Dissertations / Theses on the topic 'TMEM16B'

Notre système immunitaire assure la protection et régule l'homéostasie de l'organisme. Pour cela, il se compose d'une réponse immune innée et d'une réponse adaptative. Notre équipe a identifié TMEM176A et TMEM176B, deux protéines transmembranaires de structure et de fonction identiques. Ces protéines sont des canaux ioniques intracellulaires qui ont la particularité d'être fortement exprimés à la fois dans les cellules RORyt+ et dans les cellules dendritiques. La génération d'une souris déficiente pour ces deux gènes nous a permis d'étudier leur rôle. Nous avons mis en évidence que l'absence de Tmem176a et b n'impacte pas la génération des cellules RORyt+, ni leur capacité à sécréter des cytokines. L'étude de deux modèles de colite nous a permis de confirmer que Tmem176a et b ne semblent pas avoir un rôle majeur dans ces cellules. A l'inverse l'étude épigénétique des cellules dendritiques déficientes a mis en évidence une dérégulation de la voie de présentation du CMH de classe If. Nous avons mis en évidence une diminution de leur prolifération des lymphocytes T CD4*. En utilisant une technique de microscopie innovante, nous avons observé une localisation préférentielle de TMEM176A et B dans la voie endolysosomale et notamment dans le compartiment MIIC impliqué dans la présentation des antigènes par la voie du CMH de classe 11. Ainsi ces résultats suggèrent que dans les cellules dendritiques, Tmem176a et b participent à la présentation des antigènes et à l'activation des lymphocytes T CD4* naïfs<br>Our immune system provides protection and regulates the homeostasis of the organism. For this, it consists of an innate immune response and an adaptive response. Our team has identified TMEM176A and TMEM176B. These proteins are intracellular ion channels that are particularly expressed both in RORyt+ cells and in dendritic cells. The generation of a deficient mouse for these two genes allowed us to study their role. We have demonstrated that the absence of Tmem 176a and b does not affect the generation of RORyt+ cells, neither their ability to secrete cytokines. The study of two models of colitis allowed us to confirm that Tmem176a and b seem to be dispensable in these cells. However, the epigenetic study of deficient dendritic cells put in evidence a deregulation of the MHC class li presentation pathway. We have detected a decrease of the proliferation of CD4+ T. Using an innovative microscopy technique, we have observed a preferential localization of TMEM176A and B in the endo-lysosomal pathway and in particular in the MIIC compartment involved in the presentation of antigens by the MHC class li pathway. Thus, these results suggest that in dendritic cells, Tmem 176a and b are involved in the presentation of antigens and activation of naïve CD4* T cells

TMEM16A/Anoctamin1 is a novel calcium-­‐activated chloride channel involved in neuronal and cardiac excitation, vascular tone, pain perception and olfactory and sensory signal transduction and GI tract motility. It is also associated to diverse type of cancer including breast cancer malignancy. Alternative splicing (AS) of exons 6b, 13 and 15 generates functionally distinct TMEM16A isoforms with different electrophysiological properties. To study their splicing regulation, I performed in minigene system a systematic analysis of exonic and intronic regulatory elements followed by co-­‐transfection of a panel of splicing regulatory factors. Analysis of TMEM16A pre-­‐mRNA splicing supports a model in which each exon is regulated by different cis-­‐ and trans-­‐acting elements. Exon 6b inclusion is regulated primarily by SRSF9 and TRA2B, through a unique GAA-­‐rich ESE element. Exon 15 is enhanced only by TIA1 and FOX1 and this effect is mediated by downstream intronic sequences. On the other hand, the small exon 13, included in most human tissues, was mainly skipped in the minigene and only FOX1 and U2AF65 enhanced its inclusion. To understand if there is any preferential association between three AS exons, I have evaluated TMEM16A isoforms using a long range RT-­‐PCR assay that amplifies transcripts across the AS events. Coordination between distant alternative spliced exons in the same gene has been suggested to be an important mechanism to regulate gene expression but very few genes have been studied in detail. I observed that the selection of exons 6b and 15 is preferentially coordinated in several human normal tissues: mature transcripts that predominantly include exon 6b tend to exclude exon 15. Unexpectedly, this coordination was not conserved in mouse tissues. This was mainly due to the fact that exon 15 was largely and predominantly excluded in the mouse, a fact that suggest a peculiar evolutionary conservation of AS in this gene. To explore if changes in splicing coordination of the two major AS events are associated to cancer development I evaluated normal mammalian tissue and corresponding breast tumors of the same cohort, obtained from surgical excision (n=18). The distribution of individual AS events did not change between normal and tumor tissues. However, the TMEM16A splicing coordination increased significantly in tumors. Indeed, the splicing coordination was present in 50% of normal mammalian breast tissues and in 84% in tumors. In conclusion this study identifies several cis-­‐acting elements and trans-­‐acting factors involved in the regulation of TMEM16A Alternative Splicing and provides evidence of its intragenic splicing coordination. The increase of TMEM16A splicing coordination observed in breast tumor, might represent a common event in genes with multiple AS events.

Calcium-activated chloride channels (CaCCs) are a class of the ligand-gated channels involved in numerous cellular functions. In vascular smooth muscle, these ion channels couple agonist-induced calcium-release from the sarcoplasmic reticulum to membrane depolarisation and vasoconstriction. For this reason, CaCCs have been suggested as a potential molecular target to treat a range of vascular disorders. These ion channels, however, have not been yet explored as a drug target because their molecular identity has been elusive and their pharmacology has been restricted to compounds with low potency and poor specificity. The general aims of this work of thesis are: i) to define the molecular identity of CaCCs in vascular smooth muscle, ii) to investigate how the structural features of the identified channel relate to its functional properties and iii) to examine how drug binding modulates CaCC activity. The main findings are the following:1) By using RNA interference technology and patch-clamp analysis, the Tmem16A gene was found to encode for CaCCs in pulmonary artery smooth muscle. Furthermore, Tmem16A appeared to be expressed in other vascular smooth muscles suggesting that this ion channel may represent CaCCs in various vascular beds.2) To understand the physiology and pharmacology of TMEM16A channels it is of a fundamental importance to elucidate the molecular mechanisms by which channel gating and conductance are achieved. TMEM16A comprises eight putative transmembrane domains (TMs) with TM5 and TM6 flanking a putative re-entrant loop, which resembles the pore of other ion channels. Using a chimeric approach the role of this region was investigated. The re-entrant loop of TMEM16A was found to mediate a range of functional roles: it controlled the response of the channel to intracellular calcium, the permeation of anions and the expression of channels on the plasma membrane. Specifically, a non-canonical trafficking motif was identified within in a 38 amino acid region within the re-entrant loop.3) Drugs that modulate the function of TMEM16A channels are currently limited. The generic chloride channel blocker anthracene-9-carboxylic acid (A9C) was found to produce a bimodal effect on TMEM16A currents: low concentrations of A9C activated the channels, while doses higher than ~300 µM produced current inhibition. These two effects were mediated via A9C binding to two separate sites. Binding of A9C into the pore resulted in channel inhibition, while A9C binding to an extracellular site increased the open probability of the channel. To conclude, this work of thesis has revealed the molecular identity of CaCCs in vascular smooth muscle and elucidated the functional roles of the re-entrant loop of the TMEM16A channel protein. The identification of the activating and inhibiting A9C binding sites may help the development of selective blockers and activators of TMEM16A channels.

Meckel-Gruber syndrome (MKS) is a universally lethal heritable human disease characterised by CNS malformations, cystic kidney, polydactyly, and liver fibrosis. MKS is classed as one of the ciliopathies due to its association with dysfunctional primary cilia, signalling organelles found on most cells in the human body. Some of the symptoms of MKS can be explained as a consequence of disrupted developmental signalling through the primary cilium, other defects are harder to explain, and evidence now exists for non-ciliary influences on ciliopathies. The nature of these influences, and the implications they may have for our understanding of ciliary function and the aetiology of MKS, remain unclear. In this thesis, defects in cell-extracellular matrix (ECM) interaction in MKS are investigated to determine whether MKS proteins have a role in this process, and if so, whether this role may be involved in MKS pathology. A combination of transcriptomic, proteomic, and cell imaging approaches are used to demonstrate that MKS patient cells produce a defective extracellular matrix, and that the MKS protein TMEM67 is present at the cell surface at sites of cell-ECM interaction. It is shown that the full-length TMEM67 protein is required for correct ECM morphology, and it is further shown that the abnormal extracellular matrix morphology in MKS cells underlies other defects, including failure to build cilia and alterations to the actin cytoskeleton. This represents the first set of causal relationships identified between the cellular defects in this complex disease. It is further shown that treatment with developmental signalling pathway antagonists can rescue these defects, potentially revealing a new avenue of therapeutic intervention for MKS. Finally, possible upstream defects are investigated that might underlie the ECM defect, including alterations to cell spreading behaviour and cell deformation resistance.

Calcium-activated chloride channels (CaCCs) are ubiquitously expressed in a plethora of cell types and, consequently, are involved in numerous cellular processes as diverse as epithelial secretion, regulation of cardiac excitability and smooth muscle contraction. Current pharmacology of CaCCs is limited to compounds with low potency and poor selectivity. The lack of knowledge surrounding the molecular identity of the CaCC has greatly hindered the development of more specific drugs and has impaired our understanding of the channel physiology and biophysics. The recent discovery that the TMEM16A gene codes for CaCCs has offered hope for new developments in these areas. CaCCs have been suggested as possible targets to treat a variety of conditions including asthma as well as pulmonary and systemic hypertension. Due to the ubiquitous expression of CaCCs and the ability of the channel to interact with a number of pharmacological compounds with diverse chemical structures however, it was hypothesised that TMEM16A could be a possible source for off-target drug effects and may represent a concern for safety pharmacology. The principal aim of this thesis was to assess the functional significance of TMEM16A in the cardiovascular system, as this is one of the major systems of concern for safety pharmacology and accounts for the largest number of post-market drug withdrawals. The main findings of this study can be summarised as follows: 1) RT-PCR analysis revealed a ubiquitous expression of TMEM16A in tissues of the rat and human cardiovascular systems, including systemic and pulmonary arteries as well as cardiac tissue. Analysis also revealed the presence of multiple TMEM16A splice variants in all rat tissues examined, in addition to a number of other TMEM16x family members. 2) Myography experiments using the “classical” CaCC blocker niflumic acid and newly identified TMEM16A blockers confirmed a functional role for TMEM16A in phenylephrine-induced vascular smooth muscle contraction. 3) The suitability of currently available Cl- channel blockers for use as pharmacological tools for TMEM16A research was assessed using conventional whole-cell patch clamp and high-throughput electrophysiology techniques to respectively compare their potencies and selectivity over other cardiovascular ion channels. Of the compounds tested, DIDS and T16Ainh-A01 appeared the most suitable blockers; however all compounds had a degree of non-selectivity, raising concerns for their use in functional studies. In conclusion, these findings provide evidence for the ubiquitous expression and functional significance of TMEM16A within the cardiovascular system and support the hypothesis that TMEM16A is a concern for safety pharmacology and should be included into future pre-clinical safety assays. The inadequacy of current inhibitors however highlights the urgency for the development of novel potent and selective channel modulators for future TMEM16A research.

TMEM16A e TMEM16B sono proteine di membrana con funzione di canali del cloruro attivati da calcio. Attraverso la generazione di canali chimerici, e in particolare, sostituendo la regione carbossi-terminale di TMEM16A con la regione equivalente di TMEM16B, sono stati ottenuti dei canali dotati di una maggiore attività. Il progressivo accorciamento della regione chimerica ha permesso di restringere il “dominio attivante” a una corta sequenza di 14 aminoacidi localizzata vicino all’ultimo dominio transmembrana e ha generato proteine-canale TMEM16A dotate di un’attività molto alta anche a concentrazioni basse di calcio intracellulare. Per chiarire il meccanismo molecolare alla base di questo effetto, sono stati eseguiti esperimenti basati sulla generazione di doppie chimere, Forster resonance Energy transfer e cross-linking intermolecolare. Inoltre, è stato generato un modello tridimensionale teorico di TMEM16A basato sulla struttura di una proteina TMEM16 del fungo Nectria haematococca. I risultati ottenuti indicano che l’aumentata attività nei canali chimerici è causata da un’alterazione dell’interazione tra il carbossi-terminale e la prima ansa intracellulare di TMEM16A. L’identificazione di piccole molecole farmacologiche in grado di mimare questa perturbazione potrebbe rappresentare la base di un approccio farmacologico volto a stimolare il trasporto ionico TMEM16A-dipendente. L’attivazione farmacologica di TMEM16A potrebbe essere utile per stimolare la secrezione epiteliale nelle vie aeree, un effetto potenzialmente benefico in patologie quali la fibrosi cistica e altre malattie ostruttive croniche dell’apparato respiratorio

論文1ページ目の下部に著作権を表示すること。（© 2016, American Society for Microbiology. ）<br>Kyoto University (京都大学)<br>0048<br>新制・課程博士<br>博士(医科学)<br>甲第19634号<br>医科博第72号<br>新制||医科||5(附属図書館)<br>32670<br>京都大学大学院医学研究科医科学専攻<br>(主査)教授 近藤 玄, 教授 篠原 隆司, 教授 秋山 芳展<br>学位規則第4条第1項該当

