Dissertations / Theses on the topic 'Système du double hybride de la levure'

Nous avons invalide le gene du recepteur de l'insuline (ri) chez la souris par recombinaison homologue et analyse les alterations phenotypiques qui en resultent. Les souriceaux ri (-/-) sont d'apparence normale a la naissance montrant que ri n'est pas indispensable durant la vie foetal. Toutefois, la defaillance de la signalisation par ri conduit rapidement a une hyperglycemie extreme, une hyperinsulinemie et une hyperlipidemie conduisant a un diabete avec acidocetose et steatose hepatique et a la mort des animaux dans la semaine qui suit leur naissance. Le recepteur des igfs (insulin-like growth factors) de type i (rigf-i) ne represente donc qu'un recepteur alternatif partiel pour l'action metabolique de l'insuline, apres la naissance. Nous avons derive une lignee fibroblastique a partir des souriceaux depourvus de ri et montre que rigf-i active par son ligand homologue igf-i ou par l'insuline peut conduire a la stimulation de l'entree du glucose, a l'incorporation du glucose dans le glycogene et a l'incorporation de la thymidine dans l'adn ainsi qu'a l'activation de la pi 3-kinase et de la map kinase. Rigf-i possede donc clairement un potentiel metabolique et pourrait realiser certaines actions de l'insuline. Toutefois, les courbes dose-reponses pour l'effet mitogenique avec l'igf-i ou l'insuline indiquent que les differents couples ligand/recepteur ne seraient pas equivalents. Nous avons par ailleurs etudie l'interaction directe de la sous-unite regulatrice p85 de la pi 3-kinase avec la chaine de ri et de rigf-i dans le systeme du double hybride chez la levure. Ce travail a permis de mettre en evidence des differences qualitatives et quantitatives dans l'interaction de p85 avec ri et rigf-i. L'interaction differentielle de proteines effectrices avec ces deux recepteurs pourrait contribuer a la specialite de signalisation. Nous n'avons pas pu mettre en evidence d'interaction directe des domaines sh2 de deux autres proteines effectrices, syp et gap, avec ri ou rigf-i dans ce systeme.

La cellule est une machinerie complexe et la connaissance de la totalite de l'information genetique qu'elle contient constitue la premiere etape vers la comprehension globale de son fonctionnement. Nous avons sequence 72971 pb du chromosome xv de la levure saccharomyces cerevisiae dans le cadre du programme europeen de sequencage systematique du genome. Nous avons ainsi identifie 47 genes potentiels dont 21 etaient inconnus mais partagent des similarites avec des genes connus et 6 n'ont de similarite avec aucun gene deja repertorie. Ce programme a revele que la fonction de 31% des 6142 orfs de s. Cerevisiae etait totalement inconnue. Nous avons entame l'analyse fonctionnelle de six nouveaux genes en combinant l'analyse informatique, les methodes de la genetique, et les techniques du double-hybride et de fluorescence. Des mutants de deletion pour les orfs ygl047w et ygl061c nous ont montre qu'elles correspondaient a des genes letaux. Ygl047w est un gene conserve dans differents organismes au cours de l'evolution, il code probablement pour une fonction de base de la cellule. Nous n'avons pas observe de phenotype associe a la deletion des orfs ygl053w, ygl051w et ygl050w. De plus nous avons apporte plusieurs arguments en faveur d'une location des proteines ygl053w et ygl051w, membres de la famille dup 2 4 0, au niveau de la membrane plasmique. Notre mutant de deletion pour l'orf ygl064c est deficient dans la respiration et a perdu son adn mitochondrial. Chez le sauvage la proteine ygl064c est localisee dans la mitochondrie. Ygl064c presente une forte homologie de sequence avec les arn helicases de la famille dead. Ygl064c serait donc une arn helicase mitochondriale necessaire au maintien de l'adn mitochondrial.

Divers stimuli tels que l'ischémie, l'hypoxie et l'exercice peuvent induire la déplétion en ATP provoquant une déregulation de l'homéostasie énergétique. Cependant, les cellules disposant de mécanismes compensatoires pour contrebalancer et compenser le déficit de l'état énergétique cellulaire. Deux enzymes clés participent à la régulation du métabolisme énergétique cellulaire. La créatine kinase (CK) peut réagir immédiatement comme transporteur d'énergie. D'autre part la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), régule au niveau cellulaire et du corps en entier la livraison et la consommation d'énergie. Dans ce travail de thèse, les outils de base pour realiser un criblage des cibles de l'AMPK ont d'abord été mis en place. Ce sont les protocoles multidimensionnelles pour la purification de protéines par HPLC et le criblage in vitro de cibles membranaires de l'AMPK, dont le sous-fractionnement des membranes et la separation par électrophorèse de type blue native PAGE. Différents candidats potentiels de l'AMPK ont été obtenus, et deux ont été confirmés par phosphorylation in vitro. Ensuite, une interaction entre les deux enzymes, l'AMPK et la CK, a été confirmée pour la première fois in vitro et in vivo. L'AMPK phosphoryle la créatine kinase cytosolique du cerveau (BCK) sur la serine 6 in vitro et in vivo. Cette phosphorylation a été mis en evidance à l'aide de tests de phosphorylation et d'un anticorps généré spécifique de la phospho-Ser6. Le system de double hybride en levure a montré que cette phosphorylation est acompagné par une interaction transitoire impliquant spécifiquement l'AMPK active et BCK non phosphorylé. La phosphorylation médiée par AMPK n'affecte pas l'activité enzymatique de BCK mais localise la kinase dans le réticulum endoplasmique (RE) in vivo. Le travail presente dans ce manuscript confirme une interaction entre les deux enzymes clefs dans l'homeostasis energetique. La caracherization in vitro et in vivo de la phosphorylation de la BCK par l'AMPK suggère que l'AMPK regule probablement l'associattion de BCK aux compartements subcellulaires et pas l'activité enzymatique. Cette localisation est induite par l'AMPK en cas de stress énergetique et peut soutenir des processus fortement dépendant de l'ATP dans ce microenvironnement, comme par exemple le pompage de calcium.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l'intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l'Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d'interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d'insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d'identifier un nouveau domaine indispensable à l'interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d'ASK1 chez Arabidopsis thaliana.

