Dissertations / Theses on the topic 'Stress ossidativo'

Abstract Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) play a crucial role in DNA damage surveillance through their nick sensor functions. Since PARPs over activation leads to an excessive consumption of NAD? and ATP depletion, these enzymes also are involved in the early events of programmed cell death as well as in necrosis. In order to verify the protective action of L-carnosine and trehalose against NO induced cell death, in the present study we examined their effects on the expression of PARP-1, PARP-2 and iNOS in primary rat astrocyte and oligodendrocyte cells, treated with lipopolysaccharide (LPS) and interferon gamma (INFc), through semi-quantitative PCR and western analysis. To further characterize the molecular mechanisms underlying L-carnosine and trehalose action, we measured cell viability, nitrite production and LDH release. The data obtained clearly demonstrate that in the stress model employed L-carnosine and trehalose down regulate PARP-1 and PARP-2 expression in both cell phenotypes, thus suggesting their possible application in clinical trials.

Il sistema nervoso centrale è estremamente sensibile allo stress ossidativo e la sua difesa è mediata principalmente dal sistema del glutatione. Si suppone che uno squilibrio a livello di questo sistema sia coinvolto nella patogenesi di alcune malattie neurodegenirative tra le quali il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Il glutatione regola le funzioni proteiche attraverso il fenomeno della glutationilazione, ovverosia la formazione di diulfidi misti tra i residui di cisteina ed il glutatione stesso. La glutationilazine può avvenire sia nel corso del metabolismo costitutivo sia durante lo stress ossidativo, rappresentando sia un fenomeno fisiologico che un risposta adattativa ad un’alterazione dello stato redox. Il primo scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare quali proteine fossero costitutivamente gluatationilate a livello del sistema nervoso centrale e di analizzare la loro distribuzione topografica. Abbiamo dimostrato la presenza di una uniforme distribuzione delle proteine glutationilate a livello di tutti gli strati corticali della corteccia del cervello e del cervelletto, così come nella sostanza grigia del midollo spinale; l’immunomarcatura risultava chiara a livello dei neuroni, media a livello degli oligodendrociti e debole a livello degli astrociti. Attraverso esperimenti di western blot, immunoprecipitazione e immunofluorescenza abbiamo dimostrato che esiste una glutationilazione preferenziale delle proteine del citoscheletro, in particolare actina, b-tubulina e neurofilamenti erano costitutivamente glutationilate ed il livello della loro glutationilazione aumenteva all’aumentare del livello del trattamento con pro-ossidanti. Nella seconda parte del nostro lavoro abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull’atassia di Fredreich, una patologia neurodegenerativa autosomica recessiva causata da mutazioni a livello del gene che codifica per la fratassina, una proteina mitocondriale implicata nel metabolismo del ferro. Dati recenti suggeriscono che la perdita di fratassian provochi un aumento della generazione di radicali liberi con conseguente aumento dello stress ossidativo a livello cellulare ed inattivazione degli enzimi mitocondriali. In un precedente (Pastore et al. 2003, J Biol Chem. 278, 42588-95) lavoro abbiamo dimostrato che un aumento della quantità di glutatione legato alle proteine del citoscheletro provoca una perdita di organizzazione del citoscheletro nei fibroblasti dei pazienti con atassia di Friedreich. Per questo motivo, abbiamo analizzato la glutationilazione delle proteine e la distribuzione di tubulina e neurofilamenti a livello del midollo spinale dei pazienti con atassia di Friedreich, una delle principali sedi della malattia. Per la prima volta abbiamo dimostrato un significativo aumento a livello del pool dinamico della tubulina così come una anomlala distribuzione delle forma fosforilate dei neurfilamenti nei motoneuroni Friedreich. Nelle stesse cellule le anomalie citoscheletriche colocalizzano con un aumento della glutationilazione proteica, mentre le proteine mitocondriali risultano normalmente espresse, suggerendo un potenziale ruolo della glutationilazione nella regolazione redoxdella sopravvienza neuronale e nel controllo della stabilità a livello di assoni e dendriti. I nostri dati ci spingono ad ipotizzare che nei malati con atassia di Friedrech lo stress ossidativo provochi un’aumentata glutationilazione proteica nelle cellule del midollo spinale che può provocare un’ alterazione dell’organizzazione citoscheletrica, responsabile dell’assonopatia “dying-back”.
Central nervous system is highly sensitive to oxidative stress and his defense is mediated primary by the glutathione system. An imbalance in this system is supposed to be implicated in the pathogenesis of some neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Glutathione regulates protein functions by glutathionylation, forming mixed disulfides between cysteins and glutathione itself. Glutathionylation can occur during constitutive metabolism such as during oxidative stress, representing both a physiological process and an adaptative response to redox status alteration. The first aim of our work was to evaluate which proteins were constitutively glutathionylated in central nervous system and to analyze their topographic distribution. We showed an uniform distribution of glutathionylated proteins throughout all cortical layers of cerebral and cerebellar cortex as well as throughout the gray matter of the spinal cord; immunohystochemical staining was clear in neurons, mild in oligodendrocytes and weaker in astrocytes. By western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence experiments we demonstrated that there is a preferential glutathionylation of cytoskeletal proteins, in detail actin, b-tubulin and neurofilaments were constitutively glutathionylated and the extent of their glutathionylation increases increasing pro-oxidant treatment level. In the second part of our work we focused our attention on Friedreich’s ataxia, a neurodegenerative autosomal recessive disorder caused by mutations in the gene encoding frataxin, a mitochondrial protein implicated in iron metabolism. Current evidences suggest that loss of frataxin causes an increase in free-radical generation, leading to cellular components oxidation and inactivation of mitochondrial enzymes. In a previous work (Pastore et al. 2003, J Biol Chem. 278, 42588-95) we showed that increased levels of glutathione bound to cytoskeletal proteins caused a loss of cytoskeletal organization in fibroblasts of patients with Friedreich’s ataxia. For this reason, we analysed the glutathionylation of proteins and the distribution of tubulin and neurofilaments in the spinal cord of patients with FRDA, one of the main sites of the disease. We found, for the first time, a significant rise of the dynamic pool of tubulin as well as an abnormal distribution of the phosphorylated forms of human neurofilaments in Friedreich’s motor neurons. In the same cells, the cytoskeletal abnormalities co-localized with an increase in protein glutathionylation while the mitochondrial proteins were normally expressed, suggesting a potential role of glutathionylation in redox regulation of neuronal survivor and in the control of axon/dendrite stability. Our results leads us to speculate that in Friedreich’s ataxia oxidative stress causes an increased protein glutathionylation in the cells of the spinal cord that may lead to an alteration of the cytoskeleton organization, responsible of “dying-back” axonopathy.

Nel secolo scorso, la nitroglicerina è stato il farmaco più comunemente usato come agente antiischemico ed antianginoso. La sua continua somministrazione, però, ne fa svanire piuttosto rapidamente l’efficacia terapeutica. L’attivazione neuroormonale dei segnali vasocostrittori e l’espansione del volume intravascolare costituiscono le iniziali risposte contro-regolatorie (pseudotelleranza), mentre il trattamento a lungo termine induce cambiamenti vascolari intrinseci, come per esempio la perdita delle risposte nitrovasodilatatorie (tolleranza vascolare). Tutto ciò è causato da un’incrementata produzione di anione superossido e da una ipersensibilità verso vasocostrittori secondari per una tonica attivazione della PKC. Come fonti di anione superossido sono state proposte la NADPH ossidasi e la eNOS disaccoppiata. Il superossido ed il nitrossido vascolare formano rapidamente perossinitrito, che aumenta la tolleranza promuovendo il disaccoppiamento della eNOS e l’inibizione della guanilato ciclasi solubile e della prostaciclina. Questo concetto di stress ossidtivo può spiegare perché gli scavangers dei radicali e le sostanze che riducono indirettamente lo stress ossidativo, sono capaci di attenuare la tolleranza e la disfunzione endoteliale. Un lavoro recente ha definito un nuovo meccanismo di tolleranza basato sull’inibizione dell’ALDH-2, l’enzima deputato alla bioconversione enzimatica del GTN in NO, ed ha identificato i mitocondri come una fonte addizionale di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Le specie reattive indotte dal GTN inibiscono la 6 bioattivazione della nitroglicerina medinte l’ossidazione tiolica dell’ALDH-2. Sia l’increnmento dello stress ossidativo che l’alterazione della bioconversione del GTN in NO, possono fornire un nuovo concetto di tolleranza ai nitrati nonché di cross-tolerance. Nel presente lavoro abbiamo documentato che la somministrazione a lungo termine di IS-5-MN in vitro ed in vivo induce tolleranza al GTN (definita cross-tolerance). Si sono altresì studiati gli effetti di CPT, ENA e NAC sulle risposte in vivo al GTN dopo trattamento cronico dei ratti con IS-5-MN e sono stati paragonati gli effetti di CPT, ENA o glutatione con quelli della NAC sugli effetti antipiastrinici del GTN in assenza o in presenza di TSMCs e TECs e sulla produzione di perossinitrito da GTN in un Krebs buffer. Per finire, sono stati valutate le risposte emodinamiche al GTN in ratti tolleranti e non, in presenza ed in assenza di co-trattamento con MnTBAP (1, 20 mg/kg/die, i.p.). Il presente studio, nel tentativo di chiarire i meccanismi molecolari che sottendono alla tolleranza ai nitrati, ha incentrato l’attenzione sul ruolo, che in tale fenomeno hanno, enzimi essenziali, quali la SOD e l’ALDH-2, i quali risultano, rispettivamente, down-regulated ed inattivata dal fenomeno della tolleranza. Il MnTBAP, un SOD-mimic di ultima generazione, si è rivelato in grado di inibire lo sviluppo di tolleranza ai nitrati organici in maniera dose-dipendente, ripristinando l’effetto del GTN sulla pressione sanguigna e sull’ggregazione piastrinica, riducendo la formazione di perossinitrito, come dimostrato dallo staining della nitrotirosina ed antagonizzando l’inibizione dell’ALDH-2 indotta dallo stress ossidativo. La formazione di perossinitrito gioca un ruolo 7 cruciale durante lo sviluppo di tolleranza ai nitroderivati in quanto riduce la biodisponibilità di NO. Quindi, quanto riportato nel nostro studio potrebbe aprire una nuova frontiera nel management delle malattie cardiovascolari, consentendo l’uso a lungo termine dei nitrati organici, senza che si sviluppi tolleranza.
During the last century, nitroglycerin has been the most commonly used antiischemic and antianginal agent. Unfortunately, after continuous application, its therapeutic efficacy rapidly vanishes. Neurohormonal activation of vasoconstrictor signals and intravascular volume expansion constitute early counter-regulatory responses (pseudotolerance), whereas long-term treatment induces intrinsic vascular changes, eg, a loss of nitrovasodilatorresponsiveness (vascular tolerance). This is caused by increased vascular superoxide production and a supersensitivity to vasoconstrictors secondary to a tonic activation of protein kinase C. NADPH oxidase(s) and uncoupled endothelial nitric oxide synthase have been proposed as superoxide sources. Superoxide and vascular NO rapidly form peroxynitrite, which aggravates tolerance by promoting NO synthase uncoupling and inhibition of soluble guanylyl cyclase and prostacyclin synthase. This oxidative stress concept may explain why radical scavengers and substances, which reduce oxidative stress indirectly, are able to relieve tolerance and endothelial dysfunction. Recent work has defined a new tolerance mechanism, ie, an inhibition of mitochondrial aldehyde dehydrogenase, the enzyme that accomplishes bioactivation of nitroglycerin, and has identified mitochondria as an additional source of reactive oxygen species. Nitroglycerin-induced reactive oxygen species inhibit the bioactivation of nitroglycerin by thiol oxidation of aldehyde dehydrogenase. Both mechanisms, increased oxidative 3 stress and impaired bioactivation of nitroglycerin, can be joined to provide a new concept for nitroglycerin tolerance and crosstolerance. In this work we have demonstrate that long-term administration of isosorbide-5-mononitrate in vitro ed in vivo induces tolerance to GTN (this is the so-called cross-tolerance). Here we have studied the effects of CPT, NAC or ENA on the in vivo responses to GTN after long-term treatment of rats with IS-5-MN. In addition, we have compared the effects of CPT, ENA or glutathione to those of NAC on the anti-platelet effects of GTN in the absence or presence of tolerant cultured SMCs or ECs and on production from GTN in Krebs buffer. Finally, we have valuated the haemodynamic responses to glyceryl trinitrate in non-tolerant rats and in tolerant rats with or without pharmacological co- treatment with MnTBAP (1-20 mg/kg, i.p.). The present study was designed to elucidate the mechanisms of nitrate tolerance by assessing the function of essential enzymes implicated in this phenomenon. We demonstrated that SOD and ALDH-2 are downregulated and inactivated, respectly, during nitrate-tolerance. MnTBAP, a new generation antioxidant, is able to inhibit the development of tolerance to organic nitrates in a dose dependent fashion restoring the GTN effect on blood pressure and on platelets aggregation and reducing the peroxynitrite formation as evaluated by the inhibition of the nitrotyrosine staining and antagonizing the ALDH-2 inhibition oxidative stress-induced. Peroxynitrite formation play a crucial role during the development of tolerance to organic nitrates most likely via reduction of nitric oxide bioavalaibility. The broader implications 4 of these findings may open a new frontier in the clinical management of cardiovascular disease, in particular allowing the use of long-term organic nitrates treatment without development of tolerance.

2012/2013
I licheni, una simbiosi mutualistica tra un fungo (il micobionte), generalmente un ascomicete, e una o più popolazioni di alghe e/o cianobatteri (il fotobionte) sono considerati forme di vita estremofile in quanto da disidratati possono resistere a condizioni ambientali molto difficili come elevati irraggiamenti solari, scarsa disponibilità d'acqua e di nutrienti e dosi elevate di inquinanti aerodiffusi. Tali fattori di stress tuttavia inducono una sovrapproduzione a livello cellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che se eccede le difese antiossidanti genera stress ossidativo. L'accumulo delle ROS è un fenomeno molto pericoloso perché porta al danneggiamento di importanti macromolecole come lipidi, proteine e DNA ed in casi estremi può condurre anche alla morte cellulare. Sebbene gli effetti dello stress foto-ossidativo nei licheni siano già stati studiati, in questo dottorato di ricerca si è voluto approfondire alcuni aspetti ancora poco chiari relativi alla resistenza dei fotobionti a questo stress e alla resistenza dei licheni allo stress ossidativo indotto dalla presenza di elevate concentrazioni di inquinanti fotochimici come l'ozono (O3). Sul primo filone di ricerca sono stati condotti due studi. Nel primo ci si è focalizzati sugli effetti dello stress foto-ossidativo su parametri fisiologici di vitalità (ChlaF) e di produzione di ROS in un fotobionte lichenico e nella sua controparte lichenizzata. Ciò è stato ottenuto sottoponendo colture axeniche del fotobionte Trebouxia sp. e lobi del lichene Parmotrema perlatum da cui è stato isolato il fotobionte, a diverse combinazioni di umidità relativa e intensità luminose per periodi di tempo crescenti. L'obiettivo di questo studio è stato quello di approfondire le conoscenze sui benefici indotti dalla lichenizzazione nella resistenza al disseccamento e al concomitante stress foto-ossidativo. Il secondo studio invece, strettamente connesso al primo, è focalizzato sulla variazione di espressione genica dell'intero trascrittoma del fotobionte Trebouxia gelatinosa, isolato dal lichene Flavoparmelia caperata (L.) Hale, indotta da eventi di disidratazione e reidratazione. Con questo studio si è voluto individuare ed analizzare i meccanismi molecolari alla base della tolleranza di questo organismo al disseccamento e al concomitante stress fotoossidativo. Sul secondo filone di ricerca invece è stato condotto uno studio sulle risposte fisiologiche, citologiche e biochimiche del lichene Flavoparmelia caperata (L.) Hale sottoposto a fumigazioni con O3 e mantenuto a diversi regimi di idratazione e di umidità relativa ambientale. L'obiettivo di questo studio è stato quello di verificare se la tolleranza di questo lichene allo stress ossidativo derivante dall'esposizione all'O3 dipende da una strategia O3-avoidant, imputabile alla sua inattività metabolica durante le ore della giornata in cui si verifica il picco dell'O3, oppure da una O3-tolerant, dovuta invece alla presenza di un cospicuo ed efficace corredo di difese antiossidanti. Il primo studio ha dimostrato che il fotobionte algale al di fuori della simbiosi è in grado di resistere a livelli elevati di stress foto-ossidativo anche per periodi molto lunghi. Tuttavia è stato confermato che la simbiosi adduce benefici importanti come l'aumento della capacità di estinzione dell'energia accumulata dalle clorofille attraverso meccanismi non fotochimici e un ridotto effetto ossidativo indotto dal disseccamento. Questi risultati ci hanno permesso di sfatare l'ormai consolidata idea che i fotobionti algali, in particolare quelli del genere Trebouxia, siano particolarmente delicati e incapaci di tollerare autonomamente (al di fuori della simbiosi) fattori di stress abiotici come quelli che intervengono durante il disseccamento. Dai risultati del secondo studio è emerso che il fotobionte T. gelatinosa per far fronte alle importanti alterazioni dovute alla perdita d'acqua, si affida soprattutto a meccanismi che intervengono durante la fase di reidratazione. I più importanti coinvolgono molecole di riparazione “chaperone”, e. g. “Heath Shock Proteins”, e proteine della famiglia “Desiccation Related Proteins”, la cui funzione è ancora sconosciuta, ma visto l'elevato numero, la loro diversità intraspecifica e la sensibilità ai cambi di contenuto idrico, sembrano giocare un ruolo molto importante. Paradossalmente invece non sono state osservate alterazioni nell'espressione di geni collegati alle difese antiossidanti, che è sempre rimasta a livelli costitutivi. Ciò è stato interpretato come una strategia che permette all'organismo di avere sempre a disposizione mRNA per la neo-sintesi di nuovi enzimi coinvolti nelle difese antiossidanti. Infine nell'ultimo studio è stata riconfermata l'elevata resistenza del lichene F. caperata allo stress ossidativo derivato dall'esposizione all'O3 in quanto alla concentrazione utilizzata, ovvero il massimo registrato nell'ambiente alle nostre latitudini, non è stato osservato alcun effetto sulla vitalità nonostante sia stata osservata una notevole produzione di ROS. L'effetto ossidativo dell'O3 infatti è stato controbilanciato dalle difese antiossidanti le quali si sono mostrate altamente sensibili all'esposizione ed efficaci anche a bassi contenuti idrici. Lo stress ossidativo derivante da fattori abiotici di origine naturali e antropica dunque sembra essere gestito efficacemente sia dai licheni che dai loro fotobionti isolati, grazie ad efficienti difese antiossidanti e all'intervento di meccanismi di riparazione del danno.
XXVI Ciclo
1983

Oxidative stress plays a role in the molecular mechanisms of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD). At cerebral level, AD is characterized by presence of senile plaques constituted by β amyloid (Aβ) peptide. In previous studies it was shown that patients with AD have high plasma levels of oxidized low-density lipoproteins (ox-LDL). In addition, less activity of the enzyme paraoxonase-1 (PON1) was noted. PON1 associated with HDL is the enzyme responsible of anti-inflammatory and antioxidant activity. Aim of thesis was to investigate the functional alterations of HDL in AD patients. Therefore the activity of paraoxonase-1 was evaluated. Furthermore, using microvascular endothelial cells (HMEC), the ability of HDL, isolated from control plasma and AD patients, to protect against Aβ peptide toxicity was evaluated. Results show that mean value of paroxonase activity of PON1 is about a third of that observed in controls (293.6 ± 49.8 U / mL vs 100.3 ± 30.9 U / mL, p <0.001). In AD patients and control's serum were also studied PON1 levels, using Western blot method. PON1 levels of AD patients are significantly lower than those observed in controls. It is interesting to note that the reduced activity of PON1 in AD is observed in the absence of changes in plasma HDL levels compared to controls. Using microvascular endothelial cells (HMEC), the ability of HDL, isolated from controls plasma and AD patients, to protect against toxicity of Aβ peptide was evaluated. Research has shown that Aβ (peptide 1-40) at 20 μM concentration induces a toxic effect by reducing the viability of HMECs. Incubation in presence of HDL isolated from healthy subjects was able to protect cells from toxicity peptide. The results obtained in this thesis have shown that plasma-isolated HDL of Alzheimer's patients are significantly less efficient to protect cells from Aβ-induced damage. Data suggest that the increase in peroxidation products and reduction of PON1 enzyme activity observed in those AD affected make HDL dysfunctional.

The fruits of Capsicum annum (sweet pepper) are a good source of natural antioxidants and one of this compound, capsiate the most important capsinoid, is present in great quantity in the fruits of a nonpungent cultivar called CH-19 Sweet. In this work it has been evaluated the antioxidant activity of vanillyl nonanoate, a synthetic analog of natural capsiate, during linoleic acid and cholesterol oxidation, and the LDL-oxidation in presence of Cu2+. In these experimental systems the ability of the compound to inhibit the lipid peroxidation induced by ROO. radicals and its chelating properties has been underlined. Moreover the phenol showed a protective effect in VERO cells against the tBH-induced reduction of the main membrane lipids. The vanillyl nonanoate exerted in vivo an important protective effect on the plasma and kidney lipid fraction of rats in a model of oxidative stress induced by a sub-lethal dose of ferric nitrilotriacetate (FeNTA), showing a more evident protection in the plasma compared to that observed in the kidney. From the obtained results, vanillyl nonanoate showed an interesting antioxidant activity in vitro and in vivo and taking into account that this phenolic compound exhibits the same biological activities of the natural capsiate, it can be considered an attractive antioxidant candidate for human use.