Frontotemporal dementia is the second most common neurodegenerative disease in people younger than 65 years. Patients suffer from behavioral changes, language deficits and speech impairment. Unfortunately, there is no effective treatment available at the moment. Cytoplasmic inclusions of the DNA/RNA-binding protein TDP-43 are the pathological hallmark in the majority of FTLD cases, which are accordingly classified as FTLD-TDP. Mutations in GRN, the gene coding for the trophic factor progranulin, are responsible for the majority of familiar FTLD-TDP cases. The first genome-wide association study performed for FTLD-TDP led to the identification of risk variants in the so far uncharacterized gene TMEM106B. Initial cell culture studies revealed intracellular localization of TMEM106B protein in lysosomes but its neuronal function remained elusive. Based on these initial findings, I investigated the physiological function of TMEM106B in primary rat neurons during this thesis. I demonstrated that endogenous TMEM106B is localized to late endosomes and lysosomes in primary neurons, too. Notably, knockdown of the protein does neither impair general neuronal viability nor the protein level of FTLD associated proteins, such as GRN or TDP-43. However, shRNA-mediated knockdown of TMEM106B led to a pronounced withering of the dendritic arbor in developing and mature neurons. Moreover, the strong impairment of dendrite outgrowth and maintenance was accompanied by morphological changes and loss of dendritic spines. To gain mechanistic insight into the loss-of-function phenotypes, I searched for coimmunoprecipitating proteins by LC-MS/MS. I specifically identified the microtubule-binding protein MAP6 as interaction partner and was able to validate binding. Strikingly, overexpression of MAP6 in primary neurons phenocopied the TMEM106B knockdown effect on dendrites and loss of MAP6 restored dendritic branching in TMEM106B knockdown neurons, indicating functional interaction of the two proteins. The link between a lysosomal and a microtubule-binding protein made me study the microtubule dependent transport of dendritic lysosomes. Remarkably, live cell imaging studies revealed enhanced movement of dendritic lysosomes towards the soma in neurons devoid of TMEM106B. Again, MAP6 overexpression phenocopied and MAP6 knockdown rescued this effect, strengthening the functional link. The MAP6-independent rescue of dendrite outgrowth by enhancing anterograde lysosomal movement provided additional evidence that dendritic arborization is directly controlled by lysosomal trafficking. From these findings I suggest the following model: TMEM106B and MAP6 together act as a molecular brake for the retrograde transport of dendritic lysosomes. Knockdown of TMEM106B and (the presumably dominant negative) overexpression of MAP6 release this brake and enhance the retrograde movement of lysosomes. Subsequently, the higher protein turnover and the net loss of membranes in distal dendrites may cause the defect in dendrite outgrowth. The findings of this study suggest that lysosomal misrouting in TMEM106B risk allele carrier might further aggravate lysosomal dysfunction seen in patients harboring GRN mutations and thereby contribute to disease progression. Taken together, I discovered the first neuronal function for the FTLD-TDP risk factor TMEM106B: This lysosomal protein acts together with its novel, microtubule-associated binding partner MAP6 as molecular brake for the dendritic transport of lysosomes and thereby controls dendrite growth and maintenance.<br>Frontotemporale Demenz ist die zweithäufigste Form neurodegenerativer Erkrankungen bei Menschen unter 65 Jahren. Patienten leiden an Verhaltensauffälligkeiten und Sprach- sowie Artikulationsstörungen. Leider steht zurzeit keine wirksame medikamentöse Therapie zur Verfügung. Das pathologische Hauptmerkmal der meisten FTLD-Fälle sind zytoplasmatische Einschlüsse des DNA/RNA-bindenden Proteins TDP-43. Diese Fälle werden entsprechend als FTLD-TDP klassifiziert. Für einen Großteil der familiären FTLD-TDP Fälle sind Mutationen in GRN, dem für den Wachstumsfaktor Progranulin kodierenden Gen, verantwortlich. Die erste für FTLD-TDP durchgeführte genomweite Assoziationsstudie führte zur Entdeckung von genetischen Varianten im bis dato uncharakterisierten Gen TMEM106B. Diese Varianten sind mit einem erhöten Risiko an FTLD zu erkranken assoziiert. Initiale Studien in Zellkultur zeigten eine Lokalisierung des TMEM106B Proteins in Lysosomen, die Frage nach der neuronale Funktion des Proteins blieb allerdings bisher unbeantwortet. Auf diesen ersten Ergebnissen aufbauend untersuchte ich während meiner Dissertation die physiologische Funktion von TMEM106B in primären Ratten-neuronen. Ich konnte zeigen, dass endogenes TMEM106B auch in primären Neuronen in späten Endsosomen und Lysosomen lokalisiert ist. Beachtenswerterweise verminderte die Herunterregulierung (shRNA-vermittelter Gen-Knockdown) des Proteins weder das generelle Überleben der Neuronen noch die Level von anderen FTLD-assoziierten Proteinen, wie GRN oder TDP-43. Die Herunterregulierung von TMEM106B führte jedoch zu einem ausgeprägten Verlust von Dendriten in sich entwickelnden und ausgereiften Neuronen. Des Weiteren war die starke Beeinträchtigung dendritischen Wachstums und Aufrechterhaltung von einer morphologischen Veränderung und dem Verlust der Dornfortsätze begleitet. Um den Mechanismus dieser Phänotypen zu erklären, suchte ich nach TMEM106B coimmunopräzipitierenden Proteinen mittels Massenspektrometrie. Ich konnte das Mikrotubuli bindende Protein MAP6 als spezifischen Bindungspartner identifizieren und die Interaktion beider Proteine validieren. Hervorzuheben ist, dass die Überexpression von MAP6 in primären Neuronen den Effekt der Herunterregulation von TMEM106B auf die Dendriten kopierte und die Herunterregulation von MAP6 die dendritischen Verästelungen in TMEM106B depletierten Neuronen sogar wiederherstellen konnte. Diese Ergebnisse legen eine funktionelle Interaktion beider Proteine nahe. Die Verbindung zwischen einem lysosomalen und einem an die Mikrotubuli bindenden Protein brachte mich dazu, den Mikrotubuli abhängigen Transport von dendritischen Lysosomen zu untersuchen. Bemerkenswerterweise zeigten mittels Lebendzellmikroskopie erzeugte Aufnahmen eine erhöhte Bewegung dendritischer Lysosomen Richtung Zellsoma in TMEM106B depletierten Neuronen. Auch in diesem Kontext konnte die Überexpression von MAP6 den Effekt kopieren und die Herunterregulation von MAP6 den Effekt aufheben und somit die These einer funktionellen Interaktion festigen. Die MAP6 unabhängige Wiederherstellung des dendritischen Wachstums durch die Erhöhung des lysosomalen Transports in anterograder Richtung lieferte einen zusätzlichen Beweis dafür, dass das dendritische Wachstum direkt von lysosomalem Transport abhängt. Ausgehend von diesen Ergebnissen schlage ich folgendes Modell vor: TMEM106B und MAP6 wirken zusammen als molekulare Bremse für den retrograden Transport dendritischer Lysosomen. Die Herunterregulation von TMEM106B und die (wahrscheinlich dominant negative wirkende) Überexpression von MAP6 lösen diese Bremse und verstärken die retrograde Bewegung von Lysosomen. Daraufhin könnten der gestiegene Proteinumsatz und der Verlust von Plasmamembranbestandteilen zu einem Fehler im dendritischen Wachstum führen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass fehlerhafter, lysosomaler Transport in TMEM106B Risikoallelträgern zu einer Verstärkung der lysosomalen Fehlfunktion in Patienten mit GRN Mutation führt und dabei zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Zusammengefasst habe ich die erste neuronale Funktion für den FTLD-TDP Risikofaktor TMEM106B entdeckt: Dieses lysosomale Protein wirkt zusammen mit seinem neuentdeckten, Mikrotubuli assoziierten Bindungspartner MAP6 als molekulare Bremse für den dendritischen Transport von Lysosomen und kontrolliert dadurch Wachstum und Aufrechterhaltung von Dendriten.

Introduction: Failure of coronary blood vessels to adequately supply cardiac myocytes with oxygen underlies ischaemic heart disease and ultimately myocardial infarction. Therefore, it is important to determine the factors that regulate coronary blood flow. Activation of Ca2+-activated chloride channels depolarises vascular smooth muscle cells sufficiently to cause Ca2+ influx through voltage-dependent channels and contraction of the cell. TMEM16A is the main molecular candidate for these channels. Hypothesis: TMEM16A is expressed in rat coronary arteries where it regulates vascular smooth muscle contraction. In coronary arteries from hypertensive rats the level of expression, and function of TMEM16A is altered. Methods: Quantitative polymerase chain reaction and immunodetection techniques assessed TMEM16A expression. Whole-cell patch clamp techniques were used to measure currents from freshly isolated rat coronary artery vascular smooth muscle cells (VSMCs). Wire myography and Langendorff perfused heart setup assessed coronary artery contractility and coronary blood flow respectively. Microelectrode impalement of rat coronary artery segments were combined with wire myography for membrane potential measurements. Results: TMEM16A was identified at mRNA and protein levels in rat coronary artery smooth muscle and TMEM16A-specific blockers attenuated the vasoconstricting effects of U46619 and 5-HT. These pharmacological agents also reduced the membrane depolarising effects of U46619 in sharp microelectrode studies and enhanced coronary flow in Langendorff set-ups. TMEM16A transcript was increased in coronary arteries from spontaneously hypertensive rats while the sensitivity to U46619 and 5HT was also increased in these vessels. This increased sensitivity was diminished in the presence of a novel TMEM16A inhibitor. Conclusion: TMEM16A is expressed in rat coronary arteries, where chloride is essential for optimal contraction and novel inhibitors of TMEM16A drastically effect vascular function. The expression of TMEM16A, contractility, and sensitivity to novel inhibitors of TMEM16A are all altered in coronary arteries from hypertensive rats.

The rhomboid-like superfamily of proteins comprises transmembrane proteins with an ancient evolutionary origin. They include both intramembrane serine proteases and inactive pseudoproteases, and they have diverse cellular and pathophysiological functions. These include regulation of growth factor signalling, protein quality control, trafficking, and mitochondrial dynamics. TMEM115, a recently recognised enzymatically inactive member of the rhomboid-like superfamily (confirmed in this thesis), is conserved from yeast to human and is ubiquitously expressed in all tissues. The absence of TMEM115 in both Drosophila and mice causes severe phenotypes. These compelling preliminary data indicate that TMEM115 has important cellular functions. To capitalise on these preliminary observations, the overall aim of my PhD project was to characterise the mammalian TMEM115 both structurally and functionally. Structurally, I performed a topology study for TMEM115, and with a combination of bioinformatic and experimental analysis, proved that TMEM115 indeed has a six TMD structure. Using the HHpred and Phyre algorithms, which identify structural similarity among proteins, a high degree of homology was identified between the TMD regions of TMEM115 and other rhomboid-like proteins. The above analysis together with the topology of TMEM115 definitively positions TMEM115 in the rhomboid-like superfamily. To elucidate the biological role of TMEM115, I started with a proteomic approach, a BioID proximity screen, to identify novel interactors for TMEM115 under different physiologically relevant conditions. A number of binding partners were identified in the BioID screen and validated with co-immunoprecipitation. These indicate intriguing possible functions of TMEM115, including regulating lipid biology, protein trafficking, protein degradation and ion channels. Given that several candidates are involved in protein trafficking, I used a secretome profile analysis method, the SPECS, for identifying TMEM115 dependent secreted proteins. A role of TMEM115 in regulating the fundamental de novo lipogenesis pathway, the SCAP-SREBP pathway (Freeman lab unpublished data), had been identified during the course of my project. Pursuing this, I investigated the possible relationship between TMEM115, SCAP and the novel interactor, p62; the results suggest that TMEM115 may be involved in regulating lipid homeostasis by modulating SCAP levels through the proteasomal degradation machinery.

Les troubles congénitaux de la glycosylation (CDG) sont un groupe de troubles génétiques lié aux anomalies de glycosylation des glycoprotéines. Des études récentes ont identifié TMEM165 comme étant une nouvelle protéine déficiente chez les patients CDG présentant des anomalies ostéoarticulaires importantes, suggérant un rôle de TMEM165 dans la chondrogénèse et le développement squelettique. D’autre part, les protéoglycanes (PGs) jouent un rôle clé dans plusieurs processus biologiques, notamment la maturation chondrocytaire, le développement de la plaque de croissance et la signalisation cellulaire. Afin de déterminer s’il existe un lien potentiel entre le déficit en TMEM165 et la synthèse des PGs et identifier les mécanismes moléculaires impliqués, nous avons invalidé le gène TMEM165 dans les cellules pré-chondrocytaires ATDC5 en utilisant la technique CRISPR/Cas9. De façon intéressante, nous avons montré que l’invalidation du gène TMEM165 entraîne des anomalies de synthèse des PGs et principalement un déficit de polymérisation des chaînes de glycosaminoglycanes de type héparine-sulfate et chondroïtine-sulfate. De plus, nous avons montré que ces anomalies de synthèse peuvent être palliées par la supplémentation des cellules en ions Mn2+. Des résultats similaires ont été obtenus dans les fibroblastes de patient déficient en TMEM165. Ceci suggère que TMEM165 est impliqué dans la régulation de l'homéostasie du Mn2+, co-facteur requis pour une activité optimale des glycosyltransférases dans le Golgi. D’autre part, les PGs jouent un rôle clé dans la régulation de la signalisation du TGFβ et de la BMP. Étant donné que ces voies régulent la chondrogénèse et le développement squelettique, leur intégrité a été évaluée dans les cellules ATDC5 déficientes en TMEM 165 et les fibroblastes de patients CDG. Les résultats obtenus ont permis de montrer que la déficience en TMEM165 perturbe le fonctionnement des voies de signalisation du TGFβ et de la BMP dans les cellules ATDC5 et les fibroblastes humains mutés, suggérant un rôle dans les anomalies squelettiques observées chez les patients CDG déficients en TMEM165. De plus, l’étude de la différenciation in vitro des cellules ATDC5 a permis de révéler que la déficience en TMEM165 accélère la différenciation des cellules ATDC5 vers l’hypertrophie, un processus qui peut conduire à la maturation précoce des chondrocytes et au nanisme observé chez les patients CDG déficients en TMEM165<br>Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) is a group of human genetic disorders with defects in biosynthesis (glycosylation) of glycoproteins. Recent studies have discovered TMEM 165 as a novel protein deficient in CDG patients presenting bone abnormalities, suggesting a role of TMEM 165 in chondrogenesis and skeletal development. Proteoglycans (PGs) play a key role in several biological processes including chondrocytes maturation, growth plate development and intracellular signaling. Alterations in the synthesis of PGs may contribute to skeletal defects observed in TMEM 165-deficient CDG patients. To determine the link, if any, between TMEM165 deficiency and the synthesis of PGs, and to study the molecular mechanisms involved, we generated TMEM165 knock-out pre-chondrogenic ATDC5 cells using CRISPR/Cas9 technique. Interestingly, we showed that the knockdown of TMEM165 in ATDC5 cells resulted in profound defects in the synthesis of PGs and mainly impaired polymerization of both heparin-sulfate and chondroitin-sulfate glycosaminoglycan chains. Furthermore, we found that these defects can be overcome by supplying the cells with Mn2+. Similar results were observed in fibroblast cells from TMEM165-deficient CDG patient. These data suggest that TMEM165 is involved in the regulation of the homeostasis of Mn2+ which is used as a co-factor of Golgi glycosyltransferases and required for full enzyme activity. On the other hand, PGs play a key role in the regulation of TGFβ and BMP signaling. Given that these pathways regulate chondrogenesis and skeletal development their integrity was evaluated in TMEM 165-deficient ATDC5 cells and fibroblast from CDG patients. We demonstrated that TMEM165-deficiency functionally impairs TGFβ and BMP signaling pathways in both ATDC5 cells and human fibroblasts, suggesting a role in skeletal abnormalities observed in TMEM165-deficeint CDG patients. In addition, in vitro differentiation study of ATDC5 cells revealed that loss of TMEM165 expression promotes differentiation of ATDC5 cells towards hypertrophy, a process which may lead to premature chondrocyte maturation and to dwarfism observed in TMEM165-deficient CDG patients

