Academic literature on the topic 'Sphéroïde tumoraux'

L'infiltration tissulaire des macrophages est un facteur aggravant dans de nombreuses pathologies telles que les maladies inflammatoires chroniques ou le cancer. Les macrophages qui infiltrent les tumeurs de façon continue sont appelés macrophages associés aux tumeurs (TAMs). Ils favorisent la croissance tumorale, l'angiogenèse, l'invasion tumorale et la formation de métastases. L'inhibition de l'infiltration des macrophages est donc devenue une évidence thérapeutique. Récemment, l'équipe a démontré que les macrophages utilisent le mode migratoire amiboïde (dépendant de ROCK) ou mésenchymal (dépendant des protéases) selon l'architecture de la matrice extracellulaire (MEC) en trois-dimensions (3D) qu'ils traversent. De plus, l'étude du mode migratoire mésenchymal a montré qu'il est dépendant de Hck (une tyrosine kinase spécifique des phagocytes) et de sa capacité à réorganiser les podosomes en rosettes (structures riches en actine dégradant la MEC). Mon projet de thèse s'est articulé autour de deux axes de recherche : 1) l'identification des substrats de Hck et la caractérisation de leur rôle dans l'organisation des podosomes et la migration 3D des macrophages, et 2) l'étude de la migration 3D des monocytes/macrophages primaires humains dans un modèle mimant le microenvironnement tumoral : les sphéroïdes tumoraux. Par une approche protéomique j'ai identifié des partenaires et substrats potentiels de Hck dont la Filamine A (FLNa), une protéine assurant notamment la liaison entre le cytosquelette d'actine et les intégrines. En utilisant différents outils (protéines recombinantes, anticorps, shRNA. . . ) j'ai montré que : 1) Hck phosphoryle la FLNa in vitro, 2) la FLNa est associée aux podosomes et est nécessaire à leur organisation en rosettes sous le contrôle de Hck, 3) les podosomes des cellules déficientes en Flna ont une durée de vie plus courte, et 4) l'expression de la FLNa est nécessaire à la migration mésenchymale, mais pas à la migration amiboïde des macrophages dans une MEC en 3D. Ainsi la FLNa est impliquée dans la formation et à la stabilisation des podosomes, à leur organisation en rosettes, la migration mésenchymale des macrophages et pourrait se situer dans la voie de signalisation de Hck. En parallèle, j'ai mis au point un modèle de sphéroïdes tumoraux qui m'a permis de montrer que l'infiltration des monocytes ou des macrophages, dans ce modèle tissulaire in vitro, est dépendante de ROCK et des protéases, signature de l'utilisation des deux modes migratoires. Puis en incubant ces sphéroïdes au sein de MEC, j'ai démontré que la présence de macrophages infiltrés dans les sphéroïdes est nécessaire pour déclencher le pouvoir invasif des cellules tumorales qui émigrent des sphéroïdes en suivant les macrophages et infiltrent la MEC environnante. Les macrophages Hck-/- présentant un défaut de migration mésenchymale, sont significativement moins efficaces dans la promotion de l'invasion des cellules tumorales. Ces résultats indiquent que l'activité de migration et de remodelage de la matrice exercée par les macrophages est prépondérante dans l'invasion tumorale in vitro. Ces résultats ont permis d'établir le mode migratoire des macrophages infiltrant un modèle tissulaire in-vitro et de démontrer le mécanisme d'action des macrophages dans l'invasion tumorale. Ainsi, mes travaux de thèse ont permis de progresser dans la caractérisation des mécanismes moléculaires et cellulaires de la migration 3D des macrophages humains. En effet, j'ai pu 1) identifier une protéine nécessaire à la migration mésenchymale des macrophages, 2) mettre en évidence l'utilisation par les macrophages des modes migratoires amiboïde et mésenchymal lors de leur infiltration dans un modèle de tumeur en trois-dimensions, les sphéroïdes tumoraux et 3) montrer que le remodelage de la matrice par les macrophages, lors de leur migration, joue un rôle prépondérant dans l'invasion tumorale
Tissue infiltration of macrophages is an aggravating factor in many diseases such as chronic inflammation and cancer. Macrophages that infiltrate tumors are called tumor-associated macrophages (TAMs). They promote tumor growth, angiogenesis, invasion and metastasis. Thus, inhibition of macrophage infiltration has become a therapeutic goal. Recently, the team demonstrated that macrophages use the amoeboid (depending on ROCK) or the mesenchymal (depending on proteases) migratory mode according to the extracellular matrix (ECM) architecture in three dimensions (3D). In addition, the study of the mesenchymal migration mode showed that it is dependent on Hck (a phagocyte-specific tyrosine kinase) and its ability to reorganize podosomes (ECM-degrading actin-rich structures) into rosettes. My thesis project was organized around two axes 1) the identification of substrates of Hck and the characterization of their role in the organization of podosomes and 3D migration of macrophages, and 2) the study of the 3D migration mechanisms of primary human monocytes/ macrophages within an in vitro tumor model: tumor cell spheroids. By a proteomic approach, I have identified potential partners and substrates of Hck, including the protein Filamin A (FLNa), a protein interacting with the actin cytoskeleton and integrins. Using different tools (recombinant proteins, antibodies, shRNA. . . ) I showed that: 1) Hck phosphorylates FLNa in vitro, 2) FLNa is localized to podosomes and is necessary for their organization as rosettes under the control of Hck, 3) the podosomes of FLNa-deficient cells have