Increasing evidence suggests a role for oxidative stress in age-related decrease in osteoblast number and function, leading to the development of osteoporosis. In this study, we investigated the effects of ghrelin on tert-butyl-hydroperoxide (t-BHP)-induced oxidative damage in MC3T3-E1 osteoblastic cells, as well as the role of the ghrelin receptor (GHS-R) involved in such activity. MTT assay showed that t-BHP treatment resulted in decreased cell viability in a concentration and time dependent manner. Under 250 μM t-BHP treatment, MC3T3-E1 cells displayed significant loss of viability and dramatic morphological changes characterized by cell shrinkage and typical apoptotic alterations such as chromatin condensation. MC3T3-E1 cells pretreated with ghrelin (10-9 M) and cultured with t-BHP (250 μM) for 3h showed increased viability and reduced apoptosis as shown by MTT assay and Hoechst-33258 staining. Furthermore, ghrelin prevented t-BHP-induced osteoblastic dysfunction and changes in the cytoskeleton organization evidenced by the staining of the actin fibers with Phalloidin-FITC by reducing reactive oxygen species generation. Cell treatment with the GHS-R1a agonist, EP1572 (10-7-10-11 M), had no effect against t-BHP-induced cytotoxicity and pretreatment with the selective GHS-R1a antagonist, D-Lys3-GHRP-6 (10-7 M), failed to remove ghrelin (10-9 M)-protective effects against oxidative injury, indicating that GHS-R1a is not involved in such ghrelin activity. Accordingly, unacylated ghrelin (DAG), not binding GHS-R1a, displays the same protective actions of ghrelin against t-BHP-induced cytotoxicity. Consistently with these observations, Ghrelin has been previously shown to activate different intracellular pathways including PI3K/Akt via a specific ghrelin/DAG binding site, that is not GHS-R1a. Furthermore, cell treatment with a specific inhibitor of PI3K/Akt pathway, (Ly294002, 10μM) reduced the protective effect of ghrelin against t-BHP-induced oxidative damage. This observation indicates that ghrelin confers protection against t-BHP-induced oxidative damage via a PI3K/Akt dependent pathway. Akt activation controls the cell survival through phosphorylation of downstream targets such as protein kinase GSK-3b. Inactivation of GSK-3b results in traslocation of b-catenin to the nucleus and nuclear b-catenin is known to inhibit apoptosis. In this study we have shown that ghrelin increased GSK-3b phosphorylation and b-catenin accumulation measured by Western Blot primary in osteoblasts obtained from rat calvary cells (rOB). These findings suggest that ghrelin can function as an antioxidant compound on osteoblasts and may have therapeutic potential to promote bone formation and reduce bone loss associated with aging.

Il fumo di sigaretta è un importante fattore di rischio per aterosclerosi, una malattia infiammatoria cronica. I meccanismi con cui il fumo determina aterosclerosi non sono completamente noti. È stato ipotizzato che componenti solubili del fumo di sigaretta inducano stress ossidativo a livello vascolare e cellulare. Lo scopo di questo studio era quello di mettere in relazione stress ossidativo ed infiammazione in soggetti giovani fumatori. Sono stati valutati,quindi: 1)prodotti di perossidazione lipidica (fosfolipidi ossidati, ox-PAPC) in linfomonociti circolanti (LMC);2)ruolo dei prodotti di perossidazione lipidica nell’indurre la produzione di ROS a livello nei linfomonociti circolanti e deplezione della concentrazione plasmatica e cellulare di GSH; 3)espressione del fattore di trascrizione NF-E2 related factor 2 (Nrf2) e l’espressione di enzimi antiossidanti controllati dalla via Nrf2-ARE mediata; 4)espressione genica NfKb e concentrazione plasmatica della proteina C reattiva ultrasensibile (hs-PCR). Sono stati studiati 90 soggetti volontari sani: 32 non fumatori, 32 moderati fumatori (5-10 sigarette die) e 26 forti fumatori (25-40 sig/die). I livelli di Ox-PAPC erano più elevati nei soggetti moderati e forti fumatori rispetto ai non fumatori (p<0,01). In vitro ox-PAPC incrementavano la generazione di ROS via NADPH ossidasi. GSH plasmatico e cellulare erano più bassi nei soggetti moderati e forti fumatori rispetto ai non fumatori (p<0,01). L’espressione di Nrf2 in LMC era più elevata nei soggetti moderati fumatori rispetto ai non fumatori (p0,01), ma non nei forti fumatori, che presentavano maggior espressione di NfKb e più elevati livelli di hs-PCR.(p<0,01). In vitro, gli ox-PAPC incrementavano l’espressione di Nfkb in modo dose-dipendente, mentre a più elevate concentrazione riducevano l’espressione di Nrf2. Il fumo di sigaretta promuove la formazione di ox-PAPC e induce stress ossidativo a livello dei LMC. Questo può causare l’attivazione di NFkB che a sua volta può partecipare a regolare in modo negativo la via antiossidante Nrf2 ARE mediata favorendo l’infiammazione.
Cigarette smoking is an important risk factor for atherosclerosis, a chronic inflammatory disease. However the underlying factors of this effect are unclear. It has been hypothesized that water-soluble components of cigarette smoke can directly promote oxidative stress in vasculature and blood cells. Aim of this study was to study the relationship between oxidative stress and inflammation in a group of young smokers. To do this we evaluated: 1) the oxidation products of phospholipids (oxPAPC) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC); 2) their role in causing PBMC reactive oxygen species (ROS)generation and changes in GSH; 3) the expression of the transcription factor NF-E2-related factor 2 (Nrf2) and of related antioxidant genes (ARE); 4) the activation of NF-kB and C-reactive protein (CRP) values. We studied 90 healthy volunteers: 32 non-smokers, 32 moderate smokers (5–10 cigarettes/day) and 26 heavy smokers (25–40 cigarettes/day). OxPAPC was higher in moderate smokers and heavy smokers than in non-smokers (p,0.01), the highest values being in heavy smokers (p,0.01). In in vitro studies oxPAPC increased ROS generation via NADPH oxidase activation. GSH in PBMC and plasma was lower in moderate smokers and heavy smokers than in non-smokers (p,0.01), the lowest values being in heavy smokers (p,0.01). Nrf2 expression in PBMC was higher inmoderate smokers than in non-smokers (p,0.01), but not in heavy smokers, who had the highest levels of NF-kB and CRP (p,0.01). In in vitro studies oxPAPC dose-dependently increased NF-kB activation, whereas at the highest concentrations.Nrf2 expression was repressed. The small interference (si) RNA-mediated knockdown of NF-kB/p65 increased about three times the expression of Nrf2 stimulated with oxPAPC. Cigarette smoke promotes oxPAPC formation and oxidative stress in PBMC. This may cause the activation of NF-kB that in turn may participate in the negative regulation of Nrf2/ARE pathway favouring inflammation.

Emerging evidence indicated that oxidative stress has been implicated in mechanisms leading to neuronal cell injury in various pathological states of the brain, including neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease (AD) and aging (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Increasing evidence supports the notion that reduction of cellular expression and activity of antioxidant proteins and the resulting increase of oxidative stress are fundamental causes in the aging processes and neurodegenerative diseases (1, 9, 12, 34, 96, 249). As one of the main intracellular redox systems involved in neuroprotection, the vitagene system is emerging as a neurohormetic potential target for novel cytoprotective interventions (15, 17-18). In this study the importance of vitagenes in the cellular stress response and the potential use of dietary antioxidants in the prevention and treatment of neurodegenerative disorders, aging and systemic pathologies is discussed (12, 17, 251). The strong evidence that the vitagene network operates as a defense system in the brain during oxidative and nitrosative stress open new perspectives in the treatment of neurodegenerative disorders and other age-related diseases (2, 12, 14, 31, 249, 251). Taken together, these results suggest that the expression of Hsps increases with age and occurs as a consequence of redox state perturbation and this may have a role to limit the deleterious consequences associated with protein denaturation (1, 3, 5, 8, 12). Relevant to this, we devoted our recent interest to the development of nutritional interventions, including carnosine, able to target redox-sensitive cytoprotective genes, called vitagenes, involved in the homeostatic control of so-called longevity-assurance processes (2, 123, 251). In this study we tested the hypothesis that neurotoxicity is an important primary mediator of injury in Meniere's disease and may be reflected in measurable increases in markers of cellular stress response and oxidative stress in the peripheral blood of patients with Meniere's disease. The search for novel and more potent inducers of vitagenes will facilitate the development of pharmacological strategies to increase the intrinsic capacity of vulnerable ganglion cells to maximize antidegenerative mechanisms, such as stress response and thus cytoprotection (16, 18, 249, 251). Neurofibromatosis type 1 (NF1) is one of the most common autosomal dominant neurogenetic disorder. The mechanisms underlying NF1 clinical variability remain poorly understood, probably because of the involvement of complex pathophysiology and multiple factors. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a common monogenic tumor-predisposition disorder with an autosomal dominant pattern of inheritance that arises secondary to haploinsufficiency of the tumor suppressor gene NF1 (149, 284). The allelic heterogeneity of the constitutional NF1 mutation may be one of the factors explaining the disease phenotypic variability (285). Studies provided evidence for a strong genetic component and suggested the involvement of unlinked modifying genes and perhaps also of the normal NF1 allele, in the variable expression of the disease (285). The NF1 gene product, neurofibromin, is a cytoplasmic ubiquitously expressed protein of 2818 amino acids long, with structural and functional similarities to the mammalian GTPase-activating protein (GAP)-related protein family, a group of evolutionarily conserved proteins. Analysis of the predicted sequence of neurofibromin revealed that it likely functions as a negative regulator of Ras, a key intracellular signaling protein that is important for regulating cell growth and survival. Significant advances in the understanding of the pathophysiology of NF1 have been made in the last decade. Molecular testing is not indicated for the routine clinical care of patients with NF1, but can be helpful in individuals suspected of having NF1 (e.g. a young child with multiple cafà à à à à à à à à ©-au-lait spots and unaffected parents or a patient with a single criterion) or when prenatal or preimplantation genetic diagnosis is desired. Recently molecular testing for NF1 has become clinically available (188, 190). Because of the large size of the NF1 gene and the lack of mutation hotspots, a multi-step detection protocol is preferred. Efforts to identify and characterise all NF1 gene mutations continue to present a considerable research and diagnostic challenge due to a combination of the large gene size, the absence of any localised mutation clustering, little evidence of repeat mutation and the wide diversity of mutation types observed. Furthermore, the presence of a number of highly homologous partial NF1 pseudogene-like sequences located throughout the human genome has increased the complexity of PCR-based mutation analysis (150). According to this evidence, data illustrated in the present study clearly reported a wide spectrum of different types of mutations, including pathogenetic missense, nonsense, small deletions/insertions, which lead to the synthesis of an aberrant protein product. The data presented in this study indicate that splicing in NF1 gene is extremely complex (242-243). In fact, we identified heterozygous missense mutations in acceptor site or intraexonic causing codons in frame microdeletion or activating a criptic exon splicing site or causing exon skipping. All these mutations altered canonic mechanism of normal splicing causing aberrant transcripts formation (242-243). To better investigate smaller NF1 rearrangements, we performed multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen of a number patients affected by NF1 for whom the presence of point mutations, small deletions and insertions had been previously excluded by sequencing analysis. Single and multi-exon NF1 copy-number changes, exclusively represented by NF1 gene entire deletion in our genetic test, were found in two different clinic case of patients with NF1. Our study enlarge knowledge and spectrum of NF1 gene mutations and underlie the importance of molecular-genetic tests on the basis also of the Neurofibromatoses clinic field characterization.
Emergenti evidenze sperimentali indicano il coinvolgimento dello stress ossidativo alla base dei meccanismi patogenetici che portano al danno neuronale in diverse condizioni patologiche, inclusi i disordini neurodegenerativi, quali la malattia di Alzheimer e l'invecchiamento fisiologico (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Le attuali evidenze suggeriscono che, in generale, la riduzione dell'espressione cellulare e dell'attivita' di proteine antiossidanti associata ad una diminuzione nell'efficienza dei meccanismi cellulari di riparazione e di degradazione ed il conseguente incremento dei livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo rappresentano una delle cause fondamentali sia dei normali processi d'invecchiamento che delle principali malattie neurodegenerative (1, 9, 12, 34, 96, 249). Uno dei principali sistemi redox intracellulari coinvolti nella neuroprotezione, il sistema dei vitageni, dato principalmente dal sistema delle proteine Hsps, e' emerso quale potenziale neurormetico target di innovative strategie terapeutiche citoprotettive (15, 17-18). I dati del presente studio sperimentale indicano l'importanza del sistema dei vitageni alla base della risposta cellulare allo stress e il potenziale impiego di antiossidanti nutrizionali, nella prevenzione e nel trattamento dei disordini neurodegenerativi, dell'invecchiamento e delle patologie sistemiche (12, 17, 251). L'emergente evidenza sperimentale in base alla quale il network dei vitageni opera quale sistema di difesa nel cervello in seguito ad aumentati livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo apre nuove prospettive nel campo della medicina per il trattamento dei disordini neurodegenerativi e di altre patologie eta'à à à à à à  -dipendenti (2, 12, 14, 31, 249, 251). Considerate in una visione d'insieme, i dati sperimentali del presente studio indicano che l'espressione delle Hsps aumenta durante l'invecchiamento ed in presenza di alterazioni dello stato redox, al fine di limitare le conseguenze deleterie date dall'eccessiva produzione di proteine alterate ossidativamente (1, 3, 5, 8, 12). Riguardo cioe', abbiamo rivolto il nostro interesse verso lo sviluppo di innovativi interventi nutrizionali, dati da antiossidanti presenti nella dieta, quali la carnosina, aventi come target tali geni citoprotettivi redox-sensitivi, definiti vitageni, coinvolti nella neuroprotezione e nel mantenimento dell'omeostasi e dei processi che assicurano la longevita' (2, 123, 251). Nel presente studio abbiamo testato, inoltre, l'ipotesi sperimentale in base alla quale la neurotossicita' rappresenta un importante mediatore primario di danno nella sindrome di Menierà à à à à à à © cio' puo' essere spiegato da aumentati livelli di biomarkers di risposta cellulare allo stress quantificabili in campioni di sangue periferico di pazienti affetti. Di conseguenza, la ricerca di innovativi e potenti induttori del sistema dei vitageni apre nuove prospettive per lo sviluppo di originali strategie farmacologiche in grado di dare citoprotezione e di massimizzare i meccanismi antidegenerativi, inclusa la risposta cellulare allo stress, anche nei neuroni gangliari a spirale dell'apparato cocleovestibolare, riducendo i principali segni clinici associati alla sindrome di Menierà à à à à à à © (16, 18, 249, 251). La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), o neurofibromatosi classica o periferica, e' uno dei piu' comuni disordini neurogenetici ereditari a carattere autosomico dominante. Il meccanismo molecolare che sta alla base della variabilita' clinica di tale sindrome multisistemica rimane ancora non del tutto conosciuto, probabilmente per la complessita' dei molteplici fattori coinvolti nella sua patofisiologia. La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) e' una condizione genetica multisistemica la quale origina da mutazioni allo stato eterozigote, inattivanti il gene tumor suppressor NF1, localizzato nella regione pericentromerica del cromosoma umano 17 (17q11.2). L' eterogeneita' allelica delle mutazioni che interessano il gene NF1 rappresenta uno dei fattori che spiega l'eterogeneita' fenotipica (285). Studi clinici e sperimentali dimostrano l'esistenza di una forte componente genetica e suggeriscono il coinvolgimento di geni modificatori alla base della variabilita' di espressione di tale disordine neurogenetico (285). Il prodotto del gene NF1, la neurofibromina, e' una proteina ubiquitaria citoplasmatica di 2818 residui aminoacidici, con una struttura e funzione simili a quelle delle proteine GAP (GTPasi-activating protein), un gruppo di proteine conservate evolutivamente. L'analisi della struttura della neurofibromina ha permesso di identificarla quale regolatore negativo della proteina Ras, una proteina chiave intracellulare coinvolta nel signaling pathway che regola i processi di crescita e di sopravvivenza cellulare. Significativi progressi scientifici sono stati raggiunti nell'ultima decade per quanto riguarda la comprensione dei principali meccanismi molecolari alla base della patofisiologia di tale sindrome genetica multisistemica. L'analisi mutazionale del gene NF1 ed i test genetici vengono utilizzati quale supporto e conferma della diagnosi clinica, soprattutto in quei casi clinici che non soddisfano pienamente i criteri diagnostici o quando la diagnosi prenatale e' richiesta. Recentemente, test molecolari sono stati resi disponibili clinicamente per la diagnosi genetica di Neurofibromatosi di tipo 1 (188, 190). A causa dell'enorme grandezza e complessita' del gene NF1, della mancanza di siti hotspots mutazionali noti, dell'estrema variabilita' fenotipica e della presenza di pseudogeni, in genere e' richiesto un protocollo multi-step per la diagnosi molecolare di NF1 (150). In accordo ad evidenze cliniche e sperimentali, i dati riportati nel presente studio mostrano chiaramente la presenza di un ampio spettro di differenti tipi di mutazioni riscontrate in diversi casi clinici, incluse mutazioni patogenetiche missense, nonsense, piccole delezioni/inserzioni, le quali portano alla sintesi di un prodotto proteico aberrante. I dati sperimentali e clinici del presente studio indicano che il meccanismo di splicing nel gene NF1 e' estremamente complesso (242-243). Infatti, nel nostro laboratorio abbiamo identificato in diversi casi clinici delle mutazioni missense nel sito accettore di splicing o intraesoniche, nel gene NF1 allo stato eterozigote, le quali possono causare o la microdelezione in frame di codoni, o attivare siti criptici di splicing intraesonici o addirittura promuovere lo skipping dell'esone di interesse. In tutti questi casi si ha una profonda alterazione dei meccanismi canonici di splicing, la quale determina la formazione di trascritti aberranti e patogenetici (242-243). Per di piu', al fine di identificare ridotti riarrangiamenti del gene NF1, incluse piccole delezioni/duplicazioni, abbiamo adottato recentemente nel nostro laboratorio un nuovo protocollo diagnostico basato sull'impiego della tecnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), per testare tutti i casi clinici NF1 risultati negativi al sequenziamento diretto per la ricerca di mutazioni puntiformi (180, 207). Il nostro studio, pertanto, amplia le conoscenze e lo spettro delle mutazioni relative al gene NF1 e sottolinea l'importanza dell'analisi genetico-molecolare alla base di una caratterizzazione diagnostica anche nel campo clinico delle Neurofibromatosi.

L'arresto cardiocircolatorio è un evento improvviso, caratterizzato dalla cessazione dell attività cardiaca e respiratoria, e da una rapida perdita di coscienza a seguito della conseguente interruzione della perfusione cerebrale. Lo scopo dello studio è stato la valutazione parametri di funzionalità cardiaca ed il rilascio di mediatori di stress e dell infiammazione in un modello animale di arresto cardiaco. I nostri dati dimostrano l'aumentano della perossidazione lipidica (isoprostani ed LOOH) e dello danno ossidativo del DNA nel miocardio dopo 2h e 4h dallarresto cardiaco. Simili risultati sono stati ottenuti nel rene, fegato e cervello. In particolare, nella zona CA1 dell'ippocampo abbiamo osservato una significativa perdita di neuroni ed una astrogliosi reattiva. In conclusione i nostri dati dimostrano che i livelli plasmatici e tissutali dei paprametri dello stress ossidativo sono temporaneamente alterati durante il periodo successivo alla rianimazione e correlano con l alterata funzione cardiaca.

The VGF gene encodes a protein precursor (617/615 AA rat/man, respectively), which is processed in vivo to various low MW peptides with different biologic activities. These include attenuation of excytotoxic injury on spinal motor neurons from G93A-SOD-1 mice, upon overexpression of the VGF precursor, or an anti-apoptotic action of the VGF peptide TLQP-21 on cerebellar granules. Recently, the C3a and gC1q have been identified as TLQP-21 receptors. Using the mouse motoneuronal cell line NSC-34 and the primary human fibroblast cell colture, we studied the expression and modulation of certain VGF peptides (VGFp) in ALS and oxidative stress and their possible neuroprotective effect. Oxidative stress was induced with Na Arsenite (SA: 0.5mM, 30/60 min) while the MTT test was used to assess cell viability. Antibodies used (for either ICC or ELISA) were specific for: the N/C-terminus of the VGF precursor, NERP-1, rat PGH, NAPPE-19 and TLQP-21, and for the C3a/gC1q TLQP receptors. Both antibody receptors were also used for ICC and western blot analysis. In NSC-34, almost all VGFp were selectively localized in the growth cones, perinuclear region, and/or in a specific paranuclear region. Upon oxidative stress, most cells showed a rounded morphology, with loss of growth cones, while almost all VGFp were found mainly in a paranuclear region compatible with the Golgi apparatus. In ELISA, untreated cellular extracts showed the presence of the majority VGFp with a significant reduction in TLQP and NERP-1 levels versus untreated cells (58% and 65% of reduction, respectively) after SA treatment, while the culture medium showed a marginal increase of the same peptides. Cell viability studies showed a significant protective action of TLQP-21 on stressed neurons (SA alone: 74.7% 0.08, SA and TLQP-21 together: 82.1% 0.08 of untreated controls, p0.018), with no detectable effect for NERP-1. Results from immunocytochemistry showed the presence in NSC-34 of gC1q receptor only, confirmed also by western blot analysis. In human fibroblasts, VGFp were selectively localized in citoplasmic and paranuclear region morfologically related to the membranous cellular system, without obvious differences between healthy and ALS subjects (with TARDBPA382T and without known mutation). In ELISA, N-terminus and NERP-1 showed a significant reduction in both groups of ALS patients (TARDBPA382T: 30% and 61% of reduction, respectively; ALS without known mutation: 37% and 62% of reduction, respectively) versus healty controls, while TLQP-21 and C-terminus showed a reduction only in certain ALS patients (TLQP-21: 37% of reduction, for ALS without known mutation; C-term: 62% of reduction, only for ALS TARDBPA382T) versus healty cells. In conclusion, the VGFp studied are present in NSC-34, but only TLQPp are modulated and secreted after oxidative stress, with a potential neuroprotective role. In fibroblasts, VGFp showed a significant reduction in ALS cell extracts. Hence, the research in the VGF field using NSC-34 could open new perspectives for potential therapeutic tools, while the results obtained through fibroblasts could be helpful for diagnostic purposes.

