Dissertations / Theses on the topic 'Structures secondaires de protéines'

Ce travail présente de nouvelles méthodes pour extraire des informations structurales à partir d'une séquence en acides aminés et l'application de ces méthodes à la modélisation des protéines. Nous avons mis au point un algorithme d'alignement multiple pour des séquences protéiques basé sur l'algorithme de Needleman et Wunsch, mais qui n'est pas limité par le nombre et la taille des séquences protéiques à aligner. Nous avons développé une méthode de prédiction des structures secondaires, la Méthode des Homologues, basée sur les similarités entre peptides, qui prédit correctement 63% des résidus d'acides aminés, pour trois états. Cette méthode prédit correctement 87% des résidus d'une protéine homologue avec une protéine de la base de données. Nous avons utilisé un modèle simplifié de la chaîne polypeptique pour déterminer les limites des calculs par minimisation de l'énergie. Nous avons appliqué ces techniques à la modélisation des protéines de choc thermique (HSP90), du domaine liant l'ADN des protéines régulatrices FixK et Fnr et du domaine liant l'hème de la nitrate réductase de tabac.

Caractériser la structure tridimensionnelle des protéines avec les structures secondaires classiques est assez pauvre structurellement. Nous avons donc développé une nouvelle méthodologie pour concevoir des séries de petits prototypes moyens nommés Blocs Protéiques (BPs) qui permettent une bonne approximation des structures protéiques. L'analyse de la spécificité des blocs protéiques a montré leur stabilité et leur spécificité sur le plan structural. Le choix final du nombre de BPs est associé a une prédiction locale correcte.
Cette prédiction se base avec une méthode bayésienne qui permet de comprendre l'importance des acides aminés de maniè;re simple. Pour améliorer cette prédiction, nous nous sommes bases sur deux concepts : (i) 1 repliement local -> n séquences et (ii) 1 séquence -> n repliements. Le premier concept signifie que plusieurs types de séquences peuvent être associes a la même structure et le second qu'une séquence peut-être associée a plusieurs type de repliements. Ces deux aspects sont développés en se basant sur la recherche d'un indice de fiabilité lie a la prédiction locale, pour trouver des zones de fortes probabilités. Certains mots, i.e. successions de blocs protéiques apparaissent plus fréquemment que d'autres. Nous avons donc défini au mieux quelle est l'architecture de ces successions, les liens existants entre ces différents mots.
Du fait de cette redondance qui peut apparaìtre dans la structure protéique, une méthode de compactage qui permet d'associer des structures structurellement proches sur le plan local a été mise au point. Cette approche appelée "protéine hybride" de conception simple permet de catégoriser en classes "structurellement dépendantes" l'ensemble des structures de la base de données protéiques. Cette approche, en plus du compactage, peut être utilisée dans une optique différente, celle de la recherche d'homologie structurale et de la caractérisation des dépendances entre structures et séquences.

Les fibres élémentaires dépectinisées de lin mature (linum usitatissimum L. ) renferment, en association forte avec les dépôts secondaires de cellulose, des polymères incrustants variés. Ces polymères pourraient avoir une influence notable sur les propriétés mécaniques, et notamment sur la résistance aux tensions, de ces fibres. De nombreux polymères incrustant les parois secondaires des fibres élémentaires dépectinisées de lin ont ete caractérisés, après extraction chimique ou enzymatique. Le composé majoritaire est un long (1→4)-galactane. Ce polymère pourrait constituer les ramifications latérales de rhamnogalacturonanes de type I. Outre les polysaccharides, des protéines ont aussi été identifiées. L'une de ces protéines appartient au groupe des protéines riches en leucine, les deux autres appartenant au groupe des protéines pariétales de structure, et plus particulièrement aux protéines riches en glycine et aux arabinogalactane-protéines. Le rôle possible de chacun de ces incrustants dans les fibres élémentaires de lin est abordé. La possibilité d'une interaction entre les arabinogalactane-protéines et les (1→4)-galactanes a été mise en évidence. Les modalités de cette interaction sont discutées.

J'ai basé mon travail sur une représentation des protéines développée au laboratoire : l'alphabet structural des Blocs Protéiques (BPs). Cet alphabet permet de décrire et d'étudier les conformations locales composant les structures des protéines. Grâce à cette représentation j'ai pu m'intéresser, dans un premier temps, à l'étude structurale d'irrégularités observées au sein des feuillets 13, les β-bulges. Ils sont décrits dans la littérature comme conservés au sein des familles protéiques et impactant la structure, et la fonction des protéines. J'ai cherché à répondre à la question : les 13-bulges sont-ils réellement conservés au sein de repliements homologues ? Dans un second temps, je me suis intéressé aux modifications post-traductionnelles (PTMs) qui par essence correspondent à des modifications très diverses des résidus protéiques. Ces PTMs sont de plus en plus étudiées dans le contexte structural, et leur impact sur la flexibilité est de plus en plus pointé du doigt. J'ai ainsi développé une base de données qui répertorie les structures contenant des modification: annotées comme PTMs. Grâce à ces données j'ai essayé de répondre à la question : les PTMs ont-elles un effet sur la structure des protéines ? Cet effet impact-il globalement ou localement la structure des protéines ? Enfin dans la dernière partie de ma thèse, je me suis intéressé à la corrélation entre les conformations locales et la flexibilité du squelette polypeptidique. Par le biais de nombreuses simulations de dynamique moléculaire, j'ai cherché à quantifier cette corrélation, de manière systématique, puis au regard de la présence de β-bulges et de sites de PTMs. Ces derniers travaux amèneront un nouveau regard sur la méthode de prédiction de la flexibilité développée au laboratoire
I based my work on a representation of proteins developed in the laboratory: the structural alphabet of Protein Blocks (PBs). This alphabet is used to describe and study the local conformations of protein structures. With this representation I have firstly studied the structural irregularities observed in the 13 sheets, the β-bulges. They are described in the literature as conserved among protein families and impacting the structure and function of proteins. I tried to answer the question: are the β-bulges actually conserved within homologs folds? In a second time, I studied the post-translational modifications (PTMs), which essentially correspond to very different modifications of the protein residues. These PTMs are increasingly studied in the structural context, and their impact on the flexibility is more pointed. I have developed a database that curates the structures containing annotated modifications as PTMs. With this data I have tried to answer the question: Did the PTMs affect protein structure? This effect is global or local in protein structure? Finally in the last part of my thesis, I studied the correlation between local conformations and flexibility of the polypeptide backbone. Through numerous molecular dynamics simulations, I have attempted to quantify this correlation, systematically, and in view of the presence of β-bulges and PTMs sites. These works bring a new look on the prediction method developed in the laboratory flexibility

Pour le calcul de structures, la principale source d'informations, issues des expériences de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), sont les Effets Nucléaires d'Overhauser (NOEs) qui nous renseignent sur les distances entre certains protons de la molécule étudiée. Le logiciel ARIA (pour "Ambiguous Restraints for Itérative Assignment") sert à analyser et interpréter les données RMN, afin de déterminer un ensemble de structures tridimensionnelles compatibles avec les données expérimentales. Pour cela, ARIA utilise l'ensemble des mesures de distances issues des NOEs, sous forme de contraintes imposées in silico a la molécule. De récentes analyses ont montré que les erreurs des NOEs suivent une distribution de type log-normal, suggérant ainsi l'utilisation d'un nouveau potentiel de contraintes de distances, le potentiel log-harmonique. Le but de ma thèse a donc été de montrer l'efficacité d'un tel potentiel dans l'amélioration de la qualité des structures déterminées par RMN. La première partie de ma thèse se penche sur l'étude du comportement de ce potentiel dans des exemples de structures bien connues et dont les données ont été préparées manuellement. Dans une seconde partie, le recalcul de 398 structures RMN a permis de montrer l'amélioration globale de la qualité des structures calculées avec le potentiel log-harmonique. Enfin, dans une troisième partie, l'étude de deux protéines a permis de mettre en évidence les propriétés du potentiel log-harmonique quant à la détection d'erreurs dans les structures
For structure calculation, the main source of information from Nuclear Magnetic Resonance (NMR experiments is the Nuclear Overhauser Effects (NOEs), which provide information about the distance between some protons of the molecule studied. The ARIA software package (for "Ambiguous Restraints for Iterative Assignment") is used to analyse and interpret NMR data, to determine a set of three-dimensional structures consistent with experimental data. ARIA uses the above measures in the form of distance constraints imposed, in silico, on the molecule. To impose these distances, the software used so far the "Soft Square" potential which presents a window of tolerance around the target distance measured experimental in order to take into account the uncertainties on the experimental data. A Recent analysis has shown the NOE errors follow a log-normal distribution, suggesting the use of a new log-harmonic potential. The aim of my thesis has been to show the effectiveness of the log-harmonic potential in improving the quality of structures determined by NMR. The first part of my thesis focuses on studying the behaviour of the potential with some examples of structures well known and whose data have been manually prepared. In second part, the recalculation of 398 NMR structures has demonstrated the overall improvement of the qualit of structures calculated with the log-harmonic potential. Finally, in a third part, the study of two protein allowed identifying the properties of the log-harmonic potential for error detection in structures

Contexte. Les protéines transmembranaires ont une importance considérable tant au niveau de la survie d'une cellule qu'au niveau de ces interactions avec les autres cellules. En raison de contraintes techniques, la cristallisation de ce type de protéine demeure très complexe, ce qui limite grandement l’exploration de leur structure. Pour contourner ces difficultés, différents outils de prédiction ont été développés,en se fondant originellement sur l'hydrophobicité des régions enfouies dans la membrane. Méthode. L'outil développé repose sur une dérivation de la moyenne d'hydrophobicité calculée sur deux ensembles de taille de fenêtres. Le premier ensemble (G1) contient des petites tailles de fenêtres ce qui correspond à des événements locaux, tandis que le second (G2) correspond à des tailles de fenêtres plus larges, adaptées à la taille des hélices formant certaines protéines transmembranaires. La variation d'hydrophobicité est obtenue en dérivant les moyennes d'hydrophobicité. Un consensus est établi pour chaque groupe, et les résultats sont comparés à un ensemble de protéines transmembranaires cristallisées. Résultats. Les variations d'hydrophobicité G2 sont liées aux extrémités des hélices transmembranaires,tandis que les variations G1 sont en relation avec la limites des structures et certaines irrégularités structurelles.Ces résultats nous ont amené à introduire une nouvelle notion : les unités transmembranaires(TMU). Les TMU consistent en un ensemble de sous-structures qui composent les structures transmembranaires
Background. Few high-resolution structures of integral membranes proteins are available, as crystallization of such proteins needs yet to overcome too many technical limitations. Nevertheless, prediction oftheir transmembrane (TM) structure by bioinformatics tools provides interesting insights on the topology of these proteins.Method. We describe here how to extract new information from the analysis of hydrophobicity variations or hydrophobic pulses (HPulses) in the sequence of integral membrane proteins using the Hydrophobic Pulse Predictor, a new tool we developed for this purpose. To analyze the primary sequence of 70 integralmembrane proteins we defined two levels of analysis : G1-HPulses for sliding windows of n=2 to 6 andG2-HPulses for sliding windows of n=12 to 16.Results. The G2-HPulse analysis of 541 transmembrane helices allowed the definition of the new conceptof transmembrane unit (TMU) that groups together transmembrane helices and segments with potentialadjacent structures. In addition, the G1-HPulse analysis identified helix irregularities that correspondedto kinks, partial helices or unannotated structural events. These irregularities could represent key dynamicelements that are alternatively activated depending on the channel status as illustrated by the crystalstructures of the lactose permease in different conformations. Our results open a new way in the understanding of transmembrane secondary structures : hydrophobicity through hydrophobic pulses stronglyimpacts on such embedded structures and is not confined to define the transmembrane status of aminoacids