a shorter life span, and 4) the expression of FLNa is required for mesenchymal migration, but not for amoeboid migration of macrophages in a 3D ECM. Thus, FLNa could be a substrate of Hck necessary for the formation and stabilization of podosomes and their organization as rosettes, and is required for the mesenchymal migration of macrophages. In parallel, I developed a model of tumor cell spheroids, which allowed me to show that the infiltration of monocytes or macrophages in this in vitro tissue model of tumor is dependent on ROCK and proteases, signature of the use of the two migration modes. Then, when spheroids were embedded into ECM, I demonstrated that the presence of macrophages infiltrated into the spheroids is necessary to trigger the invasiveness of tumor cells. Indeed, macrophages infiltrate first the surrounding ECM and tumor cells follow macrophages in the matrix outside of the spheroid. Hck-/- macrophages, that are defective in mesenchymal migration, are significantly less effective in promoting the invasion of tumor cells. These results indicate that the activity of migration and matrix remodeling exerted by macrophages is prominent in tumor invasion. These results have established the migratory mode of macrophages infiltrating an in vitro tumor model and a mechanism required for tumor invasiveness promoted by macrophages. Thus during my thesis, I characterized the molecular and cellular mechanisms of 3D migration of human macrophages. Indeed, I have been able to: 1) identify a protein necessary for the mesenchymal migration of macrophages, 2) highlight the use by macrophages of the amoeboid and mesenchymal migration modes during their infiltration into an in vitro tumor model in 3D and 3) show that the matrix remodeling activity of macrophages during their migration plays a critical role in tumor cell invasion

Les dispositifs plasma à la pression atmosphérique (PA) produisent de nombreuses espèces actives physiques (photons, particules chargées, champ électriques etc.) et chimiques (radicaux libres, espèces réactives de l'oxygène, espèces réactives de l'azote etc.). Ces espèces connues pour leurs effets biologiques directs ou indirects font de l'utilisation des jets de plasmas froids à la PA pour des traitements biomédicaux un sujet de recherche en plein développement. La recrudescence des cas de radiorésistance et chimiorésistance chez les micro-organismes et les cellules cancéreuses impose la recherche de nouveaux modes de traitements innovants. C'est dans ce contexte général que s'inscrit les travaux présentés ici dont l'enjeu majeur est la compréhension des mécanismes d'actions des plasmas froids à la PA sur le cancer colorectal (deuxième cause de mortalité par cancer en France). Le travail de thèse présenté concerne l'utilisation d'un modèle biologique in-vitro (sphéroïde tumoraux multicellulaire du cancer du côlon HCT116) en 3 dimensions qui permet de prendre en compte des paramètres déterminants dans la prolifération tumorale. Ce modèle permet ainsi une meilleure prédiction des résultats in vivo dans l'objectif d'une étude clinique ultérieure. De plus les cinétiques de créations des espèces actives ont été étudiées dans leur globalité depuis le dispositif plasma jusqu'aux interactions intracellulaires à partir d'analyses physiques, biologiques et chimiques. Le traitement indirect par utilisation de liquides activés par jet de plasma d'hélium a été privilégié pour élaborer un traitement endoscopique du cancer colorectal. L'ensemble des travaux menés sur l'observation des interactions des liquides activés par plasma sur les sphéroïdes tumoraux multicellulaires a permis de révéler deux modes d'actions distincts. Le premier étant une génotoxicité du liquide activé induite par la présence de peroxyde d'hydrogène dont l'action induit une cassure double brin de l'ADN intracellulaire conduisant les cellules à la mort par apoptose. Une interaction directe des radicaux libres produits dans le milieu avec les composants de ce dernier (acides aminés, glucose, etc.) ainsi que la présence de nitrites et nitrates induisent également un effet antiprolifératif à long terme du milieu activé par plasma sur les tumeurs HCT116. Différentes méthodes comme la résonance paramagnétique électronique et la spectroscopie d'émission optique ont permis de révéler des voies de création possibles conduisant à la formation de ces espèces actives. Des campagnes d'essais thérapeutiques ont permis d'évaluer la capacité des liquides activés par plasma à cibler davantage les cellules cancéreuses plutôt que les cellules saines ce qui en fait une méthode de traitement sélectif particulièrement prometteuse. Le développement et la caractérisation d'un second jet de plasma d'argon a été réalisé avec l'objectif d'optimiser l'effet antiprolifératif des plasmas sur les tumeurs tout en tenant compte des contraintes imposées par l'utilisation d'un tel dispositif pour le traitement du cancer colorectal