High blood pressure is a major risk factor for cardiovascular disease, myocardial infarction, heart failure, kidney failure and peripheral vascular disease. Oxidative stress, due to increased production of reactive oxygen species (ROS), plays an important pathophysiological role in the development of hypertension and its long-term complications, such as cardiovascular remodeling and atherosclerosis (Touyz RM et al, 2004). Various risk factors (smoking, diabetes, increased LDL, as well as hypertension) lead to an increase of the redox state, resulting in endothelial dysfunction, increased expression of pro-inflammatory redox sensitive genes and activation of smooth muscle cells (Luft FC, 2001). In hypertensive patients, the Renin-Angiotensin-Aldosterone system (RAAS) is activated and this causes an increase of Angiotensin (Ang II) production (Ruster C et al, 2006). Ang II causes vasoconstriction, increases total peripheral resistance and, consequently, blood pressure but at the same time strongly induces oxidative stress. Ang II mediates its actions through two distinct receptors: AT1R (for which Ang II has more affinity) and AT2R (Dihn DT et al, 2001; Mehta PK et al, 2007; Calò LA et al, 2010). Many of the Ang II-related events are mediated via activation of the AT1R receptor followed by both a short term signaling, which causes vasoconstriction, and a long term signaling, which leads to vascular remodeling and atherosclerosis through the activation of NAPDH oxidase and consequently production of superoxide anion (O2-) (Griendling KK et al, 2000). Ang II signaling via AT2R stimulation has been suggested to counteract many actions mediated by AT1R inducing vasodilatation, anti-proliferation, cell differentiation, anti-apoptotic signals; it therefore has a role in the homeostatic counterbalance of an excessive stimulation of AT1R (Volpe et al, 2003; Zhuo et al, 2008; Yamamoto et al, 2008). Oxidative stress is well recognized to play a crucial role in the pathogenic mechanisms of endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction defines a complex molecular and biochemical picture of inflammatory, proliferative, structural and functional abnormalities of the vasculature. Endothelial progenitor cells (EPCs), derived from bone marrow, play an important role for the protection from these abnormalities (Hill JM et al, 2003), as they are able to repair the damaged endothelium, through a continuous process of re-endothelialization and/or neovascularization (Heiss C et al, 2005). In hypertension the number of circulating EPCs is reduced and their function is altered; this situation represents an additional risk factor in the development of cardiovascular events. It has been shown that Ang II and AngII-induced oxidative stress play a pivotal role in EPC status by accelerating the onset of their senescence, which, in turn, leads to impairment of their proliferative activity (Imanishi T et al, 2005). The calcitonin gene-related peptide (CGRP), instead, is a potent vasorelaxant, which prevents circulating EPC senescence and reverses AngII-induced senescence of EPC (Zhou Z et al, 2010). The important role that oxidative stress plays in the cardiovascular remodelling and atherogenetic processes, that are observed in hypertension, has led researchers to investigate the potential pleiotropic effects of antihypertensive drugs on oxidative stress. In particular, two drugs families are more intensive studied: ACE inhibitors (ACEIs) and the Ang II type 1 receptor blocker (ARBs) which both reduce RAAS activity. Olmesartan Medoxomil, widely used in the treatment of hypertension, blocks specifically AT1R receptor and consequently its actions via short and long term signaling independently of the Ang II source. AngII is, then, available for binding to AT2R inducing vasodilatation, anti-inflammatory and antifibrotic effects and causing a dose-dependent reduction of blood pressure. Furthemore, the treatment with Olmesartan has been shown to possess antioxidant-related effects such as reduction of the plasma levels 8-isoprostane, a marker of oxidative stress (Fliser D et al, 2005), and activation of Nitric Oxide (NO) system, through increase of eNOS phosphorylation (Oyama N et al, 2010; Kanematsu Y et al, 2006). The aim of our study was, therefore, to evaluate a possible anti-oxidant and vasoprotective effect of the Olmesartan Medoxomil, in essential hypertensive patients, using a molecular biology approach. The study was carried out at different times, using two cohorts of essential hypertensive patients with similar clinical features treated for six months with Olmesartan Medoxomil. On the first cohort of patients we analyzed markers of oxidative stress and cardiovascular remodelling-related pathways, as well as the level of oxidized LDL; on the second cohort of patients, we evaluated both the protein expression of HO-1, the plasma levels of CGRP and circulating EPCs number and senescence. In particular, in the first phase of the study, we evaluated p22phox, subunit of NADPH oxidase, essential for the production of superoxide anion (O2-), and heme oxygenase-1 (HO-1), inducible isoform of HO, known to protect from oxidative stress. We also evaluated the state of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2), an oxidative stress protein effector for cardiovascular remodeling, and the plasma level of the low-density lipoproteins (OxLDL), a plasma marker of oxidative stress, which is crucial in the development of arteries chronic inflammation at intima level. In the second phase of the study, we evaluated the vasoprotective effects of Olmesartan, considering parameters such as: HO-1, potent anti-oxidant and anti-inflammatory protein, characterized by a strong effect on re-endothelialization, which is linked to its ability to increase the number and to reduce the senescence of circulating EPC; CGRP, peptide-stimulated by HO-1, that protect the endothelium and prevents circulating EPCs senescence. Moreover, were evaluated the number and survival of circulating EPCs. The results of the first phase of the study, have demonstrated that Olmesartan Midoxomil, besides inducing blood pressure normalization in essential hypertensive patients since the third month of treatment, significantly reduced p22phox protein level after 3 months compared to baseline (0.71±0.26 vs 0,93±0.24 densitometric unit (d.u.,), p<0.001), and moreover significantly reduced p22phox at 6 months both compared to baseline (0.45±0.12 vs 0.93±0.24 d.u., p<0.001) and to 3 months (0.45±0.12 vs 0.71±0.26 d.u., p<0.02). Olmesartan treatment also significantly decreased phosphorylated ERK 1/2 levels, both after 3 months compared to baseline (0.39±0.14 vs 0.56±0.11 d.u., p=0.001), and at 6 months compared to baseline (0.19±0.08 vs 0.56±0.11, d.u., p=0.001) and to 3 months (0.19±0.08 vs 0.39±0.14, d.u., p=0.001). oxLDL plasma levels were significantly reduced after 6 months of treatment, both compared to baseline (171.92±61,83 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=0.001), and to 3 months (171.92±61,83 vs 270.06±100.34 ng/ml, p=0.002), whereas at 3 months the reduction was not significant. Furthermore, Olmesartan treatment caused a significant increase of HO-1 protein expression levels at 3 months of the therapy compared to baseline (1.10±0.19 vs 0.77±0.071 d.u., p=0.001) and at 6 months of the therapy compared to baseline (1.11±0.19 vs 0.77±0.071 d.u., p=0.001). There was no significant increase of HO-1 protein expression between 6 and 3 months of Olmesartan treatment (1.11±0.19 vs 1.10±0.19 d.u., p=ns). In the second phase of the study, confirming the previously shown increase of HO-1, we found that Olmesartan significantly increased HO-1 protein level, both at 3 months compared to baseline (0.95±0,21 vs 0.81±0.21 d.u., p=0.031), and at 6 months compared to baseline (1.1±0.26 vs 0.81±0.21 d.u., p=0.001) and to 3 months (1.1±0.26 vs 0.95±0.21 d.u., p=0.01). Moreover, we observed a significantly increase of CGRP plasma levels after 6 months of therapy, both compared to baseline (263.91±43.08 vs 198.81±51.98 pg/ml, p=0.001), and to 3 months (263.91±43.08 vs 218.97±41.13 pg/ml, p=0.03). Circulating EPC number, defined by cell surface antigens CD34+KDR+, CD133+KDR+ e CD34+CD133+KDR+, increased after 6 months of Olmesartan treatment both compared to baseline (respectively, 112.89±53.44 vs 35.11±25.98, p=0.005; 107.60±37.09 vs 20.90±14.58, p=0.0001; 38.11±19.64 vs 3.67±3.61, p=0.0007) and compared to 3 months (respectively, 112.89±53.44 vs 59.11±35.30, p=0.002; 107.60±37.09 vs 49.50±45.20, p=0.003; 38.11±19.64 vs 15.78±18.59, p=0.0028). Olmesartan significantly reduced EPC apoptosis, evaluated by gating on CD133+KDR+ cells events based on Annexin V expression, at 3 months compared to baseline (27.24± 9.64% vs 44.28 ± 12.38%, p<0.01) and further significantly reduced it at 6 months both compared to baseline (16.83±15.68% vs 44.28 ±12.38%, p<0.001) and to 3 months (16.83±15.68% vs 27.24±9.64%, p< 0.004) (Calò LA et al, 2014). In conclusion, this study demonstrates Olmesartan’s inhibitory effect on oxidative stress and oxidative stress-related proteins involved in oxidative stress signaling in essential hypertensive patients. Moreover, it demonstrates a vasoprotective effect of Olmesartan via reduction of Ang II-mediated oxidative stress and increased CGRP-mediated improvement of endothelial dysfunction, likely due also to the increased number of circulating EPC and their improved survival/function. In addition, our data provide a mechanistic rationale for the Olmesartan’s antioxidant and anti-inflammatory potential translation, in the long term, toward antiatherosclerotic and antiremodeling effects reported in clinical trials such as MORE (Stumpe KO et al 2007), OLIVUS (Hirohata A et al, 2010), EUTOPIA (Fliser D et al, 2004) e VIOS (Smith RD et al, 2006)
L’ipertensione arteriosa è il più importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari, l’infarto del miocardio, lo scompenso cardiaco, l’insufficienza renale e le vasculopatie periferiche. Lo stress ossidativo, dovuto all’aumentata produzione delle specie reattive all’ossigeno (ROS), svolge un importante ruolo fisiopatologico nello sviluppo dell’ipertensione arteriosa e delle sue complicanze a lungo termine, quali il rimodellamento cardiovascolare e l’aterosclerosi (Touyz RM et al, 2004). Vari fattori di rischio (fumo, diabete, aumento di LDL, oltre che ipertensione) portano ad un aumento dello stato redox, determinando disfunzione endoteliale, aumento dell’espressione di geni pro-infiammatori redox sensibili ed attivazione delle cellule muscolari lisce (Luft FC, 2001). In pazienti ipertesi, il sistema Renina-Angiotensina (RAAS) è attivato, causando un aumento di produzione dell’Angiotensina (Ang II) (Ruster C et al, 2006). L’Ang II, potente vasocostrittore (in grado di aumentare le resistenze periferiche totali e quindi la pressione arteriosa) è un potente induttore di stress ossidativo. L’Ang II media le sue azioni attraverso due recettori distinti: AT1R e AT2R (Dihn DT et al, 2001; Mehta PK et al, 2007; Calò LA et al, 2010). La stimolazione del recettore AT1R, per il quale l’Ang II presenta maggiore affinità, determina sia vasocostrizione attraverso un signalling cellulare a breve termine ma anche rimodellamento vascolare e aterosclerosi attraverso un signalling a lungo termine che coinvolge l’attivazione dell’NADPH ossidasi, produttore di anione superossido (O2-) (Griendling KK et al, 2000). Il legame al recettore AT2R da parte dell’Ang II controbilancia gli effetti mediati dall’attivazione di AT1R, inducendo vasodilatazione, antiproliferazione, differenziazione cellulare, segnali antiapoptotici; esso ha quindi un ruolo omeostatico nel controbilanciare un eccesso di stimolazione di AT1R (Volpe et al, 2003; Zhuo et al, 2008; Yamamoto et al, 2008). Lo stress ossidativo, è considerato uno dei meccanismi patogenetici fondamentali della disfunzione endoteliale. Per disfunzione endoteliale si intende un quadro molecolare e biochimico complesso che comprende infiammazione, proliferazione, anormalità strutturali e funzionali dei vasi. Le cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolanti di derivazione midollare, svolgono un importante ruolo di protezione da queste alterazioni (Hill JM et al, 2003) in quanto sono in grado di riparare l’endotelio danneggiato attraverso un continuo processo di re-endotelializzazione e/o neovascolarizzazione (Heiss C et al, 2005). Nell’ipertensione il numero di EPC circolanti è ridotto e la loro funzione è alterata; tale situazione rappresenta un ulteriore fattore di rischio nello sviluppo di eventi cardiovascolari. E’ stato dimostrato, infatti, che l’Ang II, che causa un aumento dello stress ossidativo, svolge un ruolo centrale nell’insorgenza dell’invecchiamento e nella inibizione della capacità proliferativa delle EPC circolanti (Imanishi T et al, 2005). Il calcitonin gene-related peptide (CGRP), invece, è un potente vasodilatatore, che previene l’invecchiamento delle EPC circolanti, indotto anche da Ang II (Zhou Z et al, 2010). L’importante ruolo che gioca lo stress ossidativo nei processi di remodelling cardiovascolare ed aterogenesi che si osservano nell’ipertensione arteriosa, ha indotto i ricercatori a porre sempre maggior attenzione e ad investigare i potenziali effetti pleiotropici dei farmaci antiipertensivi sullo stress ossidativo. I farmaci maggiormente studiati sono gli ACE inibitori (ACEIs) e i bloccanti il recettore AT1R dell'Angiotensina (ARBs), le due più importanti classi di farmaci che agiscono limitando l'attività del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS). L’Olmesartan Medoxomil, bloccante il recettore AT1R dell’Ang II, ampiamente usato nel trattamento dell’ipertensione, blocca tutte le attività dell’Ang II mediate dal recettore AT1R, indipendentemente dall’origine e dalla via di sintesi dell’Ang II; l’ormone, perciò, si rende disponibile per il legame con il suo recettore AT2R, la cui stimolazione determina vasodilatazione, effetti antifibrotici e antinfiammatori e determina una riduzione, a lungo termine, dose-dipendente, della pressione arteriosa. Inoltre, è stato dimostrato che l’Olmesartan possiede attività antiossidante in quanto riduce i livelli plasmatici del marker di stress ossidativo 8-isoprostano (Fliser D et al, 2005), e attiva il sistema del monossido d’azoto (NO) attraverso un aumento della fosforilazione della eNOS (Oyama N et al, 2010; Kanematsu Y et al, 2006). Con il nostro studio abbiamo valutato un possibile effetto antiossidante e vasoprotettivo dell’Olmesartan Medoxomil in pazienti ipertesi essenziali, utilizzando un approccio biologico molecolare. Lo studio è stato effettuato in tempi differenti utilizzando due coorti di pazienti con caratteristiche cliniche simili trattati per 6 mesi con Olmesartan Medoximil. Sulla prima coorte sono stati analizzati markers di stress ossidativo e della pathway del rimodellamento cardiovascolare, oltre che i livelli di LDL ossidate; sulla seconda coorte di pazienti sono stati valutati oltre che l’espressione proteica di HO-1, i livelli palsmatici di CGRP e il numero e la sopravvivenza delle EPC circolanti. In particolare, nella prima fase sono state valutate p22phox subunità della NADPH ossidasi essenziale per la produzione di anione superossido, ed Heme Oxigenase-1 (HO-1), isoforma inducibile di HO, in grado di proteggere dallo stress ossidativo. Abbiamo, inoltre, valutato lo stato di fosforilazione delle ERK, proteine effettrici dello stress ossidativo nel rimodellamento cardiovascolare, e lo stato di marker plasmatici di stress ossidativo come le lipoproteine ossidate a bassa densità (LDL ossidate), cruciali nello sviluppo della reazione infiammatoria cronica a livello della tonaca intima delle arterie. Nella seconda fase dello studio abbiamo preso in considerazione gli effetti vasoprotettivi dell’Olmesartan valutando parametri quali: HO-1, proteina che oltre ad avere una potente attività anti-ossidante ed anti-infiammatoria, è contraddistinta da un potente effetto favorente la re-endotelializzazione, giustificato dalla sua capacità di aumentare il numero e di ridurre l’invecchiamento di cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolanti ed il CGRP, peptide stimolato dall’HO-1 che protegge l’endotelio e previene l’invecchiamento delle EPC circolanti mediato da Ang II. Inoltre, sono stati valutati il numero e la sopravvivenza delle EPC circolanti. I risultati della prima fase hanno dimostrato come il farmaco Olmesartan, oltre a normalizzare la pressione arteriosa in pazienti ipertesi essenziali già a 3 mesi di terapia, ha ridotto significativamente i livelli di espressione proteica di p22phox già a 3 mesi di terapia rispetto al basale (rispettivamente 0.71±0.26 vs 0.93±0.24 unità densitometriche (u.d.), p<0.001), riduzione che è risultata significativa anche a 6 mesi rispetto sia al basale (0.45±0.12 vs 0.93±0.24 u.d., p<0.001) che a 3 mesi (0.45±0.12 vs 0.71±0.26 u.d., p<0.02). Il trattamento con Olmesartan ha ridotto significativamente anche i livelli di fosforilazione delle ERK 1/2 sia dopo 3 mesi rispetto al baseline (rispettivamente 0.39±0.14 vs 0.56±0.11 u.d., p=0.001) che a 6 mesi di terapia, rispetto al basale (0.19±0.08 vs 0.56±0.11, u.d., p=0.001) e rispetto a 3 mesi (0.19±0.08 vs 0.39±0.14 u.d., p=0.001). I livelli di LDL ossidate sono risultati significativamente ridotti dopo 6 mesi di terapia, sia rispetto al basale (171.92±61.83 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=0.001), che rispetto a 3 mesi (171.92±61.83 vs 270.06±100.34 ng/ml, p=0.002) mentre a 3 mesi rispetto al basale la riduzione non era significativa (270.06±100.34 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=ns). Il trattamento con Olmesartan ha, invece, determinato un significativo aumento dei livelli di espressione proteica di HO-1 rispetto al basale sia a 3 mesi di terapia (1.10±0.19 vs 0.77±0.071 u.d., p=0.001) che a 6 mesi (1.11±0.19 vs 0.77±0.071 u.d., p=0.001), mentre la variazione non è risultata significativa tra 3 e 6 mesi di trattamento (1.10±0.19 vs 1.11±0.19 u.d., p=ns). Nella seconda parte dello studio, confermando quanto riscontrato precedentemente, il trattamento con Olmesartan ha incrementato significativamente i livelli di espressione proteica di HO-1 rispetto al basale sia a 3 mesi (0.95±0.21 vs 0.81±0.21 u.d., p=0.031) che a 6 mesi (1.1±0.26 vs 0.81±0.21 u.d., p=0.001) con un aumento significativo anche nel confronto tra 3 e 6 mesi (0.95±0.21 vs 1.1±0.26 u.d., p=0.01). L’Olmesartan ha, inoltre, indotto un significativo aumento dei livelli plasmatici di CGRP dopo 6 mesi di terapia sia rispetto al basale (263.91±43.08 vs 198.81±51.98 pg/ml, p=0.001), che rispetto a 3 mesi (263.91±43.08 vs 218.97±41.13 pg/ml, p=0.03). Un aumento nel numero di EPC circolanti, espresse come CD34+KDR+, CD133+KDR+ e CD34+CD133+KDR+, è risultato significativo a 6 mesi di trattamento con Olmesartan sia rispetto al basale (rispettivamente 112.89±53.44 vs 35.11±25.98, p=0.005 per CD34+KDR+; 107.60±37.09 vs 20.90±14.58, p=0.0001 per CD133+KDR+; 38.11±19.64 vs 3.67±3.61, p=0.0007 per CD34+ CD133+KDR+) che a 3 mesi (112.89±53.44 vs 59.11±35.30, p=0.002 per CD34+KDR+; 107.60±37.09 vs 49.50±45.20, p=0.003 per CD133+KDR+; 38.11±19.64 vs 15.78±18.59, p=0.0028 per CD34+ CD133+KDR+). L’apoptosi delle cellule EPC, valutata mediante analisi citofluorimetrica del legame tra annessina V e fosfatidilserina espressa sulle cellule CD133+KDR+, è risultata significativamente ridotta già a 3 mesi di trattamento con Olmesartan (27.24± 9.64% vs 44.28 ± 12.38%, p<0.01) e si è ulteriormente ridotta in modo significativo a 6 mesi sia rispetto al basale (16.83±15.68% vs 44.28 ±12.38%, p<0.001) che rispetto a 3 mesi (16.83±15.68 vs 27.24±9.64% %, p< 0.004) (Calò LA et al, 2014). In conclusione, questo studio dimostra un effetto inibitorio dell’Olmesartan sullo stress ossidativo e sulle proteine correlate coinvolte nel signalling intracellulare dello stress ossidativo in pazienti con ipertensione essenziale. Inoltre, dimostra che l’Olmesartan possiede un effetto vasoprotettivo mediato dalla riduzione dello stress ossidativo indotto dall’Ang II e dall’aumento degli effetti benefici del CGRP sulla disfunzione endoteliale, dovuti anche all’aumento del numero delle EPC circolanti e della loro sopravvivenza/funzionalità. I nostri dati, inoltre, forniscono un razionale meccanicistico dell’azione anti-ossidante, anti-infiammatoria e vasoprotettiva, forniscono il razionale meccanicistico agli effetti anti-aterosclerotici, antiinfiammatori e di anti-remodeling di Olmesartan riportati da trials clinici come MORE (Stumpe KO et al 2007), OLIVUS (Hirohata A et al, 2010), EUTOPIA (Fliser D et al, 2004) e VIOS (Smith RD et al, 2006)

Oxidative DNA damages determine the activation of cell repair processes. These processes originate repair products, including the most studied one, 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OH-dG). Several analytical techniques have been applied to measure urinary 8-OH-dG, but a discrepancy in basal urinary 8-OH-dG levels has been noted when comparing chromatographic techniques with immunoenzymatic assays (ELISA). Our laboratory has developed a fully validated, liquid chromatography-tandem mass spectrometry method presenting high sensitivity and specificity, which has participated in an inter-laboratory validation of assays for the measurement of urinary 8-OH-dG (ESCULA project). Mass Spectrometric techniques showed more accuracy and specificity than immunoenzymatic methods. Human spot urine samples were analyzed in order to investigate the possibility to correct urinary lesion measurements for creatinine and to evaluate the intra- and inter-day variability of 8-OH-dG excretion in urine. Our results confirm the opportunity to delve into these issues. Finally, we measured urinary 8-OH-dG in workers exposed to antineoplastic drugs and in a group of unexposed subjects to evaluate the relationship between occupational exposure and oxidative damage related to the internal dose. We found higher levels of 8-OH-dG in exposed nurses, but, as compared to the non-exposed subjects, the difference was not statistically significant, probably do to the very low level of exposure. The scientific literature is rapidly developing on the topic of DNA damage and related repair capacity. Nevertheless, further studies are needed to achieve a better understanding of the sources of DNA lesions in urine and their significance, both in clinical and occupational medicine.

Oxidative DNA damages determine the activation of cell repair processes. These processes originate repair products, including the most studied one, 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OH-dG). Several analytical techniques have been applied to measure urinary 8-OH-dG, but a discrepancy in basal urinary 8-OH-dG levels has been noted when comparing chromatographic techniques with immunoenzymatic assays (ELISA). Our laboratory has developed a fully validated, liquid chromatography-tandem mass spectrometry method presenting high sensitivity and specificity, which has participated in an inter-laboratory validation of assays for the measurement of urinary 8-OH-dG (ESCULA project). Mass Spectrometric techniques showed more accuracy and specificity than immunoenzymatic methods. Human spot urine samples were analyzed in order to investigate the possibility to correct urinary lesion measurements for creatinine and to evaluate the intra- and inter-day variability of 8-OH-dG excretion in urine. Our results confirm the opportunity to delve into these issues. Finally, we measured urinary 8-OH-dG in workers exposed to antineoplastic drugs and in a group of unexposed subjects to evaluate the relationship between occupational exposure and oxidative damage related to the internal dose. We found higher levels of 8-OH-dG in exposed nurses, but, as compared to the non-exposed subjects, the difference was not statistically significant, probably do to the very low level of exposure. The scientific literature is rapidly developing on the topic of DNA damage and related repair capacity. Nevertheless, further studies are needed to achieve a better understanding of the sources of DNA lesions in urine and their significance, both in clinical and occupational medicine.

