management of crop arthropods. Despite the significance of insects as vectors of plant pathogens is unquestionable, the transmission of beneficial microbes by beneficial insects is unknown. The aims of this thesis were to get insight into the molecular basis of the interaction between endophytic bacterial strains and tomato plants in the presence of HA, in order to improve the understanding on the mechanism responsible for plant growth stimulation, and to investigate the possible use of beneficial insects as vectors to transmit selected endophytic bacterial strains for the further development of sustainable delivery strategies of bacterial biofertilisers. In order to understand the complementation effects and cellular pathways activated by endophytic bacterial strains and HA, three bacterial strains (namely Paraburkholderia phytofirmans PsJN, Pantoea agglomerans D7G and Enterobacter sp. 32A) that were able to promote tomato shoot length in the presence of HA were selected. Double labelling of oligonucleotide probes for fluorescent in situ hybridisation was used to study tomato colonisation by endophytic bacterial strains. In particular, the colonisation intensity of tomato root and stem among the tested strains were comparable in the control and HA condition. Moreover, transcriptomics approach was applied to study the molecular mechanisms activated in tomato shoots and roots in response to endophytic bacteria and HA. Tomato genes were modulated by endophytic bacterial strains mainly in roots, indicating major transcriptional regulations in 3 belowground compared to aboveground tissues. The majority of DEGs was modulated by more than two strains, involving protein metabolism, transcription, transport, signal transduction and defence, representing possible common pathways modulated in response to bacterial endophytes. Moreover, strain-specific tomato responses involved signal transduction, transcription, hormone metabolism, protein metabolism, secondary metabolism and defence processes, highlighting specific traits of the endophyte-tomato interaction. In particular, the presence of HA enhanced the activation of signal transduction, hormone metabolism, transcription, protein metabolism, transport, defence and growth-related processes in response to P. phytofirmans PsJN, P. agglomerans D7G and Enterobacter sp. 32A inoculation, in terms of number of modulated genes and fold change values, indicating additive effects of bacterial endophytes and HA in plant growth promotion mechanisms. In relation to the possibility to deliver endophytes by using insects, beneficial mirids of tomato (namely M. pygmaeus and N. tenuis) were tested as potential vectors to transmit P. phytofirmans PsJN and Enterobacter sp. 32A between tomato plants. Mirids feeding on seedinoculated tomato plants were able to acquire the beneficial bacterial strains. In particular, after contact with bacterial-inoculated plants, P. phytofirmans PsJN and Enterobacter sp. 32A were detected on the majority of mirid epicuticle and inside surface-sterilised insects. Moreover, both tested mirids transmitted the selected bacterial strains between tomato plants and P. phytofirmans PsJN and Enterobacter sp. 32A could be re-isolated from tomato shoots after mirid-mediated transmission. Our study demonstrated that P. phytofirmans PsJN and Enterobacter sp. 32A can move within tomato plants, from shoots to roots after mirid-mediated transmission, indicating that M. pygmaeus and N. tenuis can acquire non-pytopathogenic microbes and the polyphagous and mobile nature of mirids could facilitate the transmission of beneficial endophytes among crops. In summary, the overall work provide in-depth knowledge on the HA-dependent enhancement of growth-related processes stimulated by endophytic bacterial strains and demonstrates the potential of beneficial mirids in transmission of beneficial bacteria and paved the way for the further development of efficient HA- and mirid-mediated strategies for plant biofertilisation and beneficial bacteria delivery.

The proton pump interactor (Ppi) gene family of Arabidopsis thaliana: expression pattern of Ppi1 and characterisation of knockout mutants for Ppi1 and 2. Plant plasma membrane H+-ATPases (PM H+-ATPase) are essential for establishing a proton electrochemical gradient across the cell plasma membrane. Their regulation is poorly understood, except for the role of 14-3-3 proteins, which relieve autoinhibition from the C-terminal domain. A novel protein interacting with this domain was recently identified in Arabidopsis and named PPI1 (Proton Pump Interactor 1). PPI1 stimulates PM H+-ATPase activity in vitro. Here, we analyse the expression pattern of Ppi1 using b-glucuronidase as a reporter. Expression is strong in root and shoot vascular systems, particularly in meristematic and sink tissues, as well as in pollen, stigmas and siliques, but not in developing embryos. Removal of the first intron decreased GUS expression 45-fold. We also analysed the transcription of Ppi2, another gene in the family, and demonstrated that Ppi2 is expressed in seedlings, cultured cells and flowers. Insertional mutants for both Ppi1 and Ppi2 were isolated. Two different mutants of Ppi1 showed aberrant mRNAs and lacked any detectable protein and are therefore true knockouts. At the plant level, neither of the single mutants nor the double ppi1ppi2 mutant showed an altered phenotype in standard growth conditions under acid load or salt stress.

ACA8 is a plasma membrane-localized isoform of calmodulin (CaM)-regulated Ca2+-ATPase of Arabidopsis thaliana. Phospho-proteomic studies identified several phosphopeptides corresponding to portions of its regulatory N-terminus. Each of the Ser found to be phosphorylated in those studies (S19, S22, S27, S29, S57, and S99) has been mutated to Asp, to mimic phosphorylation of the ACA8 N-terminus, and to Ala to prevent phosphorylation. Mutants have been expressed in Saccharomyces cerevisiae and characterized: as shown by the low activation by CaM, mutants S19D, S57D, S22D and S27D are deregulated. Moreover, the low response to CaM of ACA8 mutants S22A, S27A, and S29A points the relevance of these serine residues per se in determining the amplitude of the response of ACA8 to CaM. To analyse the effect of S to D mutation on the kinetic of CaM binding, His-tagged N-termini of wild-type and mutant ACA8 (6His-1M-I116) were expressed in Escherichia coli, affinity-purified and used in surface plasmon resonance experiments. All the analysed mutations affect the kinetics of interaction with CaM to some extent: in most cases, the altered kinetics result in marginal changes in affinity, with the exception of mutants S57D (KD 10-fold higher than wild-type ACA8) and S99D (KD about half that of wild-type ACA8). Since S19 is in a consensus motive for calcium-dependent protein kinases (CDPKs) the ACA8 N-terminus has been subjected to in vitro phosphorylation assays with two isoforms of A. thaliana CDPKs: CDPK1, that phosphorylates ACA2 (an endoplasmic reticulum localised isoform of A. thaliana ACA) and CDPK16, a plasma membrane localised isoform of CDPK. Results show that both kinases are able to phosphorylate ACA8 N-terminus, but CDPK16 with higher extent. Phosphorylation of mutant 6His-1M-I116 peptides mapped CDPK16 phosphorylation site at S19 and at S22. Furthermore, we identified by two-hybrid screening two isoforms of CBL-interacting protein kinases (CIPKs) as putative interactors of ACA8 N-terminus region: CIPK9 and CIPK14. BiFC analysis in Nicotiana benthamiana confirmed the two-hybrid results, showing that interaction between ACA8 full length and CIPK9 or CIPK14 occurs in planta at the plasma membrane. Moreover, phosphorylation assay demonstrate that both kinases phosphorylate ACA8 N-terminus in vitro. Implications of these results are discussed.

THERMOTOLLERANCE, PHYSIOLOGY, AND TAXONOMY OF CYANOBACTERIA FROM THE EUGANEAN THERMAL DISTRICT The muds of the hydrothermal tanks of the Euganean District (Padova, Italy) are colonized by populations of cyanobacteria, both coccoid and filamentous, which can adapt themselves to drastic and sudden changes of the water temperature. This reaserch project is part of a broader program of study on the oxygenic photoautotrophic bioglea of the Euganean Thermal District. The aim of this study is to increase knowledge about these interesting thermotolerant organisms, of which little is known from a taxonomic, physiological, as well as adaptive point of view. A research integrating the structural, functional and taxonomic aspects can provide new information on the biodiversity of these extreme environments and on the adaptative mechanisms and structural and metabolic plasticity of the organisms which colonize them. This research deals with ETS-09 and ETS-10, two of the different cyanobacteria isolated from the muds of the hydrothermal tanks of the Euganean District. The features of ETS-09 cells, derived from morphological and ultrastructural analyses, as well as its composition in photosynthetic pigments, suggested that this cyanobaterium could belong to Cyanothece, Halothece or Euhalothece genera. Like Cyanothece strains, ETS-09 was able to fix atmospheric nitrogen, since it could grow well in an organic nitrogen-free medium without effects on the growth rate and cell characteristics. Moreover, a molecular analysis led to the finding of the nifH and nifD genes, coding for subunits of the enzyme nitrogenase, in its genome. The analysis of ETS-09 cultures grown at different temperatures showed that the cyanobacterium thermotolerance was low, being it able to survive only some days at 45-47°C. The results of phylogenetic analyses, carried out using the 16S rDNA and rbcL genes as molecular markers, led to the hypothesis that ETS-09 may belong to a new genus, phylogenetically far from Cyanothece, Halothece, and Euhalothece genera. Morphological, ultrastructural and physiological analyses carried out on the second cyanobacterium, ETS-10, showed features similar to strains belonging to the genus Chroococcus. The finding of nifH and nifD genes in its genome and the ability of growing in a medium without organic nitrogen proved that also ETS-10 was able to fix nitrogen. Finally, also in this case, analyses performed on cultures grown at different temperatures showed that the thermotollerance of ETS-10 was quite limited, being the organism able to live at 45-47°C only for short time. The phylogenetic analyses, based on the 16S rDNA and rbcL genes, confirmed the initial hypothesis that the cyanobacterium belongs to the genus Chroococcus. In fact, the obtained topologies were congruent and indicated the inclusion of ETS-10 in a clade with most of the Chroococcus species. As the constructed data sets included all the Chroococcus sequences available in GenBank plus the sequences of all the Chroococcus species obtained from international culture collection, we hypothesize that ETS-10 could be a new species of the genus Chroococcus, for which we suggest the name Chroococcus aponinus.
TERMOTOLLERANZA, FISIOLOGIA E TASSONOMIA DI CIANOBATTERI DEL COMPRENSORIO TERMALE EUGANEO Sui fanghi delle vasche idrotermali del Comprensorio Termale Euganeo si sviluppano abbondanti popolazioni di cianobatteri, sia filamentosi che coccoidi, che formano spesse coperture compatte. Questi microrganismi fotosintetici ossigenici sono presenti su fanghi esposti a temperature molto variabili a seconda che la vasca che li contiene venga rifornita con acqua termale (ad elevata temperatura) o che venga mantenuta a riposo per un certo periodo. Il presente progetto di ricerca si inserisce in un più ampio programma di studio della bioglea fotoautotrofa ossigenica del Comprensorio Termale Euganeo con l’obiettivo di approfondire le conoscenze su questi interessanti microrganismi termotolleranti dei quali, ancor oggi, si conosce poco sia dal punto di vista tassonomico che fisiologico ed adattativo. Una ricerca articolata che integri aspetti strutturali, funzionali e tassonomici può fornire nuove informazioni sulla biodiversità di questi ambienti limitanti, sui meccanismi adattativi e sulla plasticità strutturale e metabolica degli organismi che li occupano. Dei diversi tipi di cianobatteri, prelevati dalla superficie del fango delle vasche idrotermali di Abano Terme, sono stati considerati in questo studio due ceppi, ETS-09 ed ETS-10 (dove ETS sta per Euganean Thermal Spring), ottenuti in coltura pura mediante la tecnica della diluizione su piastra. Le caratterisiche cellulari di ETS-09, rilevate con le iniziali indagini morfologiche ed ultrastrutturali, così come la sua composizione in pigmenti fotosintetici, suggerivano che l’organismo in esame potesse appartenere ai generi Cyanothece, Halothece o Euhalothece. ETS-09, come le specie del genere Cyanothece, era in grado di fissare l’azoto atmosferico. Questa capacità è stata dimostrata dal ritrovamento nel suo genoma dei geni nifH e NifD e dalla capacità dell’organismo di crescere in terreno privo di nutrienti azotati senza conseguenze sulla velocità di crescita e sulle caratteristiche cellulari. Dalla coltura di ETS-09 a diverse temperature è risultato che la termotolleranza di questo microrganismo non era molto elevata, portandolo a sopravvivere, per un tempo limitato, a 45°-47°C. I risultati delle analisi filogenetiche condotte utilizzando come marker molecolari i geni 16S rDNA ed rbcL sono state di particolare interesse, portando a suggerire che ETS-09 possa appartenere ad un genere nuovo filogeneticamente distante dai generi Cyanothece, Halothece ed Euhalothece a cui l’organismo era stato avvicinato inizialmente in base alle sue caratteristiche strutturali e fisiologiche. Le indagini morfologiche, ultrastrutturali e fisiologiche condotte sul secondo cianobatterio coccoide (ETS-10) hanno evidenziato caratteristiche comuni con organismi del genere Chroococcus. Il ritrovamento nel genoma dei geni nifD e nifH e la capacità di crescere in terreno privo di nutrienti azotati hanno dimostrato che anche ETS-10 era in grado di fissare N2. Dalle indagini condotte su colture allestite a diverse temperature è risultato, infine, che, analogamente al ceppo precedente, la termotolleranza di ETS-10 era piuttosto limitata permettendo al cianobatterio di sopravvivere solo per breve tempo a 45-47°C. Nel caso di ETS-10, le analisi filogenetiche condotte utilizzando come marker molecolari i geni 16S rDNA ed rbcL, hanno confermato l’iniziale ipotesi di appartenenza del cianobatterio al gnere Chroococcus. Le topologie ottenute, dopo un’analisi filogenetica utilizzando i due diversi marker, infatti, sono congruenti e indicano l’inclusione di ETS-10 in un clade comprendente la maggior parte di specie di Chroococcus. Dal momento che nei data set sono state inserite le sequenze di tutte le specie di Chroococcus disponibili in GenBank più quelle di tutte le specie di Chroococcus da me acquistate presso le banche algali, è possibile ipotizzare che ETS-10 possa appartenere ad una nuova specie del genere Chroococcus per cui si suggerisce il nome di Chroococcus aponinus.

Reproductive success in plants is dependent on the timing of the switch from vegetative to reproductive phase coinciding with optimal environmental and developmental conditions. This is a key step that dramatically influences plant productivity, one of the most important aspects in agriculture. Plants have evolved an elaborate regulatory network that integrates endogenous and environmental signals to ensure that flowering occurs when conditions are most favorable. During the last two decades, functional genomics studies have revealed the existence of a complex network of genetic interactions responsible of integrating the different types of signals, both internal and external, that plants receive and that define when plants can enter into the reproductive phase (Liu et al. 2009). However, the molecular characterization of the floral transition process is far from being completed, therefore new studies flanked by new research methods are needed to identify and characterize the proteins and protein complexes that play a key role in the transition to the reproductive phase (Jang et al. 2009). One of these proteins involved in floral transition is SVP (Short Vegetative Phase), a MADS-Box transcription factor studied for a long time at genetic level. It has been reported (Liu et al. 2007) that the ectopic expression of this transcription factor causes a late flowering phenotype in transgenic plants. Moreover, this line develops abnormal leaves and also the flower structure is altered. It is known that many, if not all transcription factors, play their biological role as part of multi-subunit protein complexes, on the other side knowledge on those protein complexes is scarce. In the case of SVP, some interacting partners have been identified via yeast-2-hybrid assays (Gregis et al. 2009), however in planta evidences of such interactions have not been provided, yet. During the last two years, in our laboratory we developed a protocol that enable us to coimmunoprecipitate protein complexes using an antibody against GFP fused to SVP, in order to identify the putative partners that interact together, with SVP, in controlling the flowering time. The analysis of the first data generated a large number of putative candidates involved in acetylation, deacetylation and methylation of histones (Cohen et al. 2009; Berr et al. 2010). A major conclusion that can be drawn from our findings, in agreement with recent publications in this field, is that SVP controls flowering time in Arabidopsis by a chromatin-dependent expression regulation of genes involved in the process. The aim of this project was the validation of the results, by using different methods, and the characterization of these putative partners in order to identify the right composition of different complexes in which SVP interacts with, and the mechanisms behind the regulation of flowering time. The flowering time analysis of mutants of the two most promising candidates GCN5 (GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5) and SDG2 (SET domain protein 2) revealed, in agreement with already published data, their involvement in this mechanism (Bertrand et al. 2003; Guo et al. 2010; Berr et al. 2010). Moreover, preliminary data obtained by analyzing the 35S::SVP-GFP svp/svp SDG2/sdg2 plants, indicate that the floral defect caused by the overexpression of SVP, needs also the presence of SDG2 protein.

The work described in this thesis is aimed at the study of the reproductive phase in rice in order to understand the molecular mechanisms that induce the transition to flowering and later affect flower development. MADS-box transcription factors are key regulators of several developmental processes such as embryo development, floral transition and most of all flower development. This thesis focuses on the functional characterization of several MADS-box genes expressed in the rice flower and on the evolutionary comparison between related members of the MADS-box gene family in rice and Arabidopsis (Chapters 2, 3, 4 and 5). One of the major problems currently limiting rice research is the absence of large mutant resources. To overcome this problem mutant collections are being developed that will be useful tools for assessing gene function in rice. This thesis describes the constitution of one of these mutant collections, generated through a heterologous tagging system, based on the maize Ac/Ds transposons. The collection is composed of 1000 unique flanking sequence tags, positioned on the 12 pseudomolecules representing the sequenced rice genome (Chapter 7).

Sulfur is an essential element for all living organisms. It is found in a broad variety of compounds [two amino acids (cysteine and methionine), glutathione (GSH), phytochelatins (PCs), vitamins, iron-sulfur clusters, cofactors and other molecules]. For plants, the main source of sulfur is sulfate ion that is taken up, by roots, from the soil solution. Once inside the cells, sulfate is reduced and assimilated into cysteine from which, GSH is synthetized enzymatically. This tripeptide (i.e., GSH) is involved in the maintaining of the redox homeostasis of the cells and in the detoxification of toxins. In plants not exposed to cadmium (Cd, a toxic not essential heavy metal), GSH represents the main thiol in the cells. However, under Cd exposure, plants, starting from GSH, immediately synthetize PCs, which, in turn, become the most abundant class of thiols. These Cys-rich peptides are able to chelate Cd, reducing the levels of free Cd ions in the cell and the damage induced by the metal. The large amount of PCs represents a sulfate additional sink that increases the request for Cys and GSH and, consequently, the total amount of sulfur necessary for both mitigation of stressing conditions and plant growth. In this thesis, two experimental works are presented. The aim concerned the improvement of the knowledge on the molecular and physiological relationships existing among Cd accumulation, Cd tolerance, sulfur metabolism and sulfur use efficiency in two different model plants: barley and Arabidopsis. In the first work, six barley cultivars widely differing for Cd tolerance, partitioning, and translocation were analyzed in relation to their thiol metabolism. The data analysis indicated that Cd tolerance was not clearly related to the total amount of Cd absorbed by plants, but it is closely dependent on the capacity of the cultivars to chelate and immobilize the metal at root level. Such behaviors suggested the existence of root mechanisms preserving shoots from Cd-induced oxidative damages, as indicated by the analysis of thiobarbituric acid-reactive substances (diagnostic indicators of oxidative stress), whose levels increased in the shoots and they were negatively related to Cd root retention and tolerance. Cd exposure differentially affected GSH and PC levels in the tissues of each barley cultivar. The capacity to produce PCs appeared as a specific characteristic of each barley cultivar, since it did not depend on Cd concentration in the roots and resulted negatively related to the concentration of the metal in the shoots, indicating the existence of a cultivar-specific interference of Cd on GSH biosynthesis, as confirmed by the presence of close positive linear relationships between the effect of Cd on GSH levels and PC accumulation in both roots and shoots. The six barley cultivars also differed for their capacity to load Cd ions into the xylem, which was negatively related to PC content in the roots. All these data indicated that the different capacity of each cultivar to maintain GSH homeostasis under Cd stress may strongly affect PC accumulation and, thus, Cd tolerance and translocation. Concerning the second work, plants of Arabidopsis thaliana were grown in complete hydroponic solutions containing different sulfate concentrations and exposed or not to different levels of Cd, for short or long period. Concerning shoot, long-term Cd exposure induced an increment of the external critical sulfate concentration ([SO42-]crit, i.e. the sulfate concentration in the growing medium that produced the 95% of the maximum amount of fresh weight). Moreover, in this experimental condition, shoot tolerance to relatively low Cd concentration increased as sulfate availability in the growing medium did, whilst at root level the strong inhibition induced by Cd was independent from external sulfate concentration. Conversely, under short-term Cd exposure, [SO42-]crit did not change statistically in both shoot and roots and the inhibitory effect exerted by the metal on shoot and root growth was independent from external sulfate availability. Interestingly, the presence of Cd for both short and long period induced an increment of the relative expression levels of genes codifying for high-affinity sulfate transporters enhancing, consequently, the sulfate uptake. On the other hand, increases of the sulfate availability in the growing solution reduced the amount of sulfate taken up by roots. However, only under short-term Cd exposure the increments of sulfate uptake were coupled with increases of non-protein thiol levels indicating that long-term Cd exposure decreases the capacity of the Arabidopsis roots to efficiently use the available sulfate ions in the growing medium to promote the growth. Such a behavior is likely due to the effect exerted by Cd accumulation which, reducing the development of root apparatus, makes the adaptive response of the high-affinity sulfate transporters “per se” not enough to optimize the growth at sulfate external concentrations lower than [SO42-]crit. Finally, reassuming, the main results show that the capacity of plant tissues to maintain GSH homeostasis under Cd stress may strongly affect PC accumulation and, thus, Cd tolerance and translocation. Moreover, such a capacity seems to be related to the total amount of sulfur available for plant nutrition in the growing medium, since adequate levels of sulfate modulate thiol metabolism and partitioning, reducing the negative effects produced by Cd at shoot level. This confirms that sulfur plays a pivotal role in the mechanisms involved in Cd detoxification suggesting that the manipulation of both sulfate transport and thiol metabolism may represent a useful strategy for the selection of low Cd-accumulating cultivars or more Cd-tolerant plants when grown in Cd-contaminated soils.