Le cancer de l’ovaire est le plus mortel des cancers gynécologiques. CA125 est le marqueur de progression utilisé pour effectuer le suivi des patientes atteintes de ce dernier. La protéine CA125 est surexprimée au niveau des tissus ovariens tumoraux, mais elle est non détectable avec les moyens d'aujourd'hui au niveau des tissus ovariens normaux. CA125 est une protéine dont les fonctions demeurent inconnues sinon hypothétiques. Dans notre laboratoire, la recherche est axée sur la détermination des fonctions de l’antigène tumoral CA125. Pour cela un projet de maîtrise précédent au miens a permis la mise au point d’un outil nommé anticorps monovalent modifié (ScFv) dans une lignée de cellules tumorales de l’ovaire. Cet outil permet la liaison de la protéine cible, dans notre cas CA125, et empêche sa localisation physiologique à la membrane, éliminant ainsi sa fonction dans la cellule ciblée. Grâce à cet outil, quelques rôles potentiels ont pu être proposés. CA125 aurait des implications dans la prolifération, l’adhésion cellule-cellule, la résistance à l’apoptose et la migration des cellules tumorales de l’ovaire. Pour étudier cette protéine d’un point de vue moléculaire, mon projet principal consistait à effectuer un criblage double-hybride nucléaire chez la levure pour découvrir des interactions protéiques à une échelle cellulaire. En parallèle, l’utilisation de la méthode d’immunoprécipitation avec des cellules tumorales de l’ovaire en tant que projet secondaire avait pour but de vérifier des voies de signalisation spécifiques. Grâce aux résultats précédents obtenus par des expériences antérieures dans le laboratoire ainsi qu'à ceux obtenus pour d’autres mucines, certaines voies de signalisation démontraient un potentiel intéressant pour l’implication de la protéine CA125. Par des expériences d'immunoprécipitation, nous avons découvert que des complexes protéiques contenant la protéine E-cadhérine et la protéine β-caténine contiennent aussi CA125. Ces protéines sont impliquées dans la prolifération et l’adhésion cellulaire. Certaines fonctions hypothétiques de CA125 sont reliées à ces processus cellulaires, c’est-à-dire l’adhésion cellule-cellule et la prolifération cellulaire. Ces interactions protéiques permettront de mieux comprendre l’implication de CA125 dans ces processus cellulaires. Mon projet principal était la mise au point d’un double-hybride nucléaire chez la levure. Pour y parvenir, nous avons dû modifier les protocoles proposés normalement pour ce type de double-hybride. Nous avions choisi d’effectuer notre criblage avec le domaine cytoplasmique de CA125. Par contre, étant donné que ce domaine est très court seulement 31 a.a., le domaine transmembranaire de CA125 a été ajouté au premier domaine mentionné pour favoriser une conformation protéique adéquate. Le domaine cytoplasmique de CA125 a été choisi pour tenter de mieux comprendre d’un point de vue moléculaire les voies de signalisation dans lesquelles cet antigène tumoral est impliqué. Lors du premier essai pilote de double-hybride effectué, nous avons repêché une protéine qui interagit probablement de manière non spécifique avec CA125 selon des statistiques recueillies lors de criblages pour d’autres protéines transmembranaires. Pour remédier à ce problème majeur, nous avons recherché la source de ce problème. Nous avons alors réalisé que les levures utilisées n’étaient pas les Saccharomyces cerevisiae PJ69-4A que nous avions choisies pour effectuer notre double-hybride. Par la suite, les levures ont été maintenues sur des milieux sélectifs pour les PJ69-4A, c’est-à-dire en absence de lysine (Lys -). Pour parvenir à obtenir des colonies positives lors de la transformation de l’ADN de la librairie avec notre construction, il nous a fallu amplifier les transformants en milieu liquide toute la nuit en sélectionnant pour les vecteurs et la levure. Une fois les transformants amplifiés, nous avons obtenu des candidats potentiels qui ont franchi les différentes étapes de sélection du double-hybride. D’autres techniques ont dû être adaptées à nos besoins pour parvenir à mettre au point notre double-hybride nucléaire chez la levure pour notre protéine transmembranaire. Grâce à ces efforts, certains candidats ont été séquencés et la première protéine découverte par ce criblage est RNF5 (ring finger protein 5). Cette dernière est impliquée dans la régulation de la motilité cellulaire. CA125 semble être aussi impliqué dans ce processus. Il est alors possible de relier CA125 à RNF5. Ce premier résultat nous suggère que nous avons réussi à mettre au point un double-hybride nucléaire chez la levure pour l’antigène tumoral CA125.