Le cellule staminali mesenchimali sono cellule pleiotropiche che si differenziano in adipociti o osteoblasti attraverso un signaling pathway che prevede il coinvolgimento dell'espressione di HO-1 ed HO-2. Abbiamo esaminato gli effetti di un induttore dell'espressione di HO-1 e di un inibitore dell'attivita' enzimatica di HO-1 sul differenziamento osteoblastico delle MSC in presenza ed in assenza di un'alta concentrazione di glucosio. Le MSC sono state coltivate in un medium osteogenico aumentando l'espressione dell'osteonectina, RUNX-2, osteocalcina e la fosfatasi alcalina. L'espressione di HO-1 durante il differenziamento e' stata inizialmente downregolata per poi tornare a valori simili alle cellule indifferenziate dopo 15 giorni di differenziamento. Inoltre, l'effetto di HO-1 sugli osteoblasti appare differente da quello visto nel differenziamento in adipociti. L'induzione di HO-1 attraverso una cobalto protoporfirina (CoPP) decrementa l'adipogenesi. In piu' come evidenziato dalla diminuzione dei livelli di BMP-2, osteocalcina , osteoprotegerina l'aggiunta di glucosio al medium osteogenico inibisce il differenziamento in osteoblasti. Tuttavia il differenziamento di MSC in adipociti e' incrementato dal glucosio. L'induzione di HO-1 attraverso il CoPP e' stato in grado di aumentare l'espressione dei markers osteoblastici gia citati. Lo studio suggerisce che l'induzione dell'eme ossigenasi e' in grado di attenuare l'effetto dell'iperglicemia durante il differenziamento in osteoblasti.
Human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are pleiotrophic cells that differentiate to either adipocytes or osteoblasts as a result of crosstalk by specific signaling pathways including heme oxygenase (HO)-1/-2 expression. We examined the effect of inducers of HO-1 expression and inhibitors of HO activity on MSC differentiation to the osteoblast and following high glucose exposure. MSC cultured in osteogenic medium increased expression of osteonectin, Runt-related transcription factor 2 (RUNX-2), osteocalcin, and alkaline phosphatase. HO-1 expression during differentiation was initially decreased and then followed by a rebound increase after 15 days of culture. Additionally, the effect of HO-1 on osteoblasts appears different to that seen in adipocyte stem cells. On addition of a cobalt compound, the resultant induction of HO-1 decreases adipogenesis. Moreover, glucose (30 mM) inhibited osteoblast differentiation, as evidenced by decreased bone morphogenetic protein (BMP)-2, osteonectin, osteocalcin, and osteoprotegerin (OPG). In contrast, MSC-derived adipocytes were increased by glucose. Increased HO-1 expression increased the levels of osteonectin, OPG, and BMP-2. Inhibition of HO activity prevented the increase in osteonectin and potentiated the decrease of osteocalcin and OPG in cells exposed to high glucose levels. Furthermore, targeting HO-1 expression increased pAMPK and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and restored osteoblastic markers. Our findings suggest that targeting HO-1 gene expression attenuates the hyperglycemia-mediated decrease in MSC-derived osteoblast differentiation. Finally, the mechanism underlying the HO-1-specific cell effect on osteoblasts and adipocytes is yet to be explored. Thus, the targeting of HO-1 gene expression presents a portal to increase osteoblast function and differentiation and attenuate osteoporosis by promoting bone formation

Il lavoro di tesi si colloca all’interno di un progetto più vasto, JPI Ocean PLASTOX Project, volto ad indagare l'ingestione, il trasferimento lungo la catena trofica e l'impatto ecotossicologico delle plastiche sulle principali specie ed ecosistemi marini europei. Lo scopo della presente ricerca è stato quello di valutare la potenziale tossicità delle microplastiche (3 µm) e delle nanoplastiche (50 nm) in Mytilus galloprovincialis, sottoposto ad un dosaggio basso pari a 1,54 ng/L, intermedio pari a 15,4 ng/L, e alto pari a 154 ng/L di polistirene, al fine di ottenere informazioni circa la eventuale dose-risposta, e di correlare eventuali effetti con le dimensioni delle plastiche. L’esperimento è stato condotto in ambiente controllato e protratto per 21 giorni. E’ stata valutata la risposta immunitaria attraverso la misura dell’attività del lisozima e della fagocitosi negli emociti. E’ stata inoltre analizzata una batteria di 6 biomarker, scelti come indicatori di stress ossidativo,i n due tessuti: branchie e ghiandola digestiva. I dati ottenuti mostrano una riduzione dell’attività del lisozima, sia dopo esposizione a micro- che a nanoplastiche ed una riduzione della attività fagocitaria dopo esposizione alle sole microplastiche. L'effetto sull’attività dell’acetilcolinesterasi non appare di rilievo mentre l’attività della catalasi nelle branchie mostra una risposta a campana, con aumento alle basse concentrazioni di contaminanti e diminuzione alle concentrazioni più alte; non c’è effetto sull’enzima nelle ghiandole digestive. L'effetto sull'attività dell'enzima glutatione S-transferasi nelle branchie e nelle ghiandole digestive non è risultata significativa. Si osserva un aumento dell’accumulo della malondialdeide nei tessuti significativo alle dosi maggiori di micro e nanoplastiche. Nell’insieme 21 giorni di trattamento a micro e nanoplastiche inducono moderati effetti ossidanti e riducono la risposta immunitaria anche a concentrazioni ambientali.

La Sarcopenia è una condizione non patologica legata all’invecchiamento, relativa alla perdita sia di massa muscolare che della forza e in quanto tale, determina il rallentamento nello svolgimento delle più semplici attività quotidiane incrementando il rischio di cadute, di fratture ed un conseguente abbassamento della qualità della vita. Il significativo costo socio-economico dei disordini muscolo scheletrici generati dalla sarcopenia nella popolazione anziana richiede interventi preventivi e terapeutici. Al momento non è stato approvato l’utilizzo di nessun farmaco per il trattamento dei disturbi legati alla sarcopenia. I fattori che contribuiscono all’insorgenza della sarcopenia sono di tipo nutrizionale, ormonale, metabolico e legato ad alterazioni immunologiche, che nell’insieme determinano delle modificazioni a carico del sistema neuromuscolare le quali causano a loro volta il malfunzionamento dei motoneuroni e atrofia a livello delle miofibre. Ci sono numerose evidenze che supportano il declino delle funzioni mitocondriali e il conseguente incremento nelle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) che contribuiscono all’invecchiamento del muscolo e quindi all’insorgenza della sarcopenia. Nei soggetti anziani inoltre, si verifica uno sbilanciamento dell’equilibrio cellulare a favore della produzione di ROS che potrebbe compromettere la risposta adattativa dell’esercizio fisico. Il signaling radicalico, alla base della risposta antiossidante all’interno della cellula, rappresenta il fattore chiave nel mantenimento sia della forza muscolare che delle performance fisiche. In questo senso, il presente studio ha focalizzato l’attenzione sull’impatto della supplementazione con antiossidanti (ubichinolo) in combinazione con l’esercizio fisico regolare per contrastare la sarcopenia. L’ubichinolo è un cofattore lipofilico endogeno con entrambe le funzioni, antiossidante e bioenergetica e i cui livelli di sintesi tendono a diminuire con l’avanzare dell’età. Gli aspetti poc’anzi citati sono stati valutati su modelli murini di invecchiamento sottoposti ad attività fisica regolare e a supplementazione con ubichinolo usando un disegno fattoriale. Inoltre, colture cellulari di miociti, giovani e anziani, sono state esposte in vitro a concentrazioni crescenti di statina, un farmaco comunemente impiegato nella prevenzione degli effetti ipercolesterolemici ma in grado di ridurre la sintesi endogena di Coenzima Q. I dati mostrano un effetto sinergico dell’ubichinolo e l’attività fisica regolare nella promozione della biogenesi mitocondriale e nel contemporaneo abbassamento dello stress ossidativo a livello del muscolo scheletrico. Questi effetti sono evidenti nella popolazione anziana e meno negli organismi senescenti che risultano essere molto più compromessi a livello cellulare. I risultati suggeriscono un’interessante prospettiva legata all’utilizzo dell’ubichinolo nel trattamento preventivo dell’insorgenza della sarcopenia in associazione all’esercizio fisico, in condizioni subliminali di deficit di sintesi di Coenzima Q, durante l’invecchiamento e il trattamento farmacologico con statine.
Sarcopenia is a condition of age-related loss of muscle mass and strength which affects balance, gait and overall ability to perform tasks of daily living, with increased risk of falls and fractures and low quality of life. The significant socio-economic costs of musculoskeletal disorders in the expanding elderly human population urges for prevention and therapeutic interventions. There are currently no approved drug treatments for sarcopenia. Factors contributing to sarcopenia have been related to nutritional, hormonal, metabolic, and immunologic alterations that affect the neuromuscular system and lead to loss of motor neurons and myofiber atrophy. There is some evidence to support that the decline in mitochondrial function and the consequent increase in Reactive Oxygen Species (ROS) production contribute to muscle ageing and sarcopenia. Furthermore, age-related ROS imbalance may underpin the blunted adaptive response to physical exercise highlighted in elderly people. Thus, the interplay between ROS and protective antioxidant response in the cell is regarded as a key factor in maintaining muscle strength and physical performance. In this view, the present project focuses on the impact of antioxidant (e.g. ubiquinol) supplementation in combination with exercise training to counteract sarcopenia. Ubiquinol is a lypophilic endogenous cofactor with both antioxidant and bioenergetics function whose levels are known to decrease with age. In the project these issues have been studied in murine models of ageing subjected to physical exercise and supplemented with ubiquinol using a factorial design. Moreover cultured myocytes have been exposed in vitro to statin, common HMG-CoA inhibitor drugs with hypocholesterolemic effect, that are able to affect CoQ synthesis. Presented Data shows a synergistic effect of Ubiquinol and physical exercise in promoting mitochondrial biogenesis and lowering oxidative stress at muscular level. These effects are prominent in the ageing population but result less effective in senescent organisms that are more compromised. The data suggest an interesting prospective for ubiquinol treatment in association with physical exercise in prevention of sarcopenia in condition of subliminal deficit of CoQ synthesis including ageing and statin treatment.

Un'alimentazione sana è quella che fornisce tramite gli alimenti assunti quotidianamente la quantità di nutrienti che corrisponde al proprio fabbisogno. Ma l’alimentazione corretta permette anche alle persone sane di prevenire le malattie e migliorare il loro stato di salute. Nell’ambito della vasta gamma di prodotti alimentari di largo consumo, frutta e verdura ricoprono un ruolo di fondamentale importanza, grazie al loro notevole contenuto di composti benefici per la salute. La nostra attenzione si è focalizzata sul frutto della Fragola, tra i più ricchi in composti antiossidanti, composti specifici che costituiscono la barriera protettiva contro alte concentrazioni di radicali liberi responsabili dello stress ossidativo. Scopo di questo progetto di tesi è stato quello di valutare innanzitutto le caratteristiche nutrizionali di differenti varietà di fragola in studio (in vitro), e gli effetti di un consumo acuto o cronico di questi frutti sulla salute umana (in vivo). Abbiamo quindi analizzato con tecniche più generali la capacità antiossidante totale e il contenuto totale in polifenoli, con ulteriore indagine quantitativa sui flavonoidi e le antocianine, abbiamo confrontato i valori ottenuti che sono risultati significativi da genotipo a genotipo, e abbiamo confermato i risultati ottenuti in studi precedenti dove Sveva si era affermata essere tra le più interessanti varietà in studio, dimostrando anche nel nostro caso una elevata capacità antiossidante totale e un alto contenuto di micronutrienti, a scapito di un minor contenuto di antocianine. La cultivar OGM CALYPSO non si è messa in evidenza rispetto alle altre varietà, ma ha mostrato un aumento significativo delle antocianine rispetto alla cultivar parentale, caratteristica frutto proprio del miglioramento genetico subito riguardo appunto la quantità di antocianine. Rimanendo nell’ambito delle fragole, dopo aver portato a secco l’estratto metanolico dei frutti, abbiamo testato l’effetto gastroprotettivo di quest’ultimi su ulcere gastriche indotte da etanolo assoluto, nei ratti e la % di inibizione delle ulcere è risultata essere più elevata per quanto riguarda la cultivar Adria seguita tra le cultivar da Calypso OGM. Contemporaneamente siamo andati ad effettuare l’esame biochimico del contenuto gastrico dei topi in studio. Accanto a ciò abbiamo voluto testare gli effetti di un consumo di fragole acuto o prolungato sulla salute umana, effettuando innanzitutto una valutazione della barriera antiossidante del plasma dei soggetti partecipanti allo studio con tecniche quali il TEAC il FRAP ma aggiungendo anche test rilevanti quali il BAP test e l’SHp test, per poi andare a valutare il livello di stress ossidativo nei vari momenti dell’assunzione attraverso la valutazione dei residui carbonilici nel plasma e abbinando il test degli idroperossidi, il dROMs test. A ciò abbiamo affiancato uno studio sulla valutazione dei biomarker di stress ossidativo rilevabili nelle urine, quali l’8OhdG e i livelli di F2-isoprostani. Il disegno dello studio è proseguito con un’analisi sulla variazione della % di emolisi spontanea ed indotta da un agente ossidante sui globuli rossi, che ci ha mostrato interessanti risultati di diminuzione della % d’emolisi sia per i controlli sia per i globuli rossi a contatto con l’agente ossidante, rimarcando quindi un effetto benefico di un’alimentazione arricchita da frutta, nel nostro caso fragole, sullo stress ossidativo spontaneo o indotto. Al termine abbiamo condotto uno studio pilota sull’attivazione piastrinica, come possibile conseguenza di un consumo, di così grande entità, di fragole, ma i risultati hanno determinato una non significatività per quanto riguarda il numero di piastrine nei vari gradi di attivazione, ma con un comportamento diverso di due soggetti rispetto alla media. I risultati preliminari ottenuti in questo lavoro hanno fornito un buon punto di partenza per continuare l’indagine sui meccanismi legati allo stress ossidativo. Sarebbe interessante in futuro valutare l’effetto diretto di questi prodotti di ossidazione su organi maggiormente esposti allo stress ossidativo e pianificare magari studi su categorie di persone con malattie cronico-degenerative ad esso correlate.
A diet is healthy when the food assumed on a daily basis provides the amount of nutrients actually needed. An appropriate diet also helps healthy people to prevent diseases and improve their health. If we consider the wide range of the most consumed foodstuff, fruit and vegetables play a very important role, given their significant content of health improving compounds. We focused on Strawberry, one of the richest fruits in antioxidant compounds, specific compounds representing the protective defence against high free radical concentrations responsible for oxidative stress. The aim of this project was to firstly evaluate the nutritional properties of different strawberry varieties in study (in vitro), and the effects of acute or chronic consumptions of this fruit on human health (in vivo). Then we used more generic technics in order to analyse total antioxidant capacity and total polyphenol content, through further quantitative studies on flavonoids and anthocyanins; we compared the obtained values that resulted significant from genotype to genotype, and we confirmed the results achieved in previous studies, where Sveva had prevailed as the most interesting in study variety: in our case too, Sveva showed an high total antioxidant capacity and an high micronutrient content, in detriment of a minor anthocyanin content. The OGM CALYPSO cultivar didn’t stand out among the other varieties, but showed a significative increase of anthocyanins in detriment of the parental cultivar, this feature actually being subsequent to the genetic improvement produced by the quantity of anthocyanins. Still in the strawberry subject area, we dried the fruits methanolic extracts, then we tested their gastroprotective effect on gastric ulcers caused to rats by absolute ethanol: ulcers inhibition % resulted higher for the Adria Cultivar, followed by Calypso OGM among cultivars. At the same time, we carried out the biochemical test on the gastric content of in study rats. Besides that, we wanted to test the effects of an acute or prolonged strawberry consumption on human health, firstly carrying out an evaluation of plasma antioxidant defence in the subjects participating to the study, using technics such as TEAC and FRAP, but also adding other important tests such as BAP and SHp, and then evaluating the oxidative stress level in different assumption moments, through the evaluation of carbonyl residues in plasma and the use of a further test, the hydroperoxides test (dROMs). At this point we also made use of a study on the evaluation of oxidative stress biomarkers detectable in urines, such as the 8OhdG and the levels of F2-isoprostanes. We continued the study design analysing the % variation of haemolysis, either spontaneous or induced by an antioxidant agent on red blood cells, which showed interesting results regarding the reduction of haemolysis %, either for controls or for red blood cells in contact with the antioxidant agent: therefore we were able to highlight the favourable effects of a fruit enriched diet (strawberries in our case) on spontaneous or induced oxidative stress. In the end, we carried out a pilot study on thrombocytic activation, as a possible consequence of a strawberry consumption of such an extent, but results eventually turned out to be non-significant as for thrombocytic number in the different activation levels, even though two subjects showed different behaviours compared to average. The results preliminarly obtained with this work offered a good starting point in order to keep on researching on the mechanisms associated with oxidative stress. In the future, it would be interesting to evaluate the direct effect of these oxidation products on the organs most exposed to oxidative stress, and to possibly plan studies on people categories affected by chronic-degenerative diseases associated to it.

2015 - 2016
Neuroinflammation and oxidative stress have been recognized as common aspects in neurodegenerative diseases. Although the inflammatory process may induce beneficial effects, such as the elimination of the pathogen, uncontrolled inflammation can lead to adverse outcomes through the production of neurotoxic factors that exacerbate neurodegenerative disease. Living cells continually generate reactive oxygen species (ROS) during energetic metabolism. ROS play an important physiological role, however, imbalanced defence mechanism of antioxidants, overproduction or incorporation of free radicals from environment to living system could be extremely deleterious, especially for the central nervous system (CNS). CNS is particularly vulnerable to oxidative stress and ROS production has been associated with different neurodegenerative diseases. Microglia and astrocytes, as the immune cells in the brain, are primary involved in different forms of neurodegeneration. These cells in response to a variety of stimuli and pathological events become activated and promote the release of inflammatory mediators and ROS. Neurodegenerative complications often occur in chronic kidney disease (CKD), a condition characterized by a progressive loss of renal metabolic activities and glomerular filtration, resulting in retention of solutes, normally excreted by healthy kidneys. These compounds, called uremic toxins, accumulate in patients with CKD and may have deleterious effects in various physiological functions in these patients, such as neurological complications associated to uremic syndrome. Indoxyl sulphate (IS) is a protein-bound uremic toxin, poorly eliminated by dialytic process, recognized as an uremic nephrovascular-toxin. IS has been reported to have effects on different type of cells such as renal tubular cells, vascular smooth muscle cells, vascular endothelial cells and osteoblasts, but no data regards CNS cells. Because of the mechanism/s involved in uremic-toxins induced neurological complications are not understood, in this project it has been examined the effects of IS on neuroinflammation and oxidative stress in CNS cells. IS (15-60μM) treatment in C6 astrocyte cells increased inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, tumor necrosis factor (TNF-α). Moreover IS increased Aryl hydrocarbon Receptor (AhR), Nuclear Factor-kB (NF-kB) and inflammasome activation in these cells. In the same experimental condition, IS enhanced ROS release and decreased nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) activation, and heme oxigenase-1 (HO-1) and NAD(P)H dehydrogenase quinone 1 (NQO1) expression. Similiar observations are made in primary mouse astrocytes and mixed glial cells. It has been also observed that IS can also affected cell viability and cycle distribution, increasing the G0/G1 and S phases and decreasing G2 phase in C6 cells and in astrocytes and in mixed glial cells. Moreover neurons incubation with IS (15-60μM) induced cell death in a dose dependent fashion. In vivo data indicate that IS (800 mg/kg, i.p) induced histological changes and an increase in COX-2 expression and in nitrotyrosine formation in mice brain. Furthermore preliminary experiments on the effect of the human serum on ROS release in C6 cells, indicate that IS significantly contributes to oxidative stress in astrocytes. This study will be a step towards elucidating if this toxin could be not only a biomarker of disease progression in CKD patients, but also a potential pharmacological therapeutic target. [edited by author]
XV n.s.(XXIX ciclo)

Increased oxidative stress is a common feature of cancer cells. Uncontrolled proliferation, in fact, requires a profound metabolic remodelling, accompanied by altered redox status. Moreover, reactive oxygen species (ROS) are involved in cell signalling, tumor growth and metastasis. Recent studies suggest that increased oxidative stress in cancer cells could be exploited for therapeutic purposes. Understanding biochemical mechanisms involved in ROS generation and maintenance of the cellular antioxidant potential raises the possibility of therapeutic targeting these pathways. In our study, we investigated the role of LKB1/AMPK pathway in response to oxidative stress. LKB1 is a serine threonine kinase whose germ-line mutations are associated with the Peutz-Jeghers syndrome and somatically mutated in certain tumor types, including non-small cell lung cancer (NSCLC) and cervical carcinoma. Through the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), LKB1 modulates both anabolic and catabolic metabolic processes. We observed that LKB1 reconstitution in LKB1-deficient cancer cells significantly reduced expression of NADPH oxidase 1 (NOX1), a ROS-producing enzyme. LKB1+ cells showed reduced endogenous oxidative stress and increased resistance to exogenous oxidative stress, induced by hydrogen peroxide, cisplatin or irradiation, compared to LKB1- cells. Moreover, we observed that AMPK inhibition sensitized LKB1+ cells to oxidative stress, whereas NOX1 inhibition reduced ROS generation and increased resistance to exogenous oxidative stress. In lung cancer samples, LKB1 mutations were strongly associated with loss of LKB1 protein but the LKB1 status was not associated with response to bevacizumab and platinum-based chemotherapy in advanced NSCLC patients. Overall, these results indicate that LKB1, via the activation of AMPK and the down-regulation of NOX1, confers resistance to oxidative stress and impairs response of cancer cells to some chemotherapeutics and irradiation in vitro.
Una caratteristica comunemente riscontrata nel cancro è un aumento dello stress ossidativo, rispetto al corrispondente tessuto sano. Infatti, la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali richiede un importante rimodellamento metabolico, che si accompagna ad alterazioni dell’equilibrio redox. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) risultano, inoltre, coinvolte nelle vie di segnalazione cellulare, nella crescita tumorale e nella metastatizzazione del cancro. Recenti studi suggeriscono che l’aumento dello stress ossidativo possa essere sfruttato a scopi terapeutici, per eliminare selettivamente le cellule tumorali. La comprensione dei meccanismi molecolari che governano la produzione di ROS o il mantenimento del potenziale antiossidante delle cellule potrebbe, infatti, rendere possibile un’azione diretta su questi stessi meccanismi a scopo terapeutico. In questo lavoro di tesi abbiamo valutato il ruolo della via di segnalazione LKB1/AMPK nella risposta allo stress ossidativo. LKB1 è una serina/treonina chinasi, le cui mutazioni sono state associate alla sindrome ereditaria di Peutz-Jeghers; risulta, inoltre, mutata sporadicamente in alcuni tipi di cancro, tra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e il carcinoma della cervice uterina. Attraverso l’attivazione della chinasi AMPK, LKB1 modula sia processi anabolici, sia processi catabolici. I nostri dati hanno dimostrato come la re-introduzione di LKB1 in cellule tumorali LKB1-mutate riduce significativamente l’espressione della NADPH ossidasi 1 (NOX1), un enzima coinvolto nella produzione di ROS. Le cellule LKB1+ manifestano, inoltre, uno stress ossidativo endogeno ridotto, rispetto alle cellule LKB1-, che si accompagna ad un’aumentata resistenza allo stress ossidativo esogeno, indotto dal perossido di idrogeno, dal cisplatino o dall’irradiazione. Abbiamo osservato che l’inibizione di AMPK porta ad una sensibilizzazione delle cellule LKB1+ allo stress ossidativo, suggerendo che la loro ridotta sensibilità sia mediata da AMPK; inoltre, l’inibizione di NOX1 nelle cellule LKB1- si accompagna ad una ridotta produzione di ROS e ad una maggiore resistenza allo stress ossidativo. Infine, in campioni di carcinoma polmonare, le mutazioni di LKB1 sono risultate fortemente associate alla perdita della proteina LKB1; tuttavia, lo status di LKB1 non è risultato associato alla risposta al bevacizumab o alla chemioterapia con derivati del platino in pazienti affetti da NSCLC avanzato. Nel loro insieme, questi risultati indicano che LKB1, attraverso l’attivazione di AMPK e la ridotta espressione di NOX1, conferisce resistenza allo stress ossidativo nelle cellule tumorali, compromettendo la risposta ad agenti chemioterapici o all’irradiazione in vitro, i quali modulano l'equilibrio ossidativo della cellula.