1 ABSTRACT Negli oceani attuali, il fitoplancton è principalmente dominato dalle microalghe della linea rossa, con clorofilla a e c, mentre le microalghe della linea verde, con clorofilla a e b, contribuiscono solo in misura minore. Tuttavia, la composizione specifica del fitoplancton è cambiata nel corso dei tempi geologici e le microalghe della linea verde dominavano gli oceani dell’Era Paleozoica, mentre, a partire dall’Era Mesozoica, le alghe della linea rossa diventarono dominanti e diedero origine ai gruppi che sono più importanti negli oceani attuali. Questo cambiamento di dominanza del fitoplancton è stato messo in relazione con la variazione della chimica degli oceani che si è verificata lungo la scala dei tempi geologici. La concentrazione di SO42- negli oceani è aumentata in maniera monotonica dall’Era Paleozoica (~1-10 mmol L-1 SO42-) a oggi (28 mmol L-1 SO42-). Nonostante sia difficile avere informazioni dettagliate sull’abbondanza di NO3- e PO4- negli oceani del passato, ci sono evidenze che anche il rapporto N:P sia cambiato lungo la scala dei tempi geologici, e che gli oceani siano passati dalla limitazione da P a quella da N, dall’Era Paleozoica al presente. Inoltre, il cambiamento dello stato redox degli oceani causato dall’accumulo di O2 rilasciato dalla fotosintesi dal Neo-Proterozoico alla fine del Paleozoico, ha determinato il cambiamento dell’abbondanza di alcuni metalli in tracce, come Fe, Cu, Mn, Mo, Cd e Zn. È stato ipotizzato che la stechiometria elementale media possa essere il link tra il cambiamento della chimica degli oceani e il successo evolutivo delle microalghe della linea rossa. È stato riportato che le microalghe della linea rossa hanno una maggiore richiesta di quegli elementi (S, P, Mn) la cui disponibilità è aumentata quando gli oceani sono diventati più ossidati; il contrario è stato 2 osservato per le microalghe della linea verde, che hanno una maggiore richiesta di nutrienti meno abbondanti in condizioni ossidate (N, Fe, Cu, Zn). Questo suggerirebbe che le alghe della linea rossa siano meglio dotate per far fronte alle condizioni chimiche degli oceani ricchi di ossigeno. Dato che gli organismi della stessa linea evolutiva condividono la stechiometria elementale e i percorsi metabolici, dovrebbero rispondere in maniera simile alla variazione di disponibilità di nutrienti, allocando il C nelle stesse categorie di composti. Le modalità di allocazione del C influiscono sulla biologia delle microalghe attraverso l’impatto che il contenuto energetico esercita sulla palatabilità della cellula e mediante l’effetto della densità cellulare complessiva sulle velocità di affondamento. I differenti composti organici in cui viene allocato il C (proteine, lipidi e carboidrati) non sono equivalenti in termini di densità e di richiesta di energia. Dunque, nella scala dei tempi geologici, le modalità di allocazione del C possono aver avuto un ruolo rilevante sulle traiettorie evolutive del fitoplancton. Può essere ipotizzato che, negli oceani ossigenati e permissivi dal punto di vista ecologico che emersero dall’estinzione di massa Permo-Triassica, le alghe della linea rossa si siano avvantaggiate delle modalità di allocazione del C che ne diminuirono la palatabilità e permisero loro un miglior controllo della galleggiabilità. Lo scopo di questa tesi è valutare l’impatto della variazione della disponibilità dei macro- e micro-nutrienti sulle traiettorie evolutive del fitoplancton. Al fine di perseguire questo scopo, ho pianificato quattro esperimenti per investigare il ruolo potenziale dei seguenti fattori: 3  Disponibilità di NO3-  Rapporto N:P  Disponibilità di SO42-  Disponibilità di Fe, Cu e Mn Il primo esperimento è stato condotto su dieci differenti specie di microalghe appartenenti alle linee evolutive verde e rossa (Amphidinium klebsii, Chlorella marina, Cyclotella meneghiniana, Dunaliella parva, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema marinoi, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira weissflogii) e su un cianobatterio (Synechococcus sp.), mentre, per gli altri esperimenti è stato selezionato un numero minore di specie. In parziale disaccordo con l’ipotesi, le modalità di allocazione del C e la loro variazione in risposta ai cambiamenti della disponibilità dei nutrienti (NO3-, SO42- e metalli) erano differenti in alghe che condividono le medesime traiettorie evolutive. Anche gli organismi appartenenti allo stesso genere (Dunaliella parva e Dunaliella salina, Thalassiosira pseudonana e Thalassiosira weissflogii) avevano diverse modalità di allocazione del C in risposta a differenti concentrazioni di NO3-. D’altra parte, le modalità di allocazione del C erano fortemente influenzate dalla taglia cellulare. Quando la biomassa è stata caratterizzata in termini di livello di riduzione complessivo, l’ipotesi è stata verificata, dato che le alghe appartenenti alle due linee evolutive erano marcatamente distinte. Le specie della linea rossa mostravano un livello di riduzione più basso in condizioni che mimano gli oceani attuali, mentre il contrario era vero per le alghe della linea verde. Il maggiore livello di riduzione delle alghe negli oceani attuali si può tradurre in un maggiore contenuto energetico e quindi in 4 una maggiore palatabilità delle cellule per i pascolatori. Questo può aver avuto un ruolo nel favorire l’ascesa alla dominanza delle alghe della linea rossa. Il tasso di crescita della diatomea Thalassiosira pseudonana è stato saturato a un N:P di 13, mentre il tasso di crescita delle alghe della linea verde Dunaliella salina è stato saturato a un N:P di 76. La diatomea non ha cambiato il tasso di assimilazione del NO3- in funzione del rapporto N:P. L’alga verde, invece, ha mostrato una maggiore sensibilità alla disponibilità di NO3- e ha cambiato in maniera apprezzabile il tasso di assimilazione del NO3- in risposta al rapporto N:P. La composizione organica di T. pseudonana è rimasta inalterata in un intervallo di N:P compreso tra 2.6 e 13; per valori di N:P superiori, la diatomea ha modificato la sua composizione e ha aumentato il costo di produzione della biomassa (entrambi sono rimasti costanti quando il rapporto N:P era tra 38 e 152). Dunaliella salina ha cambiato le modalità di allocazione del C in ogni condizione di coltura e ha diminuito il contenuto energetico delle cellule quando è stata coltivata a maggiori rapporti N:P. Dunque, la diatomea ha speso meno energia per produrre la sua biomassa in condizioni di disponibilità di N che mimavano quelle degli oceani moderni; l’alga verde, invece, ha speso meno energia quando è stata cresciuta in condizioni simili al Paleozoico. La disponibilità di SO42- ha influenzato i tassi di crescita delle diatomee P. tricornutum e T. pseudonana e dell’alga verde D. salina: quando queste specie sono state coltivate alla concentrazione di 28 mmol L-1 di SO42- (che 5 mima quella degli oceani attuali), i loro tassi di crescita erano più alti di quando sono state coltivate a una concentrazione di 3 mmol L-1 di SO42- (che mima quella degli oceani del Paleozoico). I tassi di crescita di T. suecica non sono stati interessati dalla disponibilità di SO42-. Nelle alghe verdi, l’efficienza di uso dell’N non è cambiata in funzione della disponibilità di SO42-, mentre quella delle diatomee era maggiore quando la concentrazione di SO42- era alta (28 mmol L-1). La produttività di C delle alghe verdi era più alta a basso SO42- (3 mmol L-1), ma era più bassa ad alto SO42-. Il contrario era vero per le due diatomee. In P. tricornutum e T. pseudonana, il tasso di sintesi delle proteine normalizzato per unità di RNA era considerevolmente maggiore a 28 mmol L-1 di SO42- piuttosto che a 3 mmol L-1 di SO42-. Questo non era vero per le alghe verdi, per le quali non è stato notato nessun cambiamento significativo di questo parametro in funzione delle concentrazioni di SO42-. Le due alghe verdi e le due diatomee usate nei precedenti esperimenti sono state coltivate anche in presenza di differenti concentrazioni di Fe, Cu e Mn. Secondo l’ipotesi che suggerisce che le alghe della linea rossa hanno una maggiore abilità a crescere in ambienti più ossidati, un aumento della disponibilità di Cu e una diminuzione della disponibilità di Fe e Mn dovrebbero favorire queste alghe su quelle della linea verde. I nostri risultati non sembrano confermare pienamente questa ipotesi, dato che le risposte in termini di crescita delle quattro specie alla disponibilità di questi metalli non sono coerentemente correlate alla linea evolutiva. Infatti, la maggior disponibilità di Cu ha stimolato la crescita di P. tricornutum e delle due alghe verdi, ma non di T. pseudonana; la maggior disponibilità di Fe non ha avuto effetto sulle diatomee, ma ha stimolato la crescita di D. salina; il Mn ha stimolato la crescita delle diatomee, ma non quella di D. salina e T. suecica. 6 In conclusione, gli esperimenti riassunti sopra mostrano che:  La diminuzione della disponibilità di NO3- nel corso della storia della terra può aver favorito le alghe della linea rossa  Il declino del rapporto N:P osservato attraverso il Mesozoico può aver avuto un impatto positivo sull’ascesa alla dominanza delle alghe della linea rossa  I cambiamenti secolari dell’abbondanza di SO42- sono compatibili con un ruolo di questo nutriente nell’aver facilitato la predominanza della linea rossa negli oceani moderni  Il cambiamento dello stato redox per se non ha avuto un impatto sull’evoluzione del fitoplancton.
Phytoplankton in the extant oceans is mainly dominated by microalgae of the red lineage, with chlorophyll a and c, whereas microalgae of the green lineage, with chlorophyll a and b, only contribute to a minor extent. However, the species composition of phytoplankton changed over geological time scale and microalgae of the green lineage dominated the oceans of the Paleozoic Era, whereas from the Mesozoic Era the red lineage rose to dominance and gave origin to the groups of algae that dominate the extant oceans. This shift in dominance of the phytoplankton has been put in relation with the change of ocean chemistry that occurred over a geological time scale. The oceanic concentration of SO42- increased monotonically from the Paleozoic Era (~1-10 mmol L-1 SO42-) to the present (28 mmol L-1 SO42-). Although it is difficult to have detailed information about the abundances of NO3- and PO4- in the oceans of the past, there are evidences that also the N:P ratios changed over geological time scale, and the oceans passed from P- to N-limitation, from the Paleozoic Era to date. Moreover, the change of the redox state of the oceans caused by the accumulation of the O2 released by photosynthesis from the Neo-Proterozoic to the end of the Paleozoic, determined a change in the abundance of some trace metals, such as Fe, Cu, Mn, Mo, Cd and Zn. It has been hypothesized that the link between the change of ocean chemistry and the evolutionary success of the microalgae of the red lineage is the average cell elemental stoichiometry. The microalgae of the red lineage have been reported to have higher requirement for those elements (S, P, Mn) whose availability increased when the oceans became more oxidized; the opposite was observed for microalgae of the green lineage, which have higher requirement for nutrients less abundant in oxidized conditions (N, Fe, Cu, Zn). This would suggest that the algae of the red lineage are better equipped to cope with the chemical conditions of oxygenated oceans. Because organisms of the same evolutionary lineage share elemental stoichiometry and biosynthetic pathways, they should respond similarly to the variation of nutrient availability, allocating C to the same pools. The pattern of C allocation affects the biology of microalgae through the impact that the energy content exerts on cell palatability and through the effect of the overall cell density on sinking rates. Different organic pools to which C is allocated (i.e. proteins, lipids and carbohydrates) are not equivalent in terms of density and energy requirement. Therefore, on a geological time scale, the patterns of C allocation may have had a relevant role on the evolutionary trajectories of phytoplankton. It can be hypothesized that, in the oxygenated and ecologically permissive oceans that emerged from the Permo-Triassic mass extintction, the algae of the red lineage took advantage of patterns of C allocation that decreased their palatability and allowed a better buoyancy control. The aim of this thesis is to evaluate the impact of the variation of macro- and micro-nutrients availability on the evolutionary trajectories of phytoplankton. In order to pursue this aim, I designed four experiments to investigate the potential role of the following:  Availability of NO3-;  N:P ratio;  Availability of SO42-;  Availability of Fe, Cu and Mn. The first experiment was conducted on ten different species of microalgae belonging to the green and to the red lineage (Amphidinium klebsii, Chlorella marina, Cyclotella meneghiniana, Dunaliella parva, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema marinoi, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira weissflogii) and one cyanobacterium (Synechococcus sp.), whereas, for the other experiments a smaller number of species was selected. In partial disagreement with the hypothesis, the patterns of C allocation and their variation in response to changes in the availability of nutrients (NO3-, SO42- and metals) were different in algae sharing the same evolutionary trajectories. Also organisms belonging to the same genus (i.e. Dunaliella parva and Dunliella salina, Thalassiosira pseudonana and Thalassiosira weissflogii) had different patterns of C allocation in response to different NO3- concentrations. On the other hand, the allocation patterns were strongly affected by the cell size. When biomass was characterized in terms of the overall level of reduction, the hypothesis was verified, since the algae belonging to the two evolutionary lineages were consistently distinct. The species of the red lineage showed a lower level of biomass reduction in conditions mimicking the extant oceans, whereas the opposite was true for algae of the green lineage. The higher level of reduction of the green algae in today’s oceans may also translate to a higher energy content and thus a higher palatability of cells to grazers. This may have played a role in favoring the rise to dominance of the algae of the red lineage. The growth rate of the diatom Thalassiosira pseudonana was saturated at a N:P of 13, whereas, the growth rate of the green alga Dunaliella salina was saturated at a N:P of 76. The diatom did not change the rate of assimilation of NO3- as a function of the N:P ratio. The green alga, instead, showed a greater sensitivity to the availability of NO3- and appreciably changed the rate of NO3-assimilation in response to the N:P ratio. The organic composition of T. pseudonana was unaltered in a range of N:P ratio between 2.6 and 13; above this N:P ratio, the diatom modified its composition and increased the cost of biomass production (both remained constant when the N:P ratio was between 38 and 152). Dunaliella salina changed the pattern of C allocation in each culture condition and tended to decrease the energy content of the cell when cultured at higher N:P ratios. Therefore, the diatom spent less energy to produce its biomass in conditions of N availability mimicking those of extant oceans; the green alga, instead, spent less energy when growth in Paleozoic-like conditions. The availability of SO42- affected the growth rates of the diatoms P. tricornutum and T. pseudonana and of the green alga D. salina: when these species were cultured at a SO42- concentration of 28 mmol L-1 (mimicking that of the extant oceans), their growth rates was higher than when they were cultured at a SO42- concentration of 3 mmol L-1 (mimicking that of the Paleozoic oceans). The growth rates of T. suecica was not affected by the availability of SO42-. In the green algae, The N-use efficiency did not change as a function of SO42- availability, whereas that of the diatoms was higher when SO42- concentration was high (28 mmol L-1). Green algae C productivity was higher at low SO42- (3 mmol L-1), but it was lower a high SO42-. The opposite was true for the two diatoms. In P. tricornutum and T. pseudonana, the rate of protein synthesis normalized on RNA amount was appreciably higher at 28 mmol L-1 SO42- than at 3 and 14 mmol L-1 SO42-. The same was not true for the green algae, for which no significant change of this parameter as a function of SO42- concentrations was detected. The two green algae and the two diatoms used in the previous experiment were also cultured in the presence of different Fe, Cu and Mn concentrations. According to the hypothesis that suggests a higher ability of algae of the red lineage to grow in more oxidized environments, an increased availability of Cu and a decreased availability of Fe and Mn should favor these algae over those of the green lineage. Our results do not appear to fully confirm this hypothesis, as the growth response of the four species to the availability of these metals is not consistently related to the evolutionary lineage. In fact, higher Cu availability stimulates the growth of P. tricornutum and of the two green algae, but not of T. pseudonana; higher Fe availability had no effect on the diatoms, but stimulated growth of D. salina; Mn stimulates diatoms growth, but not that of D. salina and T. suecica. In conclusions, the experiments summarized above show that:  The decrease of NO3- availability in the course of Earth history may have favored the algae of the red lineage  The observed decline of the N:P ratio in the oceans across the Mesozoic may also have had a positive impact on the rise to dominance of the algae of the red lineage.  The secular changes in sulfate are compatible with a role of this nutrient in facilitating the prevalence of the red lineage in modern oceans  The change of redox state per se did not impact the evolution of phytoplankton.

Crystallization of ion channel proteins is a difficult task for several reasons related to the hydrophobic nature of these proteins, and still is a matter of trials and errors. In this work I will present an experimental approach to the crystallization of a group of small potassium channels: the viral Kcv channels. The first part deals with the expression of MA-1D Kcv in the heterologous system Pichia pastoris and its purification by detergent solubilization. Attempts to increase the yield of the protein by modification of the construct at the DNA level are discussed. In parallel the production of Fab fragments from monoclonal antibodies that recognized the tetrameric form of the protein has been established in order to make protein-antibody complexes that can promote an ordered crystallization process by increasing the polar contacts within the crystals. In the second part of this thesis, the planar lipid bilayer technique is applied to study the functional properties of several Kcv channels at the single channel level. In particular I have analyzed the block by barium of the wt PBCV-1 Kcv and of its mutants in the 4th site of the selectivity filter, residue Threonine 63. This mutation affects protein sensitivity to barium, but also alters the open probability and the number of subconductance levels. The mutation of an adjacent aminoacid, Serine 62, recovers the wt functions. The T63 mutation was then moved also to another Kcv channel, MA-1D Kcv, to check if the behavior related to the mutation is conserved. The third part deals with Kesv, a Kcv-like channel founding a related class of viruses, ESV that, differently to Kcv, shows a mitochondrial localization when expressed in heterologous systems. Due to the difficulties encountered in measuring from mitochondria of transfected cells, we have not been able to record currents from this channel in the past. It was therefore decided to produce and purify recombinant protein for functional studies in artificial lipid bilayer. Since all attempts to express it in Pichia pastoris failed, it was decided to express it in a cell-free system in collaboration with the lab of Dr. Bernhard, at the University of Frankfurt. Functional studies on the reconstituted protein channel have revealed that the protein forms a functional, selective K+ channel with overall features of the Kcv-like channels.

Fin dal passato i prodotti naturali sono stati utilizzati come rimedio alle malattie. In tempi recenti questi prodotti naturali hanno ricevuto grande attenzione nella prevenzione delle malattie grazie ai loro effetti benefici sulla salute, come ad esempio la bassa tossicità e effetti collaterali minimi. Le miniproteine cystine-knot (CKMs) appartengono ad una grande famiglia di piccole proteine ricche in cisteine diffuse nelle piante e nelle specie animali. CKMs mostrano un vasto spettro di attività biologiche naturali utili da un punto di vista terapeutico, infatti molte di queste CKMs sono commercializzate come agenti terapeutici o sono in vari fasi di sviluppo clinico. CKMs constano tipicamente di meno di 50 aminoacidi e hanno una struttura tridimensionale unica caratterizzata da tre legami disolfuro intramolecolari che formano un “cystine-knot” (nodo di cisteine) e da un piccolo foglietto beta. Il nodo di cisteine agisce come impalcatura per la proteina conferendo a tutte le miniproteine cystine-knot una struttura compatta e sorprendentemente stabile a vari fattori, come pH estremi, denaturazioni chimiche o termiche e attacchi proteolitici. Questa struttura è stata individuata per la prima volta nel 1982 in un inibitore di carbossipeptidasi di patata (PCI). PCI inibisce la carbossipeptidasi pancreatica dei mammiferi e può agire come fattore antitrombotico; inoltre è stato dimostrato che PCI agisce come inibitore della crescita di linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico funzionando come antagonista del fattore di crescita umano dell’epidermide legandosi al recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR). È stato visto che l’attività dell’EGFR, che è un recettore tirosin-kinasico appartenente alla famiglia ErbB, è aumentata in maniera anomala nella maggior parte dei tumori solidi umani e questa attività anomala è associata con la progressione del tumore e con una prognosi sfavorevole. Oggigiorno è diventato evidente che la via di segnale del EGFR, oltre a un effetto sulla progressione, gioca un ruolo importante anche nell’angiogenesi, ovvero nella formazione di nuovi vasi sanguigni partendo da vasi preesistenti per formare una rete capillare. L’angiogenesi è un evento fondamentale nei processi fisiologici come l’organogenesi, la guarigione delle ferite e la crescita dei muscoli, ma avviene anche in situazioni patologiche dove promuove la crescita e la progressione tumorale, la formazione di metastasi così come la retinopatia diabetica e la psoriasi. Alla luce di ciò è facile intuire che il trattamento anti-angiogenico è considerato una strategia efficace nella terapia tumorale e l’inibizione di EGFR sembra rappresentare un nuovo e promettente approccio. Questa ricerca mira ad investigare l’azione biologica su cellule umane di due miniproteine di pomodoro che sono componenti consueti della nostra dieta. La motivazione di questa ricerca scaturisce dalla scoperta che due miniproteine cystine-knot di pomodoro (TCMPs), di cui una espressa nel fiore (TCMP-1) e una nel frutto maturo (TCMP-2), mostrano similarità di sequenza e struttura con un inibitore di carbossipeptidasi di patata (PCI) che agisce come antagonista di EGF. Poiché EGF è una delle molecole segnale che partecipa alla formazione di nuovi vasi, abbiamo investigato se TCMP-1 e TMCP-2, che sono capaci di legarsi alla superficie di cellule umane, possono esercitare una attività anti-angiogenica avendo contemporaneamente una bassa tossicità cellulare. In questo lavoro abbiamo dimostrato che gli inibitori di carbossipeptidasi cystine-knot di pomodoro, sia in forma naturale che ricombinante, possiedono attività anti-angiogenica in vitro e che questa attività è svolta ad una concentrazione in un range nano molare, range che è di particolare rilevanza biologica. Inoltre i nostri esperimenti hanno provato che le due miniproteine non esercitano alcun effetto tossico sulla proliferazione e vitalità delle cellule endoteliali e che la loro attività anti-angiogenica è associata con l’inibizione dell’attivazione di ERK1/2, suggerendo che TCMPs interferiscano con la via di segnale delle MAPK. In conclusione possiamo dire che poiché gli inibitori di carbossipeptidasi cystine-knot di pomodoro sono presenti nel frutto commestibile, questi composti i dovrebbero essere dotati di bassa tossicità quando testati su modelli animali e sull’uomo; inoltre l’angiogenesi tumorale può rappresentare un target per l’uso terapeutico delle miniproteine di pomodoro e la loro attività anti-angiogenica può essere testata anche per la prevenzione di alter malattie. In base a questi dati e considerazioni le miniproteine di pomodoro possono avere un potenziale interesse farmacologico che merita successivi approfondimenti.
Natural products are known since the past as disease remedies. In recent years, natural products have received great attention for disease prevention owing to their various health benefits, including low toxicity and diminished side effects. Cystine-knot miniproteins (CKMs) are members of a large family of small cysteine-rich proteins widespread in plant and animal species. CKMs display a broad spectrum of therapeutically useful natural biological activities and several CKMs are marketed as therapeutics or are in clinical development. CKMs typically consist of less than 50 amino acids and have a unique three-dimensional structure characterized by three intra-molecular disulfide bonds forming a cystine-knot and a small tripled stranded beta-sheet. The cystine-knot acts as structural scaffold for the protein conferring to the cystine-knot miniproteins a compact and remarkably stable structure towards extreme pH, chemical and thermal denaturation, and proteolytic attack. This scaffold was first discovered in 1982 in a carboxypeptidase inhibitor from potato (PCI). PCI inhibits mammalian pancreatic carboxypeptidase and can act as antithrombotic agent. Moreover, it has been shown that PCI also function as inhibitor of pancreatic adenocarcinoma cell lines growth acting as antagonist of the human epidermal growth factor by binding to the epidermal growth factor receptor (EGFR). The activity of the EGFR, that is a tyrosine kinase receptor of the ErbB family, is abnormally elevated in most human solid tumors and has been associated with progression and poor prognosis. Nowadays, it has become clear that the EGFR signaling pathway also plays a key role in angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing vessels to form capillary networks. Angiogenesis is a fundamental event of physiological processes, like organogenesis, wound healing and muscle growth, but it also takes place in pathological situations and promotes tumor growth and progression, metastasis as well as diabetic retinopathy and psoriasis. Therefore, anti-angiogenic treatment is considered a very effective strategy in cancer therapy and inhibition of EGFR seems to represent a novel and promising approach. This research aims to investigate the biological action on human cells of two tomato miniproteins which are normal components of our diet. The motivation for this research stems from the discovery that two tomato cystine-knot miniproteins (TCMPs), one expressed in the flower (TCMP-1) and the other in the mature fruit (TCMP-2), are similar in sequence and structure to a potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) that acts as EGF antagonist. Since EGF is one of the signalling molecules participating in the formation of new vessels, we have investigated whether, TCMP-1 and TCMP-2, that can bind to the surface of human cells, could exert anti-angiogenic activity with limited cell toxicity. We have demonstrated that tomato cystine-knot carboxypeptidase inhibitors both native and recombinant, possess anti-angiogenic activity in vitro. The tomato miniproteins act as an anti-angiogenic factor in the nanomolar concentration range, which is of particular biological relevance. Furthermore, our experiments have proved that the two miniproteins do not exert toxic effects on endothelial cell proliferation and viability. Their anti-angiogenic activity is associated with an inhibitory effect on ERK1/2 activation, suggesting that TCMPs interfere with MAPK signaling pathway. Since tomato cystine-knot carboxypeptidase inhibitors are present in edible fruits, these compounds should be endowed with low toxicity when tested in animal models of disease and in humans. Tumorigenic angiogenesis could represent a target for therapeutic intervention with tomato miniproteins, and their anti-angiogenic activity could be tested as well for the prevention of other diseases. On these bases, miniproteins from tomato may be of potential pharmacological interest and deserve further investigation.

Kcv from the chlorella virus PBCV-1 is a viral protein that forms a tetrameric, functional K+ channel in heterologous systems. Kcv can serve as a model system to study and manipulate basic properties of the K+ channel pore because its minimalistic structure (94 amino acids) produces basic features of ion channels, such as selectivity, gating, and sensitivity to blockers. We present a characterization of Kcv properties at the single-channel level. In symmetric 100 mM K+, single-channel conductance is 114 ± 11 pS. Two different voltage-dependent mechanisms are responsible for the gating of Kcv. “Fast” gating, analyzed by  distributions, is responsible for the negative slope conductance in the single-channel current–voltage curve at extreme potentials, like in MaxiK potassium channels, and can be explained by depletion-aggravated instability of the filter region. The presence of a “slow” gating is revealed by the very low (in the order of 1–4%) mean open probability that is voltage dependent and underlies the time-dependent component of the macroscopic current.

Questo progetto di dottorato ha avuto come obiettivi: i) valutazione del ruolo del’auxina di derivazione batterica nella simbiosi rizobio-leguminosa, che dà origine a noduli di tipo indeterminato, ii) lo studio funzionale di MtN5, una proteina di tipo “Pathogenesis Related”, che viene indotta precocemente durante la nodulazione e che presenta omologie di sequenza con membri della famiglia delle Lipid Transfer Protein vegetali. L’auxina (acido indol-3-acetico, IAA) è un ormone vegetale implicato in molti aspetti che riguardano la vita e lo sviluppo delle piante; un suo coinvolgimento nello sviluppo del nodulo radicale era stato ipotizzato già all’inizio del secolo scorso. Studi successivi hanno dimostrato un’inibizione del trasporto acropeto di IAA nella radice a seguito dell’infezione con rizobi, con un conseguente accumulo di fitormone a livello del sito di infezione. E’ stato dimostrato che la maggior parte dei batteri della rizosfera che producono effetti di promozione sulla crescita della pianta, rizobi inclusi, possiedono vie biosintetiche per IAA. I rizobi sono in grado di sintetizzare auxina in coltura liquida e, molto probabilmente, mantengono questa capacità anche durante la nodulazione. Ad oggi, però, i dati riguardanti il ruolo dell’auxina batterica nello sviluppo dei noduli sono ancora controversi; sono stati infatti documentati sia effetti stimolatori che inibitori. Molti degli eventi che stanno alla base dell’associazione simbiotica tra rizobi e leguminose devono ancora essere chiariti. Ad esempio, la natura e la funzione dei segnali ormonali scambiati tra ospite e simbionte non sono ancora stati compresi nel dettaglio, così come le differenze e i parallelismi nella risposta delle leguminose verso il simbionte e verso i patogeni della radice. A tal riguardo, recenti osservazioni hanno dimostrato che la repressione della via di segnalazione intracellulare dell’auxina risulta in una maggiore resistenza innata delle piante verso microrganismi patogeni. Piante di Medicago truncatula, specie modello per le leguminose che producono noduli di tipo indeterminato, e Medicago sativa (erba medica), specie correlata di interesse agronomico, sono state nodulate sia con rizobi wild-type e che con rizobi in grado di iper-produrre IAA (S. meliloti IAA). I risultati ottenuti hanno dimostrato che piante nodulate con S. meliloti IAA producevano un numero maggiore di noduli (aumento del 50% in M. sativa e aumento del 100% in M. truncatula) e un apparato radicale più ramificato. Inoltre il contenuto di auxina nei noduli prodotti da rizobi IAA è mediamente 10 volte superiore alla concentrazione dei noduli prodotti da rizobi wild-type. I livelli di espressione dei geni responsabili del trasporto di auxina è stato valutato mediante RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) e il carrier di efflusso MtPIN2 è risultato significativamente più espresso (circa 2 volte) nel tessuto radicale di piante nodulate con rizobi IAA rispetto alle radici infettate con il rizobio di controllo. Questi risultati suggeriscono che l’effetto di promozione osservato sulla nodulazione e sull’accrescimento della radice laterale siano dovuti alla produzione di IAA nel nodulo e ad una sua redistribuzione all’interno dell’apparato radicale. E’ stato ampiamente dimostrato che l’ossido nitrico (NO) agisce come secondo messaggero nell’induzione di radici laterali e avventizie stimolata da auxina. Considerando la comune organogenesi tra radici laterali e avventizie e noduli indeterminati, in questo lavoro abbiamo dimostrato che esiste un collegamento tra auxina e NO nella via di segnalazione che porta all’induzione del nodulo. Per mezzo di uno screening preliminare, condotto mediante qRT-PCR e volto ad individuare geni differenzialmente espressi in piante nodulate con rizobi IAA e piante nodulate con rizobi wild-type, fu osservato che il gene MtN5 era più espresso negli apparati radicali di piante infettate con rizobi iperproduttori di auxina. Il prodotto genico di MtN5 è stato annotato come una Lipid Transfer Protein (LTP) putativa. Le LTP vegetali sono caratterizzate dalla capacità sia di legare lipidi in vitro che di inibire la crescita di microrganismi. In questo progetto di tesi è stato dimostrato che MtN5 possiede la capacità di legare lisolipidi e che, come molti altri membri di questa famiglia di proteine, possiede attività antimicrobica in vitro, in particolare contro Fusarium semitectum, Xanthomonas campestris e S. meliloti. Lo studio del profilo di espressione conferma che MtN5 viene precocemente indotta durante la nodulazione e che è specificamente localizzata all’interno del nodulo radicale. Inoltre, l’infezione di piante con F. semitectum provoca l’accumulo di MtN5 nel tessuto radicale. La funzione di MtN5 nella nodulazione è stata studiata mediante la generazione di radici avventizie transgeniche, sia overesprimenti che silenziante per il gene di interesse. Le radici silenziate per MtN5 sviluppano circa la metà dei noduli rispetto a radici di controllo, mentre in radici transgeniche over-esprimenti MtN5 il numero di noduli è risultato incrrementato del 300% rispetto al controllo. I risultati ottenuti dimostrano che MtN5 facilita l’interazione simbiotica tra M. truncatula e S. meliloti, agendo probabilmente negli stadi precoci dell’infezione, e suggeriscono che MtN5 potrebbe avere un ruolo nella protezione dei noduli verso patogeni della radice. Ulteriori studi sono comunque necessari per ottenere una immagine più chiara del ruolo di MtN5 sia nella simbiosi che nella risposta verso i patogeni.
The present thesis has had two main focuses: i) the evaluation of the role of bacteria-derived auxin in the symbiosis between rhizobia and legumes that bear indeterminate nodules, ii) the functional study of MtN5, a pathogenesis related protein which presents sequence homology with the members of the plant Lipid Transfer Proteins (LTP) family and is precociously induced during nodulation. Auxin (indol-3-acetic acid, IAA) is a phytohormone involved in many aspects of plants growth and development; The role of auxin in the development of the rhizobia-legumes symbiosis was first hypothesised at the beginning of the twentieth century. More recent studies have demonstrated that auxin is accumulated at the site of infection as a consequence of the inhibition of the acropetal auxin transport in roots upon rhizobia inoculation. The production of IAA has also been documented in plant-associated rhizobacteria, including rhizobia, that have promoting effects on plants growth. When grown in liquid media, rhizobia can synthesize auxin and most likely they retain the same capability also during the nodule development. However, up to date, the data concerning the role of bacteria-derived auxin in the establishment of the symbiotic association are still contradictory, since both stimulatory and inhibitory effects have been documented. Thus, there are still open questions in the understanding of the events that result in the establishment of the symbiosis. First of all the nature and the function of the hormonal signal(s) exchanged between the host and the symbiont are not thoroughly unfolded, as well as the parallelisms and the differences in the responses of legumes against root pathogens and root symbiont. In these regards, recent findings have pointed out that plants innate immunity results, at least in part, from the down-regulation of the auxin signalling pathway. Medicago truncatula and Medicago sativa plants were nodulated with both wild-type and auxin hyper-synthesising rhizobia (Sinorhizobium meliloti IAA). The results obtained showed that plants nodulated with S. meliloti IAA produced a higher number of root nodules (50% more nodules in M. sativa and 100% more nodules in M. truncatula) and a more branched root apparatus. The root nodules elicited by S. meliloti IAA had a higher IAA content (at least 10-fold) when compared to control nodules. The expression levels of the auxin carriers were evaluated and the efflux facilitator MtPIN2 resulted more abundant (about 2-fold) in the root tissue of IAA plants when compared to wild-type plants These data suggested that such promoting effects on nodulation and lateral root growth might be due to the increased auxin content detected in IAA nodule produced by auxin hyper-synthesising rhizobia, as well as to a redistribution of the phytohormone in the root tissue. It has been largely demonstrated that nitric oxide (NO) acts as second messenger in the auxin-induced pathway that leads to formation of lateral and adventitious roots. Since root nodules have the same organogenetic origin of lateral and adventitious roots, the possible connection between NO and root nodule induction was investigated and we demonstrated that NO participate in the signalling pathway for root nodule induction. During a preliminary screening carried out by means of qRT-PCR, it has been found that N5 gene of M. truncatula was more abundantly expressed in roots nodulated with S. meliloti IAA with respect to roots infected by wild-type rhizobia. The gene product of MtN5 was annotated as putative Lipid Transfer Protein (LTP). LTPs are characterized by their ability to bind lipids in vitro and the majority of them exhibits antimicrobial activity. In this thesis, it has been demonstrated that the recombinant MtN5 protein is able to bind lysolipids and possesses inhibitory activity against Fusarium semitectum, Xanthomonas campestris and S. meliloti. The studies of the expression pattern of both MtN5 transcript and MtN5 protein confirmed that it is precociously induced during nodulation and revealed that it is specifically localized in the root nodule. In addition, when M. truncatula plants are infected with the root pathogenic fungus F. semitectum, MtN5 protein is accumulated in the root apparatus. The function of MtN5 in nodulation has been studied through the generation of transgenic adventitious roots, both over-expressed and silenced for the gene of interest. MtN5-silenced roots developed approximately 50% fewer nodules as compared to control roots, whereas in hairy roots over-expressing MtN5 the nodule number was increased by about 300% with respect to control roots. Collectively the data indicate that MtN5 facilitates the symbiotic interaction between M. truncatula and S. meliloti, probably acting in the early stages of rhizobia infection, and suggest that it might have a role in the protection of nodules against root pathogen. However, further studies are needed to have a clear picture of the role played by MtN5 in both symbiosis and defence response against pathogens.