La NCp7 est impliquée dans de nombreuses étapes du cycle viral notamment la rétrotranscription. Ceci en fait une cible potentielle pour un traitement anti-HIV. Par son activité chaperonne, elle permet de stimuler le premier saut de brin. Ce dernier consiste en la déstabilisation et l'hybridation des séquences TAR et cTAR du génome viral. C'est à l'aide de séquences cTAR marquées à leurs extrémités 3' et 5' par des chromophores et différentes techniques de spectroscopie de fluorescence et d'absorption que nous avons pu mettre en évidence l'importance des structures primaire et secondaire de la NCp7 et de cTAR dans le premier saut de brin. L'activité déstabilisatrice est fortement dépendante des bulges et de la boucle interne de cTAR. D'autre part, cette activité dépend également de la présence du Trp37 ainsi que de la présence des deux doigts de zinc de la NCp7 dans leur conformation native. Ensuite, nous avons pu mettre en évidence que la NCp7 favorisait la formation de l'homodimère de mutants de la partie haute de cTAR par formation d'un complexe boucle-boucle. Finalement, nous avons étudié une nouvelle sonde fluorescente analogue à l'adénine (la 8-vinyl-déoxyadénosine) qui est une solution alternative à la 2-aminopurine.

Les protéines transmembranaires canaux-β (TMBs) se trouvent dans les membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries ainsi que des chloroplastes. Elles traversent entièrement la membrane cellulaire et exercent différentes fonctions importantes. Vu qu'il y a un petit nombre des structures des TMBs déterminées, en raison des difficultés avec les méthodes expérimentales, il est douteux que ces approches puis- sent bien trouver et prédire les TMBs qui ne sont pas homologues avec celles connues. Nous construisons un modèle de graphe pour la classification et la prédiction de structures super-secondaires permutées des TMBs à partir de leur séquence d'acides aminés, en se basant sur la minimisation d'énergie. Le modèle ne dépend essentiellement pas de l'apprentissage. Les algorithmes sont rapides, robustes avec des performances com- parables à celles des meilleures méthodes actuelles qui utilisent l'apprentissage. Cette méthode peut être donc utile pour le screening des génomes. Outre la performance de prédiction et de classification, cette étude donne une vue plus profonde de la structure des TMBs en tenant compte des contraintes physicochimiques des membranes biologiques. Les structures permutées prédites peuvent aussi aider à mieux comprendre le mécanisme du repliement des TMBs.

L'ARN, acide ribonucléique, est un des composants fondamentaux de la cellule. La majorité des ARN sont constitués d'une séquence orientée de nucléotides notés A,C,G et U. Une telle séquence se replie dans l'espace en formant des liaisons entre les nucléotides deux à deux. La fonction des ARN au sein de la cellule est liée à la conformation spatiale qu'ils adoptent. Ainsi, il est essentiel de pouvoir comparer deux ARN au niveau de leur conformation, par exemple pour déterminer si deux ARN ont la même fonction. On distingue trois niveaux dans la structure d'un ARN. La structure primaire correspond à la séquence de nucléotides, la structure secondaire est constistuée de la liste des liaisons formées entre les nucléotides tandis que la structure tertiaire consiste en la description exacte de la forme tridimensionnelle de la molécule (coordonnées de chaque nucléotide). Bien que la structure tertiaire soit celle qui décrit le mieux la forme spatiale de l'ARN, il est admis que deux ARN ayant une fonction moléculaire similaire ont une structure secondaire proche. Au niveau de la structure secondaire, une fois les liaisons nucléotidiques formées, on peut distinguer des éléments de structure secondaire telles que les hélices, les boucles multiples, les boucles terminales, les boucles internes et les renflements. Essentiellement deux formalismes ont été à ce jour proposés pour modéliser la structure secondaire des ARN. Les séquences annotées par des arcs permettent de représenter la séquence de l'ARN, les arcs codant alors pour les liaisons entre les lettres (nucléotides de la séquence). Les 2-intervalles, généralisation des séquences annotées, sont formés par deux intervalles disjoints. La structure secondaire peut alors être vue comme une famille de 2-intervalles. Enfin, les arbres racinés ordonnés offrent de nombreuses possibilités pour coder la structure secondaire, du niveau nucléotidique au niveau du réseau des boucles multiples. L'un des inconvénients de ces approches est qu'elles modélisent la structure secondaire de l'ARN selon un point de vue particulier (nucléotides, hélices etc). Nous proposons une nouvelle modélisation, appelée RNA-MiGaL, constituée de quatre arbres liés entre eux représentant la structure à différents niveaux de précision. Ainsi, le plus haut niveau code pour le réseau de boucles multiples considéré comme le squelette de la molécule. Le dernier niveau quant à lui détaille les nucléotides. Pour comparer de telles structures nous utilisons la notion de distance d'édition entre deux arbres. Cependant, au vu de certains limitations de celle-ci pour comparer des arbres représentant la structure secondaire à un haut niveau d'abstraction, nous avons introduit une nouvelle distance d'édition qui prend en compte deux nouvelles opérations d'édition: la fusion de noeud et la fusion d'arc. A l'aide de cette nouvelle distance, nous fournissons un algorithme permettant de comparer deux RNA-MiGaLs. Celui-ci est implémenté au sein d'un programme permettant la comparaison de deux structures secondaires d'ARN.

Ce travail presente trois methodes de prediction de la structure secondaire des proteines par analyse spectrale de la sequence d'hydrophobicite. Une etude comparative preliminaire sur 41 echelles d'hydrophobicite ainsi que sur differentes methodes d'analyse spectrale classiques et parametriques a ete menee pour determiner l'echelle optimale et la methode spectrale la mieux adaptee a chaque type de prediction. Les parametres des methodes de prediction ont ete evalues a partir d'une base de donnees, comportant 1028 chaines peptidiques ayant moins de 25% d'homologie (223157 residus). Les trois methodes mises au point consistent en : 1) une prediction globale sur une proteine ou un segment proteique, donnant 53. 5% de bonnes predictions selon quatre conformations : helices alpha (h), feuillets beta (b), structures aleatoires (c) et helices plus feuillets (hb), 2) une prediction localisee des helices et des feuillets sans tenir compte des residus de structure aleatoire (80% de bonnes predictions selon trois conformations : h, b et hb) et 3) une prediction acide amine par acide amine (41. 75% de bonnes predictions sur trois conformations : h, b et c). Pour cette derniere methode, on peut calculer la fiabilite de prediction de chaque residu. L'introduction d'un seuil augmente la fiabilite de prediction sur un nombre reduit de residus (par exemple en fixant le seuil de prediction des helices a 70% on obtient 65. 5% de bonnes predictions sur 8. 31% des residus).

L'objectif général de ces travaux a été de contribuer à élucider les mécanismes moléculaire qui régissent les interactions protéine-ligand dans la membrane. La première protéine concernée est le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) le ligand d'intérêt, le cholestérol. PBR est impliquée dans la biosynthèse des stéroïdes, participant à la translocation du cholestérol de la membrane externe de la mitochondrie à membrane interne. Ne disposant d'aucune information structurale sur PBR, nous nous sommes d'abord intéressés à la structure de PBR en déterminant par RMN la conformation des fragments synthétiques recouvrant les domaines transmembranaires prédits puis en étudiant la protéine recombinante entière par RMN et dichroïsme circulaire. Différentes études couplant mutations modélisations ont ensuite été effectuées, qui ont permis de caractériser l'interaction PB cholestérol et le rôle de résidus clés dans cette interaction. La deuxième partie de la thèse concerne l'interaction du domaine extracellulaire de VPAC un récepteur couplé aux protéines G, avec le neuropeptide vasointestinal (VIP), qui joue un rôle important en physiopathologie humaine. Cette étude est basée sur la construction d'un mode structural par homologie du domaine de VPAC1. En utilisant la conformation du VIP obtenue par RMN et des données expérimentales de photoaffinité, nous avons pu proposer un mode d'interaction VIP-VPAC1 par docking, et caractériser cette interaction par simulation de dynamique moléculaire. Ce travail s'intègre dans la caractérisation des bases moléculaires de reconnaissance du VIP par son récepteur et plus généralement dans la compréhension d processus d'interaction ligand-récepteur dans la famille des RCPG de classe B
The main goal of this work has been to contribute to elucidate the molecular mechanism underlying protein-ligand interaction within the membrane. The first protein studied is the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) and its ligand interest, cholesterol. PBR is involved in steroid biosynthesis, through the cholesterol translocation from the outer to the inner membrane of mitochondria. In the absence of any available structural information on PBR, our first work has been to focus on the PBR structure, by determining from NMR data the conformation of synthetic fragments encompassing the predicted transmembrane domains and then by studying the entire recombinant protein by NMR and circular dichroism. In second step, several studies combining mutagenesis and molecular modeling have be performed which allow to characterize PBR-cholesterol interaction, and the role of key residues this interaction. The second part of our work is devoted to study the interaction of the extracellular domain VPAC1, a G-protein coupled receptor, with the vasointestinal neuropeptide (VIP), which plays important role in human physiopathology. From the VIP conformation obtained by NMR a photoaffinity data, we were able to propose a molecular model of the VIP-VPAC1 interaction using docking protocols and to characterize this interaction using molecular dynamics simulation. Our result contributes to elucidate the molecular basis of VIP recognition and more generally understand the ligand-receptor interaction process of the class B family of GPCRs

La combinaison de modeles a permis ces dernieres annees des avancees significatives dans le domaine de l'apprentissage statistique, que ce soit en regression ou en reconnaissance des formes. Cependant, des questions essentielles sont demeurees pratiquement inexplorees. Ainsi, les criteres gouvernant le choix d'une methode particuliere sont mal definis et l'effet de la combinaison en discrimination n'a pas ete specifiquement mis en evidence. Cette these porte sur l'une des techniques de combinaison les plus utilisees : la regression lineaire. Dans un premier temps, nous caracterisons l'effet regularisant de la methode de stacked regression introduite par breiman. Nous etudions ensuite l'application du modele de regression lineaire multivariee au probleme de la combinaison d'experts discriminants estimant les probabilites a posteriori des classes. Cette question est traitee successivement sous l'angle de l'optimisation puis du controle de la complexite. La capacite du modele est mesuree au moyen de definitions generalisees de la dimension de vapnik-chervonenkis. L'etude se poursuit avec la presentation d'une methode non parametrique d'estimation de l'erreur de bayes. Notre modele de combinaison est evalue sur un probleme ouvert en traitement de sequences biologiques : la prediction de la structure secondaire des proteines globulaires. Pour realiser cette tache de discrimination, nous proposons une approche hierarchique et modulaire dans laquelle la combinaison intervient a un niveau intermediaire.