Plasma devices at atmospheric pressure (AP) generate many physical active species (photons, charged particles, electric field, etc.) and chemical (free radicals, reactive oxygen species, reactive nitrogen species, etc...). This species are well known for their direct or indirect biological effects thus biomedical treatment by low temperature plasma jets at AP is currently a hot research topic. The upsurge of radioresistance and chemoresistance of microorganisms and cancer cells requires the development of new biomedical treatment. In this general context, the present work is a step towards the understanding of the effect induced by low temperature plasma jets at atmospheric pressure on colorectal cancer (second leading cause of death by cancer in France). This thesis focuses on the implementation of an in vitro biological model (multicellular tumor spheroid of colorectal cancer HCT116) in 3 dimensions which allows to take into account key parameters in tumor proliferation. This model is also well suited for the prediction of in vivo results in the aim of a subsequent clinical study. Further research about kinetic reactions of active species has been studied from the plasma device up to intracellular interactions through physical, biological and chemical analyses. Indirect treatment of tumors was carried out through helium plasma jet activated liquids. This solution was chosen for its relevance for endoscopic treatment of colorectal cancer. Interaction between plasma activated liquid and multicellular tumor spheroids has shown two distinct pathways. The first one is the genotoxicity of activated medium induced by the occurrence of hydrogen peroxide which induced DNA damages once penetrated in intracellular medium and leading to cell death by apoptosis. A direct interaction between free radicals generated in liquid medium and the latter components (amino acids, glucose, etc.) associated with the occurrence of nitrites and nitrates induces a long-term antiproliferative effect of plasma activated liquid. Chemical pathways of the formation of these active species were identified by using different analysis techniques such as electron paramagnetic resonance and optical emission spectroscopy. Therapeutic analysis have also demonstrated that plasma activated liquid damage preferentially colon cancer cells rather than healthy cells making it a particularly promising selective treatment method. The design and the characterization of a second plasma jet using argon as a carrier gas was carried out with the aim to improve the antiproliferative effect of plasmas on tumors while taking into account the requirement for the use of such device for colorectal cancer treatment

Une tumeur est une structure hautement organisée en 3D, intégrant des relations entre les cellules et avec son environnement. Le remodelage de l'environnement par la tumeur et sa croissance dans un environnement restreint induisent un déséquilibre de l'homéostasie tissulaire et l'accumulation d'un stress mécanique au niveau de la tumeur. Il a été montré que ce stress mécanique est un paramètre important du développement tumoral qui influence, entre autre, la migration et la prolifération des cellules tumorales. Un des aspects majeurs du contrôle de la prolifération cellulaire est la régulation du cycle cellulaire. De nombreuses études montrent que le déroulement de la mitose, étape de division du cycle cellulaire, est régulée par les propriétés mécaniques de l'environnement cellulaire. Cependant, l'impact des contraintes mécaniques sur la progression en mitose a essentiellement été étudié sur des modèles de culture en monocouche et les conséquences induites sur le développement tumoral sont encore méconnues. Dans ce contexte, l'objectif de mes travaux est d'étudier l'impact des contraintes mécaniques sur la division cellulaire, dans un modèle tumoral multicellulaire 3D, le sphéroïde. Ce modèle mime l'organisation multicellulaire et l'hétérogénéité cellulaire telles qu'elles existent in vivo dans des microrégions tumorales. Afin de mimer un environnement confiné, des microsdispositifs ont été fabriqués pour restreindre la croissance et contraindre mécaniquement les sphéroïdes. Ces conditions expérimentales nous ont permis de démontrer que la contrainte mécanique altère la division des cellules au sein des sphéroïdes. L'étude de la dynamique de progression en mitose de sphéroïdes contraints dans un dispositif en agarose adapté à l'imagerie en temps réel, a révélé un délai en prométaphase induit par la contrainte mécanique, probablement du à un défaut transitoire de mise en place du fuseau bipolaire et impliquant le cytosquelette d'actomyosine. Ce défaut ne semble pas induire un défaut d'orientation préférentiel de l'axe de division observé dans les sphéroïdes. De plus, ces résultats montrent qu'en condition de croissance en présence d'un stress mécanique, des traitements déstabilisant le cytosquelette d'actomyosine n'induisent pas d'altération de la mitose, suggérant que des voies de signalisation permettant d'éviter les erreurs de progression en mitose soient activées. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la contrainte mécanique induite par la croissance progressive des sphéroïdes dans un environnement confiné ralentit la progression en mitose. Ce ralentissement peut être responsable d'erreurs de ségrégations des chromosomes induisant une augmentation de l'instabilité génétique et une hétérogénéité cellulaire. Cette hétérogénéité est caractéristique des tumeurs et souvent responsable de l'efficacité limitée des stratégies thérapeutiques actuelles. Les travaux réalisés viennent enrichir les connaissances de la réponse des cellules tumorales à leur environnement mécanique tel qu'il existe in vivo et ses conséquences sur le développement tumoral. Il permet aussi d'identifier les caractéristiques importantes des paramètres mécaniques à prendre en compte pour définir l'efficacité des traitements, et ouvre de nouvelles perspectives de thérapies antitumorales