L’eterogeneità delle risposte fisiologiche delle microalghe ai cambiamenti ambientali rappresenta uno dei fattori più importanti nel determinare le interazioni tra le specie in ambiente. La mia ricerca ha rivelato che specie differenti sono diversamente inclini a modificare la propria composizione cellulare in risposta ai cambiamenti ambientali. La scelta tra acclimatazione e omeostasi dipende anche dal tipo e dalla durata della perturbazione in esame. La maggior parte delle alghe considerate nel mio studio, per esempio, ha mostrato una risposta omeostatica ai cambiamenti nelle concentrazioni ambientali di CO2 e nella forma di azoto disponibile. Non è stato ritrovato nessun legame tra la strategia di risposta e la tassonomia delle alghe. Particolare attenzione è stata rivolta a Chromera velia, parente prossima dei parassiti Apicomplexa e probabile simbionte di coralli dell’ordine Scleractinia. C. velia si è dimostrata perfettamente in grado di vivere ad alta CO2. Questa condizione ha stimolato la produzione di C organico da parte di C. velia, incrementato la sua efficienza di utilizzo dei nutrienti e ha determinato cambiamenti nei rapporti stechiometrici tra gli elementi. Si può ipotizzare, dunque, che l’elevata concentrazione di CO2 rinvenuta all’interno dei tessuti del corallo che circondano il simbionte possa facilitare la vita di quest’alga in simbiosi. Infine, ho potuto dimostrare che le interazioni tra alghe e ambiente possono avere conseguenze nei rapporti tra alghe e loro predatori. I miei esperimenti hanno mostrato che i copepodi (ma non i rotiferi) possono discriminare tra alghe che sono identiche in ogni aspetto tranne che nella composizione cellulare. La storia nutrizionale delle alghe, dunque, essendo uno dei principali determinanti della loro composizione cellulare, risulta un elemento di grande importanza nelle relazioni tra alghe e predatori.
Algae exhibit a large variety of physiological responses to the environmental changes. Such heterogeneity of responses, which is a major determinant of species interaction in natural algal assemblages, was the target of my research. My results show that different species are differently prone to change their cell composition in response to environmental changes, depending on the type and duration of the perturbation. When algae are exposed to changes in the N source and in the CO2 availability, for instance, homeostasis appears as a much more common strategy than usually believed. No link between the response modes and the taxonomy of the examined species was found. I paid special attention to Chromera velia, a photosynthetic relative of apicomplexan parasites that is likely involved in symbiotic associations with scleractinian corals. This alga seems perfectly capable of copying with very high CO2. Life at high CO2 stimulates the overall organic C production of C. velia, increases its nutrient use efficiency and changes the stoichiometric relationships among elements within the cell. The high CO2 concentrations that has been reported in the animal tissue surrounding the photosynthetic cells may therefore facilitate C. velia life in symbiosis. Finally, I have demonstrated that the interactions between algae and environment can affect the relationships between algae and their grazers. My experiments show that the copepods are able to discriminate among algae identical in all aspects but in cell composition, while the rotifers are not. Therefore, the nutritional history of algae, which has the potential to affect algal cell composition, appears as a major determinant of the relationships between algae and grazers.

Plant tolerance to salinity stress involves complex physiological traits, metabolic pathways, and molecular and gene networks (Gupta and Huang, 2014, Int J Genomics). Salinity impacts plants by causing osmotic stress and ion toxicity. Salt stress also causes the production of excessive reactive oxygen species (Munns and Tester, 2008, Annu Rev Plant Biol). Salt-stress perception and signalling are required for appropriate responses to these insults. Key components of the signalling pathways induced by salt stress are Ca2+ (Knight et al., 1997, Plant J), NO and the recently re-evaluated H2O2. Cereals are overall considered to be salt sensitive and, among them, rice is the most sensitive one. Two Italian rice cultivars, Vialone Nano (VN) and Baldo (B), were selected for their contrasting salt sensitivity, being VN more sensitive and B more tolerant. The analysis of the salt-stress responses in these varieties was performed both in plants and in suspension cell cultures established from their seeds. At the whole plant level, morphological, physiological and molecular analyses showed B being able to rapidly respond to the stress, by developing of an adaptive programme that allowed growth to resume. The components of the signal transduction pathway induced by salt stress were investigated in suspension cell cultures. The role of H2O2 and NO as signalling molecules in salt stress response was investigated in detail. In particular, the signature of H2O2 seemed to be important to determine the fate of the cells: acclimation in B versus programmed cell death in VN. Moreover, to study Ca2+ signalling, transformed plants harboring Ca2+ sensors of both Italian rice varieties were obtained. These plants will be used as a tool to compare calcium signatures induced by salt stress in the sensitive and tolerant variety.
La tolleranza delle piante allo stress salino è un sistema complesso di tratti fisiologici, vie metaboliche, e reti molecolari e geniche (Gupta e Huang, 2014, Int J Genomics). Nelle piante, lo stress salino causa due tipi di stress: uno stress osmotico e uno stress ionico. Un’alta salinità provoca anche una eccessiva produzione di dannose specie reattive dell'ossigeno (Munns e Tester, 2008, Annu Rev impianto Biol). La percezione e il signalling dello stress sono necessari per l’attivazione di una risposta adeguata. I componenti chiave delle vie di signalling indotte da stress salino sono Ca2+ (Cavaliere et al., 1997, pianta J), NO e H2O2. I cereali sono generalmente considerati sensibile al sale e, tra questi, il riso è il più sensibile. Due varietà di riso italiano, Vialone Nano (VN) e Baldo (B), sono state selezionate per la loro contrastante sensibilità al sale: VN è risultato essere il più sensibile mentre B il più tollerante. Le analisi delle risposte allo stress salino in queste due varietà sono state effettuate sia in pianta che in colture cellulari generate a partire da semi. A livello dell’intera pianta, analisi morfologiche, fisiologiche e molecolari hanno dimostrato che B è in grado di rispondere rapidamente allo stress, mettendo in atto un programma di adattamento che permette di riprendere la crescita. I componenti della via di trasduzione del segnale indotto da stress sono stati studiati in colture cellulari in sospensione. Il ruolo di H2O2 e NO, come molecole segnale in risposta allo stress salino, è stato studiato in dettaglio. In particolare, un diverso andamento nella produzione di H2O2 sembra essere importante per determinare il destino delle cellule: acclimatazione in B contro morte cellulare programmata in VN. Inoltre, sono state ottenute piante esprimenti sensori per il calcio per entrambe le varietà di riso italiano. Queste piante saranno uno strumento utile per studiare il signalling del calcio indotto da stress salino.

SUMMARY Most biodiesel is currently produced from oleaginous crops like sunflower or soybean. However, the use of crop plants for this kind of applications presents many limitations. One is that even in the most producing species oils are less than 5% of total biomass basis, thus limiting the possible productivity. On the contrary, in some species of microalgae more that 50% of the total dry matter is represented by lipids. Algae have thus a promising potential as feedstock for biodiesel production. However, a strong research effort is still needed to fulfill their potential in large scale production to at least partially replace fossil fuels. Species belonging to the genus Nannochloropsis are considered among the most promising for biodiesel production because of their ability to accumulate large amounts of lipids. The general aim of this work was to analyze the role of photochemical efficiency in the productivity of the marine microalga Nannochloropsis gaditana. The efficiency in using light is in fact fundamental to have productive large scale algae cultivation. As for all photosynthetic organisms, light is a major factor influencing algae growth since it provides all the energy supporting metabolism. However, radiation can also be dangerous because, if in excess, it may drive the formation of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress affecting algae productivity. In the second chapter the effect of different light regimes on biomass and lipids productivity of Nannochloropsis gaditana is assessed. Results showed that this organism is able to adapt to a wide range of light intensities by activating an acclimative response and maintain growth rate. The exposition to different light intensities did not show differences in lipids accumulation. In the third chapter similar experiments were performed in the presence of excess CO2, one major factor for algae large scale cultivation. Algae are in fact able to exploit CO2 externally provided to support and increase the biomass productivity. Here, the combined effect of light intensity and carbon dioxide on Nannochloropsis gaditana growth and lipids productivity was analyzed. Results showed that excess CO2 strongly increased the growth rate at all light intensities and that under strong illumination lipids synthesis was stimulated. Thus, strong illumination does not induce lipids accumulation per se but it contributes when excess CO2 is also present. A major signal inducing lipids accumulation in algae is nutrients limitation and nitrogen starvation in particular. In these conditions, Nannochloropsis cells can accumulate up to 70% of dry weight as lipids. In the fourth chapter, the influence of this macronutrient availability on photosynthetic efficiency in Nannochloropsis cells was assessed. Results showed that nitrogen depletion affects the whole photosynthetic chain with Photosystem II (PSII) particularly affected. As a result linear electron flow from PSII to PSI is strongly decreased. Nannochloropsis cells were still able to maintain a residual photosynthetic efficiency exploiting alternative electron flow such as cyclic electron transport around PSI. In conclusion this work showed that Nannochloropsis could be considered a good candidate for the outdoor biodiesel production because of its good growth rate, its lipids accumulation and its ability to adapt to very different illumination intensities that usually characterize the natural environment. However, strong nutrient stress treatments, although effective in inducing large relative lipids content, limit the overall process productivity because of a reduced photosynthetic efficiency and are thus not suitable in a perspective of a large scale production. Finally, the observation that cells are able to adapt their photosynthetic apparatus to respond to this type of stress opens the possibility of finding optimized conditions where a nutrient limitation can stimulate the lipids accumulation without affecting photosynthetic efficiency or improve responses to nutrient depletion by genetic engineering Nannochloropsis cells. In the fifth chapter nitrogen depletion effects on photosynthetic apparatus were compared with that in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii, showing even in this case the alteration of the balance between the two photosystems in response to N availability. PSII was confirmed as the major target under N deprivation with the linear electron flow from PSII to PSI showing a decreased amount. However, under nitrogen deprivation the cyclic electron flow was strongly exploited. Concluding, the re-organization of the entire photosynthetic apparatus and the improvement of alternative electron flows instead of LEF in both Nannochloropsis and Chlamydomonas seem to be a common response to nitrogen deficiency in algae even not strictly correlated from an evolutive point of view. In appendix 1 the influence of different light intensities was tested using alternation of light and dark cycles with different frequencies, which mimic illumination variations in a photobioreactor due to mixing. Results showed that Nannochloropsis is able to use efficiently very intense light in presence of the optimal frequency of light-dark cycles. In fact, when the frequency was not optimal Nannochloropsis suffered a reduced photosynthetic productivity and remarkable photodamages. Thus, the mixing optimization has to be considered a seminal parameter for algae to exploit light energy with the highest efficiency. In order to understand as much as possible the basic mechanisms for light adaptation, a part of this work was then focused on the biochemical characterization of a protein involved in the regulation mechanism of photosynthesis, the Violaxanthin De-Epoxidase (VDE). In particular, it participates to the xanthophylls cycle, a well known photoprotection mechanism and it is known that at neutral pH, VDE is soluble in the lumen but it binds to the thylakoids upon a conformational change when the pH decreases. In appendix 2, for convenience the VDE belonging to the model higher plant Arabidopsis thaliana was studied. In any case, recently, a homologue gene for this protein was found in Nannochloropsis. The pH-dependent activation mechanism of this enzyme was analyzed and thanks to an in silico analysis we were able to identify the residues which are putatively involved in the pH dependent conformational change. We also mutated these residues to verify experimentally if they were indeed important for the enzyme activity and results indicated that each identified key residue was sufficient to induce the first step of the activation and all the residues together produced a cooperative effect on the final activity.
RIASSUNTO Attualmente il biodiesel è prodotto da piante superiori quali girasole e soia definite oleaginose per la loro capacità di accumulare lipidi nei semi. Tuttavia, il loro impiego per la produzione di oli combustibili presenta numerose limitazioni. Ad esempio, nel caso delle specie di piante maggiormente produttive meno del 5% sulla biomassa totale è rappresentato da lipidi. In alcune specie di microalghe, invece, più del 50% del peso secco è stimato essere in lipidi rendendo tali organismi decisamente competitivi nella possibile produzione di biodiesel. Tuttavia, è necessario ampliare le ricerche nel campo in modo tale da riuscire a sfruttare appieno il potenziale insito nelle alghe per una produzione su larga scala. In questo senso, le specie appartenenti al genere Nannochloropsis riscuotono un grande successo, dovuto principalmente alle caratteristiche fondamentali che caratterizzano questo genere, ovvero una buona velocità di crescita accompagnata da una buona produzione in termini di lipidi. Questo lavoro si propone di analizzare il ruolo svolto dalla fotosintesi nella produttività finale di una microalga marina, Nannochloropsis gaditana. L’efficienza nell’utilizzo della luce è infatti un punto cardine per massimizzare la produttività algale su larga scala. In tutti gli organismi fotosintetici la luce è uno dei fattori che maggiormente ne influenza la crescita dal momento che è essenziale per tutti i processi metabolici. Tuttavia, la radiazione luminosa può in alcuni casi essere fonte di stress. Per esempio, quando la luce incidente sull’organismo è in eccesso può portare alla formazione di forme reattive dell’ossigeno e a stress ossidativi che in qualche modo vanno ad agire sulla produttività delle alghe. Nel secondo capitolo, colture di Nannochloropsis gaditana sono state esposte a diverse intensità luminose e per ciascuna di esse sono stati monitorati il tasso di crescita e la produttività in termini di lipidi. I risultati raccolti hanno dimostrato come Nannochloropsis sia in grado di adattarsi a tutte le intensità luminose testate attivando una risposta acclimativa che ne ha permesso la crescita nelle diverse condizioni. Tuttavia l’intensità luminosa non sembra avere un effetto particolare sulla produzione finale di lipidi. Nel terzo capitolo, colture di Nannochloropsis sono state esposte alle stesse intensità luminose del capitolo precedente ma in presenza di un flusso di aria miscelato con anidride carbonica al 5% in quanto questo ultimo componente rappresenta uno dei maggiori fattori utilizzati nella produzione di biodiesel su larga scala. Le alghe infatti sono in grado di sfruttare in modo molto efficiente la CO2, utilizzandola per incrementare il tasso di crescita. In questo capitolo è stato analizzato l’effetto combinato di luce ed eccesso di CO2 sulla crescita e sulla produttività lipidica di Nannochloropsis. I risultati ottenuti hanno dimostrato come l’eccesso di CO2 stimoli positivamente la crescita algale, aumentando la quantità di biomassa finale e allo stesso modo la sintesi di lipidi, che in eccesso di luce è fortemente incrementata. La limitata disponibilità di nutrienti è uno dei maggiori fattori che influenza la sintesi di lipidi nelle alghe, in particolare la mancanza di azoto. In queste condizioni, Nannochloropsis è in grado di accumulare lipidi fino al 70% rispetto al peso secco. Nel capitolo quattro è stata quindi studiata l’influenza della carenza di azoto in colture di Nannochloropsis. I risultati prodotti hanno stabilito come in carenza di azoto si instauri una riorganizzazione dell’intero apparato fotosintetico confermando il PSII come il maggior target di tale stress producendo, inoltre, come conseguenza una diminuzione del trasporto elettronico lineare dal PSII al PSI e un forte aumento del trasporto ciclico intorno al PSI. Nannochloropsis, dunque, si presenta come candidato ideale per la produzione di biodiesel grazie al veloce tasso di crescita, alla buona produzione lipidica e all’estremo grado di adattamento alle più diverse intensità luminose che normalmente caratterizzano l’ambiente naturale. Tuttavia, l’utilizzo della forte carenza di azoto per la stimolazione dell’accumulo di lipidi non sembra il metodo migliore per la produzione di biodiesel su larga scala in quanto l’efficienza fotosintetica delle alghe ne è fortemente risentita con una riduzione della produttività finale. Ad ogni modo, il fatto che Nannochloropsis sia in grado di modulare il proprio apparato fotosintetico in risposta a cambiamenti ambientali implica la possibilità di trovare un equilibrio tra il grado di stress applicato alle alghe e il mantenimento di una buona efficienza fotosintetica nonché di modificare geneticamente le alghe in modo tale da aumentare la sintesi di lipidi finale. Nel capitolo cinque gli effetti della carenza di azoto sono stati studiati nell’alga verde Chlamydomonas reinhardtii, verificando anche in questo caso come la disponibilità di azoto influenzi soprattutto il PSII e il trasporto ciclico degli elettroni risulti incrementato in carenza di azoto. Comparando le risposte di Nannochloropsis e Chlamydomonas si può quindi proporre la riorganizzazione dell’intero apparato fotosintetico e lo sfruttamento di flussi alternativi di elettroni rispetto al comune lineare, come una tipica risposta adattiva alla mancanza di azoto nelle alghe. Nell’appendice 1 l’influenza delle diverse intensità luminose è stata analizzata applicando alle alghe un’alternanza di cicli luce-buio a diverse frequenze che potessero simulare le condizioni di ombreggiamento dovute al mescolamento presenti in un fotobioreattore. I risultati proposti hanno dimostrato come Nannochloropsis sia in grado di sfruttare al meglio anche le intensità luminose molto elevate purché la frequenza dei cicli luce-buio sia ottimale. In caso contrario le cellule sono sottoposte ad una drastica riduzione nell’efficienza fotosintetica con conseguente calo della produttività. L’ottimizzazione del mescolamento, dunque, è da considerarsi come un parametro fondamentale per poter sfruttare pienamente la capacità di utilizzo della luce da parte delle alghe. Per poter capire nel modo più dettagliato possibile i meccanismi di base che permettono agli organismi fotosintetici di adattarsi alle variazioni di intensità luminosa, una parte di questo lavoro è stata incentrata sullo studio di una proteina coinvolta in un ben noto meccanismo di fotoprotezione, il ciclo delle xantofille. L’enzima preso in considerazione è la Violaxantina De-Epossidasi (VDE) che a pH neutri si trova solubile nel lumen tilacoidale per poi essere in grado di legarsi ai tilacoidi una volta che il pH acidifica, assumendo un cambiamento conformazionale. Nell’appendice 2 è trattata la VDE della pianta superiore Arabidopsis thaliana, organismo scelto per comodità sperimentale, anche se recentemente un gene omologo che codifica per la VDE è stato trovato anche in Nannochloropsis. Il meccanismo pH-dipendente è stato indagato grazie ad analisi in silico che hanno permesso di riconoscere i residui aminoacidici coinvolti nel cambiamento conformazionale della proteina. Tali residui sono stati poi mutati per verificarne l’importanza a livello dell’attività enzimatica e i risultati finali hanno indicato come ciascun singolo residuo sia sufficiente ad indurre i primi steps di attivazione del meccanismo pH-dipendente e come tutti i residui insieme cooperino producendo un effetto cumulativo sull’attività finale dell’enzima.

The need for energy and the unsustainability in the long term of fossil fuels encouraged the quest for more environmental-friendly energy sources. One alternative is exploiting plants to produce biofuels. The screening of many perennial grasses suggested Miscanthus (Miscanthus spp), Arundo (Arundo donax), and reed canary grass (Phalaris arundinacea) in Europe and switchgrass (Panicum virgatum) in both Europe and US as good candidates for bioenergy production. This thesis focuses on two of these plants: Arundo and switchgrass. Both plants already show a good agronomic performance, but they underwent little domestication, so there is room for their genetic improvement. On the contrary to switchgrass, breeding, genetic transformation and in vitro cultivation of Arundo are lagging behind for the sterility and the recalcitrance of this plant. We developed a method for in vitro cultivation of Arundo that is faster and more efficient than the one previously reported in literature. Calli are induced from stem segments on an MS-based medium containing 9 μM 2,4-D and then a suspension culture can be obtained using the same medium supplemented with 4.4 μM BAP, leading to a 5-fold increase in cell mass over 14 days. This medium was the best in terms of growth rate and final cell density among the four tested media. Protocols for protoplast isolation from suspension cultures and electroporation were also established, allowing a transformation Tools for improving biofuel crops 4 efficiency up to 3.3±1.5 %. The use of a novel vector with two distinct fluorescent protein reporters (GFP and RFP) driven, respectively, by the Cauliflower Mosaic Virus 35S and the ubi2 promoter of switchgrass, allowed a direct comparison of the strength of the two promoters in Arundo. The switchgrass ubi2 promoter provided a much higher expression compared with the 35S promoter. Lastly, as a further methodological advancement, we developed a method to cryopreserve mesophyll protoplast of switchgrass. Both vitrification and slow-freezing methods were tested. Slow freezing is more efficient than vitrification with a percent recovery of alive protoplast of 45.8% vs. 5.2%.

When external and internal cues are favorable, rice plants stop to produce leaves and start to make flowers. This process is called floral transition and occurs in leaves and at the Shoot Apical Meristem (SAM). In rice, Heading Date 3a (Hd3a) and RICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1) are two signal molecules, called florigens, which are expressed and translated in leaves. Florigens are small and globular proteins with non-cell autonomous functions, as they can move via the vascular tissue of rice and arrive in the SAM, where they promote the transition from the vegetative to the reproductive phase. In this tissue they bind the FD-like bZIP transcription factor OsFD1 thanks to the help of Gf14c, which bridges their interaction, and they form the Florigen Activation Complex (FAC). OsMADS14 and OsMADS15 are FAC targets and they are required for proper flower development. 5 Because the florigens cannot bind the DNA alone, FD-like bZIPs have a crucial role during the floral transition. For this reason, we focused on FACs formation and we characterized different bZIPs involved in the floral transition. We found that in leaves OsFD1-FAC regulates flowering time via positive feedback loops on Hd3a and RFT1 expression. We then characterized OsHBF1, a FD-like bZIP, which generates a negative feedback loop on florigens production via OsHBF1-FAC formation. We isolated the bZIP OsFD4 which promotes the floral transition in the SAM in parallel to OsFD1. OsFD4 interacts with Hd3a and RFT1 in FACs and regulates the expression of OsMADS14 and OsMADS15, such as OsFD1-FAC does. Finally, we performed DAP-sequencing with OsFD1, OsFD4 and OsHBF1 to analyze differences among these bZIPs and to find their targets. Results indicate that bZIPs bind the same consensus motif, but the distance between two motives varies depending on the bZIP considered, suggesting that it could be causal to their different role during the floral transition.