Gli esperimenti condotti in questo progetto di ricerca sono volti allo studio degli effetti di integratori a base di clorofillina magnesiaca sullo stato di stress ossidativo sui tessuti murini. Per le analisi sono state prese in esame due corti di topi femmine da 48 e 44 esemplari ciascuna. Le due corti sono state sottoposte a un diverso tipo di trattamento, rispettivamente: trattamento cronico con diverse quantità di soluzione idroalcolica di clorofillina magnesiaca e trattamento acuto con unica dose standard di soluzione idroalcolica di clorofillina magnesiaca. In questo modo è stato possibile studiare l'efficacia degli integratori in base al tipo di trattamento. Le analisi sono state fatte con saggio TBARS sui topi della prima corte e con saggio FRAP sui topi di entrambe le corti. Il saggio TBARS mostra lo stato di tress ossidativo dei tessuti mediante quantificazione della malondialdeide. Il saggio FRAP descrive la capacità riducente della clorofilliana estratta dai campioni di tessuto. In un progetto parallelo a quello descritto in questa tesi è stata quantificata la clorofilla tramite spettrofluorimetria per costruire un parallelo fra quantità e potere riducente rilevato. Grazie all'analisi dei risultati è possibile dire che la clorofillina magnesiaca non è proossidante e presenta potere riducente. Tuttavia un trattamento acuto non è sufficiente a farla accumulare nei tessuti.

The aim of this study was to characterize markers of oxidation of proteins in cattle, developing the assay method of AOPP (advanced oxidation protein products). Using standard commercial proteins (Bovine serum Albumin, bovine g-Globuline), oxidations In vitro were performed with chlorinated oxidant (hypochlorous acid) and hydroperoxide (cumene hydroperoxide) determining the relationship between AOPP and carbonyl groups by spectrophotometric and Western blotting analysis. The conformational changes of the standards were observed by one-dimensional electrophoresis kept in non-reducing conditions. In the second part of this project, we have studied the relationship between inflammation indicators and AOPP in both healthy cow and in animals with inflammatory processes, supporting the hypothesis that AOPP are specific indicators of protein oxidation by chlorinated oxidants produced by neutrophilis. The third part of the work has focused on the production of oxidative standard protein (AOPP-BSA) for the development of ELISA systems to detect autoantibodies directed against epitopes of oxidized proteins.
Lo scopo del presente studio è stato quello di caratterizzare indicatori dell’ossidazione delle proteine nella specie bovina, sviluppando la metodica del dosaggio delle AOPP (advanced oxidation protein products). A partire da standard proteici commerciali (Albumina bovina e g-Globuline bovine) sono state eseguite delle ossidazioni in vitro con ossidante clorurato (acido ipocloroso) ed idroperossido (Cumene idroperossido) determinando la relazione tra AOPP e gruppi carbonilici tramite analisi spettrofotometriche e densitometriche tramite Western blotting. Le modificazioni conformazionali degli standard sono state osservate mediante elettroforesi monodimensionali mantenute in condizioni non riducenti. La seconda parte del progetto sono state studiate le relazioni tra indicatori del processo infiammatorio e le AOPP in animali sani e/o con processi infiammatori in atto, avvalorando l’ipotesi che le AOPP siano degli indicatori specifici dell’ossidazione proteica da parte di ossidanti clorurati di origine neutrofilica. La terza parte del lavoro si è focalizzata sulla produzione di standard proteici ossidati (AOPP-BSA) per la messa a punto di sistemi ELISA per l’individuazione di autoanticorpi diretti contro epitopi ossidati delle proteine.

La fragilità è una sindrome geriatrica definita da un progressivo declino età-correlato di diverse facoltà fisiologiche, che si traduce in una ridotta funzionalità d’organo e in un’aumentata vulnerabilità in condizioni di stress. Fried e coll. propongono una definizione operativa delle fragilità. La letteratura riporta un’alta prevalenza di fragilità in individui affetti da insufficienza renale cronica. Tra questi soggetti, il rischio di sviluppare fragilità è aumentato di due/tre volte rispetto ai soggetti sani. Ad oggi, la definizione e la valutazione della fragilità in questi pazienti è ancora controversa. Tuttavia quello che si sa è che l’invecchiamento è un processo strettamente correlato alla ridotta capacità delle cellule staminali di auto-rinnovarsi e differenziarsi. Quest’alterazione delle funzioni delle cellule staminali può svolgere un ruolo chiave nella fisiopatologia delle malattie associate all’invecchiamento, inclusa la disfunzione renale. Il nostro gruppo ha identificato e isolato le cellule staminali renali adulte a partire da colture clonali di nefrosfere umane. All’interno di queste sono presenti cellule a diversa differenziazione e maturazione, tra queste anche le staminali identificate come PKHhigh/CD133+/CD24-, multipotenti e in grado di ripopolare scaffold renali decellularizzati. Date queste premesse l'obiettivo del progetto è valutare gli effetti di condizioni biologiche legate alla fragilità sul comportamento delle cellule staminali renali adulte umane e capire se tali condizioni sono in grado di esaurire il pool di cellule staminali e alterarne la funzione. In primo luogo abbiamo arruolato soggetti fragili, pre-fragili e non-fragili e giovani sani come controllo e raccolto i rispettivi plasmi e cellule mononucleate dal sangue periferico (PBMC). Sia nelle PBMC che nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche circolanti abbiamo valutato il danno al DNA osservando una percentuale di cellule positive al danno statisticamente più alta nei pazienti fragili rispetto agli altri gruppi. Per valutare il reale effetto delle condizioni biologiche legate alla fragilità sulle proprietà delle RSC, le colture di NS, ottenute da nefrectomie, sono state trattate con il plasma dei soggetti arruolati. Abbiamo valutato dapprima le capacità di autorinnovamento delle cellule trattate e osserviamo una significativa diminuzione dell'efficienza di formazione della sfera, indice di autorinnovamento, nei soggetti fragili rispetto ai non fragili e ai giovani. Successivamente, abbiamo valutato il danno al DNA, i ROS intracellulari, la proliferazione e la vitalità nelle cellule staminali/progenitrici renali ottenute dopo la dissociazione delle NS. Non sono state evidenziate differenze nella vitalità e nella proliferazione cellulare tra i gruppi, mentre il danno al DNA e i ROS intracellulari sono aumentati nelle cellule delle NS trattate con plasma di anziani fragili rispetto a quelle trattate con gli altri plasmi. Ciò potrebbe indicare che la diminuzione della capacità di autorinnovamento nelle cellule trattate con il plasma di pazienti fragili e un aumento del danno al DNA e dei ROS intracellulari non sono correlati con la morte o la proliferazione cellulare, ma con un'elevata presenza di mediatori infiammatori e ROS nel plasma dei pazienti fragili. Per confermare questi dati abbiamo analizzato lo stress ossidativo e il profilo di 40 citochine infiammatorie nel plasma dei soggetti arruolati. Si ha un aumento dello stress ossidativo nel plasma dei soggetti fragili rispetto agli altri gruppi, così come un’aumentata presenza o l’esclusività di alcune citochine infiammatorie. Questi dati preliminari suggeriscono che esiste una combinazione di stress ossidativo e citochine pro-infiammatorie nel plasma di pazienti fragili che contribuiscono ad aumentare il danno al DNA e i ROS intracellulari alterando conseguentemente le caratteristiche di staminalità delle cellule delle NS.
Frailty is a geriatric syndrome that can be defined as an age-related progressive impairment of multiple physiological systems, resulting in a significantly reduced capacity to compensate for external stressors. Fried and colleagues proposed a phenotype characterization of frailty through five physical criteria, so this can be possible only after the onset of clinical manifestations without the possibility of a precocious diagnosis. Several studies report a high prevalence of frailty in both old and young individuals with kidney dysfunction, and this further increases with advancing age and progressive decline of renal function. Elderly individuals with chronic kidney disease (CKD) are two to three times more likely to be frail than those with normal renal function. However, the relationship between CKD and frailty is still unclear. The aging process can have adverse effects on stem cells; their self-renewal ability declines and their differentiation potential into the various cell types is altered. Aging-induced exhaustion and deterioration of stem cell pool and functions may play a key role in the pathophysiology of aging-associated diseases, including kidney dysfunction. Our group isolated a pure population of multipotent renal stem-like cells by a functional approach, taking advantage from the ability of renal stem cells (RSC) to grow as nephrospheres (NS). Investigating the expression of renal progenitor markers described in literature, our group identified in NS a homogeneous PKHhigh/CD133+/CD24- cell population displaying in vitro stem-cell properties, able to repopulate human decellularized renal scaffold and exhibiting multipotency. In this scenario, we tested whether in the organism of elderly and frail people there are biological conditions able to alter RSC behavior, justifying the high prevalence of chronic kidney dysfunction in the frail status and its severity. First, we recruited frail, pre-frail and non-frail subjects, and young subjects as controls and we obtained whole blood that was separated into plasma and PBMC. We studied DNA damage in both PBMC and circulating hematopoietic progenitor/stem cells (cHPSC) and we observed a statistically higher percentage of cells positive for DNA damage in frail patients compared to all the other groups. To assess the real effect of biological conditions related to frailty on adult RSC properties, NS cultures, obtained from nephrectomies, were treated with 10% plasma of enrolled frail and non-frail subjects and healthy young. We first evaluated the self-renewal abilities of treated cells and we observe a significant decrease in sphere forming efficiency, indication of self-renewal, in frail subjects compared to both non-frail and young people. Subsequently, we evaluated DNA damage, intracellular ROS, proliferation and viability in renal stem/progenitor cells obtained after NS dissociation after plasma treatment. We find no differences in viability and proliferation between groups, while DNA damage and intracellular ROS increased in NS cells treated with plasma of frail seniors compared to those treated with the other plasmas. This might indicate that the decrease of self-renewal ability in cell treated with plasma of frail patients and an increase of DNA damage and intracellular ROS are not correlated to cell death or proliferation, but with a high presence of inflammatory mediators and ROS in the plasma of frail patients. To confirm these data we analyzed the oxidative stress and the profile of 40 inflammatory cytokines on plasma of enrolled subjects. We observed an increase in oxidative stress and osome inflammatory cytokines in frail plasma compared to other plasmas. These preliminary data suggested that there is a combination of oxidative stress and pro-inflammatory cytokines in plasma of frail patients that contribute to increase DNA damage and intracellular ROS and consequently alter stem characteristics of NS cells.

Diversi mieli uniflorali cubani sono stati analizzati per determinare il loro contenuto totale di fenoli, flavonoidi, acido ascorbico, aminoacidi, proteine e carotenoidi, così come la loro attività radical- scavenging e la loro capacità di formare radicali liberi. Il contenuto totale di fenoli, flavonoidi e carotenoidi varia considerevolmente: i valori più alti sono stati ottenuti nel miele Linen vine (Govania polygama (Jack) Urb). Il più alto contenuto di aminoacidi è stato trovato invece nel miele Morning glory (Ipomoea triloba L.), mentre nel miele Liven vine è stato riscontrato il più alto contenuto proteico. Allo stesso modo il miele di Linen vine ha mostrato la maggiore attività antiossidante (TAC), mentre la più bassa è stata trovata in Christmas vine (Turbina corymbosa (L.) Raf). L'acido ascorbico non è stato trovato in nessun campione analizzato. Una correlazione significativa (positiva) è stata rilevata tra i risultati della TAC ottenuti in paralello con i saggi FIA-ABTS e ORAC (r = 0.9565, p < 0.001). Una correlazione simile è stata anche stabilita tra i fenoli totali e la TAC,determinata sia dall’ ORAC (r = 0.9633; p < 0.001) che dal saggio TEAC (r = 0.9582; p < 0.001). E’ stata inoltre trovata una correlazione significativa tra l'attività radical-scavenging e il contenuto fenolico totale e tra il colore vs i fenoli totali, vs il contenuto di flavonoidi e tra i fenoli vs i flavonoidi. Le capacità di radical- scavenging e la formazione di radicali ossidrili sono state determinate mediante risonanza paramagnetica elettronica (spin trapping), mentre la capacità di scavenging del radicale superossido è stata determinata mediante il saggio della ipoxantina / xantina ossidasi. Il miele Liven vite e Singing bean hanno presentato la più alta capacità antiossidante nei confronti del radicale ossidrile. Liven vite e Morning Glory hanno anche presentato i valori più elevati di attività scavenging del radicale superossido, mentre i valori più bassi sono stati trovati nel miele Christmas vine. La formazione dei radicali ossidrili è stata trovata in tutti i mieli esaminati, con il miele Christmas vine che mostra i valori più alti. L’ identificazione e la quantificazione dei composti fenolici sono state eseguite mediante HPLC-DAD-ESI/MS: quattordici composti fenolici sono stati identificati (otto acidi fenolici e sei flavonoidi), di cui tre sono derivati glicosilati. Contenuti simili di polifenoli totali sono stati riscontrati in tutti i tipi di miele, ma la differenza più importante è stata dal punto di vista del profilo qualitativo. Ogni campione è stato suddiviso mediante estrazione in fase solida in quattro frazioni ed è stato calcolato il contributo relativo di ciascuna frazione alla TAC. I composti fenolici sono stati trovati come importanti contributori alla capacità antiossidante del miele, ma non sono gli unici responsabili. La capacità antiossidante sembra essere infatti il risultato dell'attività combinata di una gamma di composti fenolici e di altre componenti minori. Inoltre, il miele e i suoi estratti fenolici, separati in base alla idrofobicità, sono stati valutati per la capacità di inibire il danno ossidativo indotto da radicali e generato sia nella membrana degli eritrociti umani che nell’ omogenato di fegato di ratto Wistar. In questo studio si è stabilito che il miele e le sue frazioni fenoliche sono in grado di proteggere gli eritrociti contro il danno ossidativo indotto dall’ AAPH (2,2 '-azobis (2-amidinopropane) dicloridrato). In questo studio abbiamo anche scoperto che i mieli Liven vine e Christmas vine hanno la capacità di diminuire significativamente la concentrazione di idroperossidi lipidici e di malondialdeide, prodotti durante il processo di perossidazione lipidica in omogenati di fegato di ratto e nella membrana degli eritrociti umani, mostrando che la capacità di modulare la produzione e lo scavenging dei i radicali liberi possono contribuire alla capacità di alcuni mieli cubani di aiutare a risolvere alcune malattie infiammatorie in cui è coinvolto lo stress ossidativo.
Several monofloral Cuban honeys were analyzed to determine their total phenolic, flavonoid, ascorbic acid, amino acid, protein and carotenoid contents as well as their radical-scavenging activity and their free radical formation capacity. The total phenolic, flavonoid and carotenoid contents varied considerably, and the highest values were obtained for Linen vine (Govania polygama (Jack) Urb) honey. The highest amino acid content was found in Morning glory (Ipomoea triloba L.) while Liven vine had the highest protein content. Similarly Linen vine honey had the highest antioxidant activity while the lowest was found in Christmas vine (Turbina corymbosa (L.) Raf). Ascorbic acid was absent. A significant (positive) correlation was found between the results of TAC obtained by parallel FIA-ABTS system and ORAC assay (r = 0.9565, p < 0.001). Similar correlations were also established between total phenolics and TAC, determined by either the ORAC (r = 0.9633; p < 0.001) or the TEAC assay (r = 0.9582; p < 0.001). A correlation between radical-scavenging activity and total phenolic content was found. Correlation existed also between color vs phenolics content, vs flavonoid content or between phenolic vs flavonoid. The scavenging and formation capacities of hydroxyl radical were determined using electron paramagnetic resonance (spin trapping), while superoxide radical scavenging were determined by the hypoxanthine/xanthine oxidase assay. Liven vine and Singing bean presented the highest scavenging capacity towards the hydroxyl radical. Liven vine and Morning glory also presented the highest values of superoxide radical scavenging activity, while the lowest values were found in Christmas vine honey. Hydroxyl radical formation was found in all honeys tested, Christmas vine honey showing the highest values. Identification and quantification of phenolics were carried out by HPLC-DAD-ESI/MS. Fourteen phenolic compounds could be identified (eight phenolic acids and six flavonoids), including three glycosylated derivatives. Similar contents of total phenolics were found in the different honeys, although they differed in their qualitative profiles. Honeys were fractionated by solid-phase extraction into four fractions, and the relative contribution of each fraction to TAC was calculated. Phenolic compounds were significant contributors to the antioxidant capacity of the honeys, but they were not uniquely responsible for it. The antioxidant activity appeared to be a result of the combined activity of a range of compounds including phenolics and other minor components. Honeys and their phenol extracts separated on the base of their hydrophobicity were evaluated for the ability to inhibit oxidative damage induced by radical species generated in the membrane of human erythrocytes and in the Wistar rat liver homogenates. In this study it was determined that honey and their phenolic fractions protect erythrocytes against 2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride-induced lysis. In this study we also found that Liven vine and Christmas vine honey has the capacity to decrease significantly the concentration of lipid hydroperoxides and malondialdehyde, produced during the lipid peroxidation process in rat liver homogenates and in membrane of human erythrocytes, showing that the ability to modulate production and scavenging of free radicals may contribute to the ability of some Cuban honeys to help in resolving some inflammatory diseases in which oxidative stress is involved.

Stress ossidativo e perossidazione lipidica a livello cerebrale sono tra i principali meccanismi molecolari coinvolti nell’insorgenza dell’Alzheimer (AD). Inoltre, anche il genere potrebbe giocare un ruolo fondamentale nello sviluppo della malattia. Sulla base di precedenti studi che dimostrano un’alterazione piastrinica in pazienti AD, lo scopo del presente lavoro è stato quindi quello di valutare l’impatto del genere sui livelli di stress nitrosativo e sulla funzionalità di piastrine di pazienti AD e controlli sani. In secondo luogo, si è andati a valutare se i livelli plasmatici di LDL ossidate (ox-LDL) rilevati nell’AD fossero influenzati dall’attività di enzimi coinvolti nella perossidazione lipidica. I maschi AD mostrano una produzione piastrinica di NO e ONOO- maggiore delle femmine AD. La stessa differenza di genere è presente nel gruppo di controllo. Un andamento simile è riscontrato per la concentrazione di Ca2+ intracellulare, mentre l’attività della Na,K-ATPasi e la fluidità delle membrane mostrano un andamento opposto. A livello plasmatico, si osservano maggiori livelli di ox-LDL, una maggiore attività dell’enzima platelet activating factor acetyl hydrolase (PAF-AH) e una diminuita attività dell’enzima paraoxonase-1 (PON1) nei pazienti AD rispetto ai controlli sani, senza alcuna differenza di genere. L’attività di PAF-AH e PON-1, rispettivamente, correlano positivamente e negativamente con la gravità della malattia. Il rapporto PON1/PAF-AH è invece inversamente correlato con i livelli di ox-LDL. L’alterazione di tali parametri biochimici, in combinazione con una ridotta capacità totale antiossidante plasmatica riscontrata negli AD, potrebbero contribuire allo status infiammatorio e all’ossidazione lipoproteica tipica della malattia. Inoltre, i maschi hanno una maggior compromissione piastrinica rispetto alle femmine, mentre tali differenze di genere non sono presenti a livello di stress ossidativo plasmatico.
Oxidative stress and neuronal lipid peroxidation are among the earliest events in Alzheimer disease (AD) pathogenesis. In addition, gender could differently contribute to the disease etiopathogenetic mechanisms. Based on previous results regarding oxidative alterations in AD platelets, firstly we aimed to investigate the role played by gender on platelet nitric oxide (NO) and peroxynitrite (ONOO-) production in AD patients (M-AD and F-AD) and healthy controls, and its effects on intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) and membrane Na,K-ATPase activity and fluidity. Secondly, we aimed to investigate whether higher plasma ox-LDL levels detected in AD were related to alterations of enzyme activities involved in lipid oxidation, including paraoxonase-1 (PON1) and platelet activating factor acetyl hydrolase (PAF-AH) in AD patients and healthy controls. NO and ONOO- production was significantly increased in platelets from both F-AD and M-AD compared to matched controls. M-AD showed a higher NO, ONOO- production and [Ca2+]i than F-AD, while membrane Na,K -ATPase activity and membrane fluidity showed an opposite trend. We also observed higher plasma ox-LDL levels and PAF-AH activity (also directly related with disease severity) and a diminished PON1 activity (inversely related to disease severity) in AD compared to control without any gender differences. A significant negative correlation was also observed between PON1/PAF-AH ratio and ox-LDL levels. Together these biochemical parameters, in combination with the lower plasma antioxidant capacity detected in AD, could contribute to inflammation and oxidative stress of plasma lipoproteins typical of AD. Furthermore, the study supports the conclusion that females are not at greater risk than males for oxidative stress injuries. Further studies on gender differences could lead to a higher probability of improved health outcomes via better-targeted therapies.

This thesis studied the role of p66shc in a murine model of ulcers complicated with peripheral ischemia. This study showed that the knockout of p66Shc improved wound healing in the setting of diabetes and ischemia. Moreover, diabetes increases the expression of p66Shc.
Questa tesi ha studiato il ruolo di p66Shc in un modello murino di ulcere diabetiche complicate da ischemia periferica. Questo studio ha dimostrato che il knockout di p66Shc migliora la guarigione delle ulcere nel contesto di diabete ed ischemia. Il diabete, inoltre, aumenta l'espressione di p66Shc.

