Academic literature on the topic 'Transporteurs ABC'

Streptococcus pneumoniae, le pneumocoque, est un pathogène majeur causant plus d'un million de morts par an dans le monde. De plus en plus de souches de pneumocoques sont résistants aux antibiotiques, en faisant un problème majeur de santé publique dans le monde. Une partie des ces antibiotiques sont les peptides anti-microbiens (AMP), qui sont produit aussi bien par l'hôte que des bactéries pathogènes en tant que premier système de défense. On trouve dans le pneumocoque un transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) lié à un système de deux composants (TCS) – la kinase d'histidine (HK) et le régulateur de réponse (RR), qui cible les AMP. Récemment, il a été démontré, que l'absence du transporteur ABC augmente la sensibilité à la bacitracine. Dans ce projet, nous avons essayé à comprendre le mécanisme fonctionnel entre le transporteur ABC et TCS en utilisant des outils in vivo et in vitro<br>Streptococcus pneumoniae, the pneumococcus, is a major human pathogen causing over a million deaths each year. Many pneumococcal strains display resistance towards antibiotics causing world-wide health concern. Some of these antibiotics are antimicrobial peptides (AMP), which are produced as a primary defense by hosts as well as pathogens. The pneumococcus harbors a system comprised of an ATP-binding cassette (ABC) transporter and a two-component system (TCS) composed of a histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), which targets these molecules. It has been shown recently that the removal of this ABC transporter increases the sensitivity of the bacteria towards bacitracin. In this project, we tried to understand the functioning mechanism of the ABC transporter and the co-operation with the TCS using both in vivo and in vitro techniques

En raison de leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, les transporteurs ABC de phénotype MDR ont attiré l'attention de la communauté scientifique. Notre projet vise à trouver des conditions dans lesquelles les transporteurs ABC restent fonctionnels en solution pour aboutir à la cristallisation de ces protéines dans une conformation active. Dans ce but, nous avons conçu et développé une nouvelle classe de détergents, à base de calix[4]arène, qui stabilisent ces protéines. Afin de résoudre la structure 3D à résolution atomique du transporteur ABC bactérien "BmrA", responsable de la résistance aux antibiotiques, nous avons utilisé une approche classique utilisant des détergents commerciaux en parallèle à nos détergents innovants. En présence de la Foscholine 12, nous avons obtenu des cristaux diffractant jusqu’à 5 Å de résolution. Cependant, les données de diffraction n’étaient pas suffisantes pour déterminer la structure tridimensionnelle complète de la protéine, seuls les domaines transmembranaires ont été résolus. D'autre part, nous avons atteint l'objectif de l'extraction, la purification et la stabilisation de ce transporteur à l'aide des détergents à base de calix [4] arène. Nous avons également montré que ces détergents promeuvent et améliorent la cinétique de cristallisation de BmrA, une étape que nous sommes en train d’optimiser, pour obtenir des cristaux de meilleure résolution, pour résoudre la structure 3D de BmrA qui sera utilisé pour concevoir des inhibiteurs adaptés<br>Due to their preponderance in the resistance to chemotherapies, the MDR ABC transporters have drawn the attention of the scientific community. Our project aimed at finding conditions in which ABC transporters are active in solution to lead the crystallization of these proteins in an active conformation. In this purpose, we conceived and developed a new class of detergents, based on calix[4]arene ring, that stabilize these proteins. In order to solve the 3D-structure to atomic resolution of bacterial ABC transporter “BmrA” responsible for antibiotic resistance, we used a classical approach with commercial detergents in addition to the innovative ones. We have crystallized the protein in presence of Foscholine 12 with a diffraction resolution up to 5 Å. The data was incomplete; solving partially the structure of the transmembrane domains. On the other hand, we have reached the objective of extraction, purification and stabilization of this transporter by using calix[4]arene-based detergents. We have also shown that these detergents promote and enhance the kinetics of crystallization of BmrA, a step that we are improving, to get crystals of better resolution, for resolving the BmrA 3D-structure which will be used to design adapted inhibitors