Negli organismi eucaritici fotosintetici il sistema antenna è composto da subunità codificate dalla famiglia multigenica Light harvesting complex (Lhc). Queste proteine sono coinvolte sia nella raccolta della luce che nella fotoprotezione. In particolare, le proteine antenna del PSII, le subunità Lhcb, sembrano essere implicate nel meccanismo di dissipazione termica dell’energia di eccitazione in eccesso (NPQ, Non Photochemical Quenching). Chiarire i dettagli molecolari dell’induzione dell’NPQ nelle piante superiori si è dimostrata essere una grande sfida. Durante il mio dottorato di ricerca, ho deciso di indagare il ruolo delle subunità Lhcb nel quenching dell’energia di eccitazione utilizzando un approccio di genetica inversa: ho ottenuto mutanti privi di ciascuna delle subunità per capire il loro coinvolgimento nel meccanismo. Qui di seguito sono riassunti i principali risultati ottenuti. Sezione A. Mutanti per le subunità monomeriche Lhc e fotoprotezione È stata studiata la funzione delle proteine antenna CP26, CP24 e CP29 nella raccolta della luce e nella regolazione della fotosintesi, mediante l’isolamento di mutanti knockout (ko) di Arabidopsis thaliana che mancano completamente di una o due di queste subunità. In particolare nella sezione A.1 sono trattati i singoli mutanti koCP24, koCP26 e il doppio mutante koCP24/26. Tutte queste tre linee mostrano una ridotta efficienza di trasferimento di energia dai complessi trimerici di raccolta della luce (LHCII) al centro di reazione del fotosistema II (PSII) a causa della disconnessione fisica degli LHCII dal PSII. Abbiamo osservato che il trasporto di elettroni è diminuito nel genotipo koCP24, ma non nelle piante che mancano di CP26: koCP24 ha una diminuita velocità di trasporto elettronico, un più basso gradiente di pH transmembrana, una ridotta capacità di NPQ, e una crescita limitata. Inoltre, i complessi PSII di queste piante sono organizzati in array bidimensionali nelle membrane granali. Sorprendentemente, il doppio koCP24/26 mutante, mancante sia di CP24 che CP26, recupera la capacità di trasporto elettronico, di NPQ e il tasso di crescita ai livelli del WT. Abbiamo quindi approfondito lo studio del mutante koCP24 per comprendere le ragioni di tali alterazioni fenotipiche. L’analisi della cinetica di induzione di fluorescenza e di misure di trasporto di elettroni nei vari passaggi all’interno della catena fotosintetica hanno suggerito che la limitazione nel trasporto degli elettroni in koCP24 è dovuta alla restrizione del trasporto degli elettroni tra i siti QA e QB del PSII, ritardando la diffusione del plastoquinone. Abbiamo concluso che la mancanza di CP24 altera l’organizzazione dei PSII e limita, di conseguenza, la diffusione del plastoquinone. Tale limitazione è ripristinata in koCP24/26. Nella sezione A.2, è descritta la caratterizzazione della funzione della subunità CP29, estendendo l'analisi alle diverse isoforme CP29. A questo scopo, ho ottenuto mutanti knock-out privi di una o più isoforme CP29 ed analizzato la loro capacità fotosintetica e di fotoprotezione. La mancanza di CP29 non comporta alcuna variazione significativa del trasporto elettronico lineare/ciclico e della capacità di transizione di stato, mentre l’efficienza quantica del PSII e la capacità di NPQ risultano alterati. L’efficienza di fotoprotezione è inferiore in koCP29 rispetto sia al WT che ai mutanti che conservano una singola isoforma. È interessante notare che, mentre l’espressione di una delle isoforme CP29.1 o CP29.2 ripristina la capacità di fotoprotezione, l’espressione di solo CP29.3 non porta all’accumulo della proteina né al recupero del fenotipo fotoprotettivo. Sezione B. Riorganizzazione dinamica delle membrane: dissociazione della B4 e identificazione di due siti di quenching. Le subunità antenna sembrano essere il sito del quenching, mentre l'innesco del meccanismo è mediato da PsbS, una subunità del PSII coinvolta nella rilevazione dell’acidificazione lumenale. Abbiamo indagato il meccanismo molecolare attraverso il quale PsbS è in grado di regolare l’efficienza di raccolta della luce, studiando mutanti di Arabidopsis che mancano dei singoli Lhcbs monomerici. Nella Sezione B.1 è mostrato come PsbS è in grado di regolare l'associazione/dissociazione di un complesso membrana di cinque subunità, composto dalle due proteine monomeriche CP29 e CP24 e dal complesso trimerico LHCII-M (Band 4 Complex - B4C). Abbiamo dimostrato che la dissociazione di questo supercomplesso è indispensabile per l'attivazione dell’NPQ in luce alta. Coerentemente, abbiamo scoperto che mutanti knock-out mancanti delle due subunità componenti la B4, koCP24 e koCP29, sono fortemente influenzati nella dissipazione dell’energia. L'osservazione diretta mediante microscopia elettronica ha mostrato che la dissociazione della B4C porta alla ridistribuzione dei PSII all'interno delle membrane granali. Proponiamo che la dissociazione della B4C renda i due siti di quenching, possibilmente CP29 e CP24, disponibili per lo switch a una conformazione quenchiata. Questi cambiamenti sono reversibili e non richiedono la sintesi/degradazione proteica, consentendo in tal modo cambiamenti di dimensione dell'antenna PSII e l'adattamento a rapide variazioni delle condizioni ambientali. Nella sezione B.2 abbiamo studiato questo meccanismo di quenching mediante analisi di fluorescenza ultra-rapida. Recenti risultati sui tempi di vita di fluorescenza in vivo propongono l’attivazione di due siti indipendenti di quenching durante l’NPQ: Q1 si localizza nei complessi LHCII, funzionalmente staccati dal PSII/RC (centro di reazione) con un meccanismo che richiede PsbS ma non Zea; Q2 si trova ed è collegato al complesso PSII, e dipende dalla formazione di Zea. Questi due eventi di quenching potrebbero originarsi in ciascuno dei due domini fisici granali rivelati dall’analisi di microscopia elettronica come precedentemente riportato. Abbiamo quindi studiato la modulazione del quenching in mutanti knock out confrontando i tempi di vita di fluorescenza in condizioni di quenching e non quenching in foglie intatte: abbiamo ottenuto risultati coerenti con il modello di due siti di quenching situati, rispettivamente, nel dominio C2S2 e nel dominio arricchito in LHCII. I dati indicano che il sito Q1 manca nel koCP24 mentre il Q2 è attenuato nel koCP29. Sulla base dei risultati di questa sezione, possiamo concludere che durante l’induzione dell’NPQ in vivo il supercomplex del PSII si dissocia in due frazioni, separate in domini distinti della membrana granale e protetti ciascuno dalla sovra-eccitazione grazie all’attività di siti di quenching localizzati in CP24 e CP29. Sezione C. Trasferimento di energia di eccitazione e organizzazione della membrana: ruolo delle subunità antenna del PSII. In questa sezione è riportato lo studio del ruolo dei singoli complessi antenna fotosintetici di PSII sia nell’organizzazione di membrana che nel trasferimento dell’energia di eccitazione, utilizzando i mutanti knock out precedentemente isolati. Membrane tilacoidali wild-type e dei tre mutanti mancanti dei complessi CP24, CP26 o CP29, sono stati studiati con spettroscopia di fluorescenza rapida, utilizzando combinazioni differenti di lunghezze d'onda di eccitazione e di detection, al fine di separare le cinetiche del PSI e PSII. Tali misurazioni spettroscopiche hanno rivelato che la mancanza di CP26 non ha modificato l'organizzazione del PSII. Al contrario, l'assenza di CP29 e soprattutto di CP24 porta a cambiamenti sostanziali dell'organizzazione del PSII come evidenziato da un aumento significativo del tempo di migrazione apparente, dimostrando una cattiva connessione tra una parte significativa dell’antenna periferica e i RC. Sezione D.
In eukaryotes the photosynthetic antenna system is composed by subunits encoded by the light harvesting complex (Lhc) multigene family. These proteins play a key role in photosynthesis and are involved in both light harvesting and photoprotection. In particular, antenna protein of PSII, the Lhcb subunits, have been proposed to be involved in the mechanism of thermal dissipation of excitation energy in excess (NPQ, non-photochemical quenching). Elucidating the molecular details of NPQ induction in higher plants has proven to be a major challenge. In my phD work, I decided to investigate the role of Lhcbs in energy quenching by using a reverse genetic approach: I knocked out each subunit in order to understand their involvement in the mechanism. Here below the major results obtained are summarized. Section A. Mutants of monomeric Lhc and photoprotection: insights on the role of minor subunits in thermal energy dissipation. In this section I investigate the function of chlorophyll a/b binding antenna proteins, CP26, CP24 and CP29 in light harvesting and regulation of photosynthesis by isolating Arabidopsis thaliana knockout (ko) lines that completely lacked one or two of these proteins. In particular in Section A.1 I focused on single mutant koCP24, koCP26 and double mutant koCP24/26. All these three mutant lines have a decreased efficiency of energy transfer from trimeric light-harvesting complex II (LHCII) to the reaction center of photosystem II (PSII) due to the physical disconnection of LHCII from PSII. We observed that photosynthetic electron transport is affected in koCP24 plants but not in plants lacking CP26: the former mutant has decreased electron transport rates, a lower pH gradient across the grana membranes, a reduced capacity for non-photochemical quenching, and a limited growth. Furthermore, the PSII particles of these plants are organized in unusual two-dimensional arrays in the grana membranes. Surprisingly, the double mutant koCP24/26, lacking both CP24 and CP26 subunits, restores overall electron transport, non-photochemical quenching, and growth rate to wild type levels. We further analysed the koCP24 phenotype to understand the reasons for the photosynthetic defection. Fluorescence induction kinetics and electron transport measurements at selected steps of the photosynthetic chain suggested that koCP24 limitation in electron transport was due to restricted electron transport between QA and QB, which retards plastoquinone diffusion. We conclude that CP24 absence alters PSII organization and consequently limits plastoquinone diffusion. The limitation in plastoquinone diffusion is restore in koCP24/26. In Section A.2 I characterized the function of CP29 subunits, extending the analyses to the different CP29 isoforms. To this aim, I have constructed knock-out mutants lacking one or more Lhcb4 isoforms and analyzed their performance in photosynthesis and photoprotection. We found that lacks of CP29 did not result in any significant alteration in linear/cyclic electron transport rate and maximal extent of state transition, while PSII quantum efficiency and capacity for NPQ were affected. Photoprotection efficiency was lower in koCP29 plants with respect to either WT or mutants retaining a single Lhcb4 isoform. Interestingly, while deletion of either isoforms Lhcb4.1 or Lhcb4.2 get into a compensatory accumulation of the remaining subunit, photoprotection capacity in the double mutant Lhcb4.1/4.2 was not restored by Lhcb4.3 accumulation. Section B. Membrane dynamics and re-organization for the quenching events: B4 dissociation and identification of two distinct quenching sites. Antenna subunits are hypothesized to be the site of energy quenching, while the trigger of the mechanism is mediated by PsbS, a PSII subunit that is involved in detection of luminal acidification. In this section we investigate the molecular mechanism by which PsbS regulates light harvesting efficiency by studying Arabidopsis mutants specifically devoid of individual monomeric Lhcbs. In Section B.1 we showed that PsbS controls the association/dissociation of a five-subunit membrane complex, composed of two monomeric Lhcb proteins, CP29 and CP24 and the trimeric LHCII-M (namely Band 4 Complex - B4C). We demonstrated that the dissociation of this supercomplex is indispensable for the onset of non-photochemical fluorescence quenching in high light. Consistently, we found that knock-out mutants lacking the two subunits participating to the B4C, namely CP24 and CP29, are strongly affected in heat dissipation. Direct observation by electron microscopy showed that B4C dissociation leads to the redistribution of PSII within grana membranes. We interpret these results proposing that the dissociation of B4C makes quenching sites, possibly CP29 and CP24, available for the switch to an energy-quenching conformation. These changes are reversible and do not require protein synthesis/degradation, thus allowing for changes in PSII antenna size and adaptation to rapidly changing environmental conditions. In Section B.2 we studied this quenching mechanism by ultra-fast Chl fluorescence analysis. Recent results based on fluorescence lifetime analysis in vivo proposed that two independent quenching sites are activated during NPQ: Q1 is located in the major LHCII complexes, which are functionally detached from the PSII/RC (reaction centre) supercomplex with a mechanism that strictly requires PsbS but not Zea; Q2 is located in and connected to the PSII complex and is dependent on the Zea formation. These two quenching events could well originate in each of the two physical domains of grana revealed by electron microscopy analysis previously reported. We thus proceeded to investigate the modulation of energy quenching in knock out mutants by comparing the fluorescence lifetimes under quenched and unquenched conditions in intact leaves: we obtained results that are consistent with the model of two quenching sites located, respectively, in the C2S2 domain and in the LHCII-enriched domain. Data reported suggest that Q1 site is released in the koCP24 mutant while Q2 is attenuated in the koCP29 mutant. On the bases of the results of this section, we conclude that during the establishment of NPQ in vivo the PSII supercomplex dissociates into two moieties, which segregates into distinct domain of the grana membrane and are each protected from over-excitation by the activity of quenching sites probably located in CP24 and CP29. Section C. Excitation energy transfer and membrane organization: role of PSII antenna subunits. In this section we investigated the role of individual photosynthetic antenna complexes of PSII both in membrane organization and excitation energy transfer, by using the knock out mutants previously isolated. Thylakoid membranes from wild-type and three mutants lacking light harvesting complexes CP24, CP26 or CP29 respectively, were studied by ps-fluorescence spectroscopy on thylakoids, using different combination of excitation and detection wavelengths in order to separate PSI and PSII kinetics. Spectroscopic measurements revealed that absence of CP26 did not alter PSII organization. In contrast, the absence of CP29 and especially CP24 lead to substantial changes in the PSII organization as evidenced by a significant increase of the apparent migration time, demonstrating a bad connection between a significant part of the peripheral antenna and the RCs. Section D.

The entry into the food chain of excessive amounts of heavy metals, due to the consumption of foodstuffs from crops grown on contaminated soils, is of increasing concern for public health. Among heavy metals, Cd results particularly dangerous since it is easily taken up by roots and translocated to vegetative and reproductive organs of plants without obvious symptoms of phytotoxicity. In particular, Cd can accumulate in grains of cereals such as rice, wheat and barley. The Codex Alimentarius Commission of the Food and Agricultural Organization/World Health Organization set the maximum permissible concentration of Cd for human consumption at 0.1 µg g-1 for cereal grains, excluding rice (0.4 µg g-1). Among the strategies to limit the risk of introducing Cd into the human food chain, the identification and/or constitution of plant genotypes able to exclude the metal from the shoot or from the edible parts seems to be the most promising line of enquiry for the future. Among cereals, barley ranks fourth in terms of both yearly-produced amounts and cultivated area in the world. In recent years, a correlation between presence of barley in the diet and reduced risk of coronary heart diseases has been suggested, inducing a progressive increase in the demand for the cereal in countries where its consumption was traditionally limited. Although some evaluations of genotypic differences in Cd accumulation in barley grain have been described, very little information is available about the physiological basis of the observed variability. Specific aims of the research were: a) to analyze six barley cultivars among the most cultivated in Tunisia for their tolerance to relatively high Cd concentrations and ability to limit the accumulation of the metal in shoot and grain; b) to identify the molecular and physiological basis of the behavior of the two most divergent cultivars, i.e. the highest and the lowest Cd accumulator, in order to develop markers useful in the selection of low-Cd grain cultivars. Among the six Tunisian barley cultivars, a large variability in their sensitiveness to Cd exists. The concentrations of the metal in the roots of plants grown in hydroponic solution in the presence of Cd did not significantly differ among the six cultivars, whereas wide differences were apparent in the shoots, where Lemsi and Manel showed the highest and the lowest values, respectively. Despite similar transpiration fluxes, the six barley cultivars loaded into the xylem and translocated to the shoots different amounts of Cd. A close linear correlation between the concentrations of the metal in the xylem sap and those measured in the shoots was observed. The measurements of concentration-dependent influx of Cd in the roots revealed marked differences between Lemsi and Manel. Lemsi showed a clearer saturable component in the low Cd concentration range; the maximum influx (Vmax) for Cd was about threefold higher in Lemsi. Although the Cd concentrations were not different in the roots of the two cultivars, the amounts of phytochelatins and the ability to retain Cd were lower in Lemsi than in Manel. The different Cd retention in roots between the two cultivars cannot be ascribed to a differential expression of the HvHMA3 gene encoding a tonoplast-localized transporter mediating the vacuolar sequestration of the metal. In detail, the Cd-treatments decreased the steady state levels of HvHMA3 mRNA in the two cultivars at the same extent. Exhaustive extraction combined with a fractionation procedure showed that in the roots of Lemsi the percentage of free non-chelated Cd ions (Cd2+), i.e. the form potentially available for xylem loading , was twice that present in Manel. Since the expression levels of the gene HvHMA2, encoding a protein actively extruding Cd2+ from the parenchyma cell of the root stele towards the xylem vessels, did not differ between Lemsi and Manel, it is reasonable to conclude that the larger amount of metal loaded in the xylem in the former cultivar is due to the higher amount of substrate (Cd2+) available for the HvHMA2 protein. When plants were grown on Cd-contaminated soil, the levels of the metal in the grain, as well as in flag leaves and husk, were higher in Lemsi than in Manel. This suggests that the reallocation of Cd from the leaves to the spike during grain filling does not involve mechanisms able to override the differences imposed by the differential Cd root uptake and root-to-shoot translocation described for the two cultivars. In conclusion, the activity of mechanisms mediating the uptake of Cd into the root, and, particularly, the efficiency of the phytochelatin-dependent system chelating and sequestering Cd in the root, emerge as critical points in controlling low the concentration of Cd in barley.

A high accumulation of proline due to increased synthesis and decreased degradation under a variety of stress conditions, such as salt, drought and metals, has been documented in many plant species (Kavi Kishor et al., 2005). This accumulation (up to 80% of total free amino acids under stress, compared to 5% under normal conditions) seems to have diverse physiological roles, such as acting as a compatible osmolyte for osmotic adjustment, stabilization of proteins, membranes and subcellular structures, buffering cellular redox potential and protecting cellular functions by scavenging reactive oxygen species (ROS) (Kavi Kishor et al., 2005; Ashraf and Foolad, 2007). In plants, proline is synthesized from either glutamate or ornithine (Kavi Kishor et al.,2005; Ashraf and Foolad, 2007). The first two steps of proline biosynthesis from glutamate are catalyzed by a single bifunctional enzyme, δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS), yielding glutamic-γ-semialdehyde (GSA). GSA spontaneously cyclises into pyrroline-5-carboxylate (P5C), that is reduced in turn by P5C reductase (P5CR) to proline (Zhang et al., 1995; Kavi Kishor et al., 2005). Plants also synthesize proline from ornithine, through the activity of ornithine-δ-aminotransferase (δOAT) that transaminates ornithine directly to GSA, which is subsequently converted to proline via P5C (Kavi Kishore et al., 2005). The onset of stress-induced proline accumulation is correlated with transcriptional activation of the gene encoding P5CS, which is believed to represent the key and rate limiting enzyme in this biosynthetic pathway (Stines et al., 1999; Zhang et al., 2008). During recent years a thorough understanding of the mechanisms underlying regulation of Pro biosynthesis has been achieved. However, the role of the catabolic pathway it is still unclear, consisting of two steps sequentially catalyzed by a Pro- and a P5C-dehydrogenase (DH). The oxidative pathway is induced by high intracellular levels of the imino acid; such induction is prevented under hyperosmotic stress conditions (Verbruggen et al., 1996). Besides its obvious role in Pro recycling after the re-establishment of normo-osmotic conditions, no other physiological roles have been up to now identified for the catabolic pathway. Actually, Arabidopsis thaliana knock-out seedlings for either Pro-DH1 or P5C-DH are morphologically undistinguishable from the wild type and show a normal life cycle. The main effect of the impairment of proline catabolism appears to be a hypersensitivity to the amino acid or to its analogues (Deuschle et al., 2004 ; Mani et al., 2002). Indeed, an unexpected result is that an exogenous Pro supply apparently causes phytotoxic effects. Besides necrotic area formation, the production of reactive oxygen species (ROS) and DNA laddering have been reported (Deuschle et al., 2004 ), suggesting the onset of programmed cell death (PCD). In animal systems it is well known that the PRODH gene is early induced by the tumor suppressor protein p53 (Maxwell et al., 2000), that may inhibit growth and trigger PCD; exogenously-supplied P5C may also cause apoptosis. P5CDH was also reported to represent a p53 target, but it seems able to protect cells from oxidative stress and inhibit cell death (Yoon et al., 2004). Human Pro-DH appears to catalyse ROS production directly, depending to substrate availability (Donald et al.,2001), but Pro-DH has never been purified and fully characterized to date from any plant species. On the other hand, an early induction of the gene for P5C-DH has been found in crops undergoing a fungal attack, a response typically observed in the case of compatible interactions (Roberts et al., 1995; Ayliffe et al., 2002). Moreover, Pro accumulation through activation of the biosynthetic pathway has been recently shown in Arabidopsis during incompatible plant-pathogen interactions (Fabro et al., 2004). Thus the possibility exists that Pro metabolism is involved in processes leading to PCD during the hypersensitive reaction. Proline effects have been proposed to be mediated by P5C (Phang et al.,1985; Deuschle et al.,2004 ). However, this seems inconsistent with the severe toxicity that occurs in prod1- mutants and plants expressing antisense ProDH constructs (Mani et al., 2002; Nanjo et al., 2003 ). P5C is the common metabolic intermediate in proline synthesis and catabolism. It is also produced by δOAT, which was recently demonstrated to be localized in the mitochondria (Funck et al., 2008). It is still a matter of debate whether the P5C produced by Arg/Orn catabolism enters proline biosynthesis directly, or it is metabolized to glutamate by mitochondrial P5CDH. Funck and coworkers showed experimental evidence supporting the latter hypothesis. Consistently, the occurrence of a specific P5C transporter has never been reported. This notwithstanding, some authors postulated that P5C can pass the mitochondrial membrane, and that a P5C/Pro cycle mediated by ProDH and P5CR activity can occur (Hu et al., 2007; Miller et al., 2009). Since P5C/Pro cycling is believed to cause ROS production, P5C oxidation by P5CDH would be essential for limiting cycle activity and avoiding ROS-induced damage (Miller et al., 2009). In Arabidopsis thaliana a single gene is present for both enzymes utilizing P5C as a substrate, namely P5CR and P5CDH. Until now, neither gene product has been purified in this species. Moreover, no obvious correlations between mRNA and protein levels and a RNA silencing-based regulatory mechanism were described for P5CR and P5CDH, respectively. The P5CR mRNA contains a non-coding region in the 5’ untranslated region (UTR) that at the same time mediates transcript stabilization and translation inhibition during salt and heat stress (Hua et al., 2001). Arabidopsis P5CDH has been found to be associated with another gene, which is partially overlapping on the complementary strand. The transcription of this gene is up-regulated under salt stress conditions, with a consequent production and processing of dsRNA. Short interfering RNA being able to downregulate P5CDH are generated from this process (Borsani et al., 2005). Although many physiological studies suggested that proline may be implicated in multiple stress protection mechanisms, it is also evident that proline accumulation does not represent a response conferring tolerance per se. Accordingly, several salt- and cold-hypersensitive Arabidopsis mutants accumulate proline at high levels without any apparent beneficial effect on stress tolerance (Liu and Zhu, 1997). Therefore, a proper understanding of how proline accumulation influences particular regulatory pathways in complex stress responses still requires many efforts (Maggio et al., 2002). Aiming at a better comprehension of the role of proline in plant stress response, Arabidopsis was selected as the experimental system. In this weed, P5CDH and P5CR are present as single genes, a feature that may simplify the analysis of expression patterns. Moreover, the availability of a lot of molecular data as well as the fully sequenced genome provide useful tools for the investigation. However, proper evaluations would be hampered in planta by the small size of Arabidopsis seedlings, a drawback that most likely explains why the proteins involved in proline metabolism have not been purified to date. On the other side, in differentiated plants inter-tissue transport, exclusion mechanisms and cell compartmentalization of proline do occur. As a consequence, it is difficult to know the exact conditions (i.e., ionic vs osmotic, extra- and intracellular concentrations, pressure values) to which a single cell is exposed. The availability of suitable experimental systems to quantify resistance to realistic and reproducible low water potential, or salt and freezing stress conditions is well recognized as a crucial point in genetic studies (Verslues et al., 2006). Suspension cultured cells may represent one of these systems. The possibility of using p5cdh seeds, kindly provided by Dr Dietmar Funck (Konstanz, Germany), was a further stimulus to establish cell suspension cultures from A. thaliana seedlings. Two well dispersed cultures were obtained, and used to evaluate cell responses to various experimental conditions, mainly focusing on the metabolic role of the possible effector of Pro toxicity, P5C.

Le ammine biogene tiramina (TA) ed octopamina (OA) sono sostanze neurochimiche, essenziali negli invertebrati, che agiscono come sostituti dell'adrenalina e della noradrenalina. TA ed OA esercitano i loro effetti legando specifici recettori che appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine G. I recettori tiramici (TAR) ed octopaminici (OAR) svolgono un ruolo importante nel modulare la biologia, la fisiologia e il comportamento degli insetti. In questa tesi di dottorato viene descritta la caratterizzazione del recettore della tiramina di tipo 1 (TAR1) in due insetti nocivi per le piante, Drosophila suzukii e Halyomorpha halys, con lo scopo di investigare il ruolo che il recettore esercita nel controllo dei tratti fisiologici e comportamentali oltre che testare TAR1 come possibile bersaglio per biopesticidi. Il TAR1 di D. suzukii si è rivelato un interessante bersaglio per biopesticidi, nello specifico i monoterpeni. Questi composti sono stati in grado di modulare quegli aspetti fisiologici e comportamentali di D. suzukii direttamente controllati da TAR1. In H. halys, la downregolazione di TAR1 attraverso RNAi ha evidenziato un possibile coinvolgimento del recettore nella percezione dei feromoni. Insieme, i dati presentati mostrano come TAR1 sia cruciale nel controllo di numerosi aspetti fisiologici e comportamentali degli insetti. Inoltre, questo recettore sembra essere un bersaglio per approcci innovativi e rispettosi dell'ambiente nel controllo dei parassiti.
The biogenic amines tyramine (TA) and octopamine (OA) are neurochemicals essential in invertebrates that act as adrenaline and noradrenaline substitutes. They exert their effects by binding specific receptor proteins that belong to the superfamily of G-protein coupled receptors. Tyramine (TAR) and octopamine (OAR) receptors play important roles in modulating the biology, physiology and behavior of insect. This PhD thesis describes the characterization of the type 1 tyramine receptor (TAR1) in two insect pests, Drosophila suzukii and Halyomorpha halys, to dissect the receptor role in controlling physiological and behavioral traits as well as to examine TAR1 as possible target for biopesticides. D. suzukii TAR1 proved to be an interesting target for biopesticides, such as monoterpenes. These compounds were in fact able to modulate directly TAR1-controlled physiology and behavior. In H. halys, RNAi-mediated TAR1 downregulation suggested that the receptor involvement in pheromone perception. Together, the data described emphasize TAR1 as crucial in controlling and defining physiological and behavioral aspects in insects. Furthermore, this receptor appears an interesting target for innovative and environmental friendly in pest control.

Inflorescence architecture is a key agronomical trait that determines fruit and seed yield. Understanding the genetic basis of inflorescence architecture will not only contribute to elucidate crop evolution/domestication mechanisms but also improve crop grain yield. Flowering plants develop different types of inflorescences, such as racemes in Arabidopsis and panicles in rice. The architecture is established during the early stages of reproductive development and it is determined by the activity of different meristem types and by the timing of the transition between indeterminate meristems to determinate ones. Inflorescence development is finely regulated by a genetic network that includes meristem identity genes and genes that regulate their expression; many genes are already known but others have still to be characterized to provide insight into how this complex process is controlled. Transcriptomic analysis performed in rice and in Arabidopsis through laser microdissection of different meristematic tissues highlighted differentially expressed genes belonging to the ALOG family suggesting their role in inflorescence patterning. We focus on G1L1, G1L2, and G1L5 of rice and on LSH1, LSH3, and LSH4 of Arabidopsis. G1L5 is already known to be a major regulator of inflorescence architecture, whereas LSH3 and LSH4 seem to have a role in meristem maintenance and organogenesis. Their expression profiles were analyzed by qRT-PCR and RNA in situ hybridization experiments using meristematic tissues from both species. We are also generating single and double/triple K.O mutants in different combinations by CRISPR-Cas9 genome editing technology to have a better understanding of their role in inflorescence patterning. The data so far obtained demonstrate the role of G1L1 and G1L2 in inflorescence branching and spikelet number determination and we also propose a role for G1L2 in root development. Furthermore, LSH1 seems to be involved in meristem maintenance and organ differentiation, and LSH3 in stem elongation. We propose the hypothesis that LSH1, LSH3, and LSH4 play a redundant function in inflorescence development.