I pattern di espressione genica permettono di valutare se gli organismi siano soggetti a stress ambientali, spesso associati a stress ossidativo e produzione di specie reattive dell’ossigeno, che possono essere analizzate per studiare gli effetti sub-letali indotti dall’ambiente negli organismi. Scopo di questa ricerca è stato valutare la possibilità di utilizzo dell’ascidia coloniale B. schlosseri come biomarker in ambiente lagunare. Le colonie, esposte a diverse condizioni ambientali nella Laguna di Venezia, sono state confrontate con esemplari allevati in condizioni di controllo. La ricerca si è concentrata in 2 siti con diverso grado di idrodinamicità e impatto antropico. Mentre nel sito 1, più vicino alla bocca di porto, si è rilevata la presenza di Tunicati, il sito 2 ne è privo. Il sito 2 ha registrato valori di pH e temperatura più alti. Inoltre, nel sito 2 è stata rilevata una mortalità maggiore delle colonie e alterazioni della morfologia nelle colonie sopravvissute. Ciò suggerisce che il sito 2 presenti condizioni avverse per B. schlosseri. Sui campioni di B. schlosseri sono state eseguite PCR semiquantitative per analizzare l’espressione di un gruppo di geni coinvolto nella risposta allo stress ossidativo: la glutammato cistein ligasi la glutatione sintetasi, 2 isoforme di glutatione perossidasi e la superossido dismutasi (SOD). Tutti i geni presentano livelli di trascrizione doppi nelle colonie del sito 1 rispetto al controllo. Viceversa, il sito 2 mostra livelli di espressione di poco superiori al controllo. Analisi spettrofotometriche evidenziano che le attività enzimatiche di SOD e catalasi sono più alte nel sito 2 rispetto al sito 1. Si può pertanto ipotizzare che le colonie esposte al sito 2 siano soggette a un maggiore stress. B. schlosseri appare dunque un buon indicatore dello stato ecologico dell’ambiente lagunare, entro parametri di pH e temperatura in cui abitualmente vive.

Previously we demonstrated that human adenocarcinoma gastric cells AGS are able to counteract the detrimental effects of the ROS-inducer diallyl-disulfide. Here we report that such resistance can be extended to other pro-oxidant molecules. Conversely, AGS cells were induced to apoptosis via the mitochondrial pathway upon treatment with thiols-oxidizing agents, such as diamide. Apoptosis is associated with persistent oxidative damages, as evidenced by the increase of carbonylated proteins and the expression/activation of DNA damage-sensitive proteins histone H2A.X and DNA-PK. Resistance to H2O2, as well as sensitivity to diamide are correlated with GSH redox state, with H2O2 transiently increasing protein-GSH mixed disulfides, and diamide dramatically elevating GSSG. Moreover, the inhibition of GSH neo-synthesis, by buthionine sulfoximine, or the enrichment of intracellular sulphydryl pool, by N-acetylcysteine, was able to protect cells. Nrf2 rapidly translocates to the nuclei when AGS cells are treated with H2O2; whereas p53 is activated in response to diamide treatment by the oxidative induction of Trx1/p38MAPK signaling pathway. Finally, experiments carried out with p53 siRNA or dominant-negative Nrf2, indicate that these transcription factors play an important role in cell death and resistance to it. Our results are of particular importance for inducing apoptosis in tumor histotypes resistant to ROS-producing chemotherapeutics.

Cardiovascular disease remains the most common cause for the excess of morbidity and mortality in end-stage renal disease (ESRD) patients. Increased oxidative stress (OxSt), inflammation and endothelial dysfunction are recognized non-traditional cardiovascular risk factors in these patients. These patients, in fact, have increased levels of inflammation-related proteins, such as interleukin-6 (IL-6) and C-reactive protein (PCR), as well as OxSt-related proteins, such as NAD(P)H oxidase, which lead to reduced nitric oxide (NO) availability and endothelial dysfunction. The cause(s) of inflammation in dialysis have been shown to be multi-factorial and to include both factors arising from dialysis as well as other non-dialysis- related factors. Unfortunately, during the last 20 years the mortality rate in ESRD patients treated with dialysis has remained high, which has prompted the exploration of multiple strategies such as anti-inflammatory treatment using either pharmacological or dialysis-based approaches, to improve outcomes in these patients. A novel dialysis technique, haemodiafiltration with online regeneration of ultrafiltrate (HFR), has recently been reported to reduce levels of inflammation-related proteins, such as tumour necrosis factor (TNF-?), IL-6 and PCR, counteracting the inflammatory state while no data are available on the effect of HFR on OxSt. HFR (double chamber HDF with reinfusion of ultrafiltrate regenerated through a charcoal-resin cartridge), combines the processes of diffusion, convection and adsorbance. During HFR, the ultrafiltrate derived from the convective section of the filter is processed in a charcoal-resin cartridge and the regenerated ultrafiltrate is reinfused into the bloodstream before the diffusive section of the filter. An additional feature is that the resin component of the cartridge adsorbs in particular pro-inflammatory cytokines. Given the important role played by OxSt and its associated molecules, including those related to inflammation in increasing cardiovascular disease (CVD) risk in end-stage renal disease (ESRD), HFR may be useful in reducing the levels of these molecules, and thereby, in reducing the morbidity and mortality of dialysis patients. The aim of the current study was to evaluate the effect of dialysis using HFR on OxSt as assessed by plasma markers of OxSt such as oxidized low density lipoproteins (LDL), an indicator of cardiovascular risk factor, as well as gene and protein expression levels of OxSt-related proteins in mononuclear cells such as p22phox, a 22 kDa subunit of cytochrome b558 included in the NADH/NADPH oxidase which is present both in leucocytes and in the vascular wall which functions as an integral subunit of the final electron transport from NAD(P)H to haeme and molecular oxygen in generating O2, plasminogen activator inhibitor (PAI)-1, a proatherothrombogenic factor; haeme-oxygenase-1 (HO-1), one of three different isoforms of HO, it acts on haeme, producing CO and biliverdin, which is further metabolized to bilirubin, a potent antioxidant itself. Eighteen patients from the Division of Nephrology II at the Padova University Hospital, age range 19-60 years, undergoing chronic dialysis treatment (210-240 min three times a week bicarbonate-dialysis) for at least 1 year (range 1-6 years), were recruited and randomized into a 1 year cross-over study. One group of patients was initially treated for 6 months with HFR (SG8 Plus-Bellco, Mirandola Italy) then followed by 6 months of low-flux bicarbonate dialysis with ultrapure dialysate, using a polysulphone dialyser 1.8m2 and the other group was first treated with low flux bicarbonate dialysis with ultrapure dialysate, using a polysulphone dialyser 1.8m2 for 6 months followed by 6 months of treatment using HFR. Treatment with HFR significantly reduced mononuclear cell p22phox mRNA level and protein expression compared with the treatment with BD. Also mononuclear cell PAI-1 mRNA level and protein expression was significantly reduced by the treatment with HFR compared with the treatment with BD. Whereas treatment with HFR did not modify gene and protein expression of HO-1 compared with the treatment with BD. Treatment with HFR compared with the treatment with BD significantly reduced the plasma level of OxLDL: -14 ± 19 ?% vs 1 ± 14, p<0.01. The results of this study indicate that the treatment with HFR has a much lower impact on OxSt, as the levels of expression of proteins related to and the level of markers of OxSt were lower than those seen with standard dialysis. The more plausible explanation may come from both the efficacy of HFR in reducing the level of pro-oxidant/proinflammatory cytokines such as TNF-?, IL-6, which are inducers of and involved in the OxSt and inflammatory response, and from a possible sparing effect of HFR on several water soluble antioxidants. These effects of HFR might contribute to reduce the oxidative status in dialysis patients in general and explain its effects compared with standard bicarbonate dialysis in reducing the gene and protein expression of the OxSt-related proteins. This lower impact on OxSt suggests that HFR is a more biocompatible system for dialysis. Given the very close relationships between OxSt and inflammation and the determinant role played by OxSt in the induction of inflammation-related mechanisms in ESRD patients, HFR treatment could have considerable clinical impact in reducing the risk of progressive atherosclerotic cardiovascular disease in dialysis patients, which is the main cause of death in these patients.

Il cancro alla vescica urinaria (BC) è uno dei tumori più comuni alla vescica urinaria, sia per le donne che per gli uomini, nei Paesi occidentali. Studi in vitro e in vivo suggeriscono che alti livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e le specie reattive dell’azoto (RNS) e lo stress ossidativo hanno un ruolo cruciale nel cancro dell’uomo. Basse concentrazioni di ROS e di RNS sono indispensabili per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule. Comunque, alte concentrazioni di ROS e d RNS possono esercitare un effetto citotossico. Un aumento dello stress ossidativo è il risultato o di un aumento della produzione di ROS/RNS o una diminuzione del meccanismo di difesa antiossidante. Una ricerca letteraria è stata portata avanti su PubMed, Medline, e Google Scholar con articoli in inglese pubblicati fino a Maggio 2018 che usano le seguenti parole chiave: stress ossidativo, antiossidanti, specie reattive dell’ossigeno, perossidazione lipidica, paraoxonasi, cancro alla vescica urinaria, ossido di azoto. Dati letterari dimostrano che BC è associato allo stress ossidativo e con uno sbilancio trae enzimi ossidanti e antiossidanti. I marcatori della perossidazione lipidica, l’ossidazione delle proteine e degli acidi nucleici sono significativamente più alte nei tessuti di pazienti con il cancro alla vescica comparati a gruppi di controllo. Una diminuzione dell’attività di enzimi antiossidanti (superossido dismutasi, catalasi, glutatione, e paraoxonasi) è stata dimostrata. Lo sbilancio tra ossidanti e antiossidanti potrebbe avere un potenziale ruolo nell’eziologia e nella progressione del cancro alla vescica.
Epidemiological studies suggest associations between type 2 diabetes mellitus and bladder cancer. Several potential mechanisms may explain the increased bladder cancer burden in DM patients. Hyperglycaemia is associated with dysregulation of cell intracellular metabolism and alterations of lipoprotein metabolism and oxidative stress. In fact, previous studies have shown that levels and functions of circulating lipoprotein are modified in DM patients. Dysfunctional HDL including glycated and oxidized HDL are described in patients with type 2 diabetes mellitus. We evaluated the effect of normal HDL and glycated HDL on cell proliferation and oxidative stress of J82 bladder cancer cells. We also studied the effect of HDL on cholesterol influx and efflux. In addition, the expression of proteins involved in cholesterol transport (ABCA1, SRB1, ABCG1) by western blot analysis was studied. Our results demonstrate that HDL incubated 7 days at 37⁰C with increasing concentrations of glucose (30-100mM) have lower levels of free amino groups with respect to untreated HDL. The decrease realized at a higher extent using glucose 100 mM therefore this concentration was used to investigate the effect of glycated HDL on J82 cells. Levels of TBARS and conjugated dienes were higher in G-HDL compared with N-HDL. These results demonstrate that lipid peroxidation occurs during glycation treatment. The enzyme activity of paraoxonase (HDL-PON1) was significantly decreased in G-HDL . High markers of lipid peroxidation and a decrease of Paraoxonase activity are described in dysfunctional HDL. The study of the effect of Normal HDL and glycated HDL (G-HDL) on J82 cells in culture has shown that both N-HDL and G-HDL promote cell proliferation and increase the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) during incubation with the oxidizing agent tert-butyl hydroperoxide. The increase of intracellular ROS was associated to higher levels of TBARS in cells incubated with G-HDL than N-HDL. The increase in oxidative stress in cells incubated with N-HDL was associated with alterations of cholesterol homeostasis. In detail Cholesterol efflux was increased, on the contrary cholesterol influx was significantly decreased in cells incubated with G-HDL. Expression of receptor protein SR-B1 and ABCG1 was increased. The higher expression of SR-B1 in cells incubated with G-HDL suggests that dysfunctional HDL could affect cholesterol homeostasis in J82 bladder cancer cells. These results suggest that HDL-based treatments should be considered for treatment of bladder cancer.

The heart is especially vulnerable to mitochondrial derangements. In fact, many cardiomyopathies are caused by anomalous mitochondrial metabolism or alterations of mitochondrial bioenergetics. The involvement of mitochondria in cardiac diseases is likely to be extended to structural changes, since mitochondrial activity and cellular signaling are tightly linked with mitochondrial morphology. A major example of this link is provided by the relationship between mitochondrial fragmentation and the progression of apoptosis. Among the proteins involved in mitochondrial dynamics, the dynamin-like GTPase Optic Atrophy 1 (OPA 1) is required for mitochondrial inner membrane fusion and maintenance of normal cristae structure. The research activity of this thesis was aimed at both investigating whether OPA 1 is altered in hearts subjected to ischemia and reperfusion and elucidating the relationships between OPA 1 changes and alterations in mitochondrial morphology. Due to the established role of mitochondria in generating reactive oxygen species, oxidative stress was investigated as a crucial mechanism altering OPA 1 structure and function.The susceptibility of OPA 1 to oxidation was initially characterized in intact hearts, cardiomyoblasts and isolated mitochondria. In isolated rat hearts perfused with hydrogen peroxide (H2O2) or subjected to ischemia and reperfusion OPA 1 was found to undergo the formation of high molecular weight (HMW) bands that were barely detectable in normoxic hearts. Since these HMW bands were only observed in electrophoreses carried out under non-reducing conditions, their formation reflected the oxidation of vicinal cysteinyl residues resulting in the generation of disulphide cross-bridges. In mitochondria isolated from heart perfused with H2O2, Blue Native-PAGE (BN-PAGE) analysis displayed the aggregation of OPA 1 in various complexes with high molecular weight (ranging from xx to xx). These complexes were not present in mitochondria isolated from normoxic rat hearts. Then OPA 1 complex formation was analyzed both in HL-1, a proliferating atrial cardiomyocites derived from mouse AT-1 cells, and in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), as a model cell line. Oxidative stress caused by incubation with H2O2 resulted in the formation of OPA 1 complexes that disappeared under reducing conditions, confirming the presence of intermolecular cross-bridges. Notably, under the same experimental condition causing OPA 1 aggregation (i.e., incubation with increasing concentration of H2O2) a fragmentation of mitochondrial network was observed in HL-1 cells suggesting that oxidation of cysteine residues might hamper the ability of OPA 1 to favour mitochondrial fusion. This hypothesis was validated by identifying which residues of cysteine were involved in the formation of disulfides cross-bridges. Since NMR and crystallographic structure of OPA 1 is not available, 3D structure information were obtained by means of homology modeling. In a collaborative effort with Prof. S. Moro (Faculty of Pharmacy, University of Study of Padova), analyses were carried out aimed at identifying the cysteine residues exposed on the protein surface that is also the region involved in OPA 1 dimerization. As a result of this study, cysteines 853, 856 and 874 were indicated as the residues that more likely contribute to the formation of OPA 1 complexes. This hypothesis was verified by performing site-directed mutagenesis experiments on the expression construct containing wild-type Opa1 isoform 1. By substituting the native cysteine residues with serine. This approach allowed us obtaining the following mutants: (i) the double mutant in C853-6S; (ii) the single mutants in C853S or in C874S. New clones have been sequenced to ensure fidelity. Lentiviral vectors containing the mutated cysteine plasmids were produced in order to transfect OPA 1-/- MEF cell line (kindly given by Prof. L. Scorrano). Both C853S and C853-6S expressed detectable level of OPA 1, while cells containing OPA 1 mutated in the single residue C874S were not obtained. Cells harbouring the OPA 1 mutants were assessed for mitochondrial morphology. Under control conditions C853-6S cells displayed punctuate mitochondria that is similar to the mitochondrial phenotype displayed by OPA 1-/- MEF cells; conversely, the expression of the C853S mutant restored the fusion morphology. Cells were incubated with H2O2 in order to elucidate the relationship between OPA 1 aggregation and disulphide crossbridge formation. OPA 1 complex formation was inhibited in both cell lines. To investigate the correlation between OPA 1 aggregation and mitochondrial fission, C853S cells were treated with H2O2. In C853S mutants the time required for completing the fission process was doubled with respect of MEF wild type cells. In conclusion these findings highlight the relevance of cysteine 853 in maintaining the role of OPA 1 in mitochondrial fusion, and especially in the derangement of this function caused by oxidative stress. In fact, when cells expressing the mutant C853S were exposed to a severe oxidative stress, OPA 1 aggregation was prevented along with a significant delay in the occurrence of mitochondrial fission.
Il cuore è particolarmente soggetto a disfunzioni mitocondriali e numerose cardiomiopatie sono associate ad un anomalo metabolismo mitocondriale o ad alterazioni bioenergetiche mitocondriali. Studi recenti hanno messo in evidenza come l’attività dei mitocondri e le vie di trasduzione del segnale cellulare influenzino la morfologia dei mitocondri, ad esempio, la frammentazione della rete mitocondriale è correlata al processo di apoptosi. La proteina OPA 1, GTPasi appartenente alla famiglia delle dinamine, è coinvolta nel processo di fusione della membrana interna mitocondriale e nel mantenimento della struttura delle cristae interne mitocondriali. Tuttavia sono necessari maggiori studi atti a contribuire ad una maggiore comprensione delle proteine e dei meccanismi alla base delle funzionalità di OPA 1. Nel presente lavoro di tesi è stato studiato l’effetto dello stress ossidativo sulla proteina mitocondriale OPA 1 nel cuore, dato che i mitocondri sono sede di produzione e bersaglio delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inizialmente, utilizzando cuori di ratto isolati e perfusi ex-vivo, è stato valutato l’effetto di ischemia/riperfusione e perfusione con perossido di idrogeno (H2O2) sulla proteina OPA 1. Nei campioni trattati è stata osservata la formazione di complessi ad alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) della proteina in esame. In condizioni riducenti, tali complessi vengono disgregati. Questi risultati indicano che in condizioni di forte stress ossidativo con H2O2 si ha l’aggregazione di OPA 1 e che nella formazione dell’aggregato è coinvolta la formazione di ponti disolfuro. In seguito, mediante Blue Native-PAGE (BN-PAGE), è stata eseguita un’analisi dei complessi proteici a partire da mitocondri isolati da cuore di ratto in condizioni normossiche e da cuori perfusi con H2O2. L’analisi ha dimostrato che OPA 1 aggrega in complessi di diverso peso molecolare in condizioni native. La formazione del complesso di OPA 1 è stata analizzata sia cellule HL-1, una linea di cardiomiociti da atrioma murino, che in fibroblasti embrionali murini (mouse embryonic fibroblasts, MEFs). Al fine di indurre stress ossidativo le cellule sono state incubate con 1 mM H2O2 per 2 ore. Il complesso di OPA 1 scompare in condizioni riducenti, confermando la formazione di ponti disolfuro intermolecolari. Inoltre, in cellule HL-1 incubate con concentrazioni crescenti di H2O2 è stata osservata frammentazione della rete mitocondriale. Ci siamo proposti di individuare quali fossero i residui cisteinici coinvolti nella formazione del ponte disolfuro. La struttura della proteina OPA 1 non è stata determinata né mediante NMR né mediante tecnica cristallografica. In collaborazione con il Prof. S. Moro (Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Padova) è stata ipotizzata la struttura 3D della proteina mediante homology modelling al fine di caratterizzare quali fossero i residui cisteinici esposti sulla superficie proteica. In questo modo le cisteine 853, 856 e 874 sono stati individuati come residui più probabilmente coinvolti nella formazione del complesso di OPA 1. Per confermare questa ipotesi, sono stati eseguiti degli esperimenti di mutagenesi sito-diretta a partire da un costrutto plasmidico contenente la sequenza genica per l’isoforma 1 umana del gene OpaI. Mediante questa tecnica sono stati ottenuti plasmidi mutati a livello delle singole cisteine 853 (C853S) e 874 (C874S), ed un doppio mutante cisteina 853-6 (C853-6S). I cloni sono stati sequenziati per confermare le avvenute mutazioni. Sono stati prodotti vettori lentivirali contenenti i plasmidi mutagenizzati al fine di esprimere stabilmente la proteina di interesse nella linea cellulare MEF OPA 1-/- (gentilmente fornita dal Prof. L. Scorrano). Sono state ottenute linee cellulari esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del singolo residuo cisteinico 853 e dei residui 853-6, mentre non è stata ottenuta la linea esprimente la proteina mutata in C874S. È stata quindi valutata la morfologia mitocondriale nelle linee cellulari ottenute. Le cellule C853-6S presentano mitocondri disgregati con un fenotipo simile alla linea MEF OPA 1-/-; al contrario, nelle cellule esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del residuo 853, si verifica il ripristino del fenotipo di fusione mitocondriale. Al fine di chiarire la relazione tra l’aggregazione di OPA 1 e la formazione dei ponti disolfuro, le cellule sono state incubate con H2O2. La formazione del complesso di OPA 1 risulta inibita in ambedue le linee cellulari contenenti la proteina mutata. Le cellule C853S sono state trattate con H2O2 per verificare la correlazione tra l’aggregazione della proteina in esame e il processo di fissione mitocondriale. I cloni C853S completano il processo di fissione mitocondriale in un tempo doppio rispetto alla linea MEF WT. Per concludere, in condizioni di elevato stress ossidativo la proteina OPA 1 è esposta ad ossidazione che ne modifica lo stato di aggregazione. Tale processo è correlato ad una diminuzione della fusione mitocondriale e, nelle cellule HL-1, ad un aumentato rilascio di citocromo c. Il meccanismo di aggregazione della proteina è stato stabilito mediante mutagenesi sito specifica che mette in luce il ruolo del residuo cisteinico 853.

Reactive oxygen species (ROS) are short-living and highly reactive molecules formed by incomplete one-electron reduction of oxygen. Mitochondria produce low levels of ROS as an inevitable consequence of oxidative metabolism. Low levels of ROS are normally reduced by nonenzymatic and enzymatic oxidizing agents, such as glutathione, thioredoxin, superoxide dismutase (SOD), catalase and peroxidases. Oxidative stress results from exposure to high levels of ROS, which are not detoxified by cellular antioxidizing agents, and produces cellular damage due to the oxidation of cellular constituents. ROS, however play not only a damaging role: recent studies have demonstrated that they also actively participate in a diverse array of biological processes, including normal cell growth, induction and maintenance of the transformed state, and cellular senescence. Moreover, ROS can also provide a signaling function, by acting as an intracellular messenger involved in the transduction of the signaling of cytokines such as TNF-α and IL-1β. We focused our attention on the effect of ROS in the activities of two proteins: PKCζ and p66Shc. On the one hand, PKCζ is a serine-threonine kinase belonging to the atypical subfamily of PKC proteins. We showed that in an in vitro model redox stress induces PKCζ translocation from the cytosol, where it is located in resting conditions, to the nucleus. Nuclear PKCζ protects cells from apoptotic stimuli such as H2O2 or ceramide and this protective effect is reverted by the selective inhibition of the nuclear pool of the protein. The protective effect of nuclear PKCζ is involved in the chemoresistance of tumor cells to chemotherapic drugs, as demonstrated by the fact that the selective inhibitor of nuclear PKCζ can revert the chemoresistance, suggesting nuclear PKCζ as a suitable target in anticancer therapies. On the other hand p66Shc is a Shc protein involved in stress responses, in particular it is activated by redox stress and it produces ROS itself. Our purpose is to investigate a possible involvement of p66Shc in two different phenomena: autophagy and adipogenic transdifferentiation of skeletal muscle cells by comparing wt mice with p66Shc KO mice. Autophagy is a general term referring to pathways for the degradation of cellular constituents (cytosol and organelles) by the autophagolysosome; it is activated mainly by nutrient starvation and it plays a dual role: it is primarly a surviving mechanism, but it also leads to cell death (called type II cell death) thus possibly acting as an alternative to apoptosis. Starting from this notion, and from the fact that p66Shc KO cells are protected from apoptosis, we investigated a possible role of p66shc as a key element in the switch from apoptosis to autophagy. We observed that, while in wt cells redox stress induces apoptosis, cells lacking p66Shc in the same condition activate the autophagic pathway. We are now trying to investigate the biological effect of these observation. The second aspect of our work is the investigation of a putative role of p66Shc in the adipogenic transdifferentiation of skeletal muscle precursor cells. To this purpose we used an in vivo model and we observed that mice lacking p66Shc exposed to muscle damage (e.g. freeze injury or redox stress) show lower adipocyte accumulation than wt mice, thus suggesting a role of p66 in the activation of adipogenic differentiation pathway. The key purpose of this work is the evaluation of many different effects of ROS production, looking for possible molecular targets to fight pathological processes such as chemoresistance and adipogenic degeneration of skeletal muscle.

