Dissertations / Theses on the topic 'Tejido adiposo'

Obesity is one of the most important public health problems facing the world today. Gene expression studies applied to fat depots from obese subjects have provided important clues about the pathophysiology of adipose tissue. The data collected in this thesis show that the synthesis of fatty acids (lipogenesis) is decreased in the adipose tissue of obese subjects, and describe the behavior of a new lipogenic factor. We also demonstrate that subcutaneous fat (beneath the skin of the buttocks, thighs and abdomen) is characterized by a greater responsiveness to thyroid hormones than the visceral (around the omentum, the intestines and the perirenal areas), and describe the increased activity of enzymes that activate thyroid hormones in adipose tissue of obese patients and the effects on the metabolism. According to these results, the local activation of thyroid hormone and the ability to synthesize fat are altered in adipose tissue from obese patients, and indicate significant differences between visceral and subcutaneous adipose tissue depots.
La obesidad es uno de los problemas de salud pública más importante. Los estudios de expresión aplicados a los depósitos de grasa en sujetos obesos han aportado importantes indicios sobre la fisiopatología del tejido adiposo. Los datos recogidos en esta tesis doctoral demuestran que la síntesis de grasa (lipogénesis) está disminuida en el tejido adiposo del paciente obeso, y describen el comportamiento de un nuevo factor lipogénicos. Se demuestra además que el tejido adiposo subcutáneo (situado bajo la piel de las nalgas , muslos y abdomen) está caracterizado por una mayor capacidad de respuesta a las hormonas tiroideas respecto al adiposo visceral (alrededor del epiplón, los intestinos y las áreas perirrenal) y se describe un incremento en la actividad de las enzimas que activan las hormonas tiroideas en el tejido adiposo del paciente obeso y los posibles efectos de esta eventualidad sobre el metabolismo. Según los resultados recopilados en esta tesis doctoral, la activación local de hormonas tiroideas y la capacidad para sintetizar acidos grasos del tejido adiposo del paciente obeso están alteradas, e indican importantes diferencias entre los depósitos de grasa visceral y subcutáneo.
L’obesitat és un dels problemes de salut pública més important. Els estudis d'expressió aplicats als dipòsits de greix en subjectes obesos han aportat importants indicis sobre la fisiopatologia del teixit adipós. Les dades recollides a aquesta tesi doctoral demostren que la síntesis de greix (lipogènesis) està disminuïda al teixit adipós del pacient obès, i descriuen el comportament d'un nou factor lipogènic. Es demostra, a més a més, que el teixit adipós subcutani (situat sota la pell de les natges, cuixes i abdomen) està caracteritzat per una major capacitat de resposta a les hormones tiroidees respecte a l'adipós visceral (al voltant de l’epipló, els intestins i las àrees perirenals) i es descriu un increment en l’activitat dels enzims que activen les hormones tiroidees al teixit adipós del pacient obès i els possibles efectes d'aquesta eventualitat sobre el metabolisme. Segons els resultats recopilats a aquesta tesi doctoral, l’activació local d'hormones tiroidees i la capacitat per sintetitzar greixos del teixit adipós del pacient obès estan alterades, i indiquen importants diferències entre els dipòsits de greix visceral i subcutani.

Las enfermedades cardiovasculares se desarrollan como consecuencia de la interacción entre factores genéticos y ambientales. Los factores de riesgo cardiovascular son una serie de condiciones que favorecen la aparición de eventos cardiovasculares, e incluyen la obesidad, la diabetes, la dislipemia y la edad entre otros. En los últimos años, la investigación de los mecanismos responsables del desarrollo de enfermedad cardiovascular ha tenido como importante objeto de estudio el tejido adiposo, ya que además de jugar un papel crucial en la regulación de la homeostasis energética, ha demostrado actuar como un potente órgano endocrino, y ser una fuente de células madre mesenquimales adultas (ASC). Se trata de células multipotentes, de fácil obtención, con propiedades inmunomoduladoras y con la capacidad de diferenciarse a múltiples linajes celulares. Por estas características, las ASC se consideran un candidato ideal para su uso en terapia celular y son objeto de numerosos estudios en medicina regenerativa. Sin embargo, es poco conocido el papel que juegan las ASC en el desarrollo de la patología cardiovascular, y el impacto que los factores de riesgo tienen sobre su funcionalidad. En esta tesis hemos analizado las propiedades fenotípicas y funcionales de las ASC de distintas localizaciones adiposas en un modelo animal con acumulación de factores de riesgo. Hemos detectado diferencias intrínsecas de las ASC residentes en los distintos depósitos de grasa, relacionadas con su potencial de diferenciación, que se ven incrementadas en una situación patológica. Estas diferencias en las ASC ayudan a explicar la menor capacidad de expansión del tejido adiposo visceral y su consecuente mayor riesgo metabólico. Por otro lado, hemos demostrado que la presencia de factores de riesgo cardiovascular tiene un impacto negativo en las propiedades angiogénicas de las ASC subcutáneas y epicárdicas. Esta disminución de la capacidad para estimular la formación de vasos limita el uso autólogo de estas células para tratar enfermedades de carácter isquémico, pero también podría ser una de las causas de los problemas vasculares asociados a importantes factores de riesgo cardiovascular. Hemos identificado la vía de señalización Notch, en todos los casos, como un mecanismo clave en la regulación del potencial de diferenciación de las ASC, mediante el cual las modificaciones patológicas producidas por la acumulación de factores de riesgo cardiovascular tienen un impacto sobre la funcionalidad de las ASC de las distintas localizaciones adiposas. Adicionalmente, hemos observado que la médula ósea de donantes con factores de riesgo cardiovascular incrementa el fenotipo pro-aterogénico en receptores sanos, lo que podría explicar el elevado riesgo cardiovascular de pacientes sometidos a este procedimiento. Finalmente, en esta tesis se han descrito por primera vez las características fenotípicas y funcionales de las ASC derivadas de tejido adiposo perivascular coronario humano. Se ha observado una comunicación activa entre las ASC y las células musculares lisas, en un proceso mediado por la expresión de Tissue factor (TF) en las ASC. Este hallazgo, junto con la observación de altos niveles de expresión de TF en las ASC de pacientes con una elevada acumulación de factores de riesgo cardiovascular, abre un nuevo enfoque en la investigación sobre los procesos angiogénicos que se desarrollan en torno a la placa aterosclerótica en las arterias coronarias. Por tanto, los resultados de esta tesis demuestran que los factores de riesgo cardiovascular regulan las propiedades funcionales de las ASC de distintas localizaciones adiposas, y que dicho efecto está mediado en parte por la alteración de la vía de señalización Notch. El efecto de los factores de riesgo cardiovascular sobre las ASC reduce el potencial de las mismas para la reparación espontánea de tejidos dañados y para su posible uso en terapia celular autóloga.
Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity and mortality. Clustering of cardiovascular risk factors (CVRF), including diabetes, obesity and dyslipidemia among others, induces a chronic metabolic disturbance with implications in diverse cells and organ function. Adipose tissue is considered a dynamic endocrine organ playing a central role in homeostasis. Moreover, it is a source of adult multipotent stem cells known as adipose-derived stem cells (ASC). Due to their properties, ASC are potential candidates in regenerative medicine. However, the role of ASC in cardiovascular disease development and the impact of CVRF on their functionality is poorly understood. In this study, we analyzed the phenotype and function of ASC from an animal model clustering CVRF. Intrinsic differences related to differentiation potential were found in ASC from different fat depots, which were increased in presence of CVRF. These differences could contribute to the reduced expansion capacity of the visceral adipose tissue and its associated cardiometabolic risk. The presence of CVRF had a negative impact on the angiogenic properties of subcutaneous and epicardial ASC. A reduced ability to stimulate vessel formation limits autologous cell therapy in diabetic and obese patients, but could also be involved in the vascular problems associated to CVRF. We described Notch signaling pathway as a key regulator of the differentiation potential of ASCs from the different fat depots, and its activation was found altered by CVRF. Additionally, our results showed that the bone marrow from donors with CVRF increased the pro-atherogenic phenotype in healthy recipients, which could explain the high cardiovascular risk of patients undergoing bone marrow transplant. Finally, we characterized for the first time the ASC derived from human coronary perivascular adipose tissue. We described a novel cross-talk between ASC and vascular smooth muscle cells involving angiogenic and proliferative processes, regulated by a mechanism in part mediated by TF expression in ASC. Therefore, the results of this study demonstrate a significant impact of the presence of CVRF in the functional properties of ASC from different adipose depots, and provide evidence of a potential role of these cells in modulating angiogenic processes during cardiovascular disease development.

El eje central de esta tesis ha sido el estudio de los efectos que ejercen el género, la localización anatómica del depósito y la situación fisiológica u hormonal sobre la capacidad lipolítica del TAB. En ratas control, la capacidad lipolítica es superior en el depósito gonadal (visceral) que en el inguinal (subcutáneo). La gestación provoca en el TAB una disminución de los niveles de los distintos elementos de la cascada lipolítica, aunque con diferencias entre depósitos, que podrían determinar su papel durante la gestación. En su conjunto, los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis permiten establecer la existencia de claras diferencias en las capacidades lipolíticas del tejido adiposo entre depósitos con distinta localización anatómica, así como entre géneros, tanto en una situación control, como en respuesta a la sobrealimentación, y en la gestación, pudiendo jugar el entorno hormonal un papel clave en estas diferencias.




The general aim of this thesis was to study the effects of gender, anatomical tissue location and the physiological or hormonal status on WAT lipolytic capacity. In control rats, the lipolytic capacity is higher in gonadal (visceral) than in inguinal WAT (subcutaneous). Pregnancy leads to a decrease in the levels of the different elements of the lipolytic pathway in WAT, although with some differences between the depots, which could determine their role during pregnancy. In conclusion, the results reported in this thesis establish the existence of clear differences in WAT lipolytic capacity between fat depots from different anatomical locations, as well as between genders, both in a control situation and in response to overfeeding, and in pregnancy; differences in which the hormonal milieu could play a key role.

Trabajo de tesina para obtener el grado de Médico Cirujano
La obesidad aumenta el riesgo de desarrollar otros padecimientos crónico-degenerativos como son: diabetes mellitus tipo II, hipertensión arterial sistémica y enfermedad coronaria. La acumulación de tejido adiposo en la obesidad está caracterizado por hiperplasia e hipertrofia de los adipocitos, aumento de la vascularidad, infiltración de macrófagos pro-inflamatorios y producción y liberación de factores pro-inflamatorios; razón por la cual la obesidad se considera un estado de inflamación crónica La importancia de este trabajo radica en poder evaluar la información existente acerca de la inflamación producida específicamente en el tejido adiposo tras la ingesta de edulcorantes no calóricos ya que esta práctica es cada vez más frecuente pero no se han descrito en su totalidad los efectos metabólicos en el tejido adiposo y la relevancia de su papel en la obesidad como estado de inflamación crónica.
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Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular
El tejido adiposo cumple distintas funciones tales como protección mecánica, reserva de energía, función endocrina, etc. Durante los últimos años se ha documentado su uso como fuente abundante y accesible de células estromales multipotenciales para medicina regenerativa. Actualmente, el protocolo estandarizado comprende el procesamiento del tejido adiposo con una digestión enzimática (colagenasa) para posteriormente rescatar la fracción vascular estromal (SVF). Ésta se siembra en una matriz de plástico apta para cultivos celulares, obteniéndose un subgrupo de células elongadas que comienzan a adherirse a la placa de cultivo (SVF-AC), permitiendo la aparición de una población celular adherente denominada “células estromales derivadas del tejido adiposo”. Diversos estudios han demostrado que éstas mantienen su capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares (endo, meso y ectodérmico), siendo candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Sin embargo, una de las limitantes para la aplicación clínica de estas células, es contar con una masa celular critica que permita un adecuado tratamiento. Ante ello, surge la interrogante de cómo criopreservarlas, manteniendo a su vez, la viabilidad y el potencial de diferenciación luego de un ciclo de congelación. El uso de compuestos que tengan propiedades criopreservantes ha mostrado ser un prerrequisito para el éxito de un proceso de congelación. Idealmente, un medio para criopreservar SVF-AC debe tener una baja toxicidad y lograr una alta viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. En nuestro laboratorio, luego de criopreservar SVF-AC utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) 10%, no logramos obtener tasas de viabilidad descritas en la literatura. Nuestra hipótesis es que una combinación de un medio basal (medio DMEM/F12 con rojo fenol) suplementado con DMSO, trehalosa y albúmina humana puede mejorar significativamente las tasas de recuperación celular post criopreservación, en comparación con medios que utilizan sólo DMSO. En el presente trabajo, medimos la tasa de viabilidad celular post criopreservación de SVF-AC obtenidas de 5 pacientes utilizando medios definidos y libres de suero bovino: DMSO 10%; DMSO 10% + Trehalosa 7,6%; DMSO 10% + Albúmina humana 10% y DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10%; mediante ensayo metabólico midiendo absorbancia (MTT) e indeminidad de membranas cuantificado por citometría de flujo con ioduro de propidio (PI). Los resultados obtenidos nos demuestran que no existen diferencias estadísticamente significativas en las tasas de viabilidad de SVF-AC posterior a un ciclo de criopreservación a diferentes niveles, desde el punto de vista metabólico con el ensayo de MTT, y a nivel de estructura de membrana por marcación de PI por citometría de flujo. Sin embargo, se observa una tendencia a mejorar la tasa de recuperación de células vitales al agregar albúmina humana. Por otro lado no se lograron obtener tasas de viabilidad tan altas como las reportadas por otros autores. Se discuten las posibles causas y se proponen alternativas para estudiarlas. En conclusión, podemos decir que no existe ninguna condición estudiada que sea superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como en respuesta a la hipótesis de trabajo podemos afirmar que la criopreservación de las SVF-AC en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente mayor que aquellas congeladas sólo con DMSO 10%.
Adipose tissue has different functions such as mechanical protection, energy reserve, endocrine function, etc. In recent years has been documented it use as abundant and accessible source of multipotent stromal cells for regenerative medicine. Currently, a standardized protocol comprises processing adipose tissue with enzymatic digestion (collagenase) and then rescue the stromal vascular fraction (SVF). This is sown in a plastic matrix suitable for cell cultures to yield a subset of elongated cells to adhere to the culture plate (SVF-AC), allowing the appearance of an adherent cell population called "stromal cells derived from adipose tissue". Several studies have shown that they maintain their ability to differentiate into multiple cell types (endo, meso and ectodermal), being suitable candidates for many applications in regenerative medicine and tissue engineering. However, one of the limitations for the clinical application of these cells is to have a critical cell number to provide an adequate treatment. In response, the question is how to cryopreservate them, while maintaining the viability and differentiation potential after a freeze cycle. Use of compounds with cryoprotective properties have shown to be a prerequisite for the success of a freezing process. Ideally, a cryoprotectant for SVF-AC must have low toxicity and achieve high cell viability without decreasing the differentiation potential. In our laboratory, after SVF-AC cryopreservation using 10% dimethyl-sulfoxide (DMSO) it is unable for us to obtain the viability rates reported in the literature. Our hypothesis is that a combination of a basal medium (DMEM / F12 medium with phenol red) supplemented with DMSO, trehalose and human albumin, can significantly improve cell recovery rates after cryopreservation compared to using only DMSO. In this study, we measured the rate of cell viability after cryopreservation of SVF-AC obtained from 5 patients using a defined and serum-free medium: 10% DMSO; 10% DMSO + 7.6% Trehalose; 10% DMSO + 10% human albumin and 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin; by measuring absorbance with a metabolic assay (MTT) and membrane indemnity quantified by flow cytometry with propidium iodide (PI). The results show us that there are no statistically significant differences in rates of SVF-AC viability after a cryopreservation cycle at different levels, from a metabolic point of view with the MTT assay, and membrane structure level with IP by flow cytometry. However, a tendency is observed to improve the recovery rate of vital cells by adding human albumin. On the other hand we could not get viability rates as high as those reported by other authors. Possible causes are discussed and proposed alternatives for study. In conclusion, we can say that there were not a studied condition better than others in terms of efficiency. Thus, in response to the working hypothesis we can say that the cryopreservation of the SVF-AC in a medium that combines DMEM / F12 with 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin fails in obtaining a significantly higher recovery rate of vital cells than those frozen with only 10% DMSO.

La adiponectina es una adipocitoquina sintetizada y secretada exclusivamente por el tejido adiposo. Actúa en diversos órganos y tiene propiedades anti-diabéticas y anti-aterogénicas, además de ser una de las hormonas con mayores propiedades sensibilizadoras de la insulina. La adiponectina ejerce sus efectos en el metabolismo de la glucosa y los lípidos a través sus receptores, adipoR1 y adipoR2.
En el primer trabajo se demostró que la expresión de adipoR1 en IAAT no estuvo alterada en obesidad ni diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se correlacionó con los niveles plasmáticos de FFA, mientras que la expresión de adipoR2 en IAAT se encontró disminuida en obesidad y diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se asoció con componentes metabólicos implicados en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en la obesidad.
Dada la importancia de la expresión de adiponectina y sus receptores, así como también de otras adipocitoquinassecretadas por el adipocito maduro en la patogenia de la obesidad y la diabetes, entender los mecanismos epigenéticos de la activación transcripcional en la diferenciación fue el objetivo de nuestro segundo estudio. Para esto examinamos las modificaciones pos-traduccionales de la histona H3 en los promotores de genes adipogénicos claves tanto de expresión temprana como tardía durante todo el proceso de la adipogenesis.
Mediante el uso de la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), realizados en células 3T3-L1 en diversos días durante el proceso de diferenciación adipocitaria, demostramos que los promotores de adiponectina, glut4, gpd1 y leptina están enriquecidos en dimetilación de H3-K4 en el día 0 de diferenciación (D0), cuando ninguno de estos genes está aún expresado. Un estudio detallado del locus de adiponectina reveló que la dimetilación de H3K4 en estas células indiferenciadas está limitada en la región promotora, donde se encontró además asociada con ocupación de la RNA pol II. El inicio de la transcripción de adiponectina, coincide con la hiperacetilación de H3 (D3-4) y con la trimetilación de H3K4 en la región promotora de la misma (D2-3). Este mismo patrón de modificación de histonas se observó en células primarias de ratón pero no en fibroblastos de ratón 10T/2, que aún no está comprometida hacia la línea adipogénica. La inhibición parcial de la dimetilación en H3K4 mediante el tratamiento con el inhibidor resultó en una disminución de la expresión de apM1, así como también en una disminución en la adipogénesis, detectada por una disminución en la incorporación de lípidos.
En resumen, el segundo trabajo de esta tesis, muestra que la dimetilación en H3K4 y el reclutamiento de la RNA polII en los promotores de genes adipogénicos claves son marcas distinguibles de células que están determinadas y se han comprometido hacia la línea celular adipogénica. Estas mismas marcas, están ausentes en las mismas regiones de los promotores, en células pluripotenciales que representan un paso previo en el proceso de diferenciación desde células totipotenciales a adipocitos maduros y en los promotores de genes que se encuentran silenciados y no se expresan en células determinadas hacia la línea adipogénica (3T3-L1). En adipocitos diferenciados, la transcripción activa de estos genes es acompañada por hiperacetilación en H3, di y trimetilación en H3K4, así como también la extensión de estas modificaciones hacia las regiones codificantes del gen. La dimetilación en H3K4 es necesaria para la expresión génica de adiponectina, así como también para el desarrollo de una normal diferenciación adipocitaria. No obstante, son necesarios más estudios para dilucidar cuales son los factores de transcripción y cofactores necesarios en el establecimiento de dicho patrón.

La técnica con injertos autólogos de grasa o lipofilling, revolucionó el tratamiento de los defectos de volumen y ahora es ampliamente utilizada en cirugía plástica para la reconstrucción mamaria. En el último tiempo se han planteado dudas con respecto a los potenciales riesgos oncológicos de estos procedimientos. Las células podrían expresar factores protumorigénicos; las células madre podrían transformarse o podría verse comprometida la capacidad para detectar una recidiva. La colocación intencional de tejido con capacidad regenerativa en el antiguo lecho tumoral, plantea inevitablemente dudas con respecto a la posibilidad de estimular la recurrencia del cáncer. Estudios experimentales han demostrado que los adipocitos y los progenitores del tejido adiposo son capaces de producir diferentes factores de crecimiento implicados en la tumorogénesis. Podrían actuar sobre el ciclo celular del cáncer mediante secreciones autocrinas, paracrinas y endocrinas promoviendo la progresión tumoral. Ante el dilema de mejorar la calidad de vida de los pacientes con el lipofilling y la reciente evidencia del papel que los injertos de grasa podrían tener sobre la progresión del cáncer de mama, hemos diseñado un estudio para analizar los resultados oncológicos de los procedimientos de lipofilling en estos pacientes. En el primer trabajo de esta tesis, revisamos todos los pacientes sometidos a lipofilling para reconstrucción mamaria del Hospital Clínic de Barcelona desde enero de 2007 hasta diciembre de 2014. Analizando los resultados oncológicos, datos de la técnica y sus complicaciones. Se revisaron 319 procedimientos de lipofilling en 195 pacientes. El lipofilling se realizó en régimen de cirugía ambulatoria en la mayoría de los casos. Se observaron 26 (8,2%) complicaciones en 319 procedimientos. La complicación más frecuente fue la liponecrosis y los quistes oleosos. La tasa de recurrencia locorregional fue del 1,08% anual; hubo 4 recidivas locales, 2 regionales y 4 metástasis durante un seguimiento medio desde la cirugía oncológica de 74 meses. En el segundo trabajo, se realizó un estudio de casos y controles para ahondar en la influencia del lipofilling sobre la recurrencia del cáncer de mama. Entre enero de 2007 y diciembre de 2015, se incluyeron 315 procedimientos de lipofilling de mama realizados en 205 pacientes con cáncer de mama tratados con lipofilling para la reconstrucciones mamaria. Cada paciente se emparejó aleatoriamente con 2 pacientes controles que no habían sido tratados con lipofilling utilizando 6 variables; fecha de la operación primaria del cáncer (dentro de 3 años), edad (dentro de 5 años), tipo de cirugía, histopatología , afectación linfática y estado de los receptores de estrogénicos. Con un seguimiento de 88,7 meses, no se encontraron diferencias en la tasa de recurrencia ni en la mortalidad entre los grupos de lipofilling y control. Además, no se observaron diferencias cuando se consideraron características histológicas o el tipos de cirugía. Las recurrencias totales para ambos grupos fueron de 14 (6,8%) y 32 (7,8%) pacientes en el caso del grupo con lipofilling y control respectivamente, obteniendo curvas de incidencia acumulada sin diferencias. Se observó una incidencia locorregional acumulada de 7 pacientes para el grupo de lipofilling (3,4%) y 16 pacientes en el grupo control (3,9%). No se detectó diferencia estadísticamente significativa en el análisis univariante (p = 0,525). En el análisis multivariante, el lipofilling tampoco se vio influenciado por otras variables. Se encontró un aumento significativo en la incidencia locorregional cuando el primer procedimiento de lipofilling se realizó dentro de los primeros 3 años después de la cirugía primaria del cáncer. Se detectaron recidivas de cáncer inflamatorio de mama en 2 de las 7 recurrencias locoregionales en los pacientes con lipofilling, lo que podría ser visto como un incidencia extremadamente alta para esta forma más agresiva de recidiva.
The autologous fat graft or lipofilling technique revolutionized the management of tissue losses and now is widely used in plastic surgery for breast reconstruction. However, concerns have been raised regarding the potential oncologic risks of these procedures. Cells could express protumorigenic factors; stem cells transform within the graft or even this new tissue could compromise our ability to detect breast disease. A number of new techniques of fat preparation have been described with the ultimate goal of improving adipocyte purification and stem cell selection. Inevitably, the intentional placement of regenerating tissue at the site of a previous tumor bed raises questions regarding the possibility of promoting a cancer recurrence. In experimental studies, adipocytes and white adipose tissue progenitors are able to produce different growth factors involved in tumorigenesis. They could act on cancer cell cycle through autocrine, paracrine, and endocrine secretions promoting tumor progression. In this current dilemma between improving patients' quality of life and the arising evidence that fat graft might have cooperative roles in breast cancer progression, we designed a clinical study to analyze the oncologic outcome of lipofilling procedures in breast cancer patients. In the first paper of this thesis, an exhaustive review of all patients who underwent lipofilling technique for breast reconstruction at Hospital Clinic of Barcelona since January 2007 to December 2014, were analyzed for oncological findings, lipofilling technique issues and its complications. We reviewed 319 lipofilling procedures from 195 patients. They underwent a mean of 1.6 lipofilling sessions (range, 1-6). Lipofilling was performed under outpatient surgery in majority of the cases, otherwise, inpatients surgery were usually associated with other procedures. We observed 26 complications from 319 procedures (8.2%). The most common complication was liponecrosis and oil cyst. Regarding oncological results; 4 local, 2 regional and 4 metastases were observed as first oncological event of relapse during a mean follow-up from oncologic surgery of 74 months, and the locoregional recurrence rate was 1.08% per year. On the second paper, we use a matched control group to analyze whether lipofilling procedures have any influence over recurrence in patients who underwent breast cancer surgery. Between January of 2007 and December of 2015, 315 breast lipofilling procedures from 205 breast cancer patients treated with fat grafting for breast cancer reconstructions were included. They were matched with 2 randomly selected patients with breast cancer who underwent surgery treatment but did not undergo any lipofilling procedures for 6 variables: date of primary cancer operation (within 3 years), age (within 5 years), type of cancer surgery, histopathology, lymphatic involvement, and estrogen receptor status. In a follow-up of 88.7 months, no relapse or mortality differences were found between the lipofilling and control groups. Moreover, no differences were observed when histological features or types of surgery were considered. The total recurrences for the lipofilling and control groups were 14 (6.8%) and 32 (7.8%) patients, respectively, leading to comparable cumulative incidence curves. We observed a cumulative locoregional incidence of 7 lipofilling patients (3.4%) and 16 control group patients (3.9%) during the follow-up time. No statistically significant difference was detected in the univariate analysis (p = 0.525), and at the multivariate analysis, lipofilling was not influenced by other variables. However, we found a significant increase in locoregional incidence when the first lipofilling procedure was performed within the first 3 years after cancer surgery and we detected inflammatory breast recurrences in 2 of the 7-locoregional recurrences of lipofilling patients, what it could be seen as an extremely high incident for this aggressive type of relapse.

Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad a nivel mundial, apareciendo como consecuencia de la acumulación de diversos factores de riesgo, tanto genéticos como ambientales. De entre los factores de riesgo cardiovascular modificables, es decir, aquellos que podemos evitar, destacan entre otros la obesidad, la diabetes y la dislipemia, con cada vez más incidencia tanto en los países desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo. Por tanto, en los últimos años, la búsqueda de estrategias que permitan entender mejor estas patologías, así como que nos ayuden a prevenirlas, han adquirido una gran importancia. En esta tesis hemos analizado el uso de intervenciones nutricionales, para prevenir y reducir la aparición de diferentes factores de riesgo cardiovascular, ayudando por tanto a prevenir, no solo la aparición de las enfermedades cardiovasculares, sino también de otras diversas patologías. Así, hemos demostrado que la sustitución de sacarosa de las dietas por un edulcorante natural a base de pinitol, ayuda a mejorar el metabolismo glucémico, así como la secreción de insulina en pacientes con intolerancia a la glucosa. Además, hemos visto que la introducción en la dieta de una bebida rica en ácidos grasos omega-3, ayuda a mejorar el metabolismo lipídico de voluntarios con sobrepeso, mientras que si incorporamos una bebida con fitoesteroles, ayudamos no solo a reducir los niveles de colesterol, sino que favorecemos la reducción del estado pro-inflamatorio característico de la obesidad. Además, teniendo en cuenta que la obesidad se caracteriza por la acumulación de grasa en diferentes localizaciones del organismo, en esta tesis hemos analizado también la composición del tejido adiposo, y su papel en la patología cardiovascular. La acumulación de tejido adiposo visceral se ha asociado con un efecto más nocivo para el organismo que el tejido adiposo subcutáneo, y en esta tesis demostramos que se trata de un depósito de grasa mucho más rico en proteínas de oxidación, coagulación e inflamación que la grasa subcutánea. Corroborando el efecto protector asociado al tejido adiposo subcutáneo, demostramos también una mayor expresión de genes implicados en el proceso de angiogénesis en este tejido comparado con la grasa visceral, en la que tan sólo aumentaba la vía del VEGF, no sólo en la grasa total, sino en las células madre (ASC) que esta contiene. Sin embargo, estas diferencias disminuyen ante la presencia otro factor de riesgo como es la diabetes. Además, en esta tesis demostramos por primera vez la presencia de células madre en el tejido adiposo cardiaco, analizando sus propiedades en función de su localización. Distinguimos así entre el tejido adiposo epicardio acumulado en la zona del ápex (VMAT) y sus células derivadas mASC y tejido adiposo perivascular, que se acumula a lo largo de las arterias coronarias (PVAT) y sus células derivadas pASC. Aunque observamos una mayor velocidad de crecimiento en las mASC, demostramos que las pASC, que se encuentran más próximas a la arteria coronaria, poseen un mayor potencial angiogénico que las mASC, viéndose alterado en presencia de comorbilidades en el donante. Por último, en esta tesis exponemos la importancia de las partículas extracelulares (microvesículas y exosomas) secretadas al medio por las ASC, que producen un aumento en la velocidad de migración de las células endoteliales HMEC-1, convirtiéndose en una terapia emergente en el campo de la medicina regenerativa. En resumen, en esta tesis analizamos la importancia de controlar y reducir los diferentes factores de riesgo cardiovascular, y como estos factores de riesgo afectan a la composición y funcionamiento del tejido adiposo, en función de la localización en la que este tejido se acumule. Además, proponemos la introducción de exosomas y microvesículas como sustitución a las células madre en el campo de la medicina regenerativa.
In this thesis we have analyzed the use of nutritional interventions to prevent and reduce the appearance of different cardiovascular risk factors. Thus, we have shown that the substitution of sucrose from diets with a natural sweetener based on Pinitol, helps to improve glycemic metabolism, as well as insulin secretion in patients with glucose intolerance. In addition, we have seen that the introduction in the diet of a drink rich in omega-3 fatty acids, helps to improve the lipid metabolism of overweight volunteers, while if we incorporate a drink with phytosterols, we help not only reduce cholesterol levels, but we favor the reduction of the pro-inflammatory state characteristic of obesity. In addition, taking into account that obesity is characterized by the accumulation of fat in different locations of the organism, in this thesis we have also analyzed the composition of adipose tissue, and its role in cardiovascular pathology. The accumulation of visceral adipose tissue has been associated with a more harmful effect for the organism than subcutaneous, and in this thesis we show that it is a fat deposit much richer in oxidation, coagulation, angiogenic and inflammation proteins than subcutaneous fat, whereas the angiogenic pathway is enhanced in the subcutaneous fat. In addition, in this thesis we demonstrate for the first time the presence of stem cells in cardiac adipose tissue, analyzing their properties based on their location. We show that the perivascular ASC, which are closer to the coronary artery, have a greater angiogenic potential than the myocardium ASC, being altered in the presence of comorbidities in the donor. Finally, in this thesis we expose the importance of extracellular particles (microvesicles and exosomes) secreted to the environment by ASCs, which produce an increase in the speed of migration of HMEC-1 endothelial cells, becoming an emerging therapy in the field of regenerative medicine. In summary, in this thesis we analyze the importance of controlling and reducing the different cardiovascular risk factors, and how these risk factors affect the composition and functioning of adipose tissue, depending on the location in which this tissue accumulates. In addition, we propose the introduction of exosomes and microvesicles as a replacement for stem cells in the field of regenerative medicine

El colágeno VI es una proteína de la matriz extracelular cuyos defectos conducen a una variedad de trastornos musculares en humanos caracterizados por una debilidad muscular entre otros múltiples síntomas. Tanto el colágeno VI, como su fragmento soluble carboxilo terminal llamado endotrofina se encuentran altamente expresados en los dos principales tejidos periféricos que regulan la glucemia, el músculo esquelético y tejido adiposo. Los niveles de ARNm de colágeno VI en el tejido adiposo se han asociado con la obesidad y la resistencia a la insulina y su expresión está regulada por los niveles de glucosa, agonistas PPAR-gamma y la leptina. Se ha demostrado como, en modelos de ratón expuestos a una dieta alta en grasas, la sobreexpresión de endotrofina en el tejido adiposo contribuye a la fibrosis e inflamación de este tejido así como al empeoramiento de un estado de resistencia a la insulina. En relación a lo anterior, la ausencia de colágeno VI en ratones obesos mejora su perfil metabólico incluyendo resistencia a la insulina. A pesar de estas evidencias no se han investigado un papel del colágeno VI en la homeostasis de la glucosa así como sus implicaciones en el contexto de la deficiencia de colágeno VI en los seres humanos. En este trabajo se utilizó un modelo in vitro basado en el tratamiento de líneas celulares musculares y adiposas, humanas y murinas, con colágeno VI o endotrofina para investigar sus efectos en la captación y la utilización de glucosa, así como las vías de señalización y genes implicados. Se estudiaron dichas vías en biopsias musculares de pacientes con mutaciones en colágeno VI y se estudió mediante absorciometría de doble energía la cantidad y distribución del tejido magro y adiposo en estos pacientes y su correlación con la función motora de los mismos y los niveles de adipoquinas circulantes. Se demostró que el colágeno VI y la endotrofina son capaces de producir, mediante la acción de la quinasa ligada a integrinas (ILK), un aumento significativo en la captación de glucosa de una manera independiente a la acción de la insulina en las células musculares y adiposas en el caso del colágeno VI y en células musculares en el caso de la ETP. Además, hallamos que el colágeno VI es capaz de producir cambios en los niveles de expresión de genes codificantes para proteínas mitocondriales, así como para la proteína GLUT1 en células musculares. Pudimos observar que los pacientes con mutaciones en colágeno VI manifiestan un aumento en los niveles de proteína GLUT1 en músculo esquelético así como un incremento de los niveles circulantes de adiponectina de alto peso molecular en suero. También evidenciamos como la cantidad de masa magra de estos pacientes se encuentra reducida, mientras que sufren un considerable incremento en la cantidad de masa grasa, la cual se correlaciona negativamente con su estado funcional y su calidad de vida. En resumen, en este estudio se evidenció el papel del colágeno VI y la ETP en el control de la captación de glucosa de manera independiente a la insulina en miotubos y adipocitos in vitro. Además, el colágeno VI es capaz de producir cambios en relación a la expresión de numerosos genes. Y finalmente, se ha descrito una alteración en la cantidad y distribución de masa muscular y adiposa en pacientes con miopatías relacionadas con déficits el colágeno VI indicando que el aumento de masa grasa en estos pacientes contribuye a la fisiopatología de la enfermedad.
Collagen VI is an extracellular matrix protein whose defects lead to a range of musculoskeletal conditions. Post-translational modification of collagen VI results in the cleavage and release of a carboxyterminal soluble fragment named endotrophin (ETP). Collagen VI is highly expressed in the two major tissues regulating glycemia, skeletal muscle and adipose tissue. COL6A3 mRNA levels in adipose tissue have been associated with obesity and insulin resistance and its expression is regulated by glucose levels, PPAR-γ agonists and leptin. In mice, ETP over-expression contributes to fibrosis, inflammation of adipose tissue and insulin resistance. In line with this, the lack of collagen VI in obese mice improves insulin resistance. Despite these evidences a signaling role for collagen VI in glucose homeostasis and its implications in the context of collagen VI deficiency in humans have not been investigated. Human and murine skeletal muscle and adipose cell lines treated with collagen VI or ETP were used to investigate the effect of collagen VI in glucose utilization and signaling pathways and genes involved. Same pathways were studied in muscle biopsies from patients with mutations in collagen VI. It was investigated, by Dual-energy X-ray absorptiometry, the amount and distribution of lean mass and adipose tissue in these patients and their correlation with motor function and levels of circulating adipokines. We demonstrated that collagen VI and endotrophin induce, through the action of integrin-linked kinase (ILK), a significant increase in glucose uptake independently of insulin action in muscle cells and adypocites. Furthermore, collagen VI is able of producing changes in expression levels of genes encoding for mitochondrial proteins as well as for GLUT1 in muscle cells. Patients with mutations in collagen VI showed an increase in GLUT1 protein level in skeletal muscle and an increase in circulating of HMW adiponectin level in serum. Finally, we see that the amount of lean mass of these patients is reduced, while suffering a considerable increase of fat mass, which is negatively correlated with functional status and quality of life. In summary, in this study we demonstrate a role for collagen VI and ETP in in vitro glucose uptake regulation and in the regulation of the expression of numerous genes. And finally, we described an alteration in the amount and distribution of adipose and muscle mass in patients with collagen VI related myopathies indicating that the increase in fat mass in these patients contributes to the pathophysiology of the disease.

Antecedentes e hipótesis La disfunción del tejido adiposo se encuentra frecuentemente asociada con alteraciones en la homeostasis metabólica, cardiovascular e inflamatoria crónica leve de la obesidad. El tejido adiposo es considerado como diana terapéutica para prevenir la obesidad. Precursores de la nicotinamida adenina dinucleotido (NAD)+, tales como el ribósido de nicotinamida y mononucleótido de nicotinamida promueven el metabolismo energético y previenen la ganancia de peso corporal en modelos animales. Sin embargo, en estos trabajos no se abordó directamente su posible efecto sobre las alteraciones fisiológicas y plásticas del tejido adiposo blanco (TAB). Su posible potencial contra la inflamación crónica, cuyo desarrollo se encuentra frecuentemente ligado al de obesidad, tampoco ha sido evaluado. La nicotinamida (NAM) es otro precursor fisiológico de NAD+. No obstante, su posible contribución sobre este fenotipo está aun pendiente. Por otro lado, aunque su acción anti-oxidante y anti-inflamatoria ya ha sido descrita, su posible contribución en la prevención de arteriosclerosis tampoco ha sido demostrada. Objetivos El objetivo principal de este estudio fue doble: investigar el efecto de la administración de una dosis bien tolerada de NAM sobre [1] la prevención de la ganancia de peso corporal y adiposidad, y [2] la mejora de inflamación crónica en modelos murinos de obesidad inducida por una dieta rica en grasas (DIO, del inglés ‘diet-induced obesity’) y arteriosclerosis (i.e., ratones deficientes en ApoE). Resultados La administración de NAM a animales se realizó a través del agua de bebida ad libitum. El agua suplementada con NAM fue bien tolerada y segura a una dosis inferior a 1%. La suplementación con NAM, a la dosis más alta empleada (1%), previno la ganancia de peso corporal, siendo esto último principalmente atribuido a una disminución en la acumulación de grasa y esteatosis hepática. Ello fue principalmente debido a un [i] aumento en el gasto energético global, [ii] desarrollo de ‘browning’ en TAB subcutáneo (TABsc) a juzgar por un aumento en los niveles tisulares de proteína desacopladora Ucp1, e [iii] inducción de la síntesis de novo de NAD+ y aumento de la relación NAD+/NADH en TABsc. El contenido de AMP en TABsc se encontró significativamente elevado en ratones obesos tratados. Además, la relación NAD+/NADH se encontró directamente relacionada con la relación AMP/ATP, posiblemente sugiriendo una situación de demanda energética aumentada en dicho tejido. Consistentemente, se observó un aumento en la abundancia relativa de la forma activa (fosforilada) de la quinasa activada por AMP (AMPK) en dicho tejido. La suplementación con NAM también mejoró el estado inflamatorio global y previno contra el desarrollo de arteriosclerosis en ratones. Ello se acompañó por elevaciones [i] en las concentraciones circulantes de interleuquina (IL-)10 y [ii] niveles relativos de mRNA de Il10 en tejido adiposo epididimal (TABe) y aórtico, sugiriendo un cambio favorable del fenotipo de macrófagos a uno anti-inflamatorio (macrófagos M2). Esto último se observó asociado con una disminución en el desarrollo de arteriosclerosis en ratones deficientes en ApoE. También se investigó su posible efecto anti-oxidante sistémico y en tejidos diana. Las lipoproteínas circulantes no-HDL de ratones deficientes de ApoE tratados con NAM presentaron menor susceptibilidad a la oxidación que las de los no tratados, siendo este efecto debido al menos en parte a la acción antioxidante intrínseca por parte de NAM. Conclusiones La suplementación dietética de NAM previno la ganancia de peso corporal y adiposidad a través de la estimulación del gasto energético en ratones. Ello se acompañó de una inducción de ‘browning’ y aumento de demanda energética en TAB. NAM también promovió acciones anti-inflamatoria y anti-oxidante. Su administración aumentó la expression génica de Il10 en tejidos diana, incluyendo la aorta, y protegió contra el desarrollo de arteriosclerosis.
Background and hypothesis Adipose tissue dysfunction is a hallmark of obesity and is frequently associated with distorted metabolic homeostasis, cardiovascular and chronic, low-grade inflammatory diseases. Several recent studies point to pharmacological and/or nutritional health initiatives targeting adipose tissue being a promising approach to obesity prevention. In this regard, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)+ precursors, such as nicotinamide riboside and mononucleotide nicotinamide has been proven beneficial in increasing energy metabolism and preventing body weight gain in vivo. However, neither their favorable anti-obesity impact on disturbed white adipose tissue (WAT) physiology and plasticity nor in alleviating chronic inflammation, which frequently accompanies obesity, was not eventually pursued in any of these studies. In addition to the above-mentioned NAD precursors, nicotinamide (NAM) is also a physiological precursor of NAD+. However, its contribution in boosting energy metabolism and body weight gain still remains elusive. Although a growing body of evidences also supports a role for NAM as an anti-oxidant and anti-inflammatory agent both in vitro and in vivo, its potential contribution in preventing atherosclerosis, which is one of the main mechanisms involved in cardiovascular disease in vivo, has not previously been proven yet. Aims The aim of this study was twofold: to investigate the effect of NAM supplementation in (1) preventing weight gain and adiposity; (2) improving features of chronic inflammation in appropriate mouse models of obesity (diet-induced obesity -DIO- mice) and atherosclerosis (i.e., ApoE-deficient mice). Results NAM administration to mice was provided orally via tap water at libitum. Its administration was shown palatable, safe and well tolerated at doses below 1%. NAM supplementation, at the highest dose used (1%) (NAM HD-treated mice), prevented body weight gain, with the latter being mainly and repeatedly accompanied by reduction in fat accumulation in different regional depots, and hepatic steatosis. Mechanistically, such anti-adiposity effect by NAM was mainly accompanied by an [i] increased global energy expenditure, [ii] enhanced promotion of browning in subcutaneous (sc)WAT, as revealed by elevations in the relative mRNA and protein abundance of the uncoupling protein (Ucp)-1, and [iii] elevation of the de novo synthesis of NAD+ and NAD/NADH ratio in scWAT of NAM HD-treated, DIO mice. Notably, the AMP content was significantly elevated in scWAT of NAM HD-treated, DIO mice. Also, the NAD+/NADH ratio was directly related to the AMP/ATP ratio. Overall these data suggested a situation of energy demand in scWAT from NAM HD-treated mice. Concomitantly, the protein abundance of the active (phosphorylated) form of AMP-activated kinase was also elevated in this tissue of NAM HD-treated mice. NAM supplementation also improved the global inflammatory condition and prevented atherosclerosis development in mice. This was revealed by [i] elevations in the circulating concentrations of interleukin (IL-)10 and [ii] up-regulation of relative mRNA of Il10 in both adipose and aortic tissues, which potentially suggested a switch to anti-inflammatory M2 macrophages. This phenotype was accompanied by a commensurate reduction in atherosclerosis development in NAM-treated, ApoE-deficient mice. In addition to improved inflammation, non-HDL of NAM-treated, ApoE-deficient mice were less prone to oxidation than those from untreated mice, being this effect at least partly provided by the intrinsic anti-oxidant action of NAM. Conclusions Dietary supplementation with NAM to mice prevented body weight gain and adiposity by boosting energy expenditure, with this being mainly attributed to induction of browning and energy demand in scWAT. NAM also promoted anti-inflammatory and anti-oxidant actions. Its administration increased gene expression Il10 in target tissues, including aorta, and protected against development of atherosclerosis.

Recientemente se han demostrado los efectos beneficiosos de los ácidos grasos omega-3 en un gran número de patologías. Entre los mecanismos responsables de estos efectos protectores, destacan dos nuevas familias de mediadores lipídicos bioactivos derivados de estos ácidos grasos, denominadas resolvinas y protectinas, con importantes efectos protectores y antiinflamatorios en varios modelos de daño experimental.

Tanto la enfermedad hepática crónica, como la obesidad y sus complicaciones hepáticas presentan un componente inflamatorio clave para su desarrollo, de manera que los ácidos grasos omega-3 podrían tener efectos protectores en estas patologías.

Los objetivos del trabajo fueron investigar los efectos de los omega-3:
i-) en la inflamación hepática
ii-) sobre el tejido adiposo y las complicaciones hepáticas asociadas a la obesidad.

Para nuestro primer objetivo investigamos los efectos hepatoprotectores de los omega-3 sobre el daño genotóxico y el estrés oxidativo, sobre la necroinflamación hepática inducida por CCl4 en ratón, la generación hepática de mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 y, por último, los efectos biológicos de los mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 en eventos clave de la necroinflamación hepática.

Los resultados del primer estudio indican que la administración de una dieta enriquecida con omega-3 induce la formación hepática de 17-HDHA y PD1, que reducen el daño genotóxico y el estrés oxidativo en lo hepatocitos, así como marcadores clave de inflamación en los macrófagos.

Para el segundo objetivo investigamos los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática, sus efectos sensibilizadores a la insulina y sobre la expresión de adipoquinas, el perfil de eicosanoides y derivados bioactivos de los omega-3 en el tejido adiposo, y la contribución de RvE1 y PD1 en los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.

Los resultados del segundo estudio indican que los omega-3 atenúan la esteatosis hepática, mejoran la tolerancia a la insulina, inducen genes sensibilizadores a la insulina en tejido adiposo e hígado, aumentan la expresión de adiponectina, activan AMPK e incrementan la formación de resolvinas y protectinas en el tejido adiposo. Además, RvE1 y PD1 reproducen los efectos beneficiosos de sus precursores omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.

Las conclusiones de esta tesis son las siguientes:
Los omega-3 protegen a los hepatocitos del daño genotóxico y del estrés oxidativo; disminuyen la necroinflamación y la degeneración hidrópica de los hepatocitos inducidas por CCl4; inhiben la expresión de COX-2 y 5-LO, así como la formación de PGE2; atenúan la esteatosis hepática en ratones obesos; mejoran la tolerancia a la insulina e inducen genes sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo y el hígado de ratones obesos; inducen la expresión génica y proteica de la adiponectina, sin modular las adipoquinas proinflamatorias resistina, MCP-1, TNF- e IL-6; activan AMPK en tejido adiposo y músculo en ratones obesos; son transformados a los mediadores lipídicos bioactivos 17-HDHA y PD1 en el hígado, y 17-HDHA, RvD1 y PD1 en el tejido adiposo de ratón.
El 17-HDHA protege a los hepatocitos del daño genotóxico, del estrés oxidativo, reduce la liberación de TNF- en macrófagos y activa PPAR.
RvE1 reduce la esteatosis hepática y los macrófagos en el hígado y aumenta la expresión génica de adiponectina y otros factores sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo de ratones obesos.
PD1 induce la expresión de adiponectina en explantes de tejido adiposo de ratón obeso a niveles similares a los de la rosiglitazona.

Estos resultados indican que los ácidos grasos omega-3 ejercen efectos protectores en la inflamación hepática y las complicaciones asociadas a la obesidad. Estos efectos beneficiosos están mediados, en parte, por la síntesis de resolvinas y protectinas.
Recently, omega-3 PUFA beneficial effects have been well-established in a number of pathologies. Among the mechanisms responsible for those protective effects, two novel families of bioactive lipid mediators termed resolvins and protectins, are thought to play a key role.

Inflammation is a key factor for chronic liver disease, as well as obesity and obesity-induced alterations development. Thus, omega-3 PUFA might display important protective actions on these pathologies.

The aim of the current study was to investigate omega-3 PUFA effects on:

i-) hepatic inflammation.
ii-) adipose tissue and obesity-induced alterations.

First, we examined hepatoprotective actions of omega-3 PUFA on genotoxic damage and oxidative stress, CCl4-induced hepatic necroinflammation in mice, hepatic generation of omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators, and their biological effects in key events for the pathophysiology of hepatic necroinflammation.

The results of our first study indicate that an omega-3 PUFA-enriched diet induces 17-HDHA and PD1 hepatic formation, which are able to reduce genotoxic damage and oxidative stress in hepatocytes, as well as key inflammatory markers in macrophages.

Second, we examined omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis, insulin sensitivity and adipokines expression, eicosanoid and omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators profile in adipose tissue, as well as RvE1 and PD1 contribution to omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis and insulin resistance.

The results of our second study indicate that omega-3 PUFA ameliorate hepatic steatosis and insulin tolerance, induce insulin-sensitizing genes in adipose and liver tissue, increase adiponectin expression, activate AMPK and induce resolvins and protectins formation in adipose tissue. Moreover, RvE1 y PD1 reproduce omega-3 PUFA beneficial effects on hepatic steatosis and insulin resistance.

Taken together, these results indicate that omega-3 PUFA display potent protective actions on hepatic inflamation and obesity-induced alterations. These beneficial effects are mediated, at least in part, by resolvins and protectins synthesis from their omega-3 PUFA precursors.

La terapia celular es una novedosa y prometedora herramienta para la medicina futura, que nos permite reparar, reemplaza o restaurar tejidos u órganos dañados usando una variedad de tipos celulares. Este tipo de terapia requiere un gran número de células en animales grandes o grandes lesiones, y este requisito es uno de los principales obstáculos a la hora de llevar a cabo dichas aplicaciones. Las células mesenquimales estromales de tejido adiposo (hAMSC) son excelentes candidatas para hacer terapia celular. La necesidad de expandirlas en cultivo para obtener el número adecuado de células, requiere de tiempos de cultivo en algunos casos crítico para ciertas aplicaciones. El tiempo de duplicación medio de las hAMSC puede variar entre 2-6 dias, dependiendo de las condiciones de cultivo. En condiciones estándar, se requiere aproximadamente 75 días de cultivo para generar 1010 células. En esta tesis, se han probado condiciones de cultivo que mejoran la producción de grandes números de hAMSC. Se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las hAMSC crecidas en su medio estándar DMEM, respecto a las hAMSC crecidas en EGM-2 (FP-MSC, fast proliferating MSCs). De forma reproducible, el medio EGM-2 confiere a las hAMSCs un fenotipo de gran capacidad proliferativa, lo cual nos permite reducir el tiempo requerido para obtener grandes cantidades de células seguras, sin perder sus propiedades de pluripotencialidad. Este trabajo recoge un extenso análisis comparativo en ambas condiciones de cultivo, que incluye estudios a nivel de proliferación in vitro, paramétros relacionados con las propiedades mesenquimaloides (perfil inmunofenotípico y capacidad de diferenciación a diferentes linajes), perfil de expresión génica y potencial oncogénico. Los datos recogidos de la experimentación in vitro, apuntan a estas células como una alternativa en el uso de hAMSC en terapias celulares. Las FP-MSC fueron probadas en dos tipos de terapias: anti-tumoral y regenerativa. La terapia anti-tumoral mediada por las FP-MSC portadoras de un gen suicida, no produjo ninguna mejora con respecto a las hAMSC crecidas en su medio estándar. Sin embargo, en el ámbito de la regeneración cardiaca, las FP-MSC mostraron una sutil mejora con respecto a las hAMSC. Ambos tipos celulares fueron capaces de diferenciarse al linaje endotelial y miocárdico, sin embargo, a nivel de función cardiaca las FP-MSC tiende a presentar ciertas mejoras en lo que se refiere a densidad vascular y fracción de eyección en comparación con las hAMSC. Si a esto, le sumamos sus características in vitro asociadas al crecimiento en EGM-2, podemos decir que estas células parecen una interesante y novedosa opción para el tratamiento en la regeneración de tejidos dañados. Podemos decir que se abre un amplio campo donde poder aplicarlas, ya que podemos obtener grandes cantidades de células autólogas para tratamientos terapéutico en un periodo de tiempo muy breve; pudiéndolas utilizar como sustitutas de las hAMSC u otro tipo de mesenquimal, o en combinación con otro tipo celular para tener un efecto sinérgico, y mejorar el resultado terapéutico.
Cell therapy is emerging as a promising strategy for future medicine, to repair, replace or restore damaged tissues or organs using a variety of cell sources. Adipose tissue is an important source of adult multipotent stem cells (AMSCs) due to their abundance and ease of isolation with relatively little trauma for the patient, and their similarity to those of their bone marrow counterparts. However, to obtain reasonable numbers of AMSCs for tissue engineering applications, in particular for regeneration in large animals or for large lesions; ex vivo expansion of AMSCs is required. AMSCs have a doubling time that could vary between 2-6 days depending on culture conditions. In standard culture conditions, approximately 75 days would be required to generate 1010 cells, a prohibitive delay for some therapeutic processes. In the current work we perform a comparative study of DMEM grown AMSCs with EGM-2 grown fast proliferating AMSCs (FP-MSCs). By using a reproducible and reliable methodology, this culture medium allowed us to reduce the time required to obtain large numbers of safe cells without losing their pluripotent properties. We have analysed in both culture conditions the parameters that characterize MSCs (specific immunophenotype and multilineage differentiation), as well as proliferative capacity, genetic stability, gene expression profile, oncogenic potential. Moreover, we also compared their capacity as a therapeutic agent against tumors and for myocardium repair. Our results indicate that paracrine effects of FP-MSCs applied in combination with scaffolds over acute myocardium infarcts may promote myocardium revascularization.

Se ha observado en nuestro grupo de investigación que tanto las células 3T3L1 como el tejido adiposo blanco in vivo son capaces de liberar, a partir de la glucosa, grandes cantidades de lactato en condiciones aeróbicas y glicerol en mayor cantidad que la que puede justificarse por lipólisis. Para investigar por qué los adipocitos actúan principalmente de manera glucolítica produciendo fragmentos de 3C sin verse afectados por la hipoxia desarrollamos la metodología necesaria aplicada a cultivos primarios. Puesto que el tejido adiposo blanco está compuesto por otros tipos celulares, comprobamos también si la hipoxia afecta de la misma manera a las células de la fracción estromal del tejido. El tejido responde a señales que el organismo produce como hormonas, por ello nos propusimos estudiar en adipocitos y en la fracción estromal, la modulación del metabolismo provocada por la insulina y la respuesta innata del tejido, es decir sin ningún estimulo externo más que el de la glucosa. Los resultados obtenidos señalan que el tejido adiposo blanco tiene una actividad metabólica elevada en términos relativos ya que a pesar de su escasa cantidad de masa “viva” (sólo el 1,3% del total), las células adiposas producen y liberan grandes cantidades de fragmentos de 3C. En los adipocitos, el lactato es producido a partir de la glucosa, independientemente de la presencia de oxígeno e insulina, para ser exportado a otras células y utilizado como fuente de energía. Esta idea se ve reforzada por el hecho que a concentraciones más elevadas de glucosa se produce más cantidad de lactato. Sin embargo, aunque las células de la fracción estromal también producen gran cantidad de lactato, este proceso no se ve influenciado por las concentraciones de glucosa. Por otra parte, el glicerol es producido solo por los adipocitos, siendo regulado por la insulina y constante en el tiempo. No obstante, al inicio el glicerol proviene de la vía glucolítica cuando la concentración de glucosa es elevada, pero cuando esta es baja proviene de la lipolisis. A las 48 h su origen cambia a glucolítico-lipolítico, excepto a 3,5mM de glucosa. Mientras que los ácidos grasos libres se reciclan para formar triacilgliceroles, muy poca glucosa 14C es incorporada, lo que indica una lipogénesis limitada. Sin embargo, la insulina promueve esta lipogénesis, aunque al mismo tiempo limita, al inicio, la incorporación de glicerol-3P para la síntesis de triacilgliceroles. La coexistencia de estos dos procesos, lipogénico y glucolítico a la vez, es probablemente una consecuencia para evitar la acumulación del exceso de energía, como un mecanismo de defensa contra la “glucolipotoxicidad” y una manera de suministrar energía en forma de fragmentos de 3C, fácilmente utilizable por otros tejidos.
Our research group has observed that both 3T3L1 cells and white adipose tissue in vivo are able to release, from glucose, large amounts of lactate under aerobic conditions and glycerol in greater quantity than which can be justified by lipolysis. To study why adipocytes, act mainly in a glycolytic manner producing 3C fragments without being affected by hypoxia, we developed the necessary methodology applied to primary cultures. Since white adipose tissue is composed by other cell types, we also check whether hypoxia affects the stromal fraction cells in the same way. White adipose tissue responds to signals produced by the body as hormones, so we decided to study in adipocytes and the stromal fraction, how insulin can affect the adipocytes metabolism and their innate response, that is without any external stimulus. The results indicate that white adipose tissue has a high metabolic activity in relative terms since, despite its small amount of "living" mass (only 1.3% of the total), adipose cells produce and release large amounts of 3C fragments. In adipocytes, lactate is produced from glucose, independently of the presence of oxygen and insulin, to be exported to other cells and used as an energy source. This idea is reinforced by the fact that at higher concentrations of glucose, more lactate is produced. However, although the stromal fraction cells also produce large amounts of lactate, this process is not influenced by glucose concentrations. On the other hand, glycerol is produced only by adipocytes, being regulated by insulin and constant over time. However, initially glycerol comes from the glycolytic pathway, when the glucose concentration is high, but when it is low it comes from lipolysis. At 48 h, its origin changes to glycolytic-lipolytic, except at 3.5 mM glucose. While free fatty acids are recycled to form triacyclglycerols, very little 14C glucose is incorporated over time, indicating limited lipogenesis. But when insulin is added, this lipogenesis is promoted, even though at the same time the hormone limits, at the beginning, the incorporation of glycerol-3P for the synthesis of triacylglycerols. The coexistence of these two processes, lipogenic and glycolytic simultaneously, is probably a consequence to prevent the accumulation of energy excess as a defense mechanism against "glycolipotoxicity", and a way to supply easily usable energy by other tissues in the form of 3C fragments.