La glycosylation est un processus cellulaire universel chez tous les organismes vivants visant aux transferts successifs de monosaccharides sur une molécule acceptrice, le plus souvent une protéine, un lipide ou un autre monosaccharide. Chez les eucaryotes, différentes voies de glycosylation coexistent, aboutissant à la biosynthèse d’une grande diversité de structures glycanniques aux fonctions diverses. Chez l’homme, des perturbations au cours d’une ou plusieurs réactions de glycosylation sont à l’origine de glycopathologies génétiques rares appelées Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). L’une d’entre elles, TMEM165-CDG, a été identifiée en 2012 par notre équipe et est au cœur de ces travaux. Des mutations pathogéniques dans le gène TMEM165 sont en effet responsables de l’apparition de sévères défauts de glycosylation caractérisés par la présence de structures N-glycanniques principalement sous-galactosylées. Lors de la caractérisation de ces anomalies de glycosylation, les travaux de l’équipe ont rapidement établi un lien entre déficience en TMEM165 et dérégulation de l’homéostasie du manganèse (Mn2+) de l’appareil de Golgi. Dès lors, et au regard de précédents résultats de l’équipe, une fonction d’antiport Ca2+/Mn2+ fut assignée à TMEM165, permettant l’import d’ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi afin d’assurer un environnement ionique adéquat et nécessaire au bon déroulement des réactions de glycosylation. De façon extrêmement intéressante, il s’avère qu’un apport exogène de Mn2+ dans le milieu de culture de cellules déficientes en TMEM165 corrige complètement les défauts de N-glycosylation observés dans ces cellules. Par ailleurs, TMEM165, tout comme Gdt1p son orthologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae, est une protéine extrêmement sensible aux ions Mn2+ étant rapidement dégradée via la voie lysosomale en présence de fortes concentrations de Mn2+. Un lien étroit s’établit donc entre fonctions de TMEM165/Gdt1p, homéostasie du Mn2+ de l’appareil de Golgi et glycosylation golgienne ; trois aspects qui furent au centre de mes travaux. Plus particulièrement, ma thèse porte sur (i) la compréhension des mécanismes de correction des défauts de glycosylation observés dans les cellules déficientes en TMEM165 et induits par le Mn2+ et (ii) les liens potentiels entre différents acteurs essentiels au maintien de l’homéostasie ionique de la voie de sécrétion que sont les pompes calciques (Ca2+) réticulaires SERCA2, TMEM165 et SPCA1, seule pompe ATPasique de l’appareil de Golgi connue à ce jour pour importer à la fois des ions Ca2+ et Mn2+. A travers l’utilisation de lignées cellulaires humaines génétiquement invalidées pour TMEM165 ou ATP2C1 et de levures déficientes en Gdt1p et/ou Pmr1p, notre étude a conduit à l’élaboration de différents concepts reliant intimement ces protéines. D’une part, nous avons démontré que l’activité des pompes SERCA était cruciale au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de TMEM165 par leur contribution dans le pompage et la redistribution des ions Mn2+ depuis le cytosol vers l’appareil de Golgi. D’autre part, TMEM165 est indispensable au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de SPCA1 et lorsque SERCA2 est inhibée par des agents pharmacologiques. Parallèlement, nos travaux ont mis en évidence que l’expression et la stabilité des protéines TMEM165, chez l’homme et Gdt1p, chez la levure étaient directement liées aux capacités de SPCA1 et Pmr1p à importer des ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi. Bien que des différences s’observent entre l’homme et la levure Saccharomyces cerevisiae, l’ensemble de mes travaux illustre l’importance de l’homéostasie ionique de l’appareil de Golgi dans le maintien du processus de glycosylation golgien<br>Glycosylation is a universal cellular process in all living organisms where monosaccharides are added one by one onto an acceptor molecule, most of the time a protein, a lipid or another monosaccharide. In eukaryotes, many glycosylation pathways occur simultaneously, resulting in the biosynthesis of a broad variety of glycan structures with different functions. In humans, if one -or more- glycosylation reactions are genetically impaired, Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) appear. One of them, TMEM165-CDG, was identified in 2012 by our group and is at the heart of this work. Pathogenic mutations in TMEM165 gene cause severe glycosylation defects mainly characterized by hypo-galactosylated N-glycan structures. While characterizing these glycosylation abnormalities, a link has rapidly been established by the team between TMEM165 deficiency and Golgi manganese (Mn2+) homeostasis disruption. Therefore, and based on previous work, TMEM165 was assumed to act as a Ca2+/Mn2+ antiporter, allowing the import of Mn2+ into the Golgi lumen in order to sustain an adequate ionic environment, required for all glycosylation reactions. Interestingly, we also found that exogenous addition of Mn2+ in the culture medium of TMEM165 deficient cells completely rescues the N-glycosylation defects observed in these cells. Moreover, TMEM165, like Gdt1p its yeast ortholog, is a protein highly sensitive to Mn2+, being rapidly degraded via the lysosomal pathway in the presence of high Mn2+ concentrations. All in all, a close link exists between TMEM165/Gdt1p, Golgi Mn2+ homeostasis and Golgi glycosylation; the three major aspects focused in my PhD research. More precisely, my thesis focuses on (i) understanding the mechanisms of Mn2+-induced glycosylation rescue in TMEM165 deficient cells and (ii) the potential links between different key players acting in the regulation of the secretory pathway ionic homeostasis which are the Sarco/Endoplasmic Reticulum calcium (Ca2+)-ATPase SERCA2, TMEM165 and SPCA1 (Secretory Pathway Ca2+/Mn2+-ATPase), the only pump of the Golgi apparatus known to import both Ca2+ and Mn2+ in the Golgi lumen. Through the use of isogenic human cell lines knockout for either TMEM165 or ATP2C1 and yeasts lacking Gdt1p and/or Pmr1p, we highlighted three main concepts that closely link these proteins: TMEM165 (Gdt1p), SPCA1 (Pmr1p) and SERCA2. On the one hand, we demonstrated that the activity of SERCA pumps is crucial to sustain Golgi glycosylation reactions in absence of TMEM165 by their contribution in Mn2+ pumping and redistribution into the Golgi lumen. On the other hand, TMEM165 was found essential for maintaining Golgi glycosylation reactions in absence of both SPCA1 and when SERCA2 are inhibited by pharmacological agents. Moreover, we also shed light on the fact that expression and stability of TMEM165 (in humans) and Gdt1p (in yeast) were directly linked to the capacities of SPCA1 and Pmr1p to import Mn2+ into the Golgi lumen. Although differences exist between humans and yeast Saccharomyces cerevisiae, all of our work illustrates the crucial importance of the ionic homeostasis of the Golgi apparatus to sustain Golgi glycosylation reactions

Le gène TMEM16A a été isolé à l’issu d’un crible à l’aide de « Differential Display » et « microarrays » visant à identifier des gènes dont l’expression est altérée dans des cellules cancéreuses des VADS. TMEM16A est fortement exprimé dans les cancers des VADS et dans plusieurs autres types de cancers. De plus, la protéine est localisée préférentiellement à la surface des cellules situées au niveau des fronts d’invasion. TMEM16A se situe dans le locus CCND1-EMS1 de la région génomique 11q13 souvent amplifiée dans les cancers humains. L’analyse bioinformatique montre que TMEM16A possède plusieurs transcrits codant pour les protéines à 8, 7, 5 ou 4 domaines transmembranaires (TM). Étant donné que les rôles fonctionnels de TMEM16Adeumeurent peu connus à ce jour, nous nous sommes alors interrogés sur l’implication de TMEM16A lors de la tumorigenèse et par conséquent sur la possibilité que ce gène puisse constituer une nouvelle cible thérapeutique dans des traitements anti-cancéreux ? L e transcrit BC033036/ORAOV2 du gène TMEM16A code pour une isoforme à 8 domaines TM et est surexprimé dans les cellules cancéreuses. La surexpression du variant 8TM/ORAOV2 dans la ligné épithéliale Hep-2, issue d’une tumeur des VADS, n’a pas affecté la prolifération et la croissance en agar mou mais a stimulé la migration et l’invasion. L’effet de TMEM16A sur la migration est illustré par une adhérence et un étalement cellulaires rapides mais surtout par une faible force d’adhérence des cellules sur le fond de la boîte de Pétri. L’inhibition de TMEM16A dans un clone surexprimant la forme 8TM diminue la vitesse de fermeture et de la strie et permet de restaurer le comportement initial, comparable à celui du clone témoin. TMEM16A est exprimé de manière endogène dans les cellules de la lignée SCC-25, issue d’une tumeur des VADS. L’inhibition de la forme endogène de TMEM16A dans SCC-25 provoque une baisse significative de la vitesse de migration cellulaire. Cette observation valide la pertinence de TMEM16A en tant que cible thérapeutique anticancéreuse. Elle devra être complétée par des tests in vitro et in vivo. En particulier, il sera intéressant de générer des anticorps neutralisants de TMEM16A qui pourraient servir de médicament contre le cancer<br>The TMEM16A gene was isolated by different display in our laboratory as a highly overexpressed transcript in head and neck tumours. This gene is located at the CCND1-EMS1 locus of human chromosome 11q13 that is amplified in cancer. We are interested in the study of the function of the TMEM16A gene. Bioinformatics’ research shows that this gene produces: 3 isoforms that code for 8 transmembrane domains proteins (8TM), 1 for a 5 transmembrane domains protein (5TM), 1 for a 7 transmembrane domains protein (7TM) and one for a 4TM. After the generation and testing of a serie of antibodies, we were able to show a higher protein expression of TMEM16A in tumour samples by immunohistochemistry. We also confirmed TMEM16A overexpression in tumors by TR-qPCR and Northern blot. We cloned cDNAs that code for the 7TM and 8TM forms. We then studies the effects of 8TM overexpression of TMEM16A deficient cell-line Hep-2, on cell cycle, proliferation and tumorigenicity. The overexpression of TMEM16A stimulated migration and invasion. Changes in cell adhesion and spreading were also noticed. Silencing TMEM16A in 8TM overexpressing clone (HEp-2 cell-line) decreases cell migration and leads to the restoration of the initial state (control clone). Silencing TMEM16A in SCC-25 carcinoma cells which have high endogenous level of TMEM16A also causes a significant decrease of cell migration. This gene, because of its expression on the cell surface, could be a promising target for cancer therapy

Proteins of anoctamin (TMEM16) family are the candidate subunits for Ca2+- activated Cl- channels (CaCC). In recent years, studies have shown that anoctamin-1 (TMEM16A or ANO1) plays important physiological roles in processes including epithelial fluid secretion, muscle contraction and olfactory transduction. How the Ca2+ regulates the activity of ANO1 in different tissue is still not clear. In this study, I showed that the excitatory CaCC in nociceptors (small-diameter sensory neurons that are responsible for transmission of painful stimuli) was activated by the release of Ca2+ from the 1, 4, 5-trisphosphate (IP3)-sensitive intracellular stores in response to bradykinin (BK) or proteases (through protease activated receptor 2). Interestingly, while in the majority of nociceptors, CaCC was induced by Ca2+ release from the stores, only in a few neurons CaCC was activated by the Ca2+ influx through the voltage-gated Ca2+ channels (VGCC). Chelating intracellular Ca2+ with the slow Ca2+ buffer EGTA did not affect CaCC activation by protease activated receptor 2 (PAR2), while BAPTA abolished such activation, suggesting a close proximity of the Ca2+ release sites and CaCC. Membrane fractionation demonstrated that in the dorsal root ganglion (DRG), ANO1, bradykinin receptor 2 (B2R) or PAR2, were co-purified with lipid raft marker caveolin-1. Using various biochemical approaches I further demonstrated that ANO1 physically interacted with the IP3 receptor 1 (IP3R1) in DRG. Moreover, IP3R1, ANO1, B2R, and/or PAR2 were all assembled into functional signalling complexes and the plasma membrane components of the complex which contained ANO1 and GPCRs were tethered to the juxtamembrane regions of the endoplasmic reticulum. Disruption of the membrane microdomains by methyl-beta-cyclodextrin (MβCD) or competitive peptides partially restored coupling of CaCC to VGCC but disrupted coupling between B2R or PAR2 signaling and ANO1. Thus, such molecular complexes dichotomize different Ca2+ sources to provide ANO1-mediated excitation in response to specific ambient signals but protect the channels from global changes in intracellular Ca2+ and prevent sensory neurons from overexcitability.