La zéaralénone (ZEN) est une mycotoxine produite par des Fusarium qui contaminent les cultures céréalières. Oestrogéno-mimétique et perturbateur endocrinien, ses effets toxiques concernent l'appareil reproducteur. En amont de l'évaluation du risque lié à une exposition à de faibles doses de ZEN, nous nous sommes intéressés à l'effet de la ZEN sur le niveau d'expression de transporteurs ABC majeurs. Ces pompes d'efflux sont présentes dans les barrières de l'organisme (notamment les barrières testiculaires et placentaires) où elles jouent un rôle dans la protection des tissus contre la toxicité de leurs substrats xénobiotiques. Dans ce travail nous avons d'abord caractérisé le métabolisme et la distribution tissulaire de la ZEN chez le rat, puis avons évalué son effet respectivement à court et long terme sur l'expression des transporteurs ABC après une exposition gestationnelle et néonatale. Nos résultats mettent en évidence des différences de comportement toxicocinétique de la ZEN en fonction du genre et du statut hormonal, et une réelle exposition fœtale et néonatale via la mère. La ZEN module l'expression des transporteurs ABC majeurs in vivo (dans les organes maternels, le foie foetal, le testicule du jeune adulte exposé J1-J5). Les résultats obtenus sur modèles in vitro (lignées sertolienne et placentaire) suggèrent que ces modulations sont liées en partie à l'interaction de la ZEN avec les récepteurs aux oestrogènes. Les conséquences d'une modulation de l'expression des transporteurs ABC induite par la ZEN pourraient être dramatiques pour le développement et la santé des individus à l'âge adulte et doivent être évaluées<br>Zearalenone (ZEN) is a mycotoxin produced by Fusarium that infect cereal crops. This Estrogenmimetic and endocrine disruptor affects the reproductive system. Upstream of the risk assessment of exposure to low doses of ZEN, we are interested in the effect of ZEN on the expression level of major ABC transporters. These efflux pumps are present in the barriers of organism (including testicular and placental barriers), where they protect tissues against the toxicity of their xenobiotic substrates. In this work, we first characterized the metabolism and tissue distribution of ZEN in rat and then evaluated respectively its short and long-term effect on ABC transporters expression after gestational and neonatal exposure. Our results highlight differences in the toxicokinetic behavior of ZEN by gender and hormonal status, and fetal and neonatal real exposure via the mother. ZEN modulates the expression of major ABC transporters in vivo (in the maternal organs, fetal liver, testis of young adult exposed J1-J5). The results of in vitro models (sertoli and placental cell lines) suggest that these variations are partly due to the interaction of ZEN with the estrogen receptors. The consequences of expression modulations of ABC transporters induced by ZEN could be dramatic for the development and health of individuals in adulthood and should be evaluated

L'échappement thérapeutique est un obstacle au traitement de l'infection par le VIH, qui repose notamment sur une modulation de la P-gp et des MRP. Dans le modèle de cultures primaires de macrophages humains, une induction transitoire de l'expression membranaire, de l'activité, et de l'expression des ARNm de la P-gp a été observée en réponse à l'infection. Elle est associée à une synthèse de TNF-a et pourrait résulter de l'interaction entre la gp120 virale et l'un des co-récepteurs du VIH i. E. CCR5. Le gène mrp4 suit le même profil d'expression alors que l'expression de mrp1 et mrp5 est induite au cours de la phase de réplication virale. Deux inhibiteurs de la P-gp et des MRP, le PSC833 et le probénécide, augmentent l'efficacité antivirale de l'AZT et de l'indinavir. Les voies de transduction induite par PSC833 pourrait expliquer l'augmentation d'expression de mrp4 et mrp5 par l'AZT et donc la meilleure efficacité de l'AZT<br>Treatment of AIDS is restricted by therapeutical escape, relying notably on modulation of P-gp and MRP. In primary cultures of human