El teixit adipós marró (TAM) està format principalment per adipòcits marrons, la funció principal dels quals és el manteniment de la temperatura corporal de l’organisme a través de la termogènesi adaptativa. La capacitat termogènica de TAM ve donada per l’expressió de la proteïna desacobladora 1 (UCP1), una proteïna mitocondrial capaç de desacoblar la cadena respiratòria de la fosforilació oxidativa, generant calor enlloc d’ATP. Els treballs realitzats en la present tesi doctoral han estat orientats en l’estudi de la implicació de l’autofàgia en els processos adaptatius relacionats amb la funció termogènica que tenen lloc en el TAM. En el moment d’iniciar aquesta tesis existien pocs estudis sobre el paper de l’autofàgia en la biologia del TAM, ja que els estudis publicats en aquell moment principalment havien centrat l’atenció en el paper de l’autofàgia en el teixit adipós blanc. Vam hipotetitzar que l’autofàgia podria ser un procés important per a la funció termogènica en el TAM. Entre els processos autofàgics, la degradació de mitocondris (mitofàgia) és un mecanisme de control de qualitat destinat al manteniment d’una xarxa mitocondrial en bones condicions. La mitofàgia és d’especial rellevància en cèl·lules amb alta capacitat oxidativa, com les cèl·lules musculars o les neurones. En canvi, a l’inici d’aquesta tesi el paper de la mitofàgia en el TAM, un dels teixits amb més capacitat oxidativa, no havia estat descrit. En aquest projecte es va identificar Parkin, una de les principals proteïnes relacionades amb la mitofàgia, com a un nou factor implicat en el control de la capacitat termogènica del TAM. L’anàlisi de la regulació de l’autofàgia durant l’activació termogènica utilitzant models in vivo (exposició al fred ) i in vitro (cultius primaris d’adipòcits marrons) ens va permetre determinar que l’autofàgia és reprimida en associació amb l’activació de la termogènesi en el TAM. A més a més, en condicions basals, els adipòcits marrons mostren signes d’activitat lipofàgica, la qual es veu suprimida per l’estímul termogènic. Aquest efecte és reproduïble en adipòcits marrons per l’acció de la noradrenalina, la qual actua mitjançant l’cAMP, principalment a través de la via de la proteïna cinasa A. La inhibició de l’autofàgia en adipòcits marrons promou un increment en els nivells d’expressió de la proteïna UCP1, i un increment en la respiració desacoblada. Un dels principals mecanismes per induir la mitofàgia és el reclutament de la proteïna Parkin als mitocondris danyats. La translocació de Parkin als mitocondris és mitjançada per la cinasa putativa induïda per PTEN 1 (PINK1), que actua com a sensor de dany mitocondrial. En aquest estudi descrivim que l’expressió de Parkin es veu fortament reprimida en el TAM de ratolins durant l’activació termogènica, mentre que PINK1 s’estabilitza als mitocondris. D’aquesta manera, la repressió de Parkin podria actuar de mecanisme regulador per tal de prevenir la degradació de mitocondris degut a la despolarització que es troba intrínsecament associada a l’activació termogènica. D’acord a la reciprocitat existent entre els nivells baixos de Parkin i l’activitat del TAM, els ratolins genèticament modificats per la falta d’expressió de Parkin presenten una elevada activitat termogènica en el TAM i són resistent a l’obesitat. Utilitzant adipòcits marrons en cultiu, vam trobar que la repressió de Parkin depèn principalment de mecanismes dependents de senyalització per àcids grassos. A més a més, el sistema PINK1-Parkin es troba activat durant la desaclimatació al fred, una situació en la qual el TAM s’inactiva i que alhora implica la pèrdua massiva de proteïna mitocondrial al teixit. En resum, els resultats d’aquesta tesi ens han permès determinar que l’autofàgia i, especialment, la mitofàgia, actuen com a reguladors negatius de l’activitat termogènica del TAM.
Brown adipose tissue (BAT) is the main site of non-shivering thermogenesis, a mechanism of heat production that enables the organism to adapt to a cold environment. Brown adipocytes possess large amounts of mitochondria with a high oxidative capacity due to the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). UPC1 uncouples the respiratory chain from oxidative phosphorylation yielding a high oxidation rate. Moreover, energy expenditure derived from BAT thermogenic activity provides a protective mechanism against obesity. Autophagy is a process that contributes to the maintenance of cellular homeostasis by degrading damaged or no longer needed organelles and cytoplasmic substrates into lysosomes. At the beginning of this thesis the role of autophagy in the adaptation of BAT to thermogenic activation had not been determined. We analyzed the effects of thermogenic activation in autophagy using in vivo and in vitro models. We found that autophagy is repressed in association with cold-induced thermogenic activation of BAT in mice. This effect was mimicked by NE action in brown adipocytes, acting mainly through a cAMP-dependent protein kinase A pathway. Moreover, we described the presence of active lipophagy in brown adipocytes under basal conditions, which is suppressed by the thermogenic stimulus. Reciprocally, inhibition of autophagy in brown adipocytes leads to an increase in UCP1 protein and uncoupled respiration. We also reported that Parkin, a protein implicated in the selective degradation of mitochondria (mitophagy), was repressed during BAT thermogenic activation, a transcriptional mechanism controlled by free fatty acids related pathways. Parkin is activated by PINK1, a protein that is stabilized in the outer membrane of damaged mitochondrial. We report that PINK1 is stabilized during thermogenic activation, probably in response to UCP1-mediated mitochondrial depolarization. Our data support the possibility that Parkin downregulation may be a compensatory mechanism to prevent PINK1-induced mitophagy. Otherwise, the PINK1-Parkin system is induced during cold-deacclimation, a situation of BAT inactivation. In accordance with the reciprocal association between low Parkin levels and BAT activity, mice lacking Parkin had an enhanced thermogenic activity and were resistant to diet-induced insulin resistance and obesity. In conclusion, autophagy and especially mitophagy are processes associated negatively with BAT thermogenic activation.
El tejido adiposo marrón (TAM) está formado principalmente por adipocitos marrones, la función principal de los cuales es el mantenimiento de la temperatura corporal del organismo a través de la termogénesis adaptativa. La capacidad termogénica de TAM viene dada por la expresión de la proteína desacopladora 1 (UCP1), una proteína mitocondrial capaz de desacoplar la cadena respiratoria de la fosforilación oxidativa, generando calor en vez de ATP. Los trabajos realizados en la presente tesis doctoral han sido orientados en el estudio de la implicación de la autofagia en los procesos adaptativos relacionados con la función termogénica en el TAM. En el momento de iniciar esta tesis existían pocos estudios sobre el papel de la autofagia en la biología del TAM, ya que los estudios publicados en ese momento principalmente habían centrado la atención en el papel de la autofagia en el tejido adiposo blanco. Nuestra hipótesis fue que la autofagia podría ser un proceso importante para la función termogénica en el TAM. Entre los procesos autofágica, la degradación de mitocondrias (mitofagia) es un mecanismo de control de calidad destinado al mantenimiento de una red mitocondrial en buenas condiciones. La mitofágia es de especial relevancia en células con alta capacidad oxidativa, como las células musculares o las neuronas. En cambio, al inicio de esta tesis el papel de la mitofágia en el TAM, uno de los tejidos con mayor capacidad oxidativa, no había sido descrito. En este proyecto se identificó Parkin, una de las principales proteínas relacionadas con la mitofàgia, como un nuevo factor implicado en el control de la capacidad termogénica del TAM. El análisis de la regulación de la autofagia durante la activación termogénica utilizando modelos in vivo (exposición al frío) e in vitro (cultivos primarios de adipocitos marrones) nos permitió determinar que la autofagia es reprimida en asociación con la activación de la termogénesis. Además, en condiciones basales, los adipocitos marrones muestran signos de actividad lipofágica, viéndose esta suprimida por el estímulo termogénico. Este efecto es reproducible en adipocitos marrones por la acción de la noradrenalina, la cual actúa mediante la cAMP, principalmente a través de la vía de la proteína quinasa A. La inhibición de la autofagia en adipocitos marrones promueve un incremento en los niveles de expresión de la proteína UCP1, y un incremento en la respiración desacoplada. Uno de los principales mecanismos para inducir la mitofágia es el reclutamiento de la proteína Parkin en las mitocondrias dañados. La translocación de Parkin en las mitocondrias es mediada por la quinasa putativa inducida por PTEN 1 (PINK1), que actúa como sensor de daño mitocondrial. En este estudio describimos que la expresión de Parkin se ve fuertemente reprimida en el TAM de ratones durante la activación termogénica, mientras que PINK1 se ve estabilizada en las mitocondrias. De este modo, la represión de Parkin podría actuar de mecanismo regulador para prevenir la degradación de mitocondrias debido a la despolarización que se encuentra intrínsecamente asociada a la activación termogénica. De acuerdo a la reciprocidad existente entre los niveles bajos de Parkin y la actividad del TAM, los ratones genéticamente modificados por la falta de expresión de Parkin (Parkin-KO) presentan una elevada actividad termogénica en el TAM y son resistentes a la obesidad. Utilizando adipocitos marrones en cultivo, describimos que la represión de Parkin depende principalmente de mecanismos dependientes de señalización por ácidos grasos. Por otro lado, el sistema PINK1-Parkin se encuentra activado durante la desaclimatación al frío, una situación de inactivación del TAM que implica la pérdida masiva de proteína mitocondrial. En resumen, los resultados de esta tesis nos han permitido determinar que la autofagia y, especialmente, la mitofàgia, actúan como reguladores negativos de la actividad termogénica del TAM.

La obesidad se asocia con un estado de inflamación crónica de bajo grado y es considerada uno de los mayores factores de riesgo cardiovascular y de otro tipo de enfermedades como son la diabetes, hipertensión, arteriosclerosis y trombosis. Se han descrito diversos procesos que tienen lugar en el tejido adiposo y que determinan el desarrollo de la obesidad. Sin embargo, el tejido adiposo no solo se considera un órgano de almacenamiento energético o endocrino, sino que hoy en día también es considerado como una fuente de células madre mesenquimales (ASC). Recientemente las ASC se han convertido en una alternativa de gran interés en terapia celular para regenerar el corazón dañado. Sin embargo se ha sugerido que una alteración en la homeostasis de las células madre desencadenada por un estímulo nocivo, constante y repetitivo, como podría ser el caso de una enfermedad crónica, podría provocar un desequilibrio persistente en el reservorio de éstas células produciendo un cambio prematuro e irreversible del potencial regenerador de las células madre. De hecho, estudios previos han demostrado que la presencia de factores de riesgo cardiovascular, como la hipertensión, la enfermedad coronaria o la diabetes, alteran y merman las propiedades de las células progenitoras circulantes. Del mismo modo, se ha visto que la edad y el género modifican la funcionalidad de las ASC. El objetivo central de esta tesis ha sido el estudiar y caracterizar las ASC derivadas de pacientes obesos. En esta tesis doctoral se ha observado que la presencia de desórdenes metabólicos disminuye el porcentaje de células positivas para ciertos marcadores característicos de ASC, como es el caso de CD90, en el tejido adiposo. Sin embargo, una vez aisladas las ASC, independientemente del índice de masa corporal del donante de las ASC, éstas presentan el 100% de los marcadores característicos confirmándonos la obtención de una población homogénea. No obstante, hemos observado que algunas características importantes y necesarias para el uso de las ASC en la terapia celular se ven afectadas cuando las células se aíslan de pacientes que presentan obesidad mórbida y factores de riesgo cardiovascular. A nivel clínico y en la terapia celular es beneficioso poder obtener el máximo número de células en el menor tiempo posible. El hecho de que observemos una mejora en la velocidad de crecimiento celular al cultivar las ASC en condiciones de hipoxia refuerza el uso de bajas concentraciones de oxígeno a la hora de su expansión para fines clínicos. Sin embargo, el uso de las ASC de pacientes obesos no parece ser tan beneficioso. Estas células presentan un crecimiento celular más lento, una menor capacidad proangiogénica al liberar el factor antiangiogénico trombospondina-1, así como una capacidad de diferenciación disminuida respecto a las ASC de pacientes no-obesos. De hecho, parece ser que las ASC de pacientes obesos se encuentran en un estado de desarrollo menos multipotencial que las de individuos no-obesos, más dirigido hacia la adipogénesis, y a un estado más proinflamatorio. Una de las ventajas del uso de las ASC en la terapia celular es su uso autólogo, sin embargo esta ventaja desaparece en el caso de los pacientes obesos. Aunque se conocen bastante bien los cambios que se producen en el tejido adiposo de los obesos, no está muy estudiado como afectan estos cambios a la población endógena de células madre mesenquimales de éste tejido. Los resultados obtenidos en este trabajo nos ayudan a comprender mejor como la obesidad, y los desórdenes metabólicos que derivan de ella, afectan y modifican a la población de ASC.
The adipose tissue is an endocrine regulator and a risk factor for atherosclerosis and cardiovascular disease when by excessive accumulation induces obesity. Moreover, it has been demonstrated that the adipose tissue is a reservoir of mesenchymal stem cells. The potential use of adipose-derived stem cells (ASCs) from white adipose tissue for organ repair and regeneration has been considered because of their obvious benefits in terms of accessibility and quantity of available sample. However, age, adipose tissue depot site, and gender have been shown to modify the number and the proliferation, differentiation, and angiogenic capacity of ASCs. Our aim was to investigate the mechanisms by which obesity affects subcutaneous white adipose tissue stem cells. Here we report that ASCs from white adipose tissue of patients with obesity have lower proliferative and angiogenic potential than ASCs of nonobese metabolically normal individuals. Moreover, the transcriptomic profile of the stem cells reservoir in obese subcutaneous adipose tissue is highly modified with significant changes in genes regulating stemcellness, lineage commitment and inflammation. In addition to body mass index, cardiovascular risk factor clustering further affect the ASC transcriptomic profile inducing loss of multipotency and, hence, capacity for tissue repair. In summary, obesity produces a detrimental effect on its resident stem cells. In fact, the ASC undifferentiated multipotent state is impaired in obese patients with respect to non-obese individuals. These effects may negatively influence their regenerative potential when used in cell therapy and also in spontaneous repair of minor organ damage. Indeed, ASCs have already been tested in several clinical trials, from repair of heart ischemic injury to Crohn’s disease and multiple sclerosis. However, our observations indicate that the therapeutic strategies based on autologous ASC implantation would be impaired in patients with obesity and metabolic syndrome.

La atrofia facial (AF) en pacientes infectados por el VIH es la manifestación más visible de la lipoatrofia (LA) asociada al trastorno de lipodistrofia (LD). Su prevalencia se ha estimado en un 50% de pacientes bajo tratamiento antirretroviral y la etiología es desconocida aunque el tratamiento antirretroviral de gran actividad parece jugar un papel relevante en su patogénesis. El cambio de la fisonomía facial inducido por la LA en los pacientes VIH+ los delata, sintiéndose estigmatizados. Esto conlleva problemas psicológicos, ansiedad y depresión, problemas de relación social o una menor adherencia al tratamiento antirretroviral que aumenta el riesgo de fracaso del tratamiento.
Dado que no es posible tratar la causa de la AF se ha intentado establecer un tratamiento paliativo de las alteraciones físicas. Los métodos invasivos de relleno, con implante de materiales autólogos o sintéticos, son los únicos que ofrecen una solución rápida y efectiva.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: Es necesario un tratamiento para la AF que sea efectivo, inocuo para el paciente y de resultados duraderos. Al no existir un tratamiento etiológico para la AF asociada al VIH podemos plantear la hipótesis que los injertos de TA autólogo pueden corregir los signos de AF de los pacientes afectos de LD asociada al VIH de una forma efectiva, inocua y duradera.

PACIENTES Y MÉTODOS: Diseñamos un estudio de la concordancia entre diferentes observadores independientes para una clasificación de AF consistente en, de menor a mayor afectación, un grado 0 (G0) de normalidad, un grado 1 (G1) de pérdida del relieve malar, un grado 2 (G2) de pérdida del relieve malar junto con hundimiento de la piel por debajo del borde inferior del malar y un grado 3 (G3) en el que además de los signos anteriormente descritos se hace manifiesta la musculatura superficial de la cara. El nivel de concordancia se midió para cada categoría por separado mediante el coeficiente KAPPA.
La valoración de los aspectos relacionados con la técnica propuesta se realizó mediante un estudio prospectivo de intervención de 50 pacientes con control hasta 12 meses. Se registró el estado previo de AF y tras el tratamiento mediante la escala de clasificación propuesta así como las distintas variables de la técnica quirúrgica. El TA se obtuvo de alguna zona con depósito graso subcutáneo (giba, abdomen, mamas).
Para el análisis estadístico descriptivo, de las variables cualitativas y cuantitativas y de datos apareados se emplearon los tests habituales. La evolución del grado de afectación a lo largo del tiempo se evaluó mediante el cálculo de la diferencia del grado respecto el momento basal y se comparó la variación de estos cambios respecto a todo el periodo de estudio, mediante un Modelo de Ecuaciones de Estimación Generalizada ajustando por el tiempo.

DISCUSIÓN: La buena concordancia entre observadores (0.68, p-valor <0.001) permite validar el método de valoración clínica, lo que supone disponer de una herramienta sencilla de valoración rápida, sin coste, para el diagnóstico y evaluación de la LA en pacientes seropositivos.
Con la inyección de TA el 100% de los pacientes mostraron una mejoría significativa en el grado de AF a los 3 meses del tratamiento y esta mejoría se mantuvo estable hasta los 12 meses, no siendo evidente ninguna tendencia a la regresión. La mejoría esperada con el tratamiento se estimó 1,86 grados, es decir, de entre 1 y 2 grados.
Por tanto, la infiltración de TA constituye un tratamiento relativamente seguro y duradero para la LA facial de los pacientes seropositivos, que se compara favorablemente con otras medidas o terapias no quirúrgicas y que debe ser tenido en consideración en ausencia de un tratamiento etiológico definitivo.
Facial atrophy HIV infected patients is the more visible manifestation of the lipoatrophy related with the lipodystrophy disorder. The change induced by the lipoatrophy results in psychological problems, problems of social relationship or reduced adherence to the antiretroviral treatment.

The hypothesis of work was that it is necessary a treatment for the facial lipoatrophy that be effective, innocuous for the patient and with durable results. As an etiologic treatment does not exist, we can formulate the hypothesis that the autologous fatty tissue grafts can correct the signs of facial atrophy of the patients affected by the lipodystrophy associated to the HIV in an effective, innocuous and durable way.

A study of the agreement among different independent observers for a classification of the facial atrophy based on simple anatomical features and assessable in 4 categories (grades) was designed. From the minor to the major affectation we described a grade 0 (G0) of normality, a grade 1 (G1) of loss of the malar relief, a grade 2 (G2) of loss of the malar relief with sinking of the skin below the inferior rim of the malar bone and a grade 3 (G3) in which becomes apparent the superficial musculature of the face together with the previously described signs. The level of agreement was measured by means of the KAPPA coefficient.

The evaluation of the aspects related with the proposed technique was carried out by means of an intervention prospective study with 50 patients. The previous state of facial atrophy and the state after the treatment were registered using the scale of the proposed classification. The different variables of the evolution of the patients were registered at 1 month, 3, 6 and 12 months after the treatment.

The method of classification was highly concordant for different professionals implied in the attention of these patients. During the follow up period all the patients improved the grade of facial atrophy in a persistent manner. The intensity of the improvement after 12 months was calculated between 1 and 2 grades. The infiltration of TA represents a relatively secure and long-lasting treatment for the facial lipoatrophy.

Se ha evidenciado como principales contribuyentes a la creciente epidemia de obesidad, al exceso de consumo de alimentos energéticamente densos y la reducción de la actividad física, entre las medidas de prevención y tratamiento se considera la implementación de edulcorantes no calóricos para este propósito. Objetivos: Caracterizar poblaciones leucocitarias del tejido adiposo gonadal de ratones consumidores de edulcorantes comerciales, y cuantificar las poblaciones leucocitarias de: linfocitos T (CD3+) y sus subpoblaciones CD4 y CD8, macrófagos (CD14+) y linfocitos B (CD19+) con marcadores de superficie MHC I, MHC II. Metodología: Se trabajó con tejido adiposo de ratones BALB/c de 14 semanas de edad, machos y hembras, suplementados con edulcorantes comerciales durante 6 semanas y clasificados en grupos de 6 ratones por edulcorante (sucralosa, estevia, sacarosa y control, por sexo). Se obtuvo el tejido adiposo gonadal y se cuantificaron las diferentes poblaciones celulares y los marcadores de superficie MHC-I y MHC-II empleando la técnica de citometría de flujo. Resultados: El aumento de peso en los grupos de tratamiento fue significativamente mayor que el grupo control, el consumo de edulcorantes fue mayor en el grupo sacarosa hembras (40 mL/semana) y machos (47.3 mL/semana), mientras que el consumo de alimento fue mayor en el grupo sucralosa hembras (27.4 g/semana) y machos (32.1g/semana). Se manifestó un incremento en la frecuencia de células CD45+ en hembras con sucralosa 66.1 ± 3.4%), estevia (63.8 ± 5.0%) y sacarosa (67.7 ± 4.9%) en contraste con ratones macho las diferencias se encontraron en sacarosa (68.4 ± 6.0%) y estevia (67.1 ± 3.4%). Para el marcador CD14+ los datos muestran que los grupos de hembras con sacarosa (21.3 ± 4.3%) y sucralosa (22.2 ± 3.3%) presentan una frecuencia mayor de células, los ratones machos muestran diferencias en el grupo sacarosa (19.6 ± 1.4%). El análisis de la frecuencia de células CD19+ en hembras muestra diferencias en sucralosa (69.4 ± 5.7%), los resultados en ratones macho mostraron diferencia en los grupos sacarosa (38.1 ± 2.6%) y estevia (36.8 ± 4.1%). Conclusiones: El consumo crónico de edulcorantes artificiales puede tener efectos en las modificaciones de las poblaciones de leucocitos totales, macrófagos y linfocitos B en el tejido adiposo
Consejo Mexiquense de Ciencia y Tecnología

Objetivo: Determinar los efectos que pueden ocasionar los ácidos grasos constituyentes del aceite y/o grasa denominada comercialmente "Light" sobre el tejido adiposo, hepático e intestinal y las posibles alteraciones enzimáticas a nivel hepático en ratas albinas. Diseño: Estudio prospectivo, longitudinal, experimental aleatorizado. Materiales y Métodos: Realizado en 30 ratas machos raza Wistar de 21 días de edad, distribuidas en tres grupos al azar. El grupo (A) recibió una dieta con 33% de ácidos grasos provenientes de un Aceite Vegetal, el grupo (B) recibió 33% de un Aceite “Light” y el grupo (C) recibió 33% de ácidos grasos presentes en Margarina “Light”. Resultados: El peso de las ratas se incremento durante todo el experimento (Grupo A 593%, Grupo B 586%, Grupo C 624%). La composición corporal del grupo C (alimentado con margarina “Light”) registro un alto contenido de agua 146%, bajo contenido de proteínas 17,74 % y bajo contenido de lípidos 12,05% en comparación con los grupos A y B La actividad enzimática de la Piruvato kinasa (E.C. 2.7.1.40) y la de Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.49) en el grupo C se incremento en 0,8 u/g en relación al grupo A. El nivel de Lactato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.27) disminuyo en el grupo C (438,7 u/g) y la 6-Fosfogluconatodeshidrogenasa (E.C. 1.1.1.41) se incremento en el grupo B (1,3 u/g). Los niveles de peroxidación lipídica del grupo C registraron un incremento de 117.96% de nivel de lipoperoxidación al ser comparados con el grupo A (100%) y B (104.63%) La concentración de proteínas hepáticas se incremento en el grupo B (0,86 g/dL) En el tejido hepático del grupo C se observó menor volumen individual del hepatocito con un alto grado de infiltración acuosa, anisonucleosis, poiquilonucleosis e infiltración grasa. El tejido adiposo presento mayor volumen individual. En el tejido intestinal las células de paneth y las células cilíndricas perdieron su forma habitual y mayor deterioro histológico al ser comparado con los grupos A y B. Conclusiones: Ratas alimentadas con dietas que incluían ácidos grasos provenientes de la grasa tipo Margarina Vegetal “Light”, presentaron trastornos en la composición corporal, variaciones en las concentraciones enzimáticas, peroxidación lipídica y cambios morfológicos en el tejido.
Objective: To determine the effects caused by fatty acids comprised in oil and fats commercially designated as “light” on adipose, liver, and intestinal tissue of Albino rats, as well as possible liver enzyme alterations in these animals. Design: Prospective, longitudinal, experimental, and randomized study. Materials and Methods: The study was performed in 30 Wistar male rats, 21 days old, who were randomly assigned to one of three groups. The animals in group (A) received a diet comprising a 33% fatty acid content from vegetable oils, Group (B) received the same fatty acid content from a “light” oil, and Group (C) received a 33% fatty acid content from “light” margarine. Results: Weights of the animals increased during the whole experiment (Group A, 593%; Group B, 586%; and Group C, 624%). Body composition of animals in Group C (fed with “light” margarine) revealed a high water content, 146%; low protein content, 17,74 %, and a low lipid content, 12,05% compared to body composition in groups A and B. Pyruvate kinase enzyme activity (E.C. 2.7.1.40) and that of glucose 6-phosphate dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49) in Group C had a 0,8 u/g improvement compared to Group A. Lactate dehydrogenase levels (E.C. 1.1.1.27) was reduced in Group C (438,7 u/g), and 6-phosphogluconatedehydrogenase levels (E.C. 1.1.1.41) increased in Group B (1,3 u/g). Lipid peroxidation in Group C animals had a 117.96% increase when compared to those of Group A (100%) and B (104.63%). Liver protein concentrations were increased in Group B (0,86 g/dL) Liver tissues of Group c animals had lower individual hepatocyte volumes, with a high degree of water infiltration, and isonucleosis, poikilonucleosis and fat infiltration. Adipose tissue had a higher individual volume. In intestinal tissues from Group C animals, both Paneth and cylinder-shaped cells lost their usual appearance, and they had more histological deterioration compared to intestinal cells from Groups A and B animals. Conclusions: Rats fed with diets including fatty acids from “light” vegetable margarine had alterations in their body composition, they also had variations in enzyme concentrations and lipid peroxidation, as well as morphological changes in liver, adipose, and
Tesis

Las células madre mesenquimales humanas (CMMh) derivadas de tejido adiposo tienen características y propiedades que las hacen atractivas para la medicina regenerativa. Para ser llevadas a clínica estas células deben ser cultivadas en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación y los medios químicamente definidos son los ideales para mantener estas condiciones por su composición definida libre de elementos xenogénicos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el medio químicamente definido XANADU como medio de expansión a largo plazo para CMMh en comparación con un medio suplementado con suero fetal bovino (medio control) y un medio comercial químicamente definido (MQD-Comercial). La cinética de crecimiento fue evaluada a lo largo de 8 pases (56 días). La morfología y adherencia al plástico fue evaluada visualmente por microscopía. Se midieron la presencia de marcadores específicos de CMMh: presencia de CD73, CD90 y CD105, y ausencia de CD45, CD34 y HLA-DR. Se realizaron ensayos de diferenciación hacia condroblasto, adipocito y osteoblasto. Se evaluó la capacidad de la inmunosupresión del secretoma de las CMMh y la expresión de marcadores de potencial de diferenciación: FABP4, RUNX2, SOX9; de capacidad de inmunomodulación: IL-10, IDO, CXCL9, CXCL10; de migración y homing: CXCR4 y reguladores del ciclo celular: p21, p53, pRb. Además, se evaluó la estabilidad cromosómica mediante un análisis de cariotipo. En todos los experimentos el medio XANADU logró mantener o mejorar significativamente (p<0,05) el perfil de las CMMh expandidas en relación al medio control y el MQD-Comercial. Durante los 8 pases analizados XANADU, en relación al medio control, mantuvo un tiempo de duplicación significativamente menor entre 45 y 70 horas, similar expresión de marcadores de CMMh y capacidad de diferenciación. Además, la capacidad de inmunosupresión del secretoma de las CMM en medio XANADU fue significativamente mayor al MQDComercial. En torno a la expresión génica el medio XANADU aumento significativamente la expresión de los marcadores de potencial de diferenciación, los antiinflamatorios: IL-10, IDO y el quimiorreceptor CXCR4; mientras que mantuvo la expresión de los marcadores proinflamatorios CXCL9 y CXCL10 y los marcadores de regulación del ciclo celular similares al control. Además, las células expandidas en medio XANADU no presentaron aberraciones cromosómicas. En conclusión, el medio químicamente definido XANADU es un medio de expansión que mejora las propiedades y características de las CMMh, que las hacen relevantes para su uso en ensayos clínicos.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). Banco Mundial. Contrato Nº 09- 2019-FONDECYT-BM-INC.INV

