Szybiński, Marcin. "Synteza analogów 1 α,25-dihydroksywitaminy D3 ze zmodyfikowanym pierścieniem D". Doctoral thesis, 2018. https://depotuw.ceon.pl/handle/item/3092.
Abstract:
Historia odkrycia związku, który dziś nazywamy kalcytriolem, lub bardziej
systematycznie, 1,25-dihydroksywitaminą D3, sięga XVIII wieku. Wtedy to, w Anglii
miała miejsce tzw. rewolucja przemysłowa. Był to złożony proces społecznoekonomiczny,
podczas którego ludność masowo migrowała do miast by pracować w
powstałych tam fabrykach. Specyficzny klimat, duże zadymienie oraz dieta oparta
głównie na produktach mącznych, spowodowały masowe wystąpienie krzywicy u
dzieci. Badania na temat przyczyny tak wysokiej zachorowalności doprowadziły do
odkrycia witaminy D3. Jak się później okazało, jest to prekursor aktywnej biologicznie
formy, jaką jest kalcytriol. Związek ten jest nazywany hormonem witaminowym ze
względu na sposób działania i mnogość funkcji, jakie spełnia w organizmie. Do
głównych można zaliczyć kontrolę homeostazy wapniowo-fosforanowej i
przeciwdziałanie chorobom autoimmunologicznym, takim jak łuszczyca. Coraz
częściej jednak jest również podkreślana znaczna rola kalcytriolu w odporności oraz
przeciwdziałaniu zmianom nowotworowym. Nic więc dziwnego, że wiele zespołów
naukowych skupionych w ośrodkach akademickich, jak i firmach farmaceutycznych,
zajęło się syntezą pochodnych witaminy D3 oraz kalcytriolu. Poszukiwano i
poszukuje się nadal związków posiadających unikalny profil biologiczny,
charakteryzujący się selektywnym i/lub wzmocnionym działaniem terapeutycznym.
Analizując doniesienia literaturowe na temat analogów 1,25-dihydroksywitaminy
D3, można zauważyć, że tylko nieliczne z nich dotyczą związków z modyfikacjami
steroidowego pierścienia D. Postanowiłem zatem skupić sięna poszerzeniu wiedzy
na temat możliwości syntez pochodnych kalcytriolu, charakteryzujących się takimi
strukturalnymi modyfikacjami.
Jako pierwszy cel syntetyczny obrałem analog z aromatycznym, sześcioczłonowym
pierścieniem D. Związek ten posiadał ponadto zmodyfikowany układ podwójnych
wiązań. Tak więc, typowy układ trienowy zamieniłem na dienowy, który nieco obniża
aktywność biologiczną, znacznie natomiast upraszcza syntezę. Podczas realizacji
pożądanego produktu użyłem -tetralon jako związek wyjściowy, będący
jednocześnie fragmentem zawierającym bicykliczny układ pierścieni C/D. W trakcie
dobudowywania łańcucha bocznego wykorzystałem asymetryczną epoksydację
Sharplessa, dzięki której w sposób wydajny i w pełni stereokontrolowany utworzyłem
centrum stereogeniczne na C-20. Kluczową reakcją była również reakcja
Sonogashiry, która umożliwiła wydajne sprzęgnięcie tryflanu zawierającego „górny”
fragment budulcowy z dienynem będącym syntonem pierścienia A. Wykorzystując
różne bloki budulcowe zawierające pierścień A, otrzymałem dwa związki finalne.
Pierwszy z nich zawierał pierścień A, identyczny z tym występującym w formie
prewitaminowej kalcytriolu. W drugim, zsyntezowanym według autorskiego projektu,
występowała dodatkowa grupa metylenowa w pozycji C-2.