The transition from a vegetative phase to a reproductive one has always been deeply studied in plants and in particular in the cereals due to the relevance of this trait for seed yield. The transition occurs upon the arrival of a mobile flowering signal, the florigen, at the shoot apical meristem (SAM). In rice (Oryza sativa), there are two different florigens: Heading Date 3a (Hd3a), that promotes flowering in short day (SD) conditions and Rice Flowering Locus T 1 (RFT1) that promotes flowering in both short and long- days (LD). They are transcribed and translated in leaves once environmental conditions are optimal, and then transported through the phloem to the SAM. After reaching the shoot they form a heterohexameric complex named Florigen Activation Complex (FAC) binding to two 14-3-3 proteins and to two bZIP transcription factors and activate conversion of the shoot apex into an inflorescence by promoting expression of inflorescence- identity genes. Here, we show that Hd3a and RFT1 arrival at the SAM activates FLOWERING LOCUS T-LIKE 1 (FT-L1), encoding a third florigen-like protein showing atypical characteristics. Expression data from qRT-PCR, in situ hybridization and transcriptional marker lines indicated that its mRNA is mainly expressed in the SAM and persists during all developmental stages of inflorescence development. Misexpression of FT-L1 from meristem- and tissue-specific promoters indicates that only when expressed in the SAM, FT-L1 has florigenic activity. Isolation and analysis of EMS and CRISPR mutants showed that FT-L1 strengthens the effects of Hd3a and RFT1 during conversion of the vegetative meristem into inflorescence, in an addictive manner. Furthermore, it controls panicle branching by inhibiting secondary branching and promoting spikelet meristem differentiation. Thus, we propose a triple florigenic module that promotes a balanced progression of inflorescence identity and determinacy.

Several environmental and endogenous stimuli activate plant signal transduction pathways through transient increases in cytosolic free calcium concentrations ([Ca2+]cyt). Strong evidence indicates that plant response specificity is triggered by the amplitude, shape, frequency and localization of these stimulus-induced Ca2+ oscillations. Due to their role in Ca2+ efflux from the cytosol, plant auto-inhibited Ca2+-ATPases (ACAs) are involved in restoring the cytosolic basal concentration of Ca2+ after its rise due to stimulus perception, therefore affecting the specificity of plant response to different stimuli. Ten ACA isoforms are present in Arabidopsis thaliana, which are divided into four clusters based on gene structure and sequence homology. Cluster I, II and IV ACAs share a common mechanism of regulation based on a N-terminal auto-inhibitory domain whose action is suppressed by the interaction with the Ca2+-sensor protein calmodulin (CaM). Cluster III isoforms (ACA12 and ACA13) compared to the other ACAs, are almost unknown and show unique features at sequence and expression levels: in particular ACA12 and ACA13 show divergences in residues involved in CaM binding and regulation while the expression levels, normally very low, are increased upon exposure to pathogens or UV stresses. By confocal microscopy, a GFP-tagged ACA12 (expressed in Arabidopsis plants) was localized at the plasma membrane (PM). ACA12 was then expressed in Saccharomyces cerevisiae strain K616, which lacks endogenous Ca2+ pumps. Our results reveal that ACA12 allows the grow of K616 in a Ca2+-depleted medium, therefore indicating that it is a functional and deregulated Ca2+ transporter. Yeast-expressed ACA12 was then purified by CaM-affinity chromatography and its activity was tested in vitro in order to study its biochemical properties. Biochemical assays results show that ACA12 is a functional Ca2+-ATPase. Moreover, as expected, its activity is not regulated by CaM. Finally, in order to try to explain ACA12 deregulated behaviour, single point mutants of ACA12 were generated and tested for K616 phenotype complementation. Taken together our results show that ACA12 has unique biochemical features suggesting for it a distinctive physiological role within the ACA family. In particular ACA12 may be involved in Ca2+-dependent signaling pathways in response to plant specific stresses such as pathogens and UV.

In the trees, water moves through a negative pressure gradient established between roots and leaves, through a network of xylem cells whose length can reach the order of magnitude of 100 meters in the higher plants on the planet. The grandeur of the transport system involves the need for the plant to implement some tricks to cope with the increasing hydraulic resistance related with the dramatic lengthening of the water path throughout the ontogeny. That is to say that the increase in plant height is accompanied by a consequent increase of the total hydraulic resistance within the xylem conduits. The most effective solution to contain the increase of hydraulic resistance seems to be the tapering of the conduit elements. The introduction by WBE (West, Brown, Enquist 1997, 1999) model of the hypothesis of universality of the degree of xylem conduit tapering in vascular plants, leads to introduce a threshold value of the "optimal" degree of tapering such that the hydraulic resistance of a path is approximately constant regardless of its length (the conduit is always potentially capable of growing). It was therefore suggested that the nature of hydraulic limitations to growth in plant height may be the result of a sub-optimality of the degree of tapering caused by the physical inability to increase cell diameter at the base indefinitely. Alternatively, it is possible that a sub-optimality of the overall transportation system can occur at some point of the development in height (and therefore in length and volume of xylem conduits) due to the impossibility of maintaining a state of optimum equilibrium of the conduction system, designed as a transport network optimized (Banavar, Maritan, Rinaldo 1999) when the volume of service inside the network and the hydraulic resistance resulting in the displacement of this volume, are both minimized in a logical solution of a minimum equilibrium bound problem. One of the objectives of this work has been put together two of the main models proposed recently to the attention of the scientific community (the WBE model and the model BMR) and to collect them in the development of a new unique model, to try to answer the fundamental question implied in this research topic: "which factors causes the plants to stop growing in height?".
All'interno degli alberi, l'acqua si muove per mezzo di un gradiente negativo di pressione, che si instaura tra le radici e le foglie, attraverso una rete di cellule xilematiche la cui lunghezza può raggiungere l'ordine di grandezza di 100 metri nelle piante più alte del pianeta. Questa imponenza del sistema di trasporto comporta la necessità da parte della pianta di porre in atto degli stratagemmi per far fronte alla crescente resistenza idraulica che si sviluppa assieme al drastico allungamento di percorso idrico durante tutta l'ontogenesi. Vale a dire che l'aumento in altezza delle piante è accompagnato da un conseguente aumento di resistenza idraulica all'interno dello xilema. La più efficace delle soluzioni per contenere questo aumento di resistenza idraulica sembrerebbe essere la rastremazione degli elementi di conduzione. L'introduzione da parte del modello WBE (West, Brown, Enquist 1997, 1999) dell'ipotesi di universalità del grado di rastremazione dei condotti xilematici nelle piante vascolari, porta ad introdurre una soglia di rastremazione "ottimale" tale da rendere all'incirca costante la resistenza idraulica di un percorso a prescindere dalla sua lunghezza (potenzialmente sempre suscettibile di crescita). E' stato dunque ipotizzato che le limitazioni di natura idraulica alla crescita in altezza delle piante possano essere conseguenti all'insorgere di una sub-ottimalità del grado di rastremazione dei condotti proveniente dall'impossibilità fisica di aumentare indefinitamente il loro diametro alla base, od in alternativa che una sub-ottimalità generale del sistema di trasporto idraulico all'interno della pianta possa manifestarsi ad un certo punto dello sviluppo in altezza (e quindi in lunghezza ed in volume dei condotti xilematici) in conseguenza alla non possibilità di mantenimento di uno stato d'equilibrio ottimo del sistema di conduzione, pensato come una rete di trasporto ottimizzata (Banavar, Maritan, Rinaldo 1999) in cui il volume di servizio presente all'interno della rete e la resistenza idraulica conseguente allo spostamento di tale volume, siano entrambi minimizzati in una logica di soluzione d'equilibrio di minimo vincolato. Uno degli obiettivi di questo lavoro è stato mettere assieme due dei principali modelli recentemente proposti all'attenzione della comunità scientifica (il modello WBE ed il modello BMR) e di raccogliere nello sviluppo di un nuovo unico modello di scala le ipotesi e le intuizioni principali dei due, per cercare di dare una risposta alla domanda fondamentale sott'intesa in questo argomento di ricerca: "per l'insorgenza di quali fattori le piante smettono di crescere in altezza?".

Many fruit species bear an abundance of flowers producing a surplus of fruits that the tree is unable to support. In anticipation of this, the major fruit species developed an immature fruit (fruitlet) physiological drop as a self-regulatory mechanism. This process is, at least in part, a consequence of the competition among fruits and between fruits and shoots for carbon assimilates. The self-regulatory mechanism responsible for the immature apple fruit shedding may be magnified by chemicals such as naphthaleneacetic acid (NAA) and its amide (NAD), and benzylaminopurine (BA) sprayed within 5-6 weeks after full bloom. The thinning action of bioregulators is quite variable and depends on environmental conditions and genotypes. In apple, there are varieties easy to thin and others difficult even though different chemicals or combinations of them are used. Understanding the molecular mechanisms and processes involved in abscission might help in finding new approaches and new chemical thinners to control abscission in fruit, or new self-thinning varieties. The described research was aimed to elucidate the molecular events underlying the in planta fruitlet abscission, taking into account the characteristics of this system and the practical importance of thinning in apple. Fruit drop is due to the activation of specific abscission zones (AZs). It is accepted that abscission is a highly regulated developmental process that is both influenced and activated in response to internal cues and/or environmental conditions. Nevertheless, the identity of the signals responsible for the activation of the AZ is as yet unknown. Among phytohormones, ethylene enhances abscission in several species and systems as well as in apple, while auxins produced by seeds are thought to desensitize AZs to ethylene and prevent abscission. In apple trees, the fruitlet physiological drop is due to the activation of the AZ located at the junction of the peduncle into the twig. In this region four lateral (LF) and one central (CF) fruitlets and the shoot are inserted. The CF comes from the pollinated king flower (KF) that, since it blooms earlier within the cluster, originates a fruitlet larger than the lateral ones. During the physiological drop, the shoot at cluster side, is thought to be a sink in competition with fruitlets for assimilate supply. Considering that seeds and/or fruits are involved in determining the shedding signal while the morphogenetic response occurs always at the AZ level, it is crucial to analyse the whole fruitlet system involved in abscission that should include concurrently seed, cortex, peduncle, and AZ. It is generally believed that the interaction between ethylene and auxin plays a major regulatory role in abscission. Starting from this, a mass gene approach was used in this work to identify genes regulating or involved in abscission. The cDNA-AFLP technique was adopted for transcriptional profiling of differentially expressed genes during apple fruitlet abscission. This allowed the isolation of 278 differential clones by comparing expression profiles of abscising (AF) versus non-abscising (NAF) fruitlet populations. AFs were obtained from lateral fruitlets of trees sprayed with benzylaminopurine (BA) at 200 ppm, 17 days after petal fall (APF) when the fruit cross diameter was about 10-12 mm. NAF originated from central flowers grown in clusters where all the lateral flowers had been removed at bloom. All ESTs (expressed sequence tags) obtained have been annotated with the Gene Ontology vocabulary and grouped according to cellular components, biological processes and molecular functions. Considering the cellular components, the most affected genes in the cortex were related to mitochondrion, plastid and membranes. Concerning the molecular functions, the mostly affected ones were the binding and the transferase activities in the cortex, the hydrolase and transport activities in the seed, and the binding activity in the peduncle. Considering the biological process, in the cortex the most abundant genes were those controlling transport, protein and carbohydrate metabolism. As a general remark, taking into account all the three ontology criteria, it appeared that a prominent up-regulation occurred in the seed. This might be consistent with the determinant role attributed to the seed in the regulation of fruit abscission. The expression and functional analyses of the most interesting clones were carried out by semiquantitative RT-PCR on agarose gel on cDNA obtained from seeds, cortex, peduncles and AZs of AFs and NAFs. Expression analyses confirmed the efficacy of the cDNA-AFLP approach to find a large amount of differentially expressed ESTs and the involvement of the studied genes in regulating the abscission and senescence processes. In particular the differential expression of sugar-metabolism and signalling related genes confirmed the importance of carbohydrates, together with hormones, in controlling the induction of AZs. Since functional studies through silencing or overexpression approaches cannot be easily performed on trees, additional experiments were carried out in Arabidopsis thaliana to investigate the participation of these and other genes in abscission. To this end, Arabidopsis genes putatively homologous to those differentially expressed in relation to fruitlet abscission in apple were identified. A dual approach was chosen to study their function in abscission. In a first attempt, insertional (T-DNA) homozygous mutants were obtained and scored for the presence of abscission-related phenotypes. Probably due to gene redundancy, no phenotypes were detected. Therefore, expression analyses were carried out on the same genes with real time RT-PCR on abscission zones of known Arabidopsis mutants with delayed (dab4-1, dab5-1) or no petal abscission (ida). The results showed a different pattern of expression in comparison to that found in wild type and confirmed an involvement of these genes in abscission. Current work is devoted to further characterise the putative role played by these genes in regulating the abscission of flower organs in Arabidopsis. In addition, a "systematic" approach for the analysis of the whole apple fruitlet abscission transcriptome is needed. To this end an apple microarray is being developed from the large number of already available ESTs, to be used for screening of new chemical thinners and for marker assisted selection of self thinning genotypes.

In the central nervous system, ionotropic Glutamate Receptors (iGluRs) are tetrameric ligand-gated non-selective cation channels. They have been linked to learning and memory as well as to neurodegenerative pathologies such as Alzheimer disease. Thus, they are among the best characterized channels in animals. Animals and plants share this class of proteins. Plant Glutamate Receptors-like (GLRs) have been implicated in stomata movement regulation, pollen tube growth, long-distance signalling, root development and defence against pathogens. However, to date few details are known about their basic properties and functions, such as binding activity, ion transportation, sub-cellular localization, subunits interaction, desensitization etc. My PhD project focused on two GLR isoforms in Arabidopsis thaliana, AtGLR3.3 and AtGLR3.7 (hereafter called ‘AtGLR3.x’). Being putative amino acids-gated Ca2+-permeable channels, I tested the hypothesis that the two isoforms could handle Ca2+ dynamics upon amino acids challenge. Remarkably, Arabidopsis Col-0 plants show a transient elevation of cytosolic Ca2+ at the root tip meristematic zone upon amino acids treatment. Ablation of the AtGLR3.3 abolished the increase of Ca2+ concentration whereas loss of-function mutants for AtGLR3.7 showed enhanced Ca2+ rises in response to amino acids. Additionally, when the double mutant glr3.3glr3.7 was challenged with amino acids, mirrored the glr3.3 null-response. These results strongly suggested that the two AtGLRs could assemble in a channel where GLR3.3 would act as main scaffold and GLR3.7 would negatively regulate the biophysical properties. Being AtGLR3.x also expressed in the vascular tissues and in the cells of the floral abscission zone, we also assayed the role of AtGLR3.x in the generation/propagation of long-distance Ca2+ waves that occurs between stems and inflorescence apexes of Arabidopsis plants subjected to flaming. In the future, our efforts will be aimed at understanding whether the predicted amino acid sensing of GLRs is also required for the long-distance signalization.

Durante il Precambriano, le variazioni di SO42- negli oceani sono state così importanti da ipotizzare che la disponibilità di S abbia influenzato l’evoluzione del fitoplancton. Ho investigato come la regolazione del suo metabolismo nei cianobatteri possa essere cambiata nel tempo, concentrandomi sul primo step della catena assimilativa controllato dalla ATP sulforilasi (ATPS). I cambiamenti ambientali preistorici hanno influenzato la chimica oceanica portando ad un aumento del SO42- disponibile, a una diminuzione del Fe disciolto e ad un aumento nel consumo di equivalenti riducenti. Questi fattori avrebbero potuto influenzare l'uso di equivalenti riducenti negli organismi unicellulari primitivi, con evidenti ripercussioni sulla regolazione del metabolismo e sulla distribuzione delle risorse. Poiché la prima produzione primaria dipendeva principalmente dai cianobatteri fotossigenici, mi sono concentrata su di essi, studiandone le prestazioni fisiologiche, la composizione chimica e la ripartizione di risorse in ambiente proterozoico ricostruito e in quello moderno. Per comprendere l'impatto che i cambiamenti ambientali potrebbero aver avuto sull'ecologia degli oceani, ho analizzato le conseguenze sulla qualità della biomassa cianobatterica. I risultati ottenuti indicano 1) che le variazioni della disponibilità di O2 influenzano il tasso di crescita nei cianobatteri, 2) che la limitazione dei nutrienti unita alla variazione del potere riducente disponibile ha un effetto sull'attività delle ATPS (la concentrazione di nutrienti sembra avere un effetto più forte), e 3) che la limitazione dei nutrienti influenza l'assimilazione degli elementi e il pool macromolecolare. È possibile concludere che l'ossigenazione del pianeta potrebbe non essere stata l'unico vincolo evolutivo per lo sviluppo di una regolazione redox nelle ATPS. Inoltre i risultati biochimici supportano la teoria per cui i cianobatteri evolvendosiin acqua dolce hanno conquistato solo secondariamente l'oceano.
During Precambrian, sulfate variations were so strong that one hypothesis guesses that S availability influenced phytoplankton evolution/radiation in the oceans. Considering this concept, I investigated how sulfate metabolism regulation in cyanobacteria may have changed through geological times focusing on the first step of the S assimilation pathway, which is controlled by the ATP sulfurylase (ATPS) protein. Precambrian environmental changes caused variation in the ocean chemistry, leading to an increase of sulfate availability, a decrease of dissolved Fe and, an increase in sinks for reducing equivalents in cell metabolism. Since all these factors could have influenced the usage of reducing equivalents in primitive unicellular organisms, evident repercussions on their metabolism regulation and resource/energy allocation/distribution are ensuing. Since the early primary production mostly depended on photo-oxygenic cyanobacteria, I focused on them studying their physiological performance, their chemical composition, and their resource and energy partitioning in the reconstructed proterozoic environment and in the modern one. To understand the impact that environmental changes may have had on ocean ecology, I also studied consequences on cyanobacterial biomass quality, to comprehend the consequences on the trophic webs. Present results point out that (1) oxygen availability variations influence growth rate in cyanobacteria, (2) nutrient limitation combined with redox power variation has an effect on the ATPS activity, but the nutrient concentration seems to be the strongest one, (3) nutrient limitation influences elements assimilation and macromolecular pool in cyanobacteria. It is possible to conclude that the oxygenation of the planet may not have been the only evolutive constraint for redox regulation in ATPS enzymes. Moreover, biochemical results support the theory stating cyanobacteria evolved in the freshwater environment and only secondly conquered the ocean.