A tumor micro-region consists of a heterogeneous cancer cell population organized in a 3D structure in which cell growth is influenced by interaction with the microenvironment. Changes in mechanical homeostasis within tissues are observed during tumor growth, leading to high pressure and tension forces within the growing tumor. Those changes in mechanical properties of the microenvironment participate to tumor development by influencing, amongst others, proliferation and migration of tumor cells. One important aspect of the control of proliferation is the regulation of the cell cycle. Many studies have demonstrated that mitosis progression, the division process of cell cycle, is not only biochemically regulated, but also mechanically regulated. However, the impact of mechanical cues on mitotic progression has essentially been documented using 2D monolayer-based models and very little is known about the consequences of mechanical stress on cell division within tumors. In this context, my goal was to investigate the impact of mechanical stress on cell division in MultiCellular Tumor Spheroids (MCTS), an in vitro model that mimics 3D cell organization and heterogeneity found in tumor microregions in vivo. We first induced mechanical stress on MCTS by restricting their growth in a confined environment. We demonstrated that mechanical stress impairs cell division. The study of the dynamics of mitosis progression within MCTS mechanically constrained in agarose, showed that mechanical stress induces a delay in prometaphase. This delay may be due to a transient defect in spindle assembly, and possibly implies actin filament dynamics. This defect in spindle assembly does not seem to induce a preferential orientation deviation of the division axis of cells within spheroids. Futhermore, we showed that in this mechanical stressed condition, drugs destabilizing the actomyosin cytoskeleton do not alter mitosis anymore, suggesting that signaling pathways could be activated and avoid aberrant mitosis progression. Altogether these results suggest that mechanical stress induced by progressive confinement of growing spheroid could slow down mitotic progression. However, a defect in mitosis progression could lead to chromosomes missegregation, responsible for increased genomic instability and cellular heterogeneity. This genetic heterogeneity characteristic of tumors is one of the major reasons for the limited efficiency of current therapeutic strategies. Mechanical stress might also induce the activation of specific pathways able to bypass the effect of certain drugs. This study paves the way for future research to a better understanding of the tumor cell response to mechanical cues similar to those encountered during in vivo tumor development. It could contribute to defining important characteristics of mechanical parameters of tumor on drug efficiency and open new perspectives in anti-tumor therapy

L'oxygène singulet (1O2) , premier état électronique excité du dioxygène, est l'agent cytotoxique majeur en photo-thérapie dynamique. Nous avons utilisé l'activation optique directe du dioxygène pour faire un lien quantitatif entre taux de production d'1O2 et mort cellulaire. Dans des sphéroïdes tumoraux, qui reproduisent in vitro la géométrie des tumeurs, nous mettons en évidence de la mort cellulaire à longue portée qui ne peut être expliquée par l'action directe de 1O2 . Cette mort est due à de l' 1O2 produit au sein des sphéroïdes mais à l'extérieur des cellules. Nous avons mis en place une expérience qui nous permets de contrôler spatialement la production de 1O2 à l'extérieur des cellules. La mort cellulaire observée à longue portée dans ces expériences implique la présence d'espèces réactives de l'oxygène secondaires.Enfin, certaines modalités de mort sont privilégiées du point de vue thérapeutique pour, entre autres, limiter la réponse inflammatoire. Nous avons mis en place une expérience in vitro qui nous permet d'observer différentes modalités de mort en fonction du taux de production de 1O2 et de la durée d'exposition
Singlet oxygen (1O2) is the first excited state of molecular oxygen. It is the major cytotoxic agent in photo-dynamic therapy. We use direct optical excitation of oxygen to quantitatively estimate 1O2 production rate in cells and to study its cytotoxic effects.In multicellular tumor spheroids, which mimic tumor geometry in vitro, we highlight long-range cell death that cannot be explained by singlet oxygen alone. This death is caused by 1O2 generated within spheroids but outside of the cells. We set up an experiment enabling spatial control of extra-cellular 1O2 production. The measured long-range cell death in these experiments implies the presence of secondary reactive oxygen species. Lastly, some cell death modalities are preferred from a treatment perspective, in order, for example, to limit inflammatory response. We set up an in vitro experiment that enabled us to observe different cell death modalities according to 1O2 production rates and exposure times