À l’ère du numérique, valoriser les données en leur donnant un sens est un enjeu capital pour supporter la prise de décision stratégique et cela dans divers domaines, notamment dans le domaine du marketing numérique ou de la santé, ou encore, dans notre contexte, pour une meilleure compréhension de la biologie des structures des acides nucléiques. L’un des défis majeurs de la biologie structurale concerne l’étude des structures des acides ribonucléiques (ARN), les effets de ces structures et de leurs altérations sur leurs fonctions. Contribuer à cet enjeu important est l’objectif de cette thèse. Celle-ci s’inscrit principalement dans le développement de méthodes et d’outils pour l’exploration efficace des structures secondaires d’ARN. En effet, explorer les structures secondaires d’ARN contribue à lever le voile sur leur fonction et permet de mieux cerner leur implication spécifique au sein des processus cellulaires. Dans ce contexte nous avons développé le modèle des super-n-motifs qui contribue à une meilleure représentation de la complexité structurale des ARN et offre un moyen efficace d’évaluer la similarité des structures d’ARN en tenant compte de cette complexité. Le modèle des super-n-motifs facilite l’étude des ARN dont le rôle est inconnu. Il permet de poser des hypothèses sur la ou les fonctions des ARN lorsque ceux-ci partagent une similarité structurale sans équivoque. Nous avons aussi développé la plateforme structurexplor pour faciliter l’exploration des structures secondaires, c’est-à-dire de permettre, en quelques clics, de caractériser les populations de structures d’ARN en, par exemple, faisant ressortir les groupes d’ARN partageant des structures similaires. La mise en œuvre du modèle des super-n-motifs et de la plateforme structurexplor a contribué à une meilleure compréhension de la phylogénie structurale des viroïdes qui sont des agents pathogènes à ARN attaquant les plantes, phylogénie jusqu’alors basée que sur leurs séquences.

Au cours de cette thèse, j'ai abordé la première étape de l'infection dans le système E. Coli -phage T5. Mes travaux se sont focalisés sur la caractérisation du complexe formé entre pb5, la protéine de liaison au récepteur (RBP) de T5 et son récepteur FhuA à la surface d'E. Coli. J'ai montré que le complexe est très stable et identifié le domaine «bouchon» de FhuA comme un nouveau site d'interaction de pb5. La formation du complexe n'induit pas de réarrangements des structures de pb5 et/ou de FhuA. Seuls des changements de conformation subtils lors de la formation du complexe, au niveau de structures secondaires, ont été décelés et attribués à pb5. Ces derniers seraient à l'origine de la transmission du signal au reste du phage. Des cristaux 3D (8 A) et 2D (3 A) ont été obtenus. Des études de diffusion de neutrons et de rayons X aux petits angles ont permis d'obtenir une enveloppe de pb5 seule ou dans le complexe, en accord avec la structure à basse résolution de pb5 et du complexe, obtenues par microscopie électronique. Ces modèles montrent que l'interface de liaison couvre toute la section extracellulaire de FhuA. Pb5 se lie à FhuA par l'une de ses extrémités de telle manière que son grand axe et l'axe du tonneau de FhuA soient alignés. Contrairement aux différentes RBP décrites, pb5 semble composée d'un domaine unique et est présente en une seule copie au bout distal de la fibre droite de T5. Par ailleurs, je me suis intéressé à la surexpression, purification, caractérisation et structure de pb9, une protéine localisée dans la partie conique de la queue de T5. Une première carte expérimentale est obtenue et la résolution de sa structure atomique est en cours
This thesis approached the first step of infection in the System E. Coli - phage T5. My research has focused on the characterization of the complex formed between pb5, the receptor binding protein (RBP) of T5 and its receptor FhuA, on the surface of E. Coli. I showed that the complex FhuA-pb5 is very stable and determined the "plug" domain of FhuA as a novel interaction site of pb5. Complex formation does not induce major rearrangements of pb5 and/or FhuA. Only subtle conformational changes during complex formation, at the secondary structures level, were identified and assigned to pb5. These changes would be at the origin of the signal transmission to the phage. 3D crystals (8 À) and 2D crystals (3 À) were obtained. Small-angle neutron and X-ray scattering studies yielded a model of pb5 isolated and within the complex. These models are in agreement with the low resolution structure of pb5 and the complex, obtained by electron microscopy, and show that the binding interface covers the entire extracellular section of FhuA. Pb5 binds to FhuA by one of its ends in a way that its major axis and the axis of the FhuA barrel are aligned. Unlike the various RBPs described so far, pb5 seems composed of a single domain and is present in one copy at the distal end of the T5's straight fiber. Furthermore, I worked on the overexpression, purification, characterization and the structure of pb9, a protein that was located in the conical part of the tail of T5. The first experimental electron density map is obtained and the resolution of its atomic structure is underway

Les recherches menées au cours de cette thèse visent à améliorer la qualité de prédiction des structures secondaires d'ARN avec pseudo-nœuds par l'approche thermodynamique. Elles se sont focalisées sur ses deux composantes essentielles : le modèle d'énergie libre qui paramètre les repliements de l'ARN et l'algorithme qui propose les repliements les plus vraisemblables. Bien que la question du modèle d'énergie libre soit considérée comme close à l'heure actuelle, il m'est apparu nécessaire et possible de repenser la manière dont il est calibré. Le principe de TT2NE, un nouvel algorithme de prédiction, est également exposé. Son efficacité repose sur une nouvelle classification des pseudo-nœuds à l'aide du genre, un indice topologique dont j'illustre par ailleurs la pertinence par une analyse qualitative et quantitative des bases de données disponibles. Au final, sans être arrivé au terme de tous les développements possibles des travaux engagés, les résultats obtenus sont prometteurs et améliorent l'état de l'art de ce problème.

L'acide ribonucleique, ou arn, est le nom generique d'une famille de macromolecules biologiques dont le role est preponderant dans un grand nombre des reactions prenant place dans la cellule vivante. La fonction de certaines des molecules d'arn presentes dans une cellule est principalement determinee par la structure qu'elles adoptent dans l'espace. Pour le biologiste desireux de decouvrir la fonction, ou de comprendre le mode de fonctionnement d'une telle molecule, il est primordiale de connaitre cette structure, ou au moins une description de la partie plane de cette structure, appelee structure secondaire. La plupart des methodes de prediction de la structure secondaire adoptee par une molecule d'arn, partent de l'hypothese que l'equilibre est atteint par le processus de formation de ces structures. Le rejet de cette hypothese donne naissance a la famille des methodes sequentiellement optimales de prediction. Dans ces methodes, on cherche a simuler le processus de formation des structures afin de pouvoir predire la structure la plus probable a un instant d'observation donne. Nous avons modelise ce processus en utilisant le puissant outil mathematique que sont les processus de saut markoviens homogenes. Cela nous a permis de decrire le processus de formation des structures dans un cadre theorique rigoureux et fiable, jusqu'alors inexistant. Ce modele utilise les vitesses des reactions elementaires permettant a la molecule d'arn de passer d'une structure a une autre. Ces vitesses n'ayant ete mesurees que dans un ensemble tres restreint de cas, nous les avons modelisees dans le cadre de la theorie stochastique des collisions activees, afin de pouvoir en calculer une approximation. Finalement, en partant de ce modele, et en effectuant diverses approximations, nous proposons un algorithme de prediction des structures secondaires sequentiellement optimales de l'arn

La connaissance de la structure secondaire des ARN est importante pour comprendre les relations entre structure et fonction des ARN. Elle est composée d'un ensemble d'hélices constituées de paires de bases complémentaires. Les algorithmes existants ont des complexités d'au moins O(n3). Cette thèse présente un algorithme, appelé P-DCfold, basé sur l'approche comparative pour la prédiction de structures secondaires des ARN avec une complexité en O(n2). Les hélices y sont recherchées récursivement en utilisant l'approche "diviser pour régner". La sélection des hélices est basée sur des critères thermodynamiques et de covariation. Le problème principal de l'approche comparative est la mauvaise qualité des alignements utilisés. P-DCfold utilise donc des modèles d'évolution sous contraintes de structure pour sélectionner les séquences correctement alignées. P-DCfold a prédit la structure secondaire de quelques ARN avec une sensibilité de 0,85 et une sélectivité de 0,95
The knowledge of RNA secondary structure is important to understand the relation between structure and function of the RNA. It is made up of a set of helices resulting from the folding of succession of a complementary base pairs. Complexities of existing algorithms is at least of O(n3). This thesis presents an algorithm, called P-DCFold, based on the comparative approach, for the prediction of RNA secondary structures with a complexity of O(n2). In this algorithm, helices are searched recursively using the "divide and conquer" approach. The selection of helices is based on thermodynamic and covariation criteria. The main problem of the comparative approach is the low quality of used alignment. So, P-DCfold use evolutionary models under structure constraints to select correctly aligned sequences. P-DCFold predicts the secondary structure of several RNA with a sensitivity of 0,85 and a sensibility of 0,95

Les recherches menées au cours de cette thèse visent à améliorer la qualité de prédiction des structures secondaires d'ARN avec pseudo-nœuds par l'approche thermodynamique. Elles se sont focalisées sur ses deux composantes essentielles : le modèle d'énergie libre qui paramètre les repliements de l'ARN et l'algorithme qui propose les repliements les plus vraisemblables. Bien que la question du modèle d'énergie libre soit considérée comme close à l'heure actuelle, il m'est apparu nécessaire et possible de repenser la manière dont il est calibré. Le principe de TT2NE, un nouvel algorithme de prédiction, est également exposé. Son efficacité repose sur une nouvelle classification des pseudo-nœuds à l'aide du genre, un indice topologique dont j'illustre par ailleurs la pertinence par une analyse qualitative et quantitative des bases de données disponibles. Au final, sans être arrivé au terme de tous les développements possibles des travaux engagés, les résultats obtenus sont prometteurs et améliorent l'état de l'art de ce problème.