monocyte-derived macrophages, we evidence a transient increase of P-gp activity related to an increase of P-gp expression at cell surface and of P-gp mRNA. This transcriptional up-regulation is associated with a TNF-a overproduction and could result from the binding between viral gp120 and CCR5, one of HIV coreceptors. Same profile is obtained for MRP4 mRNA expression while those of MRP5 and MRP1 mRNA increase concomitantly with HIV replication. In parallel, we observe that anti-HIV effects of antiretroviral drugs such AZT and indinavir are increased when we inhibit the P-gp and/or MRP efflux with specific inhibitors (PSC833 and probenecid). Transduction pathways activated by PSC833 may account for AZT-induced mrp4 and mrp5 expression and thus for increased AZT antiviral efficacy in vitro

Cette thèse a été consacré à l'analyse biochimique et structurale par microscopie électronique de 2 transporteurs membranaires « ATP-binding cassette » (ABC) BmrA de B. Subtilis et ABCC2, un transporteur humain. Les ABCs transporteurs sont responsables du transport ATP dépendant à travers les membranes cellulaires d'une large variété d’endo et de xénobiotiques organiques. Plusieurs ABC transporteurs, dont BmrA et ABCC2, sont responsables d’un phénotype de multirésistances cellulaire aux agents anticancéreux, antibiotiques ou antiviraux. La conception de nouveaux inhibiteurs est limitée par le faible niveau de connaissances structurales de ces transporteurs. Dans le cas de BmrA, l’originalité du travail a été d’obtenir la structure dans un environnement membranaire des conformations en absence et en présence de nucléotides. Pour cela, BmrA a été reconstitué à forte densité protéique dans une bicouche lipidique. Pour la forme apo, une reconstruction 3D à 23 Å de résolution a été obtenue par la technique de particule isolée en cryo-EM. Pour la forme post-hydrolytique, l'analyse de cristaux 2D a permis le calcul d'une carte de projection à 16 Å. L’ensemble des résultats permet d'établir formellement l'existence d'une forme ouverte apo-ATP vers le cytoplasme et d'une forme fermée ATP-lié ouverte vers le milieu extracellulaire favorisant un mécanisme de transport de drogues de type « soufflet ». Dans le cas d’ABCC2, le transporteur a été purifié et un modèle 3D à basse résolution d’une forme dimérique a été calculé. Les résultats ont mis en évidence une forme monomérique et une forme dimérique inédite d’ABCC2 démontrant sa capacité à former des organisations supramoléculaires<br>The goals of the PhD thesis is the biochemical and the structural analysis by cryo-electron microscopy of two « ATP-binding cassette » (ABC) membrane transporters, namely BmrA from B. Subtilis and ABCC2, a human transporter. ABC transporters are responsible for the ATP-dependent translocation across the cell membranes of a wide variety of organic endobiotics and xenobiotics. Several ABC transporters, including BmrA and ABCC2 are involved in a cellular multidrugs resistance against antibiotics, antiviral and anticancer agents. The absence of structural information on these ABC transporters prevents the conception of new inhibitors. In this context, we have characterized by electron microscopy BmrA in nucleotide-free and nucleotide bound conformation in a lipidic environment after reconstitution of BmrA at high protein densities. A tridimensional reconstruction at 23 Å resolution of the nucleotide-free conformation has been calculated from cryo-embebded samples by single particle analysis. A projection map at 16 Å of the nucleotide-bound conformation was calculated from 2D crystals. Overall, results revealed an inward-open conformation of BmrA in absence of nucleotides and an outward-facing conformation in post-hydrolytic state. This demonstrated a bellows-like mechanism of drugs transports involving a large conformational change that changes the cellular orientation of the drugs binding side upon ATP binding. ABCC2 has been purified and a 3D model at low resolution has been calculated from negatively stained images. Overall, the results have demonstrated the capacity of ABCC2 to be assembled in supramolecular organisation