Les motoneurones spinaux occupent la place centrale du système moteur. Ils intègrent l’ensemble des informations provenant de système nerveux central et périphérique pour élaborer une commande motrice finale adaptée aux demandes de l’organisme et aux contraintes de l’environnement. En particulier, le seuil de recrutement et la fréquence de décharge des motoneurones sont des paramètres déterminants dans l’élaboration d’un signal approprié à l’intensité de l’effort requis. Il permet de définir l’ordre dans lequel les unités motrices sont recrutées au cours d’une activité physique : des unités motrices de type lent (S) pour le maintien de la posture, aux unités motrices de type rapide pour les efforts d’intensité modérée (FR) et de forte intensité (FF). Cette étude met en évidence l’existence d’un nouvel acteur mis en jeu dans la régulation de l’excitabilité motoneuronale. Il s’agit du canal chlorure activé par le calcium TMEM16F exprimé spécifiquement dans les motoneurones α au niveau des synapses cholinergiques appelées « bouton C ». A l’instar du rôle des boutons C, TMEM16F est nécessaire pour l’exécution d’un effort de forte intensité. En effet, en adéquation avec les enregistrements électrophysiologiques montrant une élévation du seuil de recrutement des motoneurones rapides TMEM16F-/-, la perte de TMEM16F induit des défauts moteurs à l’effort.La sclérose latérale amyotrophique (SLA), est une maladie neurodégénérative conduisant à la mort sélective des motoneurones. Parmi les processus pathologiques décrits, nous savons que l’excitabilité motoneuronale et l’homéostasie calcique constituent des éléments majeurs de la progression de la SLA. Ce sont des facteurs de vulnérabilité qui participent à la dégénérescence séquentielle des motoneurones FF et suivie des motoneurones FR. Étant donné la sensibilité de TMEM16F au calcium et son implication dans la régulation de l’excitabilité motoneuronale, nous avons inhibé l’expression de ce canal dans un modèle murin de SLA SOD1G93A et réalisé une étude longitudinale. Celle-ci met en évidence un effet protecteur de la délétion de TMEM16F qui est dépendant du genre<br>Spinal motoneurons have a prominent place in motor system. Motoneurons integrate all inputs from the central and peripheral nervous systems to construct a motor output adapted to the organism's demands and environmental constraints. In particular, recruitment threshold and firing frequency are key motoneuronal parameters in developing an appropriate signal regarding task-dependent demands. During muscle activity, motor units are orderly recruited beginning with slow-type (S) motor units for posture maintenance, followed by fast-type motor units for moderate intensity tasks (FR) and high intensity tasks (FF). Our study highlights a new factor involved in the regulation of motoneuron excitability. This refers to a calcium-activated chloride channel called TMEM16F, specifically expressed in α motoneurons at cholinergic C-bouton synapse. Likewise C-boutons, TMEM16F is required for the procution of high intensity effort. Indeed, in accordance with electrophysiological recordings showing an increase in recruitment threshold of fast TMEM16F-/- motoneurons, TMEM16F loss of function induces motor defects during an effort.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease leading to the selective death of motoneurons. Among the pathological processes already described, we know that motoneuronal excitability and calcium homeostasis are major features in ALS progression. Those are vulnerability factors which contribute to sequential degeneration starting with FF motoneurons and followed by FR motoneurons. Given the TMEM16F sensitivity to calcium and its involvement in regulating motoneuron excitability, we inhibited its expression in a SOD1G93A mouse model of ALS and conducted a longitudinal study. It highlights a gender-dependent protective effect of TMEM16F loss

Le Lupus est une maladie systémique auto-immune complexe, caractérisée notamment par la perte de tolérance vis-à-vis d’antigènes nucléaires, qui affecte majoritairement les femmes à l’âge adulte. Cette maladie est hétérogène tant du point de vue clinique que génétique, ce qui a considérablement limité les progrès dans la compréhension de sa pathogénèse. Dans ce projet, nous avons mis à profit la technologie de séquençage de nouvelle génération de type « Whole Exome Sequencing (WES)» pour explorer la génétique du Lupus à l’échelle de familles individuelles. De plus, nous avons centré notre étude sur des formes à début pédiatrique qui sont cliniquement plus sévères que les formes adultes. Nous avons fait l’hypothèse que ce sous-groupe de patients devrait être enrichi en formes monogéniques. Nous avons ainsi inclus dans cette étude des cas familiaux de lupus ou des familles dans lesquelles il existait un patient lupique et des apparentés atteints de pathologies auto-immunes. Un séquençage WES a été réalisé dans ces familles et la validation des gènes identifiés par cette stratégie a fait l’objet de ce travail. Nous avons découvert une mutation hétérozygote gain de fonction du gène TMEM173 qui code STING, un adaptateur clé dans la signalisation de la détection des ADNs cytosoliques et la production d’interféron de type-I (IFN-I). Quatre membres de cette famille porteurs de la mutation présentent une pathologie auto-inflammatoire et auto-immune, dont un cas de Lupus, avec une expression clinique hautement variable. Une modélisation structurale in silico de la forme mutée prédisait initialement une stabilisation de la forme dimérique de STING avec pour conséquence possible une activation constitutive. En accord avec ces données, nous avons montré, en absence du ligand naturel, une activité constitutive de la forme mutée de STING exprimée dans une lignée cellulaire, ainsi qu’une localisation spontanée dans l’appareil de Golgi des fibroblastes de patients indiquant un état activé. Corrélativement, nous avons observé une concentration sérique élevée d’IFNa chez les patients ainsi qu’une signature transcriptionnelle fortement augmentée d’un panel de gènes induits par les IFN-I. A la suite de cette découverte, nous avons identifié de nouvelles mutations activatrices de STING chez des patients atteints de pathologies vasculaires et de fibroses pulmonaires sévères en relation avec un syndrome inflammatoire, et deux patients ont pu recevoir un traitement ciblant l’inhibition de la voie des IFN-I. Ce travail a permis de mettre en lumière le rôle clé de STING dans l’homéostasie du système immunitaire chez l’homme et de mieux comprendre la physiopathologie de maladies inflammatoires et auto-immunes, motivant la mise en place d’un traitement spécifique chez les patients. Au-delà de cette découverte importante pour ces malades, ce travail suggère que des variants rares et délétères permettent de décrire les causes génétiques de maladies auto-immunes dites complexes<br>Lupus is a complex systemic autoimmune disease characterized by a loss of tolerance to nuclear antigens predominantly afflicting women of childbearing age. The disease is both clinically and genetically heterogeneous and this has greatly limited progress in understanding disease pathogenesis. In this project, we utilize next generation sequencing technology such as “Whole Exome Sequencing (WES)” to explore the genetics of lupus at the level of individual families. Furthermore, we focused on a rare subgroup of lupus patients, which develop the disease in childhood and usually present with a more severe clinical phenotype compared to the adult-onset form. We hypothesized that this subgroup would be enriched for monogenic forms of the disease. Thus, we recruited several families with early-onset in the proband and at least one other familial member presenting with lupus or associated autoimmune disease. WES was performed and the validation of the gene identified by this strategy is described. We identified a familial gain of function dominant mutation in TMEM173, encoding STING, a key adaptor molecule in the cytosolic DNA sensing pathway and Type-I interferon (IFN-I) production. The four affected family members demonstrate a systemic inflammatory and autoimmune condition, including lupus, with variable clinical expression. Structural modeling initially predicted a stabilized dimerization of the mutant STING and thereby a constitutive activation. In agreement with this, we found that the STING mutant spontaneously localizes in the Golgi of patient fibroblasts, and is constitutively active in the absence of its ligand in vitro. Accordingly, we observed elevated serum interferon activity and a IFN-I signature in peripheral blood. We have also identified several other patients with activating STING mutations presenting with vascular inflammation and or pulmonary fibrosis, and two patients received a treatment targeting the IFN-I signaling pathway. This discovery highlights the key role of STING in human immune homeostasis and its implication in severe inflammatory and autoimmune diseases, leading to new and more specific therapeutical approaches. Beyond these important findings with regards to patients, this work suggests that rare deleterious variants can describe the genetic cause of autoimmune pathologies previously defined as complex diseases

Une altération du processus de N-glycosylation des protéines peut conduire à l’apparition de pathologies comme le cancer ou les "Congenital Disorders of Glycosylation" (CDG). La première partie de mon travail de thèse a porté sur l’étude de l’implication de la Man2C1 dans la cancérogenèse de la prostate. La Man2C1 est une glycosidase impliquée dans le processus ERAD « Endoplasmic reticulum associated degradation ». Nous avons montré le transfert de précurseurs oligosaccharidiques incomplets de type Man9Gn2 et Man5Gn2 sur les protéines, ainsi qu’une diminution de l’antennarisation des N-glycannes dans des lignées cancéreuses prostatiques. Cependant, même si nous avons observé une corrélation entre l’expression de la Man2C1 et l’activation de la voie PI3K/Akt aucun lien direct n’a été montré entre les deux phénomènes. La deuxième partie de mon travail de thèse a porté sur l’étude fonctionnelle de Gdt1p, orthologue fonctionnel de TMEM165, chez Saccharomyces cerevisiae. TMEM165, est une protéine golgienne dont la déficience conduit à l’apparition d’un CDG de type II. Nous avons étudié le rôle de Gdt1p dans le processus de glycosylation en utilisant différents mutants de pmr1p, unique transporteur de Ca2+/Mn2+ de l’appareil de Golgi. Notre étude a montré que le défaut de glycosylation observé est lié à une perturbation de l’homéostasie golgienne en Mn2+ et que la restauration de la glycosylation par le Mn2+ est associée au gradient calcique golgien, ce qui nous a permis de suggérer un rôle d’antiport Ca2+/Mn2+ pour Gdt1p<br>N-glycosylation is a complex process localized in two cellular subcompartiments, the Endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. N-glycans are involved in physiological functions such as cell-cell interactions and also in the folding of N-glycoproteins newly synthesized. Disturbances of N-glycosylation process can lead to pathologies such as cancer or Congenital Disorders of Glycosylation.In the first part of my work, we studied the role of Man2C1 in prostate cancer genesis. Man2C1 is a glycosidase involved in the Endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD). We pointed out the transfer of incomplete Man5Gn2 and Man9Gn2 oligosaccharide precursors and a decrease of N-linked glycan antennary profiles in prostate cancer cell lines. However, neither direct link between Man2C1 expression level, nor catalytic activity of Man2C1 and the level of activation of Akt pathway in prostate cancer cell lines have been demonstrated. In the second part of my work we analyzed the involvement of Gdt1p in N-glycosylation process in Saccharomyces cerevisiae. TMEM165 is a Golgi localized protein whose impairment leads to CDG type II. My study was based on TMEM165 ortholog in Saccharomyces cerevisiae, Gdt1p. We analyzed the involvement of Gdt1p in Glycosylation process using Pmr1p mutants, the only one Ca2+/Mn2+ transporter known in the Golgi apparatus. Our study has demonstrated that the glycosylation defect observed is due to a disturbance in manganese Golgi homeostasis and needs calcium gradient of golgi saccules. Our study confirmed Mn2+ transport function of Gdt1p and suggested an Ca2+/Mn2+ function for Gdt1p

Les déficits congénitaux de la glycosylation (CDG) sont un groupe de maladies génétiques rares, résultant d’altérations dans le processus de biosynthèse des glycannes. En 2012, un nouveau sous-type de CDG de type II, le TMEM165-CDG, conséquence de mutations dans le gène codant pour la protéine transmembranaire TMEM165 est découvert. Cette protéine est localisée au niveau de l’appareil de Golgi et serait le principal transporteur de manganèse dans l’appareil de Golgi. Nous savons désormais que le défaut de glycosylation du TMEM165-CDG est due à une altération de l’homéostasie du manganèse et que ce défaut peut être restauré par une supplémentation en cet ion. De façon intéressante, de fortes concentrations en manganèse entrainent la dégradation de TMEM165 au niveau des lysosomes.Au cours de mon doctorat, nous avons identifiés les acides aminés de TMEM165 responsables de sa fonction dans la glycosylation et sa sensibilité au manganèse, essentiellement deux séquences « signature » de la famille UPF0016. Nous avons également démontré pour la première fois que TMEM165 avait un lien fonctionnel avec la protéine SPCA1, une pompe calcium/manganèse golgienne. Une absence de SPCA1 engage TMEM165 dans la voie de la dégradation lysosomale<br>Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) are a group of rare genetic diseases affecting the process of glycans biosynthesis. In 2012, a new subtype of CDG type II was discovered, TMEM165-CDG, resulting from mutations in the gene encoding TMEM165, a transmembrane protein. This protein is localized in the Golgi apparatus and might be the major Golgi manganese importer. The glycosylation defect observed in TMEM165-CDG results of a lack of manganese in this compartment, that is restored by manganese supplementation. Interestingly, high manganese concentrations lead to the degradation of TMEM165 in the lysosomes.During my PhD, we have identified the amino acids of TMEM165 implied in the function in glycosylation and its manganese sensitivity, essentially the two signature motifs of the UPF0016 family. We also demonstrated the first evidence of a functional link between TMEM165 and SPCA1, a Golgi calcium/manganese pump. The absence of SPCA1 targets TMEM165 to the lysosomes for degradation

Transmembrane protein 114 (TMEM114) is an uncharacterised predicted transmembrane protein expressed in the lens epithelium. A balanced translocation that transects the putative promoter of TMEM114 is associated with autosomal dominant congenital cataract (ADCC), however, coding sequence variants in TMEM114 were not identified in a panel of ADCC patients. Subsequent to the identification of TMEM114 a similar novel transmembrane protein named TMEM114-like protein 1 (TMLP1) was identified. This study aimed to functionally characterise the two novel proteins TMEM114 and TMLP1.TMEM114 and TMLP1 showed homology to voltage dependent calcium channel gamma (γ) subunits, but TMEM114 and TMLP1 lacked some of the key domains present in these proteins. Expression of TMEM114 and TMLP1 in the developing human eye was identified. TMLP1 was also expressed in developing neural tissue. To aid functional characterisation, the murine orthologues of Tmem114 and Tmlp1 were cloned and polyclonal antibodies were generated. Bioinformatic tools predicted co-and post-translational modifications. The predicted plasma membrane localisation of Tmem114 was confirmed in vitro in polarised MDCK II cells and the membrane localisation was shown to be dependent on the presence of N-linked oligosaccharides. Murine Tmlp1 was localised in the endoplasmic reticulum (ER) in MDCK II cells, possibly due to the fact that murine Tmlp1 lacks an N-glycosylation site present in other species.The knockdown of Tmem114 in Xenopus tropicalis using antisense morpholinos results in microphthalmia (small eye) confirming the protein's role in eye development and growth. Sequencing of patients with microphthalmia and anophthalmia identified a novel heterozygous missense mutation (p.R2Q) not present in controls. The p.R2Q variant was not found to affect the expression or localisation of the protein. The p.A147V variant, previously reported as a SNP, mis-localises to the endoplasmic reticulum.In conclusion, this study identifies that TMEM114 is a transmembrane glycoprotein with an important role in ocular development in vertebrates, although its precise functional role remains to be elucidated. Knockdown of Tmem114 in X. tropicalis results in microphthalmia, suggesting that loss of function mutations in TMEM114 may be associated with human ocular disease. Further characterisation of TMLP1 is required to identify its role in human biology.