Ce travail de thèse est porté sur l’étude des interactions protéines-protéines, protéines-peptides ainsi que la stabilité des protéines en faisant appel à la spectroscopie Raman et infrarouge. Dans la première partie, nous nous sommes focalisés sur l’étude de l’interaction entre les différentes protéines d’adrénodoxine et d’adrénodoxine réductase afin d’apporter de nouvelles données pour compléter la compréhension du mécanisme d’échange électronique. Le deuxième objectif à atteindre dans le cadre de ce travail est de suivre les changements conformationnels au niveau de la structure secondaire et tertiaire qui se produisent en présence et en absence des peptides lors de la formation des complexes. Enfin, la dernière partie est dédiée dans un premier temps à une étude comparative de la stabilité des hémocyanines de Limulus polyphemus et Eurypelma californicum issue de deux organismes ayant des conditions de vie différentes en suivant l’effet de la température (294-20 K) et du pH sur la structure secondaire des protéines. Dans un deuxième temps l’étude porte sur l’influence de la teneur en oxygène sur la structure secondaire et sur le site actif des hemocyanines de Limulus polyphemus, Eurypelma californicum et Astacus leptodactylus
This thesis is focused on the study of protein-protein and protein-peptide interactions as well as the study of proteins stability by means of Raman and infrared spectroscopies. In the first part, we focused on the interactions between different adrenodoxin and adrenodoxin reductase proteins in order to get a better understanding of the electron transfer mechanism. The second part of the thesis concerns the changes in the secondary and tertiary structure of PDZ domains in the presence and absence of peptides during complex formation. The last part is dedicated to a comparative study of hemocyanins originated from organisms living in vastly different conditions such as Limulus polyphemus and Eurypelma californicum. This part of the project concerns the effect of temperature (294-20 K) and pH on the secondary structure of proteins. Finally the influence of oxygen binding on the secondary structure and the active site of Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and Astacus leptodactylus was investigated

Les arylamines N-acétyltransférases (NATs) sont des enzymes du métabolisme des xénobiotiques impliquées dans la biotransformation de composés aromatiques. Le rôle précis des NATs bactériennes est mal connu bien que ces enzymes pourraient contribuer à l'antibio-résistance de certains microorganismes. Nous avons étudié deux modèles bactériens : Bacillus anthracis et Nocardia farcinica. B. Anthracis est le principal agent infectieux pouvant être utilisé lors d'attaques bioterroristes. Trois cadres ouverts de lecture codant pour trois NATs (BaNATA, BaNATB, BaNATC) ont été identifiés. B. Anthracis est la seule bactérie possédant trois enzymes NAT. BaNATB et BaNATC sont fonctionnellement actives. BaNATA semble dépourvue de toute activité. Nos résultats suggèrent que BaNATC pourrait contribuer à la résistance de B. Anthracis au sulfaméthoxazole (SMX). Les résultats préliminaires de la structure tridimensionnelle de BaNATC suggèrent la présence d'éléments décrits jusqu'à présent uniquement dans les structures des NATs humaines. A/, farcinica est à l'origine d'infections pulmonaires (nocardioses) chez l'Homme dont les symptômes ressemblent à ceux de la tuberculose. Nous avons décrit une nouvelle enzyme NAT (NfNAT) apparentée aux enzymes NATs des mycobactéries. NfNAT possède une activité acétyltransférase élevée vis-à-vis de plusieurs substrats dont l'isoniazide (INH). L'INH n'est pas utilisé pour traiter les nocardioses. Le SMX, faiblement acétylé par NfNAT, est utilisé comme traitement de choix. Les données reportées dans cette étude devraient aider à la compréhension du rôle des NATs dans les nocardia et mycobacteria, et également au design de molécules antagonistes des NATs
Arylamine N-acetyltransferases (NAT) are xenobiotic-metabolizing enzymes involved in the biotransformation of aromatic drugs and pollutants. The precise role of bacterial NAT is not well known. It has been suggest they may contribute to microbial résistance to certain antibiotics. We worked on two bacterial models: Bacillus anthracis and Nocardia farcinica. B. Anthracis is one of the main infectious agents susceptible to be used in bioterrorist attack. Three sequences coding for three paralogous NAT (BaNATA, BaNATB and BaNATC) have been identified. So far, B. Anthracis appears as the sole bacterium possessing three NAT enzymes. BaNATB and BaNATC were found to be functionally active towards several aromatic substrates. Conversely, BaNATA seems to be devoid of NAT activity. Our results suggest that BaNATC could contribute to the résistance of B. Anthracis to sulfaméthoxazole (SMX). Preliminary data on BaNATC structure suggest that this enzyme displays some structural features found only in human NAT structures. N. Farcinica causes pulmonary infections in humans that resemble tuberculosis. We showed that a new NAT from this bacterium is related to the mycobacterial NAT enzymes. In particular, NfNAT was found to display high A/-acetyltransferase activity towards substrates including isoniazid (INH). Interestingly, INH is not used to cure nocardiosis. The treatment of choice is the use of SMX which was found to be poorly acetylated. The data reported in this study will help to develop our understanding of the role of NAT enzymes in nocardia and mycobacteria and may help in the rational design of NAT antagonists for a range of clinical applications

Les molécules d'ARN jouent un rôle fondamentale dans les processus chimiques mis en jeu au coeur de la cellule. Les travaux présentés dans cette thèse concernent la comparaison des structures secondaires d'ARN. Celles-ci ont été formalisées par M. S. Waterman à la fin des années 70 et capturent une grande partie des informations relative à la structure des molécules d'ARN. En se basant sur une approche similaire à celle de Shapiro et Viennot, nous les représentons par des arborescenes ordonnées étiquetés. L'un des objectifs de cette thèse est d'explorer les algorithmes de comparaison d'arborescences existants et d'envisager différentes extensions. La famille d'algorithme étudiée s'appuie sur la généralisation des méthodes de comparaison entre les mots appliquées au génome. Nous choisissons de nous focaliser sur l'un des meilleurs (en complexité) algorithmes de calcul de la distance d'édition connus à ce jour, celui de Zhang-Shasha, et effectuons une analyse exacte de sa complexité en moyenne. Ensuite, nous transposons aux arborescences quelques avancées en matière de comparaison de séquences. Nous proposons deux algorithmes originaux d'édition locale d'arborescences non-ordonnées et ordonnées, puis une extension à l'algorithme de Zhang-Shasha afin d'effectuer une édition densifiée d'arborescences. Puis, nous présentons les résultats d'un point de vue biologique et appliquons cet ensemble d'améliorations aux structures secondaires d'ARN. Ces améliorations concernent la compression structurelle, l'édition locale et l'édition densifiée de structures secondaires. Pour conclure, nous présentons un protoype d'outil logiciel permettant la comparaison de structures secondaires d'ARN et implémentant les diffférents concepts ayant vu le jour au cours de cette thèse.

Cette thèse traite deux types de problèmes algorithmiques : des problèmes de triangularisation de matrices booléennes par permutation des lignes et des colonnes et des problèmes de découverte de structures secondaires d'ARN. Nous étudions des problèmes de triangularisation de matrices booléennes par permutation des lignes et des colonnes. Ce problème apparaît, par exemple, lorsque l'on souhaite calculer "en place" un système d'équations. Une façon naturelle d'aborder ce problème est de se placer dans le cadre général de la théorie des graphes et des graphes bipartis en particulier. Nous présentons de nombreux résultats de complexité - essentiellement de NP-complétude - liés à ce problème et introduisons quelques extensions dont nous précisons toujours la complexité. Certaines familles d'ARN sont très précisément définies par des motifs de séquence, et des contraintes structurelles secondaires et tertiaires. La plupart des outils ne sont pas adaptés puisqu'ils n'intègrent pas toutes les connaissances sur la molécule lors de l'exploration des banques de séquences. D'où l'intérêt d'algorithmes de recherche assurant une recherche en séquence et structure par le biais d'un descripteur défini par l'utilisateur intégrant l'ensemble des connaissances caractérisant l'ARN à détecter. Une nouvelle façon d'aborder ce problème consiste en l'étude de problèmes algorithmiques sur les graphes d'intersection d'un ensemble de 2-intervalles. Cette notion de 2-intervalles se trouve dans la lignée des études actuelles en matière d'algorithmique de graphes où l'on étudie de plus en plus les structures des graphes issues de modèles géométriques. Nous présentons plusieurs résultats de complexité et montrons en particulier que la recherche de motifs dans un ensemble de 2-intervalles est un problème NP-complet. Nous nous intéressons, plus particulièrement, à appliquer ces travaux pour la prédiction de motifs biologiques structurés. Plus spécifiquement, nous avons mis au point l'algorithme ORANGE pour la prédiction des introns auto-catalytiques de groupe 1 dans de grandes séquences génomiques. Cet algorithme est une amélioration de l'algorithme CITRON mis au point par F. Lisacek et F. Michel du point de vue de la rapidité d'exécution. De plus, une mise-en-œuvre de l'algorithme ORANGE est accessible en ligne sur Internet.

Thesis (M.S.)--Massachusetts Institute of Technology, Dept. of Architecture, 1989.
Includes bibliographical references (p. 109-114).
Writing, designing and building constitute three moments in the representation and organization of reality and fiction in architecture. These three interdependent moments joined by fragile links disrupt the boundaries between architectural criticism and practice in architecture and promote interaction between the critic and the practitioner. My thesis focuses on the link between writing and designing. Peter Eisenman exemplifies the architect's transitory position between writing and designing. His interdisciplinary investigations look for architecture's other possibilities through criticism and practice, thus engaging architecture in interpretive activities.Writing will be examined not as a critical tool for design, but as an instrumental device that leads to design. On the one hand, language as a critical device explicitly grounds Eisenman's postponment of questions concerning architecture for architecture's benefit from the realm of ideas. On the other hand, its use as an instrumental device implicitly demarcates potential formal aspects of language as an agent of Eisenman's design and my own investigation in new modes of criticism of architecture. I structure this essay on a dual analysis of the case study by displacing architectural criticism from its house to another house, that of literary criticism, architecture's residence secondaire. While, architectural criticism is concerned with questions of understanding the interdependent mechanisms of form, function and ideas with respect to space, time and representation, literary criticism reveals the dislocating mechanisms of Eisenman's fictive structures of his own history in time. My interest in interactive criticisms advocates an open-ended process that writes and re-writes an event in different texts.
by Valeria E. Koukoutsi.
M.S.