The current global economy development trends strongly rely on fossil fuels exploitation, which are responsible for a net greenhouse gases (e.g. CO2) release in the atmosphere. In 2014, the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) stated that this net atmospheric CO2 increase is anthropogenic, and it will lead to the rising of the global temperature of > 2 °C, before the end of this century. The latter will strongly contribute to change the behavior of climate and oceans (e.g. leading to their acidification and oxygenation) in a permanent way, with a consequent magnification of the demographic pressures on food and water security, as well as on several ecosystems functional bio-diversity. To avoid this apocalyptic scenario, the development of renewable and clean energy sources to sustain a consistent part of the global economy is an unavoidable challenge for our society. A plant biomass-based economy could meet this need, but several studies predicted a food prices inflation and a concrete carbon debt, as consequence of this scenario. On the contrary, the exploitation of microalgae biomass could indeed avoid these issues and bring a positive effect on atmospheric CO2 levels, leading to its sequestration and fixation in organic carbon. Currently, microalgae are indeed the best CO2 sequestering organisms, thanks to higher photosynthetic rates with respect to plants. Their ability to grow on marginal lands and use wastewaters opens the doors for their application as environment-impact mitigating agents of current industrial processes. Their exploitation could be indeed the key for the development of an integrate process in which the biomass would be used to convert the majority of the current economy toward environmental-friendly processes. Despite this promising scenario, mainly wild type microalgae species are currently available for these purposes. Their evolution in a natural environment, different from the artificial one exploited during their intensive industrial cultivation, strongly impairs their theoretical biomass productivities, leading to unsatisfactory values. The development of an algae-based economy indeed depends on the efficient conversion of light energy into biomass and the optimization of metabolic pathways to maximize the synthesis of the products of interest. Still far from the development of an economically competitive and energetically sustainable microalgae industrial cultivation, these organisms therefore need to undergo a biotechnological optimization to achieve the competitiveness threshold. Although there isn’t an ideal species that could serve to meet all human needs, we focused on the seawater species Nannochloropsis gaditana, which is a promising candidate for both basic biological and applied investigations. The following PhD thesis was conceived to provide a molecular insight on N. gaditana photosynthetic efficiency and metabolic regulation, to provide the molecular targets for its biotechnological improvement. The prerequisite of this experimental work was the optimization of the currently available molecular toolkit for N. gaditana genetic manipulation and also the available molecular information was therefore significantly improved. In chapter II random mutagenesis approaches were performed in order to isolate mutant strains with photosynthetic phenotypes, likely more suitable for intensive growth conditions. Selected strains indeed showed an improved photosynthesis in limiting growth conditions, also serving as biological tools to improve the available information on the underlying molecular elements controlling light-use efficiency in this organism. When tested in lab-scale growth conditions, the strain E2, selected for a reduction in its Chl content, indeed showed an improved biomass productivity, therefore representing a proof of concept for the developed biotechnological approaches, to able to improve the photosynthetic performances of this organism in the artificial environment of a photobioreactor. Among the isolated mutant strains, in chapter III two major photosynthetic phenotypes, the reduction in the Chl content (strain E2) and the inability to activate NPQ (strain I48), were chosen as selection criteria to improve light penetration and energy conversion mechanisms, respectively, in an intensive culture. Both indeed showed an enhanced biomass productivity in industrial-simulating cultures, proving the theoretical advantage underneath their exploitation. However, when the growth conditions changed, leading to altering the light availability, the selected mutants altered their behavior. They weren’t able of performing better than the WT in all the tested conditions. This would explain why the data published to date for the same mutants in other species often provided contrasting results. We concluded that photosynthetic mutants can modulate their phenotype in relation to the growth conditions and some of the latter could indeed highlight their drawbacks rather than their benefits, therefore the genetic engineering efforts have to be tailored properly to the growth conditions used. The forward genetics strategy here developed could open the doors toward the identification of the molecular basis regulating photosynthesis in this promising species. In chapter IV mutant strain I48 was further investigate for the identification of the genetic basis of its phenotype. Thanks to the whole genome re-sequencing we identified a splicing variant in the 5’-donor splicing site of the 4th intron of the gene Naga_100173g12, which encodes for the LHCX1 protein. This mutation caused the retention of the intron sequence, leading to a truncated protein product, which is likely degraded. The absence of the LHCX1 protein strongly correlates with inability to activate NPQ, since this proteins clade is well known to be involved in the activation of this mechanism. However, the future complementation of the phenotype will serve to validate this conclusion. Moreover, the LHCX1 protein was found co-localized with the PSI in N. gaditana, therefore strain I48 could also serve as an optimal tool to investigate further its biological role. To develop an efficient biotechnological optimization strategy, the information on the metabolism regulation of N. gaditana has to be highly enriched. Understanding the metabolic fluxes direction could lead to specifically affect those involved in a specific product accumulation, without affecting other pathways, leading to a possible negative impact on growth. In chapter V an integrated analysis of genome-wide, biochemical and physiological approaches helped us in deciphering the metabolic remodeling of N. gaditana that switches its metabolism toward a greater lipid production in excess light conditions. The latter indeed induced the accumulation of DAGs and TAGs, together with the up-regulation of genes involved in their biosynthesis. We saw the induction of cytosolic fatty acids synthase (FAS1) genes and the down-regulation of those of the chloroplast (FAS2). Lipid accumulation is accompanied by the regulation of triose phosphate/inorganic phosphate transport across the chloroplast membranes, tuning the carbon metabolic allocation between cell compartments and favoring the cytoplasm and endoplasmic reticulum at the expense of the chloroplast. This highlighted the flexibility of N. gaditana metabolism to respond to environmental needs. In chapter VI the information gained from the latter work was exploited to test the potentiality of this prosing species also as protein expression platform. We built up a modular system for protein overexpression in which the regulatory sequences were chosen among those which revealed to induce a high level of transcription or to be highly regulated by light availability. N. gaditana revealed to be a very promising host for protein expression, given the higher luciferase activity monitored with respect to the reference species for these applications, C. reinhardtii. A method to test the efficacy of several regulatory sequences in driving proteins expression was developed, as well as several expression vectors, which are ready to be tested. The investigation of the N. gaditana metabolism regulation in chapter V, showed a fine tuning of its photosynthetic apparatus components, in different light conditions. Focusing on LHC proteins we identified a new LHCX protein in this species, called LHCX3 (GENE ID: Naga_101036g3), whose gene coding sequence wasn’t annotated correctly. In chapter VII the correct coding sequence of this gene was further investigated and experimentally validated with molecular techniques. The LHCX3 protein revealed to be fused with an N-terminal fasciclin I-like domain and a sequence analysis together with a preliminary evolution study was performed to infer the biological role of this association. Since algae metabolism entirely relies on light availability, the importance of investigating the light intensity effect on growth is seminal for their industrial application. In chapter VIII we developed a micro-scale platform, that we called micro-photobioreactor, to easy investigate the impact of light intensity on N. gaditana growth. We were able to test the effect of different light regimes, simultaneously, also on the photosynthetic performances in an integrate system which could be merged with nutrients availability studies, speeding up the N. gaditana characterization process. Three appendix sections are also included in the thesis in which some of the experimental techniques exploited in this work were applied to different organisms toward the common target of investigating light-use efficiency and the molecular elements involved in its regulation. In appendix I, the development of a mathematical prediction model for growth and fluorescence data of the species Nannochloropsis salina was described. The work was carried out in collaboration with Prof. Fabrizio Bezzo of the industrial engineering department of the University of Padova. The development of behavior prediction models representing the phenomena affecting algae growth, could be very helpful in designing and optimizing the production systems at industrial level. The developed model well represented N. salina growth over a wide range of light intensities, and could be further implemented to describe also the influence on growth of other parameters, such as nutrients availability and mixing. In appendix II, the monitoring of the in vivo chlorophyll fluorescence was exploited to study the photosynthetic features of rice plants exposed to salt stress conditions. The presented results are part of a wider project (in collaboration with Prof. Fiorella Lo Schiavo from the biology department of the University of Padova), aiming to depict the physiological, biochemical and molecular remodeling, undergoing in one of the major food crop in the world, in response to salt stress conditions. Depicting the impact of environmental stresses on photosynthesis is seminal to control biomass productivity since plants metabolism strongly relies on the former for growth. We showed the activation of the NPQ mechanism in salt tolerant plants, highlighting the importance of photosynthetic features monitoring to predict plants performances, directly on the field. In appendix III, Chlamydomonas reinhardtii 13C – 15N labeled thylakoids were isolated from the cw15 and npq2 mutant strain in order to study their structure and dynamics in term of protein and lipid components in situ, by applying the solid-state NMR technique, in collaboration with Prof. Anjali Pandit group from the Leiden Institute of Chemistry. These analyses will serve to investigate the photosynthetic membranes remodeling that undergoes from an active (cw15 strain) to a photo-protective state (npq 2 mutant strain), during the switch toward excess light conditions, with the final aim to understand the biochemical processes regulating this event.
Le attuali tendenze di sviluppo economico mondiale si basano fortemente sullo sfruttamento di combustibili fossili, che sono responsabili di un netto rilascio di gas serra (ad esempio CO2) nell'atmosfera. Nel 2014, il gruppo intergovernativo di esperti sui cambiamenti climatici (IPCC), ha dichiarato che questo incremento netto di CO2 atmosferica è di origine antropogenica, e che porterà all’aumento della temperatura globale di > 2 °C, prima della fine di questo secolo. Quest'ultimo contribuirà fortemente alla modifica del comportamento del clima e degli oceani (ad esempio portando alla loro acidificazione ed ossigenazione) in modo permanente, con conseguente aumento delle pressioni demografiche sulla sicurezza alimentare e idrica, nonché sulla bio-diversità funzionale di diversi ecosistemi. Per evitare questo scenario apocalittico, lo sviluppo di fonti energetiche rinnovabili e pulite per sostenere una parte consistente dell'economia globale è una sfida inevitabile per la nostra società. Un'economia basata sulla biomassa vegetale potrebbe soddisfare questa esigenza, ma diversi studi hanno previsto un’inflazione dei prezzi alimentari e un concreto debito di carbonio, come conseguenza di questo scenario. Al contrario, lo sfruttamento della biomassa delle microalghe potrebbe in realtà evitare questi problemi e portare ad un effetto positivo sui livelli di CO2, portando al suo sequestro e fissazione in carbonio organico. Attualmente, le microalghe sono infatti i migliori organismi capaci di sequestrare la CO2, grazie a tassi fotosintetici più elevati rispetto alle piante. La loro capacità di crescere su terreni marginali e sfruttando le acque di scarto apre le porte per la loro applicazione come agenti in grado di mitigare l’impatto ambientale degli attuali processi industriali. Il loro impiego potrebbe essere infatti la chiave per lo sviluppo di un processo integrato in cui la biomassa dovrebbe essere usata per convertire la maggior dell'economia attuale verso processi rispettosi dell'ambiente. Nonostante questo scenario promettente, attualmente soprattutto specie di microalghe di tipo selvatico sono impiegate a questi scopi. La loro evoluzione in un ambiente naturale, diverso da quello artificiale sfruttato durante la coltivazione industriale intensiva, ostacola fortemente le produttività teoriche della biomassa, portando a valori insoddisfacenti. Lo sviluppo di un'economia basata sulle alghe infatti dipende dall’efficiente conversione dell'energia luminosa in biomassa e dall'ottimizzazione delle vie metaboliche per massimizzare la sintesi dei prodotti di interesse. Ancora lontani dallo sviluppo di una coltivazione industriale di microalghe economicamente competitiva ed energicamente sostenibile, questi organismi devono quindi subire un’ottimizzazione biotecnologica per raggiungere la soglia di competitività. Sebbene non ci sia una specie ideale che potrebbe servire a soddisfare tutti i bisogni umani, noi ci siamo concentrati sulla specie di acqua marina Nannochloropsis gaditana, che è un candidato promettente sia per indagini biologiche di base che applicative. La seguente tesi di dottorato è stato concepita per fornire un’investigazione molecolare sull’efficienza fotosintetica e la regolazione metabolica di N. gaditana, al fine di fornire i bersagli molecolari per il suo miglioramento biotecnologico. Il presupposto di questo lavoro sperimentale era l'ottimizzazione degli strumenti molecolari attualmente disponibili per la manipolazione genetica di N. gaditana e anche le informazioni molecolari disponibili sono state quindi significativamente migliorate. Nel capitolo II è stato eseguito un approccio di mutagenesi casuale al fine di isolare ceppi mutanti con fenotipi fotosintetici, possibilmente più adatti alle condizioni di crescita intensiva. I ceppi selezionati in effetti hanno mostrato un miglioramento della fotosintesi in condizioni di crescita limitanti, rappresentando anche degli strumenti biologici per migliorare le informazioni disponibili sugli elementi molecolari alla base del controllo dell’efficienza dell’uso della luce in questo organismo. Quando testato in condizioni di crescita su scala di laboratorio, il ceppo E2, selezionato per una riduzione del contenuto in clorofilla, ha infatti mostrato un miglioramento della produttività della biomassa, rappresentando quindi una conferma per gli approcci biotecnologici qui sviluppati, di essere in grado di migliorare le prestazioni fotosintetiche di questo organismo, nell'ambiente artificiale di un fotobioreattore. Tra i ceppi mutanti isolati, nel capitolo III, due principali fenotipi fotosintetici, la riduzione nel contenuto di clorofilla (ceppo E2) e l'impossibilità di attivare il meccanismo di NPQ (ceppo I48), sono stati scelti come criteri di selezione per migliorare, rispettivamente, i meccanismi di penetrazione della luce e di conversione dell'energia luminosa in una cultura intensiva. Entrambi infatti hanno mostrato una produttività della biomassa maggiore nelle culture che simulano le condizioni industriali, dimostrando il vantaggio teorico dato dal loro sfruttamento. Tuttavia, quando le condizioni di crescita sono state cambiate, variando la disponibilità di luce, i mutanti selezionati hanno alterato il loro comportamento. Non erano in grado di essere più produttivi del WT in tutte le condizioni testate. Questo spiegherebbe perché i dati pubblicati fino ad oggi per gli stessi mutanti, isolati in altre specie, spesso forniscano risultati contrastanti. Abbiamo quindi concluso che i mutanti fotosintetici possono modulare il loro fenotipo in relazione alle condizioni di crescita e alcune di queste potrebbero infatti evidenziare i loro svantaggi piuttosto che i loro benefici. Pertanto, i futuri approcci di ingegneria genetica dovranno essere adattati adeguatamente alle condizioni di crescita utilizzate. La strategia di genetica diretta qui sviluppata potrebbe aprire le porte verso l'individuazione delle basi molecolari che regolano la fotosintesi in questa specie promettente. Nel capitolo IV il ceppo mutante I48 è stato ulteriormente indagato per individuare le basi genetiche responsabili del suo fenotipo. Grazie al ri-sequenziamento del suo intero genoma abbiamo identificato una variante di splicing nel sito di splicing donatore al 5’ del 4 ° introne del gene Naga_100173g12, che codifica per la proteina LHCX1. Questa mutazione ha causato la ritenzione della sequenza dell’introne, portando ad un prodotto proteico tronco, che viene probabilmente degradato. L'assenza della proteina LHCX1 si correla fortemente con l'incapacità di attivare l’NPQ, dal momento che questo gruppo di proteine è ben noto per essere coinvolto nell'attivazione di tale meccanismo. Tuttavia, la futura complementazione del fenotipo servirà per validare questa conclusione. Inoltre, la proteina LHCX1 è stata trovata co-localizzata con il PSI in N. gaditana, quindi il ceppo I48 potrebbe anche servire come strumento ottimale per indagare ulteriormente il ruolo biologico di questa associazione. Per sviluppare un’efficace strategia di ottimizzazione biotecnologica, le informazioni relative alla regolazione del metabolismo di N. gaditana devono essere notevolmente arricchite. Capire la direzione dei flussi metabolici potrebbe permettere di colpire in particolare solo quelli che sono coinvolti nell’accumulo di un determinato prodotto, senza influenzare altre vie metaboliche, cosa che potrebbe portare ad un possibile impatto negativo sulla crescita. Nel capitolo V un'analisi integrata con approcci genomici, biochimici e fisiologici ci ha aiutato a decifrare il rimodellamento metabolico di N. gaditana, che porta il suo metabolismo verso una maggiore produzione di lipidi in condizioni di luce in eccesso. Quest'ultima condizione infatti induce l'accumulo di di-acilgliceroli (DAG) e tri-acilgliceroli (TAG), insieme alla sovra-regolazione di geni coinvolti nella loro biosintesi. Abbiamo visto l'induzione di geni del complesso citosolico dell’acido grasso sintasi (FAS1) e la sub-regolazione di quelli del cloroplasto (FAS2). L’accumulo di lipidi è accompagnato dalla regolazione di trasportatori di trioso fosfati / fosfato inorganico attraverso le membrane del cloroplasto, inducendo la ripartizione metabolica del carbonio tra compartimenti cellulari e favorendo il citoplasma ed il reticolo endoplasmatico a spese del cloroplasto. Ciò ha evidenziato la flessibilità del metabolismo di N. gaditana al fine di rispondere alle esigenze ambientali. Nel capitolo VI le informazioni acquisite da quest'ultimo capitolo sono state sfruttate per testare le potenzialità di questa specie promettente, anche come piattaforma di espressione di proteine. Abbiamo costruito un sistema modulare per la sovra-espressione di proteine in cui le sequenze regolatrici sono state scelte tra quelle che inducono un elevato livello di trascrizione o che sono altamente regolate dalla disponibilità di luce. N. gaditana si è rivelata essere un organismo molto promettente per l'espressione di proteine, data la maggiore attività luciferasica osservata, rispetto alla specie di riferimento per tali applicazioni, C. reinhardtii. È stato sviluppato un metodo per testare l'efficacia di diverse sequenze regolatrici nel guidare l'espressione di proteine così come sono stati preparati diversi vettori di espressione, pronti per essere testati. L'indagine della regolazione del metabolismo di N. gaditana, svolta nel capitolo V, ha mostrato una fine regolazione dei suoi componenti dell'apparato fotosintetico, in diverse condizioni di luce. Concentrandosi sulle proteine antenna, coinvolte nella cattura delle luce (light-harvesting complex (LHC) proteins) abbiamo identificato una nuova proteina LHCX in questa specie, chiamata LHCX3 (ID del gene: Naga_101036g3), la cui sequenza codificante non era annotata in modo corretto. Nel capitolo VII, la corretta sequenza codificante di questo gene è stata studiata ulteriormente e convalidata sperimentalmente con tecniche molecolari. La proteina LHCX3 ha rivelato la presenza di un dominio simile a quello di tipo fasciclina I, all’N-terminale, e sono stati eseguiti un’analisi di sequenza insieme ad uno studio evolutivo preliminare per dedurre il ruolo biologico di questa associazione. Poiché il metabolismo delle alghe si basa interamente sulla disponibilità di luce, è fondamentale indagare l'effetto dell’intensità della luce sulla crescita per studiare la loro applicazione industriale. Nel capitolo VIII, abbiamo sviluppato una piattaforma su micro-scala, che abbiamo chiamato micro-fotobioreattore, per indagare facilmente l'impatto dell’intensità della luce sulla crescita di N. gaditana. Siamo stati in grado di testare simultaneamente l'effetto di diversi regimi di luce, anche sulle prestazioni fotosintetiche, in un sistema integrato che potrebbe essere associato a studi sull’impatto delle sostanze nutritive, accelerando il processo di caratterizzazione di N. gaditana. Nella tesi sono state incluse anche tre sezioni di appendice, in cui alcune delle tecniche sperimentali sfruttate in questo lavoro sono state applicate a diversi organismi, con l'obiettivo comune di indagare l’efficienza dell’uso della luce e gli elementi molecolari coinvolti nella sua regolazione. Nell’appendice I, è stato descritto lo sviluppo di un modello matematico per la previsione dei dati di crescita e di fluorescenza, nella specie Nannochloropsis salina. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con il Prof. Fabrizio Bezzo del dipartimento di ingegneria industriale dell'università di Padova. Lo sviluppo di modelli di previsione del comportamento che rappresentino i fenomeni che influenzano la crescita delle alghe, potrebbe essere molto utile nella progettazione e ottimizzazione dei sistemi di produzione a livello industriale. Il modello sviluppato descrive bene la crescita di N. salina in un ampio intervallo di intensità di luce, e potrebbe essere ulteriormente implementato per descrivere anche l'influenza sulla crescita di altri parametri, come la disponibilità di nutrienti ed il mescolamento. Nell’appendice II, il monitoraggio della fluorescenza della clorofilla in vivo è stato sfruttato per studiare le caratteristiche fotosintetiche di piante di riso, esposte a condizioni di stress salino. I risultati presentati sono parte di un progetto più ampio (in collaborazione con la Prof. Fiorella Lo Schiavo del dipartimento di biologia dell'università di Padova), con l'obiettivo di rappresentare il rimodellamento fisiologico, biochimico e molecolare, subito da una delle principali colture destinate ad usi alimentari nel mondo, in risposta a condizioni di stress salino. La descrizione dell'impatto degli stress ambientali sulla fotosintesi è fondamentale per controllare la produttività della biomassa delle piante poiché il loro metabolismo dipende interamente dalla fotosintesi per la crescita. Abbiamo osservato l'attivazione del meccanismo di NPQ in piante tolleranti il sale, sottolineando l'importanza del monitoraggio delle caratteristiche fotosintetiche per prevedere le prestazioni delle piante, direttamente sul campo. Nell’ appendice III, sono stati isolati i tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii marcati con atomi 13C - 15N, sia dal ceppo cw15 che dal ceppo mutante npq2, al fine di studiare la loro struttura e la dinamica delle proteine e dei lipidi costituenti, in situ, applicando la tecnica dell’NMR allo stato solido, in collaborazione con il gruppo del Prof. Anjali Pandit dell'Istituto di chimica di Leiden. Queste analisi serviranno per studiare il rimodellamento delle membrane fotosintetiche che passano da uno stato attivo (ceppo cw15) ad uno stato foto-protettivo (ceppo mutante npq2), durante il passaggio verso condizioni di luce in eccesso, con lo scopo finale di comprendere i processi biochimici che regolano quest'evento.

La concentrazione media di SO4 2- in oceano è 28-30 mmol L-1. Essa ha subito notevoli variazioni nel corso della storia della Terra e potrebbe aver facilitato la radiazione delle alghe della linea rossa (alghe con chl a+c quali diatomee, dinoflagellate e coccolitoforidi) a discapito di quelle della linea verde (alghe con chl a+b) e dei cianobatteri. È ancora da chiarire se gli enzimi responsabili dell’assimilazione del SO4 2- negli organismi fotosintetici abbiano svolto un ruolo nel controllare l’adattamento delle alghe alle variazioni di concentrazione del SO4 2-. In accordo con studi precedenti, la mia tesi dimostra che diverse specie algali possono acclimatarsi/adattarsi a diverse concentrazioni di SO4 2-. Anche se la disponibilità di SO4 2- non ha provocato cambiamenti drastici nella composizione cellulare, l’attività degli enzimi coinvolti nell’assimilazione riduttiva del SO4 2- è stata sensibilmente modificata, soprattutto quella dell’ATP solforilasi (ATPS), suggerendo che la disponibilità di SO4 2- sia un fattore importante nel controllo delle risposte intracellulari a breve termine mediate da induzione/inibizione delle attività enzimatiche. Lo studio delle sequenze di ATPS ha rivelato che contrariamente ad altri organismi, quelle algali hanno molti residui di cisteina. La posizione di alcuni di essi è conservata, sebbene vi sia una notevole differenza tra alghe eucariotiche e α-cianobatteri, e β-cianobatteri. Per verificare se l’ATPS potesse essere redox regolata in modo diverso in questi gruppi, l’attività dell’ATPS di sette specie è stata testata dopo trattamento con agenti riducenti (ditiotreitolo) o ossidanti (trans-4,5- diidrossi-1,2-ditiano) dei gruppi tiolici delle cisteine. Le cisteine dell’ATPS parzialmente purificata da Synechocystis sp. (β-cianobatteri) e T. pseudonana (eucarioti/α-cianobatteri) sono state poi identificate mediante spettrometria di massa dopo alchilazione dei gruppi sulfidrilici con iodoacetamide. I risultati mostrano che il numero e la posizione delle cisteine nelle ATPS algali sono fattori importanti per la regolazione della loro attività.
At present, the mean oceanic SO4 2- concentration is 28-30 mmol L-1. This nutrient underwent large variations during Earth history and may have influenced phytoplankton radiation by facilitating the expansion of algae of the red lineage (chl a+c algae like diatoms, dinoflagellates and coccolithophorids) at the expense of algae of the green algae (chl a+b algae) and cyanobacteria. Whether the enzymes that control SO4 2- assimilation in photosynthetic organisms have played a role in controlling algal adaptation to changes in SO4 2- concentration is however unclear. In agreement with previous studies, my thesis reveals that different algal species can modify their physiology to acclimate/adapt to different SO4 2- concentrations. Although SO4 2- availability did not elicit dramatic changes of cell internal composition, the activity of the enzymes involved in the reductive SO4 2- assimilation were appreciably modified, especially ATP sulfurylase (ATPS), suggesting that SO4 2- availability is an important factor in controlling short-term intracellular responses mediated by induction/inhibition of S-related enzymes. The study of ATPS sequences revealed that contrary to other organisms, algal ATPS has a high number of cysteine residues (cys). The position of some of these is conserved, but a notable difference exists between eukaryotic algae and α-cyanobacteria, and β-cyanobacteria. To test if ATPS may be redox regulated in different way in these groups, ATPS activity from seven species was tested after treatment with reducing (dithiothreitol) or oxidizing (trans-4,5-dihydroxy-1,2- dithiane) agents reacting with cys thiol groups. The cys of the partially purified ATPS from Synechocystis sp. (β-cyanobacteria) and T. pseudonana (eukaryotic/α-cyanobacteria) were then identified by mass spectrometry after sulfhydryl alkylation with 2-iodoacetamide. The results show that the number and position of cys in algal ATPS are important factors for the regulation of its activity.

Lo zolfo è un macronutriente fondamentale, ma spesso sottovalutato sostanzialmente meno informazioni su di esso in letteratura rispetto ad altri macronutrienti. Tra gli organismi fotosintetici, il metabolismo dello zolfo è generalmente si presume di essere conservato e la maggior parte delle informazioni disponibili è limitata alle pianti vascolari. L'indagine sulle alghe è limitata a pochissimi cladi, nonostante il importanza del solfato - la forma più disponibile di zolfo in natura - nell'acqua di mare. Infatti, ci sono prove che suggeriscono che la concentrazione di solfato nell'acqua di mare sia una delle maggiori importanti fattori determinanti della composizione del fitoplancton e potrebbero essere i responsabili di oggi predominanza delle microalghe clorofilla a + c nel fitoplancton - la facilitazione del solfato Ipotesi (SFH). Di fronte a questo scenario, questa tesi intende aumentare la comprensione di il ruolo dello zolfo nel fitoplancton implementando un approccio multidisciplinare coinvolgendo vari gruppi di microalghe. In primo luogo, un'ampia analisi in silico del cellulare localizzazione e relazioni filogenetiche dei sei enzimi fondamentali dell'assimilazione dei solfati mostra un'origine piuttosto complessa del percorso. I dati suggeriscono anche un ruolo rilevante di redox regolazione, che sembra funzionare in modo diverso tra i diversi gruppi di fototrofi. Quindi, la funzione, la localizzazione e la regolazione redox in vivo di uno di questi enzimi - con una filogenesi particolarmente complessa, denominata ATPS - è stata ulteriormente indagata nel modello di diatomee Phaeodactylum tricornutum utilizzando nuove tecniche di biologia molecolare. L'ATPS sembra essere cruciale per la vita ed è presente in P. tricornutum come due non ridondanti isoforme che si trovano in diversi compartimenti e possono funzionare nel partizionamento dello zolfo. Il recupero di mutanti knockout ATPS mediante complementazione con mezzo di crescita Vengono inizialmente studiate fonti alternative di zolfo. Infine, utilizzando un fisiologico e approccio biochimico, la crescita di microalghe marine appartenenti a vari gruppi è stata valutato in funzione della concentrazione di solfato nel mezzo di crescita. La concentrazione di il solfato che si traduce in limitazione della crescita è sorprendentemente diverso tra le microalghe. Infatti, le microalghe clorofilla a + c possono essere limitate in concentrazioni di solfato fino a 10000 volte superiore alle altre microalghe, che è altamente congruente con l'SFH. È interessante notare che le loro risposte alla limitazione dei solfati erano anche diverse all'interno delle alghe con plastide rosse, soprattutto nella quota di ferro nelle cellule.
Sulfur is a fundamental, yet frequently underestimated, macronutrient resulting on substantially less information about it in literature when compared to other macronutrients. Among photosynthetic organisms, sulfur metabolism is generally assumed to be conserved and most of the available information is limited to vascular plants. The investigation among algae is constrained to very few clades, despite the importance of sulfate – the most available form of sulfur in nature – in seawater. In fact, there is evidence to suggest that sulfate concentration in seawater is one of the most important drivers of phytoplankton composition and may be the responsible for today’s dominance of chlorophyll a + c microalgae in the phytoplankton – the Sulfate Facilitation Hypothesis (SFH). Facing this scenario, this thesis intends to raise the understanding of the role of sulfur in phytoplankton by implementing a multidisciplinary approach involving various groups of microalgae. First, a broad in silico analysis of the cellular localization and phylogenetic relationships of the six core enzymes of sulfate assimilation shows a rather complex origin of the pathway. Data also suggests a relevant role of redox regulation, that appears to function differently among different groups of phototrophs. Then, the function, localization and the in vivo redox regulation of one of these enzymes – with a particularly complex phylogeny, named ATPS – was further investigated in the model diatom Phaeodactylum tricornutum using novel molecular biology techniques. ATPS seems to be crucial for life and is present in P. tricornutum as two non-redundant isoforms that are in different compartments and may function in sulfur partitioning. The recovery of ATPS-knockout mutants by growth medium complementation with alternative sources of sulfur is initially investigated. Finally, using a physiological and biochemical approach, the growth of marine microalgae belonging to various groups was assessed as a function of sulfate concentration in growth medium. The concentration of sulfate that results in growth limitation is strikingly different among microalgae. In fact, chlorophyll a + c microalgae can be limited in sulfate concentrations up to 10000-fold higher than the other microalgae, which is highly congruent with the SFH. Interestingly, their responses to sulfate limitation were also different within the red-plastid algae, especially in the iron quota in cells.

My Ph.D. project has focused on the characterization of TPK3, a putative channel selective for potassium (K+) with a predicted chloroplast localization in higher plants, from biochemical, physiological and electrophysiological point of view. This protein belongs to the TPK channel family (from Tandem-Pore K+ channels) and displays amino acid sequence homology with another K+ channel studied in our laboratory, called SynK (Zanetti et al., 2010). SynK shows thylakoid localization in Cyanobacteria. The SynK channel has been shown to be critical for photosynthetic performances in Cyanobacteria, given the photosensitive phenotype displayed by the mutants lacking the SynK protein. Given the homology, we hypothesized that similarly, TPK3 might be involved in the regulation of photosynthetic processes in higher plants. So far, no information is available about the properties of TPK3, nor about its physiological roles, neither about its possible involvement in photosynthesis; the work presented in this thesis had the aim of clarifying some important aspects of the functions of TPK3. Following subcellular localization studies carried out using biochemistry and confocal microscopy techniques, the TPK3 channel was expressed in E. coli cells for subsequent electrophysiological characterization in a planar lipid bilayer setup in order to prove its function as K+ channel. The unavailability of commercial mutants for tpk3 gene required setting up of a silencing procedure via RNA interference of the messenger for the protein, in order to analyze the possible physiological roles of TPK3. The resulting silenced plants have been studied under different growth conditions to determine changes in physiology of the plants including their photosynthetic parameters. In parallel with the TPK3 project, the most important part of my Ph.D., I also followed two other major areas of research: one concerning the study of the functions of two members of plant Glutamate Receptors (GluRs) and the other one concerning the characterization of the plant homologous of the recently identified MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) of mammals. This thesis also includes a manuscript (Checchetto et al., 2012) to which I contributed with the heterologous expression of a calcium-activated K+ channel, SynCaK, of Cyanobacteria.
Il mio progetto di dottorato si è focalizzato sulla caratterizzazione, dal punto di vista biochimico ed elettrofisiologico, di una proteina denominata TPK3 che è predetta di funzionare come canale selettiva per il potassio (K+) ed essere localizzata nei cloroplasti nelle piante superiori,. Questa proteina appartiene alla famiglia dei canali TPK (da Tandem-Pore K+ channels) e mostra omologia di sequenza a un altro canale del K+ studiato nello stesso nostro laboratorio, denominato SynK (Zanetti et al., 2010), a localizzazione tilacoidale ed appartenente al phylum dei Cianobatteri. È stato dimostrato in più esperimenti che il canale SynK è fondamentale per la regolazione della fotosintesi nei Cianobatteri, in considerazione del fenotipo fotosensibile mostrato dai mutanti per il gene synk. Visto la localizzazione predetta del TPK3, è stato ipotizzato in partenza che TPK3 potesse svolgere un ruolo simile nelle piante superiori. Finora nulla si conosceva sulle proprietà di TPK3, ne sui suoi ruoli fisiologici, ne su di un suo eventuale coinvolgimento nella fotosintesi nelle piante superiori; il lavoro contenuto nel progetto presentato ha cercato di chiarire alcuni aspetti salienti delle funzioni di TPK3. Dopo studi di localizzazione subcellulare condotti con tecniche di biochimica e microscopia confocale, il canale TPK3 è stato espresso in E. coli per la successiva caratterizzazione elettrofisiologica in bilayer lipidico planare allo scopo di determinare la sua funzione come canale di K+. L’assenza di mutanti commerciali per il gene tpk3 ha necessitato la messa a punto del suo silenziamento tramite RNA interference del messaggero per la proteina suddetta, al fine di analizzarne i possibili ruoli fisiologici. Le piante silenziate risultanti, sottoposte a differenti condizioni di crescita, sono state studiate in vari esperimenti atti a determinarne vari parametri inclusi quelli fotosintetici. Contemporaneamente allo studio del TPK3, quello di maggior rilievo nel mio dottorato, ho seguito anche altri due filoni di ricerca principali, riguardanti l’uno l’approfondimento delle funzioni di due membri dei Recettori di Glutammato vegetali (GluRs) e l’altro la caratterizzazione degli omologhi del recentemente identificato MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) di Mammiferi. Nella presente tesi è inoltre incluso un manoscritto (Checchetto et al., 2012) per il quale ho collaborato nell’espressione eterologa del canale di K+ calcio-dipendente (SynCaK) di Cianobatteri.