Because the intestine sits at the interface between the organism and its luminal environment, it represents a critical defense barrier against luminal toxic agents. Thus, in addition to being exposed to luminal nutrients, the intestinal mucosa is constantly challenged by diet-derived oxidants, mutagens, and carcinogens as well as by endogenously generated reactive oxygen species. Among the oxidizing agents cholesterol oxidation products, oxysterols, are particularly relevant; besides being generated endogenously, they may be introduced with the diet. Oxysterols are involved in physiological processes, but they also exert several detrimental effects including cytotoxicity, induction of cell death, carcinogenicity and pro-oxidative and pro-inflammatory activities. These compounds have recently been suggested to be associated with the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD), and with a high risk of developing colorectal cancer. There is an increasing interest in the mechanisms of response of the intestinal epithelium to oxidative stress and in the capability of nutritional antioxidants to strengthen endogenous antioxidant defenses. Among dietary-derived antioxidants, phenolic compounds have been described to have a wide range of biological activities and many reports have illustrated their promising role as preventive tools in several acute and chronic disorders. Phenolic compounds are absorbed and extensively metabolized in vivo: however, the percentage of absorption does not exceed a few percent of the ingested dose. It is assumed that dietary polyphenols may display their first antioxidant defense in the digestive tract, where they concentrate, both through their “conventional“ antioxidant capacity, limiting ROS formation and scavenging them, and by an “indirect” antioxidant effect, inducing endogenous protective enzymes and/or regulating cellular process such as inflammation. Wine accounts for a very high proportion of phenolic compounds intake in the Mediterranean diet; typically a glass of red wine contains about 100 mg of compounds generally called polyphenols. We investigated the ability of two wine phenolic extracts, obtained from grape varieties grown in Sardinia, Cannonau (red) and Vermentino (white), to exert a protective action against the pro-oxidative and pro-inflammatory effect of oxysterols in Caco-2 cells, a cell line with enterocyte-like features, as a model system that mimics the insult of dietary oxidized lipids on the intestinal mucosa. Oxidative damage was induced by treating cells with a dietary-representative oxysterols mixture (7-ketocholesterol, 5α,6α-epoxycholesterol, 5β,6β-epoxycholesterol, 7α-hydroxycholesterol and 7β-hydroxycholesterol); malondialdehyde (MDA) production was evaluated as marker of oxidative damage, together with cell death. Changes in the cellular redox state were evaluated determining the glutathione peroxidase (GPx) activity, the variation of GSH concentration, NADPH oxidase 1 (NOX1) activation and ROS generation. Twenty-four hours exposure to oxysterols induced cell death and MDA production, together with a significant loss of GSH, just after 30 min of incubation. An increase in the GPx activity was observed 18 hours after treatment. Pretreatment with both the wine phenolic extracts protected Caco-2 cells from oxidative damage and the level of GSH was preserved; a further increase of the GPx activity was observed in cells pretreated with wine fenolic extracts in agreement with previous studies. Oxysterols oxidizing action was due, at least in part, to the generation of intracellular ROS, as demonstrated by the use of a fluorescent probe. Since the increase of ROS levels by oxysterols in Caco-2 cells has been reported to involve modulation of NOX1, we also measured the activation of this enzyme; oxysterols treatment significantly enhanced the activity of NOX1. Wine phenolic extracts pretreatment reduced ROS formation, probably by a scavenging direct action, but also through the modulation of NOX1 activity, which was significantly inhibited by the extracts. In view of recent studies reporting that oxysterols may induce an increase of ROS production through an enhanced expression of NOX1 in Caco-2 cells in association with an increase of inflammatory cytokine production (IL-6 and IL-8), we investigated the antinflammatory effect of the wine phenolic extracts, by measuring the release of IL-6 and IL-8 by Caco-2 cells treated with the oxysterols mixture. Differentiated Caco-2 cells in fact have been reported to be also an excellent in vitro model of intestinal inflammation, responding to different inflammatory stimuli. Cannonau phenolic extract exerted a significant antinflammatory activity, inhibiting the release of the two interleukins. Finally, we evaluated the signaling pathways modulated by oxysterols and wine phenolic extracts with the aim of clarifying the molecular mechanism involved in the antioxidant and antinflammatory activity. For this purpose the possible modulation of the MAPKs cascade was analyzed in Caco-2 treated with oxysterols. These kinases have been reported to be activated by various stress stimuli, and they have been also implicated in oxysterols induced cytokine secretion and apoptosis. Under our experimental conditions, the oxysterols mixture was not able to modulate ERK phosphorilation, but induced p38 and JNK pathways activation. Pretreatment with both the wine phenolic extracts significantly inhibited p38 and JNK phosphorilation. The results of this study support a potential role for wine phenolic compounds in preventing oxysterols induced oxidative damage and inflammatory cytokine production in Caco-2 cells. We suggest that wine phenolic compounds exerted such a preventive effect through a mechanism involving a direct scavenging of ROS and/or an inhibition of NOX1, which in turn affected ROS production and redox sensitive MAPKs, p38 and JNK, expression and interleukins release. Although further studies are needed, our results point out for the first time a direct antioxidant and antinflammatory action of the phenolic fraction from the red wine Cannonau and the white wine Vermentino on enterocytes exposed to oxidizing species. These data have an interesting biological significance, suggesting the possibility that, together with their metabolites, wine polyphenols may significantly contribute to preserve the integrity of intestinal mucosa against oxidative damage and inflammation related disorders. Our data also support the opinion that total phenolic content, as well as wine’s color, are not essential for the antioxidant activity of a wine extract; although the extract obtained from the red wine Cannonau was effective at lower concentrations and in all the experimental conditions, the extract obtained from the white wine Vermentino showed basically a comparable efficacy.

Background and Aims: In the Western countries, liver cirrhosis is the main cause of portal hypertension, which is defined as a clinical syndrome characterized by an increased hydrostatic pressure within the portal venous system. The importance of this syndrome is defined by the frequency and severity of its complications: gastrointestinal bleeding from ruptured gastroesophageal varices, ascites, hepatorenal syndrome and hepatic encephalopathy. In cirrhosis, the initial factor determining the onset of portal hypertension is the increase in intrahepatic vascular resistance, which is due to the morphological changes of the liver, but also to endothelial dysfunction in the porto-hepatic vascular bed, characterized by an exaggerated response to vasoconstrictors and a deficient response to vasodilators. Resveratrol, a polyphenol found in a variety of fruits, possesses a wide range of beneficial properties, e.g. anti-oxidant and anti-inflammatory activity. In the endothelium resveratrol regulates several vasoactive substances and decreases oxidative stress, both factors involved in the pathophysiology of endothelial dysfunction. This study aimed at evaluating the effects of resveratrol on hepatic and systemic hemodynamics, hepatic endothelial dysfunction and hepatic fibrosis in CCl4-cirrhotic (CH) rats. Methods: Resveratrol (10 or 20mg/kg/day) or its vehicle were administered to CH rats orally for two weeks; then the following measurements were done: a) in vivo: mean arterial pressure (MAP), portal pressure (PP), portal blood flow (PBF) and superior mesenteric artery blood flow (SMABF); b) isolated perfused livers: endothelial function assessed by dose-relaxation curves to acetylcholine; c) assessment of fibrosis: Sirius Red staining of liver sections, collagen-1 mRNA expression and α-smooth muscle actin (α-SMA) protein expression, as a surrogate of hepatic stellate cell activation. Results: Resveratrol administration significantly decreased PP without significant changes in MAP, PBF and SMABF. Reduction in PP was associated with an improved vasodilatory response to acetylcholine and with a significant reduction in liver fibrosis. The decrease in hepatic fibrosis was associated with a reduced collagen-1 mRNA expression and α-SMA protein expression. Conclusions: In cirrhotic rats, resveratrol administration reduces portal pressure by improving liver fibrosis and endothelial dysfunction, suggesting that it may be an ideal supplement in the treatment of portal hypertension in patients with cirrhosis.
Introduzione e scopo dello studio: L'ipertensione portale è una condizione fisiopatologica caratterizzata dall'aumento della pressione nel sistema portale che può causare lo sviluppo di manifestazioni cliniche severe quali le emorragie da rottura di varici esofagee e/o gastriche e da gastropatia congestizia, l'ascite, l'encefalopatia epatica e la sindrome epatorenale. L'ipertensione portale può manifestarsi in corso di diverse patologie, fra le quali la più comune nel mondo occidentale è la cirrosi epatica. Nella cirrosi il fattore iniziale alla base dello sviluppo dell'ipertensione portale è l'aumento delle resistenze vascolari intraepatiche, dovuto sia alle alterazioni morfologiche del fegato, sia alla disfunzione endoteliale nel letto vascolare porto-epatico, caratterizzata da un'esagerata risposta a sostanze vasocostrittrici e una risposta ridotta a sostanze vasodilatatrici. Il resveratrolo è un polifenolo di origine vegetale presente nell'uva e nei suoi derivati, negli arachidi, e in diverse altre piante. Tra le numerose proprietà benefiche di questa sostanza sono state studiate soprattutto quella antiossidante ed antinfiammatoria. Il resveratrolo possiede effetti benefici anche a livello endoteliale: è coinvolto nella regolazione di numerose sostanze vasoattive e riduce lo stress ossidativo, fattori entrambi coinvolti nella patogenesi della disfunzione endoteliale. Lo scopo di questo studio era quello di valutare gli effetti del resveratrolo sull'emodinamica sistemica ed epatica, la disfunzione endoteliale epatica e la fibrosi epatica nel modello animale di cirrosi epatica indotta mediante CCl4. Metodi: Il resveratrolo (10 o 20 mg/kg/die) o il suo veicolo sono stati somministrati oralmente per due settimane in ratti cirrotici; successivamente sono state eseguite le seguenti misurazioni: a) in vivo: pressione arteriosa media (PAM), pressione portale (PP), flusso portale (FP) e flusso arterioso mesenterico superiore (FAMS); b) fegati isolati e perfusi: funzione endoteliale valutata attraverso curve dose-risposta all'acetilcolina; c) valutazione della fibrosi epatica: colorazione Sirius Red di sezioni di fegato, espressione dell'mRNA per il collagene-1 ed espressione proteica di α-smooth muscle actin (α-SMA), indice dell'attivazione delle cellule stellate epatiche. Risultati: La somministrazione di resveratrolo ha determinato una riduzione della PP, senza modificazioni significative della PAM, del FP e del FAMS. La riduzione della PP era associata ad un miglioramento della risposta vasodilatatrice all'acetilcolina e della fibrosi a livello epatico. Oltre al miglioramento della fibrosi valutato mediante colorazione Sirius Red, è stata osservata una riduzione dell'espressione dell'mRNA per il collagene-1 e dell' α-smooth muscle actin (α-SMA). Conclusioni: Nei ratti cirrotici il resveratrolo riduce la PP attraverso un miglioramento della fibrosi e della disfunzione endoteliale epatica. Il resveratrolo, dunque, potrebbe essere un supplemento ideale nel trattamento dell'ipertensione portale in pazienti con cirrosi epatica.

Il Tebuconazolo e l'Econazolo appartengono, rispettivamente, alla classe dei fungicidi triazolici e imidazolici, largamentemente utilizzati su scala mondiale (il primo in ambito agro-alimentare come pesticida e l’altro come antimicotico in ambito clinico). Sebbene sia stata descritta la loro tossicità riproduttiva nei mammiferi, il loro effetto sul sistema riproduttivo maschile è ancora attualmente oggetto di studio. Considerando realisticamente che tutti gli esseri umani possano essere esposti contemporaneamente a diversi composti azolici, lo scopo principale di questo lavoro è stato quello di indagare la tossicità combinata in vitro di Tebuconazolo ed Econazolo (MIX) sulle attività metaboliche e funzionali di cellule del Sertoli TM4 e di valutarne il meccanismo molecolare di azione. Il nostro studio dimostra che il Tebuconazolo (40 µM) e l'Econazolo (20 µM) agiscono sinergicamente nel mediare la riduzione del potenziale di membrana mitocondriale (∆Ψm), nonché i cambiamenti nella morfologia mitocondriale. Questi eventi erano associati a condizioni di deplezione dell’ATP, all'arresto del ciclo cellulare e all'attivazione sequenziale di autofagia e apoptosi. Inoltre, l’ipotesi di una correlazione positiva tra disfunzionalità mitocondriale e stress ossidativo è stata confermata mediante analisi spettrofotometrica dei livelli intracellulari delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Sono state osservate differenze significative su altri parametri come il rapporto AMP/ATP e la carica energetica, relativa al contenuto intracellulare degli adenilati. L'inibizione farmacologica dell'autofagia da parte della bafilomicina A1 ha portato ad un aumento significativo dell’apoptosi indotta da MIX, suggerendo che questo effetto risulta essere una risposta adattativa precoce, che conferisce un vantaggio transitorio in termini di sopravvivenza cellulare. Infine, è stato ipotizzato un possibile ruolo dell'asse AMPK/ULK1 nella mediazione molecolare del processo adattativo scaturito in risposta allo stress energetico. Coerentemente, è stato verificato un aumento significativo nel grado di fosforilazione della proteina ULK1, a livello del residuo Ser 555, in risposta all'attivazione di AMPK (Thr 172). In conclusione, la combinazione di Tebuconazolo ed Econazolo, a concentrazioni rilevanti per l'esposizione cutanea e clinica, risulta in una disfunzione a livello mitocondriale, che porterebbe allo sviluppo di una condizione di stress ossidativo, parallelamente accompagnata da una situazione di deficit energetico. L’iniziale modulazione autofagica, seguita dall’attivazione di apoptosi, coinvolgerebbe la via di segnalazione AMPK/ULK1 come precoce risposta di tipo adattativo allo stress energetico. Considerando da un lato l'ampio uso a livello mondiale dei composti azolici nel campo dell’agricoltura e dell’industria e dall’altro il ruolo chiave svolto dalle cellule del Sertoli come sistema di sostegno al processo di spermatogenesi, possiamo ipotizzare per questi composti un ruolo causale nell’insorgenza di condizioni di tossicità a livello riproduttivo.

Calreticulina (CALR) è uno chaperone da 46 kDa residente nel reticolo endoplasmatico responsabile della regolazione del calcio intracellulare e del folding proteico. CALR è anche in grado di regolare diverse funzioni al di fuori dal reticolo, tra cui la risposta allo stress cellulare. Nel 2013 sono state scoperte diverse mutazioni nell’esone 9 del gene CALR nelle Neoplasie Mieloproliferative (MPNs); in particolare sono state individuate 36 tipi diversi di mutazioni nel 60-70% dei pazienti con Trombocitemia Essenziale (ET) e Mielofibrosi Primaria (PMF) non mutati per JAK2 e MPL. Tali mutazioni consistono in inserzioni o delezioni che portano a frameshift con conseguente perdita del dominio C-terminale e della sequenza KDEL. In quest’ottica, l’alterazione strutturale di CALR comprometterebbe la sua funzionalità e la sua localizzazione cellulare. Infatti è stato dimostrato che il residuo C-terminale di CALR mutato interagisce con il recettore della trombopoietina (MPL), inducendo l’attivazione costitutiva della via JAK-STAT. Tuttavia, il preciso meccanismo d’azione dei mutanti di CALR è stato solo parzialmente chiarito e non ci sono informazioni sulla funzione di CALR Wild-Type (WT) durante l’emopoiesi fisiologica. Per chiarire il ruolo biologico di CALR WT nella proliferazione e nel differenziamento dei progenitori emopoietici (HPSCs), abbiamo eseguito esperimenti di silenziamento e overespressione in cellule CD34+ umane. I nostri dati mostrano che l’overespressione di CALR WT è in grado di promuovere il differenziamento eritroide e megacariocitario (MK). Parallelamente, il silenziamento di CALR WT induce una marcata repressione del lineages eritroide e MK. In accordo con questi risultati, l'analisi del profilo d’espressione genica (GEP) ha confermato che CALR WT è in grado di influenzare l'espressione dei geni del differenziamento eritroide e MK. Inoltre, l’analisi trascrizionale ha mostrato la modulazione di diversi geni coinvolti nella risposta allo stress ossidativo, allo stress del reticolo, al danno al DNA e in pathways biologici alla base dello sviluppo delle MPNs. Successivamente, per studiare l’effetto delle mutazioni di CALR sulla sua funzionalità in risposta allo stress ossidativo e del reticolo, abbiamo infettato le cellule K562 con vettori retrovirali esprimenti una delle due varianti mutate più comuni, CALRdel52 o CALRins5. Abbiamo deciso di utilizzare la linea cellulare K562, priva dell’espressione di MPL, per individuare ulteriori vie di segnalazione alla base della trasformazione MPL-mediata. In primo luogo, i nostri dati mostrano che i mutanti di CALR compromettono la capacità di rispondere allo stress del reticolo e riducono drasticamente l'attivazione dell’apoptosi mediata dalla UPR (Unfolded Protein Response). Inoltre abbiamo dimostrato che le mutazioni di CALR causano una maggiore sensibilità allo stress ossidativo con accumulo di danni ossidativi al DNA. Infine, abbiamo studiato la funzione del gene antiossidante OXR1, deregolato nell’analisi di GEP. La downregolazione di OXR1 altera la capacità delle cellule mutate di controbilanciare l’accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS), suggerendo il possibile coinvolgimento di OXR1 nell’alterata risposta allo stress ossidativo che si osserva nei mutanti di CALR. Nel complesso, i nostri risultati rivelano un nuovo ruolo di CALR WT nella regolazione del differenziamento eritroide e MK, due lineages coinvolti nelle MPNs. Inoltre, i mutanti di CALR incidono negativamente sulla risposta allo stress del reticolo, causando resistenza all’apoptosi. Infine, l’alterata risposta allo stress ossidativo che si osserva nei mutanti di CALR può causare instabilità genomica, promuovendo così la trasformazione tumorale.
Calreticulin (CALR) is a 46 kDa endoplasmic reticulum (ER) chaperone responsible for intracellular calcium regulation and protein folding. CALR is also able to perform different functions outside the ER, such as responses to cellular stress. In 2013, several mutations were discovered in exon 9 of CALR gene in Myeloproliferative Neoplasms (MPNs); notably 36 different types of mutations have been reported in 60-80% of JAK2 and MPL unmutated Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients. These mutations consist of insertions or deletions that induce a frameshift, resulting in a loss of the C-terminal portion domain and the KDEL sequence. In this view, structural alterations of CALR protein might impair its functionality and its cellular localization. Indeed, recent data demonstrated that C-terminal of CALR mutants interacts with the thrombopoietin receptor (MPL), inducing the constitutive activation of JAK-STAT pathway. However, the precise mechanism of action through which CALR mutants contribute to the development of MPNs has only been partially clarified and there is no available information on the function of Wild-Type (WT) CALR during physiological hematopoiesis. In order to elucidate the biological role of WT CALR in the proliferation and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells (HPSCs), we performed gene silencing and overexpression experiments in human CD34+ cells. Our data demonstrated that WT CALR overexpression is able to enhance erythroid and megakaryocyte (MK) differentiation. Consistently, WT CALR silencing induces a marked repression of MK and erythroid lineages. In agreement with these results, gene expression profile (GEP) analysis confirmed that WT CALR is able to affect the expression of genes of erythroid and MK differentiation. Moreover, transcriptome analysis showed the modulation of several genes implicated in oxidative stress, ER stress response, DNA damage and in several pathways already described as able to play a role in MPN development. Next, to investigate the impact of CALR mutations in oxidative and ER stress response, we transduced K562 cells with vectors expressing one of the two commonest CALR mutated variants, either CALRdel52 or CALRins5. We chose to perform experiments in the K562 cell line, devoid of MPL expression, in order to identify additional pathways whose alterations might cooperate with cellular transformation mediated by MPL activation. Firstly, we demonstrated that CALR mutants reduce the capability to respond to ER stress and significantly decrease the activation of the pro-apoptotic unfolded protein response (UPR) pathway. Then, we showed that CALR mutations induce increased sensitivity to oxidative stress, also driving the accumulation of oxidative DNA damage. Finally, we studied the function of the antioxidant gene OXR1, found deregulated in GEP analysis. The downregulation of OXR1 affects the capability of mutant cells to counterbalance reactive oxygen species (ROS) accumulation, suggesting that lack of OXR1 expression might be one of the molecular mechanisms responsible for the impaired oxidative stress response mediated by mutant CALR. Altogether, our results suggest a new role of WT CALR in the regulation of erythroid and MK differentiation, whose deregulation is crucial in MPNs. Moreover, CALR mutants negatively impact on the ability to respond to ER stress, conferring apoptosis resistance to the cells. Finally, the impairment in oxidative stress response due to CALR mutations can lead to genomic instability, thus promoting cell transformation.