Le canal mécanosensible à large conductance MSCL d'escherichia coli est une proteine de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir de données structurales de la protéine dans son environnement natif. Nous proposons un étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13c et 15n sont deux étapes clé d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par synthèse vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été testée. Les échantillons synthétisés ont montre une bonne résolution et ont permis l'identification de plusieurs corrélations
Membrane proteins account for almost 30% of the proteome and play essential roles in many cellular mechanisms. The mechanosensitive channel of large conductance mscl is an intrinsic membrane protein of the inner membrane of escherichia coli. This protein acts as a valve pressure, in a hypo-osmotic down-shock, to prevent the bacterial lysis. In this work, a study of the structural characteristics of mscl in its native environment, the lipid bilayer, by nuclear magnetic resonance in the solid-state is presented. A major problem in determining the three-dimensional structure of membrane proteins by this technique is their overexpression and the analysis of carbon-carbon correlations from uniformly labelled samples. The analysis of mscl by solid-state nmr with a uniform labelling showed spectra with a good resolution, but the overlapping of the correlations prevented any identification or assignment of the residues. We showed that selective labelling of the membrane protein mscl by using cell-free synthesis represents a crucial help in improving data sets obtained by nmr in the solid-state. Singe the amino acids chemical shifts show a big overlapping, different strategies to choose specific labelling patterns to cet well-resolved spectra were developed. These strategies are based on chemical shifts prediction, or sequence analysis to isolate unique amino acid pairs. A combined approach was testee. These different approaches showed spectra with a good resolution, and facilitated the identification of amino acids in some cases

Ma thèse comporte deux volets: d’une part, le développement de ligands ciblant les protéines antiapoptotiques et d’autre part, l’étude par RMN des protéines CGC impliquées dans la biosynthèse de la congocidine, métabolite secondaire chez Streptomyces.La famille de protéines Bcl-2 est impliquée dans un des processus clé de la mort cellulaire programmée, appelée l’apoptose mitochondriale. Elle se divise en membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) et pro-apoptotiques (Bak, Bax et les «BH3»).Ces molécules vont réguler l’apoptose en maintenant ou non l’intégrité de la membrane mitochondriale. En réponse à un signal de stress, les «BH3» neutralisent les antiapoptotiques et activent les pro-morts, leur permettant de former des pores sur la membrane mitochondriale. Ce phénomène aboutit au relargage du cytochrome c dans le cytosol et à l’activation de la cascade des caspases dont la finalité est la destruction de la celluleLa pertinence de l’étude des Bcl-2 s’observe de manière croissante depuis les années 1990. En effet, une surexpression des membres pro-survie de cette famille (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BFL1 etc...) a été observée dans de nombreux cancers. Suite à ce constat, cibler ces molécules est devenue une piste prometteuse en cancérologie par le développement d’inhibiteurs des protéines pro-survie, l’objectif étant de restaurer l’apoptose dans les cellules tumorales.Dans cette perspective, différentes stratégies thérapeutiques ont été imaginées:(i) la thérapie génique avec l’Oblimersen, un ADN antisens développé par Genta, qui inhibe l’expression de la Bcl-2. Néanmoins, les résultats précliniques sont décevants.(ii) l’utilisation de peptides (ou peptidomimétiques) imitant les sentinelles «BH3» comme antagonistes de l’interaction Bcl-xL/Bak. Il faut souligner le concept des «stappled peptides», permettant la stabilisation des hélices par cyclisation des chaînes latérales. Si certaines de ces molécules synthétisées semblent très actives, aucune n’est encore en étude clinique.(iii) le développement de petites molécules non peptidiques, issues d’un criblage systématique in vitro ou in silico et se caractérisant par une grande variété structurale. Parmi ces molécules, certaines sont synthétiques comme l’ABT-737 et l’ABT-263 élaborés par les laboratoires Abbott, grâce à la méthode d’assemblage des fragments (fragment-based drug design) aidée par des études SAR by NMR (structure activity relationship). D’autres sont issues de produits naturels comme le (R)-Gossypol, le TW-37, la sanguinarine ou l’Obatoclax. En 2008, 11 composés étaient en phase préclinique ou clinique et les résultats pour certains d’entres eux semblaient plus prometteurs que pour l’Oblimersen.Ces stratégies ont permis de mettre au point un certain nombre de composés ciblant les protéines anti-apoptototiques. Si certains de ces composés sont actuellement en phase de tests cliniques, les plus prometteurs (ABT) ont démontré une efficacité uniquement vers certains des protéines anti-apoptotiques laissant place à un phénomène d’échappement des cellules cancéreuses.Un criblage réalisé à l’ICSN par l’équipe de F. Guéritte (Pôle Substances Naturelles Plantes) a permis d’identifier une nouvelle classe de molécules ayant une affinité de l’ordre du μM pour Bcl-xL. Parmi ces composés, deux présentent une attractivité d’un point de vue structural qui rend faisable leur synthèse chimique:(i) la meiogynine A, un sesquiterpène dimère de structure originale isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie.(ii) le drimane, un sesquiterpène isolé en grandes quantités du genre zygogynum, une espècede Nouvelle-Calédonie.Ainsi, des collaborations ont été établies au sein de l’ICSN, réunissant diverses expertises (chimie, biologie, physicochimie et modélisation) afin de dégager les synergies souhaitables.Dans la perspective de la conception rationnelle d’analogues aux propriétés améliorées ciblant l’ensemble des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, ma contribution est de choisir les cibles biologiques (Bcl-xL et Mcl-1), de les obtenir pures et marquées en isotopes stables afin de réaliser par RMN et modélisation moléculaire une étude structurale des complexes protéines/ligands et de définir un modèle d’interaction.Le deuxième volet de ma thèse, à dominante fondamentale, a pour objectif de caractériser par RMN les médiateurs enzymatiques d’une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire, la congocidine issue des bactéries Streptomyces Ambofaciens.La congocidine présente des propriétés antivirales et anticancéreuses de par sa capacité à se fixer à l’ADN. Cependant, du fait de sa forte toxicité, cette molécule ne peut pas être utilisée directement à des fins thérapeutiques.L’analyse des groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse de la congocidine a mis en évidence 24 gènes. Seuls certains intermédiaires réactionnels ont été identifiés. Cependant, le rôle précis des produits de ces gènes n’est pas encore bien défini.Ainsi, en collaboration avec l’équipe de JL Pernodet à l’Université d’Orsay, nous nous sommes intéressés à deux enzymes en particulier intervenant dans la synthèse de la congocidine, les protéines CGC-10 et CGC-19.L’objectif de cette collaboration est d’utiliser la spectroscopie RMN couplée à la modélisation moléculaire sous contraintes expérimentales afin de déterminer la structure de ces deux protéines. Nous souhaitons apporter des informations sur l’éventuelle présence de motifs structuraux au sein de ces protéines afin de mieux comprendre leur fonction et de définir à quel moment de la voie de biosynthèse elles interviennent.Concernant la protéine CGC-10, nous avons conçu un plasmide optimisé que nous avons fait synthétiser. Le gène obtenu a été cloné dans un vecteur d’expression choisi par nos collaborateurs (pQE30).Concernant la protéine CGC-19, nous allons en décrire les étapes d’expression et de purification qui nous ont permis d’enregistrer l’ensemble des expériences 3D-triple résonnance nécessaires à la détermination de la structure de la protéine. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une modification post-traductionnelle de type phosphopanthéténylation au sein de cette protéine. Nous avons produit l’enzyme responsable de cette modification, la sfp, afin de pouvoir effectuer la réaction et suivre l’effet de la modification sur les spectres RMN de la protéine et donc sur la structure.Ce projet, qui s’inscrit dans une perspective de recherche à plus long terme, a pour objectif de caractériser précisément le mécanisme de production de la congocidine. A travers cette démarche, il s’agit de combiner la biologie moléculaire (modification en amont les gènes) à la chimie afin d’obtenir des molécules différentes aux propriétés améliorées et non toxiques
My PhD thesis contains two parts: development of ligands against anti-apoptotic proteins and structural study of CGC proteins involved in the biosynthesis of congocidine, a Streptomyces Ambofaciens secondary metabolite.The first project concerns the NMR study of the interactions between the anti-apoptotic proteins and two potential ligand candidates, the Meiogynine and the Drimane. These two terpenoïds, identified from ICSN’s chemical library screening against the Bcl-xL protein, have shown a significant inhibiting activity, thus opening promising perspectives for the treatment of cancer cells overexpressing anti-apoptotic proteins. In fact, as these compounds are considerably smaller than the binding site, our objective is to introduce modifications (such as elongation of their structure, functionalization with hydrophilic groups etc.) that may improve their binding properties as well as their delivery and bioavailability.Following to the successful recombinant expression and purification, necessary to obtain labelled targets (15N/13C), our preliminary NMR studies suggested a rather universal action of our candidates, capable to bind not only to Bcl-xL but also to the other major anti-apoptotic protein, Mcl-1. Titration experiments revealed significant perturbations of the HSQC protein NMR spectra with the progressive disappearance of several protein HN and ligand signals, confirming dissociation constants at the µM region for both targets. However, the intermediate chemical exchange NMR regime observed, associated with the weak ligand solubility, poses severe difficulties for the structural elucidation of the complexes by classical NMR methods.In this work alternative approaches for the localisation of the ligands in the hydrophobic cleft of both target proteins will be presented.Oligopyrroles are secondary metabolites synthesized by Streptomyces bacteria. This family of natural products, composed by one or more pyrrole-2-carboxamide groups is characterized by a variety of biological activities such as antiviral, antitumor and antibiotic functions.One of the best-known metabolites is the congocidine, extensively studied due to its capacity to bind into the minor groove of the DNA double helix, with strong sequence specificity. However, because of its strong toxicity, this molecule cannot be directly used for therapeutic purposes.The analysis of the groups of genes involved in congocidine biosynthesis brought to light 24 genes, but their precise role is not yet well defined. We were particularly interested in two enzymes: the proteins called CGC-10 and CGC-19. For the recombinant expression of the first one, we designed an optimized insert which was cloned in an expression vector pQE30.Concerning CGC-19, the stages of expression and purification, which allowed us to obtain doubly-labeled protein, as well as the 3D NMR experiments for spectral assignment and structure elucidation, will be discussed.Furthermore, we were interested in the holo- state of this protein obtained through a post-traductional modification (phosphopanthéténylation). To this, we produced the enzyme responsible for this modification, Sfp, carry out the reaction in vitro and follow the effect of the modification at the NMR spectra