Les anomalies congénitales de la glycosylation (CDG) sont des maladies génétiques rares caractérisées par une glycosylation aberrante des protéines. Récemment, un sous-groupe de CDG dues à des perturbations de l'homéostasie de l’appareil de Golgi a fait son apparition. En 2012, notre équipe a identifié TMEM165 comme étant une protéine golgienne impliquée dans les CDG, mais dont les fonctions biologiques et cellulaires demeurent inconnues. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que l'homéostasie golgienne du Mn2+ était altérée en absence de TMEM165. Alors que de forts défauts de glycosylation, en particulier des défauts de galactosylation, ont été observés dans des cellules déficientes en TMEM165, nous avons découvert que la supplémentation en Mn2+ était suffisante pour rétablir une glycosylation normale. De façon intéressante, nous avons également démontré que ce défaut de glycosylation pouvait également être supprimé par une supplémentation en galactose. Fort de cette observation, la supplémentation orale en galactose a été testée chez des patients déficients en TMEM165 et il a été prouvé que ce traitement améliorait significativement les paramètres biochimiques et cliniques. De plus, nous avons mis en évidence que la stabilité de TMEM165 était altérée en présence d'une concentration élevée de Mn2+. En effet, nous avons montré que l'exposition à des concentrations élevées de Mn2+ entraînait une dégradation lysosomale rapide de TMEM165. Dans l'ensemble, notre étude montre que TMEM165 est (i) un acteur clé de la glycosylation golgienne en régulant finement l'homéostasie du Mn2+ et (ii) une nouvelle protéine de l’appareil de Golgi sensible au manganèse<br>Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) are severe inherited diseases in which aberrant protein glycosylation is a hallmark. From this genetically and clinically heterogeneous group, a significant subgroup due to Golgi homeostasis defects is emerging. Our team previously identified TMEM165 as a Golgi protein involved in CDG. But despite strong efforts, the biological and cellular functions of TMEM165 were not known so far. During my thesis, we highlighted that Golgi Mn2+ homeostasis was impaired due to TMEM165 deficiency. While strong glycosylation defects, especially galactosylation defects, were observed in TMEM165 depleted cells, we discovered that Mn2+ supplementation was sufficient to fully restore a normal glycosylation. Interestingly, we also demonstrated that the observed glycosylation defects in mammalian cells could be overcome by galactose supplementation. Strong of this observation, oral galactose supplementation in TMEM165 deficient patients was assayed and this treatment was proven to significantly improve biochemical and clinical parameters. Moreover, we highlighted TMEM165 as a novel Golgi protein whose stability is altered in the presence of high manganese concentration. Indeed, we showed that exposure to high Mn2+ concentrations led to a rapid lysosomal degradation of TMEM165. Altogether, our study points TMEM165 as (i) a key player in Golgi glycosylation by finely regulating Golgi Mn2+ homeostasis and (ii) a novel Golgi protein sensitive to manganese

La mucoviscidose (CF pour Cystic Fibrosis) est la conséquence de la mutation du gène codant pour le canal chlorure CFTR. Une des stratégies thérapeutiques proposées pour compenser la déficience de CFTR serait de stimuler une voie alternative à CFTR de sécrétion d'ions chlorures. En 2008, le canal ANO1 a été identifié comme CaCC (canal chlorure activé par le calcium) et alors proposé comme cible thérapeutique dans le contexte de la mucoviscidose. Des travaux précédents de notre laboratoire ont montré que l'activité et l'expression d'ANO1 étaient diminuées en contexte CF par rapport au contexte non-CF. Les mécanismes de régulation d'ANO1 n'étant pas connus, les objectifs principaux de ce travail étaient d'étudier la régulation d'ANO1 par les microARN. Nous avons donc, dans un premier temps, identifié un microARN, miR-9 qui est surexprimé dans les cellules CF et qui régule directement ANO1. Nous avons montré que la régulation d’ANO1 par miR-9 entraîne une diminution d’expression et d’activité d’ANO1 ainsi que de la vitesse de migration des cellules. Dans le contexte de la mucoviscidose, il nous a semblé plus intéressant de pouvoir augmenter l’expression d’ANO1 dans le but d’augmenter les efflux chlorures, nous avons donc fait synthétiser une molécule qui empêche la fixation de miR-9 à ANO1, un TSB (Target Site Blocker) ANO1. Nous avons alors démontré que l’utilisation de notre TSB ANO1 permettait d’augmenter l’expression d’ANO1, son activité chlorure et la migration cellulaire dans différents modèles in vitro et in vivo. L’ensemble de ses résultats suggère que notre TSB ANO1 pourrait être une cible thérapeutique intéressante chez les patients atteints de mucoviscidose<br>Cystic Fibrosis (CF) is the consequence of the mutation of the chloride channel CFTR. One of the therapeutic strategy proposed in CF to compensate the CFTR deficiency is to stimulate others chlorides channels. In 2008, the channel ANO1 was identified as CaCC (calcium-activated chloride channel) and then proposed as a therapeutic target in CF. Previous works from our lab have shown that ANO1 activity and expression are reduced in the CF context compared to non CF. Mechanisms of ANO1 regulation being unknown, the objectives of this work were to study ANO1 regulation by microRNA. First, we identified a microRNA, miR-9, which is overexpressed in CF cells and directly regulates ANO1. We have then shown that ANO1 regulation by miR-9 induces decreases of ANO1 expression and activity, and migration rate of cells. In the context of CF, it seems more interesting to increase ANO1 expression in order to increase the chloride efflux, we thus designed a target site blocker (TSB ANO1) which prevents miR-9 fixation on ANO1. In different models in vitro and in vivo, we demonstrated that our TSB ANO1 increases ANO1 expression, ANO1 activity and migration rate of cells. These results suggest that ANO1 TSB could be considered as an interesting therapeutic target in CF

Autophagy, a cellular recycling mechanism, and apoptosis, a regulated mode of cell death, are two fundamental cellular processes that contribute to carcinogenesis and tumour growth as well as treatment sensitivity and resistance. The protein encoded by DRAM1, a p53-responsive gene, has previously been described as an autophagy and apoptosis modulator downstream of p53 activation. Furthermore, a family of DRAM1-related proteins has been uncovered by in silico analysis. Of the 5 members of this protein family, only DRAM1 and DRAM-2 had previously been tested for their roles in cell death and autophagy. Much less was known about the remaining three DRAM-family members TMEM150A/B/C (termed DRAM-5/-3/-4 by us for ‘DRAM-related/associated member-5/-3/-4’) and their potential roles in autophagy, cell death or cell survival in cancer cells. In this project, we therefore aimed to test whether these DRAM-family proteins could modulate autophagy, cell death or cell survival in in vitro cancer cell line systems. We used both retroviral, constitutive overexpression systems and CRISPR/Cas9-mediated gene disruption systems to study the effect of TMEM150 overexpression or TMEM150 ablation on these processes. In summary, we found that none of the TMEM150 genes were induced by p53, but starvation conditions increased TMEM150A and C transcript levels in some conditions. Moderate changes in TMEM150 protein levels showed no dramatic effect on cell growth and survival. Of the three TMEM150 proteins, only TMEM150B affected autophagy, while TMEM150A and C did not modulate autophagic processes in any of the assays performed. Moreover, we show that TMEM150B overexpression can improve cellular survival under glucose deprived conditions, while none of the other DRAM-family proteins seems capable of doing so. Additionally, serum or amino acid starvation did not show parallel effects. Lastly, we show that the influence of TMEM150B on autophagic processes is uncoupled from its ability to modulate survival in glucose-starved cells. Taken all together, with this work we provide an initial characterisation of the TMEM150 proteins, which may lay a foundation for future, expanded studies on the cellular functions of the DRAM-family.

SPCA1 est une ATPase de type P transportant un ion Ca2+ ou un ion Mn2+ du cytosol vers la lumière de l’appareil de Golgi en hydrolysant une molécule d’ATP. Au niveau du Golgi, une autre protéine semble impliquée dans la régulation de l’homéostasie du Ca2+ et du Mn2+, il s’agit de TMEM165. Les mutations dans le gène ATP2C1, codant la protéine SPCA1, et dans le gène TMEM165, codant la protéine du même nom, provoquent deux pathologies différentes : une maladie de peau nommée Hailey-Hailey et une pathologie congénitale de glycosylation (CDG), respectivement. Alors que rien ne semblait relier ces deux protéines, nos résultats suggèrent un lien fonctionnel. Nous avons démontré, dans deux lignées cellulaires différentes (cellules HeLa et fibroblastes), que SPCA1 et TMEM165 sont proches l’une de l’autre au sein de l’appareil de Golgi. De plus, la fonction de SPCA1 semble gouverner l’expression de TMEM165. Cette dernière est sensible aux concentrations de Mn2+ cytosolique. Dans les fibroblastes et kératinocytes de patients atteints de la maladie de Hailey-Hailey, en présence de concentrations élevées de Mn2+ extracellulaire, l’expression de TMEM165 est beaucoup plus sensible au Mn2+ que dans les cellules contrôles. En utilisant la technique d’ICP-MS, nous avons mesurer le taux de Mn cellulaire et découvert une accumulation de Mn plus importante dans les cellules de patients par rapport aux cellules contrôles. Grâce à GPP130, une protéine sensible aux concentrations de Mn2+ golgien, nous avons relié cette plus forte accumulation de Mn2+ dans les cellules de patients avec une élévation de la concentration du Mn2+ dans le cytosol de ces cellules. En outre, SPCA1 interagit également avec Cab45, une protéine qui fixe le Ca2+, et toutes les deux interviennent dans une nouvelle voie de tri de certaines protéines au niveau du TGN. Nous avons montré, pour la première fois, que la localisation subcellulaire de Cab45 est sensible à l’utilisation de fortes concentrations en MnCl2 dans le milieu de culture des fibroblastes de patients HHD par rapport aux fibroblastes contrôles. A ce jour, le mécanisme moléculaire intervenant dans cette perte de localisation de Cab45 induite par le Mn2+ reste incompris. Une autre preuve est l’observation de l’augmentation de la quantité de SPCA1 qui est concomitante à la dégradation de TMEM165 en présence de fortes concentrations en MnCl2 dans le milieu de culture des cellules HeLa et des fibroblastes. Cette augmentation est probablement due à une augmentation transcriptionnelle du gène ATP2C1. De plus, nous avons montré que lorsque l’expression de l’une de ces protéines est réduite par la technique de CRISPR/Cas9, l’expression de l’autre est perturbée. Toutes ces données tendent à suggérer un lien fonctionnel entre SPCA1 et TMEM165, deux régulateurs de l’homéostasie du Mn2+ et du Ca2+ golgien<br>SPCA1 is a P-type ATPase that transports a Ca2+ ion or a Mn2+ ion from the cytosol to the Golgi lumen by hydrolyzing one molecule of ATP. Another protein seems to be involved in the regulation of Ca2+ and Mn2+ homeostasis, namely TMEM165. Mutations in the ATP2C1 gene, encoding SPCA1 protein, and in the TMEM165 gene, encoding the protein of the same name, cause two different pathologies : a skin disease called Hailey-Hailey and a congenital disorder of glycosylation (CDG), respectively. While nothing seemed to link these two proteins, our results suggest a functional link. We have demonstrated, in two different cell lines (HeLa cells and fibroblasts), that SPCA1 and TMEM165 are close to each other within the Golgi apparatus. In addition, the function of SPCA1 appears to govern the expression of TMEM165. The latter is sensitive to cytosolic Mn2+ concentrations. In fibroblasts and keratinocytes of patients with Hailey-Hailey disease, in the presence of high concentrations of extracellular Mn2+, the expression of TMEM165 is much more sensitive to Mn2+ than in control cells. Using ICP-MS, we measured cellular Mn levels and found greater Mn accumulation in patient cells compared to control cells. Thanks to GPP130, a protein sensitive to the concentrations of Golgi Mn2+ concentrations, we have linked this higher accumulation of Mn2+ in the cells of patients with an increase of the Mn2+ concentration in the cytosol of these cells. In addition, SPCA1 also interacts with Cab45, a protein that binds Ca2+ in the Golgi, and both are involved in a novel way of proteins sorting at the TGN. We have shown, for the first time that the subcellular localization of Cab45 is disturbed in presence of higher concentration of MnCl2 in the culture medium of HHD fibroblasts compared to control fibroblasts. To date, we don’t know the molecular mechanism involved in this loss of Cab45 localization induced by Mn2+.Another evidence is the observation of the increase in the amount of SPCA1 which is concomitant with the degradation of TMEM165 in the presence of high concentrations of MnCl2 in the culture medium of HeLa cells and fibroblasts. This increase is probably due to a transcriptional increase in the ATP2C1 gene. In addition, we have shown that when the expression of one of these proteins is reduced by the CRISPR/Cas9 technique, the expression of the other is disrupted. All of these data tend to suggest a functional link between SPCA1 and TMEM165, two regulators of Mn2+ and Ca2+ homeostasis

Le récepteur nucléaire d'hormone RORγt est un facteur de transcription clé qui orchestre la différenciation des cellules Th17 mais aussi définit les cellules TγƠ17 et les Cellules Lymphoïdes Innées du groupe 3 (ILC3s). Notre avons identifié TMEM176B, une protéine à quatre domaines transmembranaires qui interagit avec son homologue TMEM176A de structure identique. Des expériences d'électrophysiologie ont révélé que TMEM176A et B fonctionnent comme des canaux ioniques et peuvent s'hétérodimériser. Ces deux homologues font partie des rares cibles directes de RORγt. Nous avons prouvé que ces deux gènes sont hautement exprimés dans les cellules Th17 murines générées in vitro en comparaison des Th1, Th2 ou iTregs. Cette observation s'applique aussi aux Th17 humains et corrèle avec leurs niveaux de RORC ou IL17A. Nous avons aussi démontré que Tmem176a et b sont fortement exprimés dans les ILC3s et les celulles TγƠ17, nous avons donc émis l'hypothèse que ces deux gènes pourraient jouer un rôle crucial dans le développement de pathologies autoimmunes dépendantes des cellules RORγt+. En effet, les souris déficientes en Tmem176b sont partiellement mais significativement protégées des lésions psoriasiformes. Ces résultats suggèrent que la délétion des deux gènes serait requise pour élucider clairement leur rôle. Nous avons généré avec succès une souris double KO et avons débuté l'étude de l'impact de cette double déficience en conditions non-pathologiques et sur des modèles d'inflammation. En parallèle, nous avons trouvé que les protéines TMEM176A et B sont fortement associées avec l'appareil de Golgi, mettant ainsi en évidence de nouveaux mécanismes potentiels de modifications post-traductionnelles ou du traffic intracellulaires dans lesquels ces canaux ioniques pourraient être impliqués. Nous pensons que l'étude de TMEM176A et B peut permettre la mise en lumière de nouvelles voies spécifiques de la biologie des cellules RORγt+ qui pourraient être manipulées en thérapeutique<br>The nuclear hormone receptor RORγt is the key transcription factor that orchestrates the differentiation of Th17 cells but also defines γƠT17 cells and group 3 Innate Lymphoid Cells (ILC3s). We identified TMEM176B, a fourspan transmembrane protein that interacts with its structurally identical homolog protein TMEM176A. Electrophysiological experiments revealed that TMEM176A and B function as cation channels and can heteromerize to exert their function. Strikingy, these two homologs were found among the few direct targets of RORγt. We show that both genes are highly expressed in in vitro-generated mouse Th17 cells compared to Th1, Th2 or iTregs. We also observed that human Th17 cells strongly express TMEM176A and B mRNA, correlating with the level of RORC or IL17A. We further demonstrate that Tmem176a and b are highly expressed in ILC3s and γƠT17 cells. We thus hypothesized that these genes could play a crucial role in the development of a variety of autoimmune diseases dependent on RORγt+ cells. In this regard, Tmem176bdeficient mice were partially but significantly protected from psoriasis-like lesions when compared to control mice. These results suggest that the deletion of both genes may be required to clearly elucidate their role. We have successfully generated a double KO mouse and started to assess the impact of this double deficiency in the steady states as well as in models of inflammation. In parallel, we found that TMEM176A and B protein localizations are strongly linked to the Golgi apparatus, thus highlighting novel potential mechanisms of post-translational modifications or intracellular trafficking in which these cation channels could be involved. We believe that the study of TMEM176A and B will help decipher novel specific pathways of the RORYt+ cell biology that could be therapeutically manipulated