Le microenvironnement tumoral, l'angiogenèse tumorale et l'hypoxie jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et le développement de thérapies de nombreux cancers. Les limites de pénétration des médicaments, les phénomènes de résistance aux anti-cancéreux, la vascularisation de la tumeur et l’hypoxie sont tous des paramètres influençant les effets du médicament. La culture cellulaire 3D permet de créer un microenvironnement qui imite l’architecture et la fonction des tissus in vivo. L’expression de gènes et de protéines modifiée par l’environnement 3D est une autre caractéristique qui impacte l’effet d’une molécule thérapeutique. Dans notre première étude, afin de développer un modèle 3D vascularisé imitant celle des tumeurs in vivo, nous avons mis en culture des cellules endothéliales en 2D avec des cellules tumorales en 3D. Après 2 semaines de culture, un réseau vasculaire s’est organisé avec des structures de type tubulaire présentant une lumière et exprimant différents marqueurs angiogéniques tels que VEGF, CD31 et Collagène IV. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d’hypoxie in vitro intégrant l'environnement 3D et un agent mimétique de l'hypoxie (CoCl2). Le but de ce modèle est de créer un modèle d'hypoxie imitant les tumeurs in vivo et de montrer l'importance de l'hypoxie dans la réponse et la résistance aux médicaments. Ces résultats ont révélé que la meilleure condition était la combinaison 3D+CoCl2, conduisant à la surexpression des gènes relatifs à l’hypoxie (GLUT1/3, VEGF) et à la résistance aux médicaments (ABCG2, MRP1). L'angiogenèse et l'hypoxie sont des facteurs clés pour le microenvironnement tumoral in vivo et ils doivent être adoptés dans la conception de modèles tumoraux in vitro pour mieux sélectionner et cribler les médicaments anticancéreux
The tumor microenvironment, tumor angiogenesis, and hypoxia play a critical role in the tumor progression and therapy development of many cancers. Limitations in drug penetration, multidrug resistance phenomena, tumor vascularization, and oxygen deficiency are all parameters influencing drug effects. 3D cell culture allows to create a microenvironment that more closely mimics in vivo tissue architecture and function, thus, gene and protein expression modified by the 3D environment are further features that affect treatment outcome. In our first study, in order to develop a vascularized 3D model like in vivo tumors, we co-cultured 2D endothelial cells with 3D tumor cells. After 2 weeks of this combination, a vascular network was formed and organized with tubule-like structures presenting a lumen and expressing different angiogenic markers such as VEGF, CD31 and Collagen IV. In our second study, we developed an in vitro hypoxia model integrating the 3D environment and a hypoxia mimetic agent (CoCl2) to mimic the in vivo tumors and to show the importance of hypoxia in drug response and resistance. Results revealed that the best condition was the combination 3D+CoCl2 model, leading to overexpression oh hypoxia (GLUT1/3, VEGF) and drug resistance (ABCG2, MRP1) related genes. Taken together, angiogenesis and hypoxia are key factors for in vivo tumor microenvironment and they should be adopted in in vitro model design to better select and screen anticancer drugs

L’adénocarcinome pancréatique (AP) connaît une forte augmentation d’incidence, qui en fait la quatrième cause de mortalité par cancer avec un pronostic extrêmement sombre, moins de 5% des patients étant en vie à 5 ans. De nombreuses avancées dans la compréhension de l’oncogénèse pancréatique notamment sur les aspects génétiques, immunitaires et sur les interactions cellulaires du stroma tumoral ont permis d’envisager le développement de nouvelles stratégies de traitement. Cependant malgré des résultats pré-cliniques très encourageants aucune de ces stratégies n’a encore permis l’émergence d’un traitement plus efficace que la chimiothérapie standard. Ce travail de thèse a abordé 2 approches thérapeutiques innovantes distinctes mais potentiellement complémentaires dans le traitement de l’adénocarcinome pancréatique en étudiant in vitro (cultures cellulaire 2D et 3D) et in vivo (modèles ectopiques et orthotopiques) les effets sur la croissance tumorale de l’inhibition d’un acteur important du stress oxydant (la voie Nrf2) d’une part, de la combinaison d’une chimiothérapie liposomale et d’un agent physique, la cavitation ultrasonore, d’autre part. La cavitation ultrasonore est un effet mécanique des ultrasons permettant d’augmenter l’internalisation de molécules ou de gènes dans les cellules. Dans cette thèse, la faisabilité et l'efficacité de la combinaison d’une chimiothérapie liposomale ciblée par la cavitation ultrasonore a été évaluée dans des modèles murins orthotopiques d’AP. Un système de délivrance d’ultrasons a été adapté afin d’appliquer une cavitation inertielle focalisée sur des xénogreffes d’AP créées après l'injection de doxorubicine liposomale (L-DOX) selon une étude pharmacocinétique préliminaire réalisée dans un modèle murin. La L-DOX, conçue à base de phospholipides non saturés de dioleoylphosphatidyléthanolamine, connue pour être stable dans la circulation sanguine, a été choisie afin de maximiser son accumulation et le relargage du principe actif lors de la délivrance des ultrasons. Nous montrons que l’association de la L-DOX à la cavitation inertielle permet de réduire in vivo le volume tumoral dans un modèle orthotopique d’AP chez la souris nude. La cavitation inertielle peut donc augmenter l'effet antitumoral des liposomes porteurs de chimiothérapie avec un effet mécanique minimal sur le tissu environnant la tumeur.Des études récentes suggèrent que Nrf2 est une cible de choix pour vaincre la chimiorésistance de l’AP. Des méthodes in vitro et in vivo ont été utilisées afin d’examiner l'effet du brusatol associé à des agents chimiothérapeutiques de référence sur la mort cellulaire et son impact sur le stress oxydant. Nous montrons que l’inhibition de la voie Nrf2 par le brusatol, un composé naturel issu de Fructus Bruceae, potentialise les effets de la chimiothérapie et permet l’inhibition de la croissance tumorale in vitro sur des lignées cellulaires d’AP cultivées en 2D et 3D. Cette inhibition s’accompagne