Les molécules du CMH de classe II sont cruciales pour le bon fonctionnement du système immunitaire. Leur rôle est de présenter les antigènes provenant de pathogènes aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ et de permettre ainsi la réponse immunitaire. Leur expression est principalement régulée au niveau transcriptionnel par le transactivateur CIITA (CMHII transactivator). CIITA est un régulateur particulier car il possède un domaine d’activation de la transcription, mais ne dispose pas de domaine de liaison à l’ADN. Ainsi, pour activer la transcription, CIITA doit interagir avec plusieurs autres protéines qui sont fixées au niveau du promoteur des CMHII. Il possède également une région de liaison à la GTP et des domaines répétés riches en leucines (LRR pour « leucine rich repeats ») en c-terminal connues comme étant importants pour les interactions protéiques. Pour mieux étudier l’importance de ces différents domaines pour les fonctions transactivatrices, plusieurs différents mutants de CIITA ont été générés. De nombreuses études ont aussi tenté d’expliquer la localisation nucléocytoplasmique de CIITA et de l’inter relier aux fonctions transactivatrices. Malgré tout, le mécanisme d’importation au noyau de CIITA ainsi que son mode de transactivation ne sont pas totalement démystifiés. Il est connu que les interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans les mécanismes cellulaires. CIITA est dépendant de ce type d’interaction pour activer la transcription des CMHII. Aussi, plusieurs indices suggèrent la présence de partenaires encore inconnus et par système double hybride de levure, quelques laboratoires ont tenté de les trouver, mais sans succès. Il est connu que certaines interactions protéiques peuvent passer inaperçues dans ce système et il est probable que cet échec est plutôt dû à la technique de criblage plutôt qu’à l’absence de protéine d’interaction. Dans ce projet, un système double hybride de mammifère se basant sur celui chez la levure a donc été développé et utilisé pour tenter de trouver les partenaires inconnus de CIITA. Le système développé utilise un appât couplé à un domaine de liaison à l’ADN (GAL4DBD pour ‘DNA binding domain’) et une proie couplée à un domaine d’activation de la transcription (VP16). CIITA sans son domaine d’activation et couplé à Gal4DBD constitue « l’appât ». La « proie » est une banque d’ADN complémentaire de Raji liée au domaine VP16. De plus, pour repérer et tester de nouvelles interactions protéiques avec CIITA, quelques constructions de CIITA manquant certains domaines et couplé à Gal4DBD ont été fabriquées. Ensuite, la cassette d’expression des gènes rapporteurs a été intégrée au génome de la lignée cellulaire RJ 2.2.5 (Lymphome de Burkitt) en utilisant une adaptation du système Flp-In™ d’Invitrogen. Cette nouvelle lignée a été nommée RjFlp-casset. Grâce au promoteur synthétique Gal4 de la cassette d’expression, lorsque l’appât et la proie interagissent, VP16 active la transcription des gènes rapporteurs CD8a’ et blasticidineR. Ensuite, les cellules ont été sélectionnées par tri cellulaire en utilisant des billes magnétiques et/ou traitement à la blasticidine ou à la puromycine (gène de résistance sur le vecteur proie). Toutes les combinaisons de traitements ont été utilisées. L’ADN épisomale des cellules où les gènes rapporteurs s’exprimaient a été extrait et amplifié dans E. coli pour être ensuite analysé sur gel d’agarose. Plusieurs rondes de transfection/sélection/extraction/retransfection ont été faites. Malheureusement, après plusieurs mois de criblage, aucune nouvelle interaction impliquant CIITA n’a été découverte. Quelques modifications et perfectionnements de la stratégie semblent être nécessaires. Par exemple, développer une ligné cellulaire RjFlp-casset avec en plus l’appât intégré au génome augmenterait les chances de réussite par la présence constitutive de l’appât.[Symboles non conformes]