Le but de mon projet de thèse a été d'étudier la fonction des deux protéines AF1q (ALL-Fused gene from chromosome l) et TMEM131-L au cours du développement précoce des lymphocytes T humains. Les travaux antérieurs du laboratoire ont permis l'identification des préthymocytes humains foetaux et soulever ainsi la question des mécanismes moléculaires contrôlant leur émergence extra-thymique ainsi que les modalités de leur polarisation vers le lignage T. Dans ce contexte une étude de recherche de gènes candidats a permis de sélectionner 2 gènes sur la base de leur profil d'expression du le stade des préthymocytes aux étapes précoces du développement intrathymique. Des stratégies de surexpression et d'invalidation par interférence ARN pour l'abord de l'étude fonctionnelle de ces deux gènes. Ainsi, la protéine AF1q a été caractérisée comme une protéine nucléaire qui promeut l'engagement vers le développement de lymphocyte T en restreignant les autres potentiels lymphoïdes. Elle correspond à un nouveau régulateur de l'engagement vers le lignage T ciblant spécifiquement le compartiment hématopoïétique précoce en agissant en synergie avec le signal Notch. Le deuxième gène TMEM131-L jusqu'à lors jamais étudié a constitué la majeur partie de mon travail de thèse. Nous avons dans un premier temps abordé son profil d'expression au niveau transcriptionnel et protéique ainsi que sa distribution subcellulaire dans des lignées lymphoïdes et les différentes sous populations intratymiques. Le gène est fortement exprimé dans les thymocytes immatures CD3- et compte au moins quarte isoformes protéiques. L'analyse de sa dynamique d'expression au cours du développement intrathymique a révélé une translocation à la membrane de la protéine au moment de la beta sélection ainsi qu'une colocalisation avec l'axine impliqué dans la voie Wnt. Une étude exploratrice exhaustive a permis de caractériser la protéine TMEM131-L comme un nouvel inhibiteur proximal de cette voie de signalisation. L'analyse du profil d'expression du TMEM131-L dans des LAL T et B a permis sa caractérisation comme un gène supresseur de tumeur potentiel.

Oncolytic viruses promote anti-tumour immune response by direct tumour cell killing and activation of intratumoural immune system. The role of innate antiviral immune response to oncolytic viruses is still debated, as they counteract viral replication and trigger adaptive antitumor immunity. The DNA sensing-mediated cGAS/STING axis may act as a key balancer between lytic and immunotherapeutic activity of oncolytic viruses. Indeed, upon infection, viral DNA is sensed by cGAS/STING axis that, in turn, induces type-I interferon cascade counteracting viral replication and spread. For this reason, STING represents a hurdle for classical lytic-centric function of oncolytic viruses. On the other side, the immunological role of STING should also be considered, as it is emerging as a key bridge between innate and adaptive immunity. To evaluate the role of STING expression in tumour cells in response to onco-virotherapy, we generated murine STING KO tumour cell lines through CRISPR/Cas9 genome editing. Preclinical studies in syngeneic immunocompetent tumour-bearing mice showed that the inactivation of STING in tumour cells, while favouring oncolytic viral replication, impaired the immunotherapeutic effects of combination therapy based on herpetic oncolytic virus and PD1 blockade. Molecular characterization of tumours revealed that loss of STING prevents antitumour immune activation inducing a tolerogenic cell death and immunosuppressive tumour microenvironment. Accordingly, I propose that antiviral, tumourresident STING provides fundamental contributions to heat-up the TME eliciting immunotherapeutic efficacy of oncolytic viruses.

Les interférons de type I (IFN I) sont des cytokines antivirales aux propriétés puissantes. L’induction, la transmission et la résolution de la réponse immunitaire engendrée par les IFN I est minutieusement régulée. Le concept d’interféronopathie de type I, récemment individualisé par notre équipe, repose sur l’hypothèse que certaines pathologies seraient secondaires au déséquilibre de ces voies de signalisation complexes et à la sécrétion excessive et inappropriée d’IFN I. L’inhibition de celle-ci par des thérapeutiques ciblées permettrait de valider cette hypothèse, si les symptômes allégués s’amélioraient, voire disparaissaient. Ce travail de thèse s’est initialement concentré sur la caractérisation clinique et biologique des interféronopathies monogéniques et polygéniques, et secondairement sur l’identification moléculaire de nouvelles mutations du gène TMEM173 à l’origine de l’interféronopathie liée à STING, également appelée SAVI (STING associated vasculopathy with onset in infancy), syndrome auto-inflammatoire associant une atteinte sévère cutanée et pulmonaire. De nouvelles techniques ont permis la sélection de patients présentant une augmentation de l’IFN I en comparaison à des contrôles sains : la signature IFN I, qPCR de 6 gènes stimulés par l’IFN (IFN stimulated genes – ISGs) et le dosage d’IFN alpha sérique ou plasmatique par méthode du SIMOA (single molecule array) permettant la détection de molécules d’IFN de l’ordre du femtogramme (10-18g). Ces méthodes nous ont ainsi permis d’élargir le spectre clinique phénotypique des interféronopathies de type I, initialement considéré comme essentiellement neurologique. Les patients atteints du syndrome d’Aicardi-Goutières, première interféronopathie monogénique décrite, présentaient les signes suivants : dystonie, spasticité, décalage des acquisitions, calcifications intra-cérébrales et anomalies de la substance blanche. Cependant, l’utilisation systématique de nos méthodes de criblage associée à l’avènement des technologies de séquençage à haut débit (next generation sequencing – NGS) a permis de révéler un phénotype plus large, caractéristique des interféronopathies de type I : sur le plan cutané (engelures, vascularite nécrosante des extrémités, sclérodermie), pulmonaire (pneumopathie interstitielle isolée ou non), musculo-squelettique (arthralgies, arthrites, arthropathie de Jaccoud, myalgies et myosites), ophtalmologique (glaucome), néphrologique (néphropathies lupiques), gastro-entérologique (maladies inflammatoires chroniques intestinales précoces), associées à de l’auto-immunité ou un déficit immunitaire inconstants. Notre méthode de sélection nous a notamment permis d’identifier des patients présentant de manière variable des signes cardinaux de SAVI et une de trois nouvelles mutations activatrices dans une région spécifique du gène TMEM173 (codant pour STING). Ces mutations circonscrivent une région de la protéine à ce jour encore jamais impliquée dans le contrôle de la voie de l’IFN I. STING est une protéine du réticulum endoplasmique qui agit comme adaptateur cytosolique de senseurs intracellulaires d’ADN viral dans une voie de signalisation de l’IFN I. STING active TBK1 (TANK-binding kinase) et permet la transcription des IFN I par la phosphorylation d’IRF3. La Janus Kinase 1 (JAK1) et la tyrosine kinase 2 (TYK2) sont activées suite à la stimulation des récepteurs de l’IFN I et phosphorylent les facteurs de transcription STAT1 et STAT2, conduisant à l’expression de nombreux ISGs. Les analyses génétiques, de conformation tridimensionnelle, sur un modèle cellulaire in vitro (HEK293T) et ex vivo sur cellules mononuclées périphériques des patients nous ont ainsi permis de mettre en évidence pour ces mutations un caractère constitutionnellement activé, indépendant de la liaison au ligand cGAMP, mais transmettant ce signal à travers la voie d’aval par TBK1. (...)<br>Type I interferons (IFN I) are antiviral cytokines with potent properties. Hence, the induction, transmission and resolution of the immune response generated by IFN I is tightly regulated. The concept of the type I interferonopathies, recently formulated by our team, rests on the assumption that some diseases arise from a disturbance of this complex signalling pathway, leading to excessive and inappropriate IFN I secretion. On this basis, targeted therapeutics should improve or cure features of such type I interferonopathies, thereby providing a validation of the underlying hypothesis. This PhD project initially focused on the clinical and biological characterisation of monogenic and polygenic interferonopathies, and secondarily on the molecular identification of novel mutations in the gene TMEM173 causing the interferonopathy called STING associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI), an auto-inflammatory syndrome with severe cutaneous and pulmonary features. Our selection of patients in comparison to healthy controls was made possible through the use of novel screening tools: IFN signature (qPCR of 6 IFN stimulated genes – ISGs), and measurement of IFN alpha protein levels in serum or plasma (SIMOA-single molecule array - enabling the detection of molecules of IFN in the femtogram [10-18g]) range. In this way, we have been able to expand the phenotypic spectrum of the interferonopathies, which was initially considered as primarily neurological. Patients with Aicardi-Goutières syndrome (AGS), the first described of the monogenic interferonopathies, exhibit dystonia, spasticity, developmental delay, intra-cranial calcifications and white matter abnormalities. However, the systematic use of our interferon screening assays, plus the advent of next-generation sequencing technology, has revealed a much broader set of features relevant to this novel disease grouping – involving the skin (chilblains, necrotising vasculitis, scleroderma), lungs (isolated lung interstitial disease or associated with other signs), musculoskeletal system (joint pain, arthritis, Jaccoud’s arthropathy, muscle pain and myositis), eyes (glaucoma), kidneys (lupus nephritis) and gastro-intestinal tract (early inflammatory bowel disease), as well features of autoimmunity and immunodeficiency. Using our screening assays enabled us to identify three patients variably exhibiting the core features of SAVI, all of whom were found to harbour distinct novel activating mutations in STING. These mutations highlight a protein domain not previously implicated in the control of IFN I signalling. STING is an endoplasmic reticulum protein, acting as a cytosolic adaptor of intracellular sensors of viral DNA in the type I IFN signalling pathway. STING activates TANK-binding kinase (TBK1), allowing transcription of IFN I through phosphorylation of IRF3. Janus kinase 1 (JAK1) and tyrosine kinase 2 (TYK2) are activated following stimulation of the IFN I receptor, leading to phosphorylation of the transcription factors STAT1 and STAT2 and the subsequent induction of a large number of ISGs. Genetic analysis, conformational studies, an in vitro cellular model (HEK293T) and ex vivo experimental data (using patient peripheral blood mononuclear cells - PBMCs) enabled us to confirm the constitutive activating nature of these variants, and show that this activation did not require binding with cGAMP, but was dependent on signalling through TBK1. Ruxolitinib, a JAK1/2 inhibitor, could antagonise this constitutive activation ex vivo. These results indicate a promising therapeutic approach in such patients, and more widely in the monogenic, and perhaps even, polygenic, interferonopathy context