d’une modulation du stress oxydant dont témoignent l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la diminution du glutathion (GSH). In vivo, la combinaison du brusatol et de l'oxaliplatine a réduit le volume tumoral dans deux modèles murins de xénogreffe d’AP. Ces résultats suggèrent l'efficacité du brusatol pour lutter contre la chimiorésistance et renforce l’hypothèse d’un rôle clinique potentiel de l’inhibition de Nrf2 comme adjuvant à la chimiothérapie dans l’AP. Un travail clinique a également été mené en parallèle sur une modalité de traitement physique innovante, la radiofréquence endobiliaire, dans la prise en charge endoscopique de l’ampullome vatérien, tumeur rare à la croisée entre le tube digestif et le système biliopancréatique. Les résultats de cette étude prospective multicentrique seront également présentés dans cette thèse
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has increased in incidence over the past decade, leading it to be the fourth lethal cause of cancer in the world with a very poor prognosis, since less than 5% of patients are alive at 5 years. Many advances in the understanding of pancreatic tumorigenesis, notably on the genetic, immune and cellular stroma interactions of the tumor, have led to the development of new treatment strategies in the last decade. However, despite very encouraging pre-clinical results, none of these strategies has yet led to the emergence of a truly effective treatment in comparison with standard chemotherapy. This thesis focused on two innovative therapeutic modalities in the treatment of PDAC at a preclinical stage by studying in vitro (2D and 3D cell cultures) and in vivo (ectopic, orthotopic xenografts) the effects on the tumor growth of an inhibitor of the Nrf2 pathway (involved in oxidative stress), on the first hand, and of a physical element, ultrasound cavitation associated with liposomal chemotherapy, on the second hand. Ultrasound cavitation is a mechanical effect of ultrasound to increase the uptake of molecules or genes in cells. The feasibility and effectiveness of the combination of liposomal chemotherapy targeted by ultrasonic cavitation was evaluated in murin orthotopic models of PDAC. An ultrasound delivery system has been adapted to apply focused inertial cavitation to PDAC xenografts created after the injection of liposomal doxorubicin (L-DOX) according to a preliminary pharmacokinetic study carried out in the murine model. L-DOX, designed on unsaturated phospholipids of dioleoylphosphatidylethanolamine, was known to be stable in the bloodstream and to maximize its accumulation and release of the active drug during ultrasound delivery. This thesis shows that this therapeutic combination (L DOX and inertial cavitation) makes it possible to reduce the tumor volume in vivo in a nude mouse orthotopic model of PDAC. Inertial cavitation may be generated to increase the therapeutic effect of chemotherapybearing liposomes accumulated in the tumor with minimal mechanical effect on the surrounding tissue. Recent studies strongly suggest that Nrf2 is an ideal target against chemoresistance of PDAC. In vitro and in vivo methods were combined to examine the effect of brusatol associated with chemotherapeutic agents on cell death in addition to its impact on oxidative stress (reactive oxygen species and gluthation levels). This thesis demonstrates that the inhibition of the Nrf2 pathway via brusatol, a natural compound derived from Fructus Bruceae, potentiates the effects of chemotherapy and allows the inhibition of tumor growth in vitro on PDAC cell lines. This inhibition is accompanied by a modulation of oxidative stress by brusatol, with increasing ROS and decreasing GSH. In vivo, the combination of brusatol and oxaliplatin reduced tumor volume in two mouse models of PDAC xenograft. These results suggest the efficacy of using brusatol to combat chemoresistance and reinforce the idea that brusatol could be developed as an adjuvant to chemotherapy in PA. Clinical work was also carried out in parallel on an innovative physical treatment modality, endobiliary radiofrequency, in the management of adenoma of the ampoule of Vater, a rare tumor located between the digestive and the bilio-pancreatic systems. The results of this work will also be presented in this thesis

Au cours des dernières décennies, des systèmes de taille nanométrique chargés en principes actifs (nanomédicaments) et des nouvelles stratégies thérapeutiques ont été développés afin de surmonter les limitations liées à la chimiothérapie conventionnelle telles qu’une distribution non spécifique, une mauvaise accumulation dans les tissus cibles ainsi qu’une métabolisation rapide. Cependant, le succès des nouveaux médicaments en clinique reste encore limité et seulement un faible nombre de nanomédicaments est actuellement commercialisé.Une divergence entre les résultats précliniques in vitro et les performances obtenues in vivo est souvent observée dans la première étape du développement d'un médicament. Cet écart pourrait être attribué au manque de modèles pertinents, représentatifs de la pathologie observée chez l’Homme et qui soient de bons prédicteurs de la réponse thérapeutique chez les patients. En effet, les modèles utilisés aujourd’hui (généralement culture cellulaire en deux dimensions, 2D) ne reproduisent pas la structure complexe de la tumeur in vivo. Ainsi, ils ne permettent pas une évaluation fiable du potentiel thérapeutique réel des médicaments. Dans cette optique, les méthodologies de culture de cellules en trois dimensions (3D) sont extrêmement avantageuses. Ces méthodologies permettent, en effet, la construction de systèmes cellulaires pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. Parmi ces modèles, l'assemblage de cellules sous forme de sphéroïdes multicellulaires a été largement exploré. Néanmoins, les sphéroïdes décrits jusqu'à présent correspondent à des nodules formés exclusivement de cellules cancéreuses, ce qui constitue une vraie limitation. En effet, ces sphéroïdes ne reproduisent pas l’organisation de la tumeur et l'hétérogénéité du microenvironnement, et par conséquent ils ne parviennent pas à mimer les multiples barrières biologiques que les médicaments doivent traverser pour atteindre les cellules cibles.Dans cet esprit, l'objectif de cette thèse de doctorat était de surmonter ces limitations et de construire des modèles pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement afin de i) mieux comprendre les mécanismes de passage des nanomédicaments et ii) mieux prédire l’efficacité des nouveaux traitements.Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés au cancer du pancréas qui est caractérisé par la présence d'un abondant stroma formant un bloc fibreux (réaction desmoplastique) qui limite la pénétration des médicaments et réduit ainsi leur efficacité. Cette tumeur représente donc un bon exemple de barrière biologique tumorale.La partie principale de ce travail de recherche repose sur la construction et la caractérisation complète d’un nouveau type de sphéroïde multicellulaire, capable de reproduire in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, grâce à la co-culture de cellules cancéreuses pancréatiques, de fibroblastes et de cellules endothéliales. Les études de cytotoxicité in vitro nous ont permis d’investiguer la capacité de ce modèle à reproduire la résistance des cellules cancéreuses aux traitements observés in vivo. Grâce à la Microscopie de Fluorescence à Feuillet de Lumière nous avons pu étudier la pénétration de la doxorubicine, soit en forme libre, soit encapsulée dans des nanoparticules, au sein des sphéroïdes. Ensuite, afin de mieux comprendre comment les médicaments et nanomédicaments interagissent avec la tumeur, nous avons cherché à combiner la culture 3D avec des conditions dynamiques contrôlées dans un dispositif microfluidique. Pour atteindre cet objectif, nous avons conçu et fabriqué une puce sur mesure, adaptée pour loger à la fois le sphéroïde et des canaux dans lesquels les cellules endothéliales pourront s’organiser sous forme de vaisseaux
In the last decades, various engineered systems for drug delivery (i.e., nanomedicines) have been developed with the aim to overcome the limits associated to conventional chemotherapy, such as non-specific drug distribution, poor delivery to the target tissue and rapid metabolism. However, the success of new therapeutic strategies in the clinic is still suboptimal and only a limited number is currently marketed.A discrepancy between promising preclinical in vitro results and the in vivo performances is often observed in the early stage of drug development and might be ascribed to the lack of capacity of the models commonly used for in vitro studies to faithfully reproduce the pathophysiology of solid tumors. These models mainly consist of cancer cells cultured as flat (two dimensional, 2D) monolayers or assembled to form three dimensional (3D) multicellular tumor spheroids (MCTS).However, being composed exclusively of one cell type, these models are too simplistic. They do not allow to reproduce the heterogeneous cellular composition, as well as, the complex architecture of the tumor and its surrounding microenvironment. Thus, they fail to replicate the multiple biological barriers that drugs and nanomecidines have to cross in order to reach the target cells.The aim of this PhD thesis was to overcome these limitations and construct a reliable tool for an appropriate in vitro evaluation of the therapeutic potential of nanomedicines and other chemotherapies. Attention has been focused on the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) whose strong fibrotic reaction represents a well-known example of a tumor biological barrier responsible of the limited efficacy of the treatments. The main part of this research work relies on the construction and complete characterization of novel hetero-type MCTS based on a triple co-culture of pancreatic cancer cells, fibroblasts and endothelial cells, and thus capable to integrate the cancerous component and the microenvironment of the tumor. The constructed 3D model has demonstrated the capacity to reproduce in vitro the influence of the microenvironment on the sensitivity of cancer cells to chemotherapy. In addition, by combining the 3D model and the innovative Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), we have been able to investigate the penetration of the anticancer drug doxorubicin (in a free form and loaded into nanoparticles (NPs)) in a high informative manner. Then, in order to acquire a better understanding on how nanomedicines and other anticancer chemotherapies interact with the tumor, we sought to combine the hetero-type 3D culture with controlled flow conditions in a microfluidic device. To reach this goal we have designed and fabricated a tailor-made chip suitable to host both a MCTS and a perfusable microvascular network (i.e., MCTS-on-a-chip)