SIRT3, membre de la família d’histona desacetilases anomenades sirtuïnes, es troba principalment al mitocondri de teixits amb alta capacitat oxidativa com el fetge, el múscul, el cor o teixit adipós marró i s’ha suggerit que podria jugar un paper en el metabolisme energètic. Per tal d’aclarir el seu rol en la termogènesi, es van analitzar les alteracions en ratolins SIRT3 -/- en dues condicions de termogènesi augmentada: la transició fetal-neonatal i l’exposició crònica al fred en ratolins adults, així com es va estudiar l’efecte del dejuni en adults SIRT3 -/- , una situació en la qual la termogènesi es troba inhibida. Es van avaluar els possibles trastorns metabòlics i es va procedir a un anàlisi transcriptòmic de l’expressió de gens marcadors de diverses vies metabòliques en el teixit adipós marró i altres teixits dels ratolins SIRT3 -/-. Els resultats obtinguts indiquen alteracions significatives en el període perinatal com a conseqüència de la manca de SIRT3, però no en l’etapa adulta. Concretament s’observa una expressió alterada de gens específics de la termogènesi (uncoupling protein-1, 5’-deiodinasa, PRDM16) al teixit adipós marró en l’etapa perinatal així com de gens implicats en l’oxidació d’àcids grassos (enoil-CoA, hidratasa/3-hidroxiacil CoA deshidrogenasa, acil-CoA oxidasa) al fetge durant l’etapa perinatal. Aquests resultats posen de manifest el potencial paper de SIRT3 en aquestes vies metabòliques i evidencien l’existència de mecanismes homeostàtics durant el desenvolupament post-natal capaços de compensar l’absència de SIRT3 en l’animal adult. D’altra banda, mitjançant l’ús d’adipòcits SIRT3 -/-, vam determinat que SIRT3 és necessària per una resposta apropiada de les cèl•lules a l’activació noradrenèrgica mediada per AMPc de l’expressió de gens termogènics del teixit adipós marró. El co-activador transcripcional PGC1α (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α) indueix l’expressió de SIRT3 en adipòcits blancs i fibroblasts embrionaris com a part de la inducció global del patró d’expressió gènica específic del teixit adipós marró. A les cèl•lules sense SIRT3, PGC1α no pot induir completament l’expressió de gens termogènics específics de l’adipòcit marró. PGC1α activa la transcripció del gen SIRT3 a través de la coactivació del receptor nuclear orfe ERRα (estrogen-related receptor-α) el qual s’uneix a la regió proximal del promotor del gen SIRT3. Assajos de pèrdua de funció d’ERRα, indiquen que aquest és necessari per a la completa inducció de la l’expressió del gen SIRT3 en resposta a PGC1α. Aquests resultats indiquen que PGC1α controla l’expressió de SIRT3 i que aquesta acció és un component essencial del mecanisme global a través del qual PGC1α indueix la completa adquisició del fenotip d’adipòcit marró diferenciat.
SIRT3 is a member of the sirtuin family of deacetylases present mainly in mitochondria from tissues such as brown adipose tissue, liver, muscle and heart. To gain insight in the role of SIRT3 in thermogenesis, we determined the alterations in mice with targeted invalidation of the SIRT3 gene (SIRT3-/- mice) in two conditions of enhanced thermogenesis: the fetal-to-neonatal transition and chronic exposure of adult mice to cold, an in fasting of adult mice, a condition of depressed thermogenesis. Assessment of overall metabolic disturbances and a transcritomic analysis of the expression of marker genes of distinct metabolic pathways were performed in brown fat and other tissues from SIRT3-/- mice in these conditions. Results indicated significant alterations in the perinatal period but not in adulthood. Impaired expression of specific genes of thermogenesis in perinatal brown fat, and of genes encoding components of the fatty acid oxidation machinery in perinatal liver were observed in SIRT3-/- mice. Results highlight the potential role of SIRT3 in these pathways and evidence the appearance of homeostatic mechanisms during post-natal development capable to compensate for the absence of SIRT3 in the adulthood. Sirt3 is expressed in association with brown adipocyte differentiation. Using Sirt3-null brown adipocytes, we determined that Sirt3 is required for an appropriate responsiveness of cells to noradrenergic, cAMP-mediated activation of the expression of brown adipose tissue thermogenic genes. The transcriptional coactivator Pgc-1α (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1 α) induced Sirt3 gene expression in white adipocytes and embryonic fibroblasts as part of its overall induction of a brown adipose tissue-specific pattern of gene expression. In cells lacking Sirt3, Pgc-1α failed to fully induce the expression of brown fat-specific thermogenic genes. Pgc-1α activates Sirt3 gene transcription through coactivation of the orphan nuclear receptor Err (estrogen-related receptor)- α, which bound the proximal Sirt3 gene promoter region. Errα knockdown assays indicated that Errα is required for full induction of Sirt3 gene expression in response to Pgc-1 α. The present study indicates that Pgc-1α controls Sirt3 gene expression and this action is an essential component of the overall mechanisms by which Pgc-1α induces the full acquisition of a brown adipocyte differentiated phenotype.

Resumen: El estrés afecta actualmente a la mayor parte de la población en México y del mundo, causando daño en la salud, se ha convertido en un importante factor de riesgo cardiovascular, participando en el desarrollo y complicación de enfermedades crónicodegenerativas que pueden causar la muerte, como es el caso de la obesidad; entendida como una acumulación excesiva de adipocitos, que se desarrolla por diferentes mecanismos. La proteína GPR43 es un receptor de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que participa en la regulación energética del tejido adiposo y es considerado biomarcador de adipogénesis y riesgo cardiovascular. Estos mismos factores se han vinculado con el estrés fisiológico. La disminución de AGCC y la posible disbiosis intestinal debida al estrés, podría favorecer secreción de adipocitocinas y factores quimiotácticos, lipólisis y adipogénesis. Estas respuestas y la migración de células inmunitarias en el tejido adiposo, son factores que predisponen un estado inflamatorio crónico y silencioso. El desarrollo tecnológico, un pilar esencial para la investigación biomédica ha implementado el uso de aplicaciones que permitan el análisis cuantitativo en inmunohistoquímica, donde anteriormente sólo se asignaba una puntuación de intensidad de la reacción. En la actualidad, la documentación de imágenes digitales con cámaras de alta resolución y análisis por software, permite estudiar patrones morfológicos normales y patológicos. El propósito de este trabajo, fue evaluar el estrés fisiológico como un posible factor etiológico de obesidad, a través de la cuantificación de reacción colorimétrica en μm2 de la inmunohistoquímica de la proteína GPR43 en tejido adiposo visceral de ratones cd1 estresados de 6 y 8 meses de edad. Para evaluar el estrés se determinó corticosterona, se midió la composición corporal y se cuantificaron parámetros bioquímicos para evaluar cambios en el metabolismo de los ratones. Nuestros resultados muestran que los niveles de corticosterona se encuentran más elevados en los ratones sometidos a estrés comparado con su control, sugiriendo un protocolo adecuado de estrés; sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos estresados y sus controles en los otros parámetros estudiados. En las muestras procesadas en parafina, se realizó inmunohistoquímica y análisis cuantitativo de la inmunoreactividad de la proteína mediante software Image-Pro Plus. La inmunoreacción colorimétrica de las muestras, mostró una tendencia de aumento de la proteína GPR43 en el grupo de estrés en 6 y 8 meses respecto a su grupo control. Sin embargo, se requieren más estudios para poder establecer patrones de comportamiento en tejido adiposo como respuesta al estrés fisiológico.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias.
Las células madres mesenquimáticas (MSC) se han caracterizado inicialmente por su potencial de autorenovación y diferenciación in vitro hacia linajes celulares mesodérmicos. Sin embargo; el potencial terapéutico de las MSC se basa principalmente en sus capacidades de migración y angiogénesis importantes para la regeneración tisular. El objetivo del presente estudio fue determinar los potenciales de migración y angiogénesis de las MSC derivadas de médula ósea (MSC-MO) y de tejido adiposo (MSC-TA) fetales bovinas. El ensayo de migración scratch se utilizó para determinar la capacidad migratoria de las MSC, utilizando fibroblastos (FB) fetales como controles biológicos. Para este ensayo se cultivaron 44 x 103 células/cm2 hasta alcanzar 80% de confluencia. Luego de 24 horas, se realizó el scratch en la monocapa de cada línea celular y el área de migración fue cuantificada en el tiempo 0 y luego de 24 horas mediante el software ImageJ. El análisis de migración transwell, se utilizó para determinar el potencial de migración celular en respuesta al quimiotáctico factor derivado de células estromales-1 (SDF-1). Para este análisis se cultivaron 25x103 células/mL por 24 horas, en respuesta a SDF-1 ulilizando 5% suero fetal bovino (SFB) y medio DMEM como controles. Las células que migraron hacia el lado inferior de la membrana transwell fueron observadas y cuantificadas mediante el software ImageJ. Para el análisis del potencial angiogénico de MSC, se realizó el ensayo de formación de túbulos. Células endoteliales de aorta bovina fetal fueron aisladas y resuspendidas en medios condicionados de MSC-MO, MSC-TA y FB. Luego de 6 horas de incubación a 38°C en 5% CO2 se observó y cuantificó la formación de estructuras tubulares utilizando el software ImageJ. La expresión de genes de migración, SDF-1, su receptor CXCR4 y la quimiocina secretada y expresada por linfocitos T normales regulada por activación (RANTES) y de genes de angiogénesis, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetina 1 (ANGPT1) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente por ANOVA de una vía y para las diferencias entre los promedios se utilizó el post test de tuckey, utilizando el software InfoStat. Mediante ensayo scratch se determinó un mayor (p<0,05) porcentaje de migración in vitro en cultivos de MSC-MO comparado con FB. Sin embargo; los porcentajes de migración no fueron distintos (p>0,05) entre MSC-MO y MSC-TA. El ensayo transwell permitió determinar un mayor (p<0,05) número de células migrantes en cultivos tratados con DMEM suplementado con 5% de SFB. Sin embargo; no se detectaron diferencias significativas entre líneas celulares. Se determinó que los niveles de mRNA de SDF-1 fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con MSC-MO y FB. Los niveles de mRNA de RANTES fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con FB. Sin embargo; los niveles de mRNA de CXCR4 no fueron distintos (p>0,05) entre las líneas celulares en estudio. El medio condicionado concentrado de MSC-TA indujo mayor (p<0,05) formación de túbulos, comparado con MSC-MO, FB y sus controles DMEM con 5% de SFB y DMEM. Además, se cuantificó una mayor (P<0,05) expresión de VEGF en MSC-TA comparado con las otras líneas celulares. En comparación, la expresion de ANGPT1 fue mayor (p<0,05) en MSC-MO y FB comparado con MSC-TA. En conclusión, el potencial de migración entre MSC-MO y MSC-TA es similar, lo cual puede estar determinado por niveles de expresión similares del receptor CXCR4. A su vez, una mayor expresión de VEGF en MSC-TA puede determinar que estas células presenten una mayor capacidad angiogénica comparado con MSC-MO.
Mesenchymal stem cells (MSCs) were initially characterized by their potential for self-renewal and in vitro differentiation into mesodermal cell lines. However, the therapeutic potential of MSCs is primarily based on their migration and angiogenic capacities, which are important for tissue regeneration. The objective of the present study was to determine the migration and angiogenic potentials of MSCs derived from bone marrow (MSC-MO) and adipose fetal bovine tissue (MSC-TA). The scratch migration assay was used to determine the migratory capacity of MSC, using fetal fibroblasts (FB) as biological controls. For this, 44 x 103 cells/cm2 were cultured until 80% confluence. After 24 hours, the scratch was performed in the monolayer of each cell line culture and the migration area was quantified at time 0 and after 24 hours using ImageJ software. The transwell migration analysis was used to determine cell migration capacity in response to the chemokine stromal differentiation factor-1 (SDF-1). For this assay, 25x103 cells/mL were grown for 24 hours in response to SDF-1, using as SFB 5% and DMEM as controls. Cells that migrated to the underside of the transwell membrane were observed and quantified using the ImageJ software. In order to determine the angiogenic potential of MSC, the tubule formation test was performed. Endothelial cells of bovine aorta were isolated and resuspended in conditioned media of each cell line. After 6 hours of incubation, the number of tubular structures was quantified and analyzed using ImageJ software. The relative expression levels of migration genes SDF-1, its receptor CXR4, regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (RANTES) and angiogenic genes vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin (ANGPT1) were analyzed using quantitative-PCR (Q-PCR). The data obtained were statistically analyzed by one-way ANOVA and the tuckey post test was used to determine differences between means, using InfoStat software.The scratch test allowed to determine a higher (p<0.05) percentage of migration in MSC-MO cultures compared to FB. However, migration rates were not different (p>0.05) between MSC-MO and MSC-TA. The highest (p <0.05) number of migrant cells in the transwell test was detected in cultures treated with DMEM supplemented with 5% FBS. However, no significant differences were detected between cell lines. SDF-1 mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC-TA compared to MSC-MO and FB. Similarly, RANTES mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC -TA compared to FB. CXCR4 mRNA levels were not different (p> 0.05) between cell lines. Concentrated conditioned (CC) media of MSC-TA induced greater (p <0.05) tubule formation, compared to CC of MSC-MO, FB and its controls. Moreover, the highest (P <0.05) expression of VEGF was observed in MSC-TA, compared to the other cell lines. In the case of the expression of ANGPT1 the expression was higher in MSC-MO and FB compared to MSC-TA. In conclusión, a similar migration potential between MSC-MO and MSC-TA may be associated to similar expression of the CXCR4 receptor. Moreover, higher expression of VEGF in MSC-TA may explain the greater angiogenic capacity of these cells compared to MSC-MO.
Financiamiento: Proyecto Fondef ID 15I10129.

The current theories about endothelial inflammation in the adipose tissue in metabolic syndrome point to hypoxia as one of its main causes. Nevertheless, our group has found that both 3T3L1 adipocytes, under normoxic conditions, and WAT, in vivo, consume large amount of glucose, with high production of lactate and glycerol irrespective of oxygen availability. This thesis is based on the hypothesis that adipocytes act essentially as glycolytic cells impervious to hypoxia, and their metabolism may help reduce the blood glucose levels. We assumed that hypoxia, could affect the cells of the stromal fraction, eliciting an inflammatory response. To this purpose, we have studied ex vivo the glycolytic and anaerobic capacity of adult adipocytes and stromal vascular cells of both sex and obtained from different WAT sites, developing the methodology needed for a quantitative comparative analysis of data obtained from the same cultured cells well. We found that adipocytes, despite being the cells present in WAT in lower numbers, occupied almost the whole volume of the tissue, a consequence of their huge size due to their inert fat vacuole. The overall “live cell" volume represented only about 1.5% of the tissue, thus showing a very high metabolic activity of WAT in relative terms. Adipocytes ex vivo incubated with glucose, also took large amounts of the sugar, irrespective of its concentration, releasing instead 3C metabolites, such as lactate and glycerol to the medium. Lactate was fully derived from glucose and was produced at a steady pace, irrespective the presence of oxygen, to form the ATP needed for cell functions. Glycerol efflux increased over time and its origin shifted from glycolitic to glycolytic-lipolytic: new-formed glycerol was incorporated into TAG, by esterification with acyl-CoA, derived from the same TAG lipolisis. The coexistence of these processes appears as a “futile cycle”, with the probable function further to waste excess energy. Lipogenesis was limited because the size of cells limits the access to oxidative mitochondrial pathways. The release of 3C metabolites seems to be a mechanism to lower glycemia, defend WAT against excess of substrate, and provide 3C fragments as more accessible substrates for other tissues. Mesenteric WAT adipocytes presented the highest metabolic activity, probably to help the hepatic handling of NEFA and reduce the flow of intestinal glucose to the liver. While in almost all WAT sites, excess mitochondrial pyruvate is returned to the cytoplasm to keep forming lactate; in female mesenteric adipocytes it is in part oxidized to acetyl-CoA to fuel lipogenesis. Stromal vascular cells also released lactate, even more than adipocytes per unit of tissue weight, but not glycerol nor NEFA. Red blood cells produced lactate, but its contribution was quantitatively minimal. Thus, stromal cells, acted in consonance with adipocytes, in all sites and sexes examined, wasting glucose in an anaerobic way, producing high amounts of 3C units. Thus, reinforcing the idea that WAT may be an active protagonist both in energy handling and in the body control of glycemia.
Las teorías actuales sobre la inflamación endotelial en el tejido adiposo en el síndrome metabólico apuntan a la hipoxia como una de sus causas. Nuestro grupo ha encontrado que adipocitos 3T3L1, bajo condiciones normóxicas, consumen grandes cantidades de glucosa, con elevada producción de lactato y glicerol. La hipótesis de esta tesis es que los adipocitos actuan como células glucolíticas y su metabolismo ayuda a reducir la glucemia, mientre la hipoxia podría afectar las células estromales. Hemos estudiado ex vivo la capacidad glucolítica de adipocitos adultos y células estromales de ambos sexos y de diferentes ubicaciones del TAB, desarrollando la metodología para un análisis cuantitativo. Hallamos que los adipocitos eran las células menos númerosas del tejido y la parte "viva" representaba solo el 1,5% del total, mostrando así el TAB una actividad metabólica muy elevada. Los adipocitos ex vivo captaban grandes cantidades de glucosa, independientemente de su concentración; liberando metabolitos de 3C. El lactato, liberado a ritmo constante y independientemente de la presencia de oxígeno, procedía totalmente de la glucosa. El eflujo de glicerol aumentó con el tiempo y su origen cambió de glucolítico a glucolítico-lipolítico. El glicerol neoformado se incorporaba a los TAG, reciclado acil-CoA de la misma lipolisis. Este"ciclo fútil", probablemente sirve para desperdiciar e energía, disminuir la glucemia, y proporcionar sustratos energéticos para otros tejidos. Los adipocitos del TAB presentaban la más alta actividad metabólica; probablemente para ayudar al manejo hepático de ácidos grasos y reducir el flujo de glucosa intestinal. Mientras que en todas las localizaciones, el exceso de piruvato mitocondrial regresaba al citoplasma y seguía formando lactato; en los adipocitos de las hembras de mesentérico, parte se oxidaba a acetil-CoA para sostener la lipogénesis. Las células estromales, por unidad de tejido, liberaban más lactato que los adipocitos, pero no glicerol ni ácidos grasos. Los eritrocitos produjeron mínimas cantidades de lactato.Así las células estromales, actúan en consonancia con los adipocitos, en todas las localizaciones estudiadas y en ambos sexos. Estos resultados refuerzan la idea de que el TAB puede ser un protagonista activo en el manejo de la energía y en el control de la glucemia.

El teixit adipós és un òrgan que metabolitza i emmagatzema energia, i en l’obesitat la seva disfunció s’associa a diverses alteracions metabòliques. L’augment en la prevalença de l’obesitat remarca la importància de la seva prevenció i tractament. El fotoperíode influencia processos metabòlics mitjançant els rellotges moleculars, que quan s’alteren, augmenten el risc d’obesitat. A més, segons la teoria de la xenohormesi, els vegetals senyalitzen als heteròtrofs sobre estressos lleus en l’ambient, com els canvis estacionals, suggerint l’origen de les fruites com un factor a considerar en la prevenció de l’obesitat. L’objectiu d’aquesta tesi és avaluar si el fotoperíode i el consum de fruita fora de temporada, junt amb la dieta, podrien ser factors de risc per al desenvolupament de l’obesitat, centrant-nos en el teixit adipós. Altrament, hem estudiat si la combinació de diferents ingredients bioactius podria millorar la disfunció del teixit adipós observat en l’obesitat. Hem vist que el teixit adipós de rates Fischer 344 s’adapta al fotoperíode, específicament, el dia llarg promou l’acumulació de greix i el metabolisme lipídic, respecte a un dia curt. Una dieta obesogènica emmascara algunes d’aquestes adaptacions, estimula l’acumulació de greix, però el mecanisme difereix segons el fotoperíode. Respecte al consum de fruita fora de temporada, la taronja de l’hemisferi sud, amb una empremta molecular de dia llarg, consumida en un dia curt estimula l’acumulació de greix. La cirera fora de temporada desincronitza l’expressió dels gens del rellotge molecular i, acompanyada d’una dieta obesogènica, activa canvis associats a l’obesitat. Finalment, hem vist que el mix de compostos bioactius és beneficiós pel tractament de l’obesitat, reduint l’acumulació de greix i estimulant un perfil més saludable d’expressió gènica al teixit adipós. En conclusió, aquest treball evidencia la importància del fotoperíode i el consum de fruita fora de temporada com a factors de risc per a l’obesitat, i la utilitat d’un mix d’ingredients bioactius per al seu tractament.
El tejido adiposo metaboliza y almacena energía, aunque en obesidad, su disfunción está asociada con alteraciones metabólicas. El aumento de casos de obesidad recalca la importancia de su prevención y tratamiento. El fotoperiodo influye en procesos metabólicos sincronizando los relojes moleculares que, al alterarse, aumentan el riesgo de obesidad. Además, según la teoría de la xenohormesis, los vegetales señalizan a los heterótrofos sobre diferentes estreses leves, como los cambios estacionales, sugiriendo el origen de las frutas como un factor en la prevención de la obesidad. El objetivo es evaluar el fotoperiodo y el consumo de fruta fuera de temporada, junto con la dieta, como factores de riesgo de la obesidad, centrándonos en el tejido adiposo. También si la combinación de diferentes ingredientes bioactivos mejora la disfunción del tejido adiposo observada en individuos obesos. Observamos que el tejido adiposo de ratas Fischer 344 se adapta al fotoperiodo. Un día largo promueve la acumulación de grasa y el metabolismo lipídico, comparado con un día corto. Una dieta obesogénica enmascara algunas de las adaptaciones, estimula la acumulación de grasa, pero el mecanismo difiere según el fotoperiodo. En cuanto al consumo de fruta fuera de temporada, la naranja del hemisferio sur, con un perfil molecular de día largo, estimula la acumulación de grasa al consumirse en un día corto. El consumo de cereza fuera de temporada desincroniza la expresión génica del reloj molecular y, con una dieta obesogénica, activa cambios asociados a la obesidad. Finalmente, observamos que el mix de compuestos bioactivos es beneficioso para tratar la obesidad, reduce la acumulación de grasa y estimula un perfil más saludable de expresión génica en el tejido adiposo. En conclusión, este trabajo evidencia la importancia del fotoperiodo y el consumo de fruta fuera de temporada como factores de riesgo para la obesidad, y la utilidad de un mix de ingredientes bioactivos para tratarla.
The adipose tissue is an organ specialized in metabolism and energy storage, however, in obesity, its dysfunction is associated with several important metabolic disturbances. The increasing prevalence of obesity emphasises the importance of its prevention and treatment. The photoperiod influences many metabolic processes synchronizing the molecular clock, which, if disturbed, increases the risk of obesity. Also, according to the xenohormesis theory, fruits and vegetables signal heterotrophs about mild stresses like changes in seasons, suggesting that fruit origin should be considered in obesity preventing diets. The aim of this thesis was to evaluate whether photoperiod and consumption of fruit out of season, together with diet, could be risk factors for obesity development, focusing on the adipose tissue. Additionally, we studied whether the combination of different bioactive ingredients could improve the dysfunctional adipose tissue of obese individuals. We report that the adipose tissues of Fischer 344 rats adapt to the photoperiod, with the long day promoting fat accumulation and lipid metabolism in relation to a short day. An obesogenic diet masks some of the adaptations observed, it stimulates fat accumulation, however, the mechanism is different depending on the photoperiod. Concerning consumption of fruit out of season, orange from the southern hemisphere, with a molecular signature of a long day, stimulates fat accumulation when consumed during a short day. Furthermore, cherry consumed out of season desynchronizes the molecular clock genes and, when accompanied by an obesogenic diet, stimulates changes linked to obesity. Finally, the mix of bioactive compounds shows to be beneficial for obesity treatment, as it reduces fat accretion and stimulates an overall healthier gene expression profile in the adipose tissue. In conclusion, this work shows the importance of photoperiod and consumption of fruits out of season as risk factors for obesity, and the usefulness of a particular mix of bioactive ingredients for the treatment of obese individuals.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Determina las diferencias estructurales y ultraestructurales, entre las células madre de cáncer de mama triple negativo (CMTN) y las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. La separación de células con el fenotipo CD44+/CD24-, se realiza para las líneas celulares MDA-MB 436 y MDA-MB 231 mediante la técnica de separación inmunomagnética que emplea perlas magnéticas marcadas con monoclonales específicos para este fenotipo (Miltenyi), para lo cual utiliza el separador magnético MACS (Miltenyi) y las columnas MS (Miltenyi). Se encuentran diferencias morfológicas mediante microscopia electrónica de transmisión y microscopia electrónica de barrido entre las CMC y los otros inmunofenotipos seleccionados CD44+/CD24+ y CD44-/CD24-. Entre estas diferencias están la forma esférica y menor tamaño (13µm) de las CMC de la línea celular MDA-MB 436 en comparación a los otros inmunofenotipos. Se encuentran entre las células de la línea MDA-MB 436 que experimentan, transición de células mesenquimales a células epitelial (TME), y las células madre mesenquimales derivadas. Recomienda estudios a nivel de expresión e inmunomarcaje para corroborar la TME.
Tesis