In the last ten years, an increasing number of publications has highlighted the most interesting aspects of the biology of the colonial ascidian Botryllus schlosseri, indicating this non-vertebrate chordate as a reliable model organism for the study of gene expression, function and interaction pathways. The study of important cellular processes such as, for example, cell proliferation and death or stress and immune responses, is facilitated, in B. schlosseri, by its particular colonial life-cycle in which a continuos interchange from an apoptotic to a regenerative condition occurs. Each colony includes three different blastogenetic generations: adult filter-feeding zooids, primary buds on the adults and secondary buds on the primary buds. At the beginning of each cycle, new secondary buds originate from the atrial wall of primary buds and start to develop and grow until they become primary buds and, finally, zooids of the new adult generation replacing the old one. During the phase of generation change, also defined as take-over, these old zooids undergo a massive apoptosis and are gradually resorbed. The primary buds of the newly formed adults will then generate secondary buds. Although a morphological classification of the Botryllus blastogenetic cycle has been established, the complete lack of information on the type of genes involved, their role and level of expression remains a hard challenge. In order to add some new data, we used a library of Botryllus ESTs and considered specific sequences that showed a great BLAST similarity towards well-known vertebrate genes involved in apoptosis, proliferation and stress responses. Next, we were able to isolate their complete transcripts and we also analysed their site of synthesis and the differential expression between the main phases of the blastogenetic cycle, mid-cycle and take-over. We especially concentrated our work on the probable Botryllus orthologs of some key factors that are largely studied in vertebrates like the apoptotic BAX, AIF (Apoptosis Inducing Factor), PARP1 (Poly ADP-Ribose Polymerase 1), BIR Containing Proteins of the IAP family (Inhibitor of Apoptosis) and the transcription factor NF-kB1 (Nuclear Factor Kynase B 1); markers of cell proliferation such as PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), the Antigen KI67 and Nanos; antioxidant agents sensitive to stress conditions: the GCLM subunit of GCL (Glutathione Cysteine Ligase), GS (Glutathione Sintethase), GPx (Glutathione Peroxidase) and SOD (Superoxide Dismutase). Preliminary results obtained employing cDNA samples of two different colonies at the same blastogenetic stages of mid-cycle and take-over, indicate for five of the genes analyzed an unexpected general underexpression in the level of transcription in correspondence of the take-over phase. This work represents a first, detailed study of gene expression during the colonial blastogenetic cycle of B. schlosseri.
Nell’ultimo decennio, un numero crescente di pubblicazioni ha messo in luce gli aspetti più interessanti della biologia dell’ascidia coloniale B. schlosseri che, in quanto cordato non vertebrato, rappresenta un valido organismo modello per lo studio dell’espressione e della funzionalità genica ed il tipo di pathway. Il particolare ciclo coloniale di B. schlosseri, in cui si assiste alla continua alternanza tra morte per apoptosi e rigenerazione, offre un approccio semplificato allo studio di processi cellulari fondamentali come la proliferazione e la morte cellulare o la risposta immunitaria e allo stress. Ogni colonia include tre diverse generazioni blastogenetiche: zoidi adulti filtranti, gemme primarie sugli adulti e gemme secondarie su quelle primarie. All’inizio di ogni nuovo ciclo, le gemme secondarie si originano dalla parete atriale delle gemme primarie, cominciano a crescere e svilupparsi fino a quando diventano gemme primarie e alla fine zoidi adulti che sostituiscono quelli della vecchia generazione. Durante il cambio generazionale, una fase del ciclo chiamata anche regressione, gli zoidi senescenti vanno incontro a morte cellulare per apoptosi e vengono progressivamente riassorbiti. Nel frattempo, le gemme primarie della nuova generazione adulta sviluppano le gemme secondarie. Le diverse fasi del ciclo blastogenetico sono state classificate dal punto di vista morfologico, ma non sono disponibili dati completi sui geni coinvolti, sul ruolo e le modalità di espressione degli stessi. Per ottenere ciò, abbiamo utilizzato una libreria di EST specifiche di Botrillo, considerando le sequenze che presentavano in BLAST valori elevati di similarità rispetto ai geni dei vertebrati coinvolti nell’apoptosi, nella proliferazione e nella risposta allo stress. Dopo aver isolato i trascritti completi, abbiamo analizzato la localizzazione cellulare e le variazioni di espressione durante il ciclo blastognetico, tra fasi intermedie e cambio generazionale. In questo studio, abbiamo esaminato i probabili ortologhi in Botrillo di alcune proteine chiave, ampiamente indagate nei vertebrati, come i fattori apoptotici BAX, AIF (fattore di induzione dell’apoptosi), PARP1 (poly ADP-ribosio polimerasi 1), le componenti BIRC della famiglia IAP (inibitori dell’apoptosi) ed il fattore di trascrizione NF-kB1/p105; i marcatori di proliferazione PCNA (antigene nucleare di proliferazione cellulare), l’antigene KI67 e Nanos; gli agenti antiossidanti GCLM (subunità regolatoria della glutatione cistein ligasi GCL), GS (glutatione sintetasi), GPx (glutatione perossidasi) e SOD (superossido dismutasi). I risultati preliminari ottenuti mediante l’utilizzo di campioni di cDNA provenienti da due colonie diverse in entrambe le fasi, intermedie e cambio di generazione, del ciclo coloniale, mostrano che cinque trascritti sono sottoespressi durante il cambio generazionale. Il presente lavoro rappresenta un primo approfondito studio di espressione genica durante il ciclo blastogenetico coloniale di B. schlosseri.

La malattia di Fabry comprende una estrema varietà fenotipica in relazione con il grande numero di organi e sistemi coinvolti. La diagnosi di malattia di Fabry è complessa a causa del numero di organi/sistemi coinvolti e dei fenotipi clinici non specifici e della sua rarità. La progressione clinica della malattia si manifesta tra i 30-40 anni quando per i numerosi organi coinvolti compaiono manifestazioni cliniche quali insufficienza cardiaca, renale ed eventi cerebrovascolari. La morte di solito sopraggiunge durante la quarta/quinta decade di vita ed è secondaria all’interessamento cardiaco, renale o cerebrale anche se l’avvento della dialisi e della terapia enzimatica sostitutiva stanno sensibilmente prolungando la vita media dei pazienti. Seppur conosciuto in dettaglio il gene che causa la malattia e la sua funzione, ad oggi appare ancora poco chiaro il perché la malattia presenti un’ampia eterogeneità di presentazione clinica, anche all’interno della stessa famiglia. I fattori che potrebbero giocare un ruolo nella modulazione fenotipica della malattia di Fabry sono molteplici e non ancora studiati (fattori ambientali, fattori epigenetici, altri geni modulatori).mI mitocondri rappresentano “la centralina energetica della cellula” [202). Sono organelli intracellulari che svolgono diverse funzioni, la più importante delle quali è rappresentata dalla produzione di energia sotto forma di ATP mediante la fosforilazione ossidativa. Il mitocondrio è l’unico organellodelle cellule animali dotato di un proprio genoma, il DNA mitocondriale (mtDNA). In ogni mitocondrio si trovano da 2 a 10 copie di mtDNA, ed in ogni cellula più di 1000 copie. Il mtDNA è una molecola circolare di DNA a doppio filamento, costituito da 16569 paia basi, che codifica 37 geni: 13 codificano peptidi della catena respiratoria mitocondriale, 2 RNA ribosomali e 22 RNA transfer (tRNA). Tutte le altre proteine mitocondriali (comprese le 67 subunità che concorrono a formare i cinque complessi della catena respiratoria) sono codificate dal DNA nucleare. L’mtDNA umano è caratterizzato da un elevato tasso evolutivo che è 10 – 20 volte quello dei geni del nucleo; la sua variazione di sequenza si è perciò generata lungo linee di radiazione materna esclusivamente per l’accumulo sequenziale di nuove mutazioni. Nel tempo questo processo di divergenza molecolare ha dato origine ad entità monofiletiche dette aplogruppi. Un valido strumento per determinare se eventuali polimorfismi mitocondriali possano agire come fattori di suscettibilità o di protezione nell’insorgenza di malattie neurodegenerative è stato fornito proprio dall’analisi degli aplogruppi mitocondriali, definiti come clusters di genomi mitocondriali continente-specifici correlati all’evoluzione e definiti in base alla presenza di ancestrali e stabili polimorfismi.. La presenza di stabili siti polimorfici all’interno della regione codificante definisce l’aplogruppo, mentre la maggior parte delle mutazioni che si osservano sia nelle sequenze codificanti che nella regione di controllo e che si realizzano all’interno di preesistenti aplogruppi definiscono il tipo individuale di mtDNA, o aplotipo [172]. È stato ipotizzato che variazioni all’interno del mtDNA possano causare sottili differenze nelle proteine codificate ed indurre una modificazione, seppur minima, nelle attività della fosforilazione ossidativa e nella produzione di specie reattive dell’ossigeno, o viceversa agire come fattori protettivi, con effetto benefico sulla catena di trasporto di elettroni e/o per la produzione di radicali liberi. In questi ultimi anni la ricerca è stata finalizzata alla comprensione di un eventuale ruolo degli aplogruppi nella modulazione dell’espressione dei geni mitocondriali durante l’evoluzione e i processi di adattamento del genere umano; si è iniziato inoltre ad indagare se la variabilità del genoma mitocondriale potesse svolgere un’azione protettiva o, viceversa, agire come fattore di rischio nell’insorgenza di malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (192), la malattia di Friedreich (203), la Sclerosi Laterale Amiotrofica [196]), la malattia di Alzheimer e Corea di Huntington [172]. Benchè numerose mutazioni del gene GLA siano state associate alle forme classiche e tardive, una definitiva correlazione genotipo-fenotipo none stata dimostrata e la diagnosi e classificazione della malattia on possono essere effettuate solo su base genetica. Il deposito dei substrati è correlato al danno tissutale nella malattia di Fabry; tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti restano non completamente conosciuti. I pazienti affetti da malattia di Fabry presentano un importante danno 44 ossidativo proteico e lipidico, ridotte difese antiossidanti e aumentali livelli di citochine e biomarcatori infiammatori [204–205]. L’eccesso di GB3 intracellulare induce stress ossidativo e un up-regulation dell’espressione delle molecole di adesione cellulare nelle cellule endoteliali vascolari [206]. Inoltre è stato ipotizzato che si verifica uno stato proossidante che è correlato e sembra essere indotto dal GB3 nei pazienti con malattia di Fabry [207]Lo scopo del nostro progetto multicentrico è stato quello di valutare il ruolo dello stress ossidativo nella malattia di Fabry. In particolare abbiamo valutato (I) se vi sono segni di stress ossidativo nel sangue; (II) se esiste un’associazione tra biomarcatori di stress ossidativo e manifestazion i cliniche della malattia e/o una differenza tra forma classica e varianti late onset; (III) se i parametri dello stress ossidativo nel tempo si correlano con il Lyso-Gb3 e l’insorgenza e progressione della malattia, in un sottogruppo di 8 soggetti/paziente naive al trattamento con normali livelli di Lyso-Gb3, al fine di valutare se i biomarkers di stress ossidativo possano presentare marcatori precoci della malattia Questo progetto si proponeva inoltre di valutare la frequenza degli aplogruppi mitocondriali, un loro possibile ruolo di suscettibilità genetica nel determinismo della malattia di Fabry, e se essi potessero influenzare lo stato di stress ossidativo plasmatico in tali pazienti; tuttavia l’analisi dei dati, relativi a questo secondo obiettivo , sul gruppo dei pazienti arruolati non ha permesso di ottenere risultati rilevanti, chiari e definitivi pertanto il nostro gruppo si propone di proseguire un ulteriore approfondimento in questo campo di ricerca scientifica, raccogliere più dati estendendo l’analisi su un maggior numero di pazienti e quindi coinvolgendo più centri.
Fabry disease comprises a wide phenotypic variability in relation to the large number of organs and systems involved. The diagnosis of Fabry disease is complex due to the number of organs/systems involved, to the non-specific clinical manifestationa and to its rarity. Clinical progression of the disease occurs between 30-40 years when clinical manifestations because of the involvement of important organs such as heart failure, renal failure and cerebrovascular events. Death usually occurs during the fourth/fifth decade of life and it is secondary to cardiac, renal or cerebral involvement even if the advent of dialysis and enzyme replacement therapy are significantly prolonging the average life of patients. Although the gene that causes the disease and its function is known in detail, it still appears today unclear the wide heterogeneity of clinical presentation that characterizes this disorder, within the same family, too. Factors that might play a role in phenotypic modulation of Fabry disease are multiple and not yet studied (environmental factors, epigenetic factors, other modulatory genes).Mitochondria represent "the energy central unit of the cell" [202].They are intracellular organelles that perform different functions, the most important of which is represented by the production of energy in the form of ATP through oxidative phosphorylation. The mitochondrion is the only organelle with its own genome, mitochondrial DNA (mtDNA). In each mitochondrion there are from 2 to 10 copies of mtDNA, and in each cell more than 1000 copies. The mtDNA is a circular molecule of double-stranded DNA, consisting of 16569 base pairs, encoding 37 genes: 13 encode mitochondrial respiratory chain peptides, 2 ribosomal RNAs and 22 RNAs transfer (tRNA). All other mitochondrial proteins (including the 67 subunits that contribute to form the five complexes of the respiratory chain) are encoded by nuclear DNA. Human mtDNA is characterized by a high evolutionary rate that is 10 – 20 times that of genes of the nucleus; its sequence variation was therefore generated along lines of maternal radiation exclusively for the sequential accumulation of new mutations. Over time this process of molecular divergence has given rise to monophyletic entities called haplogroups. A valid tool to determine if any mitochondrial polymorphisms can act as susceptibility or protective factors in the onset of neurodegenerative diseases was provided precisely from the analysis of mitochondrial haplogroups, defined as clusters of mitochondrial genomes continent-specific related to evolution and defined by the presence of ancestral and stable polymorphisms. The presence of stable polymorphic sites within the coding region defines the haplogroup, on the other hand most of the mutations that are observed are both in the coding sequences and in the control region and that occur within pre-existing haplogroups define the individual mtDNA type, or haplotype [172]. It has been hypothesized that variations within the mtDNA can cause subtle differences in the encoded proteins and induce a modification, albeit minimal, in the activities of oxidative phosphorylation and in the production of reactive species of oxygen, or they act as protective factors, with a beneficial effect on the transport chain of electrons and/or for the production of free radicals. In recent years, research has been aimed at understanding a possible role of haplogroups in the modulation of mitochondrial gene expression during evolution and in the human processes of adaptation ; it has also begun to investigate whether the variability of the genome mitochondrial could perform a protective action or, conversely, it acts as a risk factor in the onset of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease (192), the disease of Friedreich (203), Amyotrophic Lateral Sclerosis [196]), Alzheimer's disease and Huntington [172]. Although numerous mutations of the GLA gene have been associated with the classic and late forms, one definitive genotype-phenotype correlation has not been demonstrated and the diagnosis and classification of disease can only be made on a genetic basis. Substrate deposition is related to tissue damage in Fabry disease; however, the underlying molecular mechanisms remain unclear fully known. Patients with Fabry disease have an important impairment of protein and lipid oxidative processes , reduced antioxidant defenses and increased levels of inflammatory cytokines and biomarkers [204–205]. the high level intracellular GB3 induces oxidative stress and up-regulation of the expression of cell adhesion molecules in vascular endothelial cells [206]. Furthermore it has been hypothesized that a pro-oxidant state occurs which is related and appears to be induced by GB3 in patients with Fabry disease [207]The aim of our multicenter project was to evaluate the role of oxidative stress in Fabry disease. In particular we evaluated (I) whether there are signs of oxidative stress in the blood; (II) whether there is an association between biomarkers of oxidative stress and clinical manifestations of the disease and/or a difference between the classic form and late onset variants; (III) whether the stress parameters over time correlate with Lyso-Gb3 and disease onset and progression, in a subset of 8 treatment-naive subjects/patients with normal Lyso-Gb3 levels, in order to evaluate whether biomarkers of oxidative stress may present early markers of the disease This project also aimed to evaluate the frequency of mitochondrial haplogroups, their possible role of genetic susceptibility in the determinism of Fabry disease, and if they could influence the state of plasma oxidative stress in such patients; however, the analysis of the data, concerning this second aim, on the group of enrolled patients did not allow to obtain relevant , clear and definitive results therefore our group proposes to pursue a further deepening in this field of scientific research, to collect more data by extending the analysis on a greater number of patients and therefore involving more centres.

La tossicità dei farmaci antitumorali rappresenta una delle principali limitazioni nella pratica clinica. Tra gli effetti collaterali dei farmaci chemioterapici, la neurotossicità periferica è uno dei più invalidanti per i pazienti malati di cancro. Oxaliplatino (OHP), un composto ampiamente usato per il trattamento del carcinoma del colon-retto metastatico, è uno dei farmaci antineoplastici più neurotossici. I pazienti possono sviluppare due forme clinicamente distinte di neuropatia periferica: una forma acuta aggravata dal freddo ed una neuropatia sensoriale distale cronica. A causa della mancanza di efficaci terapie farmacologiche in grado di prevenire e/o alleviare i sintomi neuropatici, la riduzione o l'interruzione della dose di OHP è spesso necessaria. Nonostante approfondite ricerche, la patogenesi della neurotossicità periferica indotta da OHP (OIPN) è ancora in gran parte sconosciuta. In letteratura sono descritti numerosi studi preclinici in vivo, diversi tra loro per la schedula di trattamento con OHP utilizzata, tuttavia la caratterizzazione della neurotossicità periferica è limitata. Infatti, per verificare l'insorgenza della OINP, oltre alla valutazione del dolore neuropatico, dovrebbero essere effettuate analisi neurofisiologiche ed istopatologiche. La disfunzione mitocondriale è stata recentemente suggerita come possibile meccanismo coinvolto nell'insorgenza della neurotossicità periferica indotta dai farmaci chemioterapici. Il primo obiettivo di questo lavoro è stato confrontare tre modelli murini di OIPN pubblicati con il modello murino di OIPN attualmente in uso nel nostro laboratorio, mediante una valutazione multimodale. Inoltre, dato il potenziale ruolo dello stress ossidativo nella patogenesi della neuropatia periferica, è stata analizzata la possibilità che il trattamento con OHP potesse indurre stress ossidativo e disfunzione mitocondriale. I risultati di questo studio indicano che una singola dose di OHP 5 mg/kg somministrata per via endovenosa è in grado di riprodurre le caratteristiche cliniche della forma acuta della OIPN. D'altra parte, al fine di riprodurre le caratteristiche cliniche della OIPN cronica, è necessario un trattamento prolungato con OHP. Sono state osservate alterazioni delle ampiezze dei nervi caudali e digitali, allodinia meccanica ed una riduzione della densità delle fibre nervose intraepidermiche solo dopo 4 settimane di OHP 5 mg/kg somministrato per via endovenosa due volte a settimana, schedula attualmente utilizzata nel nostro laboratorio. Pertanto, il nostro modello di laboratorio OHP è quello che meglio mima le caratteristiche della OIPN. Per quanto riguarda l'aspetto patogenetico, questo studio non ha ben chiarito il ruolo della disfunzione dei mitocondri e dello stress ossidativo nell'insorgenza della OIPN. I livelli di stress ossidativo, dosando i TBARS, non sono aumentati considerevolmente nei DRG e nei nervi caudali dopo il trattamento con OHP con qualsiasi schedula utilizzata, mentre i nervi sciatici hanno mostrato un aumento dei livelli di TBARS a 2 settimane dopo una dose cumulativa di 20 mg/kg (endovena) ed a 4 settimane dopo 30 mg/kg (intraperitoneale). Inoltre, un aumento significativo dei livelli del complesso I della catena respiratoria ed una riduzione della forma fosforilata di DRP1 sono stati rilevati nei DRG prelevati dagli animali trattati con la nostra schedula di trattamento per 4 e 2 settimane, rispettivamente. In conclusione, un modello animale affidabile dovrebbe essere in grado di valutare la neurotossicità acuta e cronica al fine di studiare i meccanismi alla base della OIPN. Definire un metodo di valutazione standard sarebbe utile per ottenere risultati coerenti tra diversi gruppi di lavoro. Inoltre, la disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo possono essere implicati nell'insorgenza della OIPN, ma sono necessarie ulteriori indagini.
The toxicity of anticancer drugs represents one of the major limitation in their clinical use. Among the side effects of chemotherapy, peripheral neurotoxicity is one of the most disabling for cancer patients. Oxaliplatin (OHP) is one of the most neurotoxic antineoplastic drug widely used for the treatment of metastatic colorectal cancer. Patients undergoing OHP-regimen experience two clinically distinct forms of peripheral neuropathy: an acute cold-enhanced form and a chronic distal sensory neuropathy. Due to the lack of effective pharmacological therapies in preventing and/or alleviating neuropathic symptoms, OHP dose reduction or interruption is often mandatory. Despite extensive investigation, the pathogenesis of OHP-induced peripheral neurotoxicity (OIPN) is still largely unknown. In literature several preclinical in vivo studies, different from each other in schedules of OHP treatment, are described but the characterization of peripheral neurotoxicity is limited. In fact, to verify the OINP onset, in addition to the evaluation of neuropathic pain, neurophysiological and histopathological analyses should be assessed. Mitochondrial dysfunction has recently been suggested as putative mechanisms possibly involved in the onset and development of chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity. Mitochondrial dysfunction and associated oxidative stress may result in chronic neuronal energy impairment leading to neuropathic symptoms. The first aim of this study was to compare OIPN mouse models reported in three published studies with OIPN mouse model currently used in our laboratory, using a multimodal assessment. Moreover, given the potential role of oxidative stress in the pathogenesis of peripheral neuropathy, the possibility that OHP treatment could induce oxidative stress and eventually mitochondrial dysfunctions has also been analysed. Taken together, the results of this study indicate that a single dose of OHP 5 mg/kg administrated in tail vein is able to reproduce the clinical features of acute OIPN. On the other hand, to reproduce the clinical features of chronic OIPN, prolonged OHP treatment is required. In fact, alterations in caudal and digital nerves amplitudes and mechanical allodynia together with a reduction in intraepidermal nerve fiber density were observed only after 4 weeks of OHP 5 mg/kg administrated intravenously twice a week, the schedule currently used in our laboratory. Changes in DRG morphometry were instead more commonly observed also in the other OHP schedules reproduced in this study. As a whole, these results suggested that our laboratory OHP model is the one which better mimic the OIPN features. Regarding the pathogenic aspect, this study is far from clarifying the role of mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the onset of OIPN, even if some results have been obtained. In general, oxidative stress levels measured with TBARS assay did not increase considerably in DRG and caudal nerves following OHP treatment with any schedule used, whereas sciatic nerves showed an increase in TBARS level at 2 weeks after a cumulative dose at 20 mg/kg (intravenous administration) and at 4 weeks after 30 mg/kg (intraperitoneal administration). Furthermore, a significant increase in protein expression levels of respiratory chain complex I in DRG collected from the animals treated for 4 weeks with our OHP schedule was detected. In the same samples, a decrease in phosphoryled form of DRP1 was observed closely approximating significance after 2 weeks of OHP treatment, indicating reduced mitochondrial fission process. In conclusion, a reliable animal model should be able to evaluate acute and chronic neurotoxicity in order to study the mechanism underlying OIPN. Setting a standard method of evaluation would be useful to obtain consistent results among different workgroups. Moreover, mitochondrial dysfunction and oxidative stress may be implicated in the onset of OIPN but further investigations are required.