ABCB4/MDR3 est une protéine transmembranaire qui assure la sécrétion de la phosphatidylcholine, un composant fondamental de la bile, au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. De nombreuses mutations qui touchent le gène encodant ce transporteur sont à l'origine de pathologies cholestatiques rares. La cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3) représente la forme la plus sévère de ces maladies. À ce jour, environ 50 % des patients ne répondent pas aux traitements conventionnels, faisant de la transplantation hépatique l'ultime alternative thérapeutique pour ces jeunes patients. Cette thèse a eu pour objectif d'identifier par une approche de criblage à haut débit, de nouveaux correcteurs pharmacologiques du trafic intracellulaire de trois variants d'ABCB4 (I541F, L556R et I490T), retenus dans le réticulum endoplasmique. Les résultats des analyses biochimiques et morphologiques nous ont permis de valider, dans nos modèles cellulaires, trois correcteurs de la maturation et de la localisation membranaire de deux variants. Néanmoins, à cause d'un effet inhibiteur de ces molécules sur la fonction d'ABCB4, un seul correcteur a pu restaurer de manière significative la fonction de ces deux variants. En association avec l'ivacaftor (VX 770, Kalydeco®), un modulateur d'activité approuvé pour la mucoviscidose, une amélioration et une potentialisation de l'activité a été obtenue. Dans le but d'explorer le mécanisme d'action de ses composés, des analyses de docking moléculaire in silico ont été réalisées et suggèrent une interaction des drogues avec les résidus d'ABCB4 impliqués dans la liaison/hydrolyse de l'ATP expliquant potentiellement l'effet inhibiteur de la fonction. De plus, in vitro, les molécules augmentent la stabilité à la membrane plasmique d'ABCB4-WT et semblent inhiber sa dégradation lysosomale. De façon intéressante, l'effet correcteur de ces molécules est conservé pour un autre variant intracellulaire du transporteur d'acides biliaires ABCB11. Cela permet d'envisager un traitement consensus des déficits des deux transporteurs ABC, ABCB4 et ABCB11. Pour conclure, nous avons identifié de nouveaux composés correcteurs pour les variants d'ABCB4 retenus au niveau intracellulaire. Ces résultats ouvrent la voie à leur optimisation chimique afin de fournir de nouveaux médicaments candidats comme alternative potentielle à la transplantation hépatique pour les patients atteints de formes sévères de maladies liées aux déficits d'ABCB4<br>ABCB4/MDR3 is a transmembrane protein that secretes phosphatidylcholine, a fundamental component of bile, to the canalicular membrane of hepatocytes. Numerous mutations in the gene encoding this transporter are responsible for rare cholestatic diseases, the most severe one being progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3). To date, at least 50 % of patients do not respond to conventional treatments, making liver transplantation the ultimate alternative therapy. Thus, this thesis was dedicated to characterizing and validating new pharmacological correctors for three traffic-defective ABCB4 variants (I541F, L556R and I490T) retained in the endoplasmic reticulum. In cell models, the biochemical and morphological analyses allowed us to identify three molecules able to rescue the maturation and canalicular localization of two variants. However, due to an inhibitory effect of these molecules on ABCB4 function, only one corrector was able to significantly restore the function of these variants. Combined with ivacaftor (VX 770, Kalydeco®), an approved modulator of activity for cystic fibrosis, an improvement and potentiation of ABCB4 activity was obtained. In silico molecular docking analyses were carried out to explore the mechanism of action of these compounds, suggesting an interaction of the drugs with ABCB4 residues involved in ATP binding/hydrolysis, which could explain the function inhibition effect. Furthermore, in vitro, the newly identified molecules increase the plasma membrane stability of ABCB4-WT and appear to inhibit its lysosomal degradation. Interestingly, the corrective effect of these molecules is conserved for an intracellular variant of the bile acid transporter ABCB11. This suggests the prospect of a consensus treatment for deficiencies of both ABC transporters. In conclusion, we have identified novel corrector compounds for intracellularly-retained ABCB4 variants. These results pave the way for their optimization to provide new drug candidates as potential alternatives to liver transplantation for patients with severe forms of ABCB4-related diseases