Les histones constituent, abstraction faite de l'eau, environ le tiers de la masse du noyau ; ce sont des constituants intrinsèques de la chromatine. Nous avons décrit cette dernière sous son aspect statique (composition, structure) et sous son aspect fonctionnel (réplication, mitose, différentiation, transcription). Une attention particulière a été accordée aux modifications post-synthétiques des histones. Après avoir mis au point un protocole permettant l'obtention de grandes quantités d'histones pures, nous avons utilisé une partie de celles-ci pour la préparation de grands fragments. Les histones h3 et h4 ont pu d'autre part être fractionnées selon leur degré d'acétylation (acétylation post-traductionnelle des fonctions epsilon-amine des lysines) par deux méthodes de chromatographie d'échange d'ions. L'une est effectuée à pH 6,8 en milieu réducteur à partir d'un mélange d'histones h3 et h4. Les histones sont élues sous forme de complexes h3-h4, dans l'ordre décroissant de leur degré d'acétylation. L'autre méthode qui procède à partir d'une histone isolée est moins douce (urée 6m, pH 3) mais conduit à la séparation totale des sous-espèces de l'histone h4. Tout ce matériel a été utilisé pour des études biochimiques, biophysiques et immunologiques, ce qui a permis notamment les observations qui suivent : les propriétés antigéniques sont liées à la structure secondaire. Les zones en hélice des histones sont essentielles dans la stabilisation de l'ADN en forme b. Le comportement in vitro des histones h3 et h4 dépend étroitement du variant d'histone h3 considère et du milieu. Les particules, reconstituées à partir d'histones acétylées, ou non acétylées, apparaissent semblables en microscopie électronique et en dichroïsme circulaire, mais différent quelque peu par leurs propriétés antigéniques. L'acétylation de l'histone h4 se fait dans un certain ordre, cet ordre dépend du processus cellulaire dans lequel elle est impliquée

La cavéoline-1 (21kDa) est le composant protéique principal des cavéoles, microdomaines spécifiques des membranes plasmiques, enrichis en cholestérol et sphingolipides. Ces structures jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires et sont le siège de nombreux réseaux d'interactions protéine-protéine et lipide-protéine. L'objectif général de ces travaux était de contribuer à la compréhension des bases moléculaires des réseaux d'interactions impliquant la cavéoline-1 avec ses partenaires lipides et protéines, afin de mieux comprendre la structure et le rôle multifonctionnel des cavéoles. Ne disposant d'aucune donnée structurale sur aucun des composants des cavéoles pour décrire ces réseaux, nous nous sommes d'abord intéressés à la structure du marqueur principale des cavéoles, i. E. La cavéoline-1 et plus particulièrement du domaine de liaison à l'interface membranaire N-MAD ou CSD (incluant le motif CRAC) et du domaine intra-membranaire. Un des objectifs de la thèse a été l'obtention d'une grande quantité de ces domaines afin de réaliser une étude structurale par RMN. Pour cela différentes approches de synthèse chimique et biochimique, ont été mises en œuvre. L'ensemble de ce travail a permis d'obtenir des premières données structurales et d'interaction avec des lipides sur des fragments de la cavéoline-1, CSD et CRAC en présence de différents environnements mimétiques menibranaires. L'étude structurale par RMN du fragment incluant le CSD et le domaine intra-membranaire obtenue par synthèse chimique a permis d'identifier des régions structurées en hélice a (82 à 102 et 115 à 120)
Caveolin-1 (21kDa) is the main component of specific microdomain of the plasma membrane, enriched in cholesterol and sphingolipids, called caveolae. These structures play a role in many cellular processes. A protein-protein and lipid-protein interactions networks occur within these structures. The main goal of this work bas been to contribute to elucidate the molecular basis of the interactions networks between caveolin-1, lipids and proteins, in order to understand the structure and multifunctional role of caveolae. In the absence of any available structural information at the atomic level on any components of caveolae to describe these networks, our first work has been to focus on the structure of the main caveolae component, i. E caveolin-1 and more particularly the membrane attachment domain N-MAD or CSD (including CRAC motif) and the intra -membrane domain. One of our goals was to obtain a large quantity of these domains to perform an NMR study. To this aim chemical synthesis and biochemical synthesis were used. Our work has provided the fîrst structural data and interaction with lipids of caveolin-1 fragment, CSD and CRAC in various membrane mimics. NMR structural study of the synthetic fragment including CSD and the hydrophobic domain highlights two a helical regions (82 to 102 and 115 to 120)

Cette thèse traite le problème d'extraction des règles logiques des réseaux de neurones formels. Les algorithmes développés se basent sur des contraintes dynamiques appliquées au cours de l'apprentissage aux poids synaptiques du réseau de telle façon que le réseau soit forcé d'apprendre des règles logiques. En exprimant les contraintes sur les paramètres du réseau comme des à priori bayesiens nous avons proposé un cadre formel pour concevoir et réaliser un système d'apprentissage des règles logiques à partir des réseaux. Les méthodes préconisées ont été validées sur le problème de la prédiction de la structure secondaire des protéines. Le perceptron multi-chouches prédisant la structure a été converti, en fin d'apprentissage, en un système de votes majoritaires. Ce système de votes englobe de nombreuses informations biologiques

Les motifs RTX (Repeat in ToXin) sont des séquences répétées caractéristiques d'une large famille de toxines bactériennes. La liaison du calcium aux motifs RTX induit la formation d'un type particulier de structure, appelée «β-roll ». La toxine adénylcyclase (CyaA) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche, est une des toxines RTX la mieux caractérisée. CyaA possède une partie C-terminale impliquée dans la liaison au récepteur cellulaire eucaryote (domaine R). R est constitué d'une quarantaine de motifs RTX organisés en cinq régions consécutives, appelées blocs I à V, séparées par des régions flanquantes non-RTX. Il a été précédemment montré que le bloc V avec ses régions flanquantes N- et C- terminales constitue un domaine autonome nécessaire pour la toxicité de CyaA. Lors de ces rencontres doctorales, nous présentons une étude biophysique qui a pour objectif d'identifier et de caractériser la contribution des régions flanquantes au processus de repliement du bloc V. Nos résultats indiquent que les motifs RTX, en absence de calcium, présentent les caractéristiques des protéines intrinsèquement désordonnées. Nous montrons que la région flanquante C-terminale est essentielle au repliement dépendant du calcium du bloc V. Par contre, la région N-terminale n'est pas nécessaire. Enfin, les structures secondaire et tertiaire se forment simultanément lors de la liaison coopérative de plusieurs ions calcium. Ce résultat suggère que le repliement du blocV est un processus à deux états: un état désordonné en absence du calcium tandis que la liaison du calcium aboutit à un état structuré et compact. Ces résultats ont un impact direct pour la sécrétion de la toxine
Repeat in ToXin (RTX) motifs are nonapeptide sequences found among numerous virulence factors of Gram-negative bacteria. In the presence of calcium, these RTX motifs are able to fold into an idiosyncratic structure called the parallel β-roll. The adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, is one of the best-characterized RTX cytolysins. CyaA contains a C-terminal receptor domain (RD) that mediates toxin binding to the eukaryotic cell receptor. RD is composed of about 40 RTX motifs organized in 5 successive blocks (called I to V). The RTX blocks are separated by non-RTX flanking regions of variable lengths. It has been shown that the block V with its N- and C-terminal flanking regions, constitutes an autonomous domain required for the toxicity of CyaA. Here, we investigated the calcium-induced biophysical changes of this domain to identify the respective contributions of the flanking regions to the folding process of the RTX motifs. We showed that the RTX polypeptides, in the absence of calcium, exhibited the hallmarks of intrinsically disordered proteins and that the C-terminal flanking region was critical for the calcium-dependent folding of the RTX polypeptides, while the N-terminal flanking region was not involved. Furthermore, the secondary and tertiary structures were acquired concomitantly upon cooperative binding of several calcium ions. This suggests that the RTX polypeptide folding is a two state reaction, from a calcium-free unfolded state to a folded and compact conformation in which the calcium-bound RTX motifs adopt a P-roll structure. These results have direct impact in the toxin secretion

Le composant PP3 est une protéine de la fraction protéoses-peptones (PP) du lactosérum bovin, principal co-produit de la filière lait. Cette protéine présente une activité de surface supérieure à celle de la fraction PP totale. L’hydrolyse du PP3 en milieu émulsionné a été réalisée pour améliorer ses propriétés tensioactives. L’hydrolysat obtenu conserve une tensioactivité comparable à celle de la protéine intégrale. Le PP3, en faible concentration dans le lactosérum, peut difficilement être valorise en agro-alimentaire mais son utilisation (ou celle de l'hydrolysat) comme émulsifiant est possible dans des secteurs à forte valeur ajoutée (cosmétologie). Une contamination survenant lors de la préparation du PP3 par FPLC d'interactions hydrophobes a été identifiée. Elle peut etre évitée par l'utilisation d'une chromatographie d'affinité sur concanavaline A. Le rôle du PP3 reste inconnu malgré les nombreux travaux effectués sur le lait bovin. Cette protéine est fortement homologue à une protéine du lactosérum de chamelle et aux protéines GlyCAM-1 murines. L’étude des éléments de structures secondaires du PP3 montre que la zone C-terminale (résidu 119 a 135) se conforme en hélice alpha amphipatique dans un environnement lipidique. Le peptide de synthèse correspondant à cette zone (peptide P17) et la protéine interagissent avec des monocouches lipidiques constituées de préférence de phospholipides anioniques à l'état de gel, comme le dimyristoylphosphatidyl-glycerol (DPPG). Les mesures de conductance indiquent que le fragment 113-135 du PP3 (peptide P23) et la protéine s'insèrent dans des bicouches planes, contrairement au peptide P17 vraisemblablement trop court. Toutefois P17, P23 et la protéine entière ne sont pas hémolytiques ni ne permettent la lyse des souches bactériennes testées. L’hélice alpha amphipatique responsable des propriétés de surface du PP3, est prédite en région c-terminale des protéines homologues. Des lors, son implication dans une fonction commune est probable.

La Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) est un variant spectral de la Green Fluorescent Protein extraite de la méduse Aequaria Victoria (GFPav). La ECFP, émettant dans le cyan, est un des donneurs les plus utilisés dans les études de transfert résonnant d'énergie d'excitation et est integré dans de nombreuses constructions de biosenseurs. Pourtant, elle souffre de nombreux inconvenients. Notamment elle pésente des propriétés photophysiques complexes et une forte sensibilité environnementale qui sont des freins à une interprétation quantitative de ses signaux de fluorescence en imagerie cellulaire. Notre objectif vise à mettre au point, grâce à l'introduction d'un minimum de mutations, un dérivé de la ECFP présentant des propriétés d'émission simplifiées et performantes ainsi qu'une faible sensibilité environementale. Des mutations ont été introduites, par mutagenèse dirigée, à deux positions clefs de la séquence peptidique de la ECFP ce qui a permis de générer des dérivés présentant des propriétés photophysiques et une sensibilité au pH modulées. En particulier, nous avons réussit à générer une protéine fluorescente, l'Aquamarine, aux propriétés photophysiques quasi-idéales caractérisée par un rendement quantique de l'ordre de 0,9 et des déclins d'émission de fluorescence quasi-monexponentiels. Elle présente également une sensibilité au pH fortement réduite avec un pH de demi-transition acide de 3,3.Ce manuscrit présente l'étude détaillée des propriétés d'émission de fluorescence des diverses protéines générées. Plusieurs paramètres présentant un intérêt particulièrement important pour une utilisation adéquate en imagerie de fluorescence ont été évalués. Outre la sensibilité au pH établie sur une large gamme de pH (2,5-11), une attention particulière a été portée sur les performances photophysiques (monoexponentialité du déclin d'émission de fluorescence, durée de vie moyenne, rendement quantique, brillance,...) de ces dérivés. De plus, grâce à des expériences de dichroïsme circulaire, des informations sur les changements structuraux, dont ces dérivés sont le siège à pH très acide, ont été obtenues. Enfin, l'examen détaillé des données spectroscopiques stationnaires et résolues en temps a permis de mettre en lumière l'existence de plusieurs espèces émissives contribuant à la photophysique de ces protéines et à l'origine de leur transition acide. L'ensemble de ces résultats constitue une première approche pour une meilleure compréhension de la relation structure-photophysique-dynamique de la ECFP et de ces dérivés.

Pour mimer le repliement des structures tridimensionnelles des biomolécules, les chimistes ont développé des oligomères artificiels capables d’adopter des formes repliées et bien définie en solution : les foldamères. Néanmoins, la variété des structures secondaires isolées que l’on rencontre au sein des foldamères n’atteint pas encore celle des biomolécules. La combinaison de différentes séquences d’oligoamides aromatiques ayant des structures secondaires distinctes a permis le développement d’architectures de type « hélice-feuillet-hélice » définie dans lesquelles chaque sous-composant secondaire conserve son intégrité respective. Ces objets uniques en forme de panier possèdent une fenêtre ouverte modulable inscrite dans le squelette du foldamère par laquelle une molécule invitée peut être accueillie. Comme preuve de concept, la liaison et le relargage d’une molécule invitée à l’une de ces structures se sont révélées rapides à l’échelle de la RMN 1H. Ensuite, le développement de brins oligomériques composés de monomères codant pour de faibles rayons de courbure a permis l’obtention d’hélices doubles. Ces structures auto-assemblées de haut-poids moléculaires possèdent un diamètre de l’ordre du nanomètre. Enfin, des segments hélicoïdaux codant pour des diamètres larges ont été couplés à des pseudo-coudes artificiels dans le but d’obtenir des architectures possédant une large cavité polaire inspirés de la structure des tonneaux β. Ces approches ouvrent la voie vers la conception d’objets moléculaires toujours plus complexes au-delà la chimie des biomolécules
To mimic the particular folding of the biomolecules’ three-dimensional structures, chemists have developed artificial oligomers that fold into a compact and well-defined structures in solution: foldamers. Nevertheless, the variety of isolated secondary structures of foldamers is not equal to those of biomolecules. The association of different sequences of aromatic oligoamide having distinct secondary structures allowed the development of well-defined helix-sheet-helix architectures in which subcomponents conserve their respective integrity. These unique basket-like objects possess an open-window within the foldamer backbone in which a molecular guest can be accommodate. As a proof of concept, guest binding to one of these structures was found to be fast on the NMR time scale. Then, the development of oligoamide aromatic strands made of monomer encoding for low curvature has allowed to obtain double helices structures. These self-assembled structures showing high molecular weights present a nanometer scale diameter. Eventually, these oligomeric strands were coupled to artificial turn units to obtain β-barrels-like architectures having a large polar cavity. These approaches open the access to the design of ever more complex molecular objects beyond the chemistry of biomolecules

Notre travail s'inscrit dans la problématique de la comparaison de structures d'ARN. Nous étudions en particulier le cas des structures secondaires sans pseudo-noeud, qu'il est possible de modéliser par des arbres ordonnés étiquetés. Il existe des algorithmes polynomiaux d'édition et d'alignement d'arbres. Cependant, les opérations d'édition utilisées par ces algorithmes ne sont pas adaptées pour l'ARN. D'un autre côté, il a été montré que si l'on utilise un jeu d'opérations réalistes d'un point de vue biologique, le problème de l'édition de structures secondaires sans pseudo-noeud est NP-complet. Dans cette thèse, nous étudions le problème de l'alignement, avec ce même jeu d'opérations réaliste, de structures secondaires d'ARN sans pseudo-noeud. Nous proposons un algorithme polynomial d'alignement global et ses variantes d'alignement local et de recherche d'un motif structurel. Puis nous montrons que cet algorithme, et par le même coup l'algorithme classique d'alignement d'arbres ordonnés, a une complexité moyenne en O(n2). Nous avons implanté notre algorithme d'alignement ainsi que ses variantes afin de comparer notre approche aux outils déjà existants, et nous présentons quelques résultats. Nous présentons ensuite un travail préliminaire sur la construction de matrices de scores pour chaque opération d'édition réaliste pour l'ARN. Enfin, nous étudions le problème de sous-structures secondaires communes à un ensemble de structures tertiaires d'ARN, de façon à maximiser le nombre d'empilements. Nous montrons que dans le cas général, ce problème est NP-complet. Cependant, nous donnons un algorithme polynomial dans le cas où le nombre de structures en entrée est fixé.

Nombre de bactéries à Gram négatif sécrètent à l'aide d'un système de sécrétion de type 2 (SST2) des toxines et des hydrolases. Dans certaines conditions, le SST2 peut assembler des pili à la surface des bactéries composés de pseudopilines. Ces filaments dynamiques sont probablement confinés à l'espace périplasmique et jouent un rôle essentiel dans le processus de sécrétion. Le pseudopilus pourrait fonctionner comme un piston poussant le substrat à travers le canal dans la membrane externe, ou induire des changements conformationnels dans le système de sécrétion aboutissant à la sécrétion du substrat. L'objectif de ce travail a été de déterminer la structure, et de comprendre l'assemblage du pseudopilus par le SST2 de Klebsiella oxytoca. PulG est la sous-unité principale du pseudopilus. Nous avons généré une série de modèles du pilus à une résolution pseudo-atomique par une nouvelle procédure de docking. Les interactions électrostatiques prédites ont été validées par mutagenèse dirigée en inversant des charges et par pontage disulfure. L'analyse de la pseudopiline majeure PulG par mutagenèse dirigée a permis par ailleurs d'isoler des variants permettant de découpler la sécrétion de la piliation ou affectés très tôt dans leur voie de biogenèse. En outre, les distances entre acides aminés dans le cœur du pilus ont été évaluées par pontage disulfure en substituant par des cystéines 2 acides aminés de chaque segment transmembranaire de PulG. Nous avons ainsi pu non seulement valider les modèles, mais aussi tester pour la première fois l'assemblage du pseudopilus dans le périplasme, et tester le rôle des différents facteurs de sécrétion dans la biogenèse du pseudopilus
Many Gram-negative bacteria secrete specific proteins to the extracellular milieu via the type II secretion Systems (T2SS). Under specific conditions, T2SS assemble pili on the bacterial surface, composed of pseudopilins. These dynamic filaments, called the pseudopili, are localized in the periplasm and play an essential role in protein secretion. They could act as a piston to push the protein substrate through the channel in the outer membrane, or drive conformational changes of secretion System components involved in the channel gating. The objective of this work was to determine the structure and understand the assembly of the pseudopilus from the pullulanase-specific T2SS of Klebsiella oxytoca. PulG is the main subunit of the pseudopilus. Pseudo-atomic resolution models were generated by a new flexible docking procedure, using ambiguous distance restraints. Predicted electrostatic interactions were validated by introducing single deleterious and double compensatory charge inversions. Extensive mutational analysis of the major pseudopilin PulG led to the isolation of variants allowing for uncoupling secretion and piliation, or affected in early steps of their biogenesis. In addition, inter-residue distances in the pilus core were probed using double cysteine substitutions in the PulG TMS, followed by cross-linking. This approach allowed us not only to validate the models, but also provided a biochemical tool to probe the assembly of the so-far elusive periplasmic pseudopilus. Using covalent cross-linking we could test the role of different T2SS components in thé pseudopilus biogenesis

L'etude des relations existantes entre la structure des toxines de scorpions anti-nsectes et leur fonction s'est faite selon deux approches, la comparaison de sequences et des modifications chimiques, et les structures secondaires (dichroisme circulaire). Deux toxines de scorpions agissant uniquement sur les insectes, aah it1 et aah it2, ont ete purifiees a partir du venin de scorpions androctonus australis hector collectes dans l'oasis de tozeur en tunisie. La structure primaire de ces deux proteines a ete determinee et revele une forte homologie de sequence entre elles. Les acides amines basiques de aah it1 ont ete modifies chimiquement de maniere selective. Six derives ont pu etre isoles, identifies et leur proprietes pharmacologiques etudiees. Les lysines 28 et 51 s'averent etre importantes pour la toxicite de ces proteines. Une etude par dichroisme circulaire a permis de constater les homologies conformationnelles de ces deux toxines. Le pourcentage des differentes structures secondaires presentes dans aah it2 a pu etre estime grace a l'analyse du spectre dichroique assistee par ordinateur et montre la presence d'une helice supplementaire par rapport aux toxines de scorpions anti-mammiferes. Trois toxines de scorpions, l'une etant active sur les mammiferes (css ii), l'autre active sur les insectes (aah it2) et enfin la derniere a la fois active sur les mammiferes et les insectes (ts vii) ont ete etudiees et comparees par dichroisme circulaire. Leur flexibilite a ete evaluee par l'amplitude des modifications de leurs structures secondaires, lorsque l'hydrophobicite du milieu est changee. Il apparait que le caractere non specifique d'une de ces toxines est associe a une plus grande flexibilite comparee aux deux autres, plus specifiques dans leur cible pharmacologique, mais egalement plus rigides. La specificite des toxines anti-insectes serait liee a la presence d'une helice