Oxygenic photosynthesis is a crucial process for life on earth as it enables plants and algae to convert sunlight into chemical energy, generating molecular oxygen as a byproduct. Light can also be harmful and when in excess can drive to photosystems over‐excitation and production of reactive oxygen species (ROS) with the consequent decrease of the overall photosynthetic efficiency. In a highly dynamic natural environment photosynthetic organisms have evolved sophisticated mechanisms to modulate their efficiency to capture and exploit light. For instance the so called non photochemical quenching of fluorescence (NPQ) acts dissipating excess energy as heat and it’s used as short term response to high light in order to avoid oxidative damages. The carotenoid zeaxanthin belonging to the xanthophyll cycle enhances this thermal dissipation but also has a direct role in the scavenging of ROS generated in the membrane. Acclimation instead is a more complex long term process that acts directly modeling the composition of the photosynthetic apparatus in response to different light intensity, for example through modifications in protein composition. Photoregulation and photoprotection are strongly related also to modulations of flow of excitation energy and electrons across the thylakoid membrane. Indeed the major pathway for the light reactions of photosynthesis, the linear electron flow, can modulate its rate depending on metabolic demand and can be also supported by alternative electron pathway which affect the thylakoid gradient across the membrane and the ATP/NADPH ratio. The general aim of this work is to investigate the different mechanisms modulating photosynthetic efficiency in the microalga Nannochloropsis gaditana in order to increase the limited knowledge about this interesting microalga and exploit it to optimize photosynthetic efficiency in a large-scale cultivation perspective, even through the development of computational models. The spectroscopic tools developed to untangle the complexity of the photosynthetic regulation in Nannochloropsis have been successfully applied to study photosynthesis in other photosynthetic organisms such as, Chlamydomonas reinhardtii, Physcomitrella patens and Koliella antarctica. Nannochloropsis gaditana is an eukaryotic alga of the phylum of heterokonta, originating from a secondary endosymbiotic event. Species of this group have received increasing attention in the scientific community, reflecting their potential application in biofuel production, although the photosynthetic and physiological properties of these organisms remain poorly characterized. Nannochloropsis species have a peculiar photosynthetic apparatus characterized by the presence of chlorophyll a, violaxanthin and vaucheriaxanthin as the most abundant pigments. The regulation of the photosynthetic apparatus in this interesting microalgae has been deeply discussed in Section B. Our study focused firstly on the acclimation response in Nannochloropsis gaditana subjected to prolonged exposition to low and high light. Intense illumination induces a decrease in the chlorophyll content and the antenna size of both Photosystem I and II. Cells grown in high light also show increased photosynthetic electron transport, paralleled by an increased contribution of cyclic electron transport around Photosystem I. Even when exposed to extreme light intensities, Nannochloropsis cells do not activate photo-protection responses, such as NPQ and the xanthophyll cycle in a constitutive way. Conversely, these responses remained available for activation upon additional changes in illumination. These results suggest NPQ and the xanthophyll cycle in Nannochloropsis gaditana play exclusive roles in response to short-term changes in illumination but only play a slight role, if any, in responses to chronic light stress. In order to further explore the short term response mediated by xanthophyll cycle the effect of zeaxanthin accumulation in the photosynthetic apparatus of Nannochloropsis gaditana was investigated revealing some peculiar aspects. Interestingly zeaxanthin molecules are found to be constitutively present in this microalga, even in conditions of very low light in which the xanthophyll cycle is not yet induced. In addition this xanthophyll does not show a specific binding site in the different protein components of the photosynthetic apparatus and, in addition, has a strong effect in the NPQ response. The influence on NPQ seems to be related mostly on de novo synthesis of zeaxanthin while the molecules already present in the photosynthetic apparatus are involved in a transient NPQ active only in the first minute after the dark-light transition. The regulation of the photosynthetic apparatus has been assessed also in N. salina in a growing system more compatible with a large-scale production system, a continuous-flow flat-plate photobioreactor. Interestingly changing the residence time maintaining the same irradiation affects the biomass concentration leading to an acclimation response very similar to that observed for N. gaditana grown in batch system, as previously discussed. These results highlight the importance of the biomass concentration and its connection with light supply as parameter to optimize in order to increase the microalgal culture productivity. The molecular investigation of the mechanisms at the basis of light exploitations in Nannochloropsis is the starting point for the development of computational models that aim to simulate and predict microalgae behavior in order to optimize their productivity in large-scale cultivation systems. Section C deals with the development and widespread application of these models, which integrate chlorophyll fluorescence measurements allowing also the representation of complex mechanisms such as NPQ. Such models prove especially useful in identifying which parameters have the largest impact on productivity, thereby providing a means for enhancing growth through design and operational changes. They can also provide guidance for genetic engineering by identifying those modifications having the largest potential impact on productivity. In Section D the study of photosynthetic processes is expanded to other organisms focusing on the regulation of the photosynthetic electron chain through the employment of several spectroscopic approaches set up during my PhD thesis. In the first work reported we show that the introduction of a mitochondrial mutation in Chlamydomonas reinhardtii mutants depleted in the chloroplastic PGRL1 rescue its photosensitivity in high light. Detailed functional analysis of these cells showed that the mitochondria mutation alters the electron transport reactions increasing alternative electron pathways around PSI at the detriment of PSII-related photosynthesis. This work thus clearly shows how mitochondrial activity play a seminal influence on photosynthesis in algae. The second work presented deals with another important mechanisms to modulate flow of excitation, the Mehler-like reactions mediated by Flavodiiron (FLV) proteins. These proteins were lost during evolution of land plants but are still present in non vascular plants, as the moss Physcomitrella patens, the model organism employed for this study. P. patens mutants depleted in FLV show these proteins are active as an electron sink downstream of Photosystem I. Measurement of electron transport showed that they play a major role particularly in the first seconds after a sudden change in light intensity, when for a few seconds they are the major sink for electrons from PSI. When exposed to fluctuating light FLV mutants showed light sensitivity and PSI photoinhibition, demonstrating their biological role as a safety valve for excess electrons in dynamic light. FLV absence in mutants was, in part, compensated by increased cyclic electron flow, suggesting that their biological role may have been substituted in vascular plants by this other mechanism of alternative electron flow. Finally we analyzed the time course of physiological and morphological responses to different irradiances in Koliella antarctica, a green antarctic microalga isolated from Ross Sea. K. antarctica not only modulates cell morphology and composition of its photosynthetic apparatus on a long-term acclimation, but also shows the ability of a very fast response to light fluctuations. The ability to activate such responses is fundamental for survival in its natural extreme environment.
La fotosintesi ossigenica è un processo fondamentale per la vita sulla terra in quanto consente a piante e alghe di convertire la luce solare in energia chimica generando ossigeno molecolare come sottoprodotto. La luce può anche essere dannosa e quando è in eccesso può portare alla sovreccitazione dei fotosistemi e alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) con un conseguente calo dell’efficienza fotosintetica. In un ambiente naturale estremamente dinamico gli organismi fotosintetici hanno evoluto meccanismi sofisticati in grado di modulare la loro efficienza per catturare e sfruttare al meglio la luce. Per esempio il cosiddetto quenching non fotochimico della fluorescenza (NPQ) agisce dissipando l’energia in eccesso sotto forma di calore ed è utilizzato come sistema di risposta a breve termine agi stress luminosi col fine di evitare danni ossidativi. Il carotenoide zeaxantina appartenente al ciclo delle xantofille partecipa attivamente a questa risposta di dissipazione termica mantenendo però anche un ruolo diretto nello scavenging dei ROS generati nella membrana tilacoidale. L’acclimatazione invece è un processo a lungo termine che agisce direttamente modellando la composizione dell'apparato fotosintetico in risposta all'intensità della luce ad esempio attraverso modifiche nella composizione proteica. I meccanismi di regolazione e protezione indotti dalla luce sono spesso legati anche a modulazioni dei flussi elettronici attraverso la membrana tilacoidale. La via principale per le reazioni alla luce della fotosintesi infatti, il flusso elettronico lineare, è in grado di modulare la sua attività a seconda della richiesta metabolica e può essere sostenuto anche da pathways elettronici alternativi che influenzano il gradiente tilacoidale e il rapporto ATP / NADPH. L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di indagare i diversi meccanismi che modulano l'efficienza fotosintetica nella microalga Nannochloropsis gaditana al fine di aumentare la conoscenza ancora limitata di questa microalga e sfruttarla per ottimizzare l'efficienza fotosintetica in un ottica di coltivazione su larga scala, anche attraverso lo sviluppo modelli di calcolo. Gli strumenti spettroscopici sviluppati per districare la complessità dei meccanismi di regolazione della fotosintesi in Nannochloropsis sono stati applicati con successo anche per lo studio di altri organismi fotosintetici quali, Chlamydomonas reinhardtii, Physcomitrella patens e Koliella antarctica. Nannochloropsis gaditana è un'alga eucariotica del phylum heterokonts originata da un evento di endosimbiosi secondaria. Specie di questo gruppo hanno ricevuto una crescente attenzione nella comunità scientifica che riflette la loro potenziale applicazione nella produzione di biocarburanti. Nonostante questo le proprietà fotosintetici e fisiologiche di questi organismi rimangono ancora poco caratterizzate. La specie Nannochloropsis possiede un apparato fotosintetico peculiare contenente come pigmenti più abbondanti clorofilla a, violaxantina e vaucheriaxantina. La regolazione dell'apparato fotosintetico in questa microalga è stato approfondito nella Sezione B. Il nostro studio si è concentrato in primo luogo sulla risposta di acclimatazione in Nannochloropsis gaditana sottoposta a prolungate esposizioni a luce bassa e alta. L’illuminazione intensa induce una diminuzione del contenuto di clorofilla e delle dimensioni della taglia d’antenna del PSI e II. Cellule coltivate in alta luce mostrano anche un aumento del trasporto fotosintetico degli elettroni di pari passo con un maggior contributo da parte del trasporto alternativo ciclico. Anche quando esposte a intensità di luce estreme, le cellule di Nannochloropsis non attivano le risposte di foto-protezione, come ad esempio NPQ e il ciclo delle xantofille, in modo costitutivo. Al contrario, queste risposte rimangono a disposizione per l'attivazione in risposta a ulteriori modifiche dell’ illuminazione. Questi risultati suggeriscono che l’NPQ e il ciclo delle xantofille in Nannochloropsis gaditana giocano un ruolo esclusivo in risposta alle variazioni luminose a breve termine, ma solo un ruolo marginale nelle risposte al stress luminosi cronico. Al fine di esplorare ulteriormente la risposta a breve termine mediata dal ciclo delle xantofille è stato studiato l'effetto dell’ accumulo di zeaxantina nell'apparato fotosintetico di Nannochloropsis gaditana rivelando alcuni aspetti peculiari. E’ interessante notare che le molecole di zeaxantina si trovano ad essere sintetizzate costitutivamente in questa microalga, anche in condizioni di scarsa illuminazione in cui il ciclo delle xantofille non viene indotto. Inoltre questa xantofilla ha dimostrato di non avere un sito di legame specifico nelle diverse componenti proteiche dell’apparato fotosintetico e ha in aggiunta un forte effetto nella risposta di NPQ. L’effetto legato all’ NPQ sembra legato principalmente alla sintesi de novo di zeaxantina mentre le molecole già presenti nel’apparato fotosintetico sono coinvolte in un NPQ transitorio attivo solo nel primo minuto dopo la transizione luce-buio. La regolazione dell'apparato fotosintetico è stata valutata anche in N. salina in un sistema di coltivazione più compatibile con la produzione su larga scala, un fotobioreattore a flusso continuo. È interessante notare che modificare il tempo di permanenza mantenendo la stessa irradiazione influisce sulla concentrazione di biomassa e produce una risposta di acclimatazione molto simile a quella osservata in N. gaditana coltivata in sistema a batch, come precedentemente discusso. Questi risultati evidenziano l'importanza della concentrazione della biomassa e la sua connessione con la luce somministrata come parametro da ottimizzare per aumentare la produttività delle colture microalgali. L'indagine molecolare sui meccanismi alla base dell’utilizzo della luce in Nannochloropsis è il punto di partenza per lo sviluppo di modelli computazionali che mirano a simulare e prevedere il comportamento delle microalghe nell’ottica di ottimizzare la produttività in sistemi di coltivazione su larga scala. La Sezione C tratta dello sviluppo e dell'applicazione di questi modelli, che integrano misure di fluorescenza della clorofilla e consentono anche la rappresentazione di meccanismi complessi come l’NPQ. Tali modelli risultano particolarmente utili per identificare i parametri che hanno il maggiore impatto sulla produttività algale fornendo inoltre una guida per individuare quelle modifiche genetiche che hanno il maggiore potenziale impatto sulla produttività. Nella sezione D lo studio dei processi fotosintetici si espande ad altri organismi focalizzandosi in particolare sui meccanismi di regolazione della catena fotosintetica di trasposto degli elettroni. Questo studio si avvale dell'impiego di diverse tecniche spettroscopiche che ho messo a punto durante la mia tesi di dottorato. Nel primo lavoro riportato viene mostrato come l'introduzione di una mutazione mitocondriale nella microalga Chlamydomonas reinhardtii priva della proteina cloroplastica PGRL1 porti ad un recupero delle performance di crescita in condizioni di alta luce. Analisi fotosintetiche effettuate in queste cellule mutanti ha mostrato che la mutazione mitocondriale altera le reazioni di trasporto degli elettroni aumentando i pathways elettronici alternativi che coinvolgono il PSI e limitando fortemente l’attività del PSII. Questo lavoro dimostra come l'attività mitocondriale abbia un'influenza fondamentale sulla fotosintesi delle microalghe. Il secondo lavoro presentato si occupa di un importante meccanismo volto a modulare il flusso di eccitazione, le reazioni Mehler-like mediate dalle proteine Flavodiiron (FLV). Queste proteine sono state perse durante l'evoluzione delle piante terrestri, ma sono ancora presenti nelle piante non vascolari, come nel muschio Physcomitrella patens, l'organismo modello utilizzato per questo studio. Mutanti di P. patens deprivati della proteina FLV mostrano come quest’ultima abbia un ruolo di sink degli elettroni a valle del PSI. Misure di trasporto elettronico hanno dimostrato che le FLV svolgono un ruolo importante in particolare nei primi secondi dopo una rapida variazione dell'intensità luminosa, quando per alcuni secondi essi agiscono da principale sink degli elettroni provenienti dal PSI. Quando esposti ad una condizione di luce fluttuante i mutanti FLV mostrano fotosensibilità e inibizione del PSI, dimostrando il loro ruolo biologico come valvola di sicurezza in caso di sovrariduzione della catena fotosintetica. L’assenza delle FLV nei mutanti è in parte compensata da un aumento del flusso ciclico degli elettroni, suggerendo che quest’ultimo possa avere sostituito il ruolo biologico delle FLV nelle piante vascolari. Infine abbiamo analizzato l'andamento nel tempo delle risposte fisiologiche e morfologiche a diverse intensità luminose in Koliella antarctica, una microalga verde antartica isolata nel Mare di Ross. K. antarctica modula non solo la morfologia cellulare e il suo apparato fotosintetico tramite una risposta acclimatativa a lungo termine, ma mostra anche la capacità di rispondere rapidamente alle variazioni dell’intensità luminosa. La possibilità di attivare tali risposte è fondamentale per la sopravvivenza nel suo ambiente naturale estremo.

Negli oceani attuali le diatomee sono abbondanti e diversificati produttori primari circondate da gusci di silice chiamati frustuli. Nel Cretaceo, diatomee sferiche con frustuli altamente silicizzati prosperavano negli oceani, solo in seguito affiancate da specie con frustuli allungati e più sottili, con un contenuto di SiO2 inferiore. Ma come ha agito l'azione sinergica delle pressioni selettive sull'evoluzione delle diverse morfologie di frustulo? L'importanza ecologica delle diatomee e lo sfruttamento dei frustuli come promettenti biomateriali guidano gli studi sull'argomento. Il ruolo di due pressioni selettive (declino di Si oceanica e predazione) sulla radiazione delle diatomee e il ruolo adattativo del frustulo sono stati studiati. Diatomee morfologicamente diverse sono state acclimatate a paleoambienti ricostruiti imitando la concentrazione mesozoica di nutrienti in presenza di regimi decrescenti di Si. Inoltre, colture monospecifiche e miste di diatomee morfologicamente diverse sono state esposte alla presenza di predatori. I dati confermano che entrambe le pressioni selettive hanno agito sull'evoluzione morfologica dei diversi frustuli, portando a forme più competitive. Il ruolo adattativo del frustulo nel controllo del galleggiamento è stato confermato dato che è stata verificata la correlazione tra capacità di affondamento delle diatomee e densità del frustulo, e non rispetto a forma e alle dimensioni cellulari. A livello cellulare una maggiore capacità di galleggiamento dipende dall'energia disponibile ed è indipendente dalla silicizzazione. Infine, la caratterizzazione dei frustuli con la prospettiva di sfruttarli come biomateriale ha dimostrato che Chaetoceros muelleri è una specie promettente grazie alla presenza relativamente elevata di siti basici, importanti per la successiva funzionalizzazione. La rimozione con acidi della materia organica è risultata essere un'opzione più sostenibile per ottenere frustuli rispetto al metodo dell’ossidazione.
In present day oceans, diatoms are abundant and diverse primary producers distinguished by their silica shells. By the Cretaceous Period, large spherical diatoms with highly silicified frustules thrived in surface oceans, only later to be joined by species with elongated and thinner frustules, with lower SiO2 content. But how has the synergic action of selective pressures acted on the evolution of morphologically different frustules? The ecological importance of diatoms, also in the perspective of future oceanic predictions, and frustule promising exploitation as emerging biomaterial drive the studies on the topic. To answer the question, both the involvement of two major selective pressures (e.g. oceanic Si decline and predation) in diatom radiation and frustule adaptative role were investigated. Diatoms were acclimated to reconstructed paleoenvironments mimicking Mesozoic concentration of nutrients in the presence of decreasing Si content. Moreover, mono- and mixed cultures of diatoms were exposed to the presence of predators. Data confirmed that both selective pressures have acted on the evolution of different frustule morphologies leading to more competitive shapes. The adaptative role of silica shells in controlling buoyancy was confirmed since sinking capacity of diatoms was related to frustule density and not to cellular shape and size. A direct relation between sinking capacity and growing light intensity was observed, independently from silicification, suggesting an energy dependent buoyancy control at cellular level. Finally, thanks to the characterization of frustules, Chaetoceros muelleri was found as a promising species for frustule exploitation due to its high surface area and relative high presence of basic sites, important for subsequent functionalization. The acidic removal of the organic matter was a more sustainable option to obtain frustules with 4 kg of equivalent CO2 released compared to 20 kg released by the oxidation method.

In the vascular plants the coordination of developmental processes, cell-cell interactions and physiological processes are mediated by the action of phytohormones, whose chemical structures include simple molecules as olefin (ethylene) and complex steroids as brassinolide. Moreover, little signal peptides were recognized to have a role as phytohormones. Such peptides were involved in defense response, callus growth, meristems homeostasis, root growth, organ abscission and hormone crosstalk. The peach peptide encoded by the ctg134 gene represents a possible candidate as mediator in the interplay between auxin and ethylene. Initially annotated as a gene of unknown function, it drawn attention because of its expression, noted by means of microarray experiments on ripening peach. Indeed, it is induced by ripening, but, unlikely many ripening-associated genes, it is also induced by auxin and 1-methylciclopropene (1-MCP) and repressed by ethylene. Recently it turned out that its sequence is similar to those of RGF (Root Growth Factors) genes, characterized in Arabidopsis thaliana only in 2010. The ctg134 promoter fusion with the GUS reporter gene was used to create transgenic lines in tobacco and Arabidopsis, that displayed a staining pattern associated to cells where an ethylene/auxin crosstalk might occur, such as lateral roots formation and organ abscission. Treatments with exogenous auxin on pctg134::GUS seedlings demonstrated that the promoter is able to respond to low concentrations of auxin and that the response reaches the maximum level within six hours from the begins of the treatment. The ctg134 overexpression in tobacco allowed to observe an increase of the root hair number and growth and the enlargement of capsules size. Both the phenotypes may be due to an enhanced sensitivity to ethylene. This aspect was confirmed by molecular analyses on ACO genes in tobacco seedlings overexpressing the peptide encoded by ctg134. The obtained data seem to confirm that ctg134 is really active in the crosstalk between the two hormones, being induced by auxin and leading to an increased ethylene sensitivity in some tissues. To facilitate the functional analysis of regulatory genes involved in fruit development and ripening, new tools for gene expression were set up by modification of a two-component expression system based on transactivation. This vectors were adapted for specific gene overexpression in tomato fruits and are now available to future functional characterizations of genes involved in ripening processes.
Nelle piante superiori la coordinazione delle interazioni cellula-cellula, durante i diversi stadi di sviluppo, è mediata prevalentemente da ormoni vegetali la cui natura chimica spazia da semplici molecole, come l’etilene, a molecole dalla struttura più complessa, come i brassinosteroli. Inoltre sono stati recentemente riconosciuti come importanti segnali intercellulari anche piccoli peptidi, con funzione ormonale, in grado di coordinare e definire specifiche funzioni nelle piante. Questi sono coinvolti in numerosi processi, come le risposte di difesa, la crescita del callo, l’organizzazione del meristema, la crescita delle radici, i fenomeni di abscissione e il cross-talk tra ormoni. In pesco, il peptide codificato dal gene ctg134 rappresenta un possibile candidato come mediatore nell’interazione tra auxina ed etilene. Inizialmente annotato come gene a funzione sconosciuta, il ctg134 è stato identificato mediante esperimenti di microarray condotti nell’ambito di studi sul processo di maturazione della pesca. Ulteriori esperimenti hanno mostrato come tale gene sia indotto dalla maturazione e, diversamente dagli altri geni legati a tale sindrome, sia indotto dall’auxina e dall’1-MCP, ma represso dall’etilene. Recentemente è stato evidenziato come esso presenti numerose similitudini con i peptidi ormonali appartenenti alla classe RGF (Root Growth Factor), caratterizzati in Arabidopsis. Fusioni del promotore con il gene GUS sono state utilizzate per creare linee transgeniche di tabacco e Arabidopsis, nelle quali è stata evidenziata attività del promotore in cellule in cui ci potrebbe essere interazione tra auxina e etilene, come la formazione di radici laterali e l’abscissione di organi. Trattamenti con auxina esogena su germinelli di tabacco pctg134::GUS hanno permesso di evidenziare come la sequenza regolatrice risponda a bassi livelli di auxina esogena e la risposta sia massima entro 6 ore dall’applicazione dell’ormone. La sovraespressione del gene codificante il ctg134 in piante di tabacco ha reso possibile osservare nelle radici un aumento della lunghezza e del numero dei peli radicali e, nella parte riproduttiva, l’ingrossamento dell’ovario. Entrambi i fenotipi potrebbero essere dovuto a un’aumentata sensibilità all’etilene. Questo aspetto è stato confermato dall’analisi dell’espressione dei geni ACO in germinelli di tabacco che sovra-esprimono il peptide codificato dal ctg134. I dati ottenuti sembrano confermare come il ctg134 sia realmente attivo nel cross-talk tra auxina ed etilene, essendo indotto dall’auxina e portando ad un aumento nella sensibilità all’etilene in vari tessuti. Per facilitare l’analisi funzionale di geni regolatori implicati nel processo di sviluppo e maturazione del frutto, sono stati messi a punto nuovi strumenti per la sovra-espressione genica attraverso la modificazione di un sistema di vettori a due componenti basato sul fenomeno della transattivazione. Questi vettori sono stati adattati per ottenere un’espressione specifica nella bacca di pomodoro, e sono ora disponibili per futuri studi di caratterizzazione funzionale di geni coinvolti nel processo di maturazione.