La @toxoplasmose est une zoonose due à un parasite intracellulaire obligatoire, Toxoplasma gondii. Les traitements de la toxoplasmose reposent sur un nombre limité de molécules. Outre la présence de mutations et/ou la surexpression sur les gènes DHFR et DHPS, l’implication de protéines de transport, telles que les Pgp et/ou les MRP pourrait intervenir dans les échecs. Notre étude a porté sur les ABC transporteurs membranaires entiers, appartenant aux familles ABC. B (TgABC. B1 et TgABC. B2) et ABC. C (TgABC. C1). Sur les souches de référence représentatives des types I, II et III, nous avons montré que les gènes codant pour les ABC transporteurs sont plus exprimés sur la souche RH. De plus, nous avons mis en évidence une expression plus importante pour TgABC. B1 (au niveau transcriptionnel et traductionnel) que pour les deux autres ABC transporteurs sur les souches représentatives des trois génotypes. L’existence de Pgp fonctionnelles chez T. Gondii est montrée avec une activité d’efflux identique pour les trois génotypes. Nous nous sommes ensuite attachés à rechercher les mécanismes de résistance sur trois souches résistantes à la sulfadiazine. Nous avons montré des variations des niveaux d’expression des ABC transporteurs qui paraissent liées au génotype de la souche plutôt qu’à son niveau de sensibilité à la sulfadiazine. Nous avons surtout montré une augmentation de l’activité d’efflux due aux Pgp, dans les souches résistantes. Nous nous sommes également intéressés à l’influence d’un traitement prolongé in utero par pyriméthamine/sulfadoxine sur une souche responsable de toxoplasmose congénitale. Nous avons observé une augmentation des transcrits de TgABC. B1 et TgABC. C1 après traitement médicamenteux associée à une augmentation de l’activité d’efflux des Pgp, indiquant une modification phénotypique de la souche sous l’influence d’un traitement antitoxoplasmique. Nous avons obtenu par pression médicamenteuse à des doses croissantes une souche RH résistante à la sulfadiazine. Cette évolution ne s’accompagne pas d’une modulation des transcrits des gènes analysés, mais de l’individualisation d’une population présentant une augmentation de la vitesse d’efflux des Pgp<br>The @apicomplexan Toxoplasma gondii, an obligate intracellular parasite, can infect humans and a wide range of vertebrates leading to toxoplasmosis. Treatment of toxoplasmosis usually uses a combination of a sulfamide with pyrimethamine; however, several failures have been reported in spite of a good observance of treatments. Common mechanisms of resistance are variations on the genes sequence encoding to the drug target (DHFR, DHPS) and/or on ABC (ATP Binding Cassette) with Pgp and MRP genes. In order to understand the failure mechanisms in T. Gondii, the objective of this study is to analyse full membrane ABC transporters TgABC. B1 and TgABC. B2: Pgp, TgABC. C1: MRP. The population structure of T. Gondii consists of three principal clonal lineages (types I,II and III) correlated with virulence expression. The three ABC genes are constitutively expressed in the three major T. Gondii genotypes but TgABC. B1 demonstrated a higher expression in virulent type I, at both transcriptional and translational levels. The existence of functional Pgp at T. Gondii is shown with an activity of efflux identical for three genotypes. A recent study on the strain’s sensitivity to treatment identify three strains with a weak sensitivity to sulfadiazine. The study of expression levels of three ABC genes didn’t show significant variation between resistant and sensitive strains. We showed an increase of the efflux activity to Pgp for the resistant strains. We were also interested in the influence of a treatment in utero by pyriméthamine/sulfadoxine on a congenital toxoplasmosis strain. We observed an increase of expression levels of TgABC. B1 and TgABC. C1 after treatment associated with an increase of the efflux activity of the Pgp, implying a modification phénotypic of the strain after toxoplasmosis treatment. We obtained by pressure in increasing doses a resistant RH strain for the sulfadiazine. This result doesn’t come along with a modulation of expression levels on the analysis genes, but with the population individualization which increase of the Pgp efflux activity