Il a ete clairement etabli qu'une possible amelioration du niveau therapeutique des maladies cardiovasculaire passe par une meilleure connaissance hydrodynamique des phenomenes circulatoires. Le present travail concerne donc l'etude des caracteristiques physiques de l'ecoulement en aval d'une bifurcation de section rectangulaire. Par une analyse quantitative des grandeurs physiques de l'ecoulement, il a ete mis en evidence que les caracteristiques tridimensionnelles de l'ecoulement post bifurcation ne peuvent etre deduites du comportement bidimensionnel de l'ecoulement. Ces premiers resultats ont ete obtenus a l'aide de simulations numeriques. L'analyse numerique tridimensionnelle de l'ecoulement post bifurcation a ensuite montre l'importance des ecoulements secondaires par rapport a l'ecoulement principal. Les ecoulements secondaires sont constitues, en partie par deux tourbillons majeurs contra rotatifs symetriques par rapport au plan median. La caracterisation de ces ecoulements a revele l'apparition d'instabilites au voisinage de la paroi interieure post bifurcation. Une investigation numerique approfondie basee sur l'etude de la solution instationnaire, completee de visualisations et de mesures anemometriquesfilm chaud ont confirme l'existence de ces instabilites. Elles apparaissent dans le plan median sous la forme de deux tourbillons mineurs contra rotatifs. Leur sens de rotation est oppose aux tourbillons majeurs. Ces structures tourbillonnaires n'ont jamais ete decrites dans la litterature dans des modeles de bifurcation. Elles s'apparentent a celles observees dans des modeles de conduites courbes, connues sous le nom d'instabilites centrifuges. Sans pouvoir evaluer les implications physiologiques de ces nouvelles structures, cette analyse tridimensionnelle a neanmoins permis d'en mesurer la complexite. Il est probable que leur role dans l'hydrodynamique du flux sanguin ne peut etre negligeable

La détection de potentielles cibles secondaires ou off-targets d’un ligand donné requiert la détermination de son site d’interaction et la recherche de sites d’interaction similaires sur d’autres protéines. Dans le but de mener à bien cette étude, nous avons développé PatchSearch : cet outil compare un patch requête, correspondant à un site d’interaction, avec la surface d’une cible potentielle. L’algorithme employé s’appuie sur une méthode originale de recherche de quasi-cliques dans un graphe produit : cette approche identifie des groupes d’atomes du patch appariés avec ceux de la surface ciblée avec des propriétés physico-chimiques conservées et dans des configurations proches. Nous montrons que PatchSearch trouve des patches qui correspondent à ceux qui sont connus sur les surfaces ciblées. De plus, les résultats de l’application de PatchSearch sur des protéines flexibles indiquent que l’approche des quasi-cliques permet de retrouver à la fois les parties rigides et flexibles des patches,contrairement à la recherche classique de cliques. Enfin, les performances de Patch-Search sont équivalentes à celles des autres outils de comparaison de sites de liaison.Nous avons également appliqué PatchSearch sur des off-targets de médicaments impliqués dans le traitement de cancers. Nos expériences suggèrent l’utilisation de PatchSearch dans la recherche des éventuelles off-targets d’un médicament
Detection of putative off-targets for a ligand requires to search for some similarbinding sites onto other proteins surface. In order to achieve this goal, we developeda tool named PatchSearch. This program compares a query patch, whichcontains the binding site, with the surface a potentially targeted protein. Patch-Search’s algorithm is based on an original method searching for some quasi-cliquesin a graph product, which identifies some atoms both in the patch and in the surfacewith conserved physicochemical properties and in similar configurations. Weshow that PatchSearch efficiently finds known patches on protein surfaces. Moreover,application of PatchSearch on flexible proteins shows that, unlike the classiccliques approach, quasi-cliques method allows to find both rigid and flexible partsof the patches. PatchSearch gets similar results compared to the other binding sitecomparison tools. We also applied PatchSearch to find patches binding polypharmacologicaldrugs involved in cancer treatment, in order to identify them on knownoff targets. Our experiments suggest to employ PatchSearch in off-targets detectionprocess

Afin de se répliquer, les rétrovirus doivent disposer à la fois d’ARN épissés et non épissés. Chez le virus du Sarcome de Rous (RSV), l’accumulation de l’ARN non épissé dépend de l’élément NRS (Negative Regulator of Splicing). L’élément NRS est un élément bipartite. Sa région 5’ est assimilée à une séquence ESE (Exon Splicing Enhancer) à laquelle se fixent de nombreuses protéines SR tandis que sa région 3’ contient un pseudo-site 5’ non fonctionnel qui constitue un leurre qui est responsable de l’inhibition de l’épissage à l’unique site 5’ fonctionnel du virus. Seule la structure 3D de la partie 3’ du NRS qui contient le pseudo-site a été expérimentalement établie. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure 2D de la totalité de l’élément NRS à l’aide de sondes chimiques et enzymatiques. La comparaison de cette structure expérimentale à celles que nous avons établies pour d’autres éléments NRS mutants fonctionnels et non fonctionnel ainsi qu’à celles théoriques de la totalité des virus aviaires séquencés argumente en faveur de la forte signification biologique de notre modèle. Des expériences d’épissage in vitro réalisées sur l’élément NRS sauvage ainsi que ses formes tronquées ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de deux structures tige-boucles dans la fonction du NRS. Les expériences de purification de complexes formés avec un extrait nucléaire de cellules HeLa sur ces différents éléments NRS par des techniques chromatographie d’affinité ont permis de démontrer l’importance de l’association de ces deux structures tige-boucles avec les protéines SR et la snRNP U1. Nous avons défini un nouvel élément NRS minimal fonctionnel capable d’inhiber l’épissage et nous avons démontré l’activation de l’inhibition de l’épissage de l’élément NRS par la protéine 9G8 in vitro et in cellulo
Retroviruses require both spliced and unspliced RNAs for productive replication. Accumulation of unspliced RNA in Rous Sarcoma Virus (RSV) depends on the NRS element, (Negative Regulator of Splicing). The NRS element is bipartite. Its 5’ terminal part is considered as an ESE that binds SR proteins and its 3’ part contains a decoy 5’-splice site (ss), which inhibits splicing at the bona fide 5’ ss. Only the 3D structure of a small NRS fragment including the decoy 5’ ss had been experimentally studied. Here, by chemical and enzymatic probing of entire RSV NRS, we determine its 2D structure. By comparative analysis of 2D structures of functional and non-functional avian NRS variants and of all sequenced avian NRSs, we bring strong arguments for a biological significance of the established structure. By in vitro splicing assays, we show a crucial role of two of the established stem-loop structures and by affinity purification of complexes formed by WT and truncated NRSs in HeLa cell nuclear extract, we demonstrate their importance for SR protein and U1 snRNP association. We define a new small NRS element retaining splicing inhibitory properties and finally demonstrate the capability of the SR protein 9G8 to increase NRS activity in vitro and in cellulo

Une nouvelle methode de prediction a ete developpee qui donne 61% des acides amines bien predit. Cette methode a ete combinee avec celle de levin et al. Decrite en 1986 et 70% des acides amines copredits sont bien predits. Ces methodes sont incorporees dans un logiciel integre destine a la prediction des sites antigeniques potentiels d'une proteine: l'application de ces methodes a ete effectuee sur les sous-unites de l'atpase f1

Les protéines membranaires résident dans un milieu anisotrope et hétérogène. Cet environnement peut être divisé en plusieurs zones et exerce divers effets qui ont des conséquences sur la structure des protéines membranaires. J'ai donc créé et analysé un base de données de structures de protéines membranaires avec une annotation adaptée qui va audelà de celle couramment pratiquée. Après avoir valider l'approche d'annotation des différents éléments structurels, j'ai pu montrer que chacun de ces éléments ont des biais de composition caractéristiques qui découlent vraisemblablement de l'environnement. Par ailleurs, un examen de l'organisation du faisceau d'hélices dans notre base de données nous montre qu'il est difficile d'appréhender les interactions individuelles des hélices. C'est pourquoi j'ai développé Ptuba, un logiciel qui fait des projections des hélices, afin de concentrer, accumuler ou modifier l'information provenant de plusieurs sources pour faire en sorte qu'elle devienne plus compréhensible et donc exploitable. Le modèle à deux étapes propose que le réseau d'interactions entre hélices transmembranaires est le moteur principal de l'assemblage des protéines membranaires. J'ai testé cette hypothèse avec une analyse énergétique de notre base de données. Il en résulte que le modèle fonctionne dans le cas des interactions au sein d'une même chaîne mais pas vraiment dans les cas d'interactions entre chaînes. Cette différence vient d'un biais de population des interactions. Bien que les interactions entre hélices transmembranaires sont composées de deux types d'interactions distincts, j'ai mis en évidence que c'est la proportion relative de chaque type d'interaction et non leur nature qui est différente dans le cas des interactions entre chaînes. Cette analyse de la nature et assemblage des différents éléments structurels qui composent les protéines membranaires améliore notre compréhension de la stabilité des protéines membranaires et peut être servira à des efforts de prédiction d'annotation ou de structure
Membrane proteins function in an anisotropic and heterogeneous environment. This environment can be divided in several distinct zones which have different influences on the structure of membrane proteins. Therefore, I created and analysed a database of membrane proteins of known structure annotated beyond usual standards. After validating the structural annotation, I show that the different structural elements that constitute these proteins display marked composition biases that probably derive from the environment's influence. An exam of the helix bundle organisation in our database is enough to see that understanding each individual interaction between helices is difficult. That is why I created Ptuba, a program to project the helices, in order to concentrate, accumulate or modify information from many sources to render it more comprehensible and thus useable. The two step model establishes that the network of interactions between transmembrane helices drive the assembly of membrane proteins. I tested this hypothesis by the analysis of interaction energies between elements in our database. The result is that this model works for interactions within chains but not for interactions between chains. The reason behind this difference is a population bias in the type of interactions involved. In fact, although two different types of interactions exist, it is not their nature but the relative population of these interactions that gives rise to the difference in interactions between chains. This analysis of the nature and assembly of different structural elements in membrane proteins improves our comprehension of the stabilty of these proteins and could evently be used in annotation or structure prediction methods