Analizując ponownie dotychczasowe doniesienia literaturowe postanowiłem
zsyntezować kolejną grupę analogów, w których główną modyfikacją był pierścień D
w formie otwarto-łańcuchowej (związki D-seko). Dodatkowymi strukturalnymi
zmianami, w porównaniu do kalcytriolu, było wprowadzenie podwójnego wiązania
pomiędzy C-17 a C-20, brak grupy metylowej przy C-20, oraz brak grupy
metylenowej przy C-10. W tej grupie pochodnych postanowiłem otrzymać -oprócz
związków z „naturalną” konfiguracją absolutną - również diastereomery, które
posiadały odwrotną konfigurację na centrach C-13 oraz C-14. Wśród tej ostatniej
podgrupy była również pochodna z pierścieniem A identycznym z kalcytriolowym.
Kluczową reakcją w trakcie realizacji projektu była ponownie reakcja Sharplessa,
która ostatecznie pozwoliła w sposób w pełni stereokontrolowany wprowadzić trzy
centra stereogeniczne w chiralnym związku, powstałym z -kaprolaktonu. Dzięki
zastosowaniu D- lub L-winianu otrzymałem odpowiedni stereoizomer. Wykorzystując
reakcję Wittiga-Hornera połączyłem keton zawierający „górny” fragment analogu z
odpowiednim tlenkiem fosfiny zawierającym pierścień A. W przypadku pochodnej z
„naturalnym” pierścieniem A, sprzęganie dużych fragmentów wykonałem za pomocą
reakcji Sonogashiry, przekształcając uprzednio keton w odpowiedni tryflan.
Dla wszystkich zsyntezowanych przeze mnie analogów kalcytriolu wykonane zostały
badania biologiczne. Przetestowana została zdolność wiązania tych związków z
receptorem witaminy D (VDR) oraz zdolność różnicowania komórek ludzkiej białaczki
linii HL-60. Dla wybranych związków wykonano testy funkcjonalne pod kątem
aktywacji transkrypcji 24-hydroksylazy oraz testy in vivo określające właściwości
kalcemiczne.
Uzupełnieniem prowadzonych przeze mnie badań nad analogami kalcytriolu ze
zmodyfikowanym pierścieniem D, była synteza pochodnych hydrindanu i dekaliny,
które mogą posłużyć jako syntony zawierające bicykliczny układ pierścieni C/D.
Związki te posiadały podwójne wiązanie C(15)-C(16)(w numeracji steroidowej), co
umożliwia dalszą funkcjonalizację w tym miejscu cząsteczek.
Przedstawiona praca doktorska poszerza wiedzę na temat zależności strukturaaktywność
w obszarze badań nad 1,25-dihydroksywitaminą D3. Niewątpliwym
atutem przedstawionych badań są wyniki otrzymane dla jej analogów posiadających
modyfikacje strukturalne w steroidowym pierścieniu D, rzadko dotychczas
eksplorowanym fragmencie cząsteczek witamin grupy D.
Wyniki zaprezentowane w niniejszej rozprawie zostały częściowo opublikowane w
formie artykułów:
1. Sibilska I. K., Szybinski M., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J. Steroid
Biochem. Mol. Biol, 136, 9-13 (2013). IF= 4.095
2. Sibilska I. K., Szybinski M., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J. Med.
Chem., 58, 9653-9662 (2015). IF= 6.253
3. Szybinski M., Sokołowska K., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J.
Steroid Biochem. Mol. Biol., 173, 57-63 (2017). IF= 4.095
4. Szybinski M., Sektas K., Sicinski R. R., Plum L. A., Frelek J., DeLuca H. F.,
J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 171, 144-154 (2017). IF= 4.095
5. Szybinski M., Brzeminski P., Fabisiak A., Berkowska K., Marcinkowska E.,
Sicinski R. R., Int. J. Mol. Sci., 18, 2162-2176 (2017). IF= 3.687<br>The history of the discovery of calcitriol, i.e., 1α,25-dihydroxyvitamin D3, dates back
to the eighteenth century when the industrial revolution began in England. It was a
complex socio-economic process, during which the population was massively
migrating to the cities to work in the factories created at that time. The specific
climate, large smokiness, and diet based mainly on farinaceous products caused a
massive occurrence of rickets in children. Research on the cause of such a high
incidence has led to the discovery of vitamin D3. As it turned out later, this was a
precursor of a biologically active form, named calcitriol. This compound is considered
as a vitamin D hormone due to its mode of action and a multitude of functions it
performs in the body. The main ones include the control of calcium-phosphate
homeostasis and prevention of autoimmune diseases such as psoriasis. The role of
calcitriol in the immunological system was also discovered. Therefore, this is not
surprising that many scientific teams gathered in academy and industry attempted to
synthesize calcitriol analogues characterized by selective and/or enhanced
therapeutic effects. Reviewing literature reports on the synthesis of 1α,25-
dihydroxyvitamin D3 analogues, one can see that only few publications describe the
synthesis of calcitriol analogues with the modified steroidal D ring. Therefore, I
decided to expand our knowledge about the possibility of the synthesis of different
calcitriol derivatives with D-ring modifications.
As the first synthetic target, I selected the analogue with an aromatic, six-membered
D ring. This compound additionally had a modified double bond system. I replaced a
“natural” triene system with the diene fragment, which usually slightly decreases the
biological activity, but significantly simplifies the synthesis. I used α-tetralone as the
starting compound, containing a bicyclic C/D ring system. During the addition of the
side chain, I used the Sharpless asymmetric epoxidation, that allowed to create a
stereogenic centre on C-20 in an efficient and fully stereocontrolled manner. The
Sonogashira reaction was also a key process, which enabled me to couple a triflate
containing the "upper" fragment with the dienyne being the A-ring synthon. Using
various building blocks containing the A ring, I obtained two final compounds. The
first one possessed the A ring identical to that one present in the previtamin form of
calcitriol. The second, synthesized according to the original project, was
characterized by the presence of an additional methylene group at the C-2 position.
After analysing the previous literature reports, I decided to synthesize another group
of calcitriol analogues, in which the main structural modification was the D ring in the
open-chain form (D-seco). Additional structural changes – as compared to calcitriol –
comprised introduction of a C(17)-C(20) double bond, lack of methyl group at C-20
and lack of methylene group at C-10. Among these derivatives, I decided to create
compounds with a "natural" absolute configuration, and also diastereomers that had
the reverse configuration at C-13 and C-14 stereogenic centres. In the latter
subgroup, there was also a derivative with its A ring identical with that of calcitriol.
The key reaction during the project was again the Sharpless asymmetrical
epoxidation, which enabled the stereocontrolled introduction of three stereogenic
centres into a chiral compound derived from -caprolactone. Using the D- or Ltartrate
in this process resulted in the desired stereoisomer. Utilizing the Wittig-
Horner reaction, I coupled a ketone containing the "upper" building block of the
analogue with an appropriate A-ring phosphine oxide derivative. In the case of a
derivative having the "natural" A ring, coupling of large fragments was carried out by
the Sonogashira reaction performed after converting the ketone into the respective
enol triflate.
Biological testing was performed for all the synthesized analogues. The affinity of
new compounds to bind the vitamin D receptor (VDR) and their ability to differentiate
human leukaemia HL-60 cells have also been tested. For the selected compounds,
additional tests were performed such as activation of 24-hydroxylase transcription
and in vivo tests indicating calcaemic potency.
My research on calcitriol analogues with the modified D ring was extended to the
synthesis of hydrindane and decalin derivatives, that can be used as synthons
containing the bicyclic C/D-ring system. These compounds have a C(15)-C(16)
double bond (according to the steroid numbering), which allows further
functionalization in the ring D.
The presented doctoral dissertation expands the knowledge about the structureactivity
relationship in the vitamin D area. Undoubtedly, advantages that arise from
the presented research are the results obtained for the calcitriol analogues
characterized by structural modifications in their steroidal ring D, being rarely
explored structural fragment of the vitamin D molecules.