Introduction The work carried on in the triennium 2007-09 put itself in the field of research known as phytoremediation. This term identifies several techniques (phytoextraction, phytostabilization, phytovolatilization) based on using different plant species able to survive on substrates contaminated by many pollutants derived from human activities and to accumulate them in own tissues or volatilize by evapotranspiration or avoiding their leakage troughout the groundwater . This ability varies strongly trough species and inside a species between genetic pools. About the ability in heavy metals removing , researchers have identified two classes of plant species : Hyperaccumulators : species tipical of metalliferous soils, able to carry on their life cycle without showing symptoms of stress as heavy metals high concentration. (Baker et al., 2000). To be classified as hyperaccumulator a plant species must accumulate a minimum of : 100 mg/Kg d.w. of Cd, 1000 mg/Kg d.w. of Pb, 10000 mg/Kg d.w. of Zn ; ranges for As are not yet determined. (Baker and Brooks 1989, Baker et al., 2000). Some of most rapresentative hyperaccumulator species are Thlaspi caerulescens, Arabidopsis halleri and Viola calamarina, Astragalus spp and several other species of following families : Cariophyllaceae, Fabaceae, Poaceae, Chenopodiaceae, Brassicaceae e Cyperaceae. About As the best accumulator is Pteris vittata. The main limit of hyperaccumulators is little biomass production. Accumulators: in this group there are herbaceous and woody species able to couple a good accumulation with a good biomass production. Between them we can find Brassica juncea, end the genus Salix. This kind of accumulators are the best solution for pollutants removal programs in short and medium period. An high biomass production allows to plan a recycle of it in energy production and to recover heavy metals from ashes. ((Kabata-Pendias and Pendias, 1992 ; Pullford and Dickinson 2004 ; Paulson et al 2003; French et al 2005; Ebbs et al 1997 ; Ebbs et al 1998). This work, divided in several steps, as described below, wants to increase the knowledge on some of previous species, from a physiological point of view and evaluating performances of accumulation in order to replace, when it’s feasible, invading and expensive remediation techniques with phytoremediation that is, in its different applications, more respectful of landscape and more cost-effective. Trials to evaluate phytoextraction performances of four species of willow (Salix spp) , Phragmites australis and Brassica juncea grown on polluted sludge dredged from Venice Lagoon. In collaboration with Department I.M.A.G.E. of Faculty of Engenering of University of Padova, in the field of PRIN 2005 (National Significant Project) “Remediation of sea, lagoon and river sediments” experimental trials were planned in order to understand remediation and biomass production potential of Salix matsudana, S. babylonica, S. alba, S. fragilis, Brassica juncea and Phragmites australis growing on salty polluted sludge , dredged from Venice Lagoon (closest to Marghera harbor) and to think about a phytoextraction installation. Sludge samples were kept in four sites (North industrial channel, West industrial channel-two samples-, and Evolution Basin), then labeled and characterized. To dry, homogenize and ameliorate their drainage capability of sludge, samples were mixed with river sand in a 1:1 ratio. Trial on 50 L tanks : After preliminary trials that underlined impossibility to grow up in field conditions Salix babylonica, fragilis , alba, , Thypha latifolia and Zea mais, seven 50 L tanks were filled up with a bottom layer of expanded clay and sludge up to 35 L (2 with Phragmites, 2 with Salix Matsudana, 2 with Brassica juncea and one without plants ) each one with a tube coupled with a filter, linked in the bottom to collect water samples and favorite drainage. Willow cuttings and Indian mustard seedlings were planted with a universal soil bulk to attenuate transplanting shock and negative effect on young root system of direct contact with polluted substrate, Phragmites rhizomes instead, after an initial steady state, showed to be able to grow on direct contact with sludge. After two months from start of trial, EDTA was added to one of Phragmites tanks to increase phytoextraction performances. Hydroponic trials : hydroponic livestocks of S. Matsudana, S. Alba, S. Fragilis, s. Babylonica and Brassica juncea were prepared mixing Hoagland nutrient solution with same Ni, Cd, Zn, Cu and Pb concentrations detected in first water sample collected from tanks. For each willow species, were prepared one becker as control with Hoagland solution only, one with Hoagland plus metals and one with Hoagland, metals plus NaCl, supplied at increasing concentrations (from 0.05 M to 0.2 M). About brassica, five beckers with 40 seedlings for each one were prepared. One becker as control with Hoagland solution, two beckers with Hoagland plus metals in the same concentration as described above, and two beckers with metals plus raising up Na concentration as described above. At the end of experimental period, cuttings and seedlings were harvested, weighted and metals and Na contents were detected. Twenty L tanks trials : five 20 L tanks with a tap on the bottom were filled up with a layer of fine gravel, a layer of sludge and a top layer of universal soil. They were placed in growth chamber. Each tank hosted three cuttings (one species for each tank) and eight Paspalum vaginatum plants, the fifth one hosted a second series of S. Babylonica cuttings and eight Paspalum vaginatum plants. Trials were 50 days long. A week after trial start, in fifth tank EDDS chelant was added, in order to increase metals bioavailability. After plant harvesting, biometric and metal content measurement were done. Willow root deepening evaluation: to see possible differences in sediment exploration by root systems of willow species twenty four 2 L plastic bottles were prepared. Sixteen of that filled up with same 20 L tank content, and eight (two for species) with grave’, universal soil on the top and soil kept from Experimental farm “L.Toniolo”. Each bottle hosted a cutting (six bottles for species). At the end of trial, willow shoots were removed, then bottles were frozen and sawed in three sections corresponding to universal soil layer and two part of sludge layer corrispondenti alla sezione contenente il terriccio e a due parti conteneti il sedimento. All root systems were extracted, washed up, weighted, scanned and analyzed to determine total length and diameter. Results : Phragmites : we can see an EDTA effective action on Cd, Ni, Pb Zn and Na accumulation in shoots while in rhizomes, there are significative differences only about Pb and Na. No differences in term of biomass production. EDTA became more available Cu and Zn in soil solution; nevertheless metals concentrations remain pretty low. Willows in growth chamber : no differences in leaves accumulation between species while Babylonica EDDS treated became the best performer in Cu, Ni, Pb and Zn accumulation, while it diminuish Na concentration. In stems babylonica appears the best, with and without EDDS for Cu, Zn and Na. About roots Babylonica is again one of best performer in Na, Zn and Cd accumulation. No differences between species or treatment in Ni accumulation. Comparing growth chamber willows with S. matsudana grown in field conditions, this one shows best performaces in leaves accumulation for Na (followed by “growth chamber matsudana”, fact that confirms the ability of the species in Na translocation), and for Cd and Ni with babylonica EDDS treated. In stems, “field matsudana” is the best accumulator of Na, Pb and Ni and it remains the best performer for root system except for Na. hydroponic trials confirm in leaves the strong competition of Na versus accumulation of other anions, particularly versus Cd, Ni, Pb and Zn ; competition versus Cu appears lighter instead. In stems le migliori performances di S. babylonica is the best accumulator of Cd, Cu, Zn and Ni, nevertheless it appears at the same time the best Na accumulator. In root system too babylonica is the best accumulator of Cd, Ni Zn and Na. The roots deepening evaluation trial shows in comparison with control of each species that babylonica root system should be the less suffering (according to accumulation data), while between four species grown on sludge Salix alba shows the deepest root system coupled with smallest diameters. This two characteristics should be a signal of less stress as found by Vamerali et al. 2008. Brassica juncea hydroponic trial show clearly interference of Na in metals accumulation. Anyway accumulation performances in hydroponic are clearly better than that ones of brassica grown in field conditions, also in presence of Na. It should mean that : Ahydroponic trial in this case isn’t reliable in a comparison with field conditions B) probably other limiting factors, as nutrients could affect metal accumulation and biomass production that is pretty low also because the quick flowering, another symptom of stress. Interaction of selenate and molybdate with the transport and assimilation of sulfate in Brassica juncea Recently MOT1, a transporter with an high affinity for Mo was identified in Arabidopsis thaliana (Tomatsu et al., 2007), but it’s common opinion plants could uptake Mo also using S transporters because the two anions are analogs and could compete in binding of active site of the same transporters (Dudev e Lim 2004; Alhendawi et al 2005). Once inside the cell, Mo can interfere with S methabolism becoming substrate for reactions catalyzed by ATP sulfurilase (APS), as is selenate, but in contrast to selenate no Mo containing products are formed in the reaction (Reuveny 1977). Given the significant impact that S fertilizers application may have on Mo and Se distribution and accumulation in plants (Shinmachi et al., 2010), this work studied interactions of sulfur nutrition with molybdenum and selenium in Brassica juncea. To this aim Brassica juncea seedlings were grown with different combinations of S and Se or S and Mo. Experiments were carried out in a short time (24h) as selenate and molybdate were given to plants at a very high concentration (200 µM), which was the same of sulfate in the S-sufficient condition. Chemical and physiological analyses were performed, including quantification of elements and plant growth. Tolerance index (% of fresh weight relative to the control) and root/shoot ratio show a greater stress for plants grown in S deficiency and in presence of Se and Mo. Se and Mo were more absorbed in minus S condition. Both for total S and sulfate Se and Mo competition becomes clear only between 6 and 24 h of treatment, while within an hour there are not significant changes in S uptake. Study on potential effects of Se accumulation on drought stress in Brassica juncea e Stanleya pinnata . Some Se accumulator species (Brassica spp, Stanleya spp, Astragalus spp.) uses Se accumulated as a weapon against herbivors (Freeman et al., 2007; Galeas et al. 2007 ; ) Brassica juncea , differently from other toxic or potentially toxic trace elements, accumulates Se also in flowers and seeds giving value to the hypothesis of an happening evolutionary in the use of Se against parassites and herbivors adaptation (Quinn C. et al., 2008). This two species were grown up in gravel and in hydroponic in presence (20 µM) and in absence of Sodium selenate. The water deficit was experimented at first on gravel by irrigation stopping for 8 days, then in hydroponic by adding polietilenglicol (PEG 10000), to modify Ψw of nutrient solution. In two hydroponic trials’ Ψw was brought to -1.3 / -1.6 Mpa. Measures of photosintetic efficency, biomass and water and osmotic potential show that there are no evidences of a positve effect of Se on drought tolerance except for the non stress condition or light stress (-0.5/-0.6 Mpa). This action, actually not very strong, increase biomass production in plants treated with selenate according to trials on Triticum aestivum (Yao Xiaoqin et al. ; 2009). Study of potentials of Se-accumulator Astragalus racemosus and non accumulator Astragalus convallarius as Ni, Mo, Cr, V, W, Te, Se and As accumulators. The genus Astragalus is composed by many species distributed in northern america, some of that adapted to live in seleniferous soils, so able to develop an high tolerance versus Selenium (Cowgill, 1990). Concentration of Arsenic, Nichel Chromium, Vanadium, Tellurium, Tungsten and Molibdenum raised up in the environment because human activities ( Bamhart 1997 ; Zarchinas et al 2004 ; Zoller et al. 1973 ; Gott and McCarthy 1966 ; ) . the aim of this work is to understand if adaptation to Se accumulation is effective also versus other elements, some of them analogs of Se. These two species of Astragalus germinated in Petri dishes then grown up in growth chamber for 3 months in Murashige & Skooge addicted agargel plus salts of elements mentioned above , mixed in different concentrations based on their degree of toxicity, in order to avoid a too quick death. Results showed that Se hyperaccumulator is not always more tolerant than the non accumulator (A. Convallarius showed more tolerance in V accumulation). Effects of Cu deficiency on Cu-proteins activity and on expression of laccases in leaves and stem of Populus trichocarpa Cu has a role of cofactor in function of several dismutases (enzymes catalyzing formation of H2O2 from R.O.S.) and in laccases enzyme (Pilon et al. 2006). Many clones of P. Trichocarpa were multiplyed and grown up in MS addicted agargel with two different Cu concentrations (0.1 µM e 5 µM) to verify trough quantification of Cu-enzymes activity (western blot and native gel) if and how much these two Cu concentrations (the first closest to the limit of deficiency and the second pretty high but far from toxicity ), could affect Cu-enzymes activity. Once quantified activity of Cu-SODdepending on Cu concentration, a preliminary investigation on Laccases regulation was done. Because Laccases needs four Cu ions and because in a condition closest to Cu deficiency, cell inhibits all Cu requiring enzymes except that necessary to make photosintesis like plastocianin, we wanted verify if Laccases faith was exactly the same. Primers were drawn (RNA short sequences neded to make a Polimerase Chain Reaction in vitro ) to amplify the target sequence of a miRNA (RNA short sequences that, coupled with RISC complex, cut down mRNA inactivating it) (Yamasaky et al. 2007; Abdel Ghani et al 2008) and to obtain after an electrophoretic run, bands of different intensity, depending on the down regulation action made by cell. Preliminary results show different levels of expression for several kinds of laccase in stem and leaves.
Introduzione generale L’attività di ricerca svolta nel triennio 2007-2009 si colloca nell’ambito della fitodepurazione. Con questo termine si identifica una serie di tecniche (fitoestrazione, fitostabilizzazione, fitovolatilizzazione) basate sull’impiego di specie vegetali diverse (l’elenco delle quali è in continua evoluzione) ma accomunate dalla capacità di sopravvivere su substrati contaminati da diversi inquinanti prodotti dall’attività umana e di interagire con il substrato in modo tale, a seconda dei casi, da depauperarne il contenuto di inquinanti accumulandoli nei propri organi e/o liberandoli nell’atmosfera attraverso l’evapotraspirazione fogliare, oppure impedendone la lisciviazione. L’attitudine ad un’azione di fitorimedio varia fortemente da specie a specie e all’interno della stessa specie in base al corredo genetico . Relativamente alla capacità di rimozione di metalli pesanti, sono state individuate due classi di specie accumulatrici: Iperaccumulatrici : sono specie tipiche di suoli metalliferi, in grado di portare a termine il proprio ciclo vitale senza manifestare sintomi di deperimento dovuti all’alta concentrazione di metalli (Baker et al., 2000). Per essere definita iperaccumulatrice, una specie deve rientrare nei seguenti limiti inferiori di bioaccumulo: 100 mg/Kg s.s. di Cd, 1000 mg/Kg s.s di Pb, 10000 mg/Kg s.s. di Zn ; i ranges per quanto riguarda l’arsenico non sono ancora stati ben definiti (Baker and Brooks 1989, Baker et al., 2000). Tra le specie iperaccumulatrici le più rappresentative sono quelle appartenenti al genere Thlaspi, Arabidopsis halleri e Viola calamarina, Astragalus spp oltre a diverse specie appartenenti alle famiglie delle Cariophyllaceae, Fabaceae, Poaceae, Chenopodiaceae, Brassicaceae e Cyperaceae. Per quanto riguarda l’iperaccumulo di arsenico spicca Pteris vittata. Il limite delle specie iperaccumulatrici è la scarsa produzione di biomassa. Accumulatrici: a questo gruppo appartengono specie, ad habitus sia erbaceo che arboreo, in grado di ottenere buone concentrazioni di metalli e metalloidi nei propri organi, pur non arrivando a livello delle iperaccumulatrici, e una buona produzione di biomassa. Fra esse sono state individuate Brassica juncea, e il genere Salix. Le caratteristiche di queste accumulatrici le rendono idonee a programmi di disinquinamento a breve e medio termine, soprattutto per suoli poco o mediamente inquinati. La possibilità di avere una considerevole produzione di biomassa permette di pensare, come seconda fase, al reimpiego di questa per la produzione di energia ed il recupero dei metalli pesanti di interesse industriale ((Kabata-Pendias and Pendias, 1992 ; Pullford and Dickinson 2004 ; Paulson et al 2003; French et al 2005; Ebbs et al 1997 ; Ebbs et al 1998). Il lavoro triennale, suddiviso in diverse fasi, come descritto in seguito, si propone di approfondire la conoscenza su alcune delle specie suddette , sia dal punto di vista della risposta fisiologica sia , con un taglio maggiormente applicativo, dal punto di vista della valutazione di performaces di bioaccumulo al fine di sostituire, ove possibile, tecniche di bonifica invasive e costose con la fitodepurazione che, nelle sue diverse applicazioni, si dimostra piu’ rispettosa del territorio, anche dal punto di vista estetico e considerevolmente piu’ vantaggiosa economicamente. Prove di valutazione della capacita’ di accumulare metalli pesanti da parte di quattro specie di Salice (Salix spp) , di Phragmites australis e Brassica juncea. Date queste premesse, in collaborazione col dipartimento I.M.A.G.E. della Facoltà di ingegneria dell'Università di Padova, nell’ambito del PRIN 2005 ““Risanamento di sedimenti marini, lagunari e fluviali” sono state messe a punto delle prove sperimentali finalizzate a comprendere le potenzialità di Salix spp, di Brassica juncea e Phragmites australis nel mettere in atto un'azione di fitorimedio su sedimenti provenienti dal dragaggio della laguna di Venezia nella zona di porto Marghera. Il campionamento dei fanghi è stato effettuato in quattro siti (canale industriale nord, due punti del canale industriale ovest, bacino dell'Evoluzione), quindi i campioni sono stati catalogati e caratterizzati. In vista dell’allestimento di possibili impianti finalizzati al fitorisanamento dei fanghi dragati dall’area di Porto Marghera, sono state allestite delle prove sperimentali con l’intento di definire le potenzialità fitoestrattive di Salix matsudana, S. babylonica, S. alba e S. fragilis, Phragmites australis e Brassica juncea e valutarne quindi l’idoneità ad essere messe a dimora su questi sedimenti, anche in base alla capacità di sopravvivenza ed alla produzione di biomassa. I campioni provenienti dai 4 siti, sono stati miscelati tra loro ed in rapporto 1:1 con della sabbia di fiume, sia per ottenere un substrato con valori omogenei relativamente alle concentrazioni di inquinanti, sia per aumentare la capacità drenante di un substrato altrimenti totalmente asfittico. Prova su mesocosmo : Dopo test preliminari che hanno evidenziato l’impossibilita’ di condurre prove, ceteris paribus, anche su Salix Babylonica, Fragilis ed Alba, su Thypha latifolia e su Zea Mais, sono state allestite 7 vasche (2 dedicate a Phragmites australis, 2 a Salix Matsudana e 2 a Brassica juncea ed una priva di vegetazione, della capienza di 50 L (riempite fino a 35 L) ciascuna, munite di un tubo per il drenaggio del percolato alla base. Sul fondo delle vasche è stato depositato uno strato di argilla espansa e l’ingresso del tubo è stato protetto dall’intasamento con un filtro Le talee di salice ed i semenzali di brassica sono state messe a dimora con un piccolo pane di terriccio universale al fine di attutire gli effetti dello stress da trapianto e di permettere all’apparato radicale di accrescersi a sufficienza prima di esplorare il sedimento contaminato, mentre i rizomi di Phragmites hanno attecchito a diretto contatto col substrato oggetto di analisi. Dopo due mesi dall’inizio della prova, ad una delle vasche ospitanti la Phragmites e’ stato addizionato il chelante EDTA. Prove in idroponica : prendendo come riferimento le concentrazioni di 5 tra metalli pesanti riscontrati nell’analisi dei campioni di percolato (Ni,Cd, Zn, Cu, Pb,) e la concentrazione media del Na (intorno a 0,2 M) sono state allestite degli allevamenti in coltura idroponica con talee, oltre che di S. matsudana, anche di S. alba, S. babylonica , S. fragilis e di Brassica juncea. Per quanto riguarda i salici, la soluzione contenente inizialmente una soluzione nutritiva di tipo hoagland, è stata arricchita dai suddetti 5 metalli, in concentrazione pari a quella riscontrata nelle acque di percolazione. Per ogni specie di salice è stato allestito un beacker di controllo con sola soluzione nutritiva, un becker con soluzione nutritiva, più i metalli ed uno con le caratteristiche precedenti più NaCl a concentrazioni crescenti (da 0,05 M fino a 0,2 M). Per le brassiche sono stati allestiti 5 becker con 40 piantine ciascuno. Un beacker di controllo con soluzione nutritiva, due con concetrazione di metalli pari a quella del percolato, due con concentrazione di metalli pari al percolato più NaCl 0,05 M (aumentato fino a 0,2 M nel corso di 3 settimane). Alla fine del periodo di trattamento sono state separate e pesate parte aerea ed apparato radicale dei semenzali e ne sono stati analizzati i contenuti in metalli e Na. Prove su microcosmi : sono state allestite 5 taniche da 20 L ciascuna, dotate di rubinetto alla base e sistemate in cella climatica, tutte dotate di uno strato drenante di ghiaino alla base, un orizzonte costituito solo da sedimento ed uno, quello più superficiale, di terriccio universale. Quattro taniche hanno ospitato ciascuna tre talee (una specie per ogni tanica) e otto piantine di Paspalum vaginatum, la quinta tre talee di S. Babylonica e otto piantine di Paspalum. L’insediamento delle talee e della graminacea è durato 50 giorni. Nella settimana successiva alla messa a dimora dei S. Babylonica nella quinta tanica è stato aggiunto l’ EDDS, un chelante che ha lo scopo di rendere più biodisponibili i metalli pesanti presenti nel substrato. Studio dell’approfondimento radicale dei salici : per verificare la capacità delle quattro specie di salice, di esplorare il sedimento contaminato sono state allestite 24 bottiglie in pet da 2 L, di cui 16 riempite con lo stesso contenuto delle taniche e 8 (due per specie) riempite con del terreno proveniente dall’Azienda Sperimentale “L. Toniolo”. In ogni bottiglia è stata messa a dimora una talea di salice (6 bottiglie per specie). Al termine dei 50 giorni di prova condotti in camera di crescita, è stata asportata la parte aerea della talea, le bottiglie sono state congelate e poi segate in tre parti corrispondenti alla sezione contenente il terriccio e a due parti conteneti il sedimento. Tutte le radici presenti sono state estratte , lavate e pesate e sottoposte a scansione digitale. Risultati : Phragmites : azione efficace del chelante EDTA per quanto riguarda l’accumulo di Cd, Ni, Pb Zn e Na nei fusti di Phragmites, mentre differenze significative nei rizomi sono state riscontrate solo per Pb e Na. Nessuna differenza in termini di biomassa prodotta. Il chelante ha reso maggiormente disponibile nella soluzione circolante Cu e Zn anche se le concentrazioni restano molto basse. Salici nelle taniche in cella climatica : gli accumuli a livello fogliare non mostrano differenze significative tra le quattro specie non trattate. Mentre l’EDDS incrementa le prestazioni del babylonica rispetto a se stesso ed alle altre specie per quanto riguarda Cu, Ni, Pb e Zn mentre riduce la concentrazione di Na. A livello di fusti la suddetta differenza si esplica nelle concentrazioni di Cu, Zn e Na; questi ultimi risultano maggiormente accumulati dal babylonica sia con che senza chelante. A livello radicale il babylonica risulta ancora uno dei migliori accumulatori del lotto per quanto riguarda Na, Zn e Cd. Nessuna differenza ne tra specie ne tra presenza/ assenza di chelante per quanto riguarda il Ni. In un confronto tra questi salici ed il matsudana cresciuto piu’ a lungo e in condizioni di T , umidita’ e fotoperiodo variabili, a livello fogliare il salice cresciuto in mesocosmo presenta valori di Na significativamente piu’ alti degli altri salici, seguito dal matsudana cresciuto in cella, a conferma dell’atitudine di questa specie a traslocare piu’ facilmente il Na nella chioma. Anche riguardo Cd e Ni il matsudana di campo denuncia tra i valori piu’ elevati assieme al babylonica trattato con EDDS. Nei fusti, per Na ,Pb e Ni ci sono differenze significative in favore del S. matsudana di campo. A livello radicale il S. matsudana cresciuto in mesocosmo presenta valori significativamente piu’ alti rispetto alle prove in cella climatica ad eccezione del Na. Le prove in idroponica confermano, a livello fogliare che l’accumulo di Na compete fortemente con l’uptake dei metalli, in particolare nei confronti di Cd, Ni, Pb e Zn ; piu’ sfumata invece l’azione competitiva verso il Cu. Da rilevare, a livello di fusti le migliori performances di S. babylonica per Cd, Cu, Zn e Ni, nonostante si rilevi nel contenpo il primato nell’accumulo di Na. Anche a livello radicale il babylonica accumula piu’ delle altre specie per quanto riguarda Cd, Ni Zn e Na. La prova sullo sviluppo radicale mostra, nella comparazione col rispettivo controllo, che l’apparato radicale di S. babylonica risulta il meno sofferente tra le quattro specie (in accordo quindi con i dati di accumulo), mentre comparando le quattro specie cresciute sul sedimento, il Salix alba risulta avere l’apparato piu’ sviluppato in profondita’ e con i diametri minori , segno questo che potrebbe essere considerato di minor sofferenza, come riscontrato anche da Vamerali et al. 2008. L’allevamento in idroponica di Brassica juncea evidenzia differenze significative tra l’accumulo di metalli in presenza di Na rispetto all’accumulo in assenza di quest’ultimo. Le performances di accumulo rispetto alle brassiche cresciute su fango sono nettamente migliori, anche in presenza di Na , a testimonianza del fatto che A) l’idroponica non offre termini di paragone affidabili rispetto alle condizioni di campo B) probabilmente intervengono altri fattori, come la carenza di nutrienti, a condizionare l’accumulo di metalli e la produzione di biomassa che risulta bassa anche per la precocita’ della fioritura, sintomo della condizione di stress. Interazione del selenato e del molibdato con il trasporto e l’assimilazione di solfato in Brassica juncea Recentemente e’ stato individuato in Arabidopsis un trasportare (MOT1) con elevata affinita’ per il Mo (Tomatsu et al., 2007), ma si ritiene che le piante assorbano Mo anche attraverso i trasportatori del S poiche’ i due anioni hanno caratteristiche simili e potrebbero competere nell’occupare il sito attivo degli stessi trasportatori (Dudev e Lim 2004; Alhendawi et al 2005). Una volta all’interno della cellula, Mo puo’ interferire col metabolismo dello S divenendo substrato per le reazioni catalizzate dall’ ATP sulfurilasi (APS), come accade per il Se ma, a differenza di quest’ultimo non si riscontra la formazione di prodotti contenenti Mo derivanti da questa reazione (Reuveny, 1977). A causa del significativo impatto che l’applicazione di fertilizzanti a base di S puo’ avere sulla distribuzione di Se e Mo e sul loro accumulo nelle piante (Shinmachi et al., 2010), si e’ cercato di capire, in questo lavoro,quale sia l’interazione tra l’uptake di S e il Se e Mo in Brassica juncea. A questo scopo semenzali di Brassica juncea sono stati allevati con differenti combinazioni di S e Se o S e Mo. Gli esperimenti sono stati condotti nel breve periodo (24h) poiche’ selenato e molibdato sono stati somministrati ad alte concentrazioni (200 µM), le stesse del solfato in condizioni di normale apporto di S. Sono state condotte analisi relative all’accumulo di S, Se e Mo e ai paramentri di crescita. L’indice di tolleranza (% del peso fresco sul controllo) e il rapporto radici/fusti denuncia un maggiore stress per le piante cresciute in carenza di zolfo e in presenza di Se e Mo. Se e Mo sono risultati maggiormente assorbiti in carenza di S. Sia per quanto riguarda lo S totale , sia riguardo al ssolfato, la competizione con Se e Mo si nota solo tra le 6 e le 24 h di trattamento, mentre nel brevissimo periodo (entro 1 h) non si apprezzano cambiamenti significativi nell’assorbimento di S. Studio dei potenziali effetti del Selenio sulla tolleranza allo stress idrico da parte di Brassica juncea e Stanleya pinnata . Talune specie accumulatrici di Se (Brassica spp, Stanleya spp, Astragalus spp.) usano questa peculiarita’ per difendersi dai predatori (Freeman et al., 2007; Galeas et al. 2007 ; ) e recentemente si e’ visto che Brassica juncea , a differenza di quello che succede per altri elementi tossici o potenzialmente tossici, accumula selenio in grandi quantita’ anche nei fiori e nei semi, avvalorando l’ipotesi, per certe specie o sottospecie o addirittura per alcune popolazioni in via di speciazione, di un adattamento evoluzionistico nell’uso del selenio contro parassiti e predatori erbivori (Quinn C. et al., dati non ancora pubblicati).Su queste due specie sono state condotte prove su substrato ghiaioso e in idroponica in presenza (20 µM) e in assenza di Selenato di sodio. Il deficit idrico e’ stato applicato prima su substrato ghiaioso attraverso la mancata irrigazione, poi in idroponica attraverso l’aggiunta di polietilenglicol (PEG 10000), un composto organico che altera il Ψ idrico della soluzione nutritiva. Nei due esperimenti condotti in idroponica il potenziale e’ stato portato fino a -1.3 / 1.6 Mpa. Dalla misurazione della capacita’ fotosintetica sotto stress idrico, della biomassa e del Ψ idrico fogliare nei diversi esperimenti, si e’ arrivati alla conclusione che non vi e’ una evidente azione positiva del Se nei riguardi della tolleranza allo stress idrico se non per quanto riguarda la condizione di controllo (non stress) e di stress lieve (-0.5/0.6 Mpa). Questa azione, pur non marcata, si esplica nell’aumento di biomassa superiore in piante trattate con selenato rispetto a quelle non trattate in accordo con quanto riscontrato per semenzali di Triticum aestivum (Yao Xiaoqin et al. ; 2009). Studio delle potenzialita’ di Astragalus racemosus (iperaccumulatore di Selenio) e Astragalus convallarius (non accumulatore) nel ruolo di accumulatori di Nichel, Molibdeno, Cromo, Vanadio, Tungsteno, Arsenico, Tellurio e Selenio. Il genere Astragalus comprende diverse specie distribuite in america centro settentrionale, alcune delle quali adattate a vivere su suoli seleniferi e quindi in grado di sviluppare un’elevata tolleranza al Se, divenendo cosi’ iperaccumulatrici (Cowgill, 1990). Arsenico, Nichel Cromo, Vanadio, Tellurio, Tungsteno e Molibdeno sono tutti elementi la cui concentrazione nell’ambiente e’ aumentata a causa dell’attivita’ umana ( Bamhart 1997 ; Zarchinas et al 2004 ; Zoller et al. 1973 ; Gott and McCarthy 1966 ; ) . e l’obiettivo di questo studio e’ capire se gli adattamenti fisiologici nei confronti dell’accumulo di Se siano efficaci anche nei confronti di altri metalli pesanti e metalloidi, in particolare Cromo e Tellurio che presentano caratteristiche steriche simili al Selenio. Queste due specie di Astragalus sono state fatte germinare in piastra petri e quindi fatte crescere in camera di crescita per 3 mesi su substrato di agargel piu’ Murashige & Skooge e addizionato con sali degli elementi sopra indicati dosati in concetrazioni differenti in base al loro grado di tossicita’ (affinche’ le piante potessero crescere ed accumulare metalli senza patirne la tossicita’ fino a morirne troppo precocemente). I risultati hanno dimostrato che non sempre la specie iperaccumulatrice di Selenio ha le caratteristiche per tollerare l’accumulo anche di altri elementi (A. Convallarius si e’ dimostrato piu’ tollerante nell’accumulo di Vanadio). Studio degli effetti del Rame nella fisiologia di Populus trichocarpa ed in particolare sull’attivita’ della proteina Laccasi, coinvolta nella formazione della parete cellulare. Il Rame e’ coinvolto come cofattore, nel funzionamento di diverse dismutasi (proteine che trasformano i ROS in H2O2) oltre che essere cofattore per il funzionamento delle laccasi (Pilon et al. 2006). Allevando in agargel e moltiplicando diversi cloni di Populus trichocarpa generati a partire dallo stesso callo, con due diverse concentrazioni di Cu (0.1 µM e 5 µM) si e’ voluto verificare attraverso analisi dell’attivita’ proteica (western blot e native gel) se e quanto due concentrazioni di rame (una prossima al limite inferiore che ne decreta la carenza ed una piuttosto elevata ma ben entro i limiti di tossicita’), influenzino l’omeostasi cellulare. Una volta verificato la diversa intensita’ dell’attivita’ delle proteine in questione (MnSOD, Cu/ZnSOD, FeSOD, CCS ecc. In base alla concentrazione di rame fornita, si e’ passato ad uno studio preliminare dell’espressione della Laccasi in base alle due diverse concentrazioni di rame. Poiche’ la laccasi necessita anch’essa del Cu come cofattore (4 ioni Cu ) e poiche’ in uno stato di carenza o prossimo alla carenza di rame, la cellula inibisce l’espressione di tutte le proteine che richiedono rame e che non sono strettamente necessarie alla fotosintesi come invece lo e’ la plastocianina, si e’ voluto verificare se la laccasi subisse esattamente questo destino. Sono stati quindi disegnati dei primers (sequenze innesco per amplificare col metodo PCR il DNA retrotrascritto da RNA) che contemplassero l’amplificazione della sequenza bersaglio dei microRNA (sequenze brevi di RNA che in coppia col complesso proteico RISC tagliano e quindi inattivano l’RNA messaggero) (Yamasaky et al. 2007; Abdel Ghani et al 2008) in modo da avere, dopo la corsa elettroforetica su gel di agarosio, bande di intensita’ diversa in base all’azione di downregulation operata o meno dalla pianta. I risultati preliminari mostrano diversi livelli di espressione per diversi tipi di laccasi analizzati presenti nel fusto e nelle foglie,