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

La paroi de Saccharomyces cerevisiae est une structure protectrice extracellulaire dont la synthèse est contrôlé par une voie de signalisation cellulaire MAPkinase. Au sein de cette voie, la protéine Knr4 jouerait un rôle dans la coordination de la synthèse de paroi avec l'émergence du bourgeon et la croissance cellulaire. Cette protéine, dont le gène correspondant avait initialement été cloné par complémentation d'un mutant résistant à la toxine killer K9, a fait l'objet d'une étude fonctionnelle. Dans un premier temps, nous avons présenté des arguments expérimentaux suggérant que cette protéine présente une structure secondaire et tertiaire atypique, et qu'elle fait partie d'un complexe protéique. En appliquant des techniques génétiques (létaux synthétiques, double-hybride) et biochimiques (purification des protéines par affinité en tandem), nous avons pu établir une carte d'un réseau de l'interaction "in vivo" de cette protéine. L'ensemble des partenaires protéiques identifiés ont confirmé que cette protéine intervenait dans deux processus biologiques majeurs : la synthèse de la paroi et l'établissement de la polarité de la cellule. Enfin, nous avons montré que la phosphorylation de deux résidus sérine (S200/S203) semble nécessaire pour obtenir une interaction optimale avec ses partenaires
The cell wall of Saccharomyces cerevisiae is a protectrice extracellular structure. Its synthesis is mainly under controlled by a MAP kinase signalisation pathway. Related to this pathway, the protein Knr4 implicated in the coordination of the cell wall synthesis with bud emergence. This protein, whose gene was originally isolated by complementation of a mutant resistant to the toxin killer K9, has been the subject of a functional study. First, we provided several experimental arguments suggesting that this protein displays an unfolded secondary and tertiary structure and takes part of a multiprotein complex. Secondly, by applying genetic (Synthetic lethal and Two-hybrid system) and biochemical techniques (Tandem affinity Purification) we established a map of an "in vivo" interaction network for this protein. The interaction identified show that Knr4p is associated to two major biological processes: the cell wall synthesis and the establishment of the cellular polarity/bud emergence. Furthermore, we showed that the phosphorylation of two serines residues (S200/S203) seems necessary to obtain an optimal interaction of this protein with its partners. Taken together, these results consolidates the notion that Knr4 is one of the proteic elements physically connecting the cell wall synthesis and the budding machinery during cell growth

Une propriété clé des systèmes biologiques est la présence d'un réseau d'interactions protéiques, crucial pour toute fonction cellulaire comme par exemple la régulation du métabolisme énergétique. Deux enzymes clé impliquées dans cette régulation sont la créatine kinase (CK), dont la fonction consiste dans la gestion du stock et du transfert d'énergie, et la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), qui régule l'homéostasie énergétique au sein de la cellule et de l'organisme entier. Dans un premier temps un crible de double hybride en levure original fut appliquée afin d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction de la CK cytosolique du cerveau (BCK) et de l'AMPK dans le cerveau humain. Différents candidats d'interaction furent identifiés, dont des protéines membranaires associées aux vésicules (VAMP) interagissant avec les deux kinases. L'interaction AMPK-VAMP fut confirmée par co-immunoprecipitation à partir de vésicules synaptiques, mais ne menait pas à la phosphorylation de VAMP, suggérant que VAMP recrute AMPK pour la régulation de processus d'endo- et d'exocytose. Une seconde stratégie combinant un essai d'interactions biophysique, basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), avec des essais de phosphorylation in vitro permit la sélection de cibles AMPK isoforme spécifique. Une de ces cibles fut la fumarate hydratase, dont la phosphorylation préférentielle par l'AMPK221 provoque une augmentation de l'efficacité enzymatique in vitro. Finalement, une classe de candidats d'interaction, les glutathion S-transferases GSTM1 et -P1, fut caractérisée en détail par un panel de méthodes d'interactomique (SPR, double hybride, co-immunoprécipitation). Cette étude les identifie comme interacteurs fiables à haute affinité ainsi que nouveaux substrats de l'AMPK. Dans le cas de GSTP1 la phosphorylation par AMPK provoque une augmentation de son activité enzymatique suggérant un rôle direct de la signalisation par AMPK dans la défense contre le stress oxydatif.

La dystrophine, proteine impliquee dans la dystrophie musculaire de duchenne (dmd), et son complexe etablissent un lien entre la matrice extra- cellulaire et le cytosquelette du muscle squelettique. Mon travail s'est articule en deux parties : (i) la recherche de proteines associees a la dystrophine dans le tissu cerebral et cardiaque et (ii) l'etude de l'implication de l'apoptose dans differentes pathologies musculaires, dont la dmd. La dystrophine et ses partenaires possedent de nombreuses isoformes tissu- et developpement- specifiques. Cette panoplie s'enrichit encore de proteines apparentees a la dystrophine et de leurs isoformes. Neanmoins, en dehors du muscle squelettique, les partenaires de cette famille de proteines sont tres mal connus. Pourtant, une meilleure connaissance de l'agencement de ces proteines dans des tissus comme le coeur ou le cerveau, permettrait de mieux comprendre les defauts cardiaques et cognitifs associes a la dmd. Nous avons, dans un premier temps, recherche de nouveaux partenaires proteiques de la dystrophine dans ces deux tissus par la technique du double- hybride dans la levure. Ce travail nous a permis de valider in vivo l'interaction de l'1- syntrophine avec la dystrophine, de cloner la sequence humaine de l'1- syntrophine, et de preciser sa region d'interaction avec la dystrophine. Enfin, nous avons caracterise un nouveau potentiel partenaire de l'extremite carboxy- terminale de la dystrophine et de l'utrophine dans le cerveau. De nombreux travaux ont recemment rapporte l'existence d'un processus apoptotique dans le muscle mdx, modele murin de deficience en dystrophine, mais aussi dans de nombreuses autres pathologies musculaires comme la deficience en merosine, la denervation ou encore l'ischemie-reperfusion myocardique. Toutefois, l'intervention de ce processus dans la physiopathologie de ces affections n'etait pas demontree jusqu'a present. Nous avons developpe des lignees de souris transgeniques surexprimant la proteine humaine bcl- 2 specifiquement dans le muscle et le coeur, et teste la capacite de ce facteur anti- apoptotique a ameliorer, par une diminution de l'apoptose, le phenotype observe dans ces quatre pathologies. Les principaux resultats de cette etude sont les suivants : - bcl- 2 ne semble pas capable de proteger le muscle de l'atrophie musculaire induite par une denervation, malgre l'observation d'une baisse significative du nombre de noyaux en apoptose, suggerant que ce processus intervient peu dans le phenotype musculaire pathologique. - en revanche, la surexpression de cette proteine permet de reduire significativement l'etendue des lesions d'ischemie- reperfusion myocardiques induites par occlusion temporaire de l'artere interventriculaire anterieure de la souris. Cet effet protecteur est associe a une amelioration de la fonction cardiaque et a une diminution de l'apoptose. Ainsi, la composante apoptotique observee au cours de la phase aigue de l'infarctus du myocarde constitue-t-elle un reel enjeu therapeutique dans lequel le facteur bcl- 2 pourrait jouer un role essentiel.