La cellule ß pancréatique sécrète l’insuline, la seule hormone capable de diminuer la concentration en glucose plasmatique. L'insuline est sécrétée de manière régulée sous l’influence de divers stimuli dont avant tout l’élévation de la glycémie, celle-ci augmentant lors de chaque repas. Elle est donc essentielle à la préservation de l'homéostasie du glucose. Son importance est attestée par le développement du diabète sucré et de ses complications sévères et parfois mortelles lorsque sa sécrétion est supprimée ou insuffisante et/ou lorsqu'il existe un défaut de son action.La cellule ß est une cellule excitable, c'est à dire capable de moduler son potentiel membranaire très rapidement en variant certaines conductances ioniques (Dean & Matthews 1968; 1970a; 1970b). En réponse à une élévation du glucose extracellulaire, la cellule ß se dépolarise et génère des potentiels d’action qui aboutissent à une augmentation du calcium cytoplasmique induisant la libération d’insuline par exocytose. La succession des différentes étapes menant à cette sécrétion régulée d'insuline est complexe, souvent désignée sous le vocable de couplage stimulus-sécrétion. Elle commence par une augmentation de l’entrée du glucose et de son métabolisme dans la cellule ß. L’augmentation de la concentration en ATP (ou du rapport de concentrations ATP/ADP) qui en résulte, entraîne la fermeture des canaux potassiques ATP-sensibles (KATP) avec une dépolarisation partielle de la membrane. Toutefois la fermeture de ces canaux ne semble pas suffisante pour expliquer la dépolarisation membranaire observée sous l’effet du glucose et une dépolarisation supplémentaire est nécessaire pour arriver au seuil d’activation des canaux calciques voltage-dépendants ou Cav (Gilon & Rorsman, 2009). Un efflux de Cl- de la cellule ß est déclenché lors d’une stimulation au glucose (Sehlin 1978; Sehlin 1987), proportionnellement à la concentration de glucose entre 5 et 20 mM (Malaisse et coll. 2004). Une diminution de la concentration en Cl- du milieu extracellulaire (à 10 mM ou moins) réduit fortement la sécrétion d’insuline (de 70 % ou plus avec 10 et 20 mM de glucose) et affecte l'activité électrique, inhibant voire abolissant les salves de potentiel d'action d'îlots de souris (Sehlin 1978; Sehlin & Meissner, 1988). L’ion chlorure joue donc un rôle essentiel dans l'activité électrique et la sécrétion d’insuline des cellules ß sous l'effet du glucose. Les travaux qui constituent l'objet de cette thèse sont consacrés à caractériser le transport membranaire des ions Cl- dans les cellules ß ainsi que sa régulation et particulièrement le rôle d’un canal Cl- récemment identifié et cloné: l’anoctamine1 (Ano1 ou TMEM16A).Au chapitre 3, nous démontrons l’expression de transcrits d’Ano1 par transcription inverse et amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) chez l'homme et le rat ainsi que l’expression de la protéine par western blot et immunohistochimie chez le rat. Sur coupe de pancréas, un marquage pour Ano1 est observé dans les îlots et dans les cellules acinaires du pancréas exocrine. La spécificité du marquage est attestée par sa disparition lors de l'addition d’un peptide compétiteur (Ano1 exogène). Nous avons démontré en patch-clamp la présence d’Ano1 actif dans la membrane des cellules ß: i) Nous avons observé des courants typiques d'Ano1 dans des patchs de cellules ß de rat entières et excisés inside-out en présence de Ca2+ intracellulaire: à 1 µM, le courant Cl- est rectifiant sortant et à 2 µM il devient presque linéaire. ii) La relation amplitude unitaire-voltage des courants Cl- unitaires activés par le Ca2+ est linéaire et montre une conductance de 8,37 pS, correspondant exactement à la conductance décrite pour Ano1. iii) Les perméabilités relatives des anions monovalents sont NO3- (1.83 ± 0.10) > Br- (1.42 ± 0.07) > Cl- (1.0), compatibles avec celles d'Ano1. iv) Ces courants sont quasi abolis par des anticorps Ano1-bloquants ou par deux inhibiteurs d’Ano1, 2-(5-éthyl-4-hydroxy-6-méthylpyrimidine-2-ylthio)-N-(4-(4-méthoxyphényl)thiazol-2-yl)acétamide (T-AO1) et acide tannique (TA). Ayant démontré la présence d'Ano1 fonctionnels au niveau de la membrane des cellules ß, nous avons investigué l'implication d'Ano1 dans la dépolarisation membranaire induite par le glucose. Cette étude a été réalisée en patch-clamp perforé sur des cellules ß d'îlots entiers de souris et des cellules ß dispersées de rat et de souris stimulées par le glucose. Les inhibiteurs d'Ano1 (T-AO1 et TA) induisent une forte diminution de la fréquence des potentiels d'action lors d'une stimulation par 16.7 mM de glucose (au moins 87 % sur cellules dispersées) et une repolarisation partielle du potentiel membranaire avec le T-AO1. Ces inhibiteurs abolissent ou inhibent fortement l'augmentation de sécrétion d'insuline d'îlots de rat induite par 8.3 mM et 16.7 mM de glucose. Des anticorps Ano1-bloquants abolissent également l'incrément de sécrétion d'insuline provoqué par 16.7 mM de glucose. Un traitement combiné avec du bumétanide (inhibant l'entrée de Cl- dans la cellule par NKCC1/2) et de l'acétazolamide (inhibant l'anhydrase carbonique V mitochondriale produisant du HCO3- intracellulaire durant le métabolisme du glucose) dans un milieu contenant 20 mM de Cl- et sans HCO3- provoque une réduction de 65 % de l'amplitude des potentiels d'action (AP) avec une repolarisation de 15 mV de leur pic sur des cellules ß dispersées de rat, confirmant l'importance de ces anions dans la régulation des oscillations du potentiel membranaire sous l'effet du glucose. Cette étude démontre que l'ouverture d'Ano1 est nécessaire pour permettre les oscillations du potentiel membranaire stimulées sous l'effet du glucose et la sécrétion d'insuline.Au chapitre 4, nous avons étudié les effets de l'H2O2 sur le canal anionique sensible au gonflement cellulaire (appelé VRAC pour volume-regulated anion channel) dans les cellules ß de rat et de la lignée de rat BRIN-BD11. L'H2O2 produit par une ou plusieurs NAD(P)H oxidase(s) (NOX) a récemment été proposé d'agir, dans plusieurs types cellulaires, comme le signal médiateur de l'activation de ces canaux activés lors du gonflement cellulaire. L'H2O2 exogène (100 à 200 µM) à une concentration de glucose basale (1,1 à 2,8 mM) stimule la sécrétion d'insuline. L'inhibiteur de VRAC, 5-nitro-2-(3-phénylpropylamino)-benzoate (NPPB), également inhibiteur d'Ano1, inhibe la réponse sécrétoire à l'H2O2 exogène. Dans des expériences de patch-clamp, nous montrons que l'H2O2 exogène stimule l’ouverture de VRAC, induisant une dépolarisation du potentiel membranaire et un courant anionique, abolis par le NPPB. L'exposition des cellules BRIN-BD11 à un milieu hypotonique (200 mosmol/l) provoquait un gonflement cellulaire suivi d’un retour vers le volume initial (en 10-15 min) suite à l’activation du canal VRAC, et une augmentation détectable du niveau intracellulaire de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) mise en évidence par l'oxydation du colorant fluorescent 5-(et-6)-chlorométhyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (CM-H2DCF). Cette production de ROS est abolie par le chlorure de diphénylèneiodonium (DPI), un inhibiteur de flavoprotéines dont les NOX et certaines protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale. Les inhibiteurs de NOX tels le DPI et la plumbagine inhibaient presque totalement l’incrément de sécrétion d'insuline provoqué par l'exposition des cellules BRIN-BD11 au milieu hypotonique. Une préincubation avec les deux drogues suivantes abolit quasiment la sécrétion d'insuline tant induite par l'hypotonicité que basale: i) N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur du glutathion qui sert d'antioxydant général et ii) l'acide bétulinique, un composé qui abolit presque totalement l'expression NOX4. Comme le NPPB, chacun de ces inhibiteurs (DPI, plumbagine, préincubation avec NAC ou de l'acide bétulinique) réduit fortement ou abolit la régulation du volume cellulaire observée suite à un choc hypotonique, fournissant une preuve indépendante que l'activation de VRAC est médiée par l'H2O2. L'ensemble de ces données suggère que l'H2O2 produit par une ou plusieurs NOX joue un rôle critique dans la réponse insulino-sécrétoire des cellules ß de la lignée de rat BRIN-BD11 et des cellules ß de rat à l'hypotonicité extracellulaire, via une dépolarisation produite par l'activation de VRAC et une sortie d'anions. L'inhibition de cette dépolarisation produite sous l’effet de l'H2O2 et de l’hypotonicité, ainsi que de la régulation du volume cellulaire observée suite à un choc hypotonique par les inhibiteurs d'Ano1 T-AO1 et TA (100 µM) suggèrent qu'Ano1 est associé à ce canal VRAC ou le constitue ou tout au moins en constitue une sous-unité. Le mécanisme exact entraînant l’ouverture d’Ano1 sous l’effet du glucose n’est pas élucidé. Toutefois à la suite des travaux de Llanos (Llanos et coll. 2015), nous suggérons la séquence d'événements suivante: outre la fermeture des canaux KATP, le métabolisme du glucose produit des ROS qui oxydent et ouvrent RyR2, libérant du Ca2+ des stocks intracellulaires à des endroits localisés près de la membrane cellulaire et d’Ano1 qui est ainsi activé. En conclusion, nos études démontrent que i) l'efflux de Cl- (dépolarisant) de cellules ß murines sous l'effet du glucose dépend de l’ouverture du canal Cl- activé par le calcium intracellulaire (CaCC) Ano1. Le canal Ano1 est activé sous l’effet du glucose et son activation est requise pour induire les potentiels d’action et l'entrée de Ca2+ dans la cellule ß, nécessaires à la libération d’insuline. L'ouverture d'Ano1 semble donc responsable des oscillations du potentiel membranaire en phase active avec potentiels d'action et sa fermeture pourrait participer à la repolarisation des phases silencieuses. ii) l'H2O2 produit par une ou plusieurs NAD(P)H oxydase(s) sous l’effet du gonflement cellulaire, ou du glucose (Pi et coll. 2007, Leloup et coll. 2009), ou encore ajouté de manière exogène est nécessaire à l’activation du canal anionique sensible au gonflement cellulaire VRAC. L'ouverture de VRAC s'accompagne d'une sortie d'anions, dépolarise les cellules ß de la lignée de rat BRIN-BD11 et de rat et provoque une stimulation de la sécrétion d’insuline. Ano1 pourrait être associé à VRAC, le constituer ou en constituer une sous-unité. Le mécanisme déclenchant l'ouverture d'Ano1 reste à élucider.<br>Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

Metazoans have evolved conserved mechanisms to promote cell survival under low oxygen tensions by initiating a transcriptional cascade centered on the action of Hypoxia Inducible transcription Factors (HIFs). In aerobic conditions, HIFs are inactivated by ubiquitin-proteasome-mediated degradation of their a subunit, which is dependent on prolyl hydroxylation by 2-oxoglutarate (2-OG) and Fe(II)-dependent prolyl hydroxylases (PHDs). In hypoxia, HIF-$\alpha$ is no longer hydroxylated and is therefore stabilised, activating a global transcriptional response to ensure cell survival. Interestingly, HIFs can also be activated in aerobic conditions, however the mechanisms of this oxygen-independent regulation are poorly understood. Here, I have explored the role of the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase), the major proton pump for acidifying intracellular vesicles and facilitating lysosomal degradation, in regulating HIF-$\alpha$ turnover. Unbiased forward genetic screens in near-haploid human cells identified that disruption of the V-ATPase leads to activation of HIFs in aerobic conditions. Rather than preventing the lysosomal degradation of HIF-$\alpha$, I found that V-ATPase inhibition indirectly affects the canonical proteasome-mediated degradation of HIF-$\alpha$ isoforms by altering the intracellular iron pool and preventing HIF-$\alpha$ prolyl hydroxylation. In parallel, I characterised two putative mammalian V-ATPase assembly proteins, TMEM199 and CCDC115, identified by the forward genetic screen and subsequent mass spectrometry analysis. I confirmed that both TMEM199 and CCDC115 are required for V-ATPase function, and established assays to determine how TMEM199 and CCDC115 associate with components of the core V-ATPase complex. Lastly, to measure how V-ATPase activity leads to changes in the labile iron pool, I developed an endogenous iron reporter using CRISPR-Cas9 knock-in technology. This approach confirmed that iron homeostasis is impaired during V-ATPase inhibition, and demonstrated that exogenous ferric iron can restore the labile iron pool in a transferrin-independent manner. Together my studies highlight a crucial link between V-ATPase activity, iron homeostasis, and the hypoxic response pathway.

Le concept d'interféronopathie de type I émerge en 2011 et fait référence à un ensemble de pathologies Mendéliennes caractérisées par une hyperactivation des interférons (IFN) de type I. Tous les gènes associés au syndrome d'Aicardi-Goutières (SAG), la première interféronopathie de type I décrite, sont impliqués dans la détection ou le métabolisme des acides nucléiques. Les autres protéines mutées associées aux interféronopathies de type I modifient toutes la voie de signalisation des acides nucléiques, de manière directe, indirecte ou encore non définie. Les IFN de type I se fixent à un récepteur unique et activent la Janus kinase 1 (JAK1) et la tyrosine kinase 2 conduisant à l'expression de gènes stimulés par les IFN (IFN-stimulated genes, ISGs) via la phosphorylation des facteurs de transcription STAT1 et STAT2. Notre équipe a développé des outils diagnostiques des interféronopathies de type I, comprenant la signature IFN, analyse combinée de l'expression de 6 ISGs, et, plus récemment, une méthode de détection de l'IFN alpha à l'aide de la technologie «single molecule array». Les mutations monogéniques associées jusqu'à présent aux interféronopathies de type I causent des phénotypes variables. Leurs points communs sont une morbidité et une mortalité importantes, notamment en raison de leur réponse faible aux immunomodulateurs classiques. Les mutations activatrices de TMEM173 codant pour STING (Stimulator of IFN genes) sont responsables d'une inflammation sévère, connue sous le nom de STING-associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI), et caractérisée par une vascularite cutanée et une atteinte interstitielle pulmonaire conduisant à une insuffisance respiratoire terminale. STING, une protéine du réticulum endoplasmique (RE), agit comme un adaptateur cytosolique de la détection de l'ADN, permettant la synthèse d'IFN de type I via la phosphorylation d'IRF3. Une cohorte internationale de 20 patients SAVI est décrite dans cette thèse soulignant l'hétérogénéité clinique de cette maladie. Nous avons également étudié le lien entre des mutations hétérozygotes de COPA et une activation de la voie des IFN de type I. COPA code pour la sous-unité alpha du complexe du coatomère I, impliqué dans le transport rétrograde entre le RE et le Golgi. Les mutations hétérozygotes de COPA sont à l'origine d'un phénotype proche du SAVI et entraînent une hausse du stress du RE et une réponse immunitaire de type Th17. Cependant, la physiopathologie de cette maladie reste peu connue. Nous avons étudié un groupe de 8 patients qui illustre l'hétérogénéité phénotypique de cette affection nouvellement décrite. Nous avons observé des similitudes entre l'histologie pulmonaire du syndrome COPA et du SAVI, ainsi qu'une signature IFN, des taux élevés d'IFN alpha dans le sérum et une phosphorylation de STAT1 dans les lymphocytes des patients. Dans un modèle cellulaire, la coexpression de COPA muté et de STING sauvage entraîne la phosphorylation d'IRF3 et à une induction d'ISGs, suggérant que les mutations de COPA conduisent à une activation dépendante de STING de la voie des IFN de type I. Nous avons mené avec succès le premier essai clinique d'un inhibiteur de JAK1, le ruxolitinib, dans le contexte du SAVI. L'amélioration clinique remarquable a été confirmée in vitro et ex vivo. La gravité de la maladie nous a également poussé à chercher des alternatives thérapeutiques pour contrôler la voie des IFN de type I. Nous avons montré que l'inhibition d'IKK bloquait efficacement la production et la signalisation des IFN de type I dans les cellules de patients STING in vitro. Devant les résultats prometteurs de l'inhibition de JAK1 dans le SAVI, nous avons ensuite testé le ruxolitinib dans le cadre d'autres interféronopathies de type I monogéniques (COPA, TREX1) mais aussi chez une enfant ayant une dermatomyosite sévère, une maladie pour laquelle le rôle pathogénique de l'IFN de type I a été suggéré<br>The term 'type I interferonopathies', first coined in 2011, refers to a set of Mendelian disorders associated with constitutive up-regulation of type I interferon (IFN) signalling. All of the genes associated with Aicardi-Goutières syndrome (AGS), the first Mendelian type I interferonopathy described, have been implicated in either the processing or sensing of nucleic acids. Beyond AGS, the other mutated proteins associated with type I interferonopathies have a direct, indirect, or currently undefined action on nucleic acid signalling. Type I IFNs drive the expression of IFN-stimulated genes (ISGs) through the engagement of a common receptor and the subsequent activation of Janus kinase 1 (JAK1) and tyrosine kinase 2, and phosphorylation of STAT1 and STAT2. Our team has developed diagnostic tools to identify type I interferonopathies, comprising a so-called IFN signature, involving the assessment of mRNA expression of 6 ISGs and, more recently, a high sensitivity assay of IFN alpha protein using single molecule array technology. Monogenic mutations so far recognised as type I interferonopathies are associated with a wide spectrum of phenotype. The hallmark of these diseases is their significant morbidity and mortality, associated with an apparent absence of response to conventional immunosuppressive therapies. Activating mutations in TMEM173, encoding stimulator of IFN genes (STING), cause a severe inflammatory condition referred to as STING-associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI), characterised by skin vasculopathy and interstitial lung disease leading to end-stage respiratory failure. The endoplasmic reticulum (ER) protein STING is a central component of DNA sensing that induces type I IFNs through phosphorylation of IRF3. An international cohort of 20 STING patients is reported in this thesis, emphasising the clinical heterogeneity of this condition. We also investigated the link between heterozygous mutations in COPA and type I IFN signalling. COPA encodes the alpha subunit of the 7 member coatomer complex I, involved in retrograde transport from the golgi to the ER. Heterozygous mutations in COPA cause a phenotype showing some overlap with SAVI, and are associated with increased ER stress and priming of a Th17 response. However, the precise pathophysiology of this disease is so far undefined. We have studied a group of 8 patients illustrating the phenotypic variability of this emerging disease. We observed commonalities in the lung pathology in COPA and SAVI, as well as an IFN signature, raised levels of IFN alpha in the serum and phosphorylation of STAT1 in patient T cells. In a cellular model, phosphorylation of IRF3 and increased ISG expression were observed in cells co-transfected with wild type STING and mutant COPA plasmids, suggesting that mutations in COPA lead to constitutive activation of type IFN signalling through STING. We reported, for the first time, the successful use of a JAK1 inhibitor, ruxolitinib, in the context of SAVI. We observed a marked clinical effect, which was mirrored by the results of in vitro and ex vivo experiments. Because of the severity of SAVI, we also aimed to evaluate alternative therapeutic approaches to block type I IFN signalling and showed that IKK inhibition efficiently abrogated in vitro constitutive activation of type I IFN production and signalling in cells from STING patients. Considering the promising results of JAK1 blockade in SAVI, we then trialled ruxolitinib in other monogenic type I interferonopathies (TREX1, COPA) and in a child with severe dermatomyositis, a disease where type I IFN has been suggested to play a key pathogenic role