En 1889, le clinicien Stefen Paget proposa l'hypothèse de « la graine et du terroir » pour expliquer la progression tumorale. La graine - la tumeur - ne peut pousser que dans le bon terroir - le microenvironnement tumoral. Durant le développement du cancer, la tumeur et ce microenvironnement sont en constant dialogue biochimique. Nous nous sommes intéressés durant cette thèse à l'hypothèse de Paget d'un point de vue mécanique : le terroir mécanique peut-il influencer la progression tumorale ? Nous avons choisi une approche in vitro afin de découpler les influences biochimiques et mécaniques. Nous avons travaillé avec des sphéroïdes multicellulaires, petites boules de cellules tumorales qui imitent remarquablement bien une tumeur. Nous avons développé une méthodologie nous permettant d'exercer des contraintes mécaniques sur des sphéroïdes, et nous avons étudié l'influence de telles contraintes. Nous avons montré qu'une contrainte mécanique influence le développement tumoral. Une contrainte mécanique réduit fortement la croissance d'un sphéroïde, et ce de manière réversible. Le volume des cellules au centre est diminué, ce qui semble déclencher un arrêt de la prolifération. Nous avons également montré que la division cellulaire est source de flux cellulaires à l'intérieur d'un sphéroïde, et que ces flux peuvent être inhibés par l'application d'une contrainte. Enfin, nous avons observé qu'une contrainte mécanique peut promouvoir l'envahissement d'une matrice de collagène par un sphéroïde. En conclusion, qu'un dialogue mécanique restreigne la progression tumorale ou la^promeuve, il en est un élément intrinsèque
In 1889, the clinician Stefen Paget came up with the « seed and soil » hypothesis, to explain tumor progression. The seed - the tumor - can only grow in the right soil - the tumor microenvironment. During cancer development, the tumor and the microenvironment are in a constant biochemical crosstalk. We studied during this thesis the seed and soil hypothesis in a mechanical perspective: can the mechanical soil influence tumor progression? We chose an in vitro approach to decouple the biochemistry from the mechanics. We worked with multicellular spheroids, which are small balls of tumor cells that remarkably mimic a tumor. We developed a methodology that enables us to exert mechanical stresses on spheroids, and we studied the influence of such stresses. We show that mechanical stress can indeed have an influence on tumor development. First, the growth rate of a spheroid under mechanical stress is drastically but reversibly reduced. The cells in the center of a spheroid show a decreased volume, and it seems that this volume reduction triggers a proliferation arrest. Second, we show that a cell flow originates from cell division, and that this flow is reduced under mechanical stress. Eventually, we report that a spheroid embedded in a collagen gel invades the latter under mechanical stress. In conclusion, whether mechanical crosstalk restrains or promotes tumor progression, it is an intrinsic element of tumor development, superimposed to the biochemical crosstalk

Cette thèse présente des travaux sur l’étude et la calibration de modèles d’équations aux dérivées partielles pour la croissance tumorale. La première partie porte sur l’analyse d’un modèle de croissance tumorale pour le cas de métastases au foie de tumeurs gastro-intestinales (GIST). Le modèle est un système d’équations aux dérivées partielles couplées et prend en compte plusieurs traitements dont un traitement anti-angiogénique. Le modèle permet de reproduire des données cliniques. La première partie de ce travail concerne la preuve d’existence/unicité de la solution du modèle. La seconde partie du travail porte sur l’étude du comportement asymptotique de la solution du modèle lorsqu’un paramètre du modèle, décrivant la capacité de la tumeur à évacuer la nécrose, converge vers 0. La seconde partie de la thèse concerne le développement d’un modèle de croissance pour des sphéroïdes tumoraux ainsi que sur la calibration de ce modèle à partir de données expérimentales in vitro. L’objectif est de développer un modèle permettant de reproduire quantitativement la distribution des cellules proliférantes à l’intérieur d’un sphéroïde en fonction de la concentration en nutriments. Le travail de modélisation et de calibration du modèle a été effectué à partir de données expérimentales permettant d’obtenir la répartition spatiale de cellules proliférantes dans un sphéroïde tumoral
In this thesis, we present several works on the study and the calibration of partial differential equations models for tumor growth. The first part is devoted to the mathematical study of a model for tumor drug resistance in the case of gastro-intestinal tumor (GIST) metastases to the liver. The model we study consists in a coupled partial differential equations system and takes several treatments into account, such as a anti-angiogenic treatment. This model is able to reproduce clinical data. In a first part, we present the proof of the existence/uniqueness of the solution to this model. Then, in a second part, we study the asymptotic behavior of the solution when a parameter of this model, describing the capacity of the tumor to evacuate the necrosis, goes to 0. In the second part of this thesis, we present the development of model for tumor spheroids growth. We also present the model calibration thanks to in vitro experimental data. The main objective of this work is to reproduce quantitatively the proliferative cell distribution in a spheroid, as a function of the concentration of nutrients. The modeling and calibration of this model have been done thanks to experimental data consisting of proliferative cells distribution in a spheroid