Les polyomavirus sont des virus très prévalents dans la population générale. Chez les sujets immunodéprimés, quatre polyomavirus sont associés à des pathologies. Parmi ces virus, le MCPyV est quant à lui responsable du carcinome à cellules de Merkel. Son implication dans un cancer humain a conduit à un regain d’intérêt pour la famille des Polyomaviridae. Au cours de ma thèse, nous nous somme intéressés à l’épidémiologie de six nouveaux polyomavirus humains (MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9 et MWPyV). Ces études ont montré que ces virus sont très répandus dans la population générale et que les infections surviennent dès l’enfance. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux réactivités croisées entre polyomavirus humains et simiens phylogénétiquement proches. Nous avons montré qu’il existe des cross réactions entre le LPyV et l’HPyV9, entre le MCPyV et deux virus de chimpanzé (PtvPyV1 et PtvPyV2). Ces polyomavirus simiens ne circulent donc pas chez l’Homme. D’autre part, afin de mieux comprendre le cycle du MCPyV, nous avons initié l’identification des partenaires cellulaires de l’ensemble de ses protéines. Ce travail a tout d’abord été réalisé sur les protéines mineures de capside VP2/VP3. Des cribles en double hybride en levure ont permis d’identifier les partenaires cellulaires des VP2/3. L’interaction effective entre les protéines virales et cellulaires a ensuite été validée en cellules de mammifères par une approche de complémentation de la luciférase Gaussia princeps. Les partenaires cellulaires des protéines VP2/VP3 identifiés sont impliqués dans les voies de prolifération cellulaire, d’apoptose, NF?B et dans le transport intracellulaire du virus
Polyomaviruses are ubiquitous in the general population and in immunocompromised patients, and four are associated with disease. 0f these viruses, MCPyV is responsible for Merkel ceil carcinoma, and its involvement in human cancer has led to a renewed interest in the Polyomaviridae family. My thesis work has focused on the epidemiology of six new human polyomaviruses (MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9 and MWPyV). These studies have shown that these viruses are widespread in the genera population and that infection occurs in early childhood. We have also focused on cross-reactivity between phylogenetically closely related human and simian polyomaviruses. We have shown that there is cross-reactivity between sirnian virus LPyV and HPyV9 and between MCPyV and two chimpanzee viruses (PtvPyVl and PtvPyV2). However, these simian polyomaviruses do not circulate in humans. Moreover, in order to improve understanding of the cycle of MCPyV, we set out to identify the cellular partners of its proteins. This work was initially performed on minor capsid proteins VP2 and VP3. Screening in yeast two-hybrid identified cellular partners of VP2 and VP3. Interactions between viral and cellular proteins were then validated in mammalian celis by complementation assay using Gaussia princeps luciferase. Cellular patners of VP2 and VP3 are involved in ceil proliferation, apoptosis, NFkB and intracellular transport of the virus

La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d’une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d’intérêt, il est alors possible d‘observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l’aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d’obtenir une qualité d’image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d’utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d’intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l’étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l’insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s’associent de manière transitoire dans la membrane. L’observation sur la durée de ces foci, et l’analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l’ensemble de la membrane de manière uniforme. L’analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante ΔclsA, on n’observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l’incorporation d’un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d’interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d’etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l’état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane
In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis

L’établissement de la symbiose Rhizobium-Légumineuse repose sur une reconnaissance spécifique par la plante hôte de signaux microbiens : les facteurs Nod. Chez Medicago truncatula, la voie de signalisation Nod fait intervenir DMI3, une protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline (CCaMK), impliquée dans le décodage des oscillations calciques générées dans le noyau en réponse aux facteurs Nod. Le travail de thèse a visé à identifier les substrats ou les régulateurs de la CCaMK afin de mieux comprendre son mode d’action. L’étude comparée du phosphoprotéome racinaire de la lignée sauvage et du mutant dmi3 d’une part, et une approche double hybride d’autre part, ont été réalisées. Une protéine nucléaire, de fonction inconnue, interagissant avec l’enzyme a été identifiée
During the establishment of the rhizobia-legume symbiosis, the host specificity is mediated by bacterial signals named “Nod factors”. Several genes are involved in the Nod factor signal pathway in the model legume Medicago truncatula. Among them, DMI3 is a calcium/calmodulin dependent kinase and is hypothesized to decode the calcium spikes generated into the nucleus in response to Nod factors. The aim of my work was to identify substrates or regulators of DMI3. A root phosphoproteome analysis between wild-type and a mutant strain has been carried out to isolate substrates of DMI3/CCaMK. A yeast-two hybrid approach was aimed at identifying protein partners of DMI3. Then, a novel nuclear protein of unknown function, interacting with DMI3, has been identified

Les gènes impliqués dans le système FAS-II ont été clonés dans des vecteurs permettant l'étude des interactions protéine-protéine à l'aide du système double-hybride chez la levure. Cette étude génétique a été complétée par une analyse en co-immunoprécipitation. Nous avons démontré qu'il existait des interactions homotypiques et hétérotypiques entre les enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques. De plus, certaines interactions homotypiques se sont révélées être vitales puisque des variants protéiques ont un effet dominant négatif lorsqu'ils sont introduits in vivo chez M. Tuberculosis, M. Bovis BCG et M. Smegmatis. Nous avons ainsi pu identifier des interactions précises, spécifiques et essentielles dont la suppression provoque la mort des mycobactéries. Cette étude pourrait représenter un premier pas vers l'identification de nouveaux antibiotiques peptidiques qui cibleraient spécifiquement les interactions protéine-protéine essentielles à la survie du pathogène
The genes coding for the enzymes implicated in the FAS-II system were cloned into vectors allowing the study of protein-protein interactions in a yeast two-hybrid system. This study was reinforced by a biochemical analysis based on co-immunoprecipitation experiments. We showed that there were both homotypic and heterotypic interactions between the enzymes implicated in the biosynthesis of mycolic acids. Moreover, these homotypic interactions proved to be essential since some variants of these proteins have a dominant negative effect when they are introduced in vivo into M. Tuberculosis, M. Bovis BCG and M. Smegmatis. Thus, we identified precise, specific and essential interactions whose suppression leads to the death of mycobacteria. All these interactions could represent a first step towards the identification of new peptidic or peptido-mimetics antibiotics that would be able to act by specifically targeting the protein-protein interactions, which are essential for mycobacteria

Un nouveau facteur de transcription, appartenant à la famille des protéines à domaine bHLH, a récemment été isolé dans notre laboratoire. Initialement appelé « clone bc8 » puis HRT1, ce facteur présentait des similitudes avec les protéines Hairy and Enhancer of split qui interviennent notamment dans le phénomène d’inhibition latérale lors de la formation du tissu neural. Des études d’hybridation in situ réalisées chez l'embryon de xénope ont suggéré un rôle important de XHRT1, la protéine HRT1 de xénope, dans le développement neural. Nous avons recherché les partenaires protéiques de XHRT1 par la technique du double-hybride afin de mieux comprendre son mécanisme d’action moléculaire dans la neurogenèse.

Tout d’abord nous avons construit les outils appropriés pour l’élaboration du travail, à savoir, les clones de levures exprimant les appâts spécifiques des domaines de la protéine étudiée et la création d’une banque d’ADNc du xénope au stade de la neurulation. Ensuite, trois criblages ont été réalisés. Dans le premier cas, nous avons recherché les partenaires des domaines bHLH et Orange (bHLH-O). Le domaine bHLH est en effet responsable de la dimérisation de ce type de protéine. Le domaine Orange qui suit le domaine bHLH, pourrait participer dans le choix du partenaire d’hétérodimérisation. Nous avons isolé deux facteurs de type bHLH-Orange apparentés à HRT1, XHairy1 et XHairy2b et confirmé leur interaction avec XHRT1. Les domaines impliqués dans ces interactions sont les bHLH-O pour les trois facteurs. Ce même criblage nous a permis d’isoler un nouvel ADNc qui code une protéine sans domaine apparent connu actuellement. Nous avons montré que cette protéine reconnaissait spécifiquement le domaine Orange de HRT1 mais pas celui des autres facteurs de type bHLH-O. Elle a été baptisée BOIP pour Bc8 Orange Interacting Protein. Le rôle physiologique de cette interaction n’a pu être démontré. Nous avons établi que la protéine BOIP pouvait aussi s’homodimériser. Nous avons aussi déterminé son profil d’expression chez le xénope et la souris. Son transcrit est hautement présent dans les testicules adultes. La protéine pourrait donc jouer un rôle important dans la spermatogenèse. Les deux autres criblages, utilisant les domaines situés dans la partie C-terminale de XHRT1, ont apporté des nouveaux partenaires potentiels, mais ces interactions n’ont pu être confirmées dans un système indépendant.

Enfin, en étudiant plus en détail les interactions entre XHRT1 et XHairy1 ou XHairy2b, nous avons mis à jour une possible fonction de spécificité dans le choix du partenaire dans la région C-terminale de HRT1. La formation de ces dimères pourrait jouer un rôle dans la formation du tube neural mais également dans d’autres différenciations tissulaires.

Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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Chez les eucaryotes, la voie de protéolyse Ub/ protéasome 26S est responsable de la dégradation sélective de la plupart des protéines intracellulaires. Cette dégradation par le protéasome 26S est initiée par une polyubiquitination de la protéine réalisée grâce à l’action d’une cascade enzymatique impliquant 3 types d'enzymes nommées « ubiquitin-activating enzyme » (E1), « ubiquitin-conjugating enzyme » (E2) et « ubiquitin-protein ligase » (E3). Il existe différentes classes d’ubiquitines ligases (E3), parmi lesquelles la plus connue est le complexe SCF (Skp1-Cullin-F-box). La protéine SKP1 fixe à la fois la Culline et la F-box qui va reconnaitre spécifiquement la protéine cible. Contrairement aux protistes, les champignons et certains vertébrés qui possèdent un unique gène SKP1 fonctionnel, de nombreux animaux et espèces de plantes présentent plusieurs SKP1 homologues. Vingt et un et trente deux gènes SKP1 ont été décrits respectivement chez Arabidopsis thaliana et Oryza sativa. En dépit de l’importance du complexe SCF, chez le riz, peu de travaux décrivent les interactions entre les dizaines de protéines « SKP1-like » et les centaines de protéines F-box. Dans un premier temps, nous avons collecté et analysé les séquences de 288 gènes « SKP1-like » appartenant à 17 espèces, dont la mousse Physcomitrella patens, cinq monocotylédones et 11 eudicotylédones. Les analyses structurales et phylogénétiques de ces gènes indiquent qu’ils peuvent être divisés en différentes sous-familles. Nos analyses ont montré qu’OSK1 et OSK20 chez le riz constituent une classe de gènes SKP1 à intron unique conservé. Dans un deuxième temps, nous avons étudié le profil d’expression des gènes « SKP1-like » chez le riz. Notre investigation sur le nombre d’EST a montré que les gènes OSK1 et OSK20 sont les plus largement représentés dans les bases de données EST publiques. La méta-analyse de l’expression des gènes « SKP1-like » chez le riz, indique que les gènes OSK présentent des profils d'expression hétérogènes selon les tissus et les conditions physiologiques. Les résultats des intearctions protéine-protéine en double hybride ont révélé que les protéines OSK présentent différentes capacités d’interactions avec les protéines F-box. Cependant, OSK1 et OSK20 semblent interagir avec la plupart des protéines F-box testées. Les études de localisation subcellulaire ont indiqué que OSK1 et OSK20 sont des protéines nucléaires et cytosoliques. En se basant sur les divers résultats obtenus dans ce travail, nous pouvons suggérer que chez le riz, les gènes OSK1 et OSK20 sont fonctionnellement équivalents aux gènes ASK1 et ASK2 chez Arabidopsis thaliana. Nous pouvons également proposer les équivalents de ces gènes chez les autres espèces végétales dont le génome a été séquencé
In eukaryotes, the ubiquitin Ub/26S proteasome pathway is responsible for the selective degradation of most intracellular proteins. This cellular process is initiated by protein polyubiquitination mediated by a three-step cascade involving: an ubiquitin-activating enzyme (E1), an ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and an ubiquitin-protein ligase (E3). The E3 ubiquitin ligases contain several classes, among which the best-known are Skp1-Cullin-F-box (SCF) complexes. The SKP1 protein binds both Cullin and F-box which recognizes specifically the target proteins. Whereas protists, fungi and some vertebrates have a single functional SKP1 gene, many animal and plant species possess multiple SKP1 homologues. Twenty one and thirty-two SKP1-related genes have been described respectively in the Arabidopsis and Oryza sativa genome. Despite the importance of the SCF complex, there have been a few reports of systematic surveys of interactions between the dozens of SKP1-like proteins and the hundreds of F-box proteins in rice. In a first step, we retrieved and analyzed 288 SKP1-like genes belonging to 17 species including the moss Physcomitrella patens, five monocots and 11 eudicots. Structural and phylogenetic analysis of rice OSK genes and other plant SKP1-like genes have indicated that the different members of the plant SKP1 can be split into different subfamily. Our analyses indicated that OSK1 and OSK20 belong to a class of SKP1 genes that contain one intron at a conserved position. In a second step, we studied expression profiles of the rice Skp1-like genes. Our EST survey indicated that OSK1 and OSK20 are the most widely represented genes in public EST databases. Meta-analysis of the expression of rice SKP1-like genes indicated that OSK genes exhibit an expression profile that was heterogeneous in terms of tissues, conditions and overall intensity. Yeast two-hybrid results revealed that OSK proteins display a differing ability to interact with F-box proteins. However, OSK1 and OSK20 seemed to interact with most F-box proteins tested. Subcellular localization studies indicated that OSK1 and OSK20 are nuclear and cytosolic proteins. Based on the results obtained in this study, we can suggest that rice OSK1 and OSK20 are likely to have similar functions as do the Arabidopsis ASK1 and ASK2 genes. Similarly, we suggest a list of functional equivalent in the other sequenced plant genomes

Le polyomavirus à cellules de Merkel est aujourd’hui reconnu comme l’agent étiologique du carcinome à cellules de Merkel (CCM). Le cycle viral et les mécanismes de l’oncogenèse viro-induite sont peu connus et les connaissances se basent essentiellement sur les études menées notamment sur le polyomavirus SV40. L’objectif des travaux de thèse était d’identifier les interactions entre les protéines virales et les protéines cellulaires lors de l’infection ou dans le contexte du carcinome à cellules de Merkel (CCM). Pour identifier ces interactions, nous avons réalisé des cribles double hybride en levures sur les oncogènes du MCPyV et du BKPyV. Afin valider les interactions obtenues en levures, nous avons utilisé une méthode orthogonale de validation par complémentation en cellules de mammifères reposant sur la restauration de la luciférase de Gaussia princeps. La combinaison de ses deux techniques nous a permis de valider des interactions avec des partenaires cellulaires impliqués dans la régulation du cycle cellulaire ou encore de la voie Akt-mTOR. Les précédents travaux du laboratoire, qui portaient sur l’interactome des protéines mineures de capsides VP2/VP3, avaient également permis d’identifier des interactions avec des protéines de la voie NF-kB. Nous avons alors testé les interactions entre les oncogènes et la protéine mineure de capside VP2 avec des protéines cellulaires impliquées dans cette voie. Ces travaux nous ont conduits à tester l’activation de la voie, l’expression des gènes sous le contrôle de NF-kB et la régulation de l’apoptose. Les résultats obtenus montrent une action de la protéine VP2 sur l’activation de la voie NF-kB et une induction de l’apoptose
The Merkel cell polyomavirus is now recognized as the etiologic agent of Merkel cell carcinoma (MCC). The viral cycle and viro-induced oncogenesis mechanisms are not fully understood and the knowledge is mainly based on the studies carried out particularly on the SV40 polyomavirus. The aim of our work is to identify interactions between viral proteins and cellular proteins during productive infection or in MCC context. To identify these interactions, we performed yeast two hybrid screens on MCPyV and BKPyV oncogenes, as control. To validate the interactions obtained in yeasts, we used an orthogonal method of validation by complementation in mammalian cells based on the restoration of Gaussia princeps luciferase. The combination of these two orthogonal techniques allowed us to validate interactions with cellular partners involved in cell cycle regulation or Akt-mTOR pathway. Previous lab work on VP2/VP3 minor capsid proteins allowed the identification of interactions with NF-kB pathway involved proteins. We examined the interactions between oncogenes, VP2, with the cellular proteins involved in this pathway. This work led us to evaluate pathway activation, genes expression under the control of NF-kB and apoptosis regulation. These results evidenced an action of the VP2 protein on the activation of NF-kB pathway and an induction of apoptosis

Les systèmes de sécrétion de type VIIb sont des machines moléculaires récemment identifiées dans les Firmicutes et ressemblant au T7SS mycobaterial. Malgré leur homologie de séquence limitée, les protéines T7SS et T7bSS présentent des similitudes structurelles frappantes, les protéines WXG100. Cependant, les T7bSS restent en grande partie obscurs à ce jour, tant du point de vue fonctionnel que structurel. Les informations disponibles ne permettent pas d'établir des liens entre les données structurelles et la sécrétion, et leur mécanisme de transport reste flou. Ici, nous avons étudié le T7bSS de B. subtilis. Nous rapportons des résultats montrant la capacité de B. subtilis à assurer la médiation de la destruction des bactéries E. coli de manière dépendante de T7bSS Nous présentons la première étude systématique du réseau d'interactions protéine-protéine dans B. subtilis T7bSS, révélant de nouvelles interactions entre sous-unités. Il a été démontré que la protéine YukC interagissait avec chaque composant du T7bSS, sous-jacente à sa importance dans l’assemblage du complexe de sécrétion. La structure cristallographique de YukC a été obtenue. Il s’agit, à notre connaissance, du premier modèle de protéine membranaire complète de T7bSS. L'analyse des caractéristiques structurelles de YukC confirme l'hypothèse selon laquelle cette protéine est impliquée dans la transduction du signal et l'assemblage de T7bSS. Son interaction avec YukE et YueB a été étudiée et la structure cristalline de YukE obtenue à 1,5 Å. Nos résultats apportent une compréhension nouvelle sur le T7bSS mal caractérisé, ouvrant de nouvelles perspectives pour la compréhension de son rôle et de son organization
Type VIIb Secretion Systems (T7bSSs) are molecular machines recently identified in Firmicutes resembling the mycobaterial T7SS. Despite their limited sequence homology, T7SS and T7bSS have substrates with striking structural similarities, the WXG100 proteins. Moreover, recent advances proposed that T7bSS is involved in intra-species competition in Firmicutes. However, T7bSSs remain largely obscure to date, both from a functional and structural point of view. The available information do not allow drawing connections between structural data and secretion, and their transport mechanism remains unclear. Here we investigated the T7bSS of Bacillus subtilis as a model system. We report preliminary result showing the B. subtilis ability of mediating killing of the negative bacteria E. coli in a T7bSS-dependent way. We also present the first systematic investigation of the protein- protein interaction network in B. subtilis T7bSS, revealing novel subunit interactions. The protein YukC is shown to interact with every component of the T7bSS, underlying its importance in the assembly of the secretion complex. The crystallographic structure of YukC was obtained at 2.9 Å resolution. This is, to our knowledge, the first model of a full-length membrane protein of T7bSS. Analysis of YukC structural features supports the hypothesis that this protein is involved in signal transduction and T7bSS assembly. Its interaction with YukE and YueB was investigated and the crystal structure of YukE obtained at 1.5 Å. Overall, our results bring novel understanding on the poorly characterized T7bSS, opening new perspectives for the understanding of its role and its molecular organization