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016<br>A morte celular programada é um mecanismo homeostático que desempenha um papel complementar à mitose na manutenção de uma população estável de células nos tecidos e órgãos. Este programa é ativado diariamente, removendo milhões de células danificadas ou envelhecidas. A apoptose é considerada a forma predominante de morte celular programada, garantindo a eliminação silenciosa de células, isto é, sem ativação do sistema imune. Durante a apoptose, as células sofrem uma grande variedade de modificações morfológicas e bioquímicas. Estas alterações são em grande parte mediadas por uma família de proteases conhecida por caspases. As caspases são normalmente expressas como precursores inativos ou procaspases, que adquirem atividade proteolítica na presença de um determinado estímulo. Depois de ativos, estas enzimas clivam outras procaspases, proteínas essenciais e ADN, sendo assim responsáveis pela amplificação da cascata apoptótica. A clivagem de todos estes substratos resulta na alteração fenotípica das células apoptóticas, as quais passam a apresentar uma redução no seu volume (shrinkage), condensação de cromatina e formação de protrusões na membrana plasmática (blebbing). A composição fosfolipídica da membrana plasmática é também afetada durante a apoptose. Numa célula viável, a bicamada lipídica é assimétrica: a fosfatidilserina (PS) e a fosfatidiletanolamina (PE) estão presentes no folheto interno, enquanto a fosfatidilcolina (PC) e a esfingomielina (SM) localizam-se no folheto externo. Esta assimetria é destruída pelo transporte bidirecional de fosfolípidos através da membrana plasmática, mediado por scramblases (scrambling). Particularmente, durante a apoptose, a PS é movida do folheto interno para o folheto externo, o que serve de sinal para a fagocitose das células apoptóticas, um processo essencial para a manutenção da integridade do hospedeiro. A Anoctamina 6 (ANO6) é uma proteína ubíqua e multifuncional pertencente a uma família proteica formada por dez membros homólogos entre si (ANO1-10; TMEM16 A-K). Esta é identificada como um canal de cloreto regulado por volume e ativado por cálcio (do inglês: Calcium activated Chloride Channel – CaCC), canal catiónico não seletivo, componente do ORCC (do inglês: Outwardly Rectifying Chloride Channel) e scramblase de fosfolípidos ativada por cálcio. A ANO6 participa numa enorme variedade de processos biológicos, tais como a coagulação sanguínea, desenvolvimento do esqueleto, regulação do volume e migração celular, entre outros. A identificação da ANO6 como uma scramblase de fosfolípidos levantou várias questões acerca do seu envolvimento na apoptose. Diferentes estudos indicam que esta proteína contribui para este processo como um canal iónico, participando eventualmente no shrinkage das células e na ativação de caspases. No entanto, no que diz respeito à sua função como scramblase, o papel da ANO6 é ainda incerto. O CFTR (do inglês: Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) é um canal de cloreto regulado por cAMP (Adenosina de monofosfato cíclico), expresso na membrana apical de células epiteliais do intestino, pâncreas, vias respiratórias e glândulas sudoríparas. Mutações no gene que codifica para esta proteína são a causa da Fibrose Quística, a doença mortal autossómica recessiva responsável pelo maior número de mortes na população caucasiana. Apesar da enorme diversidade de variantes de mutações identificadas (cerca de 1.500), a deleção de um resíduo de fenilalanina (F) no codão 508 localizado no cromossoma 7 (ΔF508) é encontrada em 90% dos pacientes com Fibrose Quística. Esta mutação resulta num folding aberrante do CFTR e consequentemente um defeito no seu tráfego do retículo endoplasmático para a membrana plasmática. A Fibrose Quística é principalmente caracterizada por uma por uma perturbação da homeostase iónica e fluídica. De entre os variados sintomas encontrados nos pacientes afetados, destaca-se a produção excessiva de muco espesso, infeções persistentes nas vias respiratórias pela bactéria Pseudomonas aeruginosa, infertilidade masculina e insuficiência pancreática e intestinal. Apesar dos esforços contínuos em compreender o CFTR a um nível funcional e molecular, a Fibrose Quística continua a ser considerada uma doença letal. A atenuação dos sintomas permitiu aumentar a esperança média de vida para cerca de 37 anos. No entanto, a doença pulmonar crónica e a resultante perda de função pulmonar continuam a ser os principais problemas por resolver, sendo responsáveis por 80% da mortalidade. Curiosamente, o CFTR foi previamente descrito como um regulador do estado redox intracelular, da acidificação do citoplasma e organelos e dos níveis de ceramida nas jangadas lipídicas, três processos determinantes para a apoptose e possivelmente responsáveis pela disfunção apoptótica encontrada na Fibrose Quística. Apesar de algumas observações não serem coerentes, a maioria dos estudos defende que mutações no CFTR aumentam a suscetibilidade das células para uma morte necrótica. Contrariamente ao que se sucede na apoptose, durante a necrose os componentes celulares são libertados para os tecidos circundantes e o sistema imune é ativado. Desta forma, especula-se que esta disfunção pode contribuir para as inflamações persistentes que caracterizam a Fibrose Quística. A interação do CFTR com outros canais e proteínas transportadoras tem sido tópico de investigação ao longo dos anos. De entre as proteínas identificadas, destaca-se o ORCC, um canal inativo em células viáveis e envolvido no shrinkage e scrambling de fosfolípidos durante a apoptose. Em 2010 Martins et. al identificou a ANO6 como componente do ORCC, existindo uma possível interação entre esta proteína e o CFTR. Tendo em conta todas estas evidências, o objetivo deste projeto foi o estudo da relação entre a ANO6 e o CFTR durante a morte celular programada. Particularmente, o trabalho focou-se na apoptose induzida por ROS (do inglês: Reactive Oxygen Species), uma vez que o CFTR é descrito como um regulador do estado redox intracelular. A primeira fase deste projeto baseou-se no estudo do impacto dos ROS na atividade da ANO6, não só em termos de corrente elétrica, mas também no que diz respeito à sua função de scramblase. Com este objetivo, a expressão endógena da ANO6 foi manipulada em células HEK293 e HeLa e a sua função foi analisada por patch clamp ou citometria de fluxo, após tratamento com diferentes indutores de stress oxidativo. Os resultados demonstraram que a ANO6 é ativada por ROS, transportando cloreto e catiões para o espaço extracelular no início da apoptose, um evento que contribui para o shrinkage das células. À medida que a via apoptótica avança, a ANO6 passa também a funcionar como scramblase, movendo a PS para o folheto externo da membrana plasmática. Como o silenciamento da ANO6 não diminuiu a morte celular, é concluído que esta proteína não é absolutamente essencial para a apoptose mediada por ROS. No entanto, esta observação não é surpreendente, visto que a morte celular programada é um processo essencial em qualquer sistema biológico, dependendo de uma grande variedade de moléculas e componentes. Assim, é muito provável que uma célula que não expresse a ANO6 compense este defeito com outras proteínas. A segunda parte deste trabalho focou-se na importância do CFTR para apoptose mediada por ROS e a identificação de uma possível interação funcional entre esta proteína e a ANO6. Estudos de co-expressão em células HEK293 revelaram que a presença das duas proteínas aumenta a corrente elétrica induzida por ROS e intensifica o scrambling de fosfolípidos durante a apoptose. Curiosamente, a co-expressão da ANO6 e do CFTR revelou ser suficiente para induzir uma apoptose significativa em condições controlo. Adicionalmente, a linha celular CFBE estavelmente transfetada com CFTR wt ou ΔF508 foi escolhida como uma ferramenta para o estudo da influência da mutação mais proeminente da Fibrose Quística na apoptose. A indução de stress oxidativo nas duas linhas celulares demonstrou que a expressão do CFTR wt intensifica a apoptose, um fenómeno independente da abertura do poro e ativação do canal. Em suma, este estudo permitiu demonstrar que a ANO6 e o CFTR cooperam durante a apoptose mediada por ROS. Estas duas proteínas revelaram ter uma relação funcional no que diz respeito à ativação de uma corrente iónica e também ao scrambling de fosfolípidos. É especulado que a expressão do CFTR na membrana plasmática aumenta a atividade da ANO6, envolvida nestes dois fenómenos apoptóticos. No entanto, é também provável que o contrário seja verdade, visto que a ANO6 foi já identificada como componente das correntes induzidas por cAMP em células que expressam o CFTR. A compreensão do papel da ANO6 e do CFTR durante a morte celular programada pode servir de motor para obter uma nova visão acerca da disfunção apoptótica encontrada na Fibrose Quística e, eventualmente, desenvolver novas terapias como tentativa de atenuar o processo inflamatório.<br>Regulated or programmed cell death is defined as an intracellular program that plays a complementary role to mitosis in maintaining a stable population of cells. Apoptosis is the main form of regulated cell death, allowing the silent elimination of harmed or aged cells without triggering any inflammatory response. Anoctamin 6 (ANO6, TMEM16F) is a multifunctional protein from a family of ten members, identified as an endogenous Ca2+-activated Cl- channel (CaCC). Apart from its function as a CaCC, ANO6 is also described as a volume-regulated and outwardly rectifying Cl- channel (ORCC), a non-selective cation channel and a Ca2+-dependent phospholipid scramblase. It has an ubiquitous expression, being involved in many physiological processes including apoptosis. Nonetheless, ANO6 role in this process is not entirely understood. The Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) is a cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-gated Cl- channel expressed in the apical membrane of epithelial cells from the intestine, pancreas, airways and sweat glands, where it is responsible to maintain ion and fluid homeostasis. Moreover, it regulates the intracellular redox status, acidification and ceramide content in lipid rafts, three different functions that may explain CFTR involvement in apoptosis. Mutations in the CFTR gene are the cause for Cystic Fibrosis (CF), the most common life-threatening autosomal recessive disease in Caucasians. Understanding ANO6 and CFTR role in regulated cell death may help to overcome the apoptotic dysfunction found in Cystic Fibrosis. Here it is shown that ANO6 is activated by ROS (Reactive Oxygen Species) during apoptosis, acting as a Ca2+-activated Cl- channel, non-selective cation channel and phospholipid scramblase in different in vitro systems. The channel has a dual contribution for this process, transporting ions to the extracellular space and mediating phosphatidylserine (PS) exposure in the outer membrane leaflet. Furthermore, a CFTR contribution to ROS-mediated apoptosis was found in CFBE cells, a mechanism independent of pore opening and channel stimulation. Co-expression studies of ANO6 and CFTR in HEK293 cells revealed a functional relationship of these proteins during ROS-mediated apoptosis not only in terms of whole-cell current but also regarding phospholipid scrambling. A possible interaction between ANO6 and CFTR is also proposed to explain why cells overexpressing both proteins have an enhanced spontaneous and ROS-induced apoptosis. Exposure of cells to oxidative stress and consequent ROS production leads to mitochondrial permeabilization, release of Ca2+ and pro-apoptotic proteins, responsible for caspase cleavage. These events terminate with ANO6 activation, which may support cell shrinkage and phospholipid scrambling, two apoptotic hallmarks enhanced in the presence of CFTR.

Planar cell polarity (PCP) refers to the coordinated orientation, movement, or structure of cells within the plane of a tissue. Zebrafish PCP mutants such as the vangl2 mutant exhibit defects in convergent extension, neural tube morphogenesis, and ciliary positioning. Tmem14a is a putative tetraspanin protein that was identified as an potential interactor of Vangl2 in a membrane yeast-two hybrid screen. GFP-tagged versions of Tmem14a are localized to the trans-Golgi network in zebrafish neuroepithelial cells. Knockdown of Tmem14a activity results in convergent extension defects, an ectopic accumulation of cells in the neural tube, and disorganized cilia. The localization of GFP-tagged Tmem14a to the trans-Golgi network suggested that Tmem14a plays a role in the trafficking of core PCP components to the cell membrane. Indeed, the membrane localization of GFP-Vangl2 was disrupted in Tmem14a morphants. Thus, Tmem14a is an interactor of Vangl2 and a novel regulator of vertebrate planar cell polarity signaling.