El uso de la terapia HAART (Highly-Active-Antiretroviral-Therapy), puede dar lugar a múltiples efectos secundarios. El más frecuente de ellos es el denominado HALS (“HIV-infection, HAARTtreatment- associated-lipodystrophy-syndrome”) que comprende alteraciones como la lipoatrofia periferica; un aumento de tejido adiposo visceral o la lipomatosis del tejido adiposo. Además, estas alteraciones fisiológicas pueden ir acompañadas de alteraciones metabólicas. Para saber la aportación individual de algunos fármacos al desarrollo del síndrome lipodistrófico HALS se realizó un estudio de los efectos de Efavirenz, Nevirapina (NNRTIs) y Kaletra (PI) sobre adipocitos primarios de linaje blanco en cultivo. Efavirenz, que no era considerado un fármaco asociado al síndrome lipodistrófico, es capaz de inhibir la adipogénesis con mayor potencia que Kaletra y Nevirapina. Ninguno de estos fármacos provoca toxicidad mitocondrial por lo que sus efectos ocurren en ausencia de toxicidad mitocondrial. Tanto efavirenz como kaletra reducen la secreción de adipoquinas y aumentan la expresión y secreción de citoquinas relacionadas con la inflamación, pero estos efectos siempre son mayores con el EFV mientras la Nevirapina parece no afectar a este tipo de secreciónes. Para estudiar las características moleculares de los diferentes depósitos de tejido adiposo con comportamiento opuesto como el tejido adiposo subcutáneo lipoatrófico y el tejido adiposo visceral lipohipertrófico o el tejido adiposo lipomatoso de las “buffalo-hump” de los pacientes se han comparado características moleculares de ellas con tejido adiposo de individuos control. En la comparación entre el tejido adiposo subcutáneo lipoatrófico y el visceral se ha observado que en ambos casos el tejido adiposo presenta alteraciones similares en la función mitocondrial. En cambio el descenso de marcadores de adipogénesis observado en el tejido subcutáneo de pacientes no se reproduce en el tejido visceral. Este hecho, acompañado de diferencias en el perfil de expresión de marcadores de inflamación (que parece más leve en el tejido visceral), podría explicar el comportamiento opuesto de ambos depósitos en pacientes. El estudio en el que se compararon el tejido adiposo lipomatosos de las “buffalo-hump” y el tejido adiposo subcutáneo lipoatrófico de pacientes infectados por el HIV- indica que el tejido adiposo de las “buffalo-hump” presenta alteraciones especificas en la expresión génica respecto al tejido lipoatrófico en las que destaca una expresión normal de genes adipogénicos. Así mismo, el tejido lipomatoso es capaz de expresar UCP1, un gen característico del tejido adiposo marrón, y su capacidad proliferativa concuerda más con un fenotipo del tipo marrón, por lo que se puede decir que estos adipocitos tienen un fenotipo intermedio entre blanco y marrón que se mantiene cuando este tejido lipomatoso es utilizado para trasplante autólogo a la zona facial lipoatrófica en la que mantiene la proliferación desarrollándose el síndrome hámster. No se observan diferencias en las alteraciones mitocondriales observadas en ambos tejidos. Por otra parte la ausencia de un estado de inflamación local en BH podría explicar en parte este comportamiento diferente de ambos tejidos. Además se ha observado que los pacientes muestran niveles elevados de FGF21 y disminuidos de FGF19 (dos agentes homeostaticos) respecto a los controles. Estas diferencias con los controles se acentúan a medida que los pacientes infectados por el virus HIV-1 pasan de ser no tratados a tratados y aun más al desarrollar la lipodistrofia. Los niveles de FGF21 en suero se correlacionaban con indicadores de sensibilidad a insulina o marcadores de síndrome metabólico así como con marcadores de daño hepático que podrían estar relacionados con esteatosis hepática. Los niveles disminuidos en suero de FGF19 se correlacionan negativamente con parámetros indicativos de resistencia a insulina. Además se ha descrito en esta tesis que los receptores de estos agentes endocrinos FGFR1 y β-Klotho aparecen disminuidos en el tejido adiposo de los pacientes infectados por el virus HIV-1.
Molecular basis of adipose tissue alterations and metabolic disturbances associated to HIV-1-infected lipodystrophic patients Disturbances in adipose tissue in HIV-1-infected patients undergoing HAART involve a complex set of alterations known as HAART-associated-lipodystrophy-syndrome (HALS). In most cases, lipoatrophy occur in the face, arms and legs. An enlargement of visceral adipose tissue, reminiscent of visceral obesity, is present often in combination with peripheral lipoatrophy. Lipomatosis is also commonly found in HALS, usually as an enlargement in the dorso-cervical area (buffalo-hump), although the development of lipomas in distinct anatomical sites has also been reported. This adipose tissue redistribution is associated with systemic metabolic alterations such as insulin resistance or dyslipidemia. To determine the individual contribution to HALS of some HAART-prescriptioned drugs, we performed an assessment of the effects of efavirenz, nevirapine and Kaletra on human cultured adipocytes. Our results support the fact that efavirenz and Kaletra impair adipogenesis, reduce the release of adipokines and increase the expression and release of inflammation-related cytokines, while nevirapine does not. Overall, those effects are greater in the case of efavirenz. We compared as well the molecular signature of subcutaneous lipoatrophic, visceral lipohipertrophic and dorso-cervical lipomatous adipose tissues from patients in order to determine the molecular basis causing these fat depots to behave in an opposite way. All fat biopsies from patients exhibited alterations in mitochondrial function marker genes. Visceral and “buffalo hump” fat didn’t show any alterations in the expression of adipogenesis marker genes when compared to healthy controls, while subcutaneous fat showed lower levels. The inflammatory profile was normal in “buffalo hump”, whereas visceral and subcutaneous adipose tissue depots exhibited a distinct, more exacerbated, pro-inflammatory profile. These differences could be part of the explanation of the mentioned different behavior. The serum levels of novel homeostatic agents FGF19 and FGF21 was also assessed in samples from lipodystrophic patients. FGF21 levels were significantly higher in patients and correlated positively with markers of insulin resistance, metabolic syndrome and hepatic damage. On the other hand, FGF19 levels were significantly lower in patients and correlated negatively with markers of insulin resistance. We studied the transcription level of FGF receptors in adipose tissue as well, resulting in a lower expression in biopsies from HALS patients.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias.
Las células madre mesenquimáticas (del inglés Mesenchymal Stem Cells, MSC), son células adultas indiferenciadas, que poseen propiedades de autorenovación, inmunomodulación y cuentan con una baja inmunogenicidad. Debido a ello son actualmente consideradas como potenciales agentes terapéuticos celulares para el tratamiento de variadas patologías. En el presente estudio se comparó el potencial de proliferación, inmunomodulación e inmunogenicidad in vitro de MSC derivadas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA) fetal bovino. Las MSC fueron asiladas en base a su capacidad de adherencia al plástico y a su morfología fibroblastoide. El potencial de proliferación se determinó en dos concentraciones celulares (5000 y 8500 células/cm2) durante 10 y 15 días de cultivo, respectivamente. La expresión de genes de inmunomodulación indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO), interleuquina 6 (IL-6), factor de crecimiento de transformante β1 (TGFβ1), prostaglandina E2 (PGE2) e interleuquina 10 (IL-10) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) en MSC-MO y MSC-TA estimuladas con interferón γ (IFNγ). Adicionalmente, se cuantificaron los niveles de expresión de genes de inmunogenicidad complejo principal de histocompatibilidad I y II (MHC-I y II) y moléculas coestimuladoras de linfocitos T (CD80 y CD86). Además, se evaluó el efecto de medio condicionado de ambas líneas celulares estimuladas con IFNγ sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) bovina activadas con aloantígenos. La población de MSC provenientes de MO y TA adherentes al plástico expresaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimales (CD105, CD90 y CD73) en comparación a marcadores hematopoyéticos (CD45 y CD34). Las MSC-MO doblaron su población en menor (P<0,01) tiempo en comparación a MSC-TA (2,9 vs 4,4 días, respectivamente). La exposición de MSC-MO y MSC-TA a IFNγ activó la expresión de mRNA de IDO y aumentó (P<0,05) la concentración del metabolito de IDO, quinurenina en el medio condicionado de MSC. Además, ambas líneas celulares expresaron niveles de mRNA de IL-6, PGE2, TGFβ1 e IL-10 con o sin tratamiento de IFNγ. Las MSC-MO expresan mayores (P<0,05) niveles de mRNA de MHC-II en comparación con MSC-TA. El medio condicionado de ambas líneas celulares suprime la proliferación de PBL bovino. En conclusión, los potenciales de proliferación e inmunogenicidad de MSC son dependientes de la fuente de origen tisular, debido a que las MSC-MO poseen alto potencial de proliferación e inmunogenicidad en comparación a MSC-TA. Sin embargo, ambas líneas de MSC poseen similares potenciales de inmunomodulación.
Mesenchymal stem cells (MSC) are undifferentiated adult cells that possess self-renewal, immunomodulating and low immunogenicity properties. Hence, they are currently considered as potential therapeutic agents for the treatment of various pathologies. In the present study, proliferation, immunomodulation and immunogenicity in vitro potentials were compared between MSCs derived from bone marrow (BM) and adipose fetal bovine tissue (AT). MSC were isolated based on their ability to adhere to plastic and fibroblastoid morphology. The proliferation potential was determined at two cell concentrations (5000 and 8500 cells / cm2) during 10- and 15-days culture periods, respectively. Relative expression of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor β1 (TGFβ1), prostaglandin E2 (PGE2) and interleukin-10 (IL-10) were quantified using quantitative PCR (Q PCR) in MSC-BM and MSC-AT stimulated with IFNγ. Additionally, the mRNA levels of immunogenicity genes, major histocompatibility complex I and II (MHC-I and II) and T-cell costimulatory molecules (CD80 and CD86) were determined. In addition, the effect of conditioned medium from IFNγ-stimulated MSC was estimated on the proliferation of alloantigen-activated bovine peripheral blood lymphocytes (PBL). The plastic-adherent population of MSC derived from BM and AT expressed higher (P <0.05) mRNA levels of mesenchymal markers (CD105, CD90 and CD73) compared to hematopoietic markers (CD45 and CD34). MSC-MO doubled population in a shorter (P <0.01) time period compared to MSC-AT (2.9 vs. 4.4 days, respectively). Exposure of MSC-BM and MSC-AT to IFNγ activated the expression of IDO mRNA and increased (P <0.05) IDO-metabolite kinurenine concentration in conditioned medium of MSC. Both MSC lines expressed levels of IL-6, PGE2, TGFβ1 and IL-10 mRNA with or without IFNγ treatment. MSC-BM expresses higher (P <0.05) mRNA levels of MHC-II mRNA in comparison to MSC-AT. Conditioned medium of MSC cell lines suppress the proliferation of bovine PBL. In conclusion, the potential for proliferation and immunogenicity are tissue-source dependent, since MSC-MO has a high potential for proliferation and immunogenicity compared to MSC-TA. However, both MSC lines display similar potential for immunomodulation.
Financiamiento: Proyecto Fondef Idea ID15I10129 y PRONABEC y Beca Presidente de la República del Perú.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
El estrés nociceptivo (NS) en ratones macho durante la lactancia, genera alteraciones metabólicas que se manifiestan en el estado adulto. El objetivo de este estudio fue determinar si algunas de dichas alteraciones que involucran al tejido adiposo epididimal están asociadas a una hiperactivación del Sistema Endocanabinoide (SEC). Al respecto, una parte fundamental del SEC lo constituyen los receptores tipo 1 para canabinoides/endocanabinoides (CB1R), su ligando endógeno Anandamida (ADA) y la enzima que degrada a ADA, la amido hidrolasa de ácidos grasos (FAAH). Doce horas posterior al nacimiento, crías macho de ratones de la cepa CD-1, de semejante tamaño de camada y peso corporal (PC), conformaron 2 grupos: Control (C) y Estrés (E), recibiendo ambos lactancia cruzada al azar. Durante la lactancia, el grupo E recibió diariamente una inyección subcutánea de suero fisiológico y ambos grupos se sometieron a un control diario de PC. A partir del día 30, el PC se evaluó cada 10 días en conjunto con la ingesta de alimento; ambos parámetros no mostraron diferencias significativas entre C y E, al igual que una prueba de tolerancia a la glucosa realizada a los 150 días de edad. Posteriormente, animales de 160 días fueron sacrificados para extraer sangre y panículo adiposo epididimal (PAE). Las concentraciones plasmáticas de corticosterona inmunoreactiva (ir-CTT), leptina y adiponectina se determinaron mediante ensayos de ELISA comerciales. En el PAE, se analizó la expresión de CB1R y adipofilina mediante RT-PCR y Western Blot, además de la actividad enzimática de la FAAH mediante su capacidad de hidrolizar ADA radioactiva y la actividad de la lipasa lipoproteica (LPL) mediante espectrofluorimetría utilizando un sustrato sintético. Los resultados mostraron cantidades significativamente mayores de grasa epididimal, ir-CTT, leptina y expresión proteica de CB1R y adipofilina en el grupo E. Contrariamente, la actividad de la FAAH como los niveles de adiponectina son significativamente menores en este grupo. No hubo diferencias significativas en la LPL (sólo tendencia a ser mayor en el grupo E), ni en la expresión de mRNA para CB1R y adipofilina. La mayor acumulación de grasa epididimal en el grupo E adulto, sugiere una reprogramación disfuncional de dicho tejido causada por el NS, reforzado a largo plazo por los niveles aumentados de leptina plasmática y molecularmente evidenciada por una hiperactividad de CB1R, debido a la acción concertada de su mayor expresión proteica con la menor actividad de la FAAH
FONDECYT 1070663/1100145

In response to nutritional variation, white adipose tissue (WAT) undergoes a physiological remodelling that involves qualitative and quantitative changes in resident cells and is coordinated with angiogenesis. In a condition of chronic over nutrition WAT expansion is associated to insufficient vascularisation which in turn leads to local hypoxia, inflammation and adipocytes death (hallmark of obesity). Currently, enhanced WAT angiogenesis is believed to be a promising intervention to ameliorate obesity associated metabolic dysfunctions. However, we still lack understanding of the cell intrinsic function of endothelial cells in WAT remodelling. Here we take advantage of our mouse model of PTEN (a dual lipid/protein phosphatase that counterbalance the activity of PI3K) deletion in ECs to promote vessel growth, in a cell autonomous manner. To this end, we crossed Ptenflox/flox mice with PdgfbiCreERT2 transgenic mice that express a tamoxifen-inducible Cre recombinase in ECs; 4-hydroxytamoxifen was administered in vivo at postnatal day 1 (P1) and P2 to activate Cre expression. Increased ECs proliferation, induced by PTEN loss, promotes vascular hyperplasia exclusively in WAT and leads to a progressive loss of WAT mass. PTEN null ECs undergo a metabolic switch towards an oxidative metabolism; in vivo inhibition of - oxidation is sufficient to revert both vascular hyperplasia and loss of WAT mass. Enhanced adipose vascularisation prevents from high fat diet induced WAT hypertrophy, limits body weight gain and improves glucose tolerance. Taken together our results suggest that, under obesogenic stimuli, more functional ECs prevent unhealthy WAT expansion and consequently the onset of obesity related comorbidity.

Aquaculture needs to develop new strategies and tools to face challenges as the reduction of fish oil use in fish feeds and climate change, to assure the obtention of a valuable high-quality product while preserving fish health, welfare and proper growth. This thesis includes the characterization of the gene expression pattern of preadipocytes during differentiation into mature adipocytes in rainbow trout, as well as during the process of osteogenesis in gilthead sea bream both, in vitro and in vivo. Moreover, it has been characterized the in vitro plasticity of the bone-derived cells to differentiate into the adipogenic linage. In addition, the effect of fatty acids derived from fish or vegetable oils has been tested in vitro on rainbow trout preadipocytes and gilthead sea bream bone-derived cells and in vivo, by oral administration in rainbow trout. In addition, it has been evaluated the effect of temperature over bone-derived cells and the in vivo skeletal development of gilthead sea bream, as well as the effect on lipid metabolism in this species when challenged with partially substituted fish oil diets by different vegetable oils. Finally, this study presents a characterization of the expression pattern of osteogenic genes in malformed skeletal structures of gilthead sea bream. Regarding the first block of studies, results demonstrate that adipogenesis and osteogenesis in fish are similar than in mammals, and in vitro gene expression patterns have reflected clear similarities with in vivo models thus, highlighting the potential tool of these cells as model systems to study their behaviour under new conditions. Furthermore, it has been demonstrated that the bone-derived cells, as seen in mammals, have the ability to differentiate into other linages, concretely into adipocyte-like cells not only with a differentiation media but also by the presence of a single fatty acid. In this context, these fatty acids showed their potential to act as inductors of adipogenesis by upregulating pparg gene expression or inducing higher lipid accumulation through transporters depending on the fatty acid oil source. The same fatty acids increased intracellular lipid accumulation and the activation of the adipogenic process in preadipocytes from rainbow trout. Moreover, the oral administration of fatty acids in the same species produced an activation of β-oxidation, lipogenesis and lipid transport in adipose tissue, whereas in liver a decrease in these processes was observed. Concerning temperature, both in vitro and in vivo affectation of the normal gene expression during differentiation and development respectively was shown, with the addition in the latter of the demonstration of a thermal imprinting existence after a temperature challenge. In this sense, an elevated temperature has been also shown to increase in gilthead sea bream somatic growth and adipogenesis as well as fatty acid oxidation in the liver. In these fish fed diets with different vegetable oil sources, it was shown that the combination of palm and rapeseed oils is the most equilibrated formulation to assure growth and balanced lipid accumulation at this warm condition. Finally, the vertebral column deformities (lordosis and LSK syndrome) have revealed a modified expression pattern for the genes related to extracellular matrix formation and mineralization and bone resorption, pointing to key genes to be used as molecular markers, whereas for the operculum, dental and jaw deformities gene markers have not been identified. Overall, the present thesis describes adipogenic factors that can be the base to found potential links with whole body energy regulation and demonstrates that nutrition and temperature influence adipose tissue and bone development and lipid metabolism in fish, providing different valuable models to evaluate new challenges for improving a sustainable aquaculture.
La acuicultura necesita desarrollar nuevas estrategias y herramientas para enfrentarse a desafíos como la reducción del uso de aceite de pescado en los alimentos para peces y el cambio climático, para asegurar la obtención de un producto valioso de alta calidad mientras se preserva la salud, el bienestar y el crecimiento adecuado de los peces. Esta tesis incluye la caracterización del patrón de expresión génica de preadipocitos durante la diferenciación en adipocitos maduros en trucha arcoíris, así como durante el proceso de osteogénesis en dorada tanto in vitro como in vivo. Además, se ha caracterizado la plasticidad in vitro de las células derivadas de hueso para diferenciarse en el linaje adipogénico. Además, el efecto de los ácidos grasos derivados de aceites de pescado o vegetales se ha probado in vitro en preadipocitos de trucha arcoíris y células derivadas de hueso de dorada e in vivo, por administración oral en la trucha. Además, se ha evaluado el efecto de la temperatura sobre las células derivadas de hueso y el desarrollo esquelético in vivo de la dorada, así como el efecto sobre el metabolismo de los lípidos en esta especie cuando se desafía con dietas de aceite de pescado parcialmente sustituidas por diferentes aceites vegetales. Finalmente, este estudio presenta una caracterización del patrón de expresión de genes osteogénicos en estructuras esqueléticas malformadas de dorada. En general, la presente tesis describe los factores adipogénicos que pueden ser la base para encontrar posibles vínculos con la regulación energética de todo el cuerpo y demuestra que la nutrición y la temperatura influyen en el desarrollo de tejido adiposo y hueso y el metabolismo de los lípidos en los peces, proporcionando diferentes modelos valiosos para evaluar nuevos desafíos para mejorar una acuicultura sostenible.

Brown and beige adipose tissues are mediators of adaptive energy expenditure in mammals, in contrast with the energy storage role of white fat. Mitochondrial activity, including uncoupled respiration, and the release of the so-called “batokines” in brown and beige adipocytes account for the majority of local and systemic adaptations to energy expenditure requirements mediated by these cells. One of these batokines is fibroblast growth factor 21 (FGF21), which has been recently proposed to be an antiaging hormone. Aging is associated with a decline in brown adipose tissue (BAT) activity and in browning of white adipose tissue (WAT). It has been proposed that the extent of BAT decline in aging may play a causative role in the enhanced propensity to age-associated metabolic conditions, and it has even been speculated that BAT reactivation may reverse them. On the other hand, aging is associated with increased amount of WAT. A loss of mitochondrial homeostasis by defective mitochondrial quality control as a result of decreased biogenesis but also to decreased degradation through mitophagy has been proposed as an underlying cause of aging in multiple tissues. Recently, Parkin has been identified as a key component of adipose tissue plasticity in response to thermogenic requirements, associated with the adaptive control of mitophagy. In the present study we investigated the impact of aging on adipose tissues in mice and humans with special focus on the status of the FGF21 system. We also tried to establish the role of Parkin in our mice model at distinct stages of aging. Parkin transcript and protein levels were up-regulated in relation to aging in mice adipose tissues, which may point to a compensatory homeostasis against diminished Parkin- independent mitophagy. Middle-aged wild-type mice presented an age-associated phenotype reminiscent of obesity and signs of BAT malfunction in middle-aged mice, which did not affect thermogenic response at this specific aging stage. Thus, our data would not support a massive effect of BAT in systemic derangements associated with aging. Parkin-KO mice were protected against age-associated obesity found in control animals. BAT activity does not seem to conduct the protection of Parkin-KO mice against aging-associated adiposity, as Parkin-KO mice do not present enhanced BAT- or browning-mediated energy expenditure. This phenomenon might rather be attributable to diminished food intake and risen energy expenditure-related processes in Parkin-KO mice. Our data denote that Parkin is possibly involved in the in the metabolic flexibility of lipid versus carbohydrate metabolism. FGF21 expression and its secretion in mice may be induced as stress hormone by mitochondrial dysfunctions in aged tissues. However, the chronic metabolic and stress-related disorders might elicit an FGF21 resistance, menacing healthy aging. Middle-aged mice lacking Parkin abolish increased levels of FGF21, which might be associated to the prevention of obesity occurring in those animals. In humans, serum FGF21 levels were increased in parallel with indicators of mildly deteriorated glucose homeostasis. FGF21- responsiveness machinery was not disrupted in subcutaneous adipose tissue from elderly individuals relative to those from young controls. Therefore, in contrast to what is observed in chronic metabolic pathologies or mice aging, high levels of FGF21 in healthy aging are not associated with repressed FGF21-responsiveness machinery in adipose tissue.

El tejido adiposo marrón (TAM) está considerado como el principal efector de la termogénesis no temblorosa inducida por el frío y de la termogénesis facultativa inducida por la dieta en la rata y otras especies de mamíferos.

Debido a su importancia en estos procesos; al metabolismo del TAM ha sido muy estudiado, si bien los aspectos relacionados con el metabolismo de los aminoácidos han recibido muy poca atención. El objetivo del presente estudio ha sido determinar las características generales del metabolismo de los aminoácidos en el TAM interescapular (TAMI) de la rata en distintas situaciones fisiológicas, habiendo sido dividido en tres bloques experimentales:

1) Estudio de las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de los aminoácidos en el TAMI.

2) Estudio de la utilización de la alanina por el TAMI «in vitro».

3) Estudio de la captación/liberación de aminoácidos y glucosa por el TAMI «in vivo».

En la primera parte se han estudiado las actividades de ocho de los principales enzimas en el metabolismo de los aminoácidos. No se actividades detectables de los enzimas serina deshidratasa arginasa. Los otros enzimas estudiados han sido la transaminasa (GPT), aspartato transaminasa (CiO"I'), transaminasa de aminoácidos de cadena ramificada (BCT), glutamina sintetasa (GST), glutamato deshidrogenasa (GDH) y adenilato desaminasa (AMD); para todos ellos las actividades en el TAMI son mayores que las observadas en el tejido adiposo blanco, y comparables a las del hígado y músculo esquelético. El ayuno induce pocos cambios en dichas actividades, mientras que la exposición aguda al frío determina un incremento en la BCT; por su parte, la exposición crónica al frío induce un notable incremento en la BCT y también en la GDH, mientras que disminuye la actividad AMD.

Por otra parte, el acervo de aminoácidos libres del TAMI muestra variaciones en función de la situación fisiológica del animal. De este modo, el ayuno y la exposición aguda al frío inducen una disminución en la concentración de los aminoácidos tisulares; en los animales expuestos al frío de forma crónica la concentración total de aminoácidos no se modifica, aunque es en este grupo donde las variaciones individuales con respecto a los controles son más numerosas. Al relacionar estas concentraciones con el aminograma sanguíneo destacan las variaciones observadas en el grupo de aminoácidos ramificados cambios que parecen estar de acuerdo con una utilización activa de los mismos en situaciones de exposición aguda o crónica al frío. En cualquier caso, se verifica que dichos cambios no son debidos a un recambio proteico especialmente rápido en el TAMI.

En la segunda parte se ha procedido a estudiar la utilización de la alanina por el TAMI «in vitro» en un modelo de incubaciones de fragmentos de tejido. Primeramente se ha determinado la validez de la técnica, para lo que se ha comprobado que la relación ATP/ADP se mantiene constante para incubaciones de hasta una hora de duración, al igual que la linealidad respecto al tiempo en la incorporación de los carbonos del aminoácido a las distintas fracciones tisulares estudiadas, siendo los destinos más importantes de la alanina su oxidación hasta CO2 y su incorporación a los ácidos grasos del tejido.

En un primer experimento se ha determinado el efecto de la glucosa sobre la utilización de la alanina, a distintas concentraciones de ambos substratos, comprobándose un efecto estimulador de la glucosa sobre la incorporación de los carbonos de la alanina al tejido, aunque no se modifica la oxidación del aminoácido. En el experimento complementario, en el que se ha estudiado el efecto de la alanina sobre la utilización de la glucosa, se verifica que para concentraciones superiores a 3 mM de glucosa, la alanina disminuye la oxidación de este substrato aunque sin afectar su oxidación.

Se ha comprobado también el efecto de la insulina, la noradrenalina y el glucagón sobre la utilización de la alanina por el TAMI, observándose que la primera hormona tiene un claro efecto estimulador sobre la utilización de la alanina, mientras que las otras dos disminuyen dicha utilización, si bien debe señalarse que en el caso del glucagón este efecto tan sólo se verifica a concentraciones por encima del rango fisiológico. Cabe señalar, asimismo, que todos estos efectos tan sólo se verifican en el caso de que la glucosa esté presente en el medio de incubación, mientras que en ausencia de la misma son menores tanto la oxidación del aminoácido como sobre todo su incorporación al tejido.

Una vez verificados todos estos aspectos, se ha estudiado la utilización de la alanina «in vitro» por el TAMI procedente de animales sometidos a distintas situaciones fisiológicas, tanto en condiciones basales corno en presencia de insulina y/o noradrenalina. El TAMI procedente de los animales sometidos a frío agudo muestra la mayor utilización de alanina, mientras que el de los sometidos a ayuno o a una exposición crónica al frío presenta una menor utilización que el tejido de los animales del grupo control.

En el tercer apartado experimental se ha determinado la captación o liberación de los distintos aminoácidos y de la glucosa por parte del TAMI en distintas situaciones fisiológicas. Se ha utilizado a tal efecto la técnica de la determinación de las diferencias arteriovenosas para cada uno de dichos substratos metabólicos, a partir de sus concentraciones en sangre arterial (aorta abdominal) y sangre venosa (vena de Sulzer). La similitud en la concentración de aminoácidos en la sangre arterial de los animales de los diferentes grupos experimentales indica que las diferencias observables deben ser atribuidas a un factor distinto de su asequibilidad. Por otra parte, se han determinado los flujos sanguíneos a través del TAMI utilizando la técnica de las microesferas radiactivas, marcadas con (46)Sc; el flujo se presenta disminuido en los animales ayunados pero sumamente elevado en los animales expuestos de forma aguda o crónica al frío, de acuerdo con la mayor actividad termogénica descrita en estas situaciones.

En los animales alimentados tan sólo se observa una liberación neta de prolina y taurina, así como una tendencia global hacia una pequeña liberación de aminoácidos. Con el ayuno el TAMI pasa a exportar alanina, glutamina, glicina y citrulina, así como el conjunto de aminoácidos no esenciales. Sin embargo el frío agudo induce una clara tendencia a la captación de aminoácidos, especialmente de los esenciales como la isoleucina, si bien el tejido continúa exportando prolina. Con la exposición crónica al frío hay una liberación muy importante de alanina, arginina y taurina, mientras que sigue captando isoleucina y también glutamina. En conjunto los resultados parecen indicar que este tejido capta activamente aminoácidos únicamente ante una estimulación aguda por el frío, pero estos compuestos no deben ser importantes substratos para el TAMI en otras situaciones. Sin embargo, los aminoácidos ramificados son utilizados tanto en una situación de estimulación aguda como durante la aclimatación al frío, por lo que podrían considerarse como un importante substrato energético de este tejido.

Este estudio «in vivo» se ha hecho extensivo para el caso de la glucosa, considerada como un importante substrato metabólico del TAMI. Su utilización por este tejido es especialmente notable tanto en los animales expuestos de forma aguda al frío como sobre todo en los aclimatados al frío, confirmándose de esta manera su importante papel
termogénico.

Los resultados obtenidos en los distintos bloques experimentales realizados en la presente tesis doctoral sugieren que el TAMI utiliza algunos aminoácidos como la alanina y los ramificados como substratos en situaciones de emergencia, como puede ser una exposición aguda al frío, si bien en general no parecen contribuir de forma significativa, en otras situaciones a la capacidad termogénica de este tejido.
Interscapular brown adipose tissue (IBAT) presented high activities of some enzymes related with aminoacid metabolism such as alanine, aspartate and branched chain amino acid transaminases, glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase and adenylate deaininase, but neither arginase nor serine dehydratase were detectable. These enzymatic activities were in a range between those of liver and skeletal muscle. Chronic cold-exposure induced some changes both in the tissue enzymatic activities and amino acid pool composition, but starvation or acute cold-exposure did not induce deep effects.

IBAT took up actively alanine and glucose, in "in vitro" incubations of tissue slices. Insulin enhanced the utilization of alanine, but noradrenaline and glucagon decreased it. These hormones had effect only when glucose was present in the incubating media. The IBAT of rats subjected to acute cold-exposure presented an active utilization of alanine, but the capacity of the starved or chronically cold-exposed rat tissue was decreased with respect to the control animals.

"In vivo" utilization of amino acids and glucose was estimated through the measurement of arterio-venous differences having into account the blood flow (measured by means of radiactive microspheres). The results indicated that IBAT took up some amino acids, as glutamine, and released glycine and proline, maintaining its amino acid nitrogen balance. Branched chain amino acids seem to play an important role as energetic substrates of IBAT under conditions of tissue stimulation, as cold-exposure; this is also true for glucose uptake.

The results obtained in the present work show that IBAT can utilize some amino acids as alanine or branched chain amino acids for energetic purposes, especially under situations of acute cold-exposure.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias.
La calreticulina recombinante de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) aplicada tóipicamente es más efectiva que su contraparte humana en inducir proliferación y migración fibroblástica in vitro, correlacionándose con los efectos in vivo de esta proteína, la cual estimula un cierre acelerado de heridas en piel de ratas. Para estudiar una de las posibles vías por la cual podría ocurrir este proceso, se analizó la influencia directa de rTcCRT sobre la diferenciación a fibroblastos a partir de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) subcutáneo, adyacente a la herida. Para esto, se propuso detectar la expresión de genes fibrogénicos específicos en ADSC, en presencia de rTcCRT, in vitro. Las ADSC de rata fueron aisladas y cultivadas para comprobar el potencial multilinaje a linaje osteogénico, adipogénico y fibrogénico. La diferenciación a cada linaje a través de tinción histoquímica y RT-PCR, a las cuatro semanas. Por otro lado, se cultivaron ADSC en medio de cultivo suplementado con rTcCRT para observar el potencial efecto diferenciador a fibroblastos. Su detección se realizó a través tinción tricrómica de Mallory luego de cuatro semanas, revelando la presencia de fibras colágenas, con patrones similares a aquellos obtenidos en los controles positivos de fibroblastos dérmicos de rata. Se utilizó RT-PCR para identificar la expresión de genes fibrogénicos, mostrando una significativa expresión de genes fibrogénicos en las ADSC suplementadas con rTcCRT y una expresión no detectable en las ADSC control sin suplementar.
Recombinant Trypanosoma cruzi calreticulin (rTcCRT) topically applied is more efficient than its human counterpart on its capacity to increase fibroblastic proliferation and migration in vitro, and correlates with an accelerated rat skin wound healing process in vivo. To study one of the possible pathways by which this process occurs, the direct influence of rTcCRT in the differentiation to fibroblasts of the subcutaneous population of rat adipose derived stem cells (ADSC) surrounding the wound, was analyzed. For this purpose, we detected the expression of specific fibrogenic genes in rTcCRT-supplemented ADSC, in vitro. Rat ADSC were obtained and cultured to analyze their multilineage potential to osteogenic, adipogenic and fibrogenic lineages. The differentiation was detected through histological staining and RT-PCR, after four weeks of culture. On the other hand, ADSC were cultured in supplemented growth medium supplemented with rTcCRT to observe the fibroblast differentiation-effect. The detection was accomplished by Mallory's trichrome staining direct histology after four weeks of culture, revealing the presence of collagen fibers with similar staining patterns to those obtained with rat skin fibroblasts primary cultures as positive controls. RT-PCR was also used to identify the expression of fibrogenic genes, showing significative expression of fibrogenic genes in the rTcCRT-supplemented ADSC and no detectable expression in ADSC negative control cultures.
Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1130257 y Proyecto U-INICIA 2036.

Tanto la infección por el virus VIH como el tratamiento antirretroviral se asocian con el desarrollo de alteraciones metabolicas relacionadas con la adiposidad, pudiendo íncluso desarrollar lipodistrofia. Estudios previos han relacionado el desarrollo de estas complicaciones con fenómenos celulares de toxicidad mitocondrial, estrés de retículo, alteraciones en el proceso de adipogénesis, fibrosis y procesos de envejecimiento prematuro. Sin embargo, no se conoce en profundidad cómo afectan estos procesos a los depósitos adiposos. Es por esto que en el primer capítulo de esta tesis se ha realizado un estudio sobre la firma molecular de los lipomas que aparecen en pacientes de VIH. Así, se ha reportado que estas formaciones de tejido adiposo no presentan signos de inflamación, alteraciones en la adipogénesis ni de disfunción mitocondrial. Sin embargo, presentan un estado de alta proliferación y de envejecimiento prematuro y precoz. También se encontró que, dentro de los diferentes tipos de lipomas, los que aparecen en la zona dorsocervical (conocidos como "giba de búfalo") son los únicos que presentan patrones de expresión génica relacionados con la presencia de adipocitos marrones clásicos. En el segundo capítulo se ha anaizado el efecto del nuevo fármaco antirretroviral elvitegravir sobre adipocitos humanos en cultivo. Este método ya se ha utilizado anteriormento con otros fármacos como una forma de alertar ante posibles efectos adversos que este nuevo fármaco pudiera producir sobre el tejido adiposo. Observamos que este fármaco no puede considerarse completamente "adipose friendly", ya que inhibe la adipogénesis y altera la expresión de adipoquinas y de citoquinas proinflamatorias. Paradójicamente, a pesar de tener dificultades a la hora de almacenar grasa con normalidad en sus depósitos de tejido adiposo, estos pacientes desarrollan alteraciones metabólicas que normalmente aparecen en personas obesas, como resistencia a la insulina, diabetes tipo II o el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. De la misma forma, estos pacientes tienen altos niveles circulantes de la hormona FGF21 y bajos niveles de su correceptor beta-klotho, el cual es necesario para que el organismo responda a los efectos antidiabéticos de esta hormona. Esta situación de aumento de FGF21 y bajada de beta-klotho recuerda al estado de resistencia a FGF21 que se observa en la obesidad y la diabetes tipo II. Por esto realizamos un estudio sistemático sobre el efecto que tienen los principales miembros de las diferentes familias de fármacos sobre células hepáticas, adiposas y musculares humanas. En algunos de los fármacos más utilizados, como el efavirenz, el elvitegravir y casi todos los inhibidores de la proteasa vírica, encontramos una alteración en el sistema FGF21/beta-klotho análoga a la que se observa en pacientes, caracterizada por la subida de FGF21 y la bajada de beta-klotho. Estas alteraciones parecen relacionarse con fenómenos de estrés de retículo y estrés oxidativo. Aunque se conoce que beta-klotho es necesario para la correcta señalización de FGF21, no se conoce hasta qué punto la bajada en los niveles de beta-klotho puede afectar al correcto desarrollo de ciertas funciones en las que FGF21 está involucrada. Gracias a estudios con ratones y con cultivos primarios parcial o totalmente deficientes para el gen que codifica beta- klotho y para el de FGF21, determinamos como la caída en los niveles de este correceptor compromete la activación termogénica de los tejidos adiposos blanco y marrón. Esta disminución en la respuesta termogénica parece relacionarse con una implicación autocrina de FGF21 en la respuesta termogénica de los adipocitos.
Both HIV infection and antiretroviral treatment are associated with the development of metabolic alterations related to adiposity, which may even include lipodystrophy development. Previous studies have related the development of these complications with mitochondrial toxicity, endoplasmic reticulum stress, and alterations in adipogenesis,. This thesis includes a study of the molecular signature of lipomas that appear in HIV patients. Thus, it has been observed that these adipose tissue formations do not show signs of inflammation, alterations in adipogenesis or mitochondrial dysfunction. Nevertheless, they present a highly proliferative state and signs of premature aging. It was also found that lipomas situated in the dorso-cervical area (known as "buffalo hump") are the only ones that present gene expression patterns related to the presence of classic brown adipocytes. Secondly, it has been analized the effect of the new antiretroviral drug elvitegravir on human adipocytes, reporting that this drug can’t be considered completely “adipose friendly”, since it inhibits adipogenesis and alters the expression and release of adipokines and proinflammatory cytokines. Paradoxically, lipodystrophic patients, develop metabolic abnormalities normally associated with obesity, such as insulin resistance, diabetes and hyperlipidemia. In the same way, these patients have high circulating levels of the hormone FGF21 and low levels of its co-receptor β-klotho, which is necessary for FGF21 signalling. This situation mimics the state of resistance to FGF21 observed in obesity and diabetes. Therefore, we performed a study on the effect of the main members of the different antiretroviral drug families on human liver, adipose and muscle cells. We found an alteration in the FGF21/β-klotho system similar to that seen in patients in some of the most commonly used drugs. Although β-klotho is known to be mandatoy for FGF21 signaling, it is not known to what extent the decline in β-klotho levels may affect certain functions in which FGF21 is involved. Using mouse models and primary cultures of adipocytes we determined how the drop in levels of this co-receptor compromises the thermogenic activation of white and brown adipose tissue. This decrease in thermogenic response seems to be related to an autocrine implication of FGF21 in the thermogenic response of adipocytes.

Els trastorns metabòlics vinculats a l’obesitat es correlaciona amb una disfunció en la capacitat d’expansió del teixit adipós blanc (TAB), la qual es produeix a través de la hipertròfia (augment de mida d’adipòcits) i/o la hiperplàsia (augment del nombre d’adipòcits). La hipertròfia s’associa a trastorns relacionats amb la obesitat mentre que la hiperplàsia protegeix envers alteracions metabòliques com la resistència a la insulina i la dislipèmia. Els polifenols presents en els aliments han mostrat millorar diferents components de la síndrome metabòlica (SM) tals com el metabolisme lipídic i l’acumulació de greix tot i no reduir el pes corporal. L’objectiu de la present tesi era avaluar l’efectivitat de diferents polifenols en prevenir o contrarestar la disfunció del TAB en la obesitat mitjançant la seva remodelació. Per assolir-lo es van emprar dosis dietètiques o farmacològiques d’un extracte de proantocianidines de pinyol de raïm (GSPE), d’Àcid Gàl·lic (GA) o de Resveratrol (RSV) en estudis in vivo en rates amb obesitat induïda per la dieta. Es van realitzar anàlisis histològics en TAB per avaluar canvis en mida i nombre d’adipòcits. A més, es va analitzar l’expressió gènica de marcadors d’adipogènesi, lipòlisi, “browning”, oxidació lipídica i inflamació en els TABs així com els metabòlits circulants per observar l’impacte de la remodelació del TAB a nivell de l’organisme complet. Els resultats mostraren que diferents polifenols de diverses famílies prevenen i/o reverteixen la disfunció del TAB induïda per l’excés d’energia en la obesitat. Aquesta remodelació del TAB s’associa amb millores en l’homeòstasi dels metabolismes lipídic i glucídic. Per tant, la remodelació del TAB podria contribuir als efectes beneficiosos dels polifenols en les malalties associades a la obesitat i la SM. Per tant, la incorporació d’ aliments rics en polifenols a la dieta o nutricèutics podria servir com estratègia en el tractament de trastorns metabòlics en l’obesitat.
Los trastornos vinculados a la obesidad se correlacionan con una disfunción en la capacidad de expansión del tejido adiposo blanco (TAB), la cual se produce a través de la hipertrofia (aumento del tamaño de los adipocitos) y/o la hiperplasia (aumento del número de adipocitos). La hipertrofia se asocia a trastornos relacionados con la obesidad mientras que la hiperplasia protege de alteraciones metabólicas como la resistencia a la insulina y la dislipemia. Los polifenoles presentes en los alimentos han mostrado mejorar distintos componentes del síndrome metabólico (SM) tales como el metabolismo lipídico y la acumulación de grasa, aunque no reducen el peso corporal. El objetivo de la presente tesis era evaluar la efectividad de distintos polifenoles en prevenir o contrarrestar la disfunción del TAB en la obesidad mediante su remodelación. Para lograrlo se usaron dosis dietéticas o farmacológicas de un extracto de proantocianidinas de pepita de uva (GSPE), de Ácido Gálico (GA) o de Resveratrol (RSV) en estudios in vivo en ratas con obesidad inducida por la dieta. Se realizaron análisis histológicos en TAB para evaluar cambios en tamaño y número de adipocitos. Además, se analizó la expresión génica de marcadores de adipogénesis, lipólisis, pardeamiento, oxidación lipídica e inflamación en los TABs, así como los metabolitos circulantes para observar el impacto de la remodelación de TAB a nivel del organismo completo. Los resultados mostraron que distintos polifenoles de diversas familias previenen y/o revierten la disfunción del TAB inducida por el exceso de energía en la obesidad. Esta remodelación del TAB se asocia a mejoras en la homeostasis lipídica y glucémica. Por tanto, la remodelación del TAB podría contribuir a los efectos beneficiosos de los polifenoles en las enfermedades asociadas a la obesidad y el SM. Por tanto, la incorporación de alimentos ricos en polifenoles a la dieta o de nutracéuticos podría servir como estrategia en el tratamiento de desórdenes metabólicos en la obesidad.
Metabolic disturbances associated with obesity correlate with a failure of white adipose tissue (WAT) to expand. WAT expansion occurs through hypertrophy (increased adipocyte size) and/or hyperplasia (increased adipocyte number). Hypertrophy is associated with obesity-related disorders while hyperplasia protects against metabolic disruptions such as insulin resistance and dyslipidaemia. Dietary polyphenols, particularly grape seed proanthocyanidins, ameliorate many metabolic syndrome (MS) components without a significant reduction of body weight. The aim of the present thesis was to evaluate the effectiveness of specific polyphenols to prevent or counteract obesity-associated WAT dysfunction through remodelling it. For this, dietary or pharmacological doses of a grape seed proanthocyanidin extract (GSPE), Gallic Acid (GA) or Resveratrol (RSV) were used in different in vivo studies with diet-induced obese rats. Histological analyses were performed in subcutaneous and/or visceral WAT fat depots to evaluate variations in adipocyte size and/or number. Moreover, gene expression of markers of adipogenesis, lipolysis, browning, lipid oxidation and inflammation was analysed in WAT as well as serum metabolites and hormones related to lipid and glucose metabolism to evaluate the impact of WAT remodelling in whole body metabolism. Results show that polyphenol with different chemical structures, flavonoids and non-flavonoids, were capable of remodelling adipose tissue in both a preventive and corrective manner in obesity. This remodelling effect was associated to the improvement of lipid and glucose homeostasis. Thus, WAT remodelling could contribute to the beneficial effects of polyphenols in obesity-related diseases and MS. Therefore, the incorporation of polyphenol-rich foods to the diet or nutraceuticals could be useful for the treatment of metabolic disorders in obesity.

Los resultados obtenidos demuestran que la función y la biogénesis mitocondriales del tejido adiposo blanco dependen del sexo, del depósito y de la dieta ingerida, y que el dimorfismo sexual se manifiesta ya a edades tempranas. Las hormonas ováricas serían responsables, en parte, de este dimorfismo sexual, especialmente en el depósito gonadal, lo que vincula, por tanto, a los estrógenos, al mayor grado de diferenciación mitocondrial y a la expresión de adiponectina. La dieta hiperlipídica atenúa el dimorfismo sexual observado en los animales controles a nivel de la función y la biogénesis mitocondriales y desvincula la relación existente entre la función mitocondrial y la síntesis de adiponectina. Además, induce un mayor incremento del peso corporal y de la adiposidad en las ratas hembra, lo que sugiere una mayor capacidad de expansión de su tejido adiposo. Esto les permite evitar la acumulación de grasa ectópica, manteniendo una mejor sensibilidad a la insulina al evitar los efectos de la lipotoxicidad

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias .
La mastitis es la principal enfermedad que afecta a vacas productoras de leche a nivel mundial, con costos de tratamiento de hasta US$ 200/vaca/año. Así mismo, las perdidas en producción de leche fluctúan entre 1.335 y 1.539 kg/lactancia/vaca en casos de mastitis sub clínica y clínica respectivamente. En Chile, dentro de los principales patógenos causantes de esta enfermedad se encuentra el Staphylococcus aureus (S. aureus) que es responsable del 22 al 68,6% de los cuadros sub clínicos. Recientemente, se ha reportado la existencia de un alto riesgo de resistencia bacteriana producto del uso inadecuado de antibacterianos para el tratamiento de mastitis causadas por S. aureus. Alternativamente en el último tiempo se ha establecido el uso de células madre mesenquimáticas (MSCs) para el tratamiento de múltiples enfermedades en medicina humana y veterinaria incluyendo infecciones bacterianas. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial antibacteriano in vitro contra S. aureus del medio condicionado de MSCs derivadas de médula ósea y tejido adiposo fetal bovino. Se utilizaron las cepas ATCC 25923 y SAU 1S de S. aureus con el fin de determinar su sobrevivencia en medio condicionado de MSCs no concentrado, concentrado, activado y activado concentrado mediante pre-exposición a S. aureus. En estos mismos cultivos de MSCs se cuantificaron los niveles de mRNA de los péptidos antimicrobianos β-defensina 4A (bBD4A), NK-lisina 1 (NK1), catelicidina 2 (CATHL2), hepcidina e indoleamina 2,3 dioxigenasa (IDO) mediante Q-PCR y de bBD4A mediante ELISA. La sobrevivencia de la cepa ATCC 25923 no fue diferente (P>0,05) cuando fue tratada con medio condicionado no concentrado de MSCs en comparación con los controles de fibroblastos y DMEM. Sin embargo, el porcentaje de sobrevivencia de la cepa SAU 1S disminuyó (P<0,05) al ser tratada con medio condicionado no concentrado de MSCs en comparación con el control DMEM. Adicionalmente, el medio condicionado concentrado de MSCs indujo una disminución (P<0,05) en la supervivencia de la cepa SAU 1S con respecto a los medios condicionados concentrados control de fibroblastos y DMEM. El medio condicionado activado, así como el medio condicionado activado concentrado de MSCs disminuyeron (P<0,05) la supervivencia de la cepa SAU-1S con respecto a los medios controles de MSCs no activados, de fibroblastos y DMEM. La activación indujo un aumento (P<0,01) de 3,5 veces en los niveles de mRNA de bBD4A en las MSCs de tejido adiposo y de 1,17 veces en MSCs de médula ósea. Además, la activación aumentó (P<0,05) en 1,66 y 1,37 veces el nivel de mRNA de NK1 en fibroblastos y MSCs de tejido adiposo, respectivamente. Los niveles de proteína bBD4A también aumentaron (P<0,05) en los medios condicionados de MSCs y de fibroblastos por efecto de la concentración. La activación solo aumenta (P<0,05) los niveles de bBD4A en los medios condicionados de MSCs derivadas de médula ósea. En conclusión, los medios condicionados de MSCs derivadas de médula ósea y tejido adiposo fetal bovino poseen efecto antibacteriano contra S. aureus en un sistema de cultivo in vitro. Este potencial antibacteriano se ve aumentado al concentrar por filtración y activar el medio condicionado mediante pre-exposición de MSCs a S. aureus. Estos resultados sugieren que el efecto antibacteriano de MSCs es mediado por la expresión de péptidos antimicrobianos NK1 y bBD4A.
Mastitis is the main disease affecting dairy cows worldwide with treatment costs reaching up to US $ 200/cow/year. Moreover, milk production losses fluctuate between 1,335 and 1,539 kg/lactation/cow in cases of clinical and clinical sub mastitis respectively. In Chile, one of the main pathogens causing mastitis Staphylococcus aureus (S. aureus), which is responsible for 22 to 68.6% of subclinical cases. Recently a high risk of bacterial resistance has been reported due to inappropriate use of antibacterial agents in the treatment of mastitis caused by S. aureus. Alternatively, the use of mesenchymal stem cells (MSCs) has been described for the treatment of multiple diseases in human and veterinary medicine including bacterial infections. Consequently, the aim of the present study was to evaluate the in vitro antibacterial potential against S. aureus of conditioned medium from MSCs derived from bone marrow and fetal bovine adipose tissue. S. aureus trains ATCC 25923 and SAU 1S were used in order to determine their survival in conditioned medium from non-concentrated, concentrated, activated and activated concentrated MSCs by exposure to S. aureus. mRNA levels from antibacterial peptides β-defensin 4A (bBD-4A), NK-lysine 1 (NK1), catelicidin 2 (CATHL2), hepcidin and Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) were quantified by quantitative-PCR (Q-PCR) and bBD-4A by ELISA. The survival percentage of ATCC strain 25923 was not different (P>0.05) when it was treated with non-concentrated conditioned medium of MSCs compared to controls of fibroblasts and DMEM. In contrast, the survival percentage of SAU-1S strain decreased (P<0.05) when it was treated with nonconcentrated conditioned medium of MSCs compared to the DMEM control. Additionally, the concentrated conditioned medium of MSCs induced a decrease (P<0.05) in the survival percentage of the SAU 1S strain in comparison to the conditioned medium control fibroblasts and DMEM. The activated conditioned medium as well as the conditioned and activated conditioned medium of MSCs decreased (P<0.05) survival percentage of the SAU 1S strain with respect to non-activated MSCs control media, fibroblasts and DMEM. Activation induced a 3.5-fold increase (P<0.01) in bBD4A mRNA levels in adipose tissue MSCs and 1.17-fold in bone marrow MSCs. In addition, activation increased (P<0.05) 1.66 and 1.37-fold levels of NK1 mRNA in fibroblasts and adipose tissue MSCs, respectively. Levels of bBD4A also increased (P<0,05) in the conditioned media of MSCs and fibroblasts by concentration effect. Moreover, activation increased levels of bBD4A in conditioned media of MSCs derived from bone marrow. In conclusion, conditioned medium of MSCs possess antibacterial effect against S. aureus in an in vitro culture system. The antibacterial property is increased when conditioned medium is concentrated by filtration and activated by pre-exposition to S. aureus. The antibacterial potential of MSCs may be exerted by expression of antimicrobial peptides bBD4A and NK1.
Financiamiento: Proyecto Fondef ID 15I10129.

El objetivo principal de esta tesis es caracterizar los efectos de las hormonas sexuales sobre la función mitocondrial del tejido adiposo blanco (TAB) y del músculo, y su relación con la síntesis de adiponectina. Nuestros resultados establecen el 17beta-estradiol como estimulador de la funcionalidad mitocondrial y de la síntesis de adiponectina en adipocitos y músculo, mientras que la testosterona actúa como un elemento negativo sobre los mismos procesos en los adipocitos. Asimismo, se ha estudiado el dimorfismo sexual en la modulación de los efectos de la rosiglitazona en el TAB de ratas intolerantes a la glucosa, poniendo de manifiesto que el TAB gonadal de las hembras es más sensible a los efectos de la rosiglitazona que el de los machos. En conjunto, los resultados apoyan la existencia de una conexión entre función mitocondrial y síntesis de adiponectina en TAB y en músculo que estaría modulada por las hormonas sexuales.

La obesidad y la diabetes de tipo 2 se han convertido en las dos grandes epidemias de los países desarrollados y en vías de desarrollo. El conocimiento de las causas y mecanismos que desencadenan la obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 es de vital importancia para su posterior prevención y tratamiento. Tanto la producción de glicerol-3¬fosfato como la obtención de ácidos grasos libres son fundamentales para la síntesis de triglicéridos por el tejido adiposo. Por tanto, alteraciones metabólicas primarias en el tejido adiposo que incrementen la obtención de glicerol-3-fosfato podrían aumentar su capacidad de almacenar lípidos, induciendo el desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. En condiciones fisiológicas, se considera que el adipocito produce glicerol-3-fosfato a partir de la glucosa durante el periodo post-prandial, o a través de la gliceroneogénesis durante el ayuno.
Así, en la primera parte de este estudio, se analizaron los efectos de un incremento en la gliceroneogénesis del tejido adiposo a través de la sobreexpresión de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) en ratones. La sobreexpresión de PEPCK llevaba a un incremento en la reesterificación de ácidos grasos y un mayor depósito de lípidos en tejido adiposo. Aunque estos animales eran obesos hipertróficos, mostraban una sensibilidad a la insulina y tolerancia a la glucosa similar a los controles. Ello probablemente era debido a la ausencia de niveles elevados de FFAs, junto con la ausencia de depósito de grasa en tejidos no adiposos y altos niveles de adiponectina sérica. Posteriormente, los ratones transgénicos aP2-PEPCK se alimentaron con una dieta alta en lípidos durante un breve período. Tras la dieta, estos animales presentaban obesidad mórbida y una severa resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa respecto a los controles. Por tanto, los efectos combinados de la dieta alta en lípidos junto al incremento en la reesterificación de ácidos grasos en tejido adiposo, probablemente saturaban la capacidad de éste de almacenar lípidos. Ello llevaba al depósito de lípidos en hígado y a hipertrigliceridemia. Además, la acumulación de lípidos en tejido adiposo marrón disminuía su capacidad termogénica. Todo ello contribuiría a la obesidad y resistencia a la insulina tan severas que presentaban estos animales transgénicos tras la dieta.
Estos resultados sugieren que la capacidad del tejido adiposo blanco para almacenar lípidos es crucial para el mantenimiento de la sensibilidad a la insulina.
Por otra parte, un incremento en la fosforilación de la glucosa por el tejido adiposo podría llevar a una mayor esterificación de ácidos grasos y depósito de lípidos, a través de un aumento en su obtención de glicerol-3-fosfato. Por ello, en la segunda parte del estudio, se expresó la enzima glucoquinasa (GK) en tejido adiposo de ratones, una enzima reguladora de la utilización de glucosa en hígado. La presencia de GK en tejido adiposo incrementaba su captación basal de glucosa, y mejoraba la tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina en estos animales. A pesar de la mayor captación de glucosa en tejido adiposo blanco, ello no generaba más glicerol-3-fosfato ni alteraba su depósito de lípidos, sino que aumentaba su producción de lactato, incrementando sus niveles circulantes.
Todos estos resultados sugieren que la regulación del aporte de glicerol-3-fosfato contribuye al control de la síntesis de triglicéridos. Además, muestran la implicación directa de la PEPCK en la síntesis de glicerol-3-fosfato y resaltan el papel clave de la gliceroneogénesis en la reesterificación de ácidos grasos y la acumulación de grasa en el tejido adiposo. Sin embargo, el incremento en la captación de glucosa no es suficiente para promover la generación de glicerol-3-fosfato y el depósito de grasa.
Obesity and type 2 diabetes are the two most important health problems in Western societies. The mechanisms underlying the development of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes are not fully understood. Obesity results from an imbalance between energy intake and expenditure, leading to increased energy storage in the form of triglycerides in white adipose tissue (WAT). Adipocytes synthesize triglyceride by esterification of free fatty acids (FFA) with glycerol-3-phosphate and net lipid deposition occurs when esterification is higher than lipolysis. Although glucose is traditionally viewed as the main precursor of the glycerol backbone for triglyceride synthesis, it may also be synthesized from pyruvate or lactate through glyceroneogenesis when glucose supply is limited, as fasting conditions.
A regulatory step of glyceroneogenesis is catalized by phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). Thus, in the first part of this study, increase in glyceroneogenesis was analyzed in transgenic mice overexpressing PEPCK in adipose tissue. PEPCK overexpression led to increased FFA re-esterification, higher adipocyte size, fat mass, body weight and circulating adiponectin and decreased circulating FFA. Moreover, despite obesity, glucose tolerance and whole-body insulin sensitivity were preserved. This suggests that obesity without increased circulating FFA does not lead to insulin resistance or type 2 diabetes. Surprisingly, when fed a high-fat diet for a short period (6 weeks), transgenic mice developed severe obesity and were more hyperinsulinemic, glucose intolerance and insulin resistance than controls. In these animals, high-fat feeding in the presence of increased FFA reesterification leads to triglyceride accumulation in white and brown adipose tissue and to fat storage saturation. This impairs the role of white adipose tissue in buffering the flux of circulating lipids, leading to fat deposition in liver, hypertriglyceridemia and insulin resistance. Furthermore, fat accumulation in brown adipose tissue probably may reduce diet-induced thermogenesis, contributing to severe obesity and insulin resistance. All these results suggest that the regulation of the lipid storage capacity of white adipose tissue is crucial to the maintenance of insulin sensitivity.
On the other hand, alterations in nutrient partitioning and particularly in glucose metabolism may contribute to obesity and type 2 diabetes. In an attempt to increase glucose uptake and triglyceride esterification, transgenic mice were engineered to increase glucose phosphorylation in adipose tissue. To this end, and to avoid the feedback inhibition of hexokinase activity by glucose-6-phosphate, the liver enzyme glucokinase (GK) was expressed under the control of aP2 promoter. Transgenic mice showed high levels of GK expression in white adipose tissue which led to increased adipose tissue basal glucose uptake. Consistent with this, transgenic mice presented increased glucose tolerance and higher whole-body insulin sensitivity than controls. Surprisingly, despite increased glucose uptake, body fat content and glycerol-3 phosphate synthesis were not altered in transgenic mice compared with controls. In vitro as well as in vivo studies using nuclear magnetic resonance showed that adipose tissue from transgenic mice released higher amounts of lactate than that from controls. This suggests that the major product from increased glucose uptake is lactate rather than glycerol-3 phosphate, leading to higher circulating lactate levels within physiological range.
All these results reinforce the idea that glyceroneogenesis and PEPCK may be crucial to regulate triglyceride synthesis in adipose tissue. However, the increased glucose uptake in adipocytes is not sufficient to promote glycerol-3-phosphate synthesis and lipid deposition.

The aim of the present thesis is directed towards the comprehension of the mechanisms involved in the regulation of lipid and carbohydrate metabolism in relevant species in European aquaculture. Special attention has been placed on adipose tissue due to its key role in the control of the overall energy homeostasis and its endocrine functions. Six diets were formulated to determine the feasibility of replacing dietary lipids (from 23 to 17%) by starch (from 12 to 28%) and subsequent replacements in starch by fibre up to levels of 18% in gilthead sea bream. The dietary treatments did not affect fish growth nor feed utilization efficiency and triggered only moderate changes in lipid and carbohydrate metabolism. Gilthead sea bream adipose tissue exhibited an activation of the lipogenic pathway and a transcriptional regulation of relevant transcription factors directed to modulate the preferential use of lipids or carbohydrates according to availability. Despite of a lack of hepatic regulation of gluconeogenesis, an efficient metabolic hepatic adaptation to dietary starch was found through the modulation of enzymes directed to increase glucose metabolization and balance fatty acid uptake and lipolysis. These metabolic adaptations encourage the formulation of diets with a relatively high content of starch or fibre. In addition, the capacity of Atlantic salmon adipocytes to synthesise fatty acids from glucose has been demonstrated for the first time. However, the capacity of the pathway is relatively low, which might be contributing to the previously reported glucose intolerance in salmonids. Atlantic salmon adipocytes mainly transformed glucose to glycerol and Krebs-cycle intermediates. The effect of glucose on the transcriptional regulation of enzymes involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway and glyceroneogenesis, highlights the relevance of carbohydrate metabolism in fish adipocytes as well as the metabolic adaptation of these cells to ensure the availability of necessary factors and other substrates for lipid synthesis and storage. The implication of adiponectin and TNFα in the regulation of glucose uptake in rainbow trout adipocytes has been explored, showing that both adipokines stimulated glucose uptake without modifying AKT or TOR phosphorylation. However, adiponectin failed to stimulate glucose uptake in insulin-treated adipocytes. Insulin regulated the transcription of the adiponectin system enhancing the mRNA levels of the peptide and reducing those of adiponectin receptors, following the mammalian model. However, neither adiponectin nor TNFα mRNA levels were affected by each other, concluding that the reciprocal suppressive effects reported in mammals are not conserved in fish. TNFα supressed PPARγ at a protein level, corroborating its anti-adipogenic role. However, TNFα enhanced glucose uptake in insulin-stimulated adipocytes, suggesting that the interactions between this cytokine and insulin are not so well defined in fish. Finally, the transcriptomic profile along primary culture of rainbow trout preadipocytes has been characterized revealing that adipogenesis is a complex process involving the coordinated activation or repression of genes associated to the different stages of cell development. It presented high similarities to the mammalian model, being characterized by two main phases: proliferation and differentiation. Proliferation phase was enriched with genes involved in cellular remodelling, autophagy and angiogenesis. In addition, the implication of the eicosanoid signalling pathway was highlighted during this phase. Differentiation phase was enriched with genes involved in energy production, lipid and carbohydrate metabolism. During this phase, the activation of the TR/RXR and the PPAR signalling pathways were revealed. The whole process was driven by a coordinated activation of transcription factors and epigenetic modulators. Overall, these studies have contributed to better understand the mechanisms regulating lipid and carbohydrate metabolisms in teleost fish, as well as adipose tissue growth and development. All this information might be applied to modulate and optimize farming practices.

Obesity prevalence has tripled in the last fifty years. For this reason, it is considered the pandemic of the century. It is characterized by the accumulation of metabolic abnormalities triggered by an increase in the size of fat depots in the body. Hence, new therapies to pursue an amelioration of metabolic abnormalities and adipose tissue dysfunction caused by this energy imbalance are being explored. The tissue responsible for the storage of fat is adipose tissue and it was considered just as an energy reservoir until recently. Currently, it is known to be actively involved in energy homeostasis at the same time that it fulfills endocrine functions. Adipose tissue is divided into two main types, white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). While energy storage is the main role of WAT, BAT is able to dissipate energy in the form of heat leading to an increased energy expenditure. Surprisingly, it has been reported that WAT has the ability to recruit cells of the brown phenotype and thus increase its energy expenditure in a process denominated as browning. BAT activity and WAT browning are important components of energy expenditure and therefore potential therapeutic targets for the treatment of obesity and its comorbidities. In this work, we show that GPR120 activation, a membrane receptor for polyunsaturated fatty acids (PUFAs), promotes BAT thermogenic activity and WAT browning. The tissue that reported the highest levels of GPR120 expression is BAT, followed by colon and WAT different deposits. In addition, it was discovered that thermal stress (cold exposure) causes an induction in the expression of GPR120 in adipose depots. Likewise, the activation of GPR120 induces an increase in oxygen consumption. Conversely, mice deficient of GPR120 show decreased temperature and UCP1 expression in neonatal BAT and decreased browning after cold exposure in adult WAT. The administration of natural or synthetic agonists of GPR120, such as omega-3 PUFAs or GW9508, induced brown and beige adipocyte differentiation as well as their thermogenic activation and glucose oxidation. This activation by n-3 PUFAs was dependent of GPR120 expression. In addition to these findings, it was revealed that the activation of GPR120 induces the expression and release of fibroblast growth factor-21 (FGF21) by BAT and WAT at the same time that it increases plasma FGF21 levels. FGF21 is a hormonal factor able to induce thermogenic activation of BAT and browning of WAT, both associated with an improvement in metabolic conditions. In the absence of GPR120, the levels of FGF21 under cold stress conditions are decreased. Furthermore, n-3 PUFAs and synthetic agonists do not induce the expression and release of FGF21 in animals and cells deficient of GPR120. Regarding the effects on the activation of BAT, browning of WAT and the increase in glucose oxidation by the activation of GPR120, these are all compromised in mice or adipocytes lacking FGF21. Therefore, it is concluded that GPR120 activation induces BAT thermogenic activity and WAT browning through a mechanism that involves the induction of FGF21.
La obesidad es pandemia del siglo XXI y se caracteriza por desencadenar anomalías metabólicas debido al exceso de grasa almacenada en el organismo. Ello urge la exploración de nuevas terapias para su tratamiento. El tejido adiposo (TA) ha pasado de considerarse solo un depósito de energía a ser relacionado con el mantenimiento de la homeostasis energética. Se divide en dos tipos, tejido adiposo blanco (TAB) y tejido adiposo marrón (TAM). El primero sirve como almacén de energía y el segundo produce calor debido al desacoplamiento de la cadena respiratoria resultando en un gasto energético incrementado. El TAB tiene la capacidad de reclutar células del fenotipo marrón en un proceso denominado pardeamiento. La actividad del TAM y el pardeamiento del TAB son componentes importantes del gasto energético y blancos terapéuticos para el tratamiento de la obesidad. GPR120 es un receptor de membrana para ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) que demostró promover la activación del TAM y el pardeamiento del TAB. El TAM es el tejido que expresa GPR120 principalmente y el estrés térmico causa una inducción en la expresión de GPR120 en los depósitos adiposos. Conjuntamente, la activación de GPR120 induce la actividad termogénica del TAM y pardeamiento del TAB. Inversamente, los ratones deficientes de GPR120 muestran una activación de la termogénesis disminuida tras la exposición al frío. Además, la activación de GPR120 ha mostrado inducir la diferenciación de adipocitos marrón y beige así como su activación termogénica. Dicha activación conlleva a la inducción en la expresión y liberación del factor de crecimiento fibroblástico-21 (FGF21) por el TA así como un aumento en los niveles en sangre. FGF21 es un factor hormonal capaz de inducir la termogénesis en el TA y de mejorar las condiciones metabólicas. Los animales deficientes de GPR120 muestran niveles de FGF21 disminuidos tras la exposición a frío mientras que la falta de FGF21 comprometió la inducción de la termogénesis tras la activación de GPR120 en ratones y adipocitos. Se concluyó que la activación de GPR120 induce la actividad termogénica de la grasa marrón y el pardeamiento de la grasa blanca a través de la inducción de FGF21.

L’obesitat s’ha convertit en les últimes dècades en un greu problema per la salut pública arribant a ser una de les principals causes de morbiditat, incapacitació i mortalitat prematura. Un teixit que pot tenir un paper important en la protecció contra l’obesitat és el teixit adipós marró (TAM). El TAM és un dels principals teixits consumidors d’energia en els mamífers. El TAM, descrit primerament en rosegadors i en nounats ha anat guanyant rellevància la última dècada amb el descobriment de la presència d’aquest i la seva activació front a estímuls de fred en humans adults. Recentment, s’ha descrit un paper secretor del TAM. En resposta a l’activació termogènica el TAM allibera factors que actuen de manera autocrina, paracrina o endocrina reforçant aquesta activació. A aquests factors secretats pel TAM se’ls anomena adipoquines marrons o batoquines. Ara fa aproximadament uns 20 anys sis laboratoris van publicar en poc temps la descripció d’un nou factor secretable de la família del TGFβ, anomenat GDF15. GDF15 és coneguda principalment com una citocina de resposta a estrès. La seva expressió augmenta en resposta tant a situacions d’estrès patològic, com gran varietat de malalties, com en situacions d’estrès fisiològiques com ara durant la gestació. Recentment, s’ha descobert un receptor de GDF15 al cervell, GFRAL. S’ha vist que GDF15 actua a nivell central com a factor anorexigènic. Tot i això, altres estudis postulen que GDF15 té altres accions en teixits perifèrics. En aquesta tesi, s’ha identificat el factor GDF15 com una adipoquina marró o batoquina, alliberada pels adipòcits marrons i beix en resposta a l’activació termogènica d’aquestes cèl·lules. S’ha determinat la via adrenèrgica β3 com la responsable de l’augment de l’expressió i secreció de GDF15 en resposta a l’estímul termogènic, i s’han trobat implicades proteïnes d’aquesta via com la PKA i adipoquines marrons prèviament identificades, com FGF21. A més a més, s’ha observat que el GDF15 produït pels adipòcits té afectes en els macròfags residents dins del teixit, reprimint-ne la inflamació. Aquests resultants suggereixen que la secreció de GDF15 per part dels adipòcits marrons pot ser un mecanisme per regular localment l’activitat pro-inflamatòria dels macròfags associada amb una millora de l’activitat del teixit adipós marró. Paral·lelament, s’han realitzat diferents estudis sobre GDF15 en poblacions humanes. S’ha vist com GDF15 augmenta en patologia mitocondrial en nens i s’han determinat els miotubs com les cèl·lules responsables d’aquest augment. També s’han analitzat els nivells circulants de GDF15 durant el desenvolupament postnatal, observant una possible associació entre aquests nivells i el pes dels nounats en el moment del naixement. Per últim, s’ha avaluat la resposta de GDF15 a un exercici intens; s’ha vist un dràstic augment de GDF15 circulant en atletes no professionals en acabar la marató de Barcelona del 2017, que era totalment revertit dos dies després de la realització de la cursa. En més d’un dels estudis s’ha observat un paral·lelisme entre els nivells de GDF15 i els nivells d’FGF21, tot i això sembla ser que aquestes dues proteïnes que sovint augmenten en paral·lel actuen a través de vies totalment independents. En resum, en aquesta tesi hem estudiat la proteïna GDF15 en situacions molt diverses; patològiques i fisiològiques, sistèmiques i locals i en models humans i de ratolí. GDF15 sembla ser una important proteïna reguladora del metabolisme, amb efectes molt diversos en funció de teixit i condició. Regula la termogènesi localment en el teixit adipós, esta implicada en el desenvolupament post-natal actuant a nivell central i respon a situacions d’estrès tant patològiques (patologia mitocondrial) com fisiològiques (exercici). És necessari, però, seguir investigant per tal d’entendre els mecanismes i la importància biològica de GDF15 en cadascuna d’aquestes situacions.
Brown adipose tissue (BAT) is the main site of energy expenditure in mammals, via adaptive thermogenesis. The thermogenic capacity of BAT occurs through the unique expression of the uncoupling protein UCP1 and high oxidative capacity of brown adipocytes. High BAT activity favors a negative energy balance, protecting against obesity. GDF15 (growth and differentiation factor-15) is a member of the TGFβ superfamily and is secreted by the liver, placenta and other organs. Its biological function is unclear, but it has been proposed as a biomarker of various pathological states, such as inflammatory diseases, cardiovascular disease, or obesity. Recently, several studies reported the presence of a specific receptor for GDF15 in the brain, known as GFRAL, which mediates the anorexigenic response to this molecule. In this thesis we were able to analyze this protein in different mouse and human models and in different physiological and pathological conditions. In mice, cold exposure strongly induced GDF15 expression in BAT, norepinephrine and cAMP induced GDF15 expression and release by cells through protein kinase A-mediated mechanisms and the GDF15 released by brown adipocytes targeted macrophages, and down-regulated the expression of pro-inflammatory genes. These results indicated that GDF15 is a novel brown adipokine released by brown adipocytes in response to thermogenic activation. In humans, children with mitochondrial diseases have increased GDF15 levels compared to healthy controls, proposing GDF15 as a biomarker for these diseases. GDF15, as well as FGF21, mRNA expression and protein secretion, were significantly induced after treatment of myotubes with drugs that block the respiratory chain, indicating that myotubes are the responsible cells for GDF15 production in these conditions. In another study, GDF15 levels appeared significantly high at birth and dropped at age 4 months, particularly in infants born with lower weight, and continued to decline progressively in both subgroups reaching adult concentrations by age 24 months. Finally, we assessed the value of GDF15 and FGF21 as biomarkers in relation to the biological response to strenuous exercise. A marked increase in the mean levels of GDF15 and FGF21 was found immediately after a marathon race. These levels returned to basal values 48h post-race.

L’obesitat és una patologia crònica que en les darreres dècades s’ha incrementat de manera alarmant al món especialment en els països mes desenvolupats. Malgrat que la dieta i l’exercici físic són dos agents primordials en el tractament d’aquesta malaltia, la seva efectivitat en els pacients amb obesitat mòrbida no sembla ser del tot eficient. Actualment i donat que a nivell farmacològic els recursos són molt limitats, la única alternativa eficaç a mig-llarg termini és la cirurgia bariàtrica. El teixit adipós presenta unes funcions reguladores en l’organisme. En la patologia de l’obesitat en la qual aquest teixit pot arribar a suposar més de la meitat del pes corporal del pacient, la seva acció és d’important rellevància. Els processos d’hipertròfia e hiperplàsia del teixit donaran resposta a la necessitat d’emmagatzematge d’energia però aquesta situació mantinguda en el temps esdevindrà una lipotoxicitat en altres teixits degut a la pròpia incapacitat de continuar emmagatzemant aquesta energia en els adipòcits. És a partir d’aquest moment en el que es produirà el desencadenament de la resposta inflamatòria que generarà una sèrie de canvis en la funcionalitat i perfil secretor del teixit. La polarització de macròfags, l’angiogènesi o l’increment en la producció de citoquines inflamatòries com OSM són alguns d’ells. L’OSM pertany a la família de les gp-130 els nivells de la qual es troben incrementats en determinades patologies entre les quals es troba l’obesitat i s’ha observat recentment que els nivells d’expressió d’aquesta proteïna podrien estar correlacionats amb el context de DM2 i/o resistència a la insulina, unes de les principals comorbiditats associades a la malaltia. El teixit adipós marró redescobert fa alguns anys en humans adults, ha permès generar noves hipòtesis sobre l’increment de la epidèmia actual d’obesitat. La funció basal del teixit adipós marró és l’activació de la termogènesi basal i per tant de la despesa calòrica basal com a resposta principalment d’estímul del fred. En condicions d’obesitat s’ha vist que aquesta funcionalitat del teixit es troba disminuïda o pràcticament inhibida així com el seu perfil secretor. Entre els potencials mecanismes de la millora de l’estat metabòlic experimentat pels pacients amb obesitat sotmesos a una cirurgia bariàtrica, podria trobar-se la modulació de la citoquina inflamatòria OSM. El bloqueig específic d’aquesta citoquina podria doncs, millorar l’estat inflamatori del teixit adipós blanc i marró i, contribuir alhora, a la millora de la resistència a la insulina que pot ser desenvolupada en condicions d’obesitat. Per últim, s’hipotetitza que la termografia infraroja podria ser un mètode per a l’avaluació de la activitat termogènica del teixit adipós marró en pacients amb obesitat, contribuint al pronòstic de la cirurgia bariàtrica i proporcionant informació addicional a la priorització de pacients candidats a la mateixa.

La obesidad y la diabetis tipo 2 (DT2) se consideran las dos grandes epidemias del siglo XXI. A pesar del grave problema de salud, económico y social que representan, actualmente no existen terapias completamente efectivas. Asimismo, los tratamientos farmacológicos que se utilizan, frecuentemente presentan importantes efectos secundarios, por lo que es necesario encontrar nuevas aproximaciones terapéuticas para combatir estas epidemias. Recientemente se ha descrito el factor de crecimiento fibroblástico (FGF21) como un prometedor agente terapéutico tanto para la obesidad como la DT2. FGF21 ejerce su función endocrina en múltiples tejidos diana, regulando la homeostasis energética. Multitud de aproximaciones terapéuticas se han centrado en el desarrollo de péptidos análogos o miméticos que mejoren sus propiedades farmacocinéticas. No obstante, la introducción de modificaciones en la molécula nativa no sólo puede inducir reacción inmunitaria, sino que tampoco evitan su administración periódica. La terapia génica presenta una gran ventaja respecto a estas estrategias terapéuticas, ya que permiten alcanzar niveles circulantes elevados y constantes de la proteína nativa mediante una única administración. Por ello, en esta tesis doctoral se utilizaron vectores virales adenoasociados (AAV) con la finalidad de transducir el músculo esquelético o el tejido adiposo, a fin de mediar elevados niveles circulantes de FGF21 para contrarrestar la obesidad y la DT2. La administración local de vectores AAV de serotipo 9 codificantes para FGF21 (AAV9-FGF21) en el tejido adiposo epididimal incrementó los niveles circulantes de FGF21 y previno la obesidad y la resistencia a la insulina inducidas por una dieta alta en lípidos en ratones. Asimismo, la administración local de vectores AAV8-FGF21 en el tejido adiposo también fue capaz de revertir la obesidad y la resistencia a la insulina en ratones ob/ob. Los animales tratados con vectores AAV-FGF21 mostraron un incremento del gasto energético y una reducción del depósito de lípidos en el tejido adiposo y en el hígado, así como menor inflamación en los mismos. La administración local de vectores AAV1-FGF21 en el músculo esquelético de ratones obesos y resistentes a la insulina medió resultados similares a los obtenidos mediante la administración de los vectores AAV8 y AAV9-FGF21 en el tejido adiposo. Además, la sobreexpresión de FGF21 en el músculo esquelético y, el consiguiente aumento de los niveles circulantes de FGF21, previnieron el desarrollo de hepatocarcinomas inducidos por el consumo crónico de una dieta alta en lípidos. Además, la administración de vectores AAV1-FGF21 en el músculo esquelético medó un envejecimiento más saludable de ratones controles, lo que se evidenció por el mantenimiento del peso corporal, una menor adiposidad y niveles de triglicéridos en hígado disminuidos así como una mejora de la resistencia a insulina mediada por la edad. En conclusión, en esta tesis doctoral se ha demostrado que la ingeniería genética del tejido adiposo y del músculo esquelético mediante vectores AAV codificantes para FGF21 permitió prevenir y revertir la obesidad y la DT2 en modelos murinos obesos y de resistencia a la insulina. Además, el tratamiento con AAV-FGF21 en animales controles promovió que estos animales envejecieran de manera más saludable. Estos resultados proporcionan las bases para la traslación clínica de estas aproximaciones de terapia génica para el tratamiento de la DT2, la obesidad y sus comorbilidades asociadas en humanos en el futuro.
Obesity and type 2 diabetes (T2D) are considered the epidemics of the 21st century. Despite the serious health, economic and social problems they represent, no completely effective therapies are available nowadays. Moreover, the current pharmacological treatments display important sides effects. Thus, there is a need to find new therapeutic approaches to combat these epidemics. Fibroblast growth factor 21 (FGF21) is considered a promising therapeutic agent against obesity and T2D. FGF21 exerts its endocrine function on multiple target tissues, regulating energy homeostasis. Many therapeutic approaches have focused on the development of analogue or mimetic peptides with improved pharmacokinetic properties. However, modifications of the native FGF21 can induce an immune reaction and do not avoid periodic administration. Gene therapy has a great advantage over these therapeutic strategies, since it allows reaching high and steady circulating levels of the native protein through a single administration. Therefore, this doctoral thesis used adeno-associated viral vectors (AAV) in order to transduce skeletal muscle or adipose tissue to mediate high circulating levels of FGF21 to counteract obesity and T2D. Local administration of AAV vectors of serotype 9 encoding FGF21 (AAV9-FGF21) in epididymal white adipose tissue increased circulating levels of FGF21 and prevented obesity and insulin resistance induced by a high fat diet (HFD) in mice. Likewise, local administration of AAV8-FGF21 vectors in adipose tissue was also able to reverse obesity and insulin resistance in ob/ob mice. Animals treated with AAV-FGF21 vectors showed increased in energy expenditure and reduction of lipid deposition in adipose tissue and in the liver, as well as lower inflammation in both tissues. Local administration of AAV1-FGF21 vectors in skeletal muscle of obese and insulin-resistant mice mediated similar results to those obtained by administration of AAV8 and AAV9-FGF21 vectors in adipose tissue. In addition, overexpression of FGF21 in skeletal muscle, and the subsequent increase in circulating levels of FGF21, prevented the development of hepatocarcinomas induced by the chronic intake of HFD. Furthermore, the administration of AAV1-FGF21 vectors in skeletal muscle expands healthspan in control mice, what was evidenced by the maintenance of body weight, lower adiposity and triglyceride levels in the liver as well as improved age-realated insulin resistance. In conclusion, the results of this doctoral thesis demonstrated that genetic engineering of adipose tissue and skeletal muscle using AAV vectors coding for FGF21 allowed to prevent and reverse obesity and T2D in murine models of obesity and insulin resistance. In addition, treatment with AAV-FGF21 in control animals improved healthspan. These results provide the basis for the clinical translation of these gene therapy approaches for the treatment of T2D, obesity and their associated comorbidities in humans in the future.

[ES] La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es una complicación metabólica que se asocia frecuentemente a la diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) y a la disfunción del tejido adiposo. La progresión de la EHGNA está mediada, entre otras, por la activación de vías inflamatorias. En este estudio, se exploró el papel de la citoquina proinflamatoria LIGHT(TNFSF14) en el desarrollo de la EHGNA y la DMT2 en ratones. Con este fin, se evaluó la expresión de LIGHT y de sus receptores, el mediador de entrada del virus herpes (HVEM, del inglés herpes virus entry mediator) y el receptor de la linfotoxina β (LTβR), en ratones silvestres (WT) tratados con dieta control (DC) y con dieta alta en grasa y alta en colesterol (DAGAC), que induce hígado graso, durante 16 semanas. Por otro lado, se investigó el papel de LIGHT mediante la pérdida de función en ratones deficientes en Light (Light-/-) y en sus controles WT alimentados con DC o DAGAC durante 16 semanas. Además, se analizó la inactivación génica de Light en ratones parcialmente deficientes en Irs2 (Irs2+/-Light-/-), que es un mediador clave en la señalización de la insulina, y sus controles (Irs2+/-) alimentados con DAGAC durante 16 semanas. Para la caracterización de los ratones tratados con las diferentes dietas y condiciones se analizó la tolerancia a la glucosa, la sensibilidad a insulina, los parámetros determinantes de hígado graso, la inflamación tisular y sistémica y la expresión de genes metabólicos. Los ratones WT alimentados con DAGAC mostraron un incremento en los niveles proteicos de los receptores LTβR y HVEM, junto con un aumento del contenido hepático de triacilgliceroles (TG), de linfocitos T CD3+, de la fibrosis y de marcadores inflamatorios comparado con ratones WT alimentados con DC. Los resultados del análisis de los ratones alimentados con DC mostraron que la deficiencia genética de Light no altera el metabolismo, el hígado graso o la inflamación. Sin embargo, en condiciones de DAGAC, la inactivación de Light, ratones Light-/- e Irs2+/-Light-/-, mejoró la tolerancia a la glucosa. Además, los ratones Light-/- mostraron un aumento de la sensibilidad a insulina. En el análisis hepático se observó una disminución del hígado graso y del contenido de macrófagos F4/80+ en los ratones Light-/- e Irs2+/-Light-/-. Además, los ratones Light-/- mostraron también una reducción de linfocitos T CD3+ hepáticos y de la expresión del factor transcripcional Zbtb16, determinante en los linfocitos NKT. Consistente con el papel potencial del tejido adiposo en la homeostasis hepática, los ratones Light-/- e Irs2+/-Light-/- alimentados con DAGAC exhibieron un aumento de macrófagos antiinflamatorios F4/80+CD206+ y una reducción de macrófagos proinflamatorios F4/80+CD11c+ y de la secreción de las citoquinas proinflamatorias en el tejido adiposo. De manera similar, en el análisis de la inflamación sistémica se observó un aumento de los monocitos antiinflamatorios, una reducción de linfocitos proinflamatorios, y una disminución de los niveles de citoquinas proinflamatorias en los ratones Light-/- e Irs2+/-Light-/- comparado con los ratones WT e Irs2+/. El estudio de la expresión de genes hepáticos en los ratones Light-/- e Irs2+/-Light-/- mostró un patrón de expresión consistente con una mejora en la homeostasis hepática y una reducción en la expresión de genes previamente implicados en la transición esteatosis simple-esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), en la activación de células estrelladas y en el carcinoma hepatocelular (CHC). Estos resultados indican que la deficiencia de Light mejora el metabolismo de carbohidratos, el hígado graso y la inflamación inducidos por una DAGAC. Por lo tanto, la señalización dependiente de LIGHT puede ser una diana terapéutica para restablecer la homeostasis hepática, moderar la EHGNA y aliviar la inflamación en condiciones de DAGAC.
[CAT] La malaltia del fetge gras no alcohòlic (MFGNA) és una complicació metabòlica que s'associa freqüentment a la diabetis mellitus tipus 2 (DMT2) i a la disfunció del teixit adipós. La progressió de l'EHGNA es regeix, entre d'altres, per l'activació de vies inflamatòries. En aquest estudi, es va explorar el paper de la citocina pro inflamatòria LIGHT(TNFSF14) en el desenvolupament de la MFGNA i la DMT2 en ratolins. Amb aquesta finalitat, es va avaluar l'expressió de LIGHT i dels seus receptors, el mediador d'entrada de l'herpes virus (HVEM, del anglès herpes virus entry mediator) i el receptor de la limfotoxina β (LTβR), en ratolins silvestres (WT) tractats amb dieta control (DC) i amb dieta alta en greixos i colesterol (DAGAC), que indueix fetge gras, al llarg de 16 setmanes. D'altra banda, es va investigar el paper de LIGHT mitjançant la pèrdua de funció en ratolins deficients en Light (Light-/-) i els seus controls WT alimentats amb DC o DAGAC al llarg de 16 setmanes. A més a més, es va analitzar la inactivació gènica de Light en ratolins parcialment deficients en lrs2 (lrs2+/-Light-/-), que és un mediador clau en la senyalització de la insulina, i els seus controls (lrs2+/-) alimentats amb DAGAC 16 setmanes. Per caracteritzar els ratolins tractats amb les diferents dietes i condicions es va analitzar la tolerància a la glucosa, la sensibilitat a la insulina, els paràmetres determinats del fetge gras, la inflamació tissular i sistèmica, i l'expressió de gens metabòlics. Els ratolins WT alimentats amb DAGAC van mostrar un increment als nivells proteics dels receptors LTβR i HVEM, junt amb un augment del contingut hepàtic de triacilglicerids (TG), de limfòcits T CD3+, de la fibrosi i de marcadors inflamatoris comparats amb ratolins WT alimentats amb DC. Els resultats de l'anàlisi dels ratolins alimentats amb DC van mostrar que la deficiència genètica de Light no altera el metabolisme, el fetge gras o la inflamació. Tanmateix, en condicions de DAGAC, la inactivació de Light, ratolins Light-/- i Irs2+/-Light-/-, millorà la tolerància a la glucosa. A més a més, els ratolins Light-/- mostraren un augment de la sensibilitat a insulina. A l'anàlisi hepàtic es va observar una disminució del fetge gras i del contingut de macròfags F4/80+ en ratolins Light-/- i Irs2+/-Light-/-, i els ratolins Light-/- van mostrar també una reducció de limfòcits T CD3+ hepàtics i de l'expressió del factor transcripcional Zbtb16, determinant als limfòcits NKT. Consistent amb el paper potencial del teixit adipós en l'homeòstasi hepàtica, els ratolins Light-/- i Irs2+/-Light-/- alimentats amb DAGAC exhibiren un augment de macròfags antiinflamatoris F4/80+CD206+ i una reducció de macròfags pro inflamatoris F4/80+CD11c+ i de la secreció de les citocines pro inflamatòries al teixit adipós. De manera semblant, l'anàlisi de la inflamació sistèmica va mostrar un augment dels monòcits antiinflamatoris, una reducció dels limfòcits pro inflamatoris, i una disminució dels nivells de citocines pro inflamatòries en ratolins Light-/- i Irs2+/-Light-/- en comparació amb els ratolins WT i Irs2+/-. L'estudi de l'expressió de gens hepàtics amb els ratolins Light-/- i Irs2+/-Light-/- va mostrar un patró d'expressió consistent amb una millora en l'homeòstasi hepàtica i una reducció en l'expressió de gens prèviament implicats en la transició esteatosi simple-esteatohepatitis no alcohòlica (EHNA), en l'activació de cèl·lules estrellades i en carcinoma hepatocel·lular (CHC). Aquests resultats indiquen que la deficiència de Light millora el metabolisme de carbohidrats, el fetge gras i la inflamació induïts per la DAGAC. Per tant, la senyalització depenent de LIGHT pot ser una diana terapèutica per restablir l'homeòstasi hepàtica, moderar la MFGNA i mitigar la inflamació en condicions de DAGAC.
[EN] Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is frequently associated with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and adipose tissue dysfunction. Progression of NAFLD is mediated, among others, by activation of inflammatory pathways. In the present study, the role of the proinflammatory cytokine LIGHT(TNFSF14) was explored in NAFLD and T2DM in mice. To this end, the expression of LIGHT and its receptors, herpes virus entry mediator (HVEM) and lymphotoxin β receptor (LTβR), was investigated in wild-type (WT) mice on a regular chow diet (RCD) and on a high-fat high-cholesterol diet (HFHCD) for 16 weeks to induce fatty liver. The role of LIGHT in NAFLD was as well investigated by loss-of-function approaches using Light-deficient (Light−/−) mice and WT controls which were fed either a RCD or HFHCD for 16 weeks. In addition, Light deficiency was also evaluated in mice partial deficient in Irs2, a major insulin effector which lack of function induces insulin resistance. Thus, Irs2+/-Light-/- and control Irs2+/- mice were fed a HFHCD for 16 weeks. To characterize mice, glucose tolerance, insulin sensitivity, non-alcoholic fatty liver (NAFL), systemic and tissue inflammation and metabolic gene expression were explored. HVEM and LTβR expression, hepatic triacyclglycerols (TG) and CD3+ T lymphocytes content, fibrosis and inflammatory markers were markedly increased in HFHCD-fed WT mice compared with RCD-fed WT. Consistent with the above findings, Light deficiency did not affect metabolism, NAFL and tissue and systemic inflammation in RCD-fed WT mice. However, under HFHCD, Light deficiency in WT mice and in Irs2+/- mice improved glucose tolerance. Moreover, Light-/- mice displayed improved insulin sensitivity. Fatty liver and hepatic F4/80+ macrophage content were decreased in both HFHCD-fed Light-/- and Irs2+/-Light-/- mice compared with their respective HFHCD-fed controls. A decrease in hepatic CD3+ T lymphocytes content and in expression levels of Zbtb16, the transcription factor essential for natural killer T (NKT) cell function, in HFHCD-fed Light−/− mice compared to its controls was also observed. Consistent with a potential role of adipose tissue in hepatic homeostasis, Light-/- and Irs2+/-Light-/- mice exhibited augmented anti-inflammatory F4/80+CD206+ adipose tissue macrophages, reduced proinflammatory F4/80+CD11c+ adipose tissue macrophages and diminished secretion of cytokines. Systemic inflammation showed augmented anti-inflammatory monocytes and a decrease in proinflammatory lymphocytes in Light−/− and Irs2+/-Light-/- mice compared to their controls. Analysis of hepatic gene expression in Light−/− and Irs2+/-Light-/- mouse livers showed an alteration in metabolic gene expression pattern consistent with improved hepatic homeostasis and a reduction in the expression of genes involved in NAFL-to-non-alcoholic steatohepatitis (NASH) transition, hepatic stellate cells activation and hepatocellular carcinoma (HCC). These results indicate that Light deficiency improves carbohydrate metabolism and reduces NAFL and inflammation induced by HFHCD. These results suggest that therapies to block LIGHT-dependent signalling might be useful to restore hepatic homeostasis, to restrain NAFLD and to alleviate inflammation in HFHCD conditions.
La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por las siguientes ayudas: Desarrollo preclínico nuevo tratamiento de la ateroesclerosis APOTIP/2018/02. Entidad financiadora: Generalitat Valenciana Conselleria de Investigació, Cultura i Esport. Investigadora principal: Herminia González Navarro. / Papel de los procesos inflamatorios asociados a la diabetes en la estabilidad de la placa de ateroma y estudio del uso potencial de estrategias terapéuticas PI16/00091. Entidad financiadora: Instituto de Salud Carlos III Acción Estratégica en Salud. Investigadora principal: Herminia González Navarro. / Role of the cytokine LIGHT (TNFSF14) in the development of IR and fatty liver Disease NN_2016_3. Entidad financiadora: European foundation for the study of diabetes (EFSD)/Novo Nordisk Programme for Diabetes Research in Europe. Investigadora principal: Herminia González Navarro. / Estudio de los mecanismos moleculares de la Diabetes Mellitus y su papel en el desarrollo de la aterosclerosis PI13/00834. Entidad financiadora: Instituto de Salud Carlos III Acción Estratégica en Salud. Investigadora principal: Herminia González Navarro
Herrero Cervera, A. (2020). Papel de la citoquina LIGHT en la esteatosis hepática y la resistencia a insulina [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137778
TESIS

Obesity prevalence in worldwide population is increasing every day due to an imbalance between the energy intake and the energy expenditure. Rich-caloric food is highly palatable and easily accessible, whereas sedentary lifestyle is the majority. This situation makes difficult to maintain energy homeostasis and leads to obesity development. Nowadays we failure to have a treatment for obesity due to a lack of acknowledge in the molecular mechanisms underlying obesity development. Lately, the activation of brown adipose tissue (BAT) thermogenesis into obese patients have emerged as a promising treatment. BAT thermogenesis is controlled from the central nervous system (CNS) upon peripheral signals that are integrated in different nuclei of the hypothalamus. The hypothalamus is the region sensing energy surplus (fats or carbohydrates intake) and consequently sending the information through the sympathetic nervous system (SNS) to activate BAT thermogenesis. Within the hypothalamic nuclei, I would like to highlight the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH) as an important regulator of BAT thermogenesis (Contreras C, 2017). However, the exact mechanism by which VMH is sensing the peripheral energy intake and controlling BAT activation is not known. Here, we hypothesized that the brain isoform of the carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1s), the CPT1C, could be a crucial factor in the VMH controlling BAT thermogenesis. CPT1C awaked our interest since it was discovered in 2002 by Dr. Zammit group. CPT1C is an intriguing protein since have no catalytic activity and is mainly localized in neurons. Several studies have demonstrate that CPT1C is involved in the regulation of obesity. CPT1C-Knock out (KO) animals are more susceptible to diet-induced obesity (DIO) (Wolfgang MJ, 2006 and 2008) and have altered peripheral glucose and lipid metabolism (Gao XF, 2009). It has been suggested that CPT1C in the hypothalamus is sensing energy deficiency or surplus and consequently it regulates body weight and peripheral metabolism (Wolfgang MJ, 2006 and 2008). However, the molecular mechanism underlying CPT1C control of obesity in not known. Furthermore, CPT1C binds malonyl-CoA (Price NT, 2002). Malonyl-CoA is the physiological inhibitor of other CPT1s isoforms (CPT1A and CPT1B) and fluctuates within the hypothalamus depending on the energy disposition (Tokutake Y, 2010). In a situation of fasting, malonyl-CoA levels decreases whereas in a refeeding or HFD situation it increases in the hypothalamus (Tokutake Y, 2010). In fact, malonyl-CoA have been observed to be a crucial regulator of food intake and energy homeostasis in the hypothalamus (Wolfgang MJ and Lane MD, 2006 and 2011). We hypothesized that CPT1C acts as a malonyl-CoA sensor to proportionate information about the energy status to the cell (Casals N, 2016). Our results demonstrated that CPT1C-KO mice presented an attenuated BAT thermogenesis after 7 days of high-fat diet (HFD) feeding or leptin administration. Restoration of CPT1C expression in the VMH was sufficient to properly activate BAT thermogenesis. Moreover, malonyl-CoA sensing through CPT1C in the VMH was necessary for BAT activation. Malonyl-CoA levels are under the control of AMPK signalling and a correct AMPK signalling in the hypothalamus is necessary for sympathetic activation of BAT thermogenesis (Contreras C, 2017). We demonstrate that CPT1C is a downstream factor in the AMPK mediation of BAT thermogenesis in the VMH. Overall, we have demonstrated that CPT1C is necessary for BAT thermogenesis activation from the VMH after 7 days of HFD intake or acute leptin administration, probably acting downstream the AMPK(VMH)-ACC-Malonyl-CoA axis. The fact that CPT1C is not catalytically active made us hypothesised that exerts its functions by interacting with other proteins. Moreover, the ability of CPT1C to sense malonyl-CoA would proportionate a checkpoint to other proteins depending on the energetic status of the cell. In the glutamate receptors complex (AMPAR) (Brechet A, 2017), CPT1C interacts with ABHD6, an hydrolase of the main endocannabinoid (eCB), the 2-arachydonoyl glycerol (2-AG). This finding was of our interest since the endocannabinoid system (ECS) is involved in the regulation of energy homeostasis from the hypothalamus and is dysregulated in obesity (Ruiz de Azua and Lutz, 2019). Increased eCBs tone in the hypothalamus generally leads to an increase of body weight and to a decrease in energy expenditure. Since the molecular mechanism by which CPT1C controls BAT thermogenesis in the VMH is not known we hypothesized that CPT1C could regulate BAT thermogenesis activation through modifying the eCBs levels in the hypothalamus interacting with ABHD6. For this reason, we studied 2-AG and anandamide (AEA) levels in the hypothalamus of wild-type (WT) and CPT1C-KO mice fed a SD or HFD. We found that CPT1C-KO mice have increased both eCB in the hypothalamus in normal fed conditions compared to WT mice. After 7 days of HFD feeding eCB levels of WT and CPT1C-KO mice were increased compared to their respective SD fed animals. The eCBs phenotype of CPT1C-KO mice leads us to question whether the increase in hypothalamic eCBs levels was the cause of diminished BAT thermogenesis in CPT1C-KO mice and whether CPT1C was able to regulate the eCBs levels through ABHD6. However, the hypothalamic dynamic of eCBs in DIO model and the relation with BAT thermogenesis activation in early stages of obesity (short-term HFD) have been poorly studied, thus we were not able to interpret our results correctly. In addition, we realised that all the studies about hypothalamic eCBs in obesity were done in male but not in female rodents, so we decided to address this topic. At this point, we concurrently studied i) the eCBs dynamics in the hypothalamus during obesity development in the DIO model and whether they correlate with BAT thermogenesis and present sex dimorphism, and ii) whether CPT1C interacts and regulates ABHD6 activity depending on malonyl-CoA sensing. Firstly, concerning hypothalamic eCBs during DIO development, we observed that hypothalamic eCBs substantially increased after 7 days of HFD feeding and progressively decrease to basal levels until 90 days of feeding in both male and female mice. This increase of eCBs at 7 days was accompanied by a higher expression of eCBs synthesis enzymes whereas the expression of the degrading enzymes was not altered. The hypothalamic eCBs profile negatively correlated with body weight gain whereas positively correlated with BAT thermogenesis activation. It was at 7 days of HFD administration when both eCBs levels and BAT thermogenesis activation were the highest. At this time point, mice did not present an obese phenotype so we suggest that the transitory increase of hypothalamic eCBs and BAT thermogenesis counteracts obesity development. To further elucidate the crosstalk between hypothalamic eCB and BAT thermogenesis we acutely activated BAT thermogenesis by central leptin and peripheral β3-adenoreceptors agonist administration and both leaded to an increase of eCB levels in the hypothalamus. In contrast, acute central administration of 2-AG and AEA did not altered BAT thermogenesis. It is generally accepted that the ECS tone increases in the hypothalamus when obesity is stablished and this activates CB1R that inhibits SNS tone leading to a decrease in BAT thermogenesis (Quarta C, 2011). Here for the first time, we describe the opposite process, activation of BAT thermogenesis signals the hypothalamic ECS, overall being important in early stages of obesity. Secondly, regarding the study of CPT1C and ABHD6, we confirmed that CPT1C and ABHD6 were interacting by using two different approaches, the FRET assay and co-immunoprecipitation in HEK-293T obtaining the same results. Besides, this interaction was independent of CPT1C malonyl-CoA sensing. Next, we wondered whether CPT1C could modulate ABHD6 activity thus, we developed a new ABHD6 activity assay based on the 4-MUH fluorogenic substrate. We demonstrated that CPT1C acts as a negative regulator of ABHD6 activity and this phenomenon is dependent on CPT1C malonyl-CoA sensing. When CPT1C is sensing malonyl-CoA, ABHD6 activity decreases, whereas when CPT1C is unable to detect malonyl-CoA levels, ABHD6 activity is restored. These results suggest that CPT1C could act as a metabolic sensor and consequently regulate ABHD6 activity. Moreover, we studied whether CPT1C could modify the cannabinoid receptor 1 (CB1R) intracellular response (measuring the cAMP) via modulating 2-AG degradation by ABHD6. The results indicated that CPT1C is able to modulate 2-AG levels and the intracellular signalling through ABHD6. Finally, we consider whether CPT1C negative regulation of ABHD6 activity was the cause of dysregulated hypothalamic eCBs levels in CPT1C-KO mice and consequently impaired BAT thermogenesis. Moreover, both proteins have been described to play a role in metabolic flexibility in the VMH nuclei of the hypothalamus since disruption of both proteins in this nucleus diminished EE and enhanced DIO (Rodríguez-Rodríguez R, 2019 and Fisette A, 2016). However, our results evidenced that hypothalamic homogenates of WT animals presented less ABHD6 activity compared to CPT1C-KO homogenates, then a decrease in 2-AG hypothalamic levels were expected in CPT1C-KO mice. In contrast, CPT1C-KO mice have both 2-AG and AEA levels increased in the hypothalamus indicating that ABHD6 is not the cause of this eCBs dysregulation. Therefore, after all these results two question remains opened: i) Why CPt1C-KO mice have increased hypothalamic endocannabinoids levels? ii) Which function of ABHD6 is CPT1C regulating? These are two questions that we will try to answer in the near future. Altogether, this thesis has defined for the first time a link between CPT1C and the ECS. Both systems at the hypothalamus are crucial regulators of BAT thermogenesis and DIO. We have demonstrated that CPT1C in the VMH is a key sensor of energy status necessary for the regulation of BAT thermogenesis and body weight gain. On the other hand, we have described a crosstalk between BAT thermogenesis and endocannabinoids in the hypothalamus at early stages of DIO in male and female mice. Finally, we have characterized CPT1C as the first ABHD6 physiological inhibitor. Overall, our results have contributed to a better understanding of CPT1C functions and the molecular mechanisms underlying energy homeostasis.

Tesis de Doctorado en Ciecnias Químicas titulada: COMPARACIÓN DE NIVELES CIRCULANTES DE OMENTINA-1, DE SU EXPRESIÓN EN TEJIDO ADIPOSO VISCERAL Y DE SU RELACIÓN CON EL PROCESO INFLAMATORIO EN MUJERES EMBARAZADAS CON Y SIN DIABETES GESTACIONAL
Objetivo: Evaluar la asociación de omentina-1 con factores inflamatorios en suero y tejido adiposo visceral (TAV) de mujeres con diabetes mellitus gestacional (DMG) comparadas con mujeres con tolerancia normal a la glucosa (TNG). Además, examinar su correlación con características clínicas maternas. Métodos: Estudio transversal comparativo con 116 mujeres con DMG y 115 mujeres con TNG muestreadas en el momento de la cesárea. Se determinaron las concentraciones séricas de omentina-1, de las citocinas proinflamatorias IL-1β, IL-6, TNF-α y de las antiinflamatorias IL-1RA e IL-10. Además, se midieron los niveles de mRNA de estas moléculas en TAV, junto con los factores inflamatorios involucrados en la vía NF-κB (TLR2, TLR4, NF-κB, IKKB). Resultados: Las concentraciones séricas de omentina-1 fueron menores, mientras que las de IL-1β, IL-1RA e IL-10 (p=0.005, p=0.007 y p=0.015, respectivamente) fueron mayores en mujeres con DMG comparadas con el grupo TNG. En todas las mujeres, las concentraciones de omentina-1 correlacionaron negativamente con el índice de masa corporal (IMC) previo y al final del embarazo, y con el HOMA-IR, pero, no correlacionaron con las concentraciones de las citocinas. Los niveles de mRNA de TLR2, TLR4, IL-1β, IL- 1RA, IL-6 e IL-10 en TAV fueron menores en DMG en comparación con TNG (p<0.05 para todos). En el análisis multivariante, el IMC al final del embarazo correlacionó significativamente con las concentraciones de omentina-1 en todas las mujeres (p<0.05). Además, los niveles de mRNA de omentina-1 correlacionaron con los niveles de expresión de los marcadores inflamatorios en todas las mujeres (p<0.05). Conclusión: Las concentraciones séricas y los niveles de expresión de omentina-1 no están relacionadas directamente a la DMG; no obstante, las mujeres con DMG tienen un estado inflamatorio alterado en TAV. Además, no se observó una asociación sistémica entre omentina-1 y factores inflamatorios, pero si una asociación entre sus niveles de expresión génica en todas las mujeres, indicando que la expresión de estas adipocinas se relaciona independientemente de la DMG.

Overweight and obesity have increased dramatically during recent decades becoming a major health problem for which therapeutic options are limited. Thus, there is an urgent need to develop new safe pharmacological therapies. Obesity results from the positive imbalance resulting from the increase of energy intake and/or decrease in energy expenditure, the latter consequence of impaired processes involved in basal metabolism, adaptive thermogenesis or associated with sedentary behaviour. The excess of energy is preferentially stored in white adipose tissue (WAT) within unilocular adipocytes. Another type of adipose tissue, the brown adipose tissue (BAT), is in charge of utilizing nutrients to produce heat in an attempt to maintain body temperature through non-shivering adaptive thermogenesis. Brown adipocytes are multilocular with many lipid droplets and mitochondria that express uncoupling protein-1 (UCP1), the final effector of heat dissipation. Upon adrenergic stimulation induced either by cold or by diet, the rise in intracellular cyclic AMP levels (cAMP) results in UCP1 activation increasing lipid oxidation uncoupled from ATP production. Functional BAT depots have recently been detected in lean adult humans that can be activated by cold exposure. Of relevance, human BAT activity correlates with lower body mass index and improved glycemia, indicating that strategies that could increase BAT mass and/or its activation could become promising targets to combat obesity and its metabolic complications. Tumour protein p53-inducible nuclear protein 2 (TP53INP2) promotes autophagy and stimulates a variety of nuclear hormone receptors, such as ecdysone receptors in flies, and thyroid hormone receptors, glucocorticoid receptors and PPAR receptors in mammalian cells. TP53INP2 is also a negative regulator of white adipogenesis through activation of TCF transcription factors. The transcription factor PPARγ plays a key role in the regulation of BAT thermogenesis, as well as in brown adipogenesis. However, the factors that modulate PPARγ activity in brown adipocytes are largely unknown. Here we document that the bifunctional protein TP53INP2 is a major regulator of BAT function and that its action is mediated by the regulation of PPARγ activity. TP53INP2 was upregulated under conditions of stimulated BAT thermogenesis, such as under low temperature or a high-fat diet. TP53INP2 deficiency reduced brown adipogenesis in cultured cells, and in vivo TP53INP2 ablation in Myf5+ precursor cells caused the dysregulation of BAT gene expression and enhanced lipid droplet accumulation in brown adipocytes. As a result, TP53INP2 depletion decreased BAT-specific thermogenic capacity, leading to positive energy balance and obesity. Furthermore, TP53INP2 loss-of-function in adult mice revealed that the protein is required for the maintenance of the differentiation state of brown adipocytes. Microarray gene expression profiling showed that the lack of TP53INP2 in BAT is linked to a reduced PPAR signalling pathway. In keeping with this, PPARγ activity was markedly decreased in TP53INP2 knockout brown preadipocytes. Under conditions of TP53INP2 deficiency, PPARγ proteasomal degradation was also impaired and this transcription factor showed a lower ubiquitination. Moreover, chronic exposure to the ligand rosiglitazone rescued brown adipogenesis. In all, we have identified a novel regulator of PPARγ activity and BAT metabolism. The expression of this regulator in BAT is induced under conditions of active thermogenesis, and its repression leads to energy imbalance, reduced thermogenesis and obesity.
TP53INP2 és una proteïna que promou autofàgia i estimula l’activitat de diferents receptors nuclears d’hormones, com ara el receptor d’ecdisona, el receptor d’hormona tiroïdal i els receptors de PPAR. També s’ha descrit que TP53INP2 és un regulador negatiu de l’adipogènesi del teixit adipós blanc per mitjà de ‘activació dels factors de transcripció TCF. Aquesta tesi doctoral s’ha centrat en l’estudi de la regulació de TP53INP2 en el teixit adipós marró i en la caracterització de la funció de TP53INP2 en el metabolisme d’aquest teixit. L’expressió de TP53INP2 en teixit adipós marró es veu augmentada en condicions de termogènesi activa, com ho són l’exposició a baixes temperatures o una alimentació rica en greixos. Per el contrari, la inhibició fisiològica de la termogènesi per exposició a un ambient termoneutral està acompanyada de la reducció de l’expressió de TP53INP2. Aquests resultats van suggerir que TP53INP2 podia ser necessari per a la regulació termogènica del teixit adipós marró. La pèrdua de funció de TP53INP2 en preadipòcits marrons va resultar en una disminució en la seva capacitat adipogènica. De la mateixa manera, l’ablació genètica de TP53INP2 en teixit adipós marró va donar lloc a una desregulació de l’expressió de gens adipogènics i termogènics, i a una reducció de la capacitat termogènica, la qual cosa va conduir a un balanç energètic positiu i obesitat. Estudis més detallats van mostrar que TP53INP2 és un regulador positiu de l’activitat PPARγ en el context de la cèl·lula adiposa marró, per mitjà de la modulació de la seva ubiqüitinació i conseqüent activitat. En resum, els resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral demostren que TP53INP2 indueix l’adipogènesi i la termogènesi del teixit adipós marró per mitjà de l’activació de la via de senyalització de PPARγ D’aquesta manera, TP53INP2 indueix la despesa energètica i prevé el desenvolupament d’obesitat.

with the indiscriminate consumption of non-nutritive sweeteners (NNS) an increase of adipose tissue has been observed, even though these products do not directly participate in the generation of metabolic energy. Until now the physiological mechanism by which this phenomenon occurs is unknown. Objective: to compare the effect of the supplementation of natural and artificial sweeteners on the histomorphological profile and body distribution of body adipose tissue in BALB/c mice. Material and methods: experimental, prospective and comparative study. Of 40 male BALB/c mice, five study groups were formed: 1) water control, 2) sucrose, 3) sucralose, 4) stevia, 5) aspartame, which were treated with sweeteners. After 6 weeks, plasma glucose, lipid profile, irisin concentration and body composition were determined by bioimpedance. Adipose tissue was determined inguinal, gonadal and mesenteric fat mass, number of cells/histological section area and relative cell volume. Results: at the end of the study it was found that the experimental groups: sucrose, aspartame, stevia and sucralose consumed more food; and a weight gain at the end of the treatment (p <0.03). The sucrose group consumed considerably more food without metabolic changes except in the weight gain without any other major change. However, there was an increase in gonadal fat in the stevia group (p <0.0001); inguinal in the sucralose and mesenteric group in the stevia and sucralose groups, as well as a decrease in plasma irisin concentrations in the sucralose group. Discussion and conclusions: compared to the control group, the groups under treatment with NNS and sucrose showed higher glycemic figures. The data suggest that non-caloric sweeteners are not inert to metabolism and to the increase of adipose tissue.
Con el consumo indiscriminado de edulcorantes no calóricos (ENC) se ha observado un incremento de tejido adiposo, a pesar de que estos productos no participan directamente en la generación de energía metabólica. Hasta ahora se desconoce el mecanismo fisiológico por el cual ocurre este fenómeno. Objetivo: Comparar el efecto de la suplementación de edulcorantes naturales y artificiales sobre el perfil histomorfológico y distribución corporal del tejido de adiposo corporal en ratones BALB/c. Material y métodos: Estudio experimental, prospectivo y comparativo. De 40 ratones BALB/c machos se formaron cinco grupos de estudio 1) control agua, 2) sacarosa, 3) sucralosa, 4) estevia, 5) aspartame) que recibieron tratamiento con edulcorantes. Posterior a 6 semanas se determinaron glucosa en plasma, perfil de lípidos, concentración de irisina y composición corporal por bioimpedancia. Del tejido adiposo se determinaron masa grasa inguinal, gonadal y mesentérica, número de células/área de corte histológico y volumen celular relativo. Resultados: Al final del estudio se encontró que los grupos experimentales: sacarosa, aspartame, estevia y sucralosa consumieron más alimento; y una ganancia de peso al termino del tratamiento (p<0.03). El grupo sacarosa consumió considerablemente más alimento sin cambios metabólicos excepto en el aumento de peso sin ningún otro cambio importante. Sin embargo hubo aumento de grasa gonadal en grupo estevia (p<0.0001); inguinal en el grupo de sucralosa y mesentérica en los grupos de estevia y sucralosa, asi como una disminución en las concentraciones plasmáticas de irisina en el grupo con sucralosa. Discusión y conclusiones: En comparación con el grupo control, los grupos bajo tratamiento con ECN y sacarosa mostrarón cifras mayores de glucemia. Los datos sugieren que los edulcorantes no calóricos no son inertes al metabolismo y al aumento del tejido adiposo.

El teixit adipós ha passat d’ésser considerat un mer reservori d’energia a un òrgan complex, implicat de forma activa en l’homeòstasi energètica i amb funcions endocrines de rellevància. Les malalties en què hi està involucrat per excés (obesitat) o manca (lipodistròfies) provoquen, coherentment, alteracions metabòliques greus que suposen un risc per a la salut. A nivell de balanç energètic, dos tipus de teixit adipós disposen de funcions diametralment oposades dins l’organisme: El teixit adipós blanc (TAB) té com a objectiu emmagatzemar reserves lipídiques en condicions d’excés de nutrients i mobilitzar-les per a garantir el funcionament dels diversos òrgans, mentre que el teixit adipós marró (TAM) pot dissipar energia en forma de calor per tal de regular la temperatura corporal. Tot i que se n’hi creia absent, el recent descobriment de la presència de TAM i de la capacitat d’inducció del mateix (“browning”) en individus humans adults ha despertat un creixent interès en aquest teixit, donada la potencial aplicació del seu reclutament com a teràpia contra l’obesitat. Les cèl·lules majoritàries del teixit adipós i que realitzen les seves funcions principals són els adipòcits, blancs en el cas del TAB o marrons clàssics i beix/brite en el del TAM. No obstant, aquests estan en estreta comunicació amb altres tipus cel·lulars, especialment amb les cèl·lules del sistema immunitari, les quals produeixen diversos factors bioactius. La producció de mediadors inflamatoris en situacions patològiques i d’estrès altera la biologia dels adipòcits i la secreció de llurs hormones (adipocines), afectant l’organisme a nivell global, mentre que en condicions de salut mediadors antiinflamatoris milloren la funció adipocitària. A la present tesi doctoral s’analitzà el patró d’expressió gènica als fenòmens de lipomatosi associats a una lipodistròfia d’origen genètic (FPLD2) i a l’associada a la infecció pel virus de la immunodeficiència humana i a la teràpia antiretroviral d’alta activitat (HALS). També s’identifiquen noves proteïnes secretables produïdes preferentment pel TAM respecte al TAB a partir d’aproximacions in silico amb la seva posterior validació funcional in vitro i in vivo. Els lipomes són insults patofisiològics ocasionals en les lipodistròfies, però estan menys caracteritzats que d’altres de concomitants. En general, presentaren alteracions heterogènies, especialment a nivell de cicle cel·lular i senescència, tant en el cas de l’FPLD2 com en la HALS. En aquesta darrera, la comparació entre els lipomes pertanyents a ubicacions anatòmiques diverses i a la zona dorsocervical va permetre detectar diferències entre tots dos tipus d’insults quant a l’existència d’un fenotip de TAM clàssic aberrant, ZIC1+, als segons, tot posant de manifest la complexitat de les alteracions en la biologia del teixit adipós en aquestes malalties. Emprant aproximacions bioinformàtiques s’identificaren diverses proteïnes secretades sobreexpressades al TAM, de les quals es procedí a la caracterització d’una en concret. CXCL14 és una quimiocina pleiotròpica amb funcions metabòliques descrites a nivell de TAB, si bé el seu paper al TAM era, fins el moment, desconegut. Com es demostrà, CXCL14 és produïda pels adipòcits marrons i la seva expressió i secreció són induïdes per estímuls simpàtics. Els animals deficients per a aquest gen mostraven alteracions en transcrits de termogènesi, de metabolisme lipídic i d’infiltració immunitària, les quals es traduïen en una disminució de la funció termogènica del TAM. Anàlisis de quimiotaxi i d’expressió gènica revelaren que la CXCL14 produïda pels adipòcits marrons realitza accions de tipus paracrí, actuant sobre macròfags activats alternativament. D’altra banda, l’administració continuada de CXCL14 exògena activà el browning als dipòsits de TAB, quelcom que suggereix accions també endocrines. En conjunt, aquests resultats destaquen el paper de l’adipocina marró CXCL14 en les interaccions teixit adipós-sistema immunitari i en la comunicació intra i intertissular que requereix la coordinació de tota maquinària termogènica.
Adipose tissue was hitherto considered just an energy storage site, but it is currently widely recognized as a dynamic homeostatic organ with relevant endocrine properties. The main function of white adipose tissue (WAT) is to store and release lipids on demand, whereas brown adipose tissue (BAT) dissipates energy as heat. The discovery of thermally-inducible BAT in human adult subjects has revamped research on it since this ability could be harnessed to improve obesity. Adipocytes, white in BAT and classic brown or beige/brite in BAT, are the main functional actors in adipose tissue, but a close cross-talk with other cell types, especially those of the immune system, is present. Accordingly, stress and production of inflammatory cytokines in pathological conditions alters the biology of adipocytes and the secretion of adipose-derived hormones (adipokines), while in healthy adipose tissue immune cell-derived anti-inflammatory cytokines improve adipose functions. The current doctoral thesis aims to assess alterations in the transcriptional signature of lipomas in lipodystrophies and to identify novel secretable proteins preferentially produced by BAT. Lipomas are a recurring symptom in lipodystrophies, but they have been poorly characterized to date. In general, lipomas exhibited heterogenic alterations in respect to healthy and lipoatrophic adipose tissue, mostly related to cell cycle control. In the case of HIV-1- and HAART-associated lipodystrophy, a differential expression pattern between dorso-cervical lipomas and those arising at different anatomical sites revealed the existence of a brown-like molecular signature in the former. Several proteins were identified in silico as potential brown adipokines. Among them, chemokine CXCL14 was considered to be a promising candidate, since validation studies revealed differential expression between WAT and BAT, transcriptional induction in the presence of thermogenic stimuli and release by brown adipocytes. Brown adipocyte-derived CXCL14 was able to blunt proinflammatory, classical macrophage activation and to recruit alternatively activated macrophages, which are known to be involved in BAT activation. Coherently, continuous external administration of CXCL14 increased browning and alternatively activated macrophage abundance of WAT depots, whereas CXCL14 knock-out mice exhibited compromised expression of transcripts related to BAT function and immune infiltration. These results indicate an instrumental role for CXCL14 in coordinating